CN103898010B - 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 - Google Patents
一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103898010B CN103898010B CN201410086648.5A CN201410086648A CN103898010B CN 103898010 B CN103898010 B CN 103898010B CN 201410086648 A CN201410086648 A CN 201410086648A CN 103898010 B CN103898010 B CN 103898010B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- butanols
- salt
- bai shi
- shi clostridium
- glucose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 title claims abstract description 47
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 16
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 15
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 15
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 12
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 12
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 12
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 claims description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 8
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 6
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 5
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 2
- -1 VITMAIN B1 Chemical compound 0.000 claims description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 26
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 21
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 13
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 abstract description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 8
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 229920002522 Wood fibre Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 3
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 9
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 9
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 9
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 description 2
- WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 4-hexylbenzene-1,3-diol Chemical compound CCCCCCC1=CC=C(O)C=C1O WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 1
- 244000241872 Lycium chinense Species 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株高耐受性拜氏梭菌<i>Clostridium beijerinckii </i>M17<b> CCTCC NO</b><b>：</b><b>M 2013425</b>及其在生产丁醇中的应用。该菌株通过常温等离子体诱变和筛选获得，对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质具有高度耐受性，在酚浓度高达2.0g/L的发酵液中，能非常好地发酵生产丁醇，其总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.9g/L和7.9g/L，即使酚浓度高达2.4g/L，本发明菌株仍具有可观的产丁醇能力，说明本发明菌株拜氏梭菌M17不仅对甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且对其中的毒素抑制物，尤其是酚类化合物具有高度耐受性，是一种适合利用甘蔗渣发酵产丁醇的优良菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一株能利用未脱毒甘蔗渣酸解糖液发酵产丁醇的高耐受性拜氏梭菌及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
丁醇是无色液体，有酒味，与乙醇/乙醚及其他多种有机溶剂混溶；已广泛应用于增塑剂等各种精细化学品的制造。丁醇具有能量密度大、可与汽油任意比混合、可直接用于内燃机、运输方便等优点；作为可再生的新型液体燃料受到越来越多的重视。
随着化石能源的日益枯竭和价格飞涨，利用可再生的木质纤维质原料（如秸秆、甘蔗渣等）发酵生产丁醇，成为研究的重点和热点之一。ThaddeusEzeji等（BioresourceTechnology.2008,99:5915-5922）利用拜氏梭菌突变株BA101，以XAD-4resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30g/L；但突变株BA101不能利用未脱毒的酸解糖液发酵产丁醇。庞浩等（生物技术,2011,21(5),79-82）报道拜氏梭菌13-2株对甘蔗渣水解液具有较高的发酵效率，在0.5%硫酸用量条件下，它的丁醇发酵量最高可达到4.5g/L。中国专利ZL201110020102.6报道：通过粒子束诱变育种得到的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)IB4对酚类化合物具有较高的抗逆性，其能以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.3g/L和7.1g/L；同时，以未脱毒的甘蔗渣酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.6g/L和7.3g/L。然而，郭亭等（JIndMicrobiolBiotechnol.,2012,39(3),401-407）研究发现，当玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚类化合物的浓度提升到1.5g/L以上时，拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)IB4基本不生长。
甘蔗渣是一种重要的可再生木质纤维原料，利用蔗渣生产丁醇，不仅节约资源，还促进制糖产业节能减排，产业升级。但是，甘蔗渣等原料经稀酸处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的去除成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；ThaddeusEzeji等（Biotechnology＆Bioengineering.2007,97(6):1460-1469）研究发现有机酸、糠醛等抑制物不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效果。基于此，甘蔗渣酸解糖液中的毒素抑制物（尤其是酚类化合物）严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明通过诱导突变和筛选的方法获取一株不仅对甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且对其中的毒素抑制物（尤其是酚类化合物）具有高度耐受性的突变菌株。
本发明的目的在于提供一株新菌种：拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17。
本发明的另一个目的在于提供上述菌株在丁醇生产中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
申请人将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2013年9月14日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCCNO：M2013425，提议的分类命名为ClostridiumbeijerinckiiM17，已于2013年9月23日鉴定保藏的菌株是存活的。
一种生产丁醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）平板培养：将拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17接种至平板培养基上，进行厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24h，使菌种活化；
2）种子培养：将平板培养活化的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17接种到种子培养基中，100mL的厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
3）发酵产丁醇：将种子培养后的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17菌液接种到发酵培养基中，接种量按5～15%的体积百分比，充氮气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为70～90h，即可发酵产出丁醇。
进一步的，步聚1）所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中的至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中的至少一种。
进一步的，步聚2）所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，碳源选自淀粉、葡萄糖中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种。
进一步的，步聚3）所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源3%～6%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05%～0.1%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、酵母粉中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种；生长因子选自对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明菌株拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiM17对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质具有高度耐受性，在酚浓度高达2.0g/L的发酵液中，能非常好地发酵生产丁醇，其总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.9g/L和7.9g/L，即使酚浓度高达2.4g/L，本发明菌株仍具有可观的产丁醇能力，说明本发明菌株拜氏梭菌M17对毒素物质耐受性强、溶剂产量和丁醇产量高、重复性好，是一种适合利用甘蔗渣发酵产丁醇的优良菌种。
本发明菌株拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiM17对甘蔗渣酸解糖液具有高效的利用率，且对其中的毒素抑制物（尤其是酚类化合物）具有高度的耐受性，这不仅有利于丁醇的生产，还有利于资源的节约，促进制糖产业的节能减排，促进产业升级。
附图说明
图1为拜氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一、等离子体诱变原始拜氏梭菌株
拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
将拜氏梭菌NCIMB8052原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，50ml肖特厌氧瓶装液量为15～20ml，充氮气3min，培养时间12～18h，得到生长旺盛的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600=0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～240s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，180s是最佳的诱变辐照时间。
二、筛选诱变后的目的拜氏梭菌株
（1）培养基配方（%为质量百分比）：
1.甘蔗渣酸解糖液平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，刃天青0.02%，甘蔗渣酸解糖液25%(v/v)，其余为水，pH6。
2.种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6。
3.摇瓶发酵初筛培养基：葡萄糖3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6。
5.摇瓶发酵复筛培养基：甘蔗渣酸解糖液3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6。
（2）筛选步骤：
1、甘蔗渣酸解糖液平板培养基培养
将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于甘蔗渣酸解糖液平板培养基上，33～37℃厌氧培养12～36h，挑选出透明圈和菌落较大的菌落50株，分别编号M1～M50，将其分别用种子培养基进行扩大培养，并保种。
2、摇瓶发酵初筛
将初筛的扩大培养后的50株菌落和原始菌株接种到摇瓶发酵初筛培养基中，接种量10%（v/v），100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，发酵温度35℃，发酵时间72h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量，结果显示菌株M17、M39和M48可发酵产出较高的丁醇产量，如表1所示。
表1各菌株的总溶剂产量和丁醇产量
经过组合筛选获得的三株突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均高于原始菌株的产量，其中M17的总溶剂产量和丁醇产量也最高。
3、摇瓶发酵复筛
将发酵初筛获得的总溶剂和丁醇产量最高的菌株M17和原始菌株接种到摇瓶发酵复筛培养基中，接种量10%（v/v），100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，发酵温度35℃，发酵时间72h后检测两个菌株的总溶剂产量和丁醇产量，结果显示菌株M17可发酵产出较高的丁醇产量，如表2所示。
表2原始菌株和M17的总溶剂产量和丁醇产量
从摇瓶发酵复筛结果可知，原始菌株拜氏梭菌NCIMB8052基本不生长；ClostridiumbeijerinckiiM17的总溶剂产量和丁醇产量分别9.4g/L和6.5g/L，可见M17在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量明显高于原始菌株的产量。这与平板培养及发酵初筛的结果是一致的。
三、目的拜氏梭菌株的传代稳定性
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株拜氏梭菌M17的传代稳定性，菌株M17传代发酵试验结果如表3所示：
表3拜氏梭菌M17的传代稳定性
从实验结果可知，经过7次连续传代，突变株M17、M39和M48的总溶剂产量和丁醇产量都较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
四、检测目的拜氏梭菌对未脱毒木质纤维酸解糖液中毒素物质的耐受性
（1）培养基配方（%为质量百分比）：
发酵培养基1：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，用未脱毒的甘蔗渣的酸解糖液（总还原糖为3%）配制，其余为水，pH6.6，培养基中可溶性总酚含量为1.5g/L。
发酵培养基2：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，用未脱毒甘蔗渣的酸解糖液（总还原糖为4%）配制，其余为水，pH6.6，培养基中可溶性总分含量为2.0g/L。
发酵培养基3：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，用未脱毒的玉米芯酸解糖液（总还原糖为4.7%）配置，其余为水，pH6.6，培养基中可溶性总酚含量为2.4g/L。
平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，，其余为水，pH6。
种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6。
（2）实验过程、结果和结论
1.菌种的平板培养、种子培养和发酵培养
平板培养：将原始菌拜氏梭菌NCIMB8052、拜氏梭菌IB4（CCTCCNO：M2010310）、拜氏梭菌M17分别接种至平板培养基上，厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h，使菌种活化。
种子培养：将上述平板培养活化后的三种菌种分别接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h，获得种子培养液。
发酵培养：将种子培养后的原始菌拜氏梭菌NCIMB8052、拜氏梭菌IB4（CCTCCNO：M2010310）、拜氏梭菌M17的菌液分别接种至装有1L发酵培养基1、发酵培养基2、发酵培养基3的2L发酵罐中，如表4所示，接种量为10%（v/v），发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，在同样的实验条件下发酵培养72h后，分别检测各组发酵产物中的总溶剂产量和丁醇产量。
表4各菌种在含不同酚浓度的发酵培养基中的总溶剂产量和丁醇产量
2.实验结果
检测结果如表4所示，从中可以看出，当发酵培养基中的总酚含量为1.5g/L时，原始菌种拜氏梭菌NCIMB8052均基本不生长，而拜氏梭菌IB4（CCTCCNO：M2010310）和拜氏梭菌M17均能良好的生长，且拜氏梭菌IB4总溶剂产量和丁醇产量分别为10.3g/L和7.1g/L，拜氏梭菌M17的产量分别为10.5g/L和7.2g/L，二者丁醇产量相差并不显著；当发酵培养基中的总酚含量为2.0g/L和2.4g/L时，拜氏梭菌NCIMB8052和拜氏梭菌IB4均不能正常生长，而拜氏梭菌M17仍可以良好地生长，且当总酚含量为2.0g/L时，M17产丁醇的能力还有所上升，其总溶剂产量和丁醇产量分别为10.9g/L和7.9g/L，当总酚含量高达2.4g/L时，M17产丁醇的能力受到一定的影响，其总溶剂产量和丁醇产量分别降至8.7g/L和5.9g/L。
3.实验结论
上述的检测结果说明本发明获得的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17能直接利用未脱毒甘蔗渣酸解糖液发酵产丁醇，且其对毒性的耐受能力远高于目前的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)IB4（最高耐受的总酚浓度约为1.5g/L），即使在高达2.4g/L的总酚浓度下，仍具有较好的产丁醇能力。
Claims (6)
1.一株拜氏梭菌，其分类命名为ClostridiumbeijerinckiiM17，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO：M2013425。
2.权利要求1所述的ClostridiumbeijerinckiiM17在生产丁醇中的应用。
3.一种生产丁醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）平板培养：将拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17接种至平板培养基上，进行厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24h，使菌种活化；
2）种子培养：将平板培养活化的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17接种到种子培养基中，100mL的厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
3）发酵产丁醇：将种子培养后的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)M17菌液接种到发酵培养基中，接种量按5～15%的体积百分比，充氮气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为70～90h，即可发酵产出丁醇。
4.根据权利要求3所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于：步聚1）所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中的至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于：步聚2）所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，碳源选自淀粉、葡萄糖中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种。
6.根据权利要求3所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于：步聚3）所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源3%～6%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05%～0.1%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、酵母粉中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种；生长因子选自对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中至少一种。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410086648.5A CN103898010B (zh) | 2014-03-10 | 2014-03-10 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
| PCT/CN2014/085470 WO2015135302A1 (zh) | 2014-03-10 | 2014-08-29 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410086648.5A CN103898010B (zh) | 2014-03-10 | 2014-03-10 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103898010A CN103898010A (zh) | 2014-07-02 |
| CN103898010B true CN103898010B (zh) | 2016-04-20 |
Family
ID=50989588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410086648.5A Expired - Fee Related CN103898010B (zh) | 2014-03-10 | 2014-03-10 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103898010B (zh) |
| WO (1) | WO2015135302A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898010B (zh) * | 2014-03-10 | 2016-04-20 | 广州甘蔗糖业研究所 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
| CN111662831A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-15 | 浙江工业大学 | 黑曲霉Rha-N1及其应用 |
| CN113247946B (zh) * | 2021-04-22 | 2022-07-05 | 哈尔滨工业大学 | 一种自组装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174433A (zh) * | 2011-01-18 | 2011-09-07 | 南京工业大学 | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 |
| CN102559778A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种发酵培养基及用该培养基发酵生产丁醇的方法 |
| CN102703523A (zh) * | 2012-07-03 | 2012-10-03 | 广西科学院 | 以甘蔗渣和糖蜜为原料混合发酵生产丁醇的方法 |
| CN103571772A (zh) * | 2013-11-08 | 2014-02-12 | 南京工业大学 | 一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101748114B (zh) * | 2008-12-12 | 2011-11-16 | 中国科学院微生物研究所 | 一种获得丁醇产生菌突变株的方法 |
| WO2013086458A1 (en) * | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Optinol, Inc. | Method for producing butanol and isopropanol |
| CN103898010B (zh) * | 2014-03-10 | 2016-04-20 | 广州甘蔗糖业研究所 | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 |
-
2014
- 2014-03-10 CN CN201410086648.5A patent/CN103898010B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2014-08-29 WO PCT/CN2014/085470 patent/WO2015135302A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174433A (zh) * | 2011-01-18 | 2011-09-07 | 南京工业大学 | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 |
| CN102559778A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种发酵培养基及用该培养基发酵生产丁醇的方法 |
| CN102703523A (zh) * | 2012-07-03 | 2012-10-03 | 广西科学院 | 以甘蔗渣和糖蜜为原料混合发酵生产丁醇的方法 |
| CN103571772A (zh) * | 2013-11-08 | 2014-02-12 | 南京工业大学 | 一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Butanol production from hemicellulosic hydrolysate of corn fiber by a Clostridium beijerinckii mutant with high inhibitor-tolerance;Ting Guo et al.;《Bioresource Technology》;20120817;第135卷;第379-385页 * |
| Clostridium beijerinckii mutant with high inhibitor tolerance obtained by low-energy ion implantation;Ting Guo et al.;《J Ind Microbiol Biotechnol》;20121231;第39卷(第3期);第401-407页 * |
| 拜氏梭菌13 － 2 发酵甘蔗渣水解液生产丁醇的研究;庞浩 等;《生物技术》;20111231;第21卷(第5期);第79-82页 * |
| 诱变选育拜氏梭菌利用碱处理木糖渣水解液生产丁醇;张婉璐 等;《可再生能源》;20120831;第30卷(第8期);第102-107页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015135302A1 (zh) | 2015-09-17 |
| CN103898010A (zh) | 2014-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102174433B (zh) | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 | |
| CN103571772B (zh) | 一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法 | |
| CN101880636B (zh) | 酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株 | |
| CN102719371B (zh) | 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法 | |
| CN102321671B (zh) | 一种生物预处理木质纤维素及同步糖化发酵产氢的方法 | |
| CN104328057A (zh) | 空间诱变高产纤维素酶的里氏木霉菌株 | |
| CN102199554A (zh) | 具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用 | |
| CN103820346B (zh) | 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用 | |
| CN101633896B (zh) | 一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用 | |
| CN103898010B (zh) | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 | |
| CN106554931A (zh) | 一株拜氏羧菌及其应用 | |
| CN108546660A (zh) | 甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用 | |
| CN105969702B (zh) | 粘质沙雷氏菌rz 21-c6及其应用 | |
| CN103421850A (zh) | 一种利用丰富栅藻生产生物乙醇的方法 | |
| CN102864113A (zh) | 产丁二酸的菌株及其生产丁二酸的方法和应用 | |
| CN103667147B (zh) | 一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用 | |
| CN103275886B (zh) | 一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌及利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法 | |
| CN102174434B (zh) | 一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用 | |
| CN103320367B (zh) | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 | |
| CN101864389A (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用 | |
| CN103497917B (zh) | 一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌 | |
| CN102226163A (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 | |
| CN102492634B (zh) | 一株耐高温酵母菌及其应用 | |
| CN113388525B (zh) | 红曲霉菌在处理超高浓度白酒废水中的应用 | |
| CN107164246A (zh) | 一种耐高温酵母菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Guo Ting Inventor after: Zhang Jiuhua Inventor after: Liu Ying Inventor after: Li Yuhong Inventor after: Yi Ximiao Inventor after: Chang Guowei Inventor after: Zeng Lianqiang Inventor after: Liang Dafeng Inventor before: Guo Ting Inventor before: Zhang Jiuhua Inventor before: Liang Dafeng Inventor before: Yi Ximiao Inventor before: Liu Ying Inventor before: Chang Guowei Inventor before: Zeng Lianqiang Inventor before: Li Yuhong |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: GUO TING ZHANG JIUHUA LIANG DAFENG YI XIMIAO LIU YING CHANG GUOWEI CENG LIANQIANG LI YUHONG TO: GUO TING ZHANG JIUHUA LIU YING LI YUHONG YI XIMIAO CHANG GUOWEI CENG LIANQIANG LIANG DAFENG |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 510316 Haizhuqu District, Guangdong Province, No. ten, road Patentee after: Guangdong Institute of Biotechnology (Guangzhou sugar cane sugar Research Institute) Address before: 510316 Haizhuqu District, Guangdong Province, No. ten, road Patentee before: Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160420 Termination date: 20190310 |