KR101976923B1 - D-루이신 치환을 통해 항균 효과를 증진시킨 항생 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

D-루이신 치환을 통해 항균 효과를 증진시킨 항생 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-루이신 치환을 통해 항균 효과가 증진된 항생 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 항생 펩타이드를 항균용 약학적 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 방부용 조성물 및 항균용 의약외품 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드는 그람음성균에 대하여 유의적인 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 그람양성균에만 강한 항균 활성을 나타내고 그람음성균에는 항균활성을 가지지 않거나 낮은 항균활성을 가지는 항생제와 본 발명의 항생 펩타이드를 혼합 처리하였을 때 유의적인 시너지 효과를 나타내어, 그람양성균 뿐 아니라 그람음성균중 대장균과 아세네토박터균과 이들의 항생제 내성균에 대하여 우수한 항균효과를 나타낼 수 있다.

Description

D-루이신 치환을 통해 항균 효과를 증진시킨 항생 펩타이드 및 이의 용도{Antimicrobial peptides substituted D-leucine for improving antibiotics effect and their uses}
본 발명은 D-루이신 치환을 통해 항균 효과가 증진된 항생 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 항생 펩타이드를 항균용 약학적 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 방부용 조성물 및 항균용 의약외품 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나이다. 페니실린(penicillin) 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(Stuart B. Levy, Scientific American, (1988): 46-53).
항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al., Nature, 227, (1970): 138-140). 페니실린, 세팔로스포린(Cephalosporin)등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 그러나, 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다. 따라서, 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메커니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다(Zasloff M. Curr Opin Immunol 4 (1992): 3-7; Boman, H. G., Cell, 65.205 (1991); Boman, H. G. J Intern Med . 254.3 (2003): 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 97 (2000): 8856-8861, Zasloff, M., Nature 415 (2002): 389-395).
최근 다제내성균 중 그람음성균인 P. aeruginosa, A. baumannii는 내인성으로 획득내성 또한 가장 빈번하게 일어나는 균종에 속해서 항균제 내성 문제가 심각한 균종으로 알려져 있다. P. aeruginosa, A. baumannii에서 다제내성은 아미노글리코사이드(Aminoglycoside), 플루오로퀴놀론(Fluoroquinolone), 카바페넴(Carbapenem) 등 3가지 계열의 약제에 모두 내성인 균주를 의미하며, 이런 다제내성 균종은 카바페넴이 거의 유일하게 유효한 항균제였는데, 10여 년간 카바페넴에도 내성인 균주가 증가하면서 항균제 치료에 큰 제한이 생겼다는 공통점을 보인다. 녹농균 또는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 그람 음성균이며, 흔한 감염성 병원균으로서, 항생제에 대한 감수성이 낮아 자연적으로 쉽게 항균제 내성을 획득할 수 있으며, 인공호흡기를 사용하는 호흡기계 감염, 화상 감염, 낭포성 섬유증 환자의 폐렴, 요로 감염을 유발하는 원인균이며, 인공환기기, 흡인카테터, 고여 있는 오염된 물 등의 감염소에 존재하다가 환자에게 직, 간접적으로 전파되어 정착하게 되는데 진행성의 질환을 가진 환자의 경우에는 치료가 어려워 높은 사망률을 보이는 것으로 알려져 있다.
아세네토박터균(Acinetobacter baumannii)은 그람음성 호기성 구간균으로 많은 병원에서 병원 내 감염의 중요한 원인이 되고 있는데 특히 최근에는 아미노글리코사이드, 세파로스포린, 플루오로퀴놀론, 베타 락타마아제 억제제(beta-lactamase inhibitors), 그리고 카바페넴에 대해서 내성을 보이는 다제내성 Acinetobacter baumannii(MRAB)에 의한 감염이 증가하고 있는 실정이다. 2010년 동경대학병원에서 아세네토박터균의 감염으로 46명이 감염되고 이중 10명이 숨진 사건은 최근 10년 사이 전 세계적으로 급증하고 있는 항생제 내성이 강한 MRAB에 대한 경각심을 불러일으켰고 항생제개발에 박차를 가하고 있다. 아세네토박터균 자체는 물이나 토양 또는 인간의 피부에도 흔하게 존재하며 건강한 사람의 경우 감염돼도 발병하지 않는다. 하지만, 면역력이 떨어진 사람이 감염될 경우 폐렴이나 패혈증으로 사망할 수 있고 1990년대부터 미국, 유럽 등에서 늘어나기 시작했으며 2000년부터는 거의 어떤 항생제도 듣지 않는 종류까지 나타났다. 통상 다약제내성 아세네토박터균(multi-drug resistant Acinetobacter baumannii, MDRAB)은 아미노글리코사이드, 플루오로퀴놀론, 카바페넴 등 3가지 계열의 약제에 모두 내성인 균주를 의미하며, 이 경우 콜리스틴(Colistin) 정도가 유일하게 감수성으로 남고, 아세네토박터균은 이에 더해서 티게사이클린(Tigecycline)에 감수성을 나타낼 수 있다. 의료관련 감염의 주요 원인균인 아세네토박터균은 다제내성 때문에 카바페넴이 거의 유일하게 유효한 항균제였으나, 10여 년간 카바페넴에도 내성인 균주가 증가하면서 감염증 치료에 큰 제한이 생겼다. 최근 P. aeruginosa는 내성률이 20% 정도인데 비해 아세네토박터균은 급속히 증가하여 대부분의 대형병원에서 50%를 넘었고 카바페넴 내성율의 증가가 아세네토박터균의 증가로 이어져서 2010년 전국 중환자실 의료관련감염률 조사에서 P. aeruginosa를 제치고, MRSA, Enterococcus sp.에 이어 원인균 빈도 3위를 차지한다. 따라서 국내 중환자 감염 원인균 중 빈도가 높고 치사율이 높아 치료제 개발이 시급하다.
넓은 의미로서 면역반응으로 불리어지는 항원 항체 반응은 인간을 포함한 무척추 동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충이나 양서류는 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충, 양서류뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 항균펩타이드를 획득한다는 것이다. 항균성 펩타이드를 중심으로 한 항미생물작용을 가진 펩타이드나 단백질은 우리 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제 및 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 항균제로서 이용 가능성이 높다. 최근 들어 항생제 내성문제가 심각해지면서 이러한 항생 펩타이드를 이용한 새로운 신약 후보 물질에 관심이 늘어나고 있다. 항생 펩타이드는 세균의 막을 타겟으로 하여 항균활성을 가지므로 기존 항생제에 내성을 가진 균주에 대해서도 활성을 유지하는 특징을 가지는 것으로 보여진다. 그러므로 다양한 천연 유래한 항생 펩타이드는 내성 균주의 출연으로 위협받고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 개념의 항생제 탐색에 중요한 생물자원으로 각광받고 있다.
현재까지 발견된 곤충의 항균 단백질 및 펩타이드는 Boman 박사 연구팀에 의해 세크로피아나방에서 세크로핀이 최초로 보고된 이래 약 200여 종이 곤충으로부터 분리되었는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다.
세크로핀류는 31 - 39개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질로 최근 본 연구팀이 특허 등록한 호랑나비 유충으로부터의 새로운 항균펩타이드(파필리오신)는 N-말단의 양친매성 나선구조와 C-말단의 소수성 helix를 포함한 α-helix-hinge-α-helix 구조를 가지며 다양한 병원균에 항균활성 및 항염증 활성이 우수하다(비특허문헌 1). 특히 N-말단의 helix 구조를 가지는 영역이 항균활성에 중요한 역할을 함을 규명하여 내성 균주에 대한 뛰어난 항균능력과 항염 활성을 확인하여 공지된 바 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 2). 마가이닌(Magainin 2, MA)은 양서류 유래 양친화성 펩타이드로서 다양한 균에 항균활성을 가지며, 본 연구진은 세크로핀의 N-말단과 마가이닌의 N-말단 펩타이드를 접합시켜 만든 CA-MA 펩타이드의 삼차원구조를 규명하고 항균, 항암활성이 뛰어난 것으로 확인한 바 있다(비특허문헌 3).
또한 최근 파필리오신(Papiliocin)의 N-terminal 영역의 8개 잔기와 마가이닌(Magainin)의 N-말단 잔기 9개의 혼성펩타이드를 연결해 만든 PapMA-1을 설계, 합성하여 뛰어난 그람음성균, 그람양성균 모두에 항균활성이 우수함을 발표한 바 있다(비특허문헌 4).
파필리오신 및 마가이닌을 연결하여 합성한 펩타이드에 관련된 연구를 계속한 결과, 본 발명자들은 모체 항생 펩타이드(PapMA-1)로부터 항균 활성이 증진될 수 있도록 아미노산 잔기를 치환하여 PapMA-2 내지 PapMA-20의 펩타이드를 설계하였다. 또한, 상기 PapMA-1 내지 PapMA-20의 펩타이드로부터 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환하여 항생 펩타이드를 설계하였다.
이와 함께, 본 발명자들은 본 발명에서 설계한 항생 펩타이드는 그람음성균에 대하여 유의적인 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 종래 항생제와 혼합 처리하였을 때 유의적인 시너지 효과를 나타내어, 그람양성균 뿐 아니라 그람음성균 중 대장균과 아세네토박터균과 이들의 항생제 내성균에 대하여 우수한 항균효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1150281 B1
Kim, Jin-Kyoung, et al. "Structure and function of papiliocin with antimicrobial and anti-inflammatory activities isolated from the swallowtail butterfly, Papilio xuthus." Journal of Biological Chemistry 286.48 (2011): 41296-41311. Lee, Eunjung, et al. "Functional roles of aromatic residues and helices of papiliocin in its antimicrobial and anti-inflammatory activities." Scientific reports 5 (2015). Oh, Donghoon, et al. "Role of the hinge region and the tryptophan residue in the synthetic antimicrobial peptides, cecropin A (1-8)-magainin 2 (1-12) and its analogues, on their antibiotic activities and structures." Biochemistry 39.39 (2000): 11855-11864. Shin, Areum, et al. "Peptoid-Substituted Hybrid Antimicrobial Peptide Derived from Papiliocin and Magainin 2 with Enhanced Bacterial Selectivity and Anti-inflammatory Activity." Biochemistry 54.25 (2015): 3921-3931.
이에, 본 발명자들은 항균 펩타이드인 파필리오신의 N-말단 영역의 잔기 및 마가이닌의 N-말단 영역의 잔기를 접합한 PapMA-1 항생 펩타이드를 주형으로 하여, 항균 활성이 증진될 수 있도록 아미노산 잔기를 치환하여 PapMA-2 내지 PapMA-20의 펩타이드를 설계하였다. 또한, 상기 PapMA-1 내지 PapMA-20의 펩타이드로부터 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환하여 PapMA-21 내지 PapMA-24의 항생 펩타이드를 설계하였다. 상기 항생 펩타이드는 그람음성균인 대장균과 아세네토박터균과 이들의 항생제 내성균에 대하여 우수한 항균효과를 나타낼 뿐 아니라, 항생제와 함께 투여하였을 때 유의적인 시너지 효과의 항균 활성을 나타낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 그람양성균, 그람음성균 또는 이들의 다제내성균에 대하여 우수한 항균활성을 나타내는 신규한 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또다른 목적은 상기 항생 펩타이드를 항생제와 함께 복합제로 투여하여 그람음성 다제내성균에 대한 우수한 시너지 효과의 항균 활성을 나타내는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된, 항생 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 항생 펩타이드는 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 신규한 합성 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 식품 첨가제를 제공한다
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 방부용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 하는 방부용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 항생 펩타이드는 서열번호 21 내지 24로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 항생제는 에리트로마이신(Erythromycin), 암피실린(Ampicillin), 반코마이신(Vancomycin), 리네졸리드(Linezolid), 메티실린(Methicillin), 옥사실린(Oxacillin), 세포탁심(Cefotaxime), 리팜피신(Rifampicin), 아미카신(Amikacin), 겐타마이신(Gentamicin), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 토브라마이신(Tobramycin), 네오마이신(Neomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세프타지딤(Ceftazidime), 세파핌(Cefepime), 세프타로린(Ceftaroline), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 아즈트레오남(Aztreonam), 피페라실린(Piperacillin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 콜리스틴(Colistin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 티게사이클린(Tigecycline), 이의 배합체 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 항균용 약학적 조성물은 그람 양성균, 그람 음성균 및 이의 항생제 내성균주에 대해 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa), 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
따라서, 본 발명은 호랑나비 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 파필리오신(Papiliocin, Pap)의 N-terminal 영역과 마가이닌(Magainin 2, MA)의 N-말단 영역잔기들을 연결하여 만든 파필리오신 혼성펩타이드 유도체인 항생 펩타이드 PapMA-1로부터 항균 활성이 증진될 수 있도록 아미노산 잔기를 치환하여 PapMA-2 내지 PapMA-20의 펩타이드를 설계하고, 이로부터 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환한 항생 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 항생 펩타이드는 프롤린 또는 D-라이신을 D-루이신으로 치환하는 것을 통해, 모체 펩타이드에 비하여 항균 효과가 증진될 수 있다. 이에 따라, 그람음성균에 대하여 유의적인 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 그람양성균에만 강한 항균 활성을 나타내고 그람음성균에는 항균활성을 가지지 않거나 낮은 항균활성을 가지는 항생제와 본 발명의 항생 펩타이드를 혼합 처리하였을 때 유의적인 시너지 효과를 나타내어, 그람양성균 뿐 아니라 그람음성균과 이들의 항생제 내성균에 대하여 우수한 항균효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 항생펩타이드를 포함하는 항균용 조성물, 및 본 발명의 항생 펩타이드와 항생제의 혼합제를 포함하는 항균용 조성물은 항균용 약학적 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 방부용 조성물 및 의약외품 조성물로서 제공할 수 있으며, 적은 농도의 화학적 항생제를 포함하고도 상승된 항균 활성을 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드 8 ㎍/㎖와 상용화되어 있는 항생제들과의 E. coli 및 그 내성균에 대한 항균활성의 시너지효과를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드 8 ㎍/㎖와 기존 알려진 항생제들과의 A. baumannii균 및 그 내성균에 대한 항균활성의 시너지효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
항생제에 대하여 내성을 가지는 다제내성균에 대한 항균활성을 나타내는 항생물질의 개발이 계속 요구되고 있고, 이에 따라 제조된 항균 펩타이드들이 보고되고 있으나, 종래 항생제와 함께 혼합 처리하여 시너지 효과를 나타낼 수 있는 항생 펩타이드에 관하여는 아직까지 보고된 바 없다.
본 발명의 항생 펩타이드는 그람음성균에 대하여 유의적인 항균활성을 나타낼 뿐 아니라, 그람양성균에만 효과적인 항균활성을 나타내는 항생제와 혼합 처리하였을 때 그람음성균인 대장균 및 아세네토박터균 및 이의 항생제 내성균에 대하여 항생 펩타이드와 항생제가 우수한 시너지 효과로 항균 활성을 나타내므로, 소량의 항생제를 투여하여도 대장균 및 아세네토박터균 및 이의 다제내성균에 대하여 항균 효과를 나타낼 수 있어 효과적이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된, 신규한 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된, 항생 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된, 신규한 합성 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 “서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드”는 파필리오신(Papiliocin, Pap) 의 N-말단 영역의 1 내지 8 영역의 8개 잔기와 마가이닌(Magainin 2, MA의 N-말단 4 내지 12 영역의 잔기 9 개의 펩타이드를 프롤린으로 연결해 만든 18개 잔기로 이루어진 합성 펩타이드인 PapMA-1이다(비특허문헌 4).
상기 “서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드”로부터, 15번째 아미노산인 알라닌(A)을 트립토판(W)으로 치환; 및/또는 18번째 아미노산인 페닐알라닌(F)을 트립토판(W)으로 치환;될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드인 것이 바람직하다.
상기 “서열번호 1 내지 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드”로부터, 11번째 아미노산인 페닐알라닌(F)을 류신(L)으로 치환; 및/또는 15번째 아미노산인 알라닌(A) 또는 트립토판(W)을 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)으로 치환;될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 10 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드인 것이 바람직하다.
상기 “서열번호 1 내지 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드”로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환;될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 21 내지 서열번호 24 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드인 것이 바람직하다.
상기 “항생 펩타이드”의 서열에 있어서, “프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환”되는 것을 통해, 본 발명의 항생 펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드보다 증가된 항균 활성을 나타내거나, 종래 항생제와 혼합 처리시 더 높은 시너지 효과를 가질 수 있도록 서열이 최적화될 수 있다.
양쪽성 구조를 가지는 항균펩타이드의 소수성, 알파 나선형구조의 양, 그리고 양이온성이 높아지면 생체막과의 상호작용이 높아져서 항균활성이 높아진다고 알려져 있으며 이 조건들을 최적화시켜서 펩타이드의 항균활성을 높일수 있다(비특허문헌 2). 본 발명에서는 9 번째 아미노산인 극성 잔기의 프롤린 또는 양전하(염기성) 잔기의 D-라이신(k)을 비극성 잔기의 D-루이신(l)으로 치환하여 펩타이드 전체의 전하가 낮아지도록 유도하였다는 것에서 특징이 있다. 이러한 특징은 9번째 잔기인 프롤린을 D-루이신으로 치환함에 따라, 펩타이드 내 형성된 bent 구조를 보다 유도하고자 하는 것으로부터 나타난 것이 바람직하다. 본 발명의 펩타이드 서열 중 9번째 아미노산 잔기에 의해 펩타이드가 bent 구조 또는 linear 구조를 나타낼 수 있다. 본 발명의 항생 펩타이드가 종래 항생제와 함께 투여되면 시너지 효과를 나타낼 수 있다는 관점에서, 항생 펩타이드의 구조가 linear 구조가 아닌 bent 구조인 것이 바람직하다. 이를 위해, 9 번째 잔기의 위치를 프롤린으로부터 D-루이신으로 치환하여 시너지 효과를 보다 증진시킬 수 있는 펩타이드를 설계하는 것이 바람직하다. 모체 펩타이드인 PapMA-17 및 PapMA-18의 총 전하는 +10인 반면, PapMA-21 및 PapMA-22는 +9로 감소하고, 또다른 모체 펩타이드인 PapMA-19 및 PapMA-20의 총 전하는 +8인 반면, PapMA-23 및 PapMA-24의 총 전하는 +7로 감소하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 “항생 펩타이드”는 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 항생 펩타이드 중, 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드는 PapMA-21이고, 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열로부터 9번째 아미노산인 D-라이신이 D-루이신으로 치환된 서열이다.
서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드는 PapMA-22이고, 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열로부터 9번째 아미노산인 D-라이신이 D-루이신으로 치환된 서열이다.
서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드는 PapMA-23이고, 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열로부터 9번째 아미노산인 D-라이신이 D-루이신으로 치환된 서열이다.
서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드는 PapMA-24이고, 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열로부터 9번째 아미노산인 D-라이신이 D-루이신으로 치환된 서열이다. 그러나, 본 발명의 항생 펩타이드는 상기 서열번호 21내지 24의 아미노산 서열로만 한정되지 않고, 서열번호 21내지 24의 아미노산 서열의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
상기 “기능적 동등물”은 펩타이드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 상기 신규한 항생 펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로,신규한 항생 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다.
본 발명의 신규한 항생 펩타이드는 합성 펩타이드로서, 상기 합성을 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles (1983))으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 고상법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 고상법(Solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 액상 고상법(Merrifield, RB., J. Am. Chem . Soc ., 85.2149: 196)으로 합성하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “신규한 항생 펩타이드”는 그람 양성균, 그람 음성균 및 이의 항생제 내성균주에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 클로스트리듐 속(Clostridium), 엔테로코쿠스 속(Enterococcus), 에리시펠로트릭스 속(Erysipelothrix) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 그람 음성균은 대장균 속(Escherichia), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 리케치아 속(Rickettsia)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa), 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로 대장균(Escherichia coli) 또는 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 중 어느 하나 인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 우수한 항균활성을 나타내는 신규 항생 펩타이드를 합성하기 위해, 호랑나비 유충으로부터 분리된 항균펩타이드 파필리오신(Papiliocin, Pap)의 N-terminal 영역과 마가이닌(Magainin 2, MA)의 N-말단 영역잔기들을 연결하여 만든 파필리오신 혼성 펩타이드인 PapMA-1의 아미노산 잔기를 치환하여 PapMA-2 내지 PapMA-20의 펩타이드를 설계하였다. 또한, 상기 PapMA-1 내지 PapMA-20의 펩타이드로부터 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환하여 PapMA-21 내지 PapMA-24의 항생 펩타이드를 설계하였다(표 1).
또한, 본 발명자들은 PapMA-21 내지 PapMA-24가 나타내는 항균 활성을 확인한 결과, PapMA-21 내지 PapMA-24는 모두 그람 음성균에 대해 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2 및 표 3). 또한, 종래 항생제로 사용되는 에리트로마이신, 반코마이신 및 리네졸리드는 그람 양성균에 항균활성을 갖고, 그람 음성균에 대한 항균활성은 매우 낮은 것을 확인하였다(표 4).
또한, 본 발명자들은 PapMA-21 내지 PapMA-24가 기존 항생제와 시너지 항균 활성을 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여 에리트로마이신, 반코마이신 또는 리네졸리드와 함께 그람음성균 및 항생제 내성 균주에 투여한 결과, 항생제를 단독으로 처리하였을 때 나타나는 항균 활성에 비해 유의적으로 상승한 수준의 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였고(표 5 내지 표13), 이는 본 발명의 합성 펩타이드와 항생제가 유의적인 상승적 효과의 항균 활성을 나타내는 결과임을 확인하였다(도 1, 도 2 및 표 14 내지 표 16).
따라서, 본 발명의 항균 펩타이드인 PapMA-21 내지 PapMA-24는 그람음성균에 대하여 보다 유의적인 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 그람양성균에만 유의적인 항균 활성을 갖고 그람 음성균에는 낮은 항균활성을 가지는 항생제와 본 발명의 항균 펩타이드를 함께 투여하였을 때, 그람음성균 및 이의 항생제 내성균에 대하여 우수한 상승적 항균 활성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드 또는 이를 항생제와 함께 포함하는 복합제는 항균용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 항균 보조제를 제공한다.
상기 “항생 펩타이드”의 서열에 있어서, “ 프롤린(P) 및/또는 글루탐산(E)을 D-라이신(k)으로 치환”하는 것을 통해, 본 발명의 항생 펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드보다 증가된 항균 활성을 나타내거나, 종래 항생제와 혼합 처리시 더 높은 시너지 효과를 가질 수 있도록 서열이 최적화될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 “항생 펩타이드”는 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 "항생제"는 그람양성균에 대하여 항균활성을 가지고, 그람음성균에 대하여 낮은 항균활성을 가지거나 항균활성이 없는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다. 구체적으로, 본 발명의 항생제는 에리트로마이신(Erythromycin), 암피실린(Ampicillin), 반코마이신(Vancomycin), 리네졸리드(Linezolid), 메티실린(Methicillin), 옥사실린(Oxacillin), 세포탁심(Cefotaxime), 리팜피신(Rifampicin), 아미카신(Amikacin), 겐타마이신(Gentamicin), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 토브라마이신(Tobramycin), 네오마이신(Neomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세프타지딤(Ceftazidime), 세파핌(Cefepime), 세프타로린(Ceftaroline), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 아즈트레오남(Aztreonam), 피페라실린(Piperacillin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 콜리스틴(Colistin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 티게사이클린(Tigecycline), 이의 배합체 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 에리트로마이신, 반코마이신 및 리네졸리드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “항균용 약학적 조성물”는 그람 양성균, 그람 음성균 및 이의 항생제 내성균주에 대해 항균 활성을 갖지며, 구체적으로 다음과 같은 병원균에 대하여 항균활성을 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다: 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 방사선균류속(Actinomyces sp.)(예를 들어, 악티노미세스 이스라에라이(Actinomyces israelii) 및 악티노미세스 네스런다이(Actinomyces naeslundii)), 에로모나스 속(Aeromonas sp.)(예를 들어, 에로모난스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에로모나스 베로나이 비오바 소브리아(에로모나스 소프리아)(Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)) 및 에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)), 아나플라스마 페토사이도필럼(Anaplasma phagocytophilum), 알칼리제니스 자일로스옥시단(Alcaligenes xylosoxidans), 악티노바실러스 악티노미세템코미탄(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실루스 속(Bacillus sp.)(예를 들어 탄저균(Bacillus anthracis), 세레우스균(Bacillus cereus), 고초균(Bacillus subtilis), 투린지엔시스균(Bacillus thuringiensis), 및 바실루스 스티로서머필러스(Bacillus stearothermophilus), 가세균 속(Bacteroides sp.)(예를 들어, 박테로이드 프레질리스(Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 속(Bartonella sp)(예를 들어, 바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 핸셀레(Bartonella henselae)), 비피더스균 속(Bifidobacterium sp.), 보데텔라 속(Bordetella sp.)(예를 들어 백일해균(Bordetella pertussis), 파라백일해균(Bordetella parapertussis) 및 보데텔라 브론카이셉티카(Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 속(Borrelia sp.)(예를 들어, 회귀열보렐리아(Borrelia recurrentis) 및 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라균 속(Brucella sp.)(예를 들어, 소유산균(Brucella abortus), 개유산균(Brucella canis), 말타열균(Brucella melintensis) 및 돼지유산균(Brucella suis)), 버르크홀데리아 속(Burkholderia sp.)(예를 들어, 버르크홀데리아 수도말레이(Burkholderia pseudomallei) 및 버르크홀데이라 세파시아(Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 속(Campylobacter sp.)(예를 들어, 공장캄필로박터(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) 및 캄필로박터 태아고균(Campylobacter fetus)), 캅노사이토파가 속(Capnocytophaga sp.), 카르디오박테리움 호미니스(Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 수모니에(Chlamydophila pneumonia), 앵무병 클라미도필라 (Chlamydophila psittaci), 시트로박터속 콕시엘라 부르네티(Citrobacter sp. Coxiella burnetii), 코리네박테리아 속(Corynebacterium sp.)(예를 들어, 디프테리아균(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 제이키움(Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움(Corynebacterium)), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.)(예를 들어, 웰치균(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) 및 파상풍균(Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.)(예를 들어, 엔테로박터 에어로게네스균(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) 및 장독성원소 대장균(enterotoxigenic E. Coli), 장침입성 대장균(enteroinvasive E. Coli), 장병원성 대장균(enteropathogenic E. Coli), 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. Coli), 장관집합성 대장균(enteroaggregative E. Coli) 및 요로질환유발성 대장균(Uropathogenic E. coli)과 같은 기회 감염성 대장균을 포함하는 대장균(Escherichia coli)), 장구균 속(Enterococcus sp.)(예를 들어 엔데로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)), 에르리치아 속(Ehrlichia sp.)(예를 들어, 에르리치아 카핀시아(Ehrlichia chafeensia) 및 에프리치아 카니스(Ehrlichia canis)), 돼지단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 속(Eubacterium sp.), 야토병균(Francisella tularensis), 누클레아튬균(Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 베지날리스(Gardnerella vaginalis), 게멜라 모르빌로럼(Gemella morbillorum), 헤모필루스 속(Haemophilus sp .)(예를 들어, 인플루엔자균(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 에이집티우스(Haemophilus aegyptius), 헤모피루스 헤모인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 헤모리티쿠스(Haemophilus haemolyticus) 및 헤모필루스 파라헤모리티쿠스(Haemophilus parahaemolyticus)), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.)(예를 들어, 헬리코박터 피포리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 시네디(Helicobacter cinaedi) 및헬리코박터 페넬리에(Helicobacter fennelliae)), 킹겔라 킹게(Kingella kingii), 클레프시엘라 속(Klebsiella sp.)(예를 들어, 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 그라눌로마티스(Klebsiella granulomatis) 및클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)), 젖산균 속(Lactobacillus sp.), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 레지오필라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 펩토사슬알균 속(Peptostreptococcus sp .), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 속(Morganella sp.), 모비룬쿠스 속(Mobiluncus sp.), 미구균 속(Micrococcus sp.), 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)(예를 들어, 나병균(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 조형결핵균(Mycobacterium avium), 소결핵균(Mycobacterium bovis) 및 마이코박테리움 마리넘(Mycobacterium marinum)), 마이코플리즘 속(Mycoplasm sp .)(예를 들어, 폐렴 마이코플라즈마(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 호미니(Mycoplasma hominis) 및 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)), 노카르디아균(Nocardia sp.)(예를 들어, 노카르니아 에스테로이드(Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시지오지카(Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라질리엔시스(Nocardia brasiliensis)), 나이세리균(Neisseria sp.)(예를 들어, 임균(Neisseria gonorrhoeae) 및 수막염균(Neisseria meningitidis)), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 플레시오모나스 시겔로이드(Plesiomonas shigelloides), 프리보텔라 속(Prevotella sp.), 포르피로모나스 속(Porphyromonas sp.), 프리보텔라 멜로니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로테우스 속(Proteus sp.)(예를 들어, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 속(Providencia sp.)(예를 들어, 프로비덴시아 알칼리파시엔(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르테(Providencia stuartii)), 녹농균,(Pseudomonas aeruginosa), 프로피온산균 에크니(Propionibacterium acnes), 로도코쿠스 에쿠이(Rhodococcus equi), 살모넬라균 속(Salmonella sp.)(예를 들어, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 장티푸스균(Salmonella typhi), 파라티푸스균(Salmonella paratyphi), 장염균(Salmonella enteritidis), 살모넬라 식중독(Salmonella cholerasuis) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 세라티아 속(Serratia sp.)(예를 들어, 영균(Serratia marcesans) 및 세라티아 리뮈파시엔(Serratia liquifaciens)), 시겔라 속(Shigella sp.)(예를 들어, 지하적리균(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 보이드 설사균(Shigella boydii) 및 시겔라 소네이균(Shigella sonnei)), 포도상국균 속(Staphylococcus sp.)(예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스(Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus)), 연쇄상구균 속(Streptococcus sp.)(예를 들어, 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 폐렴 연쇄상구균(Spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 에리트로마이신-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 옵토힌-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신-내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 폐렴 연괘상구균(Tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 및 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐련 연쇄상구균(Trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 클로람페니콜-내성 혈청형 4 폐렴 연쇄상구균(Chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 옵토힌-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신-내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 또는 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐련 연쇄상구균(Trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄(Streptococcus mutans), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), A군 용혈연쇄구균(Group A streptococci), 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), B군 용혈연쇄구균(Group B streptococci), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), C군 용혈연쇄구균(Group C streptococci), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 이퀴스밀리스(Streptococcus equismilis), D군 용혈연쇄구균(Group D streptococci), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), F군 용혈연쇄구균(Group F streptococci) 및 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), G군 용혈연쇄구균(Group G streptococci), 스피릴룸 마이너스(Spirillum minus), 모닐리포르미스연쇄간균(Streptobacillus moniliformi), 트레포네마균 속(Treponema sp.)(예를 들어, 트레포네마 카라튬(Treponema carateum), 트레포네마 페테뉴(Treponema petenue), 매독트레포네마(Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미쿰(Treponema endemicum), 트로페리마 위펠리(Tropheryma whippelii), 유레아플라스마 유레알티쿰(Ureaplasma urealyticum), 메요넬라 속(Veillonella sp.), 비브리오균 속(Vibrio sp.)(예를 들어, 아시아콜레라균(Vibrio cholerae), 장염비브리오균(Vibrio parahemolyticus), 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus), 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 알지노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus), 비브리오 홀리세(Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 메치니코비(Vibrio metchnikovii), 비브리오 뎀셀라(Vibrio damsela) 및 비브리오 푸르니시(Vibrio furnisii)), 예르시니아 속(Yersinia sp.)(예를 들어, 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 페스트균 (Yersinia pestis)) 및 말토필리아(Xanthomonas maltophilia).
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 클로스트리듐 속(Clostridium), 엔테로코쿠스 속(Enterococcus), 에리시펠로트릭스 속(Erysipelothrix) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 이들의 항생제 내성 균주를 포함할 수 있다.
상기 그람 음성균은 대장균 속(Escherichia), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 리케치아 속(Rickettsia)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa), 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로 대장균(Escherichia coli) 또는 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 중 어느 하나 인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 이들의 항생제 내성 균주를 포함할 수 있다.
본 발명의 PapMA-21 내지 PapMA-24의 펩타이드는 기존의 항생제와 함께 혼합 처리하였을 때 그람음성균 및 이의 항생제 내성 균주에 대하여 유의적인 상승적 항균 효과를 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드 및 항생제의 복합제는 항균용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항균용 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항균용 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 항균용 약학적 조성물은 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항균용 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 항균용 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드와 항생제의 복합제 총 유효량은 볼루스(Bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(Infusion) 등에 의해 단일 투여량(Single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(Multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(Fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 항균 보조제는 항생제 투여시, 항생제와 함께, 항생제 처리 전, 항생제 처리 후 투여할 수 있으며, 항생제의 항균활성을 증진시키기 위한 보조제로서 사용될 수 있다. 상기 보조제는 항생제와 항균활성에 대하여 상승적 효과를 가지는 것이 바람직하며, 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항생제의 항균활성을 증가시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 "항생 펩타이드"는 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 이의 유도체 및 기능적 동등물일 수 있다.
본 발명의 PapMA-21 내지 PapMA-24 펩타이드는 기존의 항생제와 함께 혼합 처리하였을 때 그람음성균 및 이의 항생제 내성 균주에 대하여 유의적인 상승적 항균 효과를 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항생제의 복합제는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항균제의 복합제를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항균제의 복합제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항균제의 복합제는 원료에 대하여 15 중량부이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 "항생 펩타이드"는 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 이의 유도체 및 기능적 동등물일 수 있다.
본 발명의 PapMA-21 내지 PapMA-24 펩타이드는 기존의 항생제와 함께 혼합 처리하였을 때 그람음성균 및 이의 항생제 내성 균주에 대하여 유의적인 상승적 항균 효과를 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항생제의 복합제는 사료 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 본 발명의 항생 펩타이드, 또는 항생 펩타이드 및 항균제 복합제 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 방부용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 방부용 조성물을 제공한다.
본 발명의 "항생 펩타이드"는 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 이의 유도체 및 기능적 동등물일 수 있다.
상기 방부용 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 의약외품을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)이 D-루이신(l)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 항생 펩타이드; 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 항균용 의약외품을 제공한다.
본 발명의 "항생 펩타이드"는 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 이의 유도체 및 기능적 동등물일 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본 발명의 펩타이드 및 항생제 복합제를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.
이하, 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 제조예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 제조예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
항생 펩타이드의 합성
그람음성균 및 이의 다제내성균에 대한 항균 활성을 나타내는 펩타이드를 대상으로 하기 위해서, 항생 펩타이드인 파필리오신(Papiliocin)의 N 말단 잔기 및 마가이닌(Magainin)의 N 말단 잔기를 연결한 서열을 설계하여, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드(PapMA-1)를 설계하였다.
서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드(PapMA-1)로부터, 15번째 아미노산인 알라닌(A)을 트립토판(W)으로 치환; 및/또는 18번째 아미노산인 페닐알라닌(F)을 트립토판(W)으로 치환;하여 서열번호 2 내지 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드(PapMA-2 내지 PapMA-4)를 설계하였다.
그런 다음, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드로부터, 11번째 아미노산인 페닐알라닌(F)을 류신(L)으로 치환; 및/또는 15번째 아미노산인 알라닌(A) 또는 트립토판(W)을 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)으로 치환;하여 서열번호 5 내지 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드(PapMA-5 내지 PapMA-10)를 설계하였다.
또한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드로부터, 14번째 아미노산인 세린(S)을 글루탐산(E)으로 치환하여, 서열번호 11 내지 서열번호 14로 기재되는 항생 펩타이드(PapMA-11 내지 PapMA-14)를 설계하였다.
또한, 상기 서열번호 2 내지 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드로부터, 9 번째 아미노산인 프롤린(P)이 D-라이신(k)으로 치환; 및/또는 14 번째 아미노산인 글루탐산(E)이 L-라이신(K)으로 치환;하여, 서열번호 15 내지 서열번호 20으로 기재되는 항생 펩타이드(PapMA-15 내지 PapMA-20)를 설계하였다.
또한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열의 항생 펩타이드로부터, 9번째 아미노산인 프롤린(P) 또는 D-라이신(k)을 D-루이신(l)으로 치환하여, 서열번호 21 내지 서열번호 24로 기재되는 항생 펩타이드(PapMA-21 내지 PapMA-24)를 설계하였다.
설계한 펩타이드 서열은 N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐(N-(9-fluorenyl)methoxycarbonyl; Fmoc) 합성법을 사용하여, 고체상 합성법으로 펩타이드를 합성하고 이를 정제하였다(Biochimica et Biophysica Acta ( BBA )-Biomembranes 1798.10 (2010): 1913-1925). 그러 다음, 합성한 펩타이드의 농도는 UV 분광광도계를 사용하여 정량하였고, 최종적인 펩타이드의 순도(>98%)는 역상 고성능 액체크로마토그래피(Reverse-phase HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이 서열번호 21 내지 24의 아미노산 서열로 구성된 항균 펩타이드를 합성하였다(비특허문헌 4).
본 발명에서 합성한 펩타이드의 서열 및 비교 펩타이드 서열
펩타이드
명칭		 아미노산 서열 서열번호 net
charge
PapMA-1 RWK IFK KIP KFL HSA KKF-NH2 서열번호 1 +8
PapMA-2 RWK IFK KIP KFL HSA KKW-NH2 서열번호 2 +8
PapMA-3 RWK IFK KIP KFL HSW KKF-NH2 서열번호 3 +8
PapMA-4 RWK IFK KIP KFL HSW KKW-NH2 서열번호 4 +8
PapMA-5 RWK IFK KIP KFL HSF KKF-NH2 서열번호 5 +8
PapMA-6 RWK IFK KIP KFL HSL KKF-NH2 서열번호 6 +8
PapMA-7 RWK IFK KIP KLL HSF KKF-NH2 서열번호 7 +8
PapMA-8 RWK IFK KIP KLL HSL KKF-NH2 서열번호 8 +8
PapMA-9 RWK IFK KIP KLL HSA KKW-NH2 서열번호 9 +8
PapMA-10 RWK IFK KIP KLL HSL KKW-NH2 서열번호 10 +8
PapMA-11 RWK IFK KIP KFL HEA KKF-NH2 서열번호 11 +7
PapMA-12 RWK IFK KIP KLL HEF KKF-NH2 서열번호 12 +7
PapMA-13 RWK IFK KIP KLL HEA KKW-NH2 서열번호 13 +7
PapMA-14 RWK IFK KIP KFL HEA KKW-NH2 서열번호 14 +7
PapMA-15 RWK IFK KIk KLL HSF KKF-NH2 서열번호 15 +9
PapMA-16 RWK IFK KIk KLL HSA KKW-NH2 서열번호 16 +9
PapMA-17 RWK IFK KIk KLL HKF KKF-NH2 서열번호 17 +10
PapMA-18 RWK IFK KIk KLL HKA KKW-NH2 서열번호 18 +10
PapMA-19 RWK IFK KIk KLL HEF KKF-NH2 서열번호 19 +8
PapMA-20 RWK IFK KIk KLL HEA KKW-NH2 서열번호 20 +8
PapMA-21 RWK IFK KI l KLL HKF KKF-NH2 서열번호 21 +9
PapMA-22 RWK IFK KI l KLL HKA KKW-NH2 서열번호 22 +9
PapMA-23 RWK IFK KI l KLL HEF KKF-NH2 서열번호 23 +7
PapMA-24 RWK IFK KI l KLL HEA KKW-NH2 서열번호 24 +7
항생 펩타이드의 항균 활성 확인
<2-1> 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성 확인
본 발명의 항생 펩타이드가 나타내는 항균 활성을 비교하기 위하여, 그람 음성균 및 그람 양성균에 대해 항생 펩타이드 또는 기존의 항생제가 나타내는 항균 활성을 측정하였다. 상기 항균활성은 영양분이 충분한 MH배지에서 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도(Minimal inhibitory 농도: MIC)를 측정하였다.
구체적으로, 하기 [표 2]에 기재된 균주를 구입하여, 세균수가 ㎖ 당 2×106 colony-forming units(CFUs)가 되도록 MH 배지로 희석하고 100 ㎕씩 96-웰 마이크로 적정 플레이트(Microtiter plate)에 분주한 후, MH 배지로 희석한 펩타이드 용액(2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37에서 16 시간 동안 배양한 후 ELISA판독기(Bio-Tek Instruments)로 620 ㎚에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 MIC를 결정하였다. MIC값이 해당농도 이상으로 나올 경우에는 해당 농도로 MIC를 가정하여 이후 실험을 진행하였다.
Figure 112017044416315-pat00001
그 결과, 하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 서열번호 21 내지 24의 펩타이드는 모든 그람 음성균에 대해 높은 항균활성을 가짐을 확인하였다. 특히 대장균, A. baumannii 및 S. typhimurium 대하여 서열번호 1의 펩타이드(PapMA-1)보다 유의적으로 높은 수준의 항균 활성을 나타내는 것으로 확인하여, PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24는 PapMA-1 보다 2 배 이상 우수한 항균 활성을 나타내었다.
이와 함께, 다제내성균에 대하여도 서열번호 21 내지 24의 펩타이드가 우수한 항균 활성을 나타내어, PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24가 PapMA-1 보다 2 내지 4 배로 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성
대상 균주 최소생장억제농도 MIC (㎍/㎖)
대상 균주 PapMA-1 PapMA-11 PapMA-12 PapMA-13 PapMA-14
서열번호 1 서열번호 11 서열번호 12 서열번호 13 서열번호 14
E. coli 64 64 8 16 8
MDREC 1229 64 64 16 16 16
MDREC 1238 64 64 16 16 16
P. aeruginosa 16 128 64 128 64
MDRPA 2002 16 128 64 128 64
MDRPA 2003 32 >128 64 128 64
A. baumannii 64 64 8 16 16
MDRAB 12035 64 64 8 16 16
MDRAB 12036 64 64 16 16 16
S. typhimurium 64 64 16 16 16
MDRST 8007 64 64 16 16 16
MDRST 8009 64 64 32 16 32
B. subtilis >128 >128 >128 >128 >128
S. epidermidis >128 >128 >128 >128 >128
S. aureus >128 >128 >128 >128 >128
MRSA 3114 >128 >128 >128 >128 >128
MRSA 3126 >128 >128 >128 >128 >128
<2-2> 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 기존 항생제의 항균 활성 확인
본 발명의 항생 펩타이드의 항균 활성을 기존 항생제와 비교하기 위해서, 동일한 그람 양성균 및 그람 음성균 균주에 대하여 항생제가 나타내는 MIC 농도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대상 균주를 준비하고, 항생제인 에리트로마이신(Erythromycin), 반코마이신(Vancomycin) 또는 리네졸리드(Linezolid)를 각각 처리하여 항생제의 MIC를 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 항생제는 알려진 바와 같이 그람 음성균에 대해 32 ㎍/㎖ 이상의 MIC를 보여 낮은 항균활성을 가지는 반면, 그람 양성균에 대해서는 모든 항생제가 매우 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다(표 4).
Figure 112017044416315-pat00002
항생 펩타이드 및 항생제 병용처리시 시너지 효과의 확인
<3-1> 항생 펩타이드 및 항생제 혼합 처리시 항생제의 MIC 변화 확인
본 발명의 항생 펩타이드는 그람 음성균에 대하여 높은 항균 활성을 나타내는 것을 확인하여, 그람양성균에만 강한 항균활성을 내고 그람음성균에는 유의적인 항균활성을 가지지 않는 항생제를 본 발명의 합성 펩타이드와 혼합 처리하였을 때 유의적인 시너지 활성을 나타내는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 [표 2]에 기재된 각각의 균주를 준비하여 세균수가 ml 당 2×106 colony-forming units (CFUs)가 되도록 MH 배지로 희석하고 100 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(Microtiter plate)에 분주한 후, MH 배지로 MIC 값부터 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하였다. 그 후 항생제 용액을 MH 배지에 희석하여 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고 상반된 조건으로도 동일하게 실시하여 각 혼합액의 MIC 값을 결정하였다.
그 결과, 하기 [표 5] 내지 [표 9]에서 나타낸 바와 같이, 기존의 항생제인 에리트로마이신, 반코마이신 또는 리네졸리드를 본 발명의 항생 펩타이드인 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 또는 PapMA-24와 함께 투여한 항균 활성의 시너지 효과를 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드를 1/2 MIC가로 처리하였을 때 대장균과 이의 내성균 및 A. baumannii와 이의 내성균에 대해 에리트로마이신의 MIC가 1024 배까지 낮아지는 것을 확인하였다(표 5 내지 표 9).
구체적으로, 본 발명의 유도체 펩타이드의 모체 펩타이드인 PapMA-1의 경우, 대장균에 대한 MIC 농도는 64 ㎍/㎖이었다. 항생 펩타이드와 기존 항생제와의 혼합 처리시 시너지 효과를 확인하기 위하여, PapMA-1의 MIC의 1/4 농도인 16 ㎍/㎖로 처리하면서 항생제인 에리트로마이신, 반코마이신 또는 리네졸리드와 함께 혼합하여 대장균에 처리하였을 때, 에리트로마이신의 MIC 값이 각각 0.5 ㎍/㎖(항생제 MIC의 1/256)로 감소하였고, 리네졸리드와 혼합한 경우에서 MIC 값이 각각 16 ㎍/㎖(각각 항생제 MIC의 1/16)로 감소하여, PapMA-1 펩타이드는 항생제와 유의적인 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이와 동일한 방법으로 본 발명의 유도체 펩타이드를 기존 항생제와 혼합 처리하여 시너지효과를 나타내는지 확인하였다. PapMA-21은 대장균에 대하여 32 ㎍/㎖의 MIC를 나타내었고, 이의 1/2 농도인 16 ㎍/㎖으로 PapMA-21을 에리트로마이신, 반코마이신 또는 리네졸리드와 혼합하여 처리한 경우에서, 에리트로마이신, 반코마이신 및 리네졸리드의 MIC 값은 각각 0.25, 8 및 8 ㎍/㎖을 가져, 각각 항생제를 단독으로 처리하는 경우의 MIC 값보다 1/512, 1/128 및 1/32 수준으로 감소하는 것을 확인하였다(표 5).
이를 통하여, PapMA-21 펩타이드는 PapMA-1 펩타이드보다 단독으로 투여하는 경우에서도 보다 낮은 MIC 농도를 나타내어 우수한 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 항생제와 혼합 처리하는 경우에서 에리트로마이신, 반코마이신 및 리네졸리드의 MIC 값이 PapMA-1 펩타이드와 혼합 처리하는 경우보다 더욱 감소된 수준을 나타내는 것을 알 수 있다. 이와 같은 방법으로 비교하였을 때, 본 발명의 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24 펩타이드가 PapMA-1 펩타이드보다 기존 항생제와의 시너지 효과를 높은 수준으로 나타내는 것을 확인하였다.
대장균과 동일한 방법으로 A. baumannii와 다제내성균인 MDREC1229 및 MDRAB12035에 대하여도 항생 펩타이드와 항생제의 혼합 처리에 따라 항생제의 MIC 농도 변화를 확인하였으며, 하기 [표 6] 내지 [표 8]에 나타난 바와 같이 본 발명의 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24 펩타이드는 기존 항생제와의 혼합 처리에서 유의적인 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24 펩타이드는 PapMA-1 보다 동일 또는 낮은 농도의 MIC를 나타내어 PapMA-1 보다 우수한 항균 활성을 나타낼 뿐 아니라, 항생제와 혼합하여 대상 균주에 처리하였을 때 항생제의 MIC 값이 PapMA-1과 동일 또는 2 내지 4배 낮은 수준을 나타내는 것을 확인하여, PapMA-1 보다 상승된 수준의 시너지 항균 활성을 나타내는 것으로 확인하였다(표 5 내지 표 8).
본 발명의 항생 펩타이드 처리 시, 대장균에 대한 항생제의 항균 활성
E. coli
펩타이드 처리 농도
(㎍/㎖)		 항생제 MIC(㎍/㎖)
Erythromycin Vancomycin Linezolid
Compound Alone 128 1024 256
PapMA-1
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (1) 0 0 0
32 (1/2) 0.125 4 8
16(1/4) 0.5 16 16
8 (1/8) 2 32 16
6 (1/11) 4 32 16
4 (1/16) 16 >128 64
2 (1/32) 32 >128 128
1 (1/64) 64 >128 128
PapMA-21
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 8 8
8 (1/4) 1 32 16
6 (1/5) 2 64 32
4 (1/8) 8 >128 64
2 (1/16) 32 >128 128
1 (1/32) 64 >128 >128
PapMA-22
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 1 16 16
8 (1/4) 2 32 32
6 (1/5) 8 64 32
4 (1/8) 16 128 64
2 (1/16) 32 >128 128
1 (1/32) 128 >128 >128
PapMA-23
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.5 8 16
8 (1/4) 2 16 16
6 (1/5) 4 64 32
4 (1/8) 16 >128 64
2 (1/16) 64 >128 128
1 (1/32) 128 >128 >128
PapMA-24
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.5 8 8
8 (1/4) 2 16 32
6 (1/5) 4 32 32
4 (1/8) 16 128 64
2 (1/16) 32 >128 128
1 (1/32) 64 >128 >128
본 발명의 항생 펩타이드 처리 시, MDREC 1229에 대한 항생제의 항균 활성
MDREC 1229
펩타이드 처리 농도
(㎍/㎖)		 항생제 MIC(㎍/㎖)
Erythromycin Vancomycin Linezolid
Compound Alone 256 >1024 512
PapMA-1
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (1) 0 0 0
32 (1/2) 0.25 8 8
16(1/4) 1 16 16
8 (1/8) 4 128 32
6 (1/11) 8 >128 64
4 (1/16) 16 >128 64
2 (1/32) 32 >128 128
1 (1/64) 128 >128 >128
PapMA-21
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 2 16 16
8 (1/4) 4 128 32
6 (1/5) 8 >128 64
4 (1/8) 32 >128 128
2 (1/16) 64 >128 >128
1 (1/32) 128 >128 >128
PapMA-22
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 2 32 16
8 (1/4) 4 64 32
6 (1/5) 16 >128 64
4 (1/8) 32 >128 128
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 128 >128 >128
PapMA-23
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 1 16 16
8 (1/4) 4 32 32
6 (1/5) 8 128 32
4 (1/8) 32 >128 64
2 (1/16) 64 >128 128
1 (1/32) 128 >128 >128
PapMA-24
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 1 16 8
8 (1/4) 2 32 32
6 (1/5) 8 64 64
4 (1/8) 32 >128 64
2 (1/16) 64 >128 128
1 (1/32) 128 >128 >128
본 발명의 항생 펩타이드 처리 시, A. baumannii 에 대한 항생제의 항균 활성
A. baumannii
펩타이드 처리 농도
(㎍/㎖)		 항생제 MIC(㎍/㎖)
Erythromycin Vancomycin Linezolid
Compound Alone 32 1024 256
PapMA-1
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (1) 0 0 0
32 (1/2) 0.0625 2 4
16(1/4) 0.125 8 4
8 (1/8) 0.5 8 8
6 (1/11) 2 16 32
4 (1/16) 8 32 32
2 (1/32) 16 128 128
1 (1/64) 32 >128 >128
PapMA-21
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 8 2
8 (1/4) 1 16 16
6 (1/5) 2 32 16
4 (1/8) 8 64 32
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
PapMA-22
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (4) 0 0 0
32 (2) 0 0 0
16(1) 0 0 0
8 (1/2) 1 8 8
6 (1/3) 2 32 16
4 (1/4) 8 64 32
2 (1/8) 32 128 >128
1 (1/16) 32 >128 >128
PapMA-23
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 4 2
8 (1/4) 0.5 8 4
6 (1/5) 4 32 16
4 (1/8) 8 64 64
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
PapMA-24
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (4) 0 0 0
32 (2) 0 0 0
16(1) 0 0 0
8 (1/2) 0.5 8 4
6 (1/3) 2 16 8
4 (1/4) 8 64 64
2 (1/8) 32 128 >128
1 (1/16) 32 >128 >128
본 발명의 항생 펩타이드 처리 시, MDRAB 12035에 대한 항생제의 항균 활성
MDRAB 12035
펩타이드 처리 농도
(㎍/㎖)		 항생제 MIC(㎍/㎖)
Erythromycin Vancomycin Linezolid
Compound Alone 32 >1024 512
PapMA-1
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (1) 0 0 0
32 (1/2) 0.125 8 4
16(1/4) 0.25 16 8
8 (1/8) 0.5 16 16
6 (1/11) 4 32 32
4 (1/16) 16 128 64
2 (1/32) 32 >128 128
1 (1/64) 32 >128 >128
PapMA-21
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.5 16 8
8 (1/4) 1 32 16
6 (1/5) 4 64 32
4 (1/8) 16 128 64
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
PapMA-22
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 8 8
8 (1/4) 1 16 16
6 (1/5) 2 32 16
4 (1/8) 16 128 64
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
PapMA-23
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 8 4
8 (1/4) 1 16 16
6 (1/5) 4 32 32
4 (1/8) 16 128 64
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
PapMA-24
concentration
(Concentration/MIC)		 64 (2) 0 0 0
32 (1) 0 0 0
16 (1/2) 0.25 8 4
8 (1/4) 1 16 8
6 (1/5) 2 32 16
4 (1/8) 16 64 64
2 (1/16) 32 >128 >128
1 (1/32) 32 >128 >128
<3-2> 항생 펩타이드 및 항생제 혼합 처리시 항생 펩타이드의 MIC 변화 확인
항생 펩타이드 및 항생제를 혼합 처리하였을 때 시너지 효과로 인해 항생제의 MIC가 유의적으로 감소할 수 있음을 확인하였으므로, 항생 펩타이드 및 항생제를 혼합 처리하였을 때 항생 펩타이드의 MIC 농도가 변화하는지 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 9] 내지 [표 13]에 나타낸 바와 같이, 항생제를 가했을 때 항균펩타이드의 항균활성을 측정한 결과, E. coli 와 그 내성균(MDREC 1229), A.baumannii와 그 내성균(MDRAB 12035)에 대해 항생제를 가하면 항균펩타이드의 MIC가 256배까지 낮아지는 것을 확인하였다(표 9 내지 표 13).
예를 들어 본 발명에서 확인한 바와 같이, A. baumannii의 다재내성균 MDRAB 12035에 대한 에리트로마이신의 MIC 값은 32 ㎍/㎖이다. 에리트로마이신을 기준으로 하였을 때 항생 펩타이드와 기존 항생제와의 혼합 처리에 의한 시너지 효과를 확인할 수 있다. 에리트로마이신의 MIC의 1/4 농도인 8 ㎍/㎖로 PapMA-1 펩타이드와 혼합하여 MDRAB 12035에 처리하였을 때, PapMA-1의 MIC 값이 4 ㎍/㎖으로 감소하여 항생 펩타이드를 단독으로 처리할 때의 MIC 값 보다 1/16 수준으로 감소하는 것을 확인하였다. 이에 비해, 본 발명의 유도체 펩타이드를 적용하였을 때, 반코마이신을 256 ㎍/㎖ 농도로 처리하는 경우 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24의 MIC는 각각 4 ㎍/㎖로 감소하여, 단독으로 처리할 때의 MIC 값 보다 1/8 수준으로 감소하는 것을 확인하여, 본 발명의 항생 펩타이드를 항생제와 혼합하여 처리하였을 때 항균 활성에서 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다(표 12).
이와 동일한 방법으로 비교하였을 때, 본 발명의 기존 항생제와 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24펩타이드를 혼합 처리하였을 때 항생 펩타이드를 1/2 내지 1/128 수준의 농도로 처리하여도 유의적인 항균 활성을 나타낼 수 있음을 확인하여, PapMA-1와 유사하거나 상승된 수준의 시너지 항균활성을 나타내는 것으로 확인하였다(표 9 내지 표 12).
항생제 처리 시, 대장균에 대한 본 발명의 항균 펩타이드의 항균 활성
E. coli
항생제 처리농도(㎍/㎖) 펩타이드 MIC(㎍/㎖)
PapMA-1 PapMA-21 PapMA-22 PapMA-23 PapMA-24
peptide alone 64 32 32 32 32
Erythromycin
conc
(Conc/MIC)		 128 (1) 0 0 0 0 0
64 (1/2) 1 1 2 2 1
32 (1/4) 2 2 2 4 2
16 (1/8) 4 4 4 4 4
Vancomycin
conc
(Conc/MIC)		 1024 (1) 0 0 0 0 0
512 (1/2) 2 2 2 2 2
256 (1/4) 4 4 4 4 4
128 (1/8) 8 8 4 8 4
Linezolid
conc
(Conc/MIC)		 256 (1) 0 0 0 0 0
128 (1/2) 1 2 2 2 2
64 (1/4) 4 4 4 4 4
32 (1/8) 4 8 8 8 8
항생제 처리 시, MDREC 1229에 대한 본 발명의 항균 펩타이드의 항균 활성
MDREC 1229
항생제 처리농도(㎍/㎖) 펩타이드 MIC(㎍/㎖)
PapMA-1 PapMA-21 PapMA-22 PapMA-23 PapMA-24
peptide alone 64 32 32 32 32
Erythromycin
conc
(Conc/MIC)		 256 (1) 0 0 0 0 0
128 (1/2) 1 1 1 1 1
64 (1/4) 1 2 2 2 2
32 (1/8) 2 2 2 4 4
Vancomycin
conc
(Conc/MIC)		 1024 (1) 1 2 2 1 1
512 (1/2) 2 2 2 2 2
256 (1/4) 4 4 4 4 4
128 (1/8) 8 8 8 8 8
Linezolid
conc
(Conc/MIC)		 512 (1) 0 0 0 0 0
256 (1/2) 1 1 1 1 1
128 (1/4) 2 4 4 2 2
64 (1/8) 2 8 8 4 4
항생제 처리 시, A. baumannii 에 대한 본 발명의 항균 펩타이드의 항균 활성
A. baumannii
항생제 처리농도(㎍/㎖) 펩타이드 MIC(㎍/㎖)
PapMA-1 PapMA-21 PapMA-22 PapMA-23 PapMA-24
peptide alone 64 32 16 32 16
Erythromycin
conc
(Conc/MIC)		 32 (1) 0 0 0 0 0
16 (1/2) 2 2 4 4 4
8 (1/4) 4 4 4 4 4
4 (1/8) 4 8 8 8 8
Vancomycin
conc
(Conc/MIC)		 1024 (1) 0 0 0 0 0
512 (1/2) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
256 (1/4) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
128 (1/8) 4 4 2 4 2
Linezolid
conc
(Conc/MIC)		 256 (1) 0 0 0 0 0
128 (1/2) 0.5 1 1 1 1
64 (1/4) 4 4 4 4 4
32 (1/8) 4 4 4 8 8
Figure 112017044416315-pat00003
<3-3> 항생 펩타이드 및 항생제 혼합 처리시 MIC 값을 이용한 항균 활성의 시너지 효과 확인
각 혼합액에 대하여 결정한 MIC 값을 이용하여, 균주에 대한 항균 활성에서 펩타이드와 항생제의 시너지효과를 평가하였다. 평가를 위하여, 분할 저해 농도(Fractional inhibitory 농도; FIC) 값을 사용하였다(Elion, Gertrude B., Samuel Singer, and George H. Hitchings. Journal of Biological Chemistry 208.2 (1954): 477-488.).
구체적으로, 상기 실시예 <3-1> 및 <3-2>에서 계산한 MIC 값을 이용하여, 하기 [수학식 1]에 의해 FIC 값을 계산하였으며, 계산한 FIC 값에 따라 다음과 같이 평가하였다: <0.5, 시너지 효과(Synergy effect); 0.5~1, 부분 시너지 효과(Partial synergy effect); 1.0, 상가 효과(Additive effect); 2.0~4.0, 무차별(Indifference); >4.0, 길항작용 (Antagonism).
Figure 112017044416315-pat00004
FIC 값을 사용하여 시너지 효과를 판단하기 위해 일반적으로 사용하는 방법은 체커보드 분석법(Checkerboard assay)으로서, 균의 생장이 억제되는 웰 중 가장 낮은 FIC index 값을 선택하는 방법이다. 그러나, 이러한 방법에서 하나의 FIC index를 선택하는 것은, 항생제의 항균 활성이 더 낮은 경우 큰 시너지 효과를 가지도록 계산되어 정확하지 않고 실험적 오차가 많다는 문제점을 가진다. 이에, 상기 [수학식 1]로 계산한 FIC index는 다시 하기 [수학식 2]를 사용하여 평균 FIC index를 계산하였다(He, Jing, Charles G. Starr, and William C. Wimley. Biochimica et Biophysica Acta ( BBA )- Biomembranes 1848.1 (2015): 8-15.).
Figure 112017044416315-pat00005
그 결과, 하기 [표 13] 내지 [표 19]에서 나타난 바와 같이 기존의 항생제인 에리트로마이신, 반코마이신 또는 리네졸리드를 본 발명의 항생 펩타이드인 PapMA-21, PapMA-22, PapMA-23 및 PapMA-24와 함께 투여한 항균 활성의 시너지 효과를 FIC값을 이용하여 확인한 결과, 그람 양성균에만 높은 항균활성을 가지고 그람음성균에 활성이 없는 항생제들과 본 발명의 항생 펩타이드를 함께 투여했을 때 모든 항생제에 대하여 그람 음성균인 E. coli에 대해서 0.5보다 낮거나 유사한 수준인 0.15 내지 0.36의 FIC index를 가져 시너지효과가 우수함을 확인하였다(표 13). 또한 다제내성 대장균(MDREC 1229)에 대해서 0.5보다 매우 낮은 0.14 내지 0.28 범위의 FIC index를 가져 시너지효과가 매우 우수함을 확인하였다(표 14).
A. baumannii에 대해서는 0.5보다 매우 낮거나 유사한 수준인 0.10 내지 0.54의 FIC index를 가져 시너지효과가 매우 우수함을 확인하였고(표 15), 그 내성균(MDRAB 12035)에 대해서는 0.5보다 매우 낮은 0.16 내지 0.49의 FIC index를 가져 시너지 효과가 매우 우수함을 확인하였다(표 16).
이에 따라, 최근 심각한 내성 문제로 사회적 이슈가 되고 있는 그람음성균들에 대해 기존 항생제와의 복합제로 본 발명의 항생 펩타이드를 사용하면, 높은 시너지효과를 가질 수 있는 것으로 확인하였다(표 13 내지 표 16, 도 1 및 도 2).
Figure 112017044416315-pat00006
Figure 112017044416315-pat00007
Figure 112017044416315-pat00008
Figure 112017044416315-pat00009
이하, 본 발명에 따른 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. 본 발명의 그람 음성균 및 그람 양성균에 대한 항균 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 가지고 하기와 같은 조성성분 및 조성비에 따라 제조예 1의 의약품을 통상적인 방법에 따라서 제조하였다.
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린선 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐 제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<1-6> 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 및 항균제 복합제 500 ng
만니톨 180 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
증류수 2974 mg
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Antimicrobial peptides substituted D-leucine for improving antibiotics effect and their uses <130> 1062341 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-1 <400> 1 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Ala Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-2 <400> 2 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-3 <400> 3 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Trp Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-4 <400> 4 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Trp Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-5 <400> 5 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-6 <400> 6 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Ser Leu Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-7 <400> 7 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Ser Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-8 <400> 8 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Ser Leu Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-9 <400> 9 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Ser Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-10 <400> 10 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Ser Leu Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-11 <400> 11 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-12 <400> 12 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Glu Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-13 <400> 13 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Leu Leu His Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-14 <400> 14 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Pro Lys Phe Leu His Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-15 <400> 15 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Ser Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-16 <400> 16 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Ser Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-17 <400> 17 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-18 <400> 18 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Lys Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-19 <400> 19 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Glu Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-20 <400> 20 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Lys Lys Leu Leu His Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-21 <400> 21 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-22 <400> 22 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Lys Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-23 <400> 23 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Glu Phe Lys 1 5 10 15 Lys Phe <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PapMA-24 <400> 24 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Trp

Claims (11)

  1. 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된, 항생 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 항생 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는, 항균용 조성물.
  4. 제 1항의 항생 펩타이드 및 항생제를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 그람 양성균, 그람 음성균 및 이의 항생제 내성균주에 대해 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa), 아세네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  9. 제 4항에 있어서, 상기 항생제는 에리트로마이신(Erythromycin), 암피실린(Ampicillin), 반코마이신(Vancomycin), 리네졸리드(Linezolid), 메티실린(Methicillin), 옥사실린(Oxacillin), 세포탁심(Cefotaxime), 리팜피신(Rifampicin), 아미카신(Amikacin), 겐타마이신(Gentamicin), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 토브라마이신(Tobramycin), 네오마이신(Neomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 도리페넴(Doripenem), 이미페넴/실라스타틴(Imipenem/Cilastatin), 메로페넴(Meropenem), 세프타지딤(Ceftazidime), 세파핌(Cefepime), 세프타로린(Ceftaroline), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 아즈트레오남(Aztreonam), 피페라실린(Piperacillin), 폴리믹신 B(Polymyxin B), 콜리스틴(Colistin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 티게사이클린(Tigecycline), 이의 배합체 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  10. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 약학적 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 방부용 조성물 및 의약외품 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  11. 서열번호 21 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 신규 펩타이드.


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Biochemistry, Vol. 54, pp. 3921-3931 (2015.06.08.)*
Peptides, Vol. 33, pp. 197-205 (2012.01.24.)

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