KR102177371B1

KR102177371B1 - 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 동물용 항균제 조성물

Info

Publication number: KR102177371B1
Application number: KR1020190074710A
Authority: KR
Inventors: 홍성택; 이지영
Original assignee: 에스비신일(주)
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2020-11-12

Abstract

본 발명은 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 동물용 항균제 조성물에 관한 것으로, 돼지 세균성 소화기 및 호흡기 질환의 예방, 개선 치료할 수 있는 항균제를 제공할 수 있어, 축산 농가에서 안전하고 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대한다.

Description

클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 동물용 항균제 조성물{Antibiotic composition for animals comprising chlortetracycline, neomycin, and loperamide as active ingredients}

본 발명은 동물용 항균제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 동물용 항균제 조성물에 관한 것이다.

돼지에서 호흡기 질환을 일으키는 원인체로는 바이러스, 세균, 곰팡이 등이 있으며, 이중 세균성 질병은 높은 감염율과 동시에 높은 폐사율을 유발하여 큰 경제적 손실을 유발한다. 돼지의 주요 세균성 호흡기질병으로는 흉막폐렴(Actinobacillus pleuropneumoniae), 유행성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae), 파스튜렐라폐렴(Pasteurella multocida) 등이 있다.

돼지에서 세균성 설사증의 주요 원인체로 대장균(E. coli), 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움균(Clostridium perfringens), 돼지 적리균 등이 있으며, 돼지설사증은 모든 연령에서 발생하며, 주요 증상은 패혈증, 설사, 부종병, 발열, 장관 내 회색 수양물의 저류 등이다. 대장균 및 살모넬라균에 의한 설사증은 회복하여도 위축돈이 되는 경우 증체량 저하, 사료효율 감소, 출하일수 지연 및 치료에 필요한 약품비용 증대 등 경제적으로 큰 피해를 주게 된다.

밀집사육으로 인하여 다발되고 있는 각종 감염증에 대한 대책은 양돈 경영 개선을 위해 우선적으로 고려하여야 할 사항이다. 소화기 및 호흡기 질병을 제어하고 치료하기 위해서 항균제의 사용이 효과적이다. 그러나 수의 약리학적 및 임상학적으로 충분한 검토가 없이 무절제적인 약물 사용은 결과적으로 각종 항균성 물질에 대한 내성균의 발현을 조장함으로써, 치료 및 증체효과를 제고하기 위한 여러 방책들을 무위로 끝나게 할 수도 있다. 대체로 많은 내성균들은 단일 항균요법에 대해 내성을 보이고 있어 최근의 수의약제학적 지견은 과학적인 근거에 의한 복합 항균물질 처방제제 개발에 따른 다제 내성균 살멸을 시도하는 방향으로 움직이고 있다. 그러나 이러한 방향에서 주의할 점은 무분별한 합제의 개발로 단점이 장점을 능가하여 부작용이 발생될 수 있다는 사실도 함께 주의를 하여야 한다.

호흡기 질환 치료용으로 사용하는 물질 중 클로르테트라사이클린(Chlortetracycline)은 테트라사이클린계열의 항균제로서 그람음성, 그람양성, 클라미디아, 리켓치아, 마이코플라즈마 등에 작용하는 광범위 항균제이다. 클로르테트라사이클린은 세균의 30S 리보좀에 작용하여 aminoacyl-tRNA 결합을 차단하며 결과적으로 단백질 합성을 억제하여 세균의 성장을 저해한다. 네오마이신(Neomycin)은 아미노글리코사이드계 항균제로 세균의 리보솜 30S subunit에 결합하여 단백질 합성을 차단하는 기전으로 항균효과를 나타내며, 포도상구균, 대장균, 살모넬라 등의 그람양성과 음성균에 모두 효과적으로 작용하는 항균제이다. 로페라마이드(Loperamide)는 piperidine 유도체로 opioids인 페티딘(pethidine)과 화학구조가 유사하며, 장의 연동운동을 억제하여 지사작용을 나타낸다. 또한 최근 항바이러스 효과에 대한 연구가 한창 진행 중인 약물로 알려져 있다.

한편, 동물의 호흡기 질환 치료에 사용될 수 있는 항균제 조성물과 관련된 종래 기술로는 등록특허공보 제10-0371090호(동물용 복합항균제 조성물) 및 등록특허공보 제10-0756164호(플로르페니콜 및 타이로신을 유효 성분으로 함유하는 복합 항균제 조성물) 등이 있으나, 상기 물질들을 이용한 것은 아니므로 기술적 특징이 상이하다.

이에 본 발명자들은 동물의 호흡기 질환에 사용되는 상기 물질을 특정 배합비로 포함시켜 이들 물질을 단독으로 투여할 때보다 상승효과가 뛰어난 항균제 조성물을 개발하고자 하였다.

등록특허공보 제10-0371090호 등록특허공보 제10-0756164호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 동물의 호흡기 질환뿐만 아니라 소화기 질환의 예방, 개선 또는 치료용으로 사용될 수 있는 동물용 항균제 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 동물용 항균제 조성물을 제공한다.

또한, 상기 조성물을 포함하는 동물의 호흡기, 소화기 질환의 예방, 개선, 치료용 조성물을 제공한다.

상기 항균제 조성물은 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함한다.

상기 조성물 중 네오마이신은 클로르테트라사이클린 100중량부 대비 30 내지 70 중량부, 바람직하게는 40 내지 60 중량부 포함될 수 있다.

상기 조성물 중 로페라마이드는 클로르테트라사이클린 100중량부 대비 0.1 내지 3 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량부 포함될 수 있다.

상기 범위를 벗어나게 될 경우, 병원균에 대한 항균 효과가 낮아질 수 있다.

상기 조성물은 호흡기 또는 소화기 질환 원인체 균주에 대해 우수한 항균 효과가 인정되며, 제한되지는 않지만 바람직하게는 액티노바실러스 플로르뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 대장균(Escherichia coli ) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 우수한 항균효과를 나타낸다.

상기 항균제 조성물을 유효성분으로 함유하는 약제는 산제, 액제, 주사제, 연고제 등으로 제형화 될 수 있다.

또한, 항균제 조성물을 제형화할 때 당 업계에서 통상적으로 사용되는 첨가제, 보조 성분, 또는 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 제조된 항균제 조성물의 투여시 첨가제는 사료에 혼합하여 투여되고, 산제, 펠릿, 그래뉼, 동물용 주사제, 경구투여용 액제 등으로 제형화하여 투여할 수 있다.

상기 조성물을 사료에 혼합하여 투여할 시, 제한되지는 않지만 사료의 톤당 1 내지 3kg랑 포함시켜 투여할 수 있다.

또한, 상기 조성물을 투여할 시, 바람직하게는 7일간 투여할 수 있고, 이후 휴약기간을 가질 수 있다.

본 발명은 클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하는 항균제로, 돼지 세균성 소화기 및 호흡기 질환의 예방, 개선 치료할 수 있는 조성을 제공할 수 있어, 축산 농가에서 안전하고 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대한다.

도 1은 APP type2 (래인 1), PM type A (래인 2), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae) (래인 3), 대장균(E.coli) F18 and Stx2e (래인 4) and 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium) (래인 5)의 PCR 산물의 겔 전기영동의 특정 증폭물(amplicon)을 나타낸 것이다.
도 2는 호흡기질환 실험 기간 동안 각 그룹의 사료 섭취량 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 호흡기질환 실험 기간 동안 각 그룹의 직장 온도 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 호흡기질환에 감염된 돼지의 임상 증상을 나타낸 것이다.
도 5는 호흡기질환 실험기간 동안 각 그룹의 돼지에서 관찰된 임상 지표를 나타낸 것이다.
도 6은 호흡기질환 실험기간 동안 각 그룹의 돼지에서 비강내 세균 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 무처리군 돼지의 폐 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 공격접종군의 돼지의 폐 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 공격접종 후 실시예 돼지의 폐 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 비교예 1 접종군의 돼지의 폐 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 비교예 2 접종군의 돼지의 폐 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 무처리군 돼지의 폐 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 13은 공격접종군 돼지의 폐 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 돼지의 폐 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 15은 비교예 1 돼지의 폐 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 16은 비교예 2 돼지의 폐 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 17은 소화기질환 실험 기간 동안 각 그룹의 사료 섭취량 변화를 나타낸 것이다.
도 18은 소화기질환 실험 기간 동안 각 그룹의 직장 온도 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 대장균(E.coli)과 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 감염된 돼지의 임상 증상을 나타낸 것이다.
도 20은 소화기질환 실험기간 동안 각 그룹의 돼지에서 관찰된 임상 지표를 나타낸 것이다.
도 21은 소화기질환 실험기간 동안 각 그룹의 대변에서 대장균(E.coli)의 일일 평균 CFU를 나타낸 것이다.
도 22는 소화기질환 실험기간동안 각 그룹의 대변에서 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 일일 평균 CFU를 나타낸 것이다.
도 23은 무처리군 돼지의 장 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 공격접종군 돼지의 장 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 돼지의 장 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 비교예 1 돼지의 장 육안 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 비교예 2 돼지의 장 병변 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 무처리군 돼지의 장의 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 29는 공격접종군 돼지의 장의 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 30은 실시예 돼지의 장의 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 31은 비교예 1 돼지의 장의 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.
도 32는 비교예 2 돼지의 장의 조직학적 검사결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

클로르테트라사이클린(Chlortetracycline) 100g (역가), 네오마이신(Neomycin) 50g (역가), 로페라마이드(Loperamide) 1g의 조성으로 하여 산제 분말을 제조하여 돼지의 일일 사료 톤 당 본제 1~2kg을 혼합하여 7일간 투여하였다.

<비교예 1>

클로르테트라사이클린 100g (역가), 로페라마이드(Loperamide) 1g의 조성으로 하여 산제 분말을 제조하여 돼지의 일일 사료 톤당 본제 1~2kg을 혼합하여 7일간 투여하였다.

<비교예 2>

네오마이신 50g (역가), 로페라마이드(Loperamide) 1g의 조성으로 하여 산제 분말을 제조하여 돼지의 일일 사료 톤 당 본제 1~2kg을 혼합하여 7일간 투여하였다.

<실험예 1> MIC 및 MBC 시험

MIC는 최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration)로 항균력을 측정하는 가장 기초적인 지표로 시험 관내 세균 감수성 검사(in vitro sensitivity test)에서 미생물의 번식을 억제할 수 있는 항균제의 최저농도이며, MBC는 최소살균농도(Minimal Bactericidal Concentration)로, 병원균의 양을 적어도 99.9%(즉 10^5-6/mL에서 ≤10^2-3/ mL) 이상 감소시키는 항균제의 최소농도이다.

MIC와 MBC시험은 CLSI VET01-A4 (2013)와 CLSI M26-A (1999)에 준하여 실시하였고, 시험에 사용한 공시 균주는 표 1과 같다.

Bacterial species	Strains	Year	Source
Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)	App-HS-1	2013	돼지 (type 1)	호서대
	App-HS-2	2013	돼지 (type 1)	호서대
	App-HS-3	2013	돼지 (type 2)	호서대
	APP-HS-4	2013	돼지 (type 5)	호서대
	ATCC 27090	-	-	ATCC
Pasteurella multocida (PM)	PM-HS-1	2013	돼지	호서대
	PM-HS-2	2013	돼지	호서대
	PM-HS-3	2013	돼지	호서대
	PM-HS-4	2013	돼지	호서대
	ATCC 43137	-	-	ATCC
Mycoplasma hyopneumoniae (MH)	BA0002798	-	-	농림축산검역본부
	MYH-HS-1	2012	돼지	호서대
	MYH-HS-2	2012	돼지	호서대
	ATCC 25095	-	-	ATCC
E.coli	EC-HS-1	2014	돼지	호서대
	EC-HS-2	2014	돼지	호서대
	EC-HS-3	2015	돼지	호서대
	EC-HS-4	2015	돼지	호서대
	ATCC25922	-	-	ATCC
Salmonella typhimurium	Stm-HS-1	2014	돼지	호서대
	Stm-HS-2	2014	돼지	호서대
	Stm-HS-3	2015	돼지	호서대
	Stm-HS-4	2015	돼지	호서대
	ATCC BAA-187	-	-	ATCC
MIC reference strain	E.coli ATCC 25922

1-1. 시험물질의 조제 및 희석

클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 실시예를 각각 10mg씩 칭량한 후 멸균증류수 10mL로 희석하여 stock solution (1mg/mL)을 만든 후 멸균증류수로 추가 희석하여 사용하였다. 공시 제품인 실시예의 경우 유효성분인 클로르테트라사이클린과 네오마이신 농도가 100μg/mL와 50μg/mL이었다.

시험물질의 공시 농도는 표 2와 같이 되도록 시험물질 처리 농도군을 구성하였으며, 이 때 사용되는 희석액은 각 균주의 접종액과 동일한 배지를 사용하였다. 즉, 멸균 96-well microplate (F bottom, SPL)를 미리 준비하여 균주명과 항균제명을 기입한 후 첫 well을 제외한 나머지 well에 배지를 분주하였다. 최고 농도군의 well에 시험물질 0.1mL씩를 분주하고 이 중 0.05mL를 취하여 다음 농도군의 well에 분주되어 있는 broth와 공비 2로 단계별 희석하였다.

시험물질	용매	희석용매	공시 균주	공시 농도범위 (μg/mL)
비교예 1	멸균 증류수	멸균 증류수	A. pleuropneumoniae	1.563~400
			P. multocida	1.563~400
			M. hyopneumoniae	1.953~500
			E.coli	1.953~500
			Sal. typhimurium	1.953~500
비교예 2	멸균 증류수	멸균 증류수	A. pleuropneumoniae	1.953~500
			P. multocida	1.953~500
			M. hyopneumoniae	1.563~400
			E.coli	0.977~250
			Sal. typhimurium	0.977~250
실시예	멸균 증류수	멸균 증류수	A. pleuropneumoniae	0.195/0.098~50/25
			P. multocida	0.313/0.156~80/40
			M. hyopneumoniae	0.195/0.098~50/25
			E.coli	0.313/0.156~80/40
			Sal. typhimurium	0.195/0.098~50/25

마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)의 경우에는 준비된 microplate에 Friis media (pH 7.4)를 첫 well을 제외한 각각의 well에 0.1mL씩 분주하였다. 최고 농도군의 well에 시험물질 0.2mL을 분주하여 그 중 0.1mL을 취하여 다음 농도군의 well에 분주되어 있는 broth와 공비 2로 단계별 희석하였다.

1-2. 균액 준비

마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)를 제외한 각 공시 균주를 5% sheep blood agar, choco agar 또는 MacConkey agar에 도말하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 18~24시간 배양한 후 4~6개의 단일 콜로니를 취하여 액체배지에 접종한 후 37℃ 배양기 또는 37℃, 5% CO₂에서 2~6 시간 배양하였다. 배양된 세균의 탁도를 MacFarland No. 0.5에 맞추어 균수가 약 1.5×10⁸CFU/mL이 되도록 조정한 후 희석액으로 100배 희석하여 약 1.5×10⁶CFU/mL의 접종 균액을 준비하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)를 Friis media에 접종하여 37℃, 5% CO₂에서 10~14일간 배양하고 균액을 1×10⁵CCU(colorchangeunits)/mL로 조정하여 접종균액을 준비하였다(표 3).

각 세균의 배지 및 배양 조건

균주명	배양 배지		배양조건
균주명	agar	MIC Broth	배양조건
A. pleuropneumoniae	ISO agar	BHI+0.01% NAD	35±2℃, 5±2% CO₂,20~24h
P. multocida	5% sheep blood agar	CAMH^a	35±2℃, non CO₂,18~24h
M. hyopneumoniae	-	Friis media	35±2℃, 5±2% CO₂,10~14days
E.coli	5% sheep blood agar	CAMH^a	35±2℃, non CO₂,18~24h
Salmonella typhimurium	MacConkey agar	CAMH^a	35±2℃, non CO₂,18~24h

^a: Cation-adjusted Muller Hiton broth

1-3. 균액 접종 및 배양

음성 대조군 well(12번째 well)을 제외한 각 well에 1.5x10⁶CFU/mL로 조정한 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 대장균(E.coli), 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium) 균액 0.05mL씩을 각각 분주하여 접종한 후 37℃ 배양기 또는 37℃, 5% CO₂배양기에서 18~24 시간 배양하였다. 또한, growth-control well에서 0.01mL를 취한 후 멸균생리식염수로 10mL에 희석하여 고체배지에 접종하여 도말한 후 초기 접종 균수를 측정하였다. MIC 시험에 사용된 접종균액의 균수를 확인한 결과 1.8~5.6×10⁵CFU/mL이었다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)은 각 well에 10⁵CCU(colorchangeunits)/mL로 조정한 균액 0.1mL 씩 분주한 후 sealing tape로 plate를 sealing한 후 37℃, 5% CO₂에서 배양하였으며, 매일 색깔 변화 여부를 관찰하였다. 색깔 변화의 유무는 pH 7.4 배양액과 pH 6.8 배양액 (color change endpoint) 0.2mL를 분주하여 이의 색깔을 근거로 판단하였다.

1-4. MIC 결정

액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 대장균(E.coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 MIC 농도는 18~24시간 경과한 후 균의 생육 유무를 육안으로 관찰하여 균이 자라지 않는 농도를 MIC 농도로 결정하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)는 매일 색깔 변화 여부를 관찰하여 균의 생육여부를 확인하고, 균 및 시험물질을 첨가한 well에서 배양액의 색깔을 근거로 하여 pH 7.4의 초기 배지의 색깔과 유사하거나 변화가 관찰되지 않는 최소 농도를 MIC 값으로 결정하였다.

1-5. MBC 결정

초기 접종 세균의 99.9%가 감소된 농도를 MBC 농도로 결정하였다. MIC 시험 진행 후 MIC 농도 well과 MIC 농도보다 높은 농도 3~4 well에서 0.01mL씩 3회 취하여 항균제가 첨가되어 있지 않는 배지에 접종하여 37℃ 배양기 또는 37℃, 5% CO₂배양기에서 18~24시간 배양하였다.

1-6. MIC 시험 타당성 검증

MIC 시험의 QC로 사용된 대장균(E.coli) ATCC 25922에 대한 테트라사이클린의 MIC값이 6.250μg/mL (MIC range: 2~8μg/mL)으로 이는 CLSI에서 제시한 MIC 범위에 합당하여 모든 MIC 결과는 유효하였다.

1-7. 항생물질 병용효과 검사

Checkerboard method를 적용하여 항생물질간의 병용효과를 확인하였다. 즉, 공시균에 대한 MIC 값이 포함되도록 두 종류의 항균제를 2배 계단희석하여 준비하였다. 균을 각각의 배지에 접종하여 배양한 후 각 well당 5x10⁴CFU가 들어가도록 희석한 후, 두 종류의 항균제가 들어있는 plate에 균을 0.1mL씩 분주한 후 37℃에서 18~24시간 배양하였다. 18~24시간 경과한 후 육안적으로 균의 생장이 억제된 최소의 농도를 판독하여 Fractory Inhibitory Concentration (FIC) Index를 구하였으며, FIC index 값에 따라 병용의 타당성 여부를 판단하였다.

Σ FIC 0.5: Synergism (상승) 0.5<Σ FIC≤0.75 : Partial synersim (부분적 상승), 0.75< Σ FIC 4: Indifference (상가) Σ FIC > 4 : antagonism (길항)

실험결과, 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae), 대장균(E.coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 항균효과를 확인한 결과, 실시예는 모든 공시균주에서 항균효과가 인정되었으며, 균주별 구체적인 실험결과는 다음과 같다.

(1) 액티노바실러스 플로르뉴모니아(Actinobacillus pleuropneuomoniae)

액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae) 야외분리균주 4주에 대하여 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 효과를 조사한 결과, 비교예 1의 MIC 범위는 25.0~50.0μg/mL이었으며, MIC₅₀및 MIC₉₀값은 각각 25.0μg/mL와 50.0μg/mL이었다. 비교예 2의 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae)에 대한 MIC₅₀및 MIC₉₀값은 모두 62.5μg/mL이었다. 실시예의 MIC 범위는 1.563+0.781~3.125+1.563μg/mL이었으며, MIC₅₀및 MIC₉₀는 각각 1.563+0.781과 3.125+1.563μg/mL으로 항균효과가 인정되었다. 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae)에 대한 비교예 1의 최소살균농도(MBC₉₀)는 100 μg/mL, 비교예 2은 125μg/mL, 실시예는 6.250+3.1258μg/mL으로 확인되었다(표 4).

액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 MIC 및 MBC

Antibiotic Bacterium		비교예1		비교예2		실시예
Antibiotic Bacterium		MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
Actinobacillus pleuropneumoniae	App-HS-1	50	100	62.5	125	3.125+1.563^a	6.250+3.125^a
	App-HS-2	25	50	62.5	62.5	1.563+0.781	3.125+1.563
	App-HS-3	25	50	62.5	62.5	1.563+0.781	3.125+1.563
	APP-HS-4	25	100	62.5	62.5	1.563+0.781	3.125+1.563
	MIC₅₀	25	-	62.5	-	1.563+0.781	-
	MIC₉₀	50	-	62.5	-	3.125+1.563	-
	MBC₅₀	-	50	-	62.5	-	3.125+1.563
	MBC₉₀	-	100	-	125	-	6.250+3.125
	표준균주	25	50	62.5	125	1.563+0.781	6.250+3.125

(μg/mL)

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

(2) 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)

파스튜렐라 멀토시다(P. multocida) 야외분리균주 4주에 대하여 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 효과를 조사한 결과, 비교예 1의 MIC₅₀및 MIC₉₀값은 모두 200μg/mL으로 항균효과가 미비하였으며, 비교예 2의 MIC 범위는 1.953~7.813μg/mL이었고, MIC₅₀과 MIC₉₀은 각각 1.953μg/mL과 7.813μg/mL으로 항균효과가 확인되었다. 실시예의 MIC는 모든 균주에서 10.0 + 5.0μg/mL으로 항균효과가 확인되었다. 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida) 야외분리균주에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 최소 살균농도(MBC₉₀)는 각각 400μg/mL, 15.625μg/mL 및 10.0+5.0μg/mL이었다(표 5).

파스튜렐라 멀토시다(P. multocida)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 MIC 및 MBC

Antibiotic Bacterium		비교예1		비교예2		실시예
Antibiotic Bacterium		MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
Pasteurella multocida	PM-HS-1	200	400	1.953	3.906	10.0+5.0^a	10.0+5.0^a
	PM-HS-2	200	400	1.953	7.813	10.0+5.0	10.0+5.0
	PM-HS-3	200	400	1.953	7.813	10.0+5.0	10.0+5.0
	PM-HS-4	200	400	7.813	15.625	10.0+5.0	10.0+5.0
	MIC₅₀	200	-	1.953	-	10.0+5.0	-
	MIC₉₀	200	-	7.813	-	10.0+5.0	-
	MBC₅₀	-	400	-	7.813	-	10.0+5.0
	MBC₉₀	-	400	-	15.625	-	10.0+5.0
	표준균주	100	200	7.813	15.625	2.50+1.25	2.50+1.25

(μg/mL)

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

(3) 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae)

마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae) 야외분리균주 3주에 대하여 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 효과를 조사한 결과, 비교예 1의 MIC 범위는 15.625~62.5μg/mL로 MIC₅₀과 MIC₉₀은 각각 31.25μg/mL와 62.5μg/mL이었으며, 비교예 2의 MIC₅₀과 MIC₉₀은 각각 6.25μg/mL, 12.5μg/mL이었다. 실시예의 MIC₅₀과 MIC₉₀은 모두 3.125+1.563μg/mL으로 항균효과가 현저하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 살균효과(MBC₉₀)는 각각 250μg/mL, 50μg/mL 및 6.25+3.125μg/mL이었다(표 6).

마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 MIC 및 MBC

Antibiotic Bacterium		비교예1		비교예2		실시예
Antibiotic Bacterium		MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
Mycoplasma hyopneumoniae	BA0002798	31.250	125	6.25	12.5	3.125+1.563	6.250+3.125
	MYH-HS-1	15.625	31.25	12.5	50	1.563+0.781	3.125+1.563
	MYH-HS-2	62.5	250	6.25	12.5	3.125+1.563	6.250+3.125
	MIC₅₀	31.25	-	6.25	-	3.125+1.563	-
	MIC₉₀	62.5	-	12.5	-	3.125+1.563	-
	MBC₅₀	-	125	-	12.5	-	6.250+3.125
	MBC₉₀	-	250	-	50	-	6.250+3.125
	표준균주	62.5	125	3.125	6.25	1.536+0.781	3.125+1.563

(μg/mL)

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

(4) 대장균(E.coli)

대장균(E.coli) 야외분리균주 4주에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 효과를 조사한 결과, 비교예 1의 MIC 범위는 125~>500 μg/mL이었으며, MIC₅₀값은 125μg/mL, MIC₉₀값은 >500 μg/mL으로 항균효과가 미비하였다. 비교예 2의 MIC₅₀과 MIC₉₀은 각각 0.977μg/mL와 62.5μg/mL이었으며, 실시예의 MIC 범위는 1.25+0.625~20.0+10.0μg/mL으로 MIC₅₀과 MIC₉₀은 각각 2.5+1.25μg/mL 와 20.0+10.0μg/mL이었다. E.coli에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 최소살균농도(MBC₉₀)은 각각 >500μg/mL, 125μg/mL 및 40+20μg/mL이었다(표 7).

대장균(E.coli)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 MIC 및 MBC

Antibiotic Bacterium		클로르테트라사이클린		네오마이신		실시예 (Chlortetracycline+Neomycin)
Antibiotic Bacterium		MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
E.coli	야외분리 1	>500	>500	15.625	62.5	20+10^a	40+20^a
	야외분리 2	125	250	0.977	1.953	1.250+0.625	2.50+1.25
	야외분리 3	125	250	62.5	125	20+10	40+20
	야외분리 4	>500	>500	0.977	3.906	2.50+1.25	10+5
	MIC₅₀	125	-	0.977	-	2.50+1.25	-
	MIC₉₀	>500	-	62.5	-	20+10	-
	MBC₅₀	-	250	-	3.906	-	10+5
	MBC₉₀	-	>500	-	125	-	40+20
	표준균주	125	250	62.5	100	1.250+0.625	2.50+0.625

(μg/mL)

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

(5) 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)

살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium) 야외분리균주 4주에 대하여 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 효과를 조사한 결과, 비교예 1의 MIC는 >500μg/mL 으로 항균효과가 매우 낮은 반면, 비교예 2의 MIC₅₀과 MIC₉₀은 모두 1.953μg/mL으로 항균효과가 탁월하였다. 실시예의 경우 MIC 농도범위가 3.125+1.563~6.250+3.125μg/mL으로 항균효과가 인정되었다. 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 최소살균농도는(MBC₉₀)은 각각 >500μg/mL, 7.813μg/mL 및 12.5+6.25μg/mL으로 확인되었다(표 8).

살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 MIC 및 MBC

Antibiotic Bacterium		비교예1		비교예2		실시예
Antibiotic Bacterium		MIC	MBC	MIC	MBC	MIC	MBC
Sal. typhimurium	야외분리 1	>500	>500	1.953	3.906	3.125+1.563^a	6.250+3.125^a
	야외분리 2	>500	>500	1.953	7.813	6.250+3.125	12.500+6.250
	야외분리 3	>500	>500	1.953	3.906	3.125+1.563	6.250+3.125
	야외분리 4	>500	>500	1.953	7.813	6.250+3.125	12.500+6.250
	MIC₅₀	>500	-	1.953	-	3.125+1.563	-
	MIC₉₀	>500	-	1.953	-	6.250+3.125	-
	MBC₅₀	-	>500	-	3.906	-	6.250+3.125
	MBC₉₀	-	>500	-	7.813	-	12.500+6.250
	표준균주	>500	>500	1.953	3.906	3.125+1.563	6.250+3.125

(μg/mL)

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

비교예 1, 비교예 2 및 실시예의 항균 및 살균효과

Antibiotic Bacterium		비교예 1 (μg/mL)	비교예2 (μg/mL)	실시예^a (μg/mL)
A. pleuropneumoniae.	MIC₅₀	25.000	62.500	1.563+0.781
	MIC₉₀	50.000	62.500	3.125+1.563
	MBC₅₀	50.000	62.500	3.125+1.563
	MBC₉₀	100.000	125.000	6.250+3.125
	MBC₉₀/MIC₉₀	2	2	2
P. multocida	MIC₅₀	200.000	1.953	10.0+5.0
	MIC₉₀	200.000	7.813	10.0+5.0
	MBC₅₀	400.000	7.813	10.0+5.0
	MBC₉₀	400.000	15.625	10.0+5.0
	MBC₉₀/MIC₉₀	2	2	1
M. hyopneumoniae	MIC₅₀	31.250	6.250	3.125+1.563
	MIC₉₀	62.500	12.500	3.125+1.563
	MBC₅₀	125.000	12.500	6.250+3.125
	MBC₉₀	250.000	50.000	6.250+3.125
	MBC₉₀/MIC₉₀	4	4	2
E.coli	MIC₅₀	125.000	0.977	2.50+1.25
	MIC₉₀	>500	62.500	20+10
	MBC₅₀	250.000	3.906	10+5
	MBC₉₀	>500	125.000	40+20
	MBC₉₀/MIC₉₀	>1	2	2
Sal. typhimurium	MIC₅₀	>500	1.953	3.125+1.563
	MIC₉₀	>500	1.953	6.250+3.125
	MBC₅₀	>500	3.906	6.250+3.125
	MBC₉₀	>500	7.813	12.500+6.250
	MBC₉₀/MIC₉₀	>1	4	2

^a: presented as active ingredients (Chlortetracycline+Neomycin) concentrations

1-8. FIC index

클로르테트라사이클린과 네오마이신의 병용효과를 확인하기 위하여 A. pleuropneumoniae, P. multocida, M. hyopneumoniae. 및 E.coli 야외분리균주를 대상으로 Checkerboard를 실시한 결과 모든 균에 대하여 상승 또는 상가 작용이 확인되었다.

(1) 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae)

클로르테트라사이클린과 네오마이신의 각 항균제 농도에서 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae)에 대한 FIC 값이 각각 0.500~1.063으로 상승 및 상가작용이 관찰되었다.

(2) 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida)

비교예 1과 비교예2의 각 항균제 농도에서 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida)에 대한 FIC 값이 각각 1.000~1.250으로 상가작용이 확인되었다.

(3) 대장균(E.coli)

비교예 1과 비교예2의 각 항균제 농도에서 대장균(E.coli)에 대한 FIC 값이 각각 0.750~1.250으로 부분적 상승 및 상가로 작용하였다.

<실험예 2> 임상효능 및 안전성 시험

동물실험은 호서대학교 동물실험윤리위원회의 심의절차를 거쳐 승인을 얻은 후 실시하였고(승인번호: HUACUC-17-14), 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

2-1. 실험동물

Conventional Landrace pig(Male) 10~11주령 40마리를 입수하였고, 동물 입수 후, 1주간 동물실에서 순화하였다.

온도 20±5℃, 환기횟수 20회/시간, 조명주기 12시간, 조도 200∼250Lux의 환경조건으로 설정된 호서대학교 안전성평가센터 동물실험실을 이용하여 사육하였다.

2-2. 접종균주 확인

공시동물에서 접종 균의 배출 여부를 확인하고자 표 13과 같은 primer를 이용하여 PCR을 수행하여 병원균의 존재 유무를 확인한 결과 각각의 균이 검출되지 않았음을 확인하였다(도 1).

Bacterium	Nucleotide sequences (5’→3’)	Target Band (bp)
APP	F : ATA CGG TTA ATG GCG GTA ATG G R : ACC TGA GTG CTC ACC AAC G	346
APP type2	F : ACTATGGCAATCAGTCGATTCAT R : CCTAATCGGAAACGCCATTCTG	500
PM	F : ATCCGCTATTTACCCAGTGG R : GCTGTAAACGAACTCGCCAC	460
PM type A	F : TGC CAA AAT CGC AGT CAG R : TTG CCA TCA TTG TCA GTG	1044
M. hyopneumoniae	F : ACTA GAT AGG AAA TGC TCT AGT R : GTG GAC TAC CAG GGT ATC T	352
E.coli (F18)	F: GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC R: CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC	510
E.coli (Stx2e)	F: CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC R: TTC ACC AGT TGT ATA TAA AGA	759
Sal. typhimurium (spy)	F: TTG TTC ACT TTT TAC CCC TGA A R: CCC TGA CAG CCG TTA GAT ATT	401

2-3. 공격접종

시험군의 구성은 표 14와 같이 구성하였고, 구체적인 공격접종은 다음과 같이 진행하였다.

돼지 호흡기 질환을 유발하기 위하여 APP 2mL (9×10⁹CFU/mL), PM 2mL (1.8×10⁹CFU/mL), MH 2mL(5×10⁸CCU/mL)를 비강을 통하여 기관내로 1회 접종하였으며, 균접종 후 비강 삼출물 및 임상증상 발현여부를 확인 한 후 공시물질을 투여하였다. 돼지 소화기 질환을 유발하기 위하여 병원성 대장균(3.5×10⁸CFU/mL)과 살모넬라균(1.13×10⁸CFU/mL)을 각각 50 mL(총 100mL씩) 3일간 경구 접종하였으며, 분변 및 임상증상 발현여부를 확인한 후 공시물질을 투여하였다.

시험군		처치방법	두수
무처치군		무처치 대조군	4
안전성군 (3배용량군)		일일 사료 톤당 본제 6kg 혼합하여 7일간 공급	4
호 흡 기 질 환	병원체 감염군	각각을 균을 1회 비강 접종 APP 2mL (9×10⁹CFU/mL) + PM 2mL (1.8×10⁹CFU/mL) + MH 2mL (5×10⁸CCU/mL)	4
	실시예 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤 당 본제 2kg 혼합하여 7일간 공급	4
	비교예1 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤 당 비교예 1 200g 혼합하여 7일간 공급	4
	비교예2 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤당 비교예 2 100g 혼합하여 7일간 공급	4
소 화 기 질 환	병원체 감염군	각각의 균을 3회 경구 접종 E.coli 50mL (3.5×10⁸CFU/mL) + Salmonella typhimurium 50mL (1.13×10⁸CFU/mL)	4
	실시예 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤 당 본제 2kg 혼합하여 7일간 공급	4
	비교예1 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤 당 비교예1 200g 혼합하여 7일간 공급	4
	비교예2 투여군	병원체 감염에 의한 증상발현 확인 후 일일 사료 톤 당 비교예2 100g 혼합하여 7일간 공급	4

2-4. 임상효능 지표

2-4-1. 체중측정

호흡기 또는 소화기 질환 유발 전 및 시험물질 투여 전과 투여 개시 후 Day 1, 7, 14에 체중을 측정하여 일일 증체량의 변화를 조사하였다. 일일 증체량은 실험종료 시점(Day 14)의 체중에서 시험물질 투여 당일(Day 0)을 뺀 값에 시험일수를 나눈 값으로 하였다.

2-4-2. 사료 섭취량 측정

사료 섭취량을 측정하기 위하여 계획급여를 실시하였다. 즉, 1일 1두당 사료 요구량을 고려하여 1두당 매일 2.5kg의 사료를 실험 기간 동안 공급하였다.

2-4-3. 임상 증상 관찰

공시물질 투여 개시시점부터 실험이 종료되는 14일간 임상 증상을 관찰하였다.

2-4-4. 혈액학치 및 혈액화학치 분석

혈액학치 및 혈액화학치 분석은 약물 투여 전 1회, 약물투여 후 1, 4, 7 및 14일째에 실시하였다. 혈액학치 분석을 위해 경정맥에서 혈액을 채취하여 혈액 1mL를 potassium EDTA병에 넣어 섞은 후 혈액학치를 분석하였다. 혈액학치 분석장비(Urit-3000 Vet plus Hematology analyzer, Urit medical electronic)를 이용하여 WBC, RBC, 헤모글로빈(HGB), 적혈구용적(HCT), 적혈구 평균용적(mean corpuscular volume, MCV), 적혈구평균혈색소(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 적혈구혈색소 평균농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 혈소판(platelet, PLT)를 측정하였다.

혈액화학적 검사를 위하여 경정맥을 통하여 혈액을 채취하여 응고시킨 후 상층액을 분리한 후 원심분리하여 상층액을 -80℃에 보관하였다. 혈액화학 분석은 혈액화학치 분석은 혈액화학치 분석장비(COBAS C702)를 이용하여 Alanine aminotransaminase (ALT), Aspartate transaminase (AST), Alkaline phosphatase (ALP), 총 단백질 (Total protein, T-PRO), Albumin (ALB), 총 빌리루빈 (Total bilirubin,T-BIL), Glucose (GLU), 총 콜레스테롤 (Total cholesterol, T-CHO), 혈중요소질소 (Blood urea nitrogen, BUN), Creatinine (CREA)을 측정하였다.

2-4-5. 부검 및 병리소견

실험이 종료되는 14일째에 모든 시험군의 돼지를 안락사 시킨 후 부검하여 육안적 소견을 관찰하고, 육안 병변이 관찰되는 조직을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후 H&E 염색을 하여 병리조직학적 소견을 관찰하였다.

2-4-6. 조직 내 균 수 측정

부검 후 병변이 발견되는 폐 또는 장 부위를 무균적으로 채취하여 중량을 칭량 한 후 10배량의 멸균생리식염수를 분주하고 homogenizer를 이용하여 균질화하였다. 균질액을 10배 계단희석한 후 10μL씩 3회 반복하여 배지(5% sheep blood agar, ISO agar 또는 SS agar)에 점적 한 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 18~24 시간 배양한 후 균 집락수를 계수하였다.

돼지에 호흡기 질환 유발 후 증상 별 임상 지수

임상증상		임상지수
외관/행동이상	정상	0
	둔함	1
	침울	2
	횡와	3
직장 체온	정상 (38~39.5℃)	0
	39.51~40.5℃	1
	> 40.5℃	2
	< 38	3
호흡수 (횟수/min)	18~40	0
	41~60	1
	61~80	2
	81~100	3
	>100	4
호흡양상	정상	0
	호흡노력 (increased effort)	1
	힘든호흡, 복식호흡, 헐떡거림	2
	호흡곤란 (Dyspnea)	3
기침 횟수	없음	0
	1~10	1
	10~30	2
	30~50	3
	> 50	4
기침양상	없음	0
	마른기침	1
	습한기침(가래)	2
	잦은 습성기침	3
콧물 분비량	없음	0
	소량	1
	보통	2
	다량	3
콧물 양상	정상	0
	투명한 콧물	1
	점조성 회백색 콧물	2
	점액화농성 (mucopurulent)	3
피부/피모	정상	0
	피모거침	1
	청색증 (코, 귀, 다리)	2
폐사	폐사	20

돼지에 소화기 질환 유발 후 증상 별 임상 지수

임상증상		임상지수
외관/행동이상	정상	0
	둔함	1
	침울	2
	횡와	3
직장 체온	정상 (38~39.5℃)	0
	39.51~40.5℃	1
	> 40.5℃	2
	< 38	3
분변양상	정상변	0
	연변(모양이 있는 연한 변)	1
	약한 설사(노란색의 묽은 변)	2
	심한 설사 (수양성, 분출성 변)	3
분변색깔	갈색	0
	녹색	1
	노란색	2
	출혈성	3
피부/피모	정상	0
	피모거침	1
	청색증 (코, 귀, 다리)	2
폐사	폐사	20

폐 병변 점수

	점수	기준
폐 경화 존재 여부	0	경화 부위 없음
	1	경화가 1개 병소 관찰
	2	1개엽의 여러 부위에 경화가 확인되거나, 하나의 큰 부위에 경화 관찰
	3	1개엽 전체에 경화 관찰
	4	여러 엽에 걸쳐 경화 발생, 농양 관찰
유착, 흉막염 존재 여부	0	흉벽 또는 엽간 유착 및 흉막염 없음
	1	폐/흉막 표면의 50% 이하에 유착이나 흉막염 관찰
	2	폐/흉막 표면의 50% 이상에 유착이나 흉막염 관찰

통계처리는 STATISTICA 프로그램을 이용하여 F-test를 실시하였다. 즉, LSD를 이용한 One-way ANOVA 분석을 하였고, 이후 Duncan 분석에 의하여 사후 검정을 실시하였다.

안전성 시험 결과

체중변화

시험물질을 임상적용 용량의 3배량 즉, 사료 1톤당 실시예 6kg을 사료에 혼합하여 두당 2.5kg씩 7일 동안 공급하였으며, 이후 일반 사료를 두당 2.5kg씩 14일째까지 공급하여 체중의 변화 및 일일증체량을 조사하였다. 약물투여 개시 당시의 무처치군과 3배 용량 약물투여군 돼지의 평균 체중은 각각 48.45±1.83kg과 48.40±1.97kg이었다. 시험물질 투여 후 14일째의 무처치군과 3배 용량 약물투여군의 체중은 각각 60.63±2.17kg과 60.88±2.53kg으로 측정되었고, 일일증체량은 각각 0.87±0.08kg과 0.89±0.12kg으로 나타났다(표 18).

돼지 체중과 일일증체량 변화

시험군	체중 변화 (kg)		총 증체량 (kg)	일일증체량 (kg/day)
시험군	약물 투여 개시 (Day 0)	실험 종료 (Day 14)	총 증체량 (kg)	일일증체량 (kg/day)
무처치군	48.45±1.83	60.63 ±2.17	12.18±1.18	0.87±0.08
3배용량 약물투여군	48.40±1.97	60.88±2.53	12.48±1.66	0.89±0.12

사료 효율

무처치군과 3배 용량 약물투여군의 개체별 총 증체량은 각각 12.18±1.18kg과 12.48±1.66kg이었으며, 무처치군과 3배 용량군의 개체별 총 사료 섭취량은 35.0kg 이었다. 무처치군과 3배 용량 약물투여군의 사료효율은 각각 0.35±0.03과 0.36±0.05으로 나타났다(표 19).

돼지 사료효율 변화

시험군	총 증체량 (kg/animal)	총 사료 섭취량 (kg/animal)	사료효율
무처치군	12.18±1.18	35.0±0.0	0.35±0.03
3배 용량 약물투여군	12.48±1.66	35.0±0.0	0.36±0.05

혈액학치 및 혈액화학치

3배 용량의 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 공급한 후 돼지에 대한 부작용 유발을 확인하기 위하여 혈액학 및 혈액화학적 검사를 실시하였다. 혈액학적 검사 결과 무처치군과 3배 용량 약물투여군에서 염증 여부, 빈혈 등의 지표가 되는 혈액학적 수치들은 무처치군과 차이가 없었다(표 20).

실시예 무처치군과 3배용량 약물투여군의 혈액학치 변화

Parameters	Group	Day -1	Day 0	Day 1	Day 4	Day 7	Day 14
WBC (×10⁹/L)	정상대조군	16.9±1.1	17.4±1.0	18.0±2.8	14.1±1.8	16.8±1.7	15.4±2.6
WBC (×10⁹/L)	3배용량군	18.2±3.9	17.8±3.0	18.8±2.5	17.5±1.6	16.3±1.1	15.8±3.2
RBC (×10¹²/L)	정상대조군	6.1±0.4	6.0±0.2	5.8±0.3	5.7±0.2	5.6±0.4	6.3±0.5
RBC (×10¹²/L)	3배용량군	6.5±0.9	5.8±0.2	5.2±0.3	5.4±0.2	5.3±0.5	6.4±0.5
HGB (g/dL)	정상대조군	10.3±0.8	11.0±1.1	10.7±0.7	10.3±0.4	10.7±0.9	10.5±1.1
HGB (g/dL)	3배용량군	10.6±1.7	10.1±0.7	9.7±0.7	9.6±0.3	9.8±0.7	11.4±0.9
HCT (%)	정상대조군	36.5±2.5	37.8±3.2	34.8±1.1	34.3±1.5	35.3±3.0	36.5±2.3
HCT (%)	3배용량군	37.3±6.9	34.6±1.5	32.0±3.3	31.6±1.6	30.7±2.2	37.7±3.3
MCV (fL)	정상대조군	60.1±1.7	60.2±1.6	60.3±1.4	60.8±2.9	59.1±2.7	60.2±4.0
MCV (fL)	3배용량군	57.2±3.4	58.2±4.0	56.5±2.6	58.8±2.2	58.3±2.2	58.6±2.3
MCH (Pg)	정상대조군	16.9±0.6	17.5±0.3	18.4±0.7	18.1±0.4	18.7±0.3	17.4±1.4
MCH (Pg)	3배용량군	16.2±0.4	17.4±0.9	17.3±0.1	17.9±0.7	18.0±0.5	17.7±0.5
MCHC (g/dL)	정상대조군	29.7±1.1	31.4±0.8	30.6±1.8	30.0±1.9	30.2±1.0	30.2±0.7
MCHC (g/dL)	3배용량군	30.2±2.0	30.3±0.6	30.7±1.2	30.5±0.6	30.9±1.3	30.3±0.5
PLT (×10⁹/L)	정상대조군	545.5±74.3	543.8±85.9	491.3±88.3	478.0±58.8	504.5±86.6	528.0±43.4
PLT (×10⁹/L)	3배용량군	513.8±63.0	516.0±54.6	460.3±60.0	488.3±36.7	495.0±78.3	505.5±49.9

무처치군과 3배 용량군에서 간기능, 신장기능 등의 지표가 되는 혈액화학치 결과에 있어 각 군간의 차이가 관찰되지 않았다(표 21).

실시예 무처치군과 3배 용량 약물투여군의 혈액화학치 변화

Parameters	Group	Day 0	Day 1	Day 4	Day 7	Day 14
ALT (U/L)	정상대조군	48.50±5.57	47.75±6.24	49.75±6.90	46.25±12.45	47.50±4.20
ALT (U/L)	3배용량군	49.75±5.85	49.00±6.68	41.50±2.65	42.50±8.50	45.75±5.85
AST (U/L)	정상대조군	79.50±12.61	38.25±7.63	39.50±8.27	44.75±9.00	57.75±19.96
AST (U/L)	3배용량군	76.50±21.25	57.25±8.18	50.25±11.59	59.25±5.06	47.00±10.61
ALP (U/L)	정상대조군	263.50±95.51	261.75±43.55	224.00±62.11	219.75±54.81	229.00±28.95
ALP (U/L)	3배용량군	284.25±81.74	212.75±59.94	188.75±38.13	191.50±53.49	253.50±44.04
T-PRO (g/dL)	정상대조군	5.49±0.41	6.24±0.68	6.34±0.64	6.71±0.85	6.14±0.99
T-PRO (g/dL)	3배용량군	5.11±0.56	5.81±0.76	6.19±0.74	5.39±0.29	6.60±1.02
ALB (g/dL)	정상대조군	3.03±0.39	3.87±0.51	3.42±0.48	3.52±0.75	3.88±0.61
ALB (g/dL)	3배용량군	3.03±0.08	3.58±0.34	3.41±0.23	3.25±0.35	4.03±0.32
T-BIL (mg/dL)	정상대조군	0.04±0.02	0.12±0.07	0.13±.0.03	0.15±0.0	0.13±0.03
T-BIL (mg/dL)	3배용량군	0.06±0.03	0.12±0.06	0.11±0.06	0.09±0.07	0.09±0.05
GLU (mg/dL)	정상대조군	106.50±17.54	91.25±13.38	82.50±14.06	127.00±22.76	150.25±25.13
GLU (mg/dL)	3배용량군	95.00±13.37	90.25±16.68	95.00±25.14	101.50±12.71	132.50±24.56
T-CHO (mg/dL)	정상대조군	75.25±9.64	92.25±5.38	96.00±7.48	92.25±34.94	109.50±26.75
T-CHO (mg/dL)	3배용량군	72.25±9.32	102.75±12.42	89.50±13.40	87.50±15.86	101.25±15.65
TG (mg/dL)	정상대조군	49.75±13.35	53.75±27.73	55.50±19.47	52.50±12.37	82.75±21.82
TG (mg/dL)	3배용량군	41.00±15.03	66.50±17.31	69.25±13.40	59.75±22.17	80.00±20.82
BUN (mg/dL)	정상대조군	9.33±1.45	6.63±3.10	6.28±1.55	9.53±2.02	10.90±3.13
BUN (mg/dL)	3배용량군	10.70±4.18	7.73±3.70	7.78±2.58	9.23±3.27	11.43±3.69
CREA (×10⁹/L)	정상대조군	0.69±0.29	0.90±0.12	0.96±0.16	0.90±0.34	1.16±0.35
CREA (×10⁹/L)	3배용량군	0.74±0.28	0.80±0.17	0.90±0.23	0.86±0.25	0.95±0.33

임상증상 결과, 3배 용량의 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 공급한 후 임상증상의 발현 여부를 관찰한 결과, 실험 종료 시까지 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았다.

부검 소견 결과, 약물 투여 개시 후 14일째에 돼지를 안락사시켜 부검한 후 간, 폐, 기관지, 비장, 소장, 대장 등 실질 장기에 대한 육안적 변화를 관찰한 결과, 대조군과 3배 용량 약물 투여군에서 특별한 육안적 병변이 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 실시예가 돼지의 전반적인 건강에 유해한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

임상효능 시험 결과

(1) 호흡기질환 임상효능시험

무처치군을 제외한 공격접종군과 돼지에 액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae) (APP), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida) (PM) 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae) (MH)를 비강내에 접종하여 돼지 호흡기 질환을 유발하였고, 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 공급하여 임상증상 변화 등을 관찰하였다.

1) 체중 변화

균접종 당일 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 체중은 각각 45.95±1.75kg, 45.23±3.72kg, 46.08±2.71kg, 46.03±2.01kg 및 45.93±3.92kg이었다. 균 접종 3일 후에 유효성 시험군(실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군)에 각각의 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 투여하였으며, 약물투여 개시시점의 각 군의 체중은 공격접종에 의하여 무처치군에 비하여 3~4 kg 정도 감소된 상태이었다. 시험물질 투여 후 14일째의 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군의 체중은 각각 60.63±2.17kg, 49.47±4.36kg, 55.00±4.79kg, 52.45±3.77kg, 50.98±5.66kg으로 공격접종군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 체중은 무처치군에 비해 유의하게 낮은 반면, 실시예 투여군은 무처치군과 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각 군의 증체량은 각각 12.18±1.18kg, 4.57±1.46kg, 9.58±2.12kg, 7.35±1.82kg, 6.88±1.89kg이었으며, 일일증체량은 각각 0.87±0.08 kg/day, 0.33±0.10 kg/day, 0.68±0.15 kg/day, 0.53±0.13 kg/day 및 0.49±0.14 kg/day이었다. 실시예 투여군의 총 증체량 및 일일증체량은 공격접종군보다 유의하게 증가하여 세균성 돼지호흡기 질환에 의한 증체량 저하를 방지하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 실시예 투여군의 총 증체량 및 일일증체량은 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군보다 증가하였다. 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군의 증체량 및 일일증체량은 경우 무처치군에 비하여 유의하게 낮았다(표 22).

호흡기 질환 균접종 및 약물투여 후 돼지의 체중과 일일증체량 변화

시험군	체중 변화(kg)			총 증체량 (D14-D0)	일일증체량 (kg/day)
시험군	균접종 (D-3)	약물투여개시 (Day 0)	실험 종료 (Day 14)	총 증체량 (D14-D0)	일일증체량 (kg/day)
무처치군	45.95±1.75	48.45±1.83	60.63 ±2.17	12.18±1.18	0.87±0.08
공격접종군¹⁾	45.23±3.72	44.05±3.22	49.47±4.36^**,1)	4.57±1.46^***	0.33±0.10^***
실시예 투여군	46.08±2.71	45.43±3.06	55.00±4.79	9.58±2.12^##	0.68±0.15^##
비교예1 투여군	46.03±2.01	45.10±2.77	52.45±3.77^*	7.35±1.82^**	0.53±0.13^**
비교예2 투여군	45.93±3.92	44.10±4.02	50.98±5.66^*	6.88±1.89^**	0.49±0.14^**

* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001: significantly different from normal group.^# p<0.05,^## p<0.01: significantly different from challenge group.

¹⁾: One dead animal because of disease was not included.

(2) 사료 효율

사료 섭취량의 정확한 측정을 위해 14일 동안 두당 2.5kg의 사료를 공급하였다. 실험기간 동안 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군의 개체별 총 사료 섭취량은 각각 35.00±0.00kg, 24.35±4.23kg, 30.50±1.50kg, 28.73±1.74kg 및 27.91±1.41kg으로 모든 시험군의 사료섭취량은 무처치군에 비해 유의하게 감소하였으나, 공격접종군 보다는 유의하게 높았다. 또한 실시예 투여군의 사료섭취량은 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군 보다 유의하게 높았다. 실험기간 동안 각 군의 사료효율은 각각 0.35±0.03, 0.18±0.03, 0.31±0.06, 0.26±0.06 및 0.24±0.06이었으며, 실시예 투여군의 사료효율은 공격접종군 보다 유의하게 높았으며, 특히 실시예 투여군의 사료효율은 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군 보다 0.5~0.7 정도 높았다(표 23 및 도 2).

호흡기질환 균접종 및 시험물질 투여 후 사료효율 변화

시험군	총 증체량 (kg)	사료섭취량 (kg/animal)	사료효율
무처치군	12.18±1.18	35.00±0.00	0.35±0.03
공격접종군¹⁾	4.57±1.46^***	24.35±4.23^***	0.18±0.03^**
실시예 투여군	9.58±2.12^##	30.50±1.50^*,##,a,b	0.31±0.06^#
비교예1 투여군	7.35±1.82^**	28.73±1.74^**	0.26±0.06^*
비교예2 투여군	6.88±1.89^**	27.91±1.41^***	0.24±0.06^**

* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, significantly different from normal group.

^# p<0.05,^## p<0.01, ^### p<0.001, significantly different from challenge group.

^a p<0.05, significantly different from CTC treatment group.

^b p<0.05, significantly different from neomycin treatment group.

¹⁾: One dead animal because of disease was not included.

(3) 체온 변화

Day -3일부터 Day 14일까지 1일 1회 이상 각 시험개체에 대해 체온을 측정한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 공격접종군의 경우 대부분의 개체에서 감염초기에는 확연한 발열이 관찰되었고, 실험 종료시까지 체온의 증감이 관찰되었다. 실시예 투여군의 경우 공격접종 후 시험물질 투여 후 1일째까지 대부분의 개체에서 높은 체온을 보였으며, 시험물질 투여 후 2일째에는 모든 개체에서 정상 체온을 보였으며, 이후에는 일부 개체에서 일시적으로 체온이 증가한 것을 제외하고는 실험 종료시에는 모든 개체에서 체온에 큰 변화는 관찰되지 않았다. 비교예 1 투여군도 공격접종 후 1일째(Day -2)에는 모든 개체에서 체온이 높았으며, 이 후 산발적으로 체온 상승이 관찰되었다. 비교예 2 투여군의 체온은 공격접종 및 시험물질 투여 후 3일째까지 대부분의 개체에서 39.6℃ 이상으로 높게 나타났으며, 이 후 실험 종료시까지 산발적으로 체온이 상승하였으며, 또는 하강하였다(도 3).

(4) 혈액학치 변화

균접종 및 시험물질 투여에 의한 총 백혈구수의 변화를 관찰하였다. 공격접종군의 총 백혈구수는 균접종 후 3일째(Day 0)에 57.8±17.8×10⁹/L이었으며, 실험종료일에는 38.2±6.9×10⁹/L 지속적으로 높은 경향을 보였다. 실시예 투여의 경우 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 54.1±16.7×10⁹/L 이었으나, 실시예 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 33.1±4.0×10⁹/L으로 감소하였으며, 실시예 투여개시 후 7일째에는 총백혈구수가 28.6±6.3×10⁹/L으로 공격접종군보다 유의하게 낮았으며, 총백혈수가 지속적으로 감소하여 실시예 투여개시 후 14일째의 총 백혈구수는 22.5±3.3×10⁹/L으로 공격접종군보다 유의하게 낮았으나 무처치군에 비해서는 유의하게 높았다. 비교예 1 투여군의 경우 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 43.5±17.2×10⁹/L 이었으나, 비교예 1 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 37.8±3.7×10⁹/L으로 감소하였으며, 비교예 1 투여개시 후 7일째에는 총백혈구수가 28.9±2.9×10⁹/L,14일째에는 27.7±2.4×10⁹/L으로 공격접종군보다 유의하게 낮았으나 무처치군에 비해서는 유의하게 높았다. 비교예 2 투여군에서는 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 40.9±7.5×10⁹/L 이었으나, 비교예 2 투여 개시 후 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 38.2±7.6×10⁹/L으로 감소하였으며, 비교예 2 투여개시 후 7일째에는 총 백혈구수가 29.8±2.9×10⁹/L,투여개시 후 14일째의 총백혈구수는 28.2±4.0×10⁹/L으로 공격접종군보다 유의하게 낮았으나 무처치군에 비해서는 유의하게 높았다(표 24).

각 시험군의 혈액학치 검사 결과

Parameters	Group	Day -1	Day 0	Day 1	Day 4	Day 7	Day 14
WBC (×10⁹/L)	무처치군	16.9±1.1	17.4±1.0	18.0±2.8	14.1±1.8	16.8±1.7	15.4±2.6
	공격접종군	42.7±9.3^***	57.8±17.8	48.6±8.9^***	36.9±4.7^***	43.2±11.7^***	38.2±6.9^***
	실시예 투여군	43.0±10.6^***	54.1±16.7	33.1±4.0^{**, ##}	28.6±6.3^{***, #}	23.6±4.6^***	22.5±3.3^*,###
	비교예1 투여군	35.4±5.7^**	43.5±17.2	37.8±3.7^{***, #}	32.0±3.3^***	28.9±2.9^*,##	27.7±2.4^{**, ##}
	비교예2 투여군	39.7±7.9^**	40.9±7.5	38.2±7.6^{***, #}	32.9±3.2^***	29.8±2.9^*,##	28.2±4.0^{**, ##}

* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, significantly different from normal group. ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001, significantly different from challenge group.

^a p<0.05, significantly different from CTC treatment group.

^b p<0.05, significantly different from neomycin treatment group.

(5) 임상증상

균 접종 후 1일째부터 시험물질 투여 후 14일째까지 1일 1회 이상 전체 시험개체에 대한 임상증상을 관찰하였고, 표 6에 따라 임상지수를 측정하였다. 즉, Day -3일에 공격접종군과 유효성 시험군에 APP, PM, MH균을 비강 내로 접종하여 SRD를 유발하였고, 이후 호흡기 임상증상이 확인된 Day 0일에 시험물질을 투여하였다. 공격접종군은 균접종 후 2일째(Day -1)부터 실험종료일까지 기침, 점액 또는 점액화농성 콧물, 침울, 체온상승, 호흡수 증가 등의 임상증상이 지속적으로 관찰되었으며, 이중 한 마리는 7일째에 사망하였다. 실시예 투여군은 균접종에 의한 점액성 또는 점액화농성 콧물, 침울, 체온상승, 기침, 호흡수 증가 등의 임상증상이 관찰되어 균접종 후 3일째에 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 투여하였으며, 그 결과 약물투여 개시 후 3~5일째부터 투명한 콧물이 관찰된 후 실험종료시까지 간헐적으로 투명한 콧물이 관찰되었다. 건성 또는 습성기침은 실험기간동안 일부 개체에서 간헐적으로 관찰되었으며, 시험물질 투여 개시 후 4일째부터 체온이 정상으로 회복되었고, 실험종료 시까지 체온의 변화가 거의 없었다. 비교예 1 투여군은 균접종에 의한 점액성 또는 점액화농성 콧물, 침울, 체온상승, 기침, 호흡수 증가 등의 임상증상이 관찰되어 균접종 후 3일째에 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 투여하였으며, 그 결과 약물투여 개시 후 6~8일째부터 투명한 콧물이 관찰되기 시작하여 실험 종료시까지 관찰되었으며, 일부 개체에서는 점액성 콧물이 관찰되기도 하였다. 건성 또는 습성기침은 실험기간동안 모든 개체에서 간헐적으로 관찰되었으며, 공격접종 후 1일째(Day -2)에는 모든 개체에서 체온이 높았으며, 실험 종료시까지 산발적으로 체온 상승이 관찰되었다. 비교예 2 투여군의 경우 균접종에 의한 점액성 또는 점액화농성 콧물, 침울, 체온상승, 기침, 호흡수 증가 등의 임상증상이 관찰되어 균접종 후 3일째에 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 투여하였다. 약물투여 개시 후 11일째까지 대부분의 개체에서 점액성 콧물이 관찰되었고, 실험종료시에는 투명한 콧물이 관찰되었다. 또한 실험기간 동안 대부분의 개체에서 기침이 간헐적으로 관찰되었으며, 체온은 시험물질 투여 후 3일째까지 대부분의 개체에서 39.6℃ 이상으로 높게 나타났으며, 이 후 실험 종료시까지 산발적으로 체온이 상승하였다(도 4 및 도 5).

(6) 비강내 균수 측정

액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae)를 비강 내 1회 접종한 후 실시예, 비교예 1 및 비교예 2을 각각 사료에 혼합하여 7일간 공급하면서 각 개체별로 비강 삼출물을 swab하여 비강 내 존재하는 균 수를 조사하였다. 공격접종군과 실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 총 균수가 각각 (13.85±5.22)×10⁴CFU/mL, (29.80±44.14)×10⁴CFU/mL, (29.20±25.68)×10⁴CFU/mL, (17.50±12.26)×10⁴CFU/mL으로 확인되었다. 공격접종군은 실험종료 시 비강 내에 (1.37±0.93)×10⁴CFU/mL가 존재하였다. 실시예 투여군은 약물투여 개시후 2일째부터 비강 내 존재하는 세균수가 (6.63±3.03)×10⁴CFU/mL로 공격접종군에 비하여 유의하게 감소하였고, 이 후 약물투여 개시 후 7일째까지의 균수가 (0.29±0.37)×10⁴CFU/mL으로 공격종군 보다 유의하게 낮았고, 이후에도 공격접종군보다 유의하게 낮게 검출되다가 약물투여 개시 후 12일째부터는 균이 검출되지 않았다. 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군에서는 약물투여 개시 후 3일째부터 비강 내 균수가 각각 (8.63±4.39)×10⁴CFU/mL와 (9.95±5.82)×10⁴CFU/mL으로 공격접종군보다 낮게 검출되었으며, 약물투여 개시 후 14일째까지 균이 (0.003±0.005)×10⁴CFU/mL와 (0.006±0.013)×10⁴CFU/mL으로 검출되었다(표 25 및 도 6).

공격접종군 및 유효성시험군의 비강내 균수 변화

	공격접종군	실시예 투여군	비교예 1 투여군	비교예 2투여군
Day -3	-	-	-	-
Day -2	3.08±2.81	1.88±0.81	3.37±2.80	6.97±1.19
Day -1	9.11±4.34	15.39±18.74	18.86±14.45	20.53±15.20
Day 0 (투여 개시)	13.85±5.22	29.80±44.14	29.20±25.68	17.50±12.26
Day 1	11.42±8.08	16.28±21.21	18.34±14.29	9.33±6.03
Day 2	14.73±7.13	6.63±3.03	11.85±9.51	10.01±5.17
Day 3	11.55±5.31	3.49±3.13^#	8.63±4.39	9.95±5.82^#
Day 4	14.98±5.72	2.42±2.63^#	5.55±4.39	7.88±4.70^##
Day 5	8.98±4.38	0.95±0.63^#	2.40±2.06	9.10±7.44^#
Day 6	8.40±1.14	0.53±0.52^##	0.81±0.70	3.85±3.53^#
Day 7 (투여 종료)	9.73±3.37	0.29±0.37^##	0.50±0.35^#	0.69±0.45^#
Day 8	7.33±6.83	0.12±0.14	0.29±0.17	0.32±0.24
Day 9	9.70±10.79	0.04±0.07	0.17±0.11	0.22±0.21
Day 10	5.33±4.97	0.02±0.04^#	0.08±0.07	0.16±0.23
Day 11	4.56±6.17	0.004±0.01^#	0.03±0.03	0.06±0.08
Day 12	2.44±2.84	-	0.02±0.03^#	0.03±0.05^#
Day 13	3.46±3.34	-	0.01±0.01^#	0.01±0.02^#
Day 14	1.37±0.93	-	0.003±0.005^#	0.006±0.013^#

(10⁴CFU/mL)

^# p<0.05,^## p<0.01, significantly different from challenge group.(7) 부검 소견

1) 육안적 병리소견

실험기간 동안 사망한 동물과 실험 종료 후 생존한 돼지를 안락사 하여 각 시험군에서의 폐 육안병변을 확인한 결과, 무처치군의 폐에서는 특이적인 소견이 관찰되지 않았다(도 7). 공격 접종군에서는 흉수, 좌우 폐의 흉벽 유착, 심외막 섬유소성막 형성 및 유착, 다발성 화농성 결절, 일부 폐엽의 자적색조의 경화소 등이 관찰되었다(도 8). 실시예 투여군의 폐는 일부 개체에서는 오른쪽 또는 왼쪽 앞쪽엽과 중간엽 일부에 경화 및 흉벽유착, 국소성 화농성 결절이 관찰되었지만, 전체적으로 특이적인 병변은 관찰되지 않았다(도 9). 비교예 1 투여군의 경우 왼쪽 또는 오른쪽 폐의 경화 및 흉벽 유착, 다발성 화농성 결절, 섬유소성 막이 관찰되었다(도 10). 비교예 2 투여군에서도 폐 흉벽유착, 다발성 화농성 결절, 섬유소성 막이 관찰되었다(도 11).

2) 조직 병리소견

부검 후 무처치군, 공격접종군과 유효성시험군의 폐 병변 부위를 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정 한 후 조직을 염색하여 관찰하였다. 무처치군의 폐 조직학적 검사결과 폐포벽 비후 외 특이소견이 관찰되지 않았다(도 12). 공격접종군의 폐 조직학적 검사결과 대부분의 개체에서 기관지강내와 폐포강에 염증세포(주로 다형핵백혈구, 대식세포)의 침윤 등의 기관지성 폐렴이 관찰되었고, 섬유소성 괴사성 폐렴이 관찰되었다(도 13). 또한, 공격접종군 한 개체 심장에서는 심각한 섬유소성 심외막염이 관찰되었다. 실시예 투여군 폐의 조직학적 검사 결과 대부분의 개체에서 국소적인 폐포벽 비후와 흉막염이 관찰되었으며, 한 개체에서는 흉막염을 동반한 기관지성 폐렴이 관찰되었다(도 14). 비교예 1 투여군 폐의 조직학적 검사 결과 대부분의 개체에서 폐포벽 비후, 기관지강내와 폐포강에 염증세포(주로 다형핵백혈구, 대식세포)의 침윤, 흉막염이 관찰되었으며, 한 개체에서는 섬유소성 괴사성 폐렴이 관찰되었다(도 15). 비교예 2 투여군의 폐 조직학적 소견을 확인한 대부분의 개체에서 폐포벽 비후, 기관지강내와 폐포강에 염증세포(주로 다형핵백혈구, 대식세포)의 침윤, 흉막염이 관찰되었으며, 두 개체에서 섬유소성 괴사성 폐렴이 관찰되었다(도 16).

(8) 폐 조직 내 균수 측정

부검 후 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군의 폐 병변 조직을 채취하여 1g당 존재하는 균의 숫자를 조사하였다. 공격접종군의 경우 모든 개체에서 균이 검출되었고, 평균 7.90±6.39×10⁵CFU/g 으로 균이 검출되었다. 실시예 투여군에서는 2마리에서 2.65±4.78×10³CFU/g으로 균이 검출되었다. 비교예 1 투여군과 비교예 2 투여군에서는 모든 개체에서 균이 검출되었으며, 각각 3.23±3.77×10⁴CFU/g와 5.44±6.70×10⁴CFU/g이었다.

공격접종군 및 유효성시험군의 폐 조직 내 균수 변화

시험군	개체번호	Lung lesion score	CFU/g
공격접종군	G-1	6	1.03×10⁶
	G-2	6	1.53×10⁶
	G-3	4	3.65×10⁴
	G-4	5	5.65×10⁵
	Mean±SD	5.3±1.0	7.90±6.39×10⁵
실시예 투여군	E-1	2	8×10²
	E-2	0	0
	E-3	3	9.8×10³
	E-4	1	0
	Mean±SD	1.5±1.3	2.65±4.78×10³
비교예 1투여군	H-1	4	4.5×10⁴
	H-2	3	3.25×10³
	H-3	4	8.0×10⁴
	H-4	3	1.1×10³
	Mean±SD	3.5±0.6	3.23±3.77×10⁴
비교예 2 투여군	F-1	5	1.5×10⁵
	F-2	4	5.15×10⁴
	F-3	3	7.3×10³
	F-4	3	8.65×10³
	Mean±SD	3.8±1.0	5.44±6.70×10⁴

(2) 소화기질환 임상효능시험

무처치군을 제외한 공격접종군과 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군의 돼지에 대장균(E.coli)와 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)을 1일 1회 3일간 경구로 접종하여 소화기 질환을 유발하였고, 소화기 질환 유발 확인 후 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 공급하여 임상증상 변화 등을 관찰하였다.

(1) 체중변화

균접종 당일 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 체중은 각각 45.95±1.75kg, 46.05±3.26kg, 47.10±4.25kg, 46.38±2.73kg 및 46.30±2.12kg이었다. 균 접종 3일 후에 유효성 시험군(실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군)에 각 시험물질을 사료에 혼합하여 7일간 투여하였으며, 약물투여 개시시점의 각 군의 체중은 무처치군에 비하여 2~3kg 정도 감소된 상태이었다. 시험물질 투여 후 14일째의 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 체중은 각각 60.63±2.17kg, 51.15±3.81kg, 56.80±4.76kg, 54.23±3.16kg, 53.40±3.06kg으로 공격접종군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 체중은 무처치군에 비해 유의하게 낮은 반면, 실시예 투여군은 무처치군과 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각 군의 증체량은 각각 12.18±1.18kg, 5.58±1.40kg, 10.33±1.91kg, 8.38±1.41kg, 7.40±1.90kg이었으며, 일일증체량은 각각 0.87±0.08 kg/day, 0.40±0.09 kg/day, 0.74±0.14 kg/day, 0.60±0.10 kg/day 및 0.53±0.14 kg/day이었다. 실시예 투여군의 총 증체량 및 일일증체량은 공격접종군 및 비교예 2 투여군보다 유의하게 증가하였다. 공격접종군과 비교예 2 투여군의 총 증체량 및 일일증체량은 무처치군에 비하여 유의하게 낮았다(표 27).

소화기 질환 균접종 및 약물투여 후 돼지의 체중과 일일증체량

시험군	체중 변화(kg)			총 증체량 (kg) (D14-D0)	일일증체량 (kg/day)
시험군	균접종 (D-3)	투여개시 (Day 0)	실험 종료 (Day 14)	총 증체량 (kg) (D14-D0)	일일증체량 (kg/day)
무처치군	45.95±1.75	48.45±1.83	60.63 ±2.17	12.18±1.18	0.87±0.08
공격접종군	46.05±3.26	45.58±3.21	51.15±3.81^**	5.58±1.40^***	0.40±0.09^**
실시예 투여군	47.10±4.23	46.48±3.95	56.80±4.76	10.33±1.91^###,b	0.74±0.14^##,b
비교예1 투여군	46.38±2.73	45.85±2.52	54.23±3.16^*	8.38±1.41^**,#	0.60±0.10^**,#
비교예2 투여군	46.30±2.12	46.00±1.80	53.40±3.06^*	7.40±1.90^***	0.53±0.14^***

* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001: significantly different from normal group.^# p<0.05,^## p<0.01, ^### p<0.001: significantly different from challenge group.

^b p<0.05, significantly different from neomycin treatment group.

(2) 사료효율

사료 섭취량의 정확한 측정을 위해 14일 동안 1일 1두당 2.5kg의 사료를 공급하였다. 실험기간 동안 무처치군, 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군의 개체별 총 사료 섭취량은 각각 35.00±0.00kg, 29.71±1.24kg, 33.00±1.04kg, 31.17±0.73kg, 30.97±0.55kg이었으며, 실시예 투여군의 사료섭취량은 공격접종군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군보다 유의하게 높았다. 공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군의 사료효율은 각각 0.19±0.04, 0.31±0.06, 0.27±0.04, 및 0.24±0.06으로 실시예 투여군의 사료효율은 공격접종군과 비교예 2 투여군에 비하여 유의하게 높았다(표 28 및 도 17).

소화기 질환 균접종 및 시험물질 투여 후 사료효율의 변화

무처치군	총 증체량 (kg)	사료섭취량 (kg/animal)	사료효율
무처치군	12.18±1.18	35.00±0.00	0.35±0.03
공격접종군	5.58±1.40^***	29.71±1.24^***	0.19±0.04^***
실시예 투여군	10.33±1.91^###,b	33.00±1.04^***,###,a,b	0.31±0.06^##,b
비교예1 투여군	8.38±1.41^**,#	31.17±0.73^***,#	0.27±0.04^*,#
비교예2 투여군	7.40±1.90^***	30.97±0.55^***,#	0.24±0.06^**

^a p<0.05, significantly different from CTC treatment group.

^b p<0.05, significantly different from neomycin treatment group.

(3) 체온변화

Day -3일부터 Day 14일까지 1일 1회 이상 각 시험개체에 대해 체온을 측정한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 공격접종군의 경우 공격접종 후 체온 변화는 관찰되지 않았으나, Day 0일부터 Day 6일까지 일부 개체에서 체온이 높았으며, Day 8, 9, 10일에는 1마리의 체온이 38℃ 이하(37.8~37.9℃)로 감소하였으나, 이후에는 정상체온을 유지하였다. 실시예 투여군의 경우 실험기간 동안 1~2마리에서 일시적으로 체온이 상승한 것을 제외하고는 모든 개체에서 체온의 큰 변화는 관찰되지 않았다. 비교예 1 투여군의 체온변화를 확인한 결과 시험물질 투여 후 1일째(Day 1)에 3마리의 체온이 상승하였으며, 이 외에는 1~2마리에서 일시적으로 체온이 상승하였다. 비교예 2 투여군의 경우 2마리가 시험물질 투여 당일(Day 0)부터 3일째(Day 3)까지 체온이 높았으며, 시험물질 투여 후 10일째(Day 10)에 한마리의 체온이 37.8℃로 체온이 감소된 것을 제외하고는 모든 개체에서 체온의 큰 변화는 관찰되지 않았다(도 18).

(4) 혈액학치변화

균접종 및 시험물질 투여에 의한 총 백혈구수의 변화를 관찰하였다. 공격접종군의 총 백혈구수는 균접종 후 3일째(Day 0)에 39.2±7.2x10⁹/L이었으며, 실험종료일에는 29.0±5.9x10⁹/L 지속적으로 높은 경향을 보였다. 실시예 투여의 경우 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 36.4±6.9×10⁹/L 이었으나, 실시예 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 29.4±5.5×10⁹/L으로 감소하였으며, 실시예 투여개시 후 7일째에는 총백혈구수가 23.2±4.6×10⁹/L으로 공격접종군보다 유의하게 낮았으며, 총 백혈수가 지속적으로 감소하여 실시예 투여개시 후 14일째의 총 백혈구수는 20.0±2.3×10⁹/L으로 공격접종군 보다 유의하게 낮게 나타났다. 비교예 1 투여군의 경우 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 36.8±12.0×10⁹/L 이었으나, 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 29.4±5.5×10⁹/L으로 감소하였으며, 7일째에는 총백혈구수가 28.8±3.1×10⁹/L,14일째에는 23.7±4.6×10⁹/L으로 공격접종군보다 낮았으나 무처치군에 비해서는 유의하게 높았다. 비교예 2 투여군에서는 균접종 후 3일째(Day 0)에 총 백혈구수가 38.3±10.0×10⁹/L 이었으나, 투여개시 후 1일째에 총 백혈구수가 33.6±5.9×10⁹/L으로 감소하였으며, 투여개시 후 7일째에는 총 백혈구수가 28.9±3.3×10⁹/L, 투여개시 후 14일째의 총 백혈구수는 24.6±3.5×10⁹/L으로 공격접종군보다 낮았으나 무처치군에 비해서는 유의하게 높았다(표 29).

소화기 질환 유발군 및 실시예 투여군의 혈액학치 변화

Parameters	Group	Day -1	Day 0	Day 1	Day 4	Day 7	Day 14
WBC (×10⁹/L)	무처치군	16.9±1.1	17.4±1.0	18.0±2.8	14.1±1.8	16.8±1.7	15.4±2.6
	공격접종군	28.4±3.5^**	39.2±7.2^**	34.4±10.5^**	34.0±10.4^**	30.9±7.2^***	29.0±5.9^***
	실시예 투여군	32.8±7.4^***	36.4±6.9^**	29.4±5.5^*	26.2±4.8^*	23.2±4.6^#	20.0±2.3^##
	비교예1 투여군	32.0±3.8^***	36.8±12.0^**	31.6±5.8^*	29.7±6.0^**	28.8±3.1^**	23.7±4.6^*
	비교예2 투여군	29.6±4.3^**	38.3±10.0^**	33.6±5.9^**	31.4±7.7^**	28.9±3.3^**	24.6±3.5^**

* p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, significantly different from normal group.

^# p<0.05,^## p<0.01, ^### p<0.001, significantly different from Mycin complex treatment group.

(5) 임상증상

공격접종군과 유효성 시험군에 대장균(E.coli)와 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)을 구강으로 접종하였으며, 대부분의 개체에서 연변, 설사 등의 임상증상 발현이 확인된 Day 0일에 실시예, 비교예 1 및 비교예 2를 사료에 혼합하여 7일간 공급하였다. 공격접종군의 경우 2마리에서 약한 설사가 Day 4일에서 Day 7일까지 관찰되었고, 이후 연변이 Day 11일에서 Day 14일까지 관찰되었다. 나머지 2마리는 심한설사 및 약한 설사가 Day 14일까지 지속되었다. 실시예 투여군의 경우 약한 설사 또는 분출성 설사가 시험물질 투여 개시 후 1일(Day 1)에서 3일째(Day 3)까지 관찰되었으며, 이후 연변이 Day 3일에서 Day 9일까지 관찰되다가 이후 정상변이 관찰되었다. 비교예 1 투여군의 경우 약한 설사 또는 분출성 설사가 시험물질 투여 개시 후 2일(Day 2)에서 5일째(Day 5)까지 관찰되었으며, 이후 연변이 Day 10일에서 Day 11일까지 관찰되었다. 비교예 2 투여군의 3마리는 약한 설사 또는 분출성 설사가 시험물질 투여 개시 후 5일(Day 5)에서 7일째(Day 7)까지 관찰되었으며, 이후 연변이 Day 9일에서 Day 12일째까지 관찰되었다. 1 마리는 시험물질 투여 후 12일째까지 약한 설사가 관찰되었으며, 실험 종료일에는 연변이 관찰되었다(도 19 및 도 20).

(6) 분변 내 균수 측정

공격접종군, 실시예 투여군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군에 병원성 대장균(E.coli)와 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)을 3회 구강 접종하고, 각 시험물질을 투여 한 후 각 개체별 분변을 채취하여 병원성 대장균(E.coli)와 S살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)의 균수를 측정하였다.

1) 대장균(E.coli) 균수 변화

공격접종군의 경우 Day 0에 병원성 대장균(E.coli)가 (24.00±8.04)×10⁴CFU/mL이 검출되었고, 지속적으로 병원성 대장균(E.coli)가 검출되어 Day 14에는 (0.01±0.02)×10⁴CFU/mL균이 분리되었다. 실시예 투여군에서는 시험물질 투여 전 분변 내 병원성 대장균이 약 (34.04±25.32)×10⁴CFU/mL이 검출되었으나, 약물투여 개시 후 1일째에 (4.72±3.70)×10⁴CFU/mL으로 급격하게 감소하였고, 6일째부터는 분변에서는 병원성 병원균이 검출되지 않았다. 실시예 투여군의 분변내 병원성 대장균의 감소는 공격접종군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군에 비하여 유의한 감소를 보였다. 비교예 1 투여군의 분변 내 병원성 대장균의 균수를 확인한 결과 약물투여 전 분변 내 병원성 대장균은 (19.60±27.25)×10⁴CFU/mL이었으나 약물투여 개시 후 3일째에는 (3.23±2.50)×10⁴CFU/mL으로 감소하였으며, 약물투여 개시 후 9일째까지 분변에서 병원성 대장균이 (0.002±0.004)×10⁴CFU/mL으로 검출된 후 이후에는 검출되지 않았으며, 분변에서 검출된 병원성 대장균 균수는 공격접종군 보다 유의하게 낮았다. 비교예 2 투여군의 경우 약물투여 전 분변내 병원성 대장균이 (17.83±14.64)×10⁴CFU/mL으로 검출되었으나, 약물투여 개시 후 3일째부터 공격접종군에 비하여 유의하게 감소하여 (8.86±5.80)×10⁴CFU/mL이 검출되었으며, 약물투여 개시 후 10일째부터는 분변에서 병원성 대장균이 검출되지 않았다(표 30 및 도 21).

공격접종군 및 유효성시험군의 분변 내 병원성 대장균(E.coli) 균수 변화

	공격접종군	실시예 투여군	비교예1 투여군	비교예2 투여군
Day -3	-	-	-	-
Day -2	0.10±0.14	0.33±0.47	0.06±0.06	0.04±0.05
Day -1	1.82±0.92	20.53±34.99	2.17±4.09^#	2.12±2.36
Day 0 (투여 개시)	17.50±8.27	34.04±25.32	19.60±27.25	17.83±14.64
Day 1	24.00±8.04	4.72±3.70^#,b	11.48±14.91	19.12±14.46
Day 2	23.39±9.80	0.55±0.70^###,c,d	10.12±12.72	12.73±10.29
Day 3	17.08±11.72	0.10±0.08^##,e,f	3.23±2.50^#	8.86±5.80^#
Day 4	27.99±26.26	0.03±0.03^###,c,f	0.80±1.14^###	3.79±2.69^#
Day 5	11.70±12.58	0.01±0.01^###,c,f	0.12±0.07^#	1.26±1.29
Day 6	4.48±3.70	-	0.06±0.05^###	0.21±0.13^###
Day 7 (투여 종료)	5.32±3.40	-	0.03±0.04^##	0.07±0.07^##
Day 8	0.31±0.14	-	0.009±0.012^##	0.02±0.03^#
Day 9	0.13±0.04	-	0.002±0.004^###	0.005±0.01^###
Day 10	0.12±0.10	-	-	-
Day 11	0.03±0.03	-	-	-
Day 12	0.03±0.04	-	-	-
Day 13	0.01±0.01	-	-	-
Day 14	0.01±0.02	-	-	-

(×10⁴CFU/mL)

^# p<0.05,^## p<0.01, ^### p<0.001: significantly different from challenge group.

^a p<0.05, ^c p<0.01, ^e p<0.001, significantly different from CTC treatment group.

^b p<0.05, ^d p<0.01,^f p<0.001, significantly different from neomycin treatment group.

2) 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균수 변화

공격접종군의 경우 Day 0에 병원성 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)이 (3.65±2.95)×10⁴CFU/mL이 검출되었고, 지속적으로 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)이 검출되어 Day 14에는 (0.04±0.07)×10⁴CFU/mL균이 분리되었다. 실시예 투여군에서는 시험물질 투여 전 분변 내 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)이 약 (9.02±6.43)×10⁴CFU/mL이 검출되었으나, 약물투여 개시 후 1일째에 (2.97±2.45)×10⁴CFU/mL으로 감소하였고, 약물투여 개시 후 2일째부터는 공격접종군, 비교예 1 투여군, 비교예 2 투여군에 비하여 유의하게 감소하였으며, 약물투여 개시 후 9일째부터는 분변에서는 살모넬라 티피뮤리움이 검출되지 않았다. 비교예 1 투여군의 분변 내 살모넬라 티피뮤리움의 균수를 확인한 결과 약물투여 전 (7.09±5.18)×10⁴CFU/mL이었으나, 약물투여 개시 후 4일째부터는 분변 내 살모넬라 티피뮤리움이 (0.70±0.75)×10⁴CFU/mL으로 공격접종군보다 유의하게 감소하였으며, 약물투여 개시 후 12일째부터 분변에서 살모넬라 티피뮤리움이 검출되지 않았다. 비교예 2 투여군의 분변 내 살모넬라 티피뮤리움의 균수를 확인한 결과 약물투여 전 (8.49±8.09)×10⁴CFU/mL이었으나, 약물투여 개시 후 3일째 분변 내 살모넬라 티피뮤리움이 (1.76±1.02)×10⁴CFU/mL으로 감소하였으며, 약물투여 개시 후 7일째부터는 분변 내 살모넬라 티피뮤리움 균수가 (0.08±0.04)×10⁴CFU/mL으로 공격접종군 대비 유의하게 감소하였고, 약물투여 개시 후 13일째부터 분변에서 살모넬라 티피뮤리움이 검출되지 않았다(표 31 및 도 22).

공격접종군 및 유효성시험군의 분변 내 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium) 균수 변화

	공격접종군	실시예 투여군	비교예1 투여군	비교예2 투여군
Day -3	-	-	-	-
Day -2	0.05±0.05	0.31±0.34	0.07±0.07	0.15±0.19
Day -1	1.63±2.91	1.85±1.88	0.26±0.16	1.97±1.06
Day 0 (투여 개시)	3.65±2.95	9.02±6.43	7.09±5.18	8.49±8.09
Day 1	9.23±13.87	2.97±2.45	3.38±3.78	7.28±5.46
Day 2	10.03±11.69	0.27±0.23 ^###,c,f	2.27±1.01	3.98±2.75
Day 3	7.87±11.83	0.09±0.05 ^{###,e, f}	1.43±0.85	1.76±1.02
Day 4	5.89±7.75	0.05±0.02 ^###,c,f	0.70±0.75 ^#	2.16±2.33
Day 5	4.27±3.62	0.03±0.03 ^###,a,d	0.13±0.06 ^#	0.39±0.11
Day 6	3.47±2.39	0.01±0.01 ^###,c,d	0.13±0.06 ^#	0.24±0.17
Day 7 (투여 종료)	4.23±4.21	0.005±0.00 ^###,c,f	0.04±0.04 ^#	0.08±0.04 ^#
Day 8	1.46±1.93	0.001±0.002 ^###,a,f	0.02±0.03 ^#	0.05±0.05
Day 9	0.70±1.07	-	0.01±0.02 ^##	0.03±0.04 ^#
Day 10	0.87±1.42	-	0.004±0.01 ^##	0.02±0.03 ^##
Day 11	0.29±0.43	-	0.001±0.002 ^##	0.02±0.03 ^##
Day 12	0.17±0.29	-	-	0.003±0.01 ^#
Day 13	0.11±0.20	-	-	-
Day 14	0.04±0.07	-	-	-

(×10⁴CFU/mL)

^b p<0.05, ^d p<0.01, ^f p<0.001, significantly different from neomycin treatment group.

(7) 부검소견

1) 육안적 병리소견

실험 종료 후 돼지를 안락사 하여 각 시험군에서의 장 육안병변을 확인한 결과, 무처치군의 장에서는 특이적인 소견이 관찰되지 않았다(도 23). 공격접종군에서는 모든 개체의 장벽이 얇아졌으며, 이 중 한 개체에서는 충혈이 관찰되었다(도 24). 실시예 투여군의 한 개체에서 소장벽이 얇아진 것을 제외하고는 나머지 개체에서는 특이적인 소견이 관찰되지 않았다(도 25). 비교예 1 투여군의 경우 2개체에서 소장벽이 얇아진 것을 제외하고는 나머지 개체에서는 특이적인 소견이 관찰되지 않았다(도 26). 비교예 2 투여군에서도 개체에서 2개체의 소장벽이 얇아진 것을 제외하고는 나머지 개체에서는 특이적인 소견이 관찰되지 않았다(도 27).

2) 조직 병리소견

부검 후 무처치군, 공격접종군과 유효성시험군의 장 병변 부위를 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후 조직을 염색하여 관찰하였다. 무처치군의 장 조직학적 검사결과 특이소견이 관찰되지 않았다(도 28). 공격접종군의 장 조직학적 검사결과, 융모상피 탈락 또는 융합 및 움(crypt)의 파괴가 관찰되었으며, 괴사성 장염 및 대장에서 미세농양이 관찰된 개체도 있었다(도 29). 실시예 투여군의 장 조직학적 검사 결과 무처치군과 마찬가지로 특이 소견이 관찰되지 않았으나 1마리는 융모길이가 짧아지고, 융합이 관찰되었다(도 30). 비교예 1 투여군에서는 2마리에서는 무처치군과 마찬가지로 특이 소견이 관찰되지 않았으나 2마리는 융모길이가 짧아지고, 융합이 관찰되었다(도 31). 비교예 2 투여군의 경우 2마리는 특이소견이 관찰되지 않았으나 2마리에서는 융모 길이가 짧아지거나 융합되었으며, 움(crypt)의 수 감소가 관찰되었으며, 이중 한 개체의 대장에서 미세 농양이 관찰되었다(도 32).

(8) 장 조직내 균수변화

부검 후 장 조직을 채취하여 병원성 대장균과 살모넬라균을 확인한 결과 공격접종군의 경우 장조직에서 병원성 대장균과 살모네라균이 각각 2.2±4.26×10⁴CFU/g, 3.18±4.28×10³ CFU/g으로 검출된 반면 실시예 투여군에서는 모든 개체에서 병원성 대장균과 살모넬라균이 검출되지 않았고, 비교예 1 투여군에서는 한 마리에서 병원성 대장균과 살모넬라균이 530 CFU/g와 110 CFU/g검출되었으며, 비교예 2 투여군에서는 한 개체에서 병원성 대장균과 살모넬라균이 각각 3000 CFU/g와 230 CFU/g 검출되었다(표 32).

균접종군 및 유효성시험군의 장 조직 내 균수 변화

시험군	개체번호	CFU/g of intestine
시험군	개체번호	E.coli	Sal. typhimurium
공격접종군	C-1	86×10³	93x10²
	C-2	7×10²	2.5x10²
	C-3	13×10²	30x10²
	C-4	3×10²	0
	Mean±SD	2.2±4.26×10⁴	3.14±4.33×10³
실시예 투여군	A-1	0	0
	A-2	0	0
	A-3	0	0
	A-4	0	0
	Mean±SD	0±0	0±0
비교예1 투여군	D-1	0	0
	D-2	530	110
	D-3	0	0
	D-4	0	0
	Mean±SD	132±265	27.55±55
비교예2 투여군	B-1	0	0
	B-2	3.0×10³	230
	B-3	0	0
	B-4	0	0
	Mean±SD	750±1500	57.5±115

액티노바실러스 플로르뉴모니아(A. pleuropneuomoniae), 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida) 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(M. hyopneumoniae), 대장균(E.coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 비교예 1, 비교예 2 또는 실시예의 항균효과를 확인한 결과, 비교예 1은 모든 공식균에 대하여 항균효과가 미비하였고, 비교예 2는 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 대장균(E.coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Sal.typhimurium)에 대한 항균효과가 높았으며, 실시예는 모든 공시 균주에 대해 항균효과가 탁월하였고, 공시균주에 대하여 실시예는 병용에 의한 상승 또는 상가 효과가 인정되었다.

실시예의 돼지에서의 안전성을 확인하기 위하여 임상적용량의 3배량을 돼지에 경구투여 한 결과 특이한 임상증상 및 부검 소견 등이 관찰되지 않아 안전한 약물로 확인되었다.

돼지 비강을 통한 호흡기 질환 원인균을 1회 접종하여 호흡기질환을 유발한 후 사료 톤당 2kg의 비율로 실시예를 혼합하여 7일간 공급하여 호흡기 질환에 대한 치료효과를 확인하였다. 그 결과 실시예 투여 개시 후 3~8일째부터 호흡기질환과 관련된 임상증상의 발현이 감소하였으며, 일부 개체에서 간헐적인 콧물과 기침이 관찰되었을 뿐 실험종료일까지 임상증상 발현이 억제되었고, 증체량 및 사료효율도 공격접종군보다 개선되었다. 또한, 비강 내 균수가 약물투여 개시 후 3일째부터는 공격접종군보다 유의하게 낮았으며, 약물투여 개시 후 12일째부터는 비강에서 원인균이 검출되지 않았고, 폐에서의 육안소견에 있어서도 공격접종군에서 관찰되는 흉벽 유착, 다발성 농양, 경화소 등의 병변이 나타나지 않거나 미약하였고, 폐 조직 내 균 제거효과도 우수하였다.

돼지 구강을 통한 소화기 질환 원인균(병원성 대장균과 살모넬라 티피뮤리움)을 3회 접종하여 소화기 질환(연변 또는 설사)을 유발한 후 실시예를 사료 톤 당 2kg으로 사료에 혼합하여 7일간 공급한 결과 시험물질 투여 개시 후 2~4일째에 설사가 연변으로 완화된 후 8일째부터는 대부분의 개체에서 정상변이 관찰되었고, 약물투여 개시 후 6일째부터 분변에서 병원성 대장균이 검출되지 않았으며, 살모넬라 티피뮤리움은 약물투여 개시 후 2일째부터 공격접종군, 비교예 1 투여군 및 비교예 2 투여군보다 유의하게 낮았으며, 약물투여 개시 후 9일째부터는 분변에서 검출되지 않았다. 또한, 장 조직에서도 병원성 대장균과 살모넬라 티피뮤리움이 검출되지 않아 균제거 효과가 확인되었다.

따라서 본 발명은 돼지 호흡기 질환 및 소화기 질환 임상증상 억제 및 치료효과가 인정되었으며, 대상동물에 대하여 안전성이 확보된 제품인 것으로 판단되었다.

<110> SB Shinil Co., Ltd. <120> Antibiotic composition for animals comprising chlortetracycline, neomycin, and loperamide as active ingredients <130> 19-11320 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for APP <400> 1 atacggttaa tggcggtaat gg 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for APP <400> 2 acctgagtgc tcaccaacg 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for APP type 2 <400> 3 actatggcaa tcagtcgatt cat 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for APP type 2 <400> 4 cctaatcgga aacgccattc tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PM <400> 5 atccgctatt tacccagtgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PM <400> 6 gctgtaaacg aactcgccac 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PM type A <400> 7 tgccaaaatc gcagtcag 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PM type A <400> 8 ttgccatcat tgtcagtg 18 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for M. hyopneumoniae <400> 9 actagatagg aaatgctcta gt 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for M. hyopneumoniae <400> 10 gtggactacc agggtatct 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E.coli (F18) <400> 11 gtgaaaagac tagtgtttat ttc 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E.coli (F18) <400> 12 cttgtaagta accgcgtaag c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E.coli (Stx2e) <400> 13 ccaccaggaa gttatatttc c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E.coli (Stx2e) <400> 14 ttcaccagtt gtatataaag a 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sal. typhimurium (spy) <400> 15 ttgttcactt tttacccctg aa 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sal. typhimurium (spy) <400> 16 ccctgacagc cgttagatat t 21

Claims

클로르테트라사이클린, 네오마이신 및 로페라마이드를 유효성분으로 포함하고, 동물의 호흡기 및 소화기 질환을 일으키는 병원균에 항균효과를 갖는 동물용 항균제 조성물로써,
상기 동물용 항균제 조성물은 클로르테트라사이클린 100 중량부 대비 네오마이신 40 내지 60 중량부, 로페라마이드는 클로르테트라사이클린 100 중량부 대비 0.1 내지 3 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 동물용 항균제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 동물용 항균제 조성물은 클로르테트라사이클린 100 중량부 대비 네오마이신 50 중량부, 로페라마이드는 클로르테트라사이클린 100 중량부 대비 1 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 동물용 항균제 조성물.
제1항에 있어서, 동물의 호흡기 및 소화기 질환을 일으키는 균은 액티노바실러스 플로르뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonae), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 동물용 항균제 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 산제, 펠릿, 경구투여용 액제, 주사제 또는 연고제로 제형화된 것을 특징으로 하는 동물용 항균제 조성물.