CN103275896A

CN103275896A - 蜡状芽孢杆菌及其在微生物转化制备l-草铵膦中的应用

Info

Publication number: CN103275896A
Application number: CN2013102013177A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 徐建妙; 徐永鑫; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103275896B

Abstract

本发明提供了一株可用于制备光学纯L-草铵膦的新菌种——蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ZJB-09280）及其在微生物制备L-草铵膦中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期2012年11月8日，保藏编号CCTCC NO：M2012450。本发明提供了一种具有立体选择性、可制备光学纯L-草铵膦的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的L-草铵膦；本发明通过筛选得到不同于以往研究的新菌种，从而为考察在手性拆分方面的微生物菌种的多样性、进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差异提供了基础。

Description

蜡状芽孢杆菌及其在微生物转化制备L-草铵膦中的应用

（一）技术领域

本发明涉及一株新的产腈水解酶菌株——蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）ZJB-09280，及其在微生物转化制备L-草铵膦中的应用。

（二）背景技术

草铵膦为广谱、触杀型、灭生性、非残留除草剂，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦只有L-型具有植物毒性。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50%，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

L-草铵膦可以采用不对称合成法和酶法合成来生产。酶法合成大体上可分为酶水解法、转氨酶法和酶拆分法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株可用于制备光学纯L-草铵膦的新菌种——蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，及其在微生物制备L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期2012年11月8日，保藏编号CCTCC NO：M2012450。

该新菌株的特征如下：

生理生化特征：阳性项目是：革兰氏阳性，糊精，D-麦芽糖，D-海藻糖，蔗糖，明胶，丙氨酸，精氨酸，L-谷氨酸，组氨酸，L-丝氨酸，果胶，D-半乳糖醛酸，肌苷，甘油，L-乳酸，L-苹果酸，醋酸，甲酸；全部阴性的项目是：柠檬酸，D-蜜二糖，D-棉子糖，D-乳糖，粘酸，D-山梨醇，D-阿拉伯糖醇，肌醇，对羟基苯乙酸，a-酮基丁酸，D-天冬氨酸。

本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：

1）将由全国各地采回的土样和污水样接种到富集培养基中，在30℃，150rpm的摇床上培养3天，待培养基变混浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养3天。如此重复4～5个循环。富集培养基以1g/L（终浓度）2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈为唯一氮源，再加入其他物质配方如下（终浓度）：葡萄糖（5g/L），氯化钠（1g/L），K₂HPO₄·3H₂O(0.8g/L)，KH₂PO₄(3.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，以自来水配制，pH为7。

2）最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基为富集培养基中加入20g/L的琼脂。

3）挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下（终浓度）：甘露醇（10g/L），酵母膏（3g/L），谷氨酸钠（10g/L），己内酰胺（7g/L），K₂HPO₄·3H₂O(0.75g/L)，KH₂PO₄(0.75g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，以自来水配制，pH为7；25～45℃下，摇瓶转速100～300rpm，培养48h～72h，离心后悬浮于蒸馏水体系中。然后利用液相色谱法筛选产腈水解酶的菌株。

4）对通过上述方法筛选到的产腈水解酶菌株，通过水解转化反应进行复筛。按照上述方法培养得到的菌体，离心后悬浮于蒸馏水体系中，加入2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物，进行转化；用柱前手性衍生化反相液相色谱法分析产物的含量及光学纯度。

柱前手性衍生化反相色谱法的具体操作条件为：美国戴安U3000液相色谱仪（配置荧光检测器），变色龙色谱工作站；戴安C18色谱柱；流动性为50mmol.L^-1醋酸铵缓冲溶液（pH5.7）-甲醇（90:10）流动相，流速为1mL/min；进样量20μL，柱温35℃，激发波长350nm，发射波长450nm。

通过考察了碳源、氮源、诱导剂与金属离子等培养基组分对蜡状芽孢杆菌ZJB-09280菌株酶活的影响，得到蜡状芽孢杆菌ZJB-09280的最佳产酶培养基组成为（终浓度）：葡萄糖10～15g/L，酵母膏10～15g/L，KH₂PO₄0.5～1g/L，K₂HPO₄0.5～1g/L，MnCl₂0.001～1g/L，尿素2～3g/L，溶剂为水。

蜡状芽孢杆菌ZJB-09280的最佳培养条件为：起始pH6.0～8.5，装液量5～30%，接种量1%～10%，培养温度20～30℃，摇床转速100～300rpm，培养时间24～72小时。

本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-09280在微生物转化制备L-草铵膦中的应用。

具体的，所述应用为：以外消旋2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈为反应底物，加入蜡状芽孢杆菌ZJB-09280经产酶培养获得的含酶菌体细胞，28～35℃摇床振荡条件下进行转化反应1～30小时，反应液经分离纯化得到所述L-草铵膦。

优选的，所述产酶培养在组成如下的产酶培养基中进行：葡萄糖10～15g/L，酵母膏10～15g/L，KH₂PO₄0.5～1g/L，K₂HPO₄0.5～1g/L，MnCl₂0.001～1g/L，尿素2～3g/L，溶剂为水，pH6.0～8.5。

优选的，所述产酶培养在20～30℃、100～300rpm条件下进行，培养时间24～72小时。

优选的，所述转化反应在pH7.0～8.9的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中进行。优选的，底物添加量为0.1～10mmol/mL缓冲液，含酶菌体细胞添加量以湿重计为10～100mg/mL缓冲液。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有立体选择性、可制备光学纯L-草铵膦的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的L-草铵膦；本发明通过筛选得到不同于以往研究的新菌种，从而为考察在手性拆分方面的微生物菌种的多样性、进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差异提供了基础。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株的分离

产腈水解酶产生菌的分离：在9mL0.85%（w/w）的生理盐水中加入1g土样、适量玻璃珠，摇匀，使成均匀的土壤悬液；吸取0.5mL的土壤悬液接种到装有30mL富集培养基的250mL的三角瓶中，置于30℃，150rpm的摇床培养3天，等富集液出现浑浊后，再吸取0.5mL转接到新鲜的培养基中，继续培养3天；如此重复4～5个循环后，将富集液稀释多个梯度，涂布到分离平板上，获得单菌落；

富集培养基以2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈为唯一氮源，组成如下（终浓度）：葡萄糖（5g/L），氯化钠（1g/L），K₂HPO₄·3H₂O(0.8g/L)，KH₂PO₄(3.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，以自来水配制，pH为7；挑取的单菌落接种到富集培养基中，培养48h、72h后取样，用柱前手性衍生化反相液相色谱法检测产物L-草铵膦的对应体过量值(e.e.值)，筛选获得一株e.e.值超过90％的菌株，该菌株被鉴定为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，即为所述的微生物蜡状芽孢杆菌ZJB-09280（CCTCC NO：M2012450）。

实施例2：菌株的培养

斜面培养基组成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，自来水配制后制成斜面；

于平板上挑取蜡状芽孢杆菌ZJB-09280的单菌落，接种至斜面，于30℃恒温培养箱内培养48h后，放入4℃冰箱内保藏备用。

实施例3：湿菌体细胞的获得

培养基配制：葡萄糖15g/L，酵母膏12g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄1g/L，MnCl₂0.005g/L，尿素3g/L，溶剂为水，pH7.0。

250ml摇瓶装液量10mL，接种一环蜡状芽孢杆菌ZJB-09280，于30℃、150rpm振荡培养48h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，悬浮于蒸馏水中，得湿菌体细胞含量为0.1g/10mL的菌悬液，备用。

实施例4：湿菌体细胞的获得

培养基配制：葡萄糖12g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄0.75g/L，K₂HPO₄0.75g/L，MnCl₂0.001g/L，尿素2.5g/L，溶剂为水，pH7.5。

250ml摇瓶装液量10mL，接种一环蜡状芽孢杆菌ZJB-09280，于30℃、150rpm振荡培养48h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，悬浮于100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，得湿菌体细胞含量为0.5g/10mL的菌悬液，备用。

实施例5：

取pH7.5的磷酸盐缓冲溶液50mL，加入10mL实施例3所得菌悬液；并加入30mmol的外消旋2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物。于30℃恒温水浴摇床振荡反应24小时。反应液离心，取上清液，经液相检测，产物L-草铵膦的光学纯度90.5%e.e.。

实施例6：

取100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液50mL，加入10mL实施例3所得菌悬液；并加入60mmol外消旋2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物。于30℃恒温水浴摇床振荡反应24小时。反应液离心，取上清液，经液相检测，产物L-草铵膦的光学纯度91%e.e.

实施例7：

取100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液50mL，加入10mL实施例4所得菌悬液；并加入30mmol外消旋2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物。于30℃恒温水浴摇床振荡反应24小时。反应液离心，取上清液，经液相检测，产物L-草铵膦的光学纯度95%e.e.。

实施例8：

取100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液50mL，加入10mL实施例4所得菌悬液；并加入60mmol外消旋2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物。于30℃恒温水浴摇床振荡反应24小时。反应液离心，取上清液，经液相检测，产物L-草铵膦的光学纯度95%e.e.。

Claims

1.蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期2012年11月8日，保藏编号CCTCC NO：M2012450。

2.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-09280在微生物转化制备L-草铵膦中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以外消旋2-氨基-4-羟基甲基磷酰基-丁腈为反应底物，加入蜡状芽孢杆菌ZJB-09280经产酶培养获得的含酶菌体细胞，28～35℃摇床振荡条件下进行转化反应1～30小时，反应液经分离纯化得到所述L-草铵膦。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产酶培养在组成如下的产酶培养基中进行：葡萄糖10～15g/L，酵母膏10～15g/L，KH₂PO₄0.5～1g/L，K₂HPO₄0.5～1g/L，MnCl₂0.001～1g/L，尿素2～3g/L，溶剂为水，pH6.0～8.5。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产酶培养在20～30℃、100～300rpm条件下进行，培养时间24～72小时。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应在pH7.0～8.9的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中进行。