JPH09509677A - 茶エキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤 - Google Patents

茶エキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤

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Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトを含む動物のMRSA感染症の治療において同時に、別々にまたは連続的に使用するための組み合わせ製剤として、茶のエキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラクタム抗生物質の相乗的組み合わせを含んでなる製品を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 茶エキスまたはその活性フラクション およびβ−ラクタム抗生物質を含む抗菌剤 本発明は抗菌活性を有する新規組成物およびその使用に関する。特に、その組 成物はメチシリン耐性スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus )(MRSA)に対し活性を有する。 スタフィロコッカス アウレウスはコアグラーゼをつくるその能力により臨床 微生物学研究所において認識されるグラム陽性バクテリアである。スタフィロコ ッカス アウレウスはしばしばヒトに宿る。スタフィロコッカス アウレウスの 更なる分類の詳細については、測定細菌学のベルゲイのマニュアル（第９編、19 93）が参考になる。スタフィロコッカス アウレウスは抗生物質に対する耐性を 獲得し得る。病院中の患者はMRSAに感染するようになることがあり、このMRSAは 重大な病気または更には死亡をもたらし得る。メチシリンに対し耐性と考えられ るスタフィロコッカス アウレウスの株は、増殖が８μg/mlのメチシリンの存在 下で起こる株である(臨床研究所の規格に関する国内委員会（National Committe e for Clinical Laboratory Standards）、1990−好気増殖するバクテリアに関 する希釈抗菌感受性試験のための方法（第２編）、文書M7- A2、NCCLS、ビラノ バ、Pa、USA)。 MRSAは主要かつ次第に重要になってきている病原体である。それらはβ−ラク タムグループの全ての抗生物質、例えば、ペニシリンおよびセファロスポリンに 対するそれらの耐性により、その他のスタフィロコッカス アウレウスとは区別 される。これらの化合物は“ペニシリン結合タンパク質"(PBP)と称されるバクテ リアタンパク質に結合することにより感受性株に作用する。MRSAでは、一種の特 別なPBP、即ちPBP2’と称されるものは、β−ラクタム抗生物質がそれに不十分 にしか結合しないような程度に変性された。このように、PBP2’はMRSAにおいて 耐性に対する手掛かりとなる。加えて、スタフィロコッカス アウレウスは酵素 β−ラクタマーゼを産生する能力を有する。この能力はMRSAおよび非メチシリン 耐性スタフィロコッカス アウレウスの両方に存在する。この酵素はベンジルペ ニシリンおよびアンピシリンを破壊する。メチシリンまたはセファロチンの如き その他のβ−ラクタム抗生物質はβ−ラクタマーゼに対し耐性である。 MRSAによる感染症は、糖ペプチドと称される抗生物質のグループで治療し得る 。これらは高価であり、かつ潜在的に毒性である。最も心配なことは、これが唯 一の広く利用できる治療であることである。糖ペプチドに対する耐性が密接に関 連するバクテリア中で現れ、MRSA中でまた容易に現れることができた。 臨床上の観点から、MRSAを治療するのにバンコマイシンの如き糖ペプチドを使 用する必要がある。しかしながら、それらが多く使用される程、糖ペプチド耐性 が更に現れそうである。これはMRSA感染症の信頼できる治療の欠如を残すであろ う。 スタフィロコッカスのその他の型はメチシリン耐性株を有し、その幾つかはPB P2’の存在のために耐性である。例はスタフィロコッカス エピデルミディスお よびスタフィロコッカス ヘモリチクスであり、これらの両方がコアグラーゼ陰 性種である。 茶のエキスが抗菌性を有することがわかっている。例えば、EP-A-443,090は、 約0.2-2.0g/100mlの濃度の茶のエキスがMRSAの幾つかの株を含む幾つかの型のバ クテリアの増殖を防止することができることを示している。 この状況において、茶は植物カメリア シネンシスを乾燥し、加工処理した葉 を表す。この植物は単一種と見なされるが、植物変種が生じ、２種の変種：大き い葉（15-20 cm）の植物であるアサミカ(assamica)と小さい葉(5-12 cm)の変種 であるシネンシス(sinensis)が認められる。頂芽と未成熟葉（技術的には“開芽 ”として知られている）からなる植物の成長点が摘み取られる。緑茶（例えば、 “煎茶”）は開芽から加熱し、柔らかにし、そして含水量が３〜４％に低下する まで熱空気中で乾燥することによりつくられる。黒い紅茶は含水量が50〜60％に 低下するまで開芽をかわかし、その後それを柔らかにし、次に“醗酵”させるこ とによりつくられる。これは茶を薄く広げ、それを室温で１〜３時間放置させる ことにより起こる。この時間中に、それはポリフェノールに対するカテコールオ キシダーゼの作用のために黒色に変化する。次に含水量が３％に達するまでそれ は熱空気中で乾燥される。茶の更に別の型であるウーロン茶は、部分醗酵を利用 して調製される。茶の処理は化学技術のキルク−オスマー百科事典（Kirk-Othme r Encyclopedia of chemical Technology）（第３版，1983）、John Wiley & So ns 発行に更に詳しく記載されている。 茶のエキスはMRSAを抑制することができるだけでなく、MRSAに対するメチシリ ンの活性を回復できることが今回見出された。こうして、茶のエキスはMRSAに対 してメチシリンと相乗作用することがわかった。MRSAに対する茶のエキスのこの 相乗作用は３つの構成要素の活性の組み合わせであると考えられる。 第一に（活性Ｉ）、茶のエキスはMRSAを抑制しまたは死滅させる。 第二に（活性II）、茶のエキスはPBP2’に対する活性を有する。或る特別な理論 により拘束されることを望まないが、茶のエキスはMRSA中のPBP2’生成を抑制し 、メチシリン（およびその他のβ−ラクタム抗生物質）をこれらの病原体に対し 作用させると考えられる。この作用の形式は、PBP2’の存在のために耐性である その他のメチシリン耐性バクテリア（特にその他のスタフィロコッカス）がまた 茶およびメチシリンの相乗作用に感受性であるであろうことを意味する。 第三に(活性III)、茶のエキスはまたMRSAを含むスタフィロコッカス アウレ ウスのβ−ラクタマーゼ活性を抑制し得ることもわかった。こうして、茶のエキ スはベンジルペニシリンまたはアンピシリンを含むβ−ラクタム抗生物質と相乗 作用する。 それ故、本発明はヒトを含む動物のMRSA感染症の治療における同時、別々また は連続の使用のための組み合わされた製剤としての、茶のエキスまたはその活性 フラクションおよびβ−ラクタム抗生物質の相乗的組み合わせを含む製品を提供 するものである。 更に詳しくは、本発明は、茶のエキスが (a)茶を水性媒体に抽出し、 (b)固形分をその媒体から除去し、 (c)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (d)(c)から得られる水相を有機溶媒で抽出し、そして有機相を保持し、 (e)必要により、水性媒体をその有機相に添加し、そして有機相を蒸発させて 、水溶液を残し、 (f)こうして得られた溶液から溶媒を除去して乾燥生成物を得、 (g)その乾燥生成物を有機溶媒に溶解し、 (h)その混合物をセファデックスカラムから溶離溶媒としての有機溶媒で溶離 し、 (i)280nm における溶出液の連続フラクションの吸光度(E280)を測定し、 (j)E280にピークを示す１以上のフラクションを保持することにより得られる 上記の生成物を提供するものである。 更に、本発明はβ−ラクタム抗生物質との組み合わせによりMRSAに対して相乗 効果を有する茶のエキスを得る方法を提供するものであり、その方法は (i)茶を水性媒体に抽出し、 (ii)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (iii)必要により、得られる水性媒体を更に精製し、 (iv)こうして得られた生成物を分別し、そして (v)所望の相乗効果を有する１以上のフラクションを保持することを含んでな る。 更に、本発明は (a)茶を水性媒体に抽出し、 (b)固形分をその媒体から除去し、 (c)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (d)(c)から得られる水相を有機溶媒で抽出し、そして有機相を保持し、 (e)必要により、水性媒体を有機相に添加し、そして有機相を蒸発させて、水 溶液を残し、 (f)こうして得られた溶液から溶媒を除去して乾燥生成物を得、 (g)乾燥生成物を更に別の有機溶媒に溶解し、 (h)その混合物をセファデックスカラムから溶離溶媒としての有機溶媒で溶離 し、 そしてβ−ラクタム抗生物質と組み合わせされ、MRSAに対し最大の相乗作用を 有するフラクションを保持することにより得られる茶のエキスを提供するもので ある。 また、本発明はβ−ラクタム抗生物質と共に有効量の茶のエキスまたはその活 性フラクションを患者に同時に、別々にまたは連続的に投与することによるMRSA に感染した患者の治療方法を提供するものである。 また、本発明はヒトを含む哺乳類のMRSA感染症の治療用医薬の製造におけるβ −ラクタム抗生物質および茶のエキスの使用を提供する。 茶のエキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラクタム抗生物質は、必要 によりそれらの投与のための指示と一緒に、キット中に包装してもよい。このよ うなキットは本発明の別の局面を形成する。 また、茶のエキスまたはその活性フラクションの組み合わせが包装され、そし てPBP2’により媒介されるその他のメチシリン耐性バクテリア感染症を治療する のに使用し得る。 使用し得る好適なβ−ラクタム抗生物質はペニシリン型抗生物質およびセファ ロスポリン型抗生物質の両方を含む。例えば、好適な抗生物質として、ベンジル ペニシリン、アンピシリン、メチシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン 、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフロキシム、セファタキ シム、およびセフトリアキソンが挙げられる。好ましい抗生物質として、メチシ リン、フルクロキサシリンおよびセファゾリンが挙げられる。必要により、一種 より多い抗生物質が茶のエキスと組み合わされた製剤中に使用し得る。 本発明において、“茶のエキス”という用語は処理された乾燥茶（例えば、紅 茶、緑茶またはウーロン茶）を熱水、好ましくは沸騰水と混合することにより得 られる水性エキスを表す。その混合は水溶性成分を溶解するのに充分な時間の期 間にわたって行われる。90〜100 ℃で１分から10分にわたる水またはその他の好 適な水性緩衝液との混合が充分であろう。そのエキスは、未溶解固体を除去し、 または水性エキスを濃縮するために更に処理してもよい。水性エキスそれ自体を 処理し、更に分別してもよい。ポリフェノールを含む水性フラクションが完全水 性フラクションの相乗作用を保持することがわかった。これは、活性成分がポリ フェノールであることを言うものではない。実際に、或る種のポリフェノールは 茶のエキスの三つの活性を全ては保持しないことが分析された。むしろ、活性成 分は、例えば、Robertson およびBendall（Phytoche-mistry（1983）22;883-887 ）の方法に従ってエキスのポリフェノールフラクションの精製により精製し得る ことが確立される。 あらゆる好適な方法が活性フラクションの精製に使用し得るが、一般に、茶を 水性媒体、好ましくは水、更に好ましくは沸騰水に抽出し、そして例えばロータ リー エバポレーター中で濃縮する。典型的には、固体を除去するためにこのエ キスを濾過、遠心分離またはそれ以外の処理を行う。色素およびカフェインを、 好ましくはクロロホルムの如き溶媒への抽出により除去してもよい。この場合、 色素およびカフェインを含む有機層を捨てる。次に残りの水相を更に別の有機溶 媒、好ましくは酢酸エチルに抽出し得る。この抽出は数回繰り返してもよい。次 に、こうして得られた１又は複数の酢酸エチル相は、好ましくは真空で濃縮し得 る。必要により、水性媒体、好ましくは等容積の水を添加してもよく、そして残 っている有機溶媒を蒸発し、水溶液を残す。溶媒は、例えば、水溶液の場合には 凍結乾燥によりこうして得られた溶液から除去し、そして固体を更に別の溶媒中 で再懸濁する。次にこの溶液を有機溶媒の使用に適した分離カラムに負荷する。 セファデックスカラムが好ましく、セファデックス（登録商標）LH-20 が特に好 ましい。カラムを通したその混合物の溶離により幾つかのフラクションが生じる 。これらはそれらの生物学的性質(活性Ｉ、IIおよびIII)を測定するために、好 ましくは280nm で溶離液の連続フラクションの吸光度を測定することにより適当 な方法で分析し得る。典型的には、高活性を有するフラクションが保持される。 下記の好ましいフラクションはE280にピークを示すが、高いE280を有しないもの の三つの活性のうちの一つ以上を有するフラクションがまた保持されてもよい。 好ましい実施態様では、茶を沸騰水で抽出し、ロータリー エバポレーター中 で濃縮し、クロロホルムで抽出する。有機層を捨て、そして水相を酢酸エチルで ８回抽出する。有機相を合わせ、真空で30mlまで濃縮し、等容積の水に添加し、 そして残っている酢酸エチルを蒸発する。水溶液は凍結乾燥し、メタノール中で 再懸濁し、等容積のクロロホルム：ペトロール（1:1）に添加し、そして分離カ ラム、例えば、クロロホルム：メタノール：ペトロール(1:2:1)で平衡にしたセ ファデックス（登録商標）LH-20 に負荷する。フラクションは回収し、凍結乾燥 することができる。酢酸エチルフラクションは水性エキスの全乾燥重量の約16％ を含む。このフラクションは相乗活性を保持した。 茶のエキスの活性フラクションは、本発明で使用し得る全エキスの相乗活性を 実質的に保持するフラクションである。フラクションは上記のRobertson および Bendall の方法を含む当業界で利用できるあらゆるその他の方法により生成し得 る。幾つかの好ましいフラクションは実施例６において記載されたピーク＃Ｃ、 Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびHa-Hc として記載されたものである。特にフラクションＦお よびＧ、さらにはＧが特に好ましい。フラクションは、それらが下記の実施例１ に記載された方法により相乗作用を保持するかどうかを見るために試験し得る。 ポリフェノール化合物として、式(I) （式中、Ｒ1は水素原子またはヒドロキシ基であり、かつＲ2は水素原子または３ ，４，５−トリヒドロキシベンゾイル基である） のカテキンが挙げられる。 一般式(I)により表されるカテキン化合物の特別な例として、(-)エピカテキン （これはＲ1がＨであり、かつＲ2がＨである式(I)の化合物である）；(-)エピガ ロカテキン（これはＲ1がＯＨであり、かつＲ2がＨである式(I)の化合物である ）；(-)エピカテキンガレート（これはＲ1がＨであり、かつＲ2が３，４，５− トリヒドロキシベンゾイルである式(I)の化合物である）；および(-)エピガロカ テキンガレート（これはＲ1がＯＨであり、かつＲ2が３，４，５−トリヒドロキ シベンゾイル基である式(I)の化合物である）が挙げられる。その他のポリフェ ノールとして、没食子酸、テオガリン、フラバノール、例えば、クエルセチン、 ケンプフェロール、ミリセチン、およびそれらのグリコシド；並びにデプシド、 例えば、クロロゲン酸およびｐ−クマリルキナ酸が挙げられる。 例えば、黒い紅茶中に存在するテアフラビンは一般式(II) （式中、Ｒ3およびＲ4は互いに独立に水素または３，４，５−トリヒドロキシベ ンゾイルである） の化合物を含む。テアフラビン化合物の特別な例として、遊離テアフラビン（こ れはＲ3がＨであり、かつＲ4がＨである式(II)の化合物である）；テアフラビン モノガレートＡ（これはＲ3が３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルであり、 かつＲ4がＨである式(II)の化合物である）；テアフラビンモノガレートＢ（こ れはＲ3がＨであり、かつＲ4が３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルである式 (II)の化合物である）；およびテアフラビンジガレート（これはＲ3が３，４， ５−トリヒドロキシベンゾイルであり、かつＲ4が３，４，５−トリヒドロキシ ベンゾイル基である式(II)の化合物である）が挙げられる。茶中に見られるその 他の化合物として、テアルビギン、テオフィリン、テオブロミンおよびカフェイ ンのみならず、おそらく微量濃度の300 種を超える揮発性風味成分が挙げられる 。 茶の幾つかのフラクションは市販されている。例えば、Taiyo Kagakuのサンフ ェノン（登録商標）およびMitsui Norinのポリフェノン30、100 およびＢがカテ キンの市販製剤である。カテキンはSigma Chemical社から入手し得る。 本発明による茶のエキスと抗生物質との組み合わせは当業界で通常の手段によ りMRSAに感染した患者に投与し得る。投与の経路は投与すべき抗生物質および茶 のエキスの量を決めるであろう。茶のエキスを未分別の形態で使用する場合、茶 の経口投与は本発明から除外される。 抗生物質および茶のエキスは、治療すべき症状に適したあらゆる経路によりヒ トを含む哺乳類に投与されてもよく、好適な経路として、経口経路、直腸経路、 鼻経路、局所経路（頬経路および舌下経路を含む）、膣経路および非経口経路（ 皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、皮内経路、くも膜下経路および硬膜外経路 を含む）が挙げられる。好ましい経路は、例えば、レシピエントの症状により変 化し得ることが理解されるであろう。 化合物は単独で投与されることが可能であるが、それらを医薬製剤として提供 することが好ましい。本発明の製剤は上記の少なくとも一種の活性成分を、それ らの一種以上の許される担体および必要によりその他の治療成分と一緒に含んで なる。担体は製剤のその他の成分と適合性があり、かつそれらのレシピエントに 有害ではないという意味で“許される”ものでなければならない。 製剤として、上記の投与の経路に適したものが挙げられる。製剤は単位投薬形 態で都合よく提供してもよく、そして医薬の分野で公知の方法のいずれかにより 調製し得る。このような方法は活性成分を一種以上の副成分を構成する担体と混 在させる工程を含む。一般に、製剤は活性成分を液体の担体もしくは微細な固体 の担体またはこれらの両方と均一かつ緊密に混在させ、次に必要により製品を成 形することにより調製される。 経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが所定の量の活性成分を含むカプ セル、カシェ剤または錠剤の如きばらばらの単位；粉末または顆粒；水性液体ま たは非水性液体中の溶液または懸濁液；または水中油型の液体エマルジョンもし くは油中水型の液体エマルジョンとして提供されてもよい。また、活性成分は巨 丸剤、舐剤またはペーストとして提供されてもよい。 眼またはその他の外部組織、例えば、口および皮膚の感染症に関して、製剤は 活性成分を含む局所軟膏またはクリームとして適用されることが好ましい。 また、眼への局所投与に適した製剤として、活性成分が好適な担体、特に活性 成分の水性溶媒に溶解または懸濁した点眼液が挙げられる。 口中の局所投与に適した製剤として、香味料入りのベース中に活性成分を含ん でなるロゼンジが挙げられる。 直腸投与用の製剤は好適なベースを含む座薬として提供し得る。 担体が固体である鼻投与に適した製剤は、嗅剤が吸収されるような方法で、即 ち、密閉して保持された粉末の容器から鼻通過による鼻への迅速な吸入により投 与される、例えば、20〜500 ミクロンの範囲の粒径を有する粗大粉末を含む。例 えば、鼻スプレーまたは点鼻液としての投与用の、担体が液体である好適な製剤 は活性成分の水性または油性の溶液を含む。 膣投与に適した製剤はペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フ ォームまたはスプレー製剤として提供し得る。 非経口投与に適した製剤は水性および非水性の無菌注射液を含む。注射溶液お よび懸濁液は前記の種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から即座に調製し得る。 上記製剤は抗生物質および茶のエキスまたはそのフラクションを一緒に含んで いてもよく、または２成分が異なる製剤中で別々に調製されてもよい。例えば、 茶のエキスを局所に、例えば、感染傷に投与することが都合のよいことがあるが 、抗生物質を経口投与または注射により投与することが都合のよいことがある。 ２成分は単一製剤で一緒に投与されてもよく、または異なる製剤で同時に一緒に 投与されてもよい。また、２成分は相乗効果が生じるのに充分な短い期間内に連 続的に投与されてもよい。２成分の連続使用は互いの１時間以内、好ましくは５ 分もしくは10分以内に両成分の投与を必要とするであろう。 投与すべき抗生物質の量は投与の経路および治療すべき患者の症状に一部依存 するであろう。一般に、経口投与または注射により投与される抗生物質は１日に つき体重１kg当たり10〜200 mg、好ましくは１日につき体重１kg当たり50〜100 mgの投薬量であろう。その量は患者の症状および使用される特別な抗生物質の効 力に依存するであろう。局所投与用の組成物中に、抗生物質は一般に0.1 〜５％ w/w 、好ましくは0.5 〜３％w/w の濃度で存在するであろう。一般に、患者への 投与用の製剤中に存在する抗生物質の量は、投与される抗生物質の投薬量がMRSA 表現型を有しないスタフィロコッカス アウレウスの株の増殖を抑制し、または 死滅させるのに必要とされる投薬量に近似し、かつMRSAの増殖を抑制し、または それを死滅させるのに必要とされる投薬量を下回るような量であろう。 投与すべき茶のエキスの量は茶のエキスの濃度およびその型に依存するであろ う。茶の好適な型として、緑の葉の茶である日本茶（煎茶）並びに黒い紅茶が挙 げられる。 下記の実験では、沸騰水中でつくられた砕いた葉茶の２％抽出物（水100 ml中 2gの茶）がエキスの源として使用され、この希釈液はメチシリンの活性を増強す ることができた。以下に示されるエキスの重量および濃度は、全て特にことわら ない限り水性エキス中に溶解した葉茶の重量を表す。２％のエキスの1/200 希釈 液がメチシリンの活性を増強するのに有効であることがわかった。こうして、作 用の所望の部位で少なくとも10〜100 μg/ml、例えば、20〜50μg/mlの局所濃度 を与えるための茶のエキスの直接の適用が、MRSAを治療する際にβ−ラクタム抗 生物質の活性を増強するのに有効である。茶は一般にそれがつくられ、または飲 まれる濃度(約３mg/ml)で無毒性と見なされるので、100 μg/mlの茶よりも極め て高い濃度、例えば、１mg/ml まで、例えば、10mg/ml 、100mg/mlまたは１g/ml の濃度を使用することが可能である。茶の特定のフラクションが使用される場合 、そのフラクションの量は全茶のエキス中のその濃度に比例するであろう。例え ば、エキスの約1/3 はポリフェノールである。ポリフェノールを含むフラクショ ンが使用される場合、上記の濃度は1/3 に減少されてもよい。注射組成物または 経口組成物に関する茶のエキスまたはそのフラクションの濃度は、その作用が必 要とされる部位に同様の量の茶をデリバリーするように設計されるであろう。全 エキスの好適な１日の投薬量は体重１kg当たり約10〜約1000mg、例えば、体重１ kg当たり約50〜100mg の範囲であろう。 抗生物質および茶はいずれも単位投薬形態で投与してもよく、その１日あたり の好適な投薬量は単一投薬として、または分割された投薬、例えば、１日中に適 当な間隔で投与される２回、３回もしくは４回のサブ投薬で提供してもよい。 下記の実施例は本発明を説明し、そしてMRSAに対する茶のエキスの活性の３成 分を実証する。それらは、茶のエキスがMRSAの増殖を抑制するのに通常必要とさ れるよりも８〜128 倍少ないメチシリンの濃度に対しMRSAを感受性にするのに有 効であることを示す。その効果は茶との特別な相乗効果である。茶は、それが直 接の抗菌効果を有しない濃度でさえもその相乗効果を与える。これは、メチシリ ン感受性スタフィロコッカス アウレウス(MSSA)に対し茶をメチシリンとともに 使用した時に相乗効果が見られないという事実により実証される。茶に代えて第 二抗生物質、バンコマイシンを使用する対照実験は相乗効果を何ら示さない。実施例１ 原料 メチシリンに対し高度に耐性〔（即ち、それらを抑制するのに少なくとも128 μg/mlが必要とされる）〕であるMRSAの20種の株（オーストラリア、ブラジル、 チリ、デンマークおよびドイツで単離された）を試験した。 砕いた葉の日本の“煎茶”の２％のエキスを沸騰水中でつくり、ミリポアフィ ルターで濾過した。このエキスは約14.7mg/ml の茶を含む。 ナトリウムメチシリン（SmithKline Beecham）およびバンコマイシン塩酸塩（ Lilly Industries）はLaboratory Referenceから入手した。 IsoSensitest寒天(Unipath CM471)に20g のNaCl/Lを補給した。 方法 株をIsoSensitest（登録商標）ブロス(ISB、Unipath CM473)中で37℃で一夜増 殖させ、１μl の量(約106のコロニー形成単位(cfu))を、メチシリンの二重希釈 液(1024 -1μg/ml)単独を含み、また種々の抑制濃度以下、即ち、1/40、1/70、1 /100 、1/200 そして1/300 の最終希釈の茶のエキスの存在下でIsoSensitest（ 登録商標）寒天の６つの一連のプレートに接種した。 バンコマイシンの一連の抑制濃度以下、即ち、0.5 、0.28、0.2 、0.1 そして 0.07μg/l に希釈されたメチシリンを使用して同様の実験を行った。 プレートを30℃で48時間インキュベートした。抗生物質の最小抑制濃度(MIC) を活性IIの目安としてそれぞれのサンプルについて計算した。 結果 1/300 の茶のエキスはメチシリンMIC に対し効果を有していなかった。しかし ながら、それより高い全ての濃度は、８希釈工程〜３希釈工程（即ち、128 倍か ら８倍まで）により、全ての株についてメチシリンのMIC を著しく低下した。株 の大半はエキスの存在下で２、４または８μg/mlのメチシリンに対し感受性にな った。エキスの不在下では、MIC は通常512 μg/mlであった。 結果を表１に要約した。バンコマイシンの存在下ではメチシリンMIC の低下は なかった。 比較例１ 茶のエキスの抗菌スペクトル（活性Ｉ）をウェル拡散方法により測定した。Is oSensitest寒天（Oxoid）のプレートに、最終接種物が約105cfu/ プレートとな るように希釈した培養物を塗布した。６mmのウェルを寒天から切断し、そして実 施例１に従って得られた茶のエキス100 μl で満たした。抑制のゾーンを一夜の インキュベーション後に測定した。 エキスの力価（即ち、抑制のゾーンを生じるのに丁度失敗した希釈）を、上記 のエキスの連続希釈液を分析し、そして回帰線のゼロゾーンサイズを示す切片を 計算することにより測定した。この数値（希釈ファクター）をオリジナルのエキ ス中の固体の既知濃度を基準として最大非抑制濃度（MNIC，Cooper 1963 in Ana lytical Microbiology(Ed Kavanagh)London，Academic Press）に変換した。 MIC をチューブ希釈方法によりIsoSensitest ブロス（Oxoid）１ml容積中で1 05cfu/ チューブの接種物で測定した。チューブの一夜のインキュベーション後 の増殖について読み取り、次にMBC(少なくとも99.9％死滅)をそれぞれのチュー ブからの0.2 mlの継代培養により測定した（終点：<20 のコロニーの増殖）。MR SAの15種の株を試験した。MNICは190 ±50μg/mlであることがわかった。MIC は 280 μg/mlであり、そして最小バクテリア濃度(MBC)は410 μg/mlであった。こ れは上記の実施例１および下記の実施例２（この場合、50μg/ml程度に小さい濃 度のエキスが或るMRSAをメチシリンに感受性にするのに充分である）とは対照的 である。 実施例２ 低レベルMRSAの更に別の20種の株について、実施例１に記載された操作に従っ て活性IIを試験した。結果を表２に示す。その表は、茶の1/300 希釈液の存在で さえもがMRSAの増殖を抑制するメチシリンの能力に対し効果を有していたことを 示す。 実施例３ MRSAの２種の株（そのうちの一方、13136p-M+、(A)はPBP2’のその産生につい て構成的であり、他方の(B)は誘導性である）を、活性IIを測定するという観点 で研究した。 株をブロース(A)単独または+25 μg/mlの茶のエキス；(B)+メチシリン100 μ g/ml［インデューサーとして］±茶のエキス25μg/ml中で増殖させた。株を回収 し、PBP を抽出し、そして先に記載されたようにして（Brown DFJ ＆Reynolds P E1980: スタフィロコッカス アウレウスにおけるβ−ラクタム抗生物質に対す る内在性耐性(FEBS Letters 122;275-278)）、〔（14C-ベンジルペニシリンで標 識した後のゲル電気泳動により）〕分析した。 結果は、PBP2’の産生がＢ中で完全に抑制され、そしてＡ中で90％より多く抑 制されることを示した。 実施例４ スタフィロコッカス アウレウス株をブロス＋１μg/mlのメチシリン［誘導剤 ］中で増殖させた。茶の存在下そして不在下でニトロセフィンを使用してβ−ラ クタマーゼ活性を測定した(Gaisford WC ＆Reynolds PE，1989.スタフィロコッ カス エピデルミジスにおけるメシチリン耐性．付加的なペニシリン結合性タン パク質と付着トランスペプチダーゼの間の関係．European J.Biochem．185;211- 218)。予備生成された酵素の活性について、効果が殆どまたは全く見られなかっ た。その株を誘導剤そして茶のエキス（25μg/ml）の存在下で増殖させ、培養物 を遠心分離により細胞および上澄みに分離し、そして上記のようにしてフラクシ ョンのβ−ラクタマーゼ活性について分析した。茶は酵素の誘導を約60％阻止し 、誘導されたものは上澄みに排出されるのとは反対に細胞に結合されたまま残っ た。４世代にわたって上澄みフラクションへの酵素分泌の80〜90％の抑制があっ た。この知見は活性III を実証し、そして茶とベンジルペニシリンの組み合わせ が相乗的であり得ることを示す。茶中で増殖した培養物中に存在するβ−ラクタ マーゼの減少量は、ベンジルペニシリンの致死作用からそのバクテリアをあまり 保護することができない。 実施例５ メチシレン感受性スタフィロコッカス アウレウス(MSSA)の９種の株と一緒に 、上記の実施例１および２で試験した40種の株を、活性III を測定するという観 点で、茶のエキスの存在下または不在下でベンジルペニシリンに対するそれらの 耐性について試験した。使用した操作は、ベンジルペニシリンをメチシリンに替 えた以外は、実施例１に記載されたものと同様であった。MSSAおよびMRSAのいず れ ともβ−ラクタマーゼの産生によりベンジルペニシリンに対し自然の耐性を有す る。 結果を表３に示す。茶のT/300 からT/40まで（約50から370 μg/mlまでのエキ ス）の希釈液がベンジルペニシリンの活性に相乗作用するのに充分であったこと がわかる。 実施例６ 茶のエキス中そして茶成分であると知られている純粋な化合物中の３種の異な る生物活性の測定 方法 薬品 エピガロカテキン(EGC)およびエピガロカテキンガレート(EGCG)をFuna koshi 社（東京）から購入した。エピカテキン、クロロゲン酸、没食子酸、テオ ブロミン、テオフィリン、クエルシチン、およびケンフェロールをSigma から購 入した。この実施例において、また一般に、“ペトロール”という用語は石油エ ーテルを表す。下記の方法に使用された特定の石油エーテルは、54℃〜93℃の沸 騰範囲を有する“BDH Petroleum Spirit Technical”であった。 茶のエキスの分別 煎茶（日本の緑茶，“ウィッターズ オブ チェルシア(Wittards of Chelsea) ”）30g を乳鉢中で砕き、10分間にわたって沸騰水500 mlで抽出した。その混合 物を濾過し、そして残渣を前記のようにして再度抽出した。液相を合わせ、そし て真空下で約100 mlの容積まで蒸発させた。色素およびカフェインをCHCl3への ５連続の分配により除去した。水相を遠心分離し、その上澄みを酢酸エチル200 mlで８回抽出した。有機相を合わせ、真空下で約30mlの容積に濃縮した。等容積 の水を添加し、酢酸エチルの残部を蒸発させた。得られた水相を凍結乾燥した。 こうして得られた固体1gをメタノール1.5 mlに溶解し、そして等容積のペトロ ール／CHCl3(1:1)を添加して、メタノール／ペトロール／CHCl3の2:1:1 溶液を つくった。これをメタノール／ペトロール／CHCl3(2:1:1)で平衡にしたセファデ ックスLH-20(登録商標)のカラム(2.5 X 47 cm)に負荷し、同溶媒を使用して重力 下に溶離した。一定のヘッド装置を使用して、流量を１ml/ 分に調節した。10ml のフラクションを回収し、そしてそれぞれのE280 nm を測定した。 194 のフラクションを回収した後、溶出相をメタノール単独に変えた。カラム に残った物質を洗い流して、ピーク#Hを得た。 溶出プロフィールを図１として示す。番号を付したピーク(＃A-Hc)のそれぞれ を構成するフラクションを別々に溜め、そして凍結乾燥した。それらをホイルで 包装し、しっかりと栓をしたジャー中で４℃で貯蔵した。 以下に記載されるようにこれらのフラクションの活性Ｉ、IIおよびIII につい て分析した。 生物活性の測定 スタフィロコッカス アウレウスで約４mmの深さまで表面接種したIsoSensite st寒天(Unipath CM471)を含む大きいプレート（直径14cmの円形、または25X25cm の正方形）を使用して、バイオアッセイにより、活性Ｉ（バクテリアに対する 抑制／死滅作用）、II（抗PBP2’作用）およびIII(β−ラクタマーゼに対する作 用)を定量した。アッセイ株および寒天への添加は分析される活性に従って変化 した（表４）。 ６mmのウェルにおける寒天を切断し、そして分析すべき物質の溶液の適当な希 釈液（二重）を入れた。一夜のインキュベーション後に、抑制ゾーンの直径を測 定し、ゾーン直径に対し（対数濃度）をプロットした。その回帰線をゾーン直径 （６mm）に外挿することによりMNICを計算した。それを濃度（μg/ml）または活 性（濃度、mg/ml の逆数）として表した。 結果 純粋な化合物の生物活性 エピカテキン、クロロゲン酸、没食子酸、テオブロ ミンおよびテオフィリンは、１mg/ml で試験した時に活性ＩまたはIIの形跡を示 さなかった。 クエルシチン（MNIC=175pg/ml;活性=5.7）、ケンフェロール(>200; <5)、EGC( 50; 20)およびEGCG（84; 12）は活性Ｉの適度の量を示したが、活性IIを示さな かった。 茶のエキスの分別 カラムからの溶出プロフィールを図１として示し、そして 種々のピーク間の活性Ｉ、IIおよびIII の分布を表５に示す。 活性Ｉ 活性Ｉはフラクションの全域に広く及んでいることが明らかである。 殆どがピーク#E中にあり、これはEGC + EGCGに相当する。しかしながら、定量的 には、#Eはそれが純粋なEGC であった場合（上記を参照のこと）よりも大きな活 性を示すことが注目されるべきである。こうして、茶のエキス中でここに見られ た活性ＩはEGC およびEGCGによるだけでなく、その他の化合物によるものである 。 この結論は別の実験により支持される。17種の異なる型およびブランドの茶葉 を公称２％として抽出した。EGC およびEGCGに関するE272 nm 、最大吸光度をそ れぞれのエキスについて測定し、同様に乾燥重量（凍結乾燥後）、およびスタフ ィロコッカス アウレウス オクスフォードに対する生物活性（活性Ｉ）を測定 した。次にこれらの三つのパラメーターの間の相関関係を回帰分析により調べた 。E272と乾燥重量の間にのみ統計上有意な相関関係があった。これは、(i)乾燥 重量の殆どがECG + EGCGによるものであったこと、(ii)活性ＩがEGC + ECGCの含 量と相関関係がなかったことを示す。 活性II 活性IIはピーク#G中で最高であり、そして活性Ｉから明らかに分離さ れる。活性IIの原因となる成分は大きな固有の活性を有する必要がある。何とな れば、少量の粗ピーク#Gが２μg/ml程度で依然としてその効果を示したからであ る。 活性III 活性III は定性的かつ定量的の両方で活性IIと同時に作用すると思 われる。 比較例２ Tajimaらの“抗PBP2’原理”による実験 背景 Tajimaら(Microbiol.Immunol．37:695-703，1993; 同文献38:639-648， 1994）は、タングステン酸塩およびリン酸塩の混合物から誘導された化合物がMR SAによるPBP2’の生成を抑制し、こうしてそれらをメチシレンに対し感作させる ことを報告した。比較の目的のために、或る“因子Ｔ”をつくり、茶のエキスと 比較した。 方法 薬品をSigma から購入し、そしてTajimaら(1994)により記載された“因 子Ｔ”の製造方法に近似して従った。製造された因子Ｔの活性Ｉ、IIおよびIII について上記のようにして分析した。 結果 “因子Ｔ”の活性Ｉに関するMNICは60pg/ml であることがわかった（即 ち、それは本発明者らの茶のエキスのピークＥに関してその活性の約50％を有す る）。しかしながら、この濃度では、それは活性IIおよびIII を示さず、こうし て本発明者らの茶のエキスよりもこれに関して少なくとも30倍少ない活性である 。 結論 “因子Ｔ”は本明細書に記載された茶のエキスとは定量的かつ定性的に 異なる。その二つの間の近似は純粋に符合する。 実施例８ 表１〜３中のデータの数理解析 MRSA(20 の高レベルおよび20の低レベル)に対する種々の濃度の茶のエキスお よびメチシリンの間に生じる相乗作用−活性II並びに bla-スタフィロコッカス アウレウスの49株に対する同濃度およびベンジルペニシリンの間に生じる相乗 作用−活性III の量が数的用語でここに定量された。 これらの表に示されたそれぞれの終点についてΣFIC を計算することによりこ れを行った。“相乗作用”をΣFIC <0.7の値（即ち、両方の個々の抗菌剤に関す るMIC の少なくとも３倍の低下）として定義した。この操作の詳細はKerry ら(1 975; J.Antimicrob.Chemother．1:417-427)に見られる。 活性II 20の高レベルMRSAの全てについて、濃度T/70、T/100 およびT/200 の 茶のエキスはメチシリンと相乗作用を生じた。最高の相乗作用がT/200 で15種の 株について見られ（ΣFIC =0.22-0.29）、そしてT/100 で５種について見られた （ΣFIC =0.38-0.45）。観察された相乗作用の最大の程度はΣFIC =0.22(即ち、 それぞれのパートナーのMIC の10倍の低下)であった。 試験した20の低レベルの株の全てについて、濃度T/70-T/300の茶のエキスはメ チシリンと相乗作用を示した。最大の相乗作用(ΣFIC 0.17-0.36)がT/300 で６ 種の株について見られ、そしてT/200 で14種について見られた（ΣFIC 0.18-0.2 9）。相乗作用の最大の程度はΣFIC =0.17 であった。 活性III 49種の株をここで試験した−MRSAとMSSAの混合物。相乗作用が株の43 種（88％）について少なくとも一つの濃度の茶のエキスとベンジルペニシリンの 間で観察された。最大の相乗作用(ΣFIC=0.14-0.36)が10種の株についてT/300 で見られ、14種についてT/200 で見られ(ΣFIC=0.38-0.61)、そして９種の株に ついてT/70で見られた(ΣFIC=0.52-0.59)。見られた相乗作用の最大の程度は ΣFIC =0.14であった。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月７日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヒトを含む動物のMRSA感染症の治療において同時に、別々にまたは連続的に 使用するための組み合わせ製剤として茶のエキスまたはその活性フラクションお よびβ−ラクタム抗生物質の組み合わせを含んでなる製品であって、前記製品が 相乗的抗菌作用を生じる量の前記茶のエキスまたはその活性フラクションを含む ことを特徴とする製品。 ２．抗生物質がメチシリン、フルクロキサシリンおよびセファゾリンから選ばれ る請求項１に記載の製品。 ３．茶のエキスが茶を水性媒体に抽出することにより得られる請求項１または２ に記載の製品。 ４．茶のエキスが (a)茶を水性媒体に抽出し、 (b)固形分を媒体から除去し、 (c)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (d)(c)から得られる水相を有機溶媒で抽出し、そして有機相を保持し、 (e)必要により、水性媒体をその有機相に添加し、そして有機相を蒸発させて 、水溶液を残し、 (f)こうして得られた溶液から溶媒を除去して乾燥生成物を得、 (g)その乾燥生成物を有機溶媒に溶解し、 (h)その混合物を溶離溶媒としての有機溶媒で平衡化させたセファデックスカ ラムから溶離し、 (i)280nm における溶出液の連続フラクションの吸光度(E280)を測定し、 (j)E280にピークを示す１以上のフラクションを保持する、 ことにより得られる請求項３に記載の製品。 ５．保持されるフラクションが第三ピーク（ピークＣ）、第五ピーク（ピークＥ ）、第六ピーク（ピークＦ）および第七ピーク（ピークＧ）から選ばれた一種以 上のフラクションである請求項４に記載の製品。 12．ヒトを含む哺乳類のMRSA感染症の治療用の医薬品の製造におけるβ−ラクタ ム抗生物質および茶のエキスの使用。 13．患者に相乗効果量の茶のエキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラク タム抗生物質を同時に、別々に、または連続的に投与することを含んでなる患者 のMRSA感染症の治療方法。 14．抗生物質が請求項２に記載のとおりである請求項13に記載の方法。 15．茶のエキスが請求項４〜９のいずれか一項に記載のとおりである請求項13ま たは14に記載の方法。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトを含む動物のMRSA感染症の治療において同時に、別々にまたは連続的に 使用するための組み合わせ製剤として、茶のエキスまたはその活性フラクション およびβ−ラクタム抗生物質の相乗的組み合わせを含んでなる製品。 ２．抗生物質がメチシリン、フルクロキサシリンおよびセファゾリンから選ばれ る請求項１に記載の製品。 ３．茶のエキスが茶を水性媒体に抽出することにより得られる請求項１または２ に記載の製品。 ４．茶のエキスが (a)茶を水性媒体に抽出し、 (b)固形分を媒体から除去し、 (c)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (d)(c)から得られる水相を有機溶媒で抽出し、そして有機相を保持し、 (e)必要により、水性媒体をその有機相に添加し、そして有機相を蒸発させて 、水溶液を残し、 (f)こうして得られた溶液から溶媒を除去して乾燥生成物を得、 (g)その乾燥生成物を有機溶媒に溶解し、 (h)その混合物を溶離溶媒としての有機溶媒で平衡化させたセファデックスカ ラムから溶離し、 (i)280nm における溶出液の連続フラクションの吸光度(E280)を測定し、 (j)E280にピークを示す１以上のフラクションを保持する、 ことにより得られる請求項３に記載の製品。 ５．保持されるフラクションが第三ピーク（ピークＣ）、第五ピーク（ピークＥ ）、第六ピーク（ピークＦ）および第七ピーク（ピークＧ）から選ばれた１以上 のフラクションである請求項４に記載の製品。 ６．保持されるフラクションが第七ピーク（ピークＧ）である請求項５に記載の 製品。 ７．保持されるフラクションが、β−ラクタム抗生物質と組み合わされて、その 他のフラクションよりもMRSAに対する大きい相乗効果を有する請求項４に記載の 製品。 ８．請求項４に記載の工程(a)〜(i)を行い、カラム中の溶離溶媒をメタノールに 変え、そして請求項４に記載の工程(g)で得られた混合物の更に別のフラクショ ンを溶離し、これらのフラクションのE280を測定し、そしてE280にピークを示す １以上のフラクションを保持することにより得られる請求項３に記載の製品。 ９．保持されるフラクションが溶離溶媒をメタノールに変えた後に得られた第一 ピーク（ピークＨ）およびそのピーク中の３成分ピーク（ピークHa、HbおよびHc ）の１以上から選ばれる請求項８に記載の製品。 10．β−ラクタム抗生物質と組み合わされて、MRSAに対して相乗効果を有する茶 のエキスを得る方法であって、その方法が (i)茶を水性媒体に抽出し、 (ii)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (iii)必要により、得られる水性媒体を更に精製し、 (iv)こうして得られた生成物を分別し、そして (v)所望の相乗効果を有する１以上のフラクションを保持する、 ことを含んでなる茶のエキスを得る方法。 11.(a)茶を水性媒体に抽出し、 (b)固形分をその媒体から除去し、 (c)必要により、色素およびカフェインを除去し、 (d)(c)から得られる水相を有機溶媒で抽出し、そして有機相を保持し、 (e)必要により、水性媒体をその有機相に添加し、そして有機相を蒸発させて 、水溶液を残し、 (f)こうして得られた溶液から溶媒を除去して乾燥生成物を得、 (g)乾燥生成物を更に別の有機溶媒に溶解し、 (h)その混合物をセファデックスカラムから溶離溶媒として有機溶媒を使用し て溶離し、 そしてβ−ラクタム抗生物質と組み合わされて、MRSAに対し最大の相乗作用を 有するフラクションを保持する、 ことにより得られる茶のエキス。 12．ヒトを含む哺乳類のMRSA感染症の治療用の医薬品の製造におけるβ−ラクタ ム抗生物質および茶のエキスまたはそのフラクションの使用であって、前記医薬 品が相乗的抗菌作用を生じる量の茶のエキスを含むことを特徴とする使用。 13．患者に相乗効果量の茶のエキスまたはその活性フラクションおよびβ−ラク タム抗生物質を同時に、別々に、または連続的に投与することを含んでなる患者 のMRSA感染症の治療方法。 14．抗生物質が請求項２に記載のとおりである請求項13に記載の方法。 15．茶のエキスが請求項４〜９のいずれか一項に記載のとおりである請求項13ま たは14に記載の方法。
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