CN102031247B - 一种腈水解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法和应用。本发明提供的腈水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。本发明提供的腈水解酶可以通过对Arthrobacternitroguajacolicus菌进行发酵而获得。本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，反应的水解副产物少，条件温和，时空产率高，此外，3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。

Description

一种腈水解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶学领域，具体地说，涉及一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法和应用。

背景技术

腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，可以催化腈水解生成相应的羟基酸。由于天然腈化物的广泛存在，使很多微生物都或多或少具有降解腈化物的能力。目前已有多种微生物来源的腈水解酶被报道，其反应底物多种多样，具体如以下表1所示：

表1、用于制备腈水解酶的菌株及其对应的水解底物

3-羟基丁酸俗称β-羟基丁酸，英文名称为3-hydroxybutyric acid或DL-β-hydroxybutyricacid，其分子式为C₄H₈O₃，分子量104.10，CAS号为625-71-8，结构式：

3-羟基丁酸有两种构型的对映体，分别为(R)-3-羟基丁酸[CAS：625-72-9]和(S)-3-羟基丁酸[CAS：6168-83-8]。

3-羟基丁酸在医药领域中的用途广泛，例如(R)-3-羟基丁酸不仅可用于治疗癌症、糖代谢紊乱等疾病，还具有抑制酮体水平异常提高，减少自由基伤害，加强代谢效率等功效(WO2004108740)。同时，在可降解塑料合成中，3-羟基丁酸也有应用价值，例如，以其为基础可得到3-羟基脂肪酸，进而制备具有生物可降解性和生物相容性的热塑性材料聚羟基脂肪酸酯(PHB)。因此，制备3-羟基丁酸具有重要意义。

但现有工艺中，制备3-羟基丁酸主要通过化学方法，如β-丁内酯的水解、Reformatsky反应、还原法、丁烯酸水合制备、萘锂催化剂制备以及水解法或氧化法等方法制备，但采用上述化学法具有以下不足：合成工艺复杂，反应条件比较苛刻，对设备要求高，金属催化剂价格昂贵，易造成污染，对环保不利等。

而生物法催化腈水解副产物少，反应条件温和，但目前发现的腈水解酶中还没有哪一种酶能够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

发明内容

本申请的发明人在长期的研究中，找到了一种微生物来源的新的腈水解酶，其能够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

因此，本发明的首要目的就在于，提供一种微生物来源的腈水解酶。

本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的应用。

本发明提供的腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

根据本发明的一个优选实施例，该腈水解酶的DNA序列如SEQ ID NO：19所示。

根据本发明，所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus菌。

本发明提供的腈水解酶，通过发酵Arthrobacter nitroguajacolicus菌而获得。

本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

本发明提供了一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且反应的水解副产物少，反应条件温和，时空产率高。此外，由于3-羟基丁腈的水溶性好，因此水解反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。

附图说明

图1是细胞破碎离心后的上层粗酶液和放置8h后的上层粗酶液进行电泳检测的检测结果，其中，泳道1为直接检测的结果，泳道2为放置8h后的检测结果。

图2是经苯基疏水柱纯化后P3-P7号接收段溶液及粗酶液的蛋白质电泳检测结果，其中，泳道1-5分别为P7-P3号接收段的检测结果，泳道6为粗酶液的检测结果。

图3是经丁基疏水柱纯化后B2号接收段溶液的蛋白质电泳检测结果。

图4是回收酶切后的基因组和质粒的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1是基因组0.5-1kb部分的电泳结果，泳道2是基因组1-2kb部分的电泳结果，泳道3是基因组2-4kb部分的电泳结果，泳道4是pUC18的电泳结果。

图5是转化子质粒验证的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1-12是不同转化子质粒的电泳结果。

图6是片段NYNit9的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1是NYNit9。

图7是片段NYNit10的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分别是巢式PCR第一轮扩增和第二轮扩增的检测结果。

图8是片段NYNit11的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分别是巢式PCR第一轮扩增和第二轮扩增的检测结果。

图9是片段NYNit12的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分别是巢式PCR第一轮扩增和第二轮扩增的检测结果。

图10是NYNit和pET32a经双酶切后的凝胶电泳检测结果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分别是酶切后的NYNit和pET32a。

图11是重组质粒的酶切验证结果，其中，泳道M是Marker，泳道1是使用EcoR I+Sal I双酶切的结果，泳道2是BamH I单酶切的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

以下实施例中，所使用的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，已于2008年3月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.2405。

以下实施例中，用于发酵培养Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405菌株的培养基配方如下：

斜面培养基(wt％)：葡萄糖1.0％、酵母膏0.3％、NaCl 0.1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、琼脂粉2％。

发酵培养基(wt％)：葡萄糖1.5％、蛋白胨1.0％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、谷氨酸纳0.075％、半胱氨酸盐酸盐0.015％、苯甲腈0.025％(体积)，pH7.0。

以下实施例中，使用的Glassmilk采用以下方法获得：使用PBS缓冲液浸泡处理购自Sigama公司的硅胶S5631。

以下实施例中，PCR扩增条件如下：

扩增体系(20μl)：正向引物，1-2μl；反向引物，1-2μl；模板，1μl；dNTP，2μl；10×PCR Buffer，2μl；Taq，1μl；DMSO，1μl；ddH₂O，9-11μl；其中，当引物为特异性引物时，加入量为1μl，为简并引物时，加入量2μl。

扩增程序：

基因文库筛选：95℃4min→(95℃40s→50℃40s→72℃3min)30个循环→72℃10min；

NYNit9-NYNit12扩增：95℃4min→(95℃40s→55℃40s→72℃1min)30个循环→72℃10min。

以下实施例中，酶活的检测方法如下：

1体积的酶液或细胞液加1/20体积的丙烯腈(99.0％)，反应1小时后加入盐酸终止反应，气相色谱分析产物丙烯酸含量。

酶活单位定义：1毫升酶液反应1小时产生1个ppm的酸为1个单位。

以下实施例中，测定水解产物3-羟基丁酸的含量的方法采用高效液相色谱法，具体如下：

检测条件：色谱柱为150mm×4.6mm，不锈钢柱，内装Kromasil ODS C₁₈、5u的填充物；流动相为磷酸二氢钠缓冲液∶乙腈＝95∶5(V/V)；流速为0.5ml/min；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为20μL。

检测方法：称取3-羟基丁酸标准品0.1g，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。称取约含3-羟基丁酸0.1g的样品，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。

在上述色谱条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准品溶液，待相邻两针标准品溶液峰面积的响应值变化小于1.0％时，按照标样、样品、样品、标样的顺序进行测定。将测得的两针样品以及前后两针标样的峰面积进行平均。试样的质量分数X％按以下公式计算：

$X=\frac{m_1\×A_2}{m_2\×A_1}\×P$

其中，

A₁为标准品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；

A₂为样品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；

m₁为称取3-羟基丁酸标准品的质量，g；

m₂为称取试样的质量，g；

P为标准品中3-羟基丁酸标准品的质量分数，％。

实施例1、发酵菌株培养及发酵液检测

1.1、发酵菌株培养

挑取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405，接种至斜面培养基，于28℃培养4天；然后，从斜面挑取培养好的菌株，转移到发酵培养基中，于220rpm、28℃培养3-4天，获得发酵液。

1.2、酶液稳定性检测

取步骤1.1获得的发酵液25ml，浓缩5倍，使用10mM Tris-HCl缓冲液进行细胞悬浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下：

超声2秒、间歇5秒、功率700～800W、时间0.5小时。

破碎后的细胞溶液于15000rpm离心30～40分钟，收集上层粗酶液。

将收集到的离心上清放置8h后，进行蛋白质电泳检测，同时以未经放置的离心上清作为对照，检测结果如图1所示。

图1的检测结果显示，随着放置时间的延长，酶液中分子量约30kDa的蛋白质增加，而分子量大于30kDa的蛋白质减少，上述结果说明破碎细胞后获得粗酶液中的目标蛋白不稳定、易降解，降解后的单体的分子量约为30kDa。

然后，采用上述方法，分别检测了该酶在HEPES、磷酸钾缓冲液等多种缓冲体系中的稳定性，结果显示在高浓度磷酸钾缓冲体系中，此酶稳定性较好。

因此，在下述发酵液进行预处理时，使用0.5M pH7.2的磷酸钾缓冲液(含1mM DTT)进行细胞悬浮。

1.3、发酵液预处理

将步骤1.1获得的发酵液浓缩5倍，然后使用0.5M pH7.2的磷酸钾缓冲液(含1mMDTT)进行细胞悬浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下：

超声2秒、间歇5秒、功率700～800W、时间1～1.5小时。

破碎后的细胞溶液于15000rpm离心30～40分钟，收集上层粗酶液。

实施例2、蛋白纯化

将实施例1中获得的上层粗酶液进行饱和硫酸铵分级沉淀，并收集0～35％饱和度下的沉淀。

然后，用0.5M pH7.2磷酸钾缓冲液溶解粗酶沉淀，将获得的粗酶液经苯基疏水柱纯化，并收集洗脱液，同时检测洗脱液的酶活和蛋白含量，再将收集到的比酶活较高部分使用丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下：

1、苯基疏水柱(Phenyl-650C)

柱床：高12cm×直径1cm，体积9.4ml；

流速：0.1ml/min吸附、1ml/min洗柱(0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.2)、0.1ml/min洗脱(去离子水)；

上柱量：2ml(6.42mg/ml)。

以1.5～2ml为一个接收段，并以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接收液的A280值后等体积加入1M、pH7.2磷酸钾缓冲液。

在接收了约6ml液体后，A280较空白对照明显上升，将A280明显上升的几段接收液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表2所示，其中，P0为上柱前的粗酶液，P2-P7为A280明显的几段接收液。

表2、苯基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果

编号	蛋白质浓度(mg/ml)	浓缩后体积(ml)	蛋白质总量(mg)	回收率(％)	酶活	比酶活
							P0	6.42	2(未浓缩)	12.84	/	309746	24124
P2	1.74	0.48	0.84	6.5	无	/
							P3	4.14	0.33	1.37	10.7	无	/
P4	4.08	0.44	1.80	14.0	195500	108611
							P5	4.68	0.25	1.17	9.1	211396	180680
P6	5.46	0.31	1.69	13.2	73386	43424
							P7	1.92	0.48	0.92	7.2	20210	21967

根据表2的结果，将P0以及P3～P7号接收段溶液进行蛋白质电泳检测，电泳结果如图2所示，根据检测结果，将比酶活较高的两段接收液P4和P5合并。

重复苯基疏水柱纯化步骤，以获得足够用于丁基疏水柱纯化的接收液，然后使用丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下：

2、丁基疏水柱(Butyl-650C)

柱床：高12cm×直径1cm，体积9.4ml；

流速：0.1ml/min吸附、1ml/min洗柱(0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.2)、0.1ml/min洗脱(去离子水)；

上样量：1ml(3.12mg/ml)。

以约1.5ml为一个接收段，以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接收液的A280值后等体积加入1M、pH7.2磷酸钾缓冲液。

在接收了约6ml液体后，A280较空白对照开始有所上升，将A280明显的几段接收液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表3所示，其中，B0为上柱前的酶液，B1～B6为A280明显的几段接收液。

表3、丁基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果

编号

蛋白质浓度(mg/ml)

浓缩后体积(ml)

蛋白质总量(mg)

回收率(％)

酶活

比酶活

B0

3.12

1(未浓缩)

3.12

/

53420

17122

B1

0.33

0.27

0.09

2.9

无

/

B2	4.98	0.21	1.05	33.7	25472	24259
							B3	1.02	0.29	0.30	9.6	无	/
B4	0.24	0.3	0.07	2.2	无	/
							B5	0.17	0.14	0.24	7.7	无	/
B6	0.10	0.25	0.03	1.0	无	/

根据表3的结果，取B2段接收液进行蛋白质电泳检测，电泳检测结果如图3所示。

上述结果显示：上完第一根苯基疏水柱后的比酶活较高的酶液仍能在30～40kDa范围里看到明显的大于30kDa分子量条带；而上完第二根丁基疏水柱后，收集到的酶液中仅见到分子量近30kDa的小分子量条带。

实施例3、蛋白检测

3.1、N端氨基酸序列测定

将实施例2中经丁基疏水柱纯化获得的酶进行N端测序，检测结果显示，该酶的N端二十个氨基酸的序列为NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD。

然后，将测定序列进行Blastp比对，比对结果显示，实施例2中获得的酶与腈水解酶的氨基酸序列具有很高的同源性，因此，有可能为目的蛋白--腈水解酶。

3.2、全长DNA序列测定

参考《精编分子生物学实验指南(第四版)》(科学出版社)中的实验方法，提取实施例1.1中获得的菌株的基因组。

用BamHI完全酶切菌株基因组和载体pUC18质粒(购自上海生工)，用Glassmilk回收酶切后基因组和质粒，并将回收的基因组片段和质粒片段进行凝胶电泳检测，结果如图4所示，然后根据估计的浓度，将回收的质粒和基因组以摩尔比1∶3配制连接体系，进行连接并转化大肠杆菌DH5α，然后培养，获得近6000个转化子，从而获得构建好的基因文库。

然后从构建好的基因文库中随机挑取12个转化子，培养后提取质粒，用BamHI酶切验证，结果如图5所示。根据图5结果，在上述转化子中，不仅有11个转化子为具有插入的基因组片段的重组转化子(因此，构建的基因文库中重组转化子约占90％)，而且有多个转化子中插入了多条插入片段。

用无菌水从转化平板上洗下菌落，并以100个菌落设为一组，离心后吸去部分上清，使得每组细胞都悬浮于约100μl上清中，将其作为下述测序过程中PCR扩增步骤的模板。

根据对比文献，此菌株与Streptomyces coelicolor 3A(2)具有较高同源性(Citation：Mongodin EF，Shapir N，Daugherty SC，DeBoy RT，Emerson JB，et al.(2006)Secrets of soilsurvival revealed by the genome sequence of Arthrobacter aurescens TC1.PLoS Genet 2(12)：e214.doi：10.1371/journal.pgen.0020214)，因此，使用Vector软件分析酶的N端氨基酸序列NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD后，参考Streptomyces coelicolor 3A(2)的密码子频率表(www.kazusa.or.jp/codon)设计简并引物nit10，其序列如SEQ ID NO：6所示。

由于基因组插入载体时存在两个方向，因此在pUC18质粒BamHI酶切位点两侧各设计一组嵌套引物，分别为P1-P4，其序列分别如SEQ ID NO：11-14所示。

其中，P1和P2为一组嵌套引物，P3和P4为另一组嵌套引物。

然后，使用引物nit10与P1-P4组合进行巢式PCR扩增，具体方法如下：

将引物nit10先分别与P2、P4组合进行PCR扩增，再以扩增获得的产物为模板，使用引物nit10分别与P1、P3组合进行PCR扩增，

扩增产物经凝胶电泳检测，确定获得2条大小在1-2kb的阳性扩增条带(分别命名为NYNit1和NYNit2)，将扩增条带进行测序，然后进行Blastn比对，比对结果显示上述2条条带都不是目标DNA，其中，NYNit1序列与菌株Arthrobacter aurescens TC1基因组中的3010979-3012170bp的序列有极高同源性(87％同源性)。

然后在Arthrobacter aurescens TC1全基因组中搜索THPQFKAAVVQAAPVFLNLD序列，找到一个注释为nitrilase(腈水解酶)的基因AAur_1898(1035bp)，经分析，其翻译得到的蛋白质(344aa)N端的氨基酸序列与测序得到的氨基酸序列完全相同，并且其大小(约36kD)与纯化过程中SDS-PAGE电泳显示的大小相近，但此基因被标注为有移码突变的假基因，即为不具备功能的基因。

基于与AAur_1898间极高的同源性，因此，参考由AAur_1898翻译的蛋白质序列中179-184氨基酸序列NEQVHV，设计简并引物nit22(序列如SEQ ID NO：7所示)，将简并引物nit22与简并引物nit10组合进行PCR扩增，然后将扩增产物经凝胶电泳检测，结果如图6所示，根据图6结果，得到了一条与预期大小(500bp)相近的扩增条带(命名为NYNit9)，将NYNit9测序并与AAur_1898比对，结果显示NYNit9序列如SEQ ID NO：15所示，其大小为549bp，与AAur_1898相比只有4处碱基不同，分别为SEQ ID NO：15中15、123、261和474bp处的碱基，而翻译得到的蛋白质序列则完全相同。

然后，将NYNit9序列向3’端延伸扩增，具体过程如下：

根据NYNit9的25-48bp和418-435bp处的序列，分别设计两条特异性引物nitsp2(序列如SEQ ID NO：1所示)和nitsp4(序列如SEQ ID NO：2所示)，其中nitsp4位于nitsp2的下游，再参考AAur_1898翻译的蛋白质序列的最末端的7个氨基酸LPDMAEL设计简并引物nit23(序列如SEQ ID NO：8所示)。

然后，使用nit23与nitsp2和nitsp4组合进行巢式PCR扩增，具体过程如下：

先以引物nit23与nitsp2组合，菌株基因组为模板进行第一轮PCR扩增，再以扩增获得的产物为模板，用引物nit23与nitsp4组合进行第二轮PCR扩增。

经凝胶电泳检测，结果如图7所示，根据图7结果，得到一条约600bp大小的扩增条带(命名为NYNit10)，将NYNit10进行测序并与AAur_1898比对，结果显示，NYNit10序列如SEQ ID NO：16所示，与AAur_1898相比，只有5处碱基不同，分别为SEQ ID NO：16中34、184、208、247和253bp处的碱基，而翻译得到的蛋白质序列也只有一个氨基酸的差异。

由于简并扩增得到的序列在简并引物处是不准确的，因此，需要再次向3’端延伸扩增以得到准确的3’端DNA序列，同时还要向5’端延伸扩增以获得完整的5’端序列，具体过程如下：

参考Arthrobacter aurescens TC1 AAur_1898下游基因AAur_1899(oxdA)编码的蛋白质中的氨基酸序列MWELCAN(76-82位点)设计简并引物nit24(序列如SEQ ID NO：9所示)，并根据NYNit9的508-528bp处序列设计特异性引物nitsp5(序列如SEQ ID NO：3所示)。

然后，使用nit24与nitsp2和nitsp5组合进行巢式PCR扩增，具体过程如下：

以引物nit24与nitsp2组合，菌株基因组为模板进行第一轮PCR扩增，再以扩增获得的产物为模板，用引物nit24与nitsp5组合进行第二轮PCR扩增。

将扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图8所示，根据图8结果，获得目标扩增条带(命名为NYNit11)，并将NYNit11测序，结果如SEQ ID NO：17所示。

参考上游基因AAur_1897(AraC family)编码的蛋白质中的氨基酸序列FWTEAVS(18-24位点)设计简并引物nit25(序列如SEQ ID NO：10所示)，并根据NYNit9的253-273bp和301-318bp处序列分别设计了特异性引物nitsp6(序列如SEQ ID NO：4所示)和nitsp7(序列如SEQ ID NO：5所示)，其中nitsp7在nitsp6下游。

然后，使用nit25与nitsp6和nitsp7组合进行巢式PCR扩增，具体过程如下：

先以引物nit25与nitsp7组合，菌株基因组为模板进行第一轮PCR扩增，再以扩增获得的产物为模板，用引物nit25与nitsp6组合进行第二轮PCR扩增，

将扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图9所示，根据图9结果，获得目标扩增条带(命名为NYNit12)，并将NYNit12测序，结果如SEQ ID NO：18所示。

将NYNit11和NYNit12的测序结果与NYNit9、NYNit10的测序结果进行比对拼接，得到了此菌株的完整的、可能具有编码腈水解酶的基因序列，命名为NYNit，其序列如SEQ ID NO：19所示，与AAur_1898相比，有8处碱基不同(分别如SEQ ID NO：19中下划线所示)，由该序列翻译获得的蛋白质序列如SEQ ID NO：20所示，命名为NYNitp，与AAur_1898序列对应的氨基酸序列相比，有一个氨基酸的差异(如SEQ ID NO：20中下划线所示)。

为确定NYNit是否具有编码腈水解酶的功能，即NYNitp是否为腈水解酶，在下述实施例中构建了包含其基因序列的基因工程菌，并进行了诱导培养和水解试验，具体详见实施例4和实施例5。

实施例4、基因工程菌构建

使用pET-32a(+)(购自Novagen公司)作为表达载体，在其多聚克隆位点EcoR I和Sal I间插入NYNit，具体过程如下：

根据基因NYNit两端DNA序列设计引物，在其5’端加上EcoR I酶切位点，3’端加上Sal I酶切位点，从而保证插入序列的方向及翻译阅读框都正确，其中，使用的引物分别为NYNit1和NYNit2，其序列分别如SEQ ID NO：21和22所示。

以菌株基因组为模板，通过PCR扩增得到5’端加上EcoR I酶切位点，3’端加上SalI酶切位点的NYNit。

然后，使用EcoR I和Sal I分别双酶切NYNit和pET32a，再使用Glassmilk分别回收酶切片段，并进行凝胶电泳检测，结果如图10所示，然后根据估计的浓度，将回收的pET-32a(+)片段和NYNit片段以摩尔比1∶3配制连接体系进行连接并转化大肠杆菌DH5α，再将得到的转化子培养，提取质粒，并进行酶切验证(分别为EcoR I+Sal I双酶切和BamH I单酶切，结果如图11所示)和PCR验证，挑出正确的重组质粒，命名为pETNYNit，然后将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到工程菌，命名为BL21(DE3)/pETNYNit。

实施例5、水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸

将实施例4中获得的工程菌BL21(DE3)/pETNYNit培养并诱导表达，检测酶活，具体过程如下：

接30μl甘油保藏菌液于3ml LB培养基(含终浓度100μg/ml Amp)，37℃、250rpm培养约3小时至OD600值约0.5，然后转接0.6ml菌液于20ml LB培养基(含终浓度100μg/mlAmp)中，于37℃培养3.5小时至OD600值约0.2(稀释10倍后)，加入IPTG(终浓度0.5mM)，于30℃诱导培养8-15小时，菌液浓缩20倍，测得酶活近9万。

然后将此酶用于水解3-羟基丁腈，具体过程如下：

取300μl酶液，加入3-羟基丁腈至终浓度为1％，30℃反应20小时，然后，检测获得的3-羟基丁酸含量，根据检测结果，生成的3-羟基丁酸的含量为0.96％。

根据上述结果，NYNitp为腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且反应条件温和，此外，由于3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，因而可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸的工业化生产。

综上所述，本发明提供了一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且具有很高的工业化生产潜力。

序列表

<110>上海市农药研究所

<120>一种腈水解酶及其制备方法和应用

<130>P5091064

<160>22

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>1

gtagttcagg cagcaccggt attc    24

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>2

ggcgaaggcg acggaagc           18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>3

tccaagtacg ccatgtacgc c       21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>4

cttggctgcc ttcgagatcc g       21

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>5

gccgtggcgt tcgctcag    18

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>简并引物

<400>6

Ala Cys Ser Cys Ala Cys Cys Cys Ser Cys Ala Arg Thr Thr Tyr Ala

1               5                   10                  15

Ala Arg

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>简并引物

<400>7

Ser Ala Cys Arg Thr Gly Ser Ala Cys Tyr Thr Gly Tyr Thr Cys Arg

1               5                   10                  15

Thr Thr

<210>8

<211>21

<212>PRT

<213>简并引物

<400>8

Ser Ala Arg Tyr Thr Cys Ser Gly Cys Cys Ala Thr Arg Thr Cys Asn

1               5                   10                  15

Gly Gly Asn Ala Arg

            20

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>简并引物

<400>9

Arg Thr Thr Ser Gly Cys Arg Cys Ala Asn Ala Arg Tyr Thr Cys Cys

1               5                   10                  15

Cys Ala Cys Ala Thr

            20

<210>10

<211>21

<212>PRT

<213>简并引物

<400>10

Ala Ser Trp Asn Ala Cys Val Gly Cys Tyr Thr Cys Val Gly Thr Cys

1               5                   10                  15

Cys Ala Arg Ala Ala

            20

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>11

gatgtgctgc aaggcgat      18

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>12

gcctcttcgc tattacgcc     19

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>13

gtgtggaatt gtgagcgga     19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>14

cggctcgtat gttgtgtgg                                                 19

<210>15

<211>549

<212>DNA

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>15

acccaccccc agtttaaggc agccgtagtt caggcagcac cggtattcct caatttggac    60

aagaccatcg ataaaacgat cgccttgatc gaggacgcgg cccgtaacgg cgcggagatc    120

atcgcgttcc ccgagacctg gctcccgggt tacccatggt acgcctggct cgacgcccct    180

gccctgtggc taccgcaata cacccaacgc tacttcgata attccctcga gtacggcact    240

ccccaggctg agcggatctc gaaggcagcc aaggaaaaca acatcatggt cagcatgggc    300

ctgagcgaac gccacggcgg cagcctctac atcgctcaat ggttcatcga cagtgaaggg    360

cagaccatct cccagcgccg caagctcaag cccacctttg tggagcgcac catcttcggc    420

gaaggcgacg gaagcgacct tgccgtctgg gacaccaagc tgggccgcgt cggagggctc    480

tgctgctggg agcacctgca gccactgtcc aagtacgcca tgtacgccca aaacgaacaa    540

gtccacgtg                                                            549

<210>16

<211>593

<212>DNA

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>16

caggtacaat tggtaacagc tgggccgcgt cggagggctc tgctgctggg agcacctgca   60

gccactgtcc aagtacgcca tgtacgccca aaacgagcag gtccacgtcg ccgcatggcc   120

aagcttttcc ctttatgaag gtggcgctta cgccctcggc cctgaggtca acagttccgc    180

ctcacggatc tatgccgtgg aaggccagtg cttcgtcctg gctccttgcg ccaccgtatc    240

ccaggacatg gtggacgaaa tgtgcaccac cgacatgcag aaggcactcc tgaaaaccgg    300

cggcggacat gcccgcatct tcggacccga cggccagcaa ctccacgaat ccctcccgga    360

aaaccaggaa ggcctcatct acgctgagat agatctgggt ctcatctcag cgtcgaagac    420

tatttccgac cccgcaggcc actacgcccg ccccgatgtc acccagctgg tcctcaacaa    480

ggttcctcgg cgggccgtca tcgacgccgc cccgccagcg gattccgccc ccggtcctga    540

acagttccgc cacgtagagg agccagcgct accagattgc ccggaattga agc           593

<210>17

<211>731

<212>DNA

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>17

agcagtccgt cgccgcatgg ccagcttttc cctttatgaa ggtggcgctt acgccctcgg    60

ccctgaggtc aacagttccg cctcacggat ctatgccgtg gaaggccagt gcttcgtcct    120

ggctccttgc gccaccgtat cccaggacat ggtggacgaa atgtgcacca ccgacatgca    180

gaaggcactc ctgaaaaccg gcggcggaca tgcccgcatc ttcggacccg acggccagca    240

actccacgaa tccctcccgg aaaaccagga aggcctcatc tacgctgaga tagatctggg    300

tctcatctca gcgtcgaaga ctatttccga ccccgcaggc cactacgccc gccccgatgt    360

cacccagctg gtcctcaaca aggttcctcg gcgggccgtc atcgacgccg ccccgccagc    420

ggattccgcc cccggtcctg aacagttccg ccacgtagag gagccagcgc ttccagacat    480

ggcggaactc tagatggctc ctgacccaag ccggcaagac ccggctattg agtcttcgat    540

cccgagacac ctcactgtcg aacggacgcg cccgaagcgg gcaggtgctg gctatacgcc    600

gccctatccg tcctactccg tgcgattcgc ggaaggcgtc agcaatcttg tttgcgcctt    660

cctcggcgtc caaagcaggg cgccgctctc tcacgaggcg aaagtagctt ccgctggaat    720

gtgggatttg t                                                         731

<210>18

<211>505

<212>DNA

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>18

gagggccgtg cgtactcgag ggattatcga agtagcgttg ggtgtattgc ggtagccaca    60

gggcaggggc gtcgagccag gcgtaccatg ggtaacccgg gagccaggtc tcggggaacg    120

cgatgatctc cgcgccgtta cgggccgcgt cctcgatcaa ggcgatcgtt ttatcgatgg    180

tcttgtccaa attgaggaat accggtgctg cctgaactac ggctgccttg aactgggggt    240

gggtcattgg gatctcctaa agcatgtgat gcgagtcata aactgaatgc atttccacgg    300

taagtctcaa ttccgaagga ttcttgatcg agaatcgcag gaacgttgac tgcgagtgtc    360

acgttgaatg cacccccgcc tcccttctga aatagaccgc agagtgggcg cagggcgacg    420

gtaagatggg gcatggccaa ggttgtgagc acagcggcgg tgtctccccg gaacagtgtt    480

tcgttctgga ctgagccggt gtaag                                          505

<210>19

<211>1035

<212>DNA

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>19

atgacccacc cccagttcaa ggcagccgta gttcaggcag caccggtatt cctcaatttg    60

gacaagacca tcgataaaac gatcgccttg atcgaggacg cggcccgtaa cggcgcggag    120

atcatcgcgt tccccgagac ctggctcccg ggttacccat ggtacgcctg gctcgacgcc    180

cctgccctgt ggctaccgca atacacccaa cgctacttcg ataattccct cgagtacggc    240

actccccagg ctgagcggat ctcgaaggca gccaaggaaa acaacatcat ggtcagcatg    300

ggcctgagcg aacgccacgg cggcagcctc tacatcgctc aatggttcat cgacagtgaa    360

gggcagacca tctcccagcg ccgcaagctc aagcccacct ttgtggagcg caccatcttc    420

ggcgaaggcg acggaagcga ccttgccgtc tgggacacca agctgggccg cgtcggaggg    480

ctctgctgct gggagcacct gcagccactg tccaagtacg ccatgtacgc ccaaaacgag    540

caggtccacg tcgccgcatg gccaagcttt tccctttatg aaggtggcgc ttacgccctc    600

ggccctgagg tcaacagttc cgcctcacgg atctatgccg tggaaggcca gtgcttcgtc    660

ctggctcctt gcgccaccgt atcccaggac atggtggacg aaatgtgcac caccgacatg    720

cagaaggcac tcctgaaaac cggcggcgga catgcccgca tcttcggacc cgacggccag    780

caactccacg aatccctccc ggaaaaccag gaaggcctca tctacgctga gatagatctg    840

ggtctcatct cagcgtcgaa gactatttcc gaccccgcag gccactacgc ccgccccgat    900

gtcacccagc tggtcctcaa caaggttcct cggcgggccg tcatcgacgc cgccccgcca    960

gcggattccg cccccggtcc tgaacagttc cgccacgtag aggagccagc gcttccagac    1020

atggcggaac tctag                                                     1035

<210>20

<211>344

<212>PRT

<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405

<400>20

Met Thr His Pro Gln Phe Lys Ala Ala Val Val Gln Ala Ala Pro Val

1               5                   10                  15

Phe Leu Asn Leu Asp Lys Thr Ile Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Glu

            20                  25                  30

Asp Ala Ala Arg Asn Gly Ala Glu Ile Ile Ala Phe Pro Glu Thr Trp

        35                  40                  45

Leu Pro Gly Tyr Pro Trp Tyr Ala Trp Leu Asp Ala Pro Ala Leu Trp

    50                  55                  60

Leu Pro Gln Tyr Thr Gln Arg Tyr Phe Asp Asn Ser Leu Glu Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Thr Pro Gln Ala Glu Arg Ile Ser Lys Ala Ala Lys Glu Asn Asn Ile

                85                  90                  95

Met Val Ser Met Gly Leu Ser Glu Arg His Gly Gly Ser Leu Tyr Ile

            100                 105                 110

Ala Gln Trp Phe Ile Asp Ser Glu Gly Gln Thr Ile Ser Gln Arg Arg

        115                 120                 125

Lys Leu Lys Pro Thr Phe Val Glu Arg Thr Ile Phe Gly Glu Gly Asp

    130                 135                 140

Gly Ser Asp Leu Ala Val Trp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Val Gly Gly

145                 150                 155                 160

Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Met Tyr

                165                 170                 175

Ala Gln Asn Glu Gln Val His Val Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu

            180                 185                 190

Tyr Glu Gly Gly Ala Tyr Ala Leu Gly Pro Glu Val Asn Ser Ser Ala

        195                 200                 205

Ser Arg Ile Tyr Ala Val Glu Gly Gln Cys Phe Val Leu Ala Pro Cys

    210                 215                 220

Ala Thr Val Ser Gln Asp Met Val Asp Glu Met Cys Thr Thr Asp Met

225                 230                 235                 240

Gln Lys Ala Leu Leu Lys Thr Gly Gly Gly Hi s Ala Arg Ile Phe Gly

                245                 250                 255

Pro Asp Gly Gln Gln Leu His Glu Ser Leu Pro Glu Asn Gln Glu Gly

            260                 265                 270

Leu Ile Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Gly Leu Ile Ser Ala Ser Lys Thr

        275                 280                 285

Ile Ser Asp Pro Ala Gly His Tyr Ala Arg Pro Asp Val Thr Gln Leu

    290                 295                 300

Val Leu Asn Lys Val Pro Arg Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala Pro Pro

305                 310                 315                 320

Ala Asp Ser Ala Pro Gly Pro Glu Gln Phe Arg His Val Glu Glu Pro

                325                 330                 335

Ala Leu Pro Asp Met Ala Glu Leu

            340

<210>21

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>21

tagaattcat gacccacccc cagttc    26

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>22

tagtcgacct agagttccgc catgtc    26

Claims (7)

1.一种微生物来源的腈水解酶，其特征在于：所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。 

2.如权利要求1所述的腈水解酶，其特征在于：所述腈水解酶的DNA序列如SEQID NO：19所示。 

3.如权利要求1所述的腈水解酶，其特征在于：所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus菌，所述Arthrobacter nitroguajacolicus菌的保藏号为CGMCC No.2405。 

4.如权利要求1～3中任一项所述的腈水解酶的制备方法，其特征在于：所述方法包括对Arthrobacter nitroguajacolicus菌进行发酵以获得腈水解酶，所述Arthrobacter nitroguajacolicus菌的保藏号为CGMCC No.2405。 

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：用于发酵的培养基的配方如下： 

葡萄糖1.5wt％，蛋白胨1.0wt％，MgSO₄·7H₂O0.05wt％，KH₂PO₄0.05wt％，K₂HPO₄·3H₂O0.05wt％，谷氨酸钠0.075wt％，半胱氨酸盐酸盐0.015wt％，苯甲腈0.025％(体积)，pH7.0。 

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对发酵液进行固液分离以及对固液分离获得的细胞进行破壁的步骤。 

7.如权利要求1～3中任一项所述的腈水解酶的应用，其特征在于：用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。 

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