CN102787129A - 贪噬菌cgmcc 4969的酰胺酶基因及其在生物降解丙烯酰胺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了贪噬菌Variovorax boronicumulansCGMCC4969可生物降解丙烯酰胺；该菌株的酰胺酶基因由具有序列表中SEQIDNo：1所示的DNA序列组成；将SEQIDNo：1序列组成的DNA片段插入到大肠杆菌表达载体pET28a质粒上，得到重组体pET28a-amidase；重组体pET28a-amidase转化EscherichiacoliRosetta菌株中并诱导表达酰胺酶，含表达蛋白的大肠杆菌细胞可降解丙烯酰胺。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969 产生的酰胺酶基因应用于丙烯酰胺生物降解。
背景技术
丙烯酰胺广泛应用于石油开采、农业和化工业中，丙烯酰胺的聚合物聚丙烯酰胺作为驱油剂用于提高石油开采回收率；作为絮凝剂用于造纸工业、工厂废水处理及下水处理；用作土壤改良剂，可使土壤团粒化，改善空气流通性、水渗透性和保水性。工农业中大量使用丙烯酰胺造成土壤和水环境污染。由于丙烯酰胺是一种神经毒剂和致癌物，消除丙烯酰胺的污染有助于改善环境，降低其生态环境的潜在风险。
微生物降解被认为是最为有效的有机污染物的降解方法之一。微生物产生的酰胺酶(amidase，EC.3.5.1. 4)可将酰胺化合物水解生成相应的酸并释放氨。目前节杆菌Arthrobacter sp.J1、芽孢杆菌Bacillus sphaericu、假单胞菌Pseudomonas putrefaciens、红球菌Rhodococcus sp.、诺卡氏菌Nocardia rhodochrous，沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris，产气肠杆菌Enterobacter aerogenes等可降解丙烯酰胺，然而未见有贪噬菌降解丙烯酰胺的报道（Buranasilp K, Charoenpanich J, 2011. Biodegradation of acrylamide by Enterobacter aerogenes isolated from wastewater in Thailand. Journal of Environmental Sciences, 23 (3): 396–403）。
申请人筛选到一株降解农药噻虫啉的贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969菌株，已在申请号为2011102159822的中国专利申请中公开；在应用方面该申请仅公开了贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供贪噬菌（V.boronicumulans）CGMCC 4969的一种新用途，该菌能产生酰胺酶，进而可在生物降解丙烯酰胺中应用；以及从该菌株中克隆酰胺酶基因并在E. coli Rosetta中诱导表达，重组表达菌株在降解丙烯酰胺中的应用。
申请人从贪噬菌（V.boronicumulans ）CGMCC 4969菌株中克隆到了一个酰胺酶基因，其碱基由序列表中SEQ ID No：1组成。将酰胺酶基因重组于pET28a质粒上，重组质粒pET28a-amidase电转化至E. coli Rosetta菌株中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，含表达酰胺酶的E. coli Rosetta 菌株可降解丙烯酰胺，而不含酰胺酶基因的对照菌株不能降解丙烯酰胺。
本发明提供了V. boronicumulans CGMCC 4969菌株在生物降解丙烯酰胺中的应用，其降解丙烯酰胺的HPLC结果如图1所示，降解曲线如图2所示。
从V.boronicumulans CGMCC 4969菌株中克隆出的酰胺酶基因，其序列如SEQ ID No：1所示。该基因由1038个碱基组成。
上述所说的应用是将由SEQ ID No：1组成的DNA序列插入到重组表达质粒pET28a中，得到重组质粒pET28a-amidase，pET28a-amidase质粒电转化至大肠杆菌E. coli Rosetta菌株中，经IPTG诱导，宿主菌表达酰胺酶（图3），含表达蛋白的E. coli Rosetta细胞用于生物降解丙烯酰胺。
本发明实验表明重组V. boronicumulans CGMCC 4969的酰胺酶基因的大肠杆菌细胞可降解丙烯酰胺（如图4所示）；而不含重组酰胺酶的E. coli Rosetta pET28a不降解丙烯酰胺。
附图说明
图1：V. boronicumulans CGMCC 4969降解丙烯酰胺生成丙烯酸的HPLC图。
图2：V. boronicumulans CGMCC 4969降解丙烯酰胺曲线图。
图3：E. coli Rosetta -pET28a-amidase的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4：E. coli Rosetta -pET28a-amidase降解丙烯酰胺曲线图。
具体实施方式
实例一：V. boronicumulans CGMCC 4969菌株降解丙烯酰胺
将保藏的V. boronicumulans CGMCC 4969菌株划线于含LB固体培养基的培养皿中。LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂粉15g/L，pH7.2。待平板中长出单菌落，挑取一环单菌落接种至LB液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养24 h后，离心收集细胞。细胞悬浮于含5.60g/L丙烯酰胺的2 0mmol/L的磷酸钠盐缓冲液中（pH 7.0），采用Prabu和Thatheyus（2007）报道的HPLC法检测丙烯酰胺的降解。如图1所示，底物丙烯酰胺的保留时间为3.0 min，产物丙烯酸出峰时间为2.7 min。转化24h后，剩余底物丙烯酰胺的浓度为1.16g/L，丙烯酰胺的降解量为4.44g/L，底物的降解率为79.3%；未加菌体的底物丙烯酰胺对照没有减少。上述实验结果表明V. boronicumulans CGMCC 4969可降解丙烯酰胺生成丙烯酸。
实例二：V. boronicumulans CGMCC 4969菌株的丙烯酰胺降解动力学
实验方法与实例一相同，底物丙烯酰胺起始浓度为0.5g/L。定时取样，检测丙烯酰胺的减少量。得到如图2所示的丙烯酰胺降解曲线，其降解半衰期为45min，反应120min，丙烯酰胺降解量为0.46g/L，降解率为92%；而底物对照则几乎不发生降解。
实例三：V. boronicumulans CGMCC 4969酰胺酶基因克隆
从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取V. boronicumulans CGMCC 4969单菌落接种于装有20mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，于30℃、220rpm的摇床中培养16h。培养液于13000 rpm离心5min，收集和洗涤菌体，采用TaKaRa公司的MiniBEST细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。
利用Genbank数据库中公布的贪噬菌V.paradoxus S110（登录号：CP001635.1）和V. paradoxus EPS（登录号：CP002417.1）的酰胺酶基因进行同源比对，并设计引物P3-1：5’-ATGAGACATGGT GATATTTCGAGC-3’ (SEQ ID No：2)和 P3-2：5’-ATCGAGAGTTCGG CGTAGTTG-3’ (SEQ ID No：3)，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。合成引物用无菌水溶解至浓度为20μmol/L，备用。PCR扩增所用DNA聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由生工生物工程（上海）有限公司购得。从基因组DNA上PCR克隆出目的DNA片段，PCR反应体系（20μl）：10×PCR 缓冲液2μl，dNTP混合液2μl，MgCl2溶液2μl，引物各0.4μl，基因组DNA 2μl，Taq酶 0.2μl，DMSO 1μl，加水至总体积20μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共30个循环；72℃ 10min。PCR产物采用pMD18-T载体试剂盒（TaKaRa公司）进行TA克隆后，送生工生物工程（上海）有限公司测序。测得PCR产物的长度为779bp。该序列位于SEQ ID No：1序列中的第1位碱基至第779位碱基。
采用反向PCR法克隆该酰胺酶基因的下游序列。选择NcoI 内切酶酶切基因组DNA,，37℃孵育24h，用TaKaRa公司的T4连接酶对酶切产物进行连接环化,16℃孵育24h，从上述长779bp的DNA片段上设计引物R-1：5’- ATCGAGAGTTCGGCGTAGTTG -3’ ( SEQ ID No：4)和引物R-2：5’-CATCAACTACGCCGAACTCTCGAT-3’ (SEQ ID No：5)。反向PCR反应体系为：10×Ex-taq 缓冲液2μl，dNTP混合液2μl，MgCl2溶液2μl，引物各0.4μl，基因组DNA 2μl，Ex-taq聚合酶0.2μl，DMSO 1μl，加水至总体积20μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃ 10 min。 PCR产物进行TA克隆后，测序。共测得284bp的DNA片段。该序列包含了位于SEQ ID No：1序列中的780位碱基至1038位碱基。
将上述PCR获得的779bp和284 bp的DNA序列进行拼接，分析开放阅读框分析，并在Genbank数据库中进行比对，得到全长为1038 bp的酰胺酶基因，其序列如SEQ ID No：1所示。
实例四：酰胺酶基因的表达
1、酰胺酶基因DNA片段连接至质粒pET28a
设计含EcoRI酶切位点的引物AA-1和含XhoI酶切位点的引物AA-2（酶切位点如下划线所示）。引物AA-1由38个核苷酸残基组成，依次为：5′-CGGAATTCATGAGACATGGTGATATTTCGAGC AGCAAC -3′（SEQ ID No：6）；引物AA-2由30个核苷酸残基组成，依次为：5′-CCGCTCGAGTCA GCGGTGCTTGGCCGGTTC -3′（SEQ ID No：7）。在灭菌的0.2mLPCR管中，依次加入11μL无菌水、4μL的扩增缓冲液、2μL的四种脱氧核苷酸、0.4μL的引物AA-1、0.4μL的引物AA-2、2μL基因组DNA溶液、0.2μL的Primer Star DNA聚合酶，总体积为20μL；将PCR管置于PCR仪中，条件设置为：升温至95℃，保持5min，接着按升温至95℃并保持5s、降温至60℃并保持15s、升温至72℃并保持65s的变化顺序循环29次，最后于72℃保持10min，结束扩增反应。
将PCR产物加腺嘌呤脱氧核苷酸A用于TA克隆，体系：10×Ex-taq 缓冲液2μl，dATP混合液0.5μl，MgCl2溶液0.8μl， Ex-taq聚合酶0.1μl，PCR纯化产物7.6μl。反应条件：72℃ 30min。将加A片段连TA克隆。连接液化转入E. coli 10B中，并提取质粒。含PCR产物-PMD18T质粒的酶切体系为PCR产物-PMD18T质粒10μL，EcoRI (15U/μL) 0.6μL，XhoI (10U/μL) 0.6μL，缓冲液(10×H Buffer) 3μL，总体积共为30μL；pET28a质粒(购自于Novagen公司)DNA的酶切体系为：pET28a质粒DNA20μL， EcoRI (15U/μL) 2.5μL，XhoI (10U/μL) 2.5μL，缓冲液(10×H Buffer) 5μL，总体积共为50μL。在37℃水浴锅中反应24 h，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到5.3 kb左右的酶切后pET28a质粒DNA片段以及约1.3Kb的酶切后连接有PCR产物的PMD18T质粒。用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收纯化DNA试剂盒纯化回收pET28a的DNA片段和酶切后的PCR产物。将回收pET28a的DNA片段和酶切后的PCR产物片段进行连接。所用T4连接酶及相应缓冲液由宝生物工程（大连）有限公司购得。连接样品组成为：酰胺酶基因DNA片段7.5μL，PET28a质粒DNA片段(100ng/μL) 1μL，10×T4 连接酶缓冲液1μL，T4 连接酶0.5μL，总体积10μL。连接样品在16℃下反应20 h。
、制备大肠杆菌的感受态细胞
将E. coli Rosetta(购买于Novagen公司)划线于LB 固体培养基上，于37 °C 培养箱中培养。挑取单菌落，接种于含50 mL LB液体培养基的500 mL 锥形瓶中，37 ℃，220 rpm下振荡培养过夜。接种两份25 mL 的过夜培养物分别于装入500 mL预热LB液体培养基的2 L锥形瓶中，于37 ℃，220 rpm振荡培养，每隔20 min 测量波长为600nm的光密度值（OD600）。当OD600值达到0.4时，从摇床中取出摇瓶，迅速将培养物置于冰上冷却20min，不时摇匀以保证内容物充分冷却，同时将离心管预冷。将培养液转移至离心管中，4℃、5000 g下离心15 min，菌体沉淀用5 mL灭菌的冰水重悬浮。加500 mL灭菌的冰水，混匀，重复离心一次，弃去上清液，用残余液体重悬浮细胞。用40 mL灭菌的、冰冷后的10 %甘油重悬浮细胞，4 ℃、5000 g 下离心15 min，弃去上清液。加入等体积冰浴过的10 %甘油，重新悬浮菌体，按50 μL 等份装入预冷的微量离心管中，于-80℃保存。
、含酰胺酶基因的pET28a质粒转化宿主菌E. coli Rosetta
在冰上解冻E. coli Rosetta感受态细胞。加入10μL连接液至解冻的感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激90s，冰浴2min，加入900μL LB培养基，37℃孵育1h。将菌液涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB 平板。待培养板中的液体被完全吸收后，将平板置于37 °C 培养箱培养16 h。随机挑取若干单菌落接入含卡那霉素抗性的LB液体培养基，以碱裂解法提取质粒DNA。上述收获的质粒DNA进行酶切验证，以EcoRI和XhoI内切酶切开PCR产物，然后将酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果得到约1.0Kb和5.3Kb的条带，分别对应于上述PCR产物和线性化pET28a质粒DNA。上述实验结果表明重组质粒pET28a-amidase成功转化到E. coli Rosetta中。
、基因工程菌中酰胺酶的诱导表达
将上述获得的基因工程菌E. coli Rosetta-pET28a-amidase菌株接种于LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇床培养过夜。转接2mL菌液至含30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的100mL LB培养基的500mL的摇瓶中，于37℃、220rpm摇床中培养至菌液的OD600接近0.6时，加入0.2 mmol/L的IPTG，30℃、220rpm诱导培养10h，离心收集菌体。将收集的菌体进行菌体总蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），实验结果如图3所示，。图3中泳道M为标准分子量蛋白 (116, 66.2, 45.0, 35.0, 25.0, 18.4和14.4 Kd)。泳道1和泳道2分别为E. coli Rosetta-pET28a对照组的菌体总蛋白和可溶性蛋白；泳道3和4分别为加0.2mM的IPTG在30℃诱导的E. coli Rosetta-pET28a-amidase的总蛋白和可溶性蛋白；泳道5和6分别为加0.2mM的IPTG在37℃诱导的E. coli Rosetta-pET28a-amidase的总蛋白和可溶性蛋白。泳道3、5、6都出现了非常明显的与预测表达蛋白分子量相一致的条带（图中箭头所指），而E. coli Rosetta -pET28a（泳道1和2）对照组中未出现目的表达条带。
实例五：含重组酰胺酶的E. coli用于丙烯酰胺的生物降解
上述酰胺酶基因表达菌株进一步用于检测丙烯酰胺的生物转化和降解。取上述诱导表达的基因工程菌E. coli Rosetta-pET28a-amidase菌液50mL于4℃、8000 rpm 离心5min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L Na2HPO4/KH2PO4，pH7.0）洗涤菌体一次，再次收集菌体，用15 mL浓度为5.37g/L的丙烯酰胺溶液（用磷酸盐缓冲液配制）在50mL的离心管中重悬菌体。30℃，220rpm摇床反应20min。HPLC结果显示剩余底物丙烯酰胺的浓度为3.75g/L，丙烯酰胺降解量为1.62g/L；而未重组酰胺酶的pET28a空质粒的对照组不能降解丙烯酰胺。
实例六：含重组酰胺酶的E. coli用于丙烯酰胺的降解动力学
实验方法与实例五相同，底物丙烯酰胺起始浓度为0.5g/L。定时取样，HPLC检测丙烯酰胺的残留量。丙烯酰胺降解曲线如图4所示，其降解半衰期计算为75min；反应120min，丙烯酰胺降解量为0.36g/L，底物降解率为72%；而不含酰胺酶基因的对照组几乎不降解丙烯酰胺。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 贪噬菌CGMCC 4969的酰胺酶基因及其在生物降解丙烯酰胺中的应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1038
<212> DNA
<213> 贪噬菌（Variovorax boronicumulans）
<400> 1
atgagacatg gtgatatttc gagcagcaac gattgcgtcg gcgtcgcggt cgtcaactac 60
aagatgcccc gcctgcacac caaggccgag gtgctggaca acgcacgcaa gatcggtgag 120
atgctggtcg gcatgaagaa aggcctgccg ggcatggacc tggtgatctt tcccgagtac 180
tccacgcacg ggatcatgta cgacgccaag gagatgtacg acaccgcctc ggccatcccc 240
ggcgaggaga ccgcgatctt cgcggacgcg tgccggcgcg ccaacgtgtg gggcgtgttc 300
tcgctcaccg gcgagcgcca cgaggagcac ccgaacaagg cgccctacaa cacgctgatc 360
ctcatgaaca accagggaga gatcgtccag aagtaccgca agatcatgcc gtgggtgccc 420
atcgagggct ggtacccggg cgactgcacc tacgtgagcg aaggccccaa gggcatgaag 480
atgagcctga tcatctgcga cgacggcaac taccccgaga tctggcgcga ctgcgcgatg 540
cgcggcgccg agctcatcat ccgctgccag ggctacatgt acccggccaa ggagcagcag 600
atcatggtct ccaaggccat ggccttcatg aacaacacct acgtggcggt ggccaacgcg 660
gccggcttcg acggcgtgta ctcgtacttc ggccactccg cgctcatcgg cttcgacggc 720
cgcacgctcg gcgaatgcgg cgaggaagag atgggcatca actacgccga gctgtcgatg 780
ggcctgatcc gcgacgcgcg caagaacggc cagtcgcaga accacctctt caagctggtg 840
caccgcggct acaccggcac catcaactcg ggcgacggcg acaagggcgt ggcggcctgc 900
ccctacaact tctacacgca gtggatcaac gaccccgagg gcacgcgcga gcgcgtggag 960
tcgttcacgc gcaccaccgt cggcacgccc gagtgcccga tcgagggcat cccgaacgaa 1020
ccggccaagc accgctga 1038
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcgagagtt cggcgtagtt g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcgagagtt cggcgtagtt g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggaattcat gagacatggt gatatttcga gcagcaac 38
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgctcgagt cagcggtgct tggccggttc 30
Claims (3)
1.贪噬菌（V.boronicumulans）CGMCC 4969的酰胺酶基因，其特征在于该基因由1038个碱基组成，DNA碱基序列如SEQ ID No：1所示。
2.贪噬菌（V.boronicumulans）CGMCC 4969在生物降解丙烯酰胺中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，是将SEQ ID No：1所示序列的DNA片段重组于表达载体pET28a质粒上，并在大肠杆菌E. coli Rosetta中诱导表达；含酰胺酶的重组E. coli Rosetta细胞用于降解丙烯酰胺。
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