CN103695477A - 利用维生素c提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法 - Google Patents

利用维生素c提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法 Download PDF

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本发明公开了一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：（1）种子培养；（2）发酵培养：将二级种子接入发酵培养基中，在通气量为0.1～0.8vvm，搅拌转速为300～500rpm，温度为32～42℃条件下发酵12～24h，当发酵培养基中葡萄糖浓度降低至2～10g/L时，加入浓度为80～160g/L维生素C水溶液。本发明采用连续添加还原剂的方式，有利于整个发酵过程中生物所处外部环境的氧化还原态势的维持，最终促进了发酵液中葡萄糖的消耗和乙偶姻的转化，提高了(R,R)-2,3-丁二醇的积累。

Description

利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法。
背景技术
2，3-丁二醇作为一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于医疗、化工、能源及食品等领域，有广阔的工业应用前景。多粘类芽孢杆菌通过生物催化乙偶姻的方式生成(R,R)-2,3-丁二醇，由于每一分子乙偶姻在转化为(R,R)-2,3-丁二醇的过程中需要消耗一分子NADH，因此，保证辅酶NADH的充足供给有利于(R,R)-2,3-丁二醇的积累。目前在促进乙偶姻转化为(R,R)-2,3-丁二醇的过程中，构建辅因子的生物再生系统成为研究的主流。由于基因操作本身操作手段相对繁琐、实验周期相对较长的限制，加之构建辅酶再生过程中外源基因的导入或內源基因的修饰均可能导致整个代谢途径的扰动，从而影响目标代谢途径物质流和能量流分配。因此，寻找一种更为简单且有效的方法尤为重要。基于胞内辅酶还原态与氧化态的比值（NADH/NAD+）往往与生物所处外部环境的氧化还原态势密切关联，因此，改变生物所处外部环境的氧化还原态势有可能会导致胞内NADH/NAD+的改变。由于外源还原剂（如NaBH4和DTT）的添加可以够影响到细胞所处环境氧化还原态势，目前，通过外源还原剂的添加来调节生物所处外部环境的氧化还原电势，进而影响胞内辅酶NADH/NAD+的比例，促进1,3-丙二醇等目标产物积累的研究已有报告，但利用外源还原剂VC来提高(R,R)-2,3-丁二醇产量的报道尚未见到。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518保藏编号为CGMCCNO.7096在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
（2）发酵培养：按体积百分比为5%～10%的接种密度将二级种子接入发酵培养基中，在通气量为0.1～0.8vvm，搅拌转速为300～500rpm，温度为32～42℃条件下发酵12～24h，当发酵培养基中葡萄糖浓度降低至2～10g/L时，加入浓度为80～160g/L维生素C水溶液，每次加入维生素C的量与发酵培养基体积之比为40～160mg:1L，每1～6h加1次维生素C，至发酵结束。
所述发酵培养基由下述成分以g/L计组成：葡萄糖55，酵母浸膏粉10，NaCl5，K2HPO44，KH2PO42，(NH4)2SO42，柠檬酸钠2，MgSO4·7H2O0.7，KCl0.5，CaCl20.05，ZnSO4·7H2O0.005，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.005，pH为7.0。
本发明优点：
本发明是在Paenibacillus polymyxa CJX-518发酵过程中，当生物量积累到一定程度后开始添加外源还原剂VC，相对以往报道的在发酵起始阶段添加还原剂的方式，降低了因还原剂对微生物的毒害作用而导致目标产物积累受阻的影响；同时，在发酵过程中，采用连续添加还原剂的方式，有利于整个发酵过程中生物所处外部环境的氧化还原态势的维持，最终促进了发酵液中葡萄糖的消耗和乙偶姻的转化，提高了(R,R)-2,3-丁二醇的积累。
附图说明
图1为维生素C的添加对Paenibacillus polymyxa CJX-518发酵过程中葡萄糖消耗的影响。
图2为维生素C的添加对Paenibacillus polymyxa CJX-518发酵过程中乙偶姻产量的影响。
图3为维生素C的添加对Paenibacillus polymyxa CJX-518发酵过程中(R,R)-2,3-丁二醇产
量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
本发明涉及的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），命名为Paenibacillus polymyxaCJX-518。并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号:CGMCC NO.7096。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2013年1月8日，并存活。以下将一种产2,3-丁二醇的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518保藏编号为CGMCC NO.7096简称CJX-518。
实施例1
一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：
（1）培养基的配制
固体斜面培养基成分以g/L计：淀粉20，葡萄糖5，蛋白胨2，MgSO4.7H2O0.5，NaCl0.5，玉米浆2，琼脂20，121℃蒸汽灭菌20min；
种子培养基成分以g/L计：淀粉30，葡萄糖5，酵母浸粉2，蛋白胨4，MgSO4.7H2O0.5，NaCl0.5，K2HPO41.5，121℃蒸汽灭菌20min；
发酵培养基成分以g/L计：葡萄糖55，酵母浸膏粉10，NaCl5，K2HPO44，KH2PO42，(NH4)2SO42，柠檬酸钠2，MgSO4·7H2O0.7，KCl0.5，CaCl20.05，ZnSO4·7H2O0.005，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.005，pH为7.0，121℃蒸汽灭菌20min；
（2）摇瓶培养
一级种子的培养
将CJX-518从固体斜面培养基接入50mL的种子培养基中，在温度37℃，转速200rpm条件下，培养24h，制得一级种子培养液；
二级种子的培养
将1mL一级种子培养液接入100mL的新的种子培养基中，在温度37℃，转速200rpm条件下，培养24h，制得二级种子培养液；
（3）发酵培养
按体积百分比为10%的接种密度将二级种子接入5L装有3L发酵培养基的发酵罐中，在通气量为0.2vvm，搅拌转速为300rpm，温度为37℃，发酵24h，检测到发酵培养基中葡萄糖浓度降低至5g/L时，加入浓度为160g/L的维生素C水溶液，每次加入维生素C的量与发酵培养基体积之比为80mg:1L，每3h加1次维生素C，直至发酵结束，各时间段检测到的消耗的葡萄糖总量如图1添加VC处理组所示，生成的乙偶姻浓度如图2添加VC处理组所示，生成的(R,R)-2,3-丁二醇浓度如图3添加VC处理组所示。
高效液相色谱所用分析柱为Aminex HPX-87H Ion Exclusion particles(300mm×7.8mm,BIORAD)，进样量为25μL，流动相为含5MmH2SO4的MillQ水，流速为0.6mL.min-1，检测器温度维持在50℃、分析柱柱温维持在65℃。不同时间点检测发酵液中剩余葡萄糖含量以及(R,R)-2,3-丁二醇浓度。
实施例2
对照组：不添加维生素C的发酵
（1）～（2）同实施例1步骤（1）～（2）；
（3）按体积百分比为10%接种密度将二级种子培养液接入5L装有3L发酵培养基的发酵罐中，在通气量为0.2vvm，搅拌转速为300rpm，温度为37℃条件下发酵24h，分别在12h、18h、24h取发酵液12000rpm离心10min后取上清，用超纯水稀释10倍数后用0.22μm滤器过滤，高效液相色谱检测发酵产物含量，各时间段检测到的消耗的葡萄糖总量如图1对照组所示，生成的乙偶姻浓度如图2对照组所示，生成的(R,R)-2,3-丁二醇浓度如图3对照组所示。
实施例3
一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将CJX-518在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；种子培养基的配制同实施例1；
（2）发酵培养
按体积百分比为5%的接种密度将二级种子接入发酵培养基中，在通气量为0.8vvm，搅拌转速为500rpm，温度为42℃，发酵时间为12h，当检测到发酵培养基中葡萄糖浓度降低至2g/L时，加入浓度为80g/L的维生素C水溶液，每次加入维生素C的量与发酵培养基体积之比为160mg:1L，每1h加1次维生素C，直至发酵结束，检测发酵液中(R,R)-2,3-丁二醇的含量为14.29g/L。发酵培养基同实施例1。
实施例4
一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将CJX-518在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；种子培养基的配制同实施例1；
（2）发酵培养
按体积百分比为10%的接种密度将二级种子接入发酵培养基中，在通气量为0.1vvm，搅拌转速为400rpm，温度为32℃，发酵时间为24h，当检测到发酵培养基中葡萄糖浓度降低至10g/L时，加入浓度为160g/L维生素C水溶液，每次加入维生素C的量与发酵培养基体积之比为40mg:1L，每6h加1次维生素C，至发酵结束，检测发酵液中(R,R)-2,3-丁二醇的含量为19.82g/L。发酵培养基同实施例1。

Claims (2)

1.一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）种子培养：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518保藏编号为CGMCCNO.7096在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
（2）发酵培养：按体积百分比为5%～10%的接种密度将二级种子接入发酵培养基中，在通气量为0.1～0.8vvm，搅拌转速为300～500rpm，温度为32～42℃条件下发酵12～24h，当发酵培养基中葡萄糖浓度降低至2～10g/L时，加入浓度为80～160g/L维生素C水溶液，每次加入维生素C的量与发酵培养基体积之比为40～160mg:1L，每1～6h加1次维生素C，至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法，其特征是所述发酵培养基由下述成分以g/L计组成：葡萄糖55，酵母浸膏粉10，NaCl5，K2HPO44，KH2PO42，(NH4)2SO42，柠檬酸钠2，MgSO4·7H2O0.7，KCl0.5，CaCl20.05，ZnSO4·7H2O0.005，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.005，pH为7.0。
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