KR102203849B1 - 동물용 복합 항생제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세프티오퍼(Ceftiofur)와 네오마이신(Neomycin) 및 덱사메타손(Dexamethasone)을 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비의 중량비로 복합처방됨으로서 단독 처방시에 비해 동물의 유방염 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것이다.

Description

동물용 복합 항생제 조성물{ANTIBIOTICS COMPOSITION FOR ANIMALS}
본 발명은 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것으로 , 더욱 상세하게는 세프티오퍼(Ceftiofur)와 네오마이신(Neomycin) 및 덱사메타손(Dexamethasone)을 1-5:1-5:0.01-0.05의 중량비로 복합처방됨으로서 단독 처방시에 비해 동물의 유방염 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 세프티오퍼(Ceftiofur), 네오마이신(Neomycin) 및 덱사메타손(Dexamethasone)을 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비로 복합 처방됨으로써 단독 처방시에 비해 동물의 유방염 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것이다.
최근 젖소 농장에서 페니실린 내성균, 연쇄상구균, 슈도모나스균 및 대장균 등에 의한 젖소의 유방염의 발생으로 우유의 생산성이 감소하여 농가에서는 안전한 치료제에 대한 요구가 증대하고 있다.
가축 동물인 소, 돼지, 염소 등 유방염의 원인균으로는 약 140 여종의 미생물이 복합적으로 광범위하게 관여되어 있는 것으로 알려져 있으며, 많은 종류의 항균제 약품이 소개되어 있다.
세프티오퍼(ceftiofur)는 제 3 세대 세팔로스포린계 항생제로서, 계통 명칭은 {6R-[6α, 7β(Z)] }-7- { [(2-아미노-4-티아졸릴) (메톡시이미노) 아세틸] 아미노 }-3- { [(2- 푸라닐 카보닐)-티오] 메틸 }-8-옥소-5-티아-1-아자바이사이클로 [4.2.0] 옥트-2-엔-2-카복실산이며, 모노소디움염 또는 모노염산염 형태로 존재한다. 세프티오퍼는 다른 베타락탐계 항생제(페니실린계 및 세팔로스포린계)와 마찬가지로 세균의 세포벽 합성을 억제함으로써 항균작용을 나타내는 살균성 항생제이다. 베타락탐계 항생제는 감수성 있는 세균세포벽에 존재하는 한 개 또는 그 이상의 PBPs(Penicillin Binding Proteins)와 결합하여 세균 세포막 형성의 세 번째 단계를 억제한다. 따라서, 베타락탐계 항생제의 항균력은 이들 PBPs와의 결합 친화력에 따라 달라지게 된다. 예를 들면, 포도상구균의 PBPs와의 친화력은 일반적으로 제 1 세대 세팔로스포린이 제 3세대 세팔로스포린 보다 크다. 그러나, 장내 세균과(Enterobacteriaceae) 세균의 PBPs에 대한 친화력은 일반적으로 제 3 세대 세팔로스포린이 더 크다. 또한, 그람 양성균 및 음성균이 생산하는 베타락탐에 대한 안정성과 약물의 그람 음성균 외막 투과능에 따라 개개 항생제의 항균력이 달라진다. 세프티오퍼는 다른 제 1 세대 세팔로스포린과 마찬가지로 대부분의 그람 양성세균에 대해 매우 높은 항균력을 나타내며 몇몇의 그람 음성균에도 높은 항균력을 나타낸다. 최근에는 세프티오퍼에 대해 몇몇 대장균주는 내성을 보인다는 보고가 있으나 현재 주입 용액(오일현탁액) 제제로만 제제화되어 있다. (EP 36812 (1981), USP 4464367 (1984) 및 Am. J. Vet. Res. 48, 1050-3 (1987), ibid. 53, 2201, (1992) 참조)
또한, 아미노글리코사이드(Aminoglycoside) 계열의 항생제로는 아미카신, 아르베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신 등이 사용되고 있으며, 이들중 네오마이신(Neomycin)은 옛부터 널리 사용되어온 약물로, 계통 명칭이 (2R,3S,4R,5R,6R)-5-아미노-2-(아미노메틸)-6-[(1R,2R,3S,4R,6S)-4,6-디아미노-2-[(2S,3R,4S,5R)-4-[(2R,3R,4R,5S,6S)-3-아미노-6-(아미노메틸)-4,5-디하이드록시옥산-2-일]옥시-3-하이드로옥시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]옥시-3-하이드록시 사이클로헥실]옥시옥산-3,4-디올로서, 네오마이신 A, 네오미아신 B, 네오마이신 B 염산염 및 네오마이신 B 황산염 등이 알려져 있다. 동물용으로만 사용되고 DNA 복제 및 전사에 필수적인 DNA gyrase(topoisomeraseⅡ)를 억제하여 DNA 슈퍼코일의 형성을 특이적으로 저해하는 살균성 항균제다. 대장균(E. coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 클렙시엘라 속(Klebsiella spp.) 엔테로받터(Enterobacter), 캄파일로박터(Campylobacter), 시젤라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 아에로모나스(Aeromonas), 헤모필러스(Haemophilus), 프로테우스(Proteus), 예르시니아(Yersinia), 세라티아(Serratia), 비브리오 종(Vibrio species) 등의 병원성 세균에 강한 항균력을 발휘하여 뛰어난 치료 및 예방 효과를 나타낸다고 할 수 있다. 네오마이신은 위와 같은 독특한 작용기전으로 다른 계통의 항균제와는 교차 내성을 일으키지 않는다는 특징이 있다. (USP 2799620, 2848365, 3108996, 3005815, 3022228 및 J. Antibiot. 40, 1464, (1997) 참조)
덱사메타손(Dexamethasone)은 항염증성 활성을 나타내는 잘 알려진 합성 코르티코스테로이드(Corticosteroid)이다. 이는 다양한 염증성 상황의 치료에 사용되기 위해 여러 물리적 형태로 투여되어질 수 있다. 덱사메타손의 계통 명칭은 (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-플루오로-11,17-디하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-6,7,8,11,12,14,15,16-옥사하이드록시클로펜타[a]페난트렌-3-원으로, 그의 염으로 21-아세테이트, 21-포스페이페이트 디소디움염 및 17, 21-디프로피오네이트 등이 알려져 있다. (DE 1113690, GB 869511 및 N. Engl. J. Med. 311. 549 (1984) 참조)
상기와 같이, 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손은 수의 임상분야에서 각각 단독제제로는 많이 사용되고 있는 항생물질이지만, 단독 제제만으로는 항균력이 미치지 못하는 미생물이나 내성균까지 감안한 이들 3 종 복합 제제에 대한 수의 약리학적 연구는 국내외적으로 이루어지지 않고 있는 실정이다.
EP 36812; USP 2796620, 2848365, 3005815, 3022228, 3108996; DE 1113690; GB 869511
Am. J. Vet. Res. 48, 1050-3 (1987) ibid 53, 2201 (1992), J. Antibiot. 40, 1464 (1987) N. Engl. J. Med. 3ll. 549 (1984)
이에, 본 발명자들은 최적의 동물용 복합항생제 조성물을 얻고자 연구 노력한 결과, 동물의 병원성 미생물의 억제 효과가 탁월한 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손의 동물용 복합항생제 조성물을 개발하였고, 단독으로 사용하는 경우와 기존에 사용된 복합제제에 비해 동물의 유방염 예방 및 치료에 탁월한 상승효과가 나타남을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 동물의 유방염을 일으키는 병원성 미생물의 억제 효과가 우수한 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손이 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비로 혼합되어 포함된 동물용 복합항생제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비로 혼합되어 포함된 동물용 복합 항생제 조성물을 제공함을 특징으로 한다. 이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비로 복합 처방됨으로써 단독 처방과 기존 복합제제에 비해 동물의 유방염 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는 동물용 복합항생제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손의 혼합 비율을 최적화시켜 경제적이면서도 동물의 유방염 원인균에 대한 항균 활성이 우수한 새로운 조성의 동물용 약제 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에서는 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손 사이의 상호 작용을 규명하고 혼합비간의 상관관계를 알아보기 위해 항생제 다제 내성균주(Multi-resistant microorganism), 즉 각종 세균성 질병에 이환된 닭, 돼지, 소로부터 분리한 그람양성 및 음성세균에 대한 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손 복합제제의 항균효과를 최소 발육저지 농도(Minimum Inhibition Concentration, MIC)로 시험하여 측정하였다.
본 발명에서 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손 혼합비율은 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비가 바람직하다. 상기 혼합비율이 1:1:0.01 미만이면 경제적이기는 하나 항균력이 저하되어 목적하는 바의 항균효과는 거두기어렵고 5:5:0.05 이상이면 세프티오퍼의 높은 가격으로 인해 비경제적이다. 제형별 바람직한 중량은, 세프티오퍼 100~500 mg, 네오마이신 100~500 mg 및 덱사메타손 1-5 mg을 포함하고, 바람직하게는 세프티오퍼 100~300 mg, 네오마이신 100~300 mg 및 덱사메타손 1-3 mg을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 네오마이신과 동일한 아미노글리코사이드계열의 항생물질인 아미카신, 아르베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 또는 토브라마이신을 세프티오퍼와 혼합하는 것보다 네오마이신을 세프티오퍼와 혼합하는 것이 그 항균 효과가 월등하였음을 확인할 수 있었다.
이에 추가하여 덱사메타손을 추가하여 항균범위를 더욱 넓혔다.
본 발명의 복합 항생제 조성물은 1-5:1-5:0.01-0.05, 바람직하게는 1-3:1-3:0.01-0.03, 특히 1:1:0.01의 중량비로 혼합된 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 유효성분으로 포함하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 1 종 이상의 담체와 함께 첨가제, 산제, 동물용 주사제, 경구투여용 액제 및 연고제로 제형화될 수 있으며, 본 발명에서 바람직한 제형은 연고제이다.
한편, 본 발명의 복합 항생제를 포함하는 동물용 첨가제, 산제는 통상적으로 사용되는 비타민류, 글루코스, 락토스 등의 당류, 전분, 말분, 옥분, 맥아분, 탄산칼슘 또는 탄산수소나트륨 중에서 선택된 1종 이상의 부형제 또는 효소를 사용량 범위로 함유시켜 제조된다. 효소는 브로멜라인 또는 알란토인이다.
또한, 본 발명의 복합 항생제를 연고제로 제형화 할 때는 항산화제, 색소, 보습제, 용제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 항산화제로 비에이치티(BHT, 부틸하히드록시톨루엔), 비타민 A, C, E 또는 이의 유도체 중에서 선택된 1 종 이상, 상기 보습제로 알란토인, 글리세린, 바셀린, 또는 왁스 중에서 선택된 1 종 이상, 상기 용제로 알루미늄모노스테아레이트, 올리브유, 대두유, 또는 코코넛유 중에서 선택된 1 종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에서 제조된 복합 항생제의 투여는 첨가제는 사료에 혼합하여 투여되고, 산제, 동물용 주사제, 경구투여용 액제 및 연고제로 제형되어 투여된다.
본 발명에서 정하는 비율로 혼합된 복합 항생제로 첨가제의 경우 사료 톤당 200 g~10 kg(통상 500 g~2 kg)으로 투여되며, 특히 연고제로 투여할 경우 젖소 1 분방 당 0.5-2 개, 통상 1 개로 투여되는 것이 바람직하다. 연고제 1 개에는 대략 항생제가 총 200~1000 mg이 함유된다.
본 발명은 상기한 바와 같이 세프티오퍼, 네오마이신과 덱사메타손을 상기 비율로 혼합하여 제조함으로써, 항생제 저항균주의 출현을 억제할 수 있고, 광범위한 항균 범위를 가지며, 병용 투여 시 용량을 감소시킴으로써 단독 투여 시보다 독성을 감소시킬 수 있으며, 복합 감염 질병이 발생하였을 때 보다 효과적으로 작용함으로써 유방염의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 상기 비율로 혼합하여 제조함으로써 항생제 저항균주의 출현을 억제할 수 있고, 광범위한 항균 범위를 가지며, 병용 투여시 용량을 감소시킴으로써, 단독 투여시보다 독성을 감소시킬 수 있으며, 복합 감염 질병이 발생하였을 때 보다 효과적으로 작용함으로써 유방염의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1과 도 2는 비유기 유방염에 걸린 젖소에 본 발명 연고, 세프티오퍼 연고, 네오마이신 연고를 투여한 후 체세포수의 변화를 나타낸 도면이다.
도 3은 유두병변 및 원유침전물 지수 등 임상지수를 나타낸 도면이다.
도 4는 비유기 유방염에 걸린 젖소의 원유내 균수변화도이다.
본 발명에 따른 동물용 복합 항생제 조성물은 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 1-5:1-5:0.01-0.05의 중량비로 혼합되어 포함된 것을 특징으로 하는 가축동물의 유방염을 예방 또는 치료하는 동물용 복합항생제 조성물로서, 바람직하게는, 세프티오피, 네오마이신 및 덱사메타손을 1-3:1-3:0.01, 특히 1:1:0.01의 중량비로 혼합된 조성물이다.
상기 조성물제제는 산제, 수용제 또는 연고제로 제형화할 수 있으며, 특히 효능이나 제제의 안정성, 투여방법 등을 고려시 연고제가 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 복합항생제 조성물을 약효유효성분으로 포함하는 가축동물의 유방염의 예방 및 치료제를 제공한다.
본 발명의 약물 제제의 젖소 비유기 유방염에 대한 임상시험을 실시하였는바, 본 발명의 연고제는 각 성분의 단독 투여시보다 향균효과가 더 효과적으로 작용하여 체세포감소, 원유내 총세균수 감소율이 높아 비유기 젖소 유방염 치료에 유효한 제제로 확인되었다.
이하, 다음 실시 예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 균주별 항균 효과 비교 (충남 아산시 소재 ○○대학교 바이오의과학연구소)
1) MIC 측정
유방염 원인균인 E. coli, Staphylococcus spp (S. aureus, S. epidermidis), Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus 등 7 종 42 균주 (각 균별 표준균주 1 주, 야외균주 5 주)에 필드에서 채취한 유방염 원인균의 최소 발육억제농도(MIC)를 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손을 이용하여 측정하였다.
2) 재료 및 장치
① 항생제
세프티오퍼 염산염과 네오마이신 황산염을 각각 40 mg과 45 mg (네오마이신으로서 30 mg)으로 칭량하여 멸균증류수를 이용하여 유효성분의 농도가 1 mg/mL이 되도록 희석하여 사용하였다.
② MIC와 MBC 시험 : CLSI VET01-A4 (2013)와 CLSI M26-A(1999)에 준하여 실시.
③ 배지
각 공시 균주를 5 % sheep blood agar에 도말하여 37 ℃(S.uberis는 37 ℃, 5 % CO2)배양기에서 18~24 시간 배양한 후 4~6 개의 단일 콜로니를 취하여 액체배지에 접종한 후 37 ℃ 배양기에서 2~6 시간 배양. 배양된 세균의 탁도를 맥화랜드(MacFarland) No. 0.5에 맞추어 균수가 약 1.5Х108 CFU/mL이 되도록 조정한 후 희석액으로 100 배 희석하여 약 1.5Х106 CFU/mL의 접종 균액으로 사용
④ 실험균주 : 필드에서 채취한 7 종 42 균주(각 균별 표준균주 1 주, 야외균주 5 주)
대장균속(Escherichia coli)
스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylooccus epidermidis)
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)
스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)
슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)
클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella nuoniae)
엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)
Figure 112020032445925-pat00001
3) 균액 접종 및 배양
음성 대조균 well(12 번째 well)을 제외한 각 well에 1.5Х106 CFU/mL로 조정한 균액을 0.05 mL씩 분주하여 접종 한 후 37 ℃ 배양기에서 18~24 시간 배양하였다. 또한, 접종균액을 멸균생리식염수로 10-5 까지 10 배 계단 희석하여 각 희석배수당 10 μL씩을 3 회 반복하여 고체배지에 접종하여 초기 접종 균수를 측정하였다. MIC 시험에 사용 된 접종균액의 접종균수를 확인 한 결과 1.5~6.5105 CFU/mL이었다.
4) MIC 결정
18~24 시간 경과한 후 균의 상육 유무를 육안으로 관찰하여 균이 자라지 않는 농도를 MIC 농도로 결정하였다.
*5) MIC & FIC(FRACTORY INHIBITION CONCENTRATION) 결과
∑ FIC 0.5 : Synergism (상승)
0.5<∑ FIC=0.75 : Partial synersim (부분적 상승)
0.75< ∑ FIC 4: Indifference (상가)
∑ FIC > 4 : antagonism (길항)
Figure 112020032445925-pat00002
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 E.coli에 대한 FIC값이 1.008~1.500으로 상가작용 또는 상승작용이 관찰되었는바, 본 발명의 복합제제는 단독 투여군에 비하여 대장균에 대한 항균활성이 부분적인 상승 작용 또는 상가 작용이 확인되었다.
E.coli 야외분리균주 5 주와 표준균주 1 주에 대하여 세프티오퍼, 네오마신 및 본 발명의 복합제제의 항균 효과를 조사한 결과, 세프티오퍼의 MIC 범위는 0.122~0.244 μg/mL이었으며, MIC50과 MIC90 값은 0.244 μg/mL으로 소유방염의 원인균인 E.coli에 대한 세프티오퍼 MIC 감수성 기준인 2 μg/mL 보다 약 8 배 낮은 농도로 항균효과가 매우 탁월하였다. 네오마이신의 경우 MIC가 1.953~250 μg/mL이었고, MIC50과 MIC90 모두 250 μg/mL으로항균효과가 미미 하였다. 본 발명의 복합제제의 MIC는 모두 0.488 μg/mL이었으며, 이를 유효성분인 세프티오퍼와 네오마이신 양으로 환산하면 0.006 + 0.006 μg/mL으로 항균효과가 탁월하였다.
Figure 112020032445925-pat00003
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제의 농도에서 S.aureus에 대한 FIC 값이 각각 1.008~1.500으로 상가 작용이 관찰되었다.
Staphylococcus spp. 야외분리균주 6 주 (S. aureus 4 주, S. epidermidis 2 주)와 표준균주 1주에 대하여 세프티오퍼, 네오마신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 공시한 모든 항생제에서 뛰어난 항균효과가 나타났다. 야외분리 균주에 대한 세프티오퍼 MIC50 및 MIC90 값이 각각 0.244 μg/mL과 1.953 μg/mL이었으며, 이는 소 유방염 원인균인 S.aureus에 대한 세프티오퍼의 MIC 감수성 기준인 2 μg/mL 이하로 항균효과가 확인되었다.
네오마이신의 경우 MIC50 및 MIC90 값은 0.977μg/mL (세프티오퍼+ 네오마이신: 0.012 + 0.012 μg/mL)으로 항균효과가 현저하게 나타났다.
Staphylococcus spp에 대한 세프티오퍼, 네오마이신 및 본 발명의 복합제제의 최소살균농도(MBC
Figure 112020032445925-pat00004
)은 각각 3.906 μg/mL, 2.0 μg/mL, 1.953 μg/mL으로 MIC 농도보다 2 배 높은 농도에서 살균효과가 나타났다.
Figure 112020032445925-pat00005
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 S.uberis에 대한 FIC 값이 각각 1.008~1.500으로 부분적 상승 및 상가작용이 관찰되었다.
S.uberis 야외분리균주 5 주와 표준균주 1 주에 대하여 세프티오퍼, 네오마신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 공시한 모든 항생제에서 항균효과가 우수하였다. 즉, 야외분리 균주에 대한 세프티오퍼의 MIC50 및 MIC90 값이 각각 0.0024 μg/mL과 0.0049 μg/mL이었으며, 네오마이신은 0.488 μg/mL, 본 발명의 복합제제의 MIC50 및 MIC90 값은 0.004 μg/mL(세프티오퍼+네오마이신: 0.000048 + 0.000048 μg/mL)으로 항균효과가 우수하였다.
S. uberis 에 대한 세프티오퍼, 네오마이신 및 본 발명의 복합제제의 최소살균농도 (MBC90)는 각각 0.908 μg/mL, 1.953 μg/mL, 0.015 μg/mL (세프티오퍼+네오마이신: 0.0002 + 0.0002 μg/mL)으로 MIC 농도보다 2 배~4 배 높은 농도에서 살균효과가 나타났다.
Figure 112020032445925-pat00006
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 Pseudomonas aeruginosa에 대한 FIC 값이 각각 0.625~1.125으로 부분적 상승 및 상가작용이 관찰되었다.
Pseudomonas aeruginosa 야외분리균주 5 주와 표준균주 1 주에 대하여 세프티오퍼, 네오마신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 공시한 모든 항생제에서 항균효과가 인정되었다. 야외분리 균주에 대한 세프티오퍼의 MIC50 및 MIC90 값이 각각 15.625 μg/mL과 31.250 μg/mL이었으며, 네오마이신의 MIC50 및 MIC90 62.5 μg/mL과 125.0 μg/mL으로 항균효과가 미비하였다. 본 발명의 복합제제의 MIC50 및 MIC90 값은 모두 0.488 μg/mL으로 항균효과가 탁월하였다. 세프티오퍼와 본 발명의 복합제제의 MIC는 모두 15.625 μg/mL(세프티오퍼+네오마이신: 0.195 + 0.195 μg/mL)으로 항균효과가 확인되었다.
Pseudomonas aeruginosa에 대한 세프티오퍼, 네오마이신, 본 발명의 복합제제의 살균효과(MBC
Figure 112020032445925-pat00007
)는 각 공시 항생제의 MIC 농도와 같거나 2 배 높은 농도인 62.5 μg/mL, 125 μg/mL, 31.250 μg/mL (세프티오퍼+네오마이신: 0.391 + 0.391 μg/mL) 이었다.
Figure 112020032445925-pat00008
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 Klebsiella pneumoniae에 대한 FIC 값이 각각 1.008~1.500으로 상가작용이 관찰되었다.
Klebsiella pneumoniae 야외분리균주 5 주와 표준균주 1 주에 대하여 세프티오퍼, 네오마신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 세프티오퍼의 MIC50와 MIC90 모두 0.488 μg/mL으로 항균 효과가 탁월하였다. 세프티오퍼와 본 발명의 복합제제의 MIC는 모두 0.488 μg/mL(0.006 + 0.006 μg/mL) 으로 항균효과가 탁월하였다.
Klebsiella pneumoniae에 대한 세프티오퍼, 네오마이신과 본 발명의 복합제제의 최소살균농도 (MBC90)는 각각 0.907 μg/mL, 0.488 μg/mL, 0.488 μg/mL (세프티오퍼+네오마이신: 0.006 + 0.0069 μg/mL)이었다.
Figure 112020032445925-pat00009
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 Enterococcus faecalis에 대한 FIC 값이 각각 0.507~1.125으로 부분적 상승 및 상가작용이 관찰되었다.
Enterococcus faecalis 야외분리균주 5 주와 표준균주 1 주에 대하여 세프티오퍼, 네오마이신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 세프티오퍼의 MIC 범위는 0.244~125 μg/mL이었으며, MIC50 및 MIC90 값이 각각 1.953 μg/mL과 125 μg/mL이었다. 네오마이신의 MIC 범위는 0.015~250 μg/mL이었으며, MIC50 및 MIC90 값이 각각 1.953 μg/mL과 125 μg/mL이었다. 네오마이신의 MIC 범위는 0.015~250 μg/mL이었으며, MIC50 및 MIC90 값이 각각 31.250 μg/mL과 250 μg/mL이었다.
본 발명의 복합제제의 MIC50 및 MIC90 값은 7.813 μg/mL(세프티오퍼+네오마이신: 0.098+0.098 μg/mL)이었다.
Enterococcus faecalis에 대한 세프티오퍼, 네오마이신, 본 발명의 복합제제의 살균효과는 각 공시 항생제의 MIC 농도보다 1~4 배 높은 농도인 125 μg/mL, 500 μg/mL, 31.250 μg/mL (세프티오퍼+네오마이신: 0.391+0.391)이었다.
Figure 112020032445925-pat00010
세프티오퍼와 네오마이신의 각 항생제 농도에서 Bacillus cereus에 대한 FIC 값이 각각 1.008~1.500으로 상가작용이 관찰되었다.
Bacillus cereus 야외분리균주 5주와 표준균주 1주에 대하여 세프티오퍼, 네오마이신, 본 발명의 복합제제의 항균효과를 조사한 결과, 세프티오퍼의 MIC50 및 MIC90 값이 모두 7.813 μg/mL으로 항균효과가 미약한 반면, 네오마이신은 0.488 μg/mL이었으며, 본 발명의 복합제제의 MIC50 및 MIC90 값은 0.488 μg/mL (세프티오퍼+네오마이신: 0.006 + 0.006 μg/mL)으로 항균효과가 우수하였다.
Bacillus cereus에 대한 각 공시 항생제의 살균효과는 세프티오퍼, 네오마이신, 본 발명의 복합제제의 살균효과는 각 공시 항생제의 MIC 농도보다 1~2 배 높은 농도에서 나타났으며, 각 항생제의 최소살균농도(MIC90 )는 각각 15.625 μg/mL, 0.488 μg/mL, 0.977 μg/mL (세프티오퍼 + 네오마이신: 0.012 + 0.012 μg/mL)이었다.
[제제예]
제제예 1: 비유기 연고제의 제조
다음 표 9에 기재된 조성으로부터 연고를 제조하였다.
1. 보습제, 용제를 칭량한 후 160 ℃에서 1 시간 건열 멸균을 실시하고 혼합한 다음 조제탱크에 투입하여 50 ℃로 냉각시켰다.
2. 따로 비닐 용기에 세프티오퍼, 네오마이신, 덱사메타손, 색소를 넣어 충분하게 혼합하였다.
3. 멸균된 소량의 용제에 혼합된 원료 세프티오퍼, 네오마이신, 덱사메타손, 색소 및 항산화제를 투입하고 교반하여 균질하게 분산시켰다.
4. 상기 3의 용액을 상기 1의 용액에 투입하고 30 분 이상 혼합한 후 작업을 종료하였다.
5. 성상: 주입제, 회청색의 균일한 연고, 보관조건: 상온
6. 용법 및 용량: 유방 및 유두를 깨끗하게 소독한 후 1 일 1 분방에 1 시린지 (8 g)를 3~5 일간 주입한다.
Figure 112020032445925-pat00011
제제예 2: 비유기 연고제의 제조
다음 표 10에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00012
제제예 3: 비유기 연고제의 제조
다음 표 11에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00013
제제예 4: 비유기 연고제의 제조
다음 표 12에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00014
제제예 5: 비유기 연고제의 제조
다음 표 13에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00015
제제예 6: 비유기 연고제의 제조
다음 표 14에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00016
제제예 7: 비유기 연고제의 제조
다음 표 15에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00017
제제예 8: 비유기 연고제의 제조
다음 표 16에 기재된 조성으로 연고를 상기 제제예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
Figure 112020032445925-pat00018
제제예 9~13: 산제 및 첨가제의 제제 예
Figure 112020032445925-pat00019
제조방법: 상기 처방성분을 혼합하여 산제 제조방법에 따라 제조한다.
제제예 14~19: 수용제의 제제 예
Figure 112020032445925-pat00020
제조방법: 상기 유효성분을 용매에 용해 또는 현탁화시켜 제조한다.
비교 제제예 1:세프티오퍼 연고
조성 (본제 1 시린지, 8 g 중)
세프티오퍼 염산염 --------- 100 mg(역가)
부틸히드록시톨루엔 --------- 적당량
제형 및 성상: 분방 내 주입제
용법 및 용량: 유방 및 유두를 깨끗이 소독 한 후 1 일 1 분방에 1 시린지(8 g)을 3~5 일간 주입한다.
비교 제제예 2 : 네오마이신 연고
조성 (본제 1 시린지, 8 g 중)
네오마이신황산염 --------- 100 mg(역가)
덱사메타손 디나트륨인산염 ----------1.3 mg(덱사메타손으로서 1 mg)
부틸히드록시톨루엔 --------- 적당량
제형 및 성상: 분방 내 주입제
용법 및 용량: 유방 및 유두를 깨끗이 소독 한 후 1 일 1 분방에 1 시린지(8 g)을 3~5 일간 주입한다.
[임상실험예]
임상효능시험
비유기 유방염에 대한 본 발명의 제제예 1 연고와 비교제제예 1 및 2 연고의 치료효과를 확인하기 위하여 체세포수 2 Х 105 cell/mL 이상인 개체 및 분방을 선별하여 분방 내에 본 발명의 1 시린지를 주입한 후 14 일간 체세포수, 혈액학치, 원유내 균 수, 유두 및 우유 등의 변화를 확인하였다.
체세포수 변화
비유기 유방염에 걸린 젖소에 공시물질을 투여하기 전(Day 0) 본 발명 제제 연고(제제예 1), 세프티오퍼 연고(비교제제예 1), 네오마이신 연고(비교제제예 2) 투여군의 체세포수는 각각 1040.3 ± 557.6 Х 103 cell/mL, 1021.2 ± 246.0Х103 cell/mL, 1276.7 ± 692.8 Х 103 cell/mL 이었으며, 공시물질 투여개시 후 3 일째 체세포수는 676.3 ± 298.9Х103 cell/mL, 710.2 ± 250.1 Х 103 cell/mL, 851.5 ± 293.5 Х 103 cell/mL으로 감소하였다. 투여 개시 후 6 일째 각 투여군의 체세포수는 투여 전 대비 약 45~50 % 감소되어 각각 429.0 ± 223.2Х103 cell/mL, 507.2 ± 160.0 Х 103 cell/mL, 612.0 ± 172.5 Х 103 cell/mL이었다. 약물 투여 개시 후 10 일째의 체세포수는 투여 전 대비 70 % 감소되었으며, 투여 개시 후 14 일째의 각 군의 체세포수는 투여 전 대비 약 80 %~90 %가 감소하여 대부분의 개체에서 체세포수가 정상범위로 회복되는 것이 확인되었다. (표 19, 도 1 및 도 2 참조)
Figure 112020032445925-pat00021
3) 혈액학적 변화
비유기 유방염에 걸린 소에 본 발명 연고, 세프티오퍼 연고, 네오마이신 연고를 투여하고 투여 전후 혈액학적 검사에서 총 백혈구의 변화를 관찰하였다. 각 시험군에 본 발명 연고, 세프티오퍼 연고, 네오마이신 연고를 투여하기 전 총 백혈구수가 각각 21.9 ± 5.2
Figure 112020032445925-pat00022
109/L, 24.2 ± 4.4
Figure 112020032445925-pat00023
109/L, 22.6 ± 4.5
Figure 112020032445925-pat00024
109/L 이었으나, 각 공시물질 투여 개시 후 3일째의 총백혈구수가 각각 14.6 ± 2.7
Figure 112020032445925-pat00025
109/L, 17.1 ± 2.1
Figure 112020032445925-pat00026
109/L, 18.3 ± 4.0
Figure 112020032445925-pat00027
109/L으로 감소하였으며, 본발명 연고와 세프티오퍼 연고 투여군의 경우 총 백혈구수는 투여 전 보다 유의하게 감소하였다.
투여 개시 후 6 일째부터 투여 개시 후 14 일째까지 모든 시험군의 총 백혈구수는 투여 전 총 백혈구 수보다 유의하게 감소되었다. 또한, 투여개시 후 14 일째의 본 발명 연고 투여군의 총 백혈구수는 네오마이신 투여군 보다 유의하게 낮았다(표 20).
Figure 112020032445925-pat00028
4) 유두 병변 및 원유 침전물 지수
유방염 발현 소에 본 발명 연고, 세프티오퍼 연고, 네오마신 연고를 투여 한 후 실험 종료 시까지 유두 및 원유 상태를 확인하였다(도 3).
본 발명 연고 투여군의 유두 경결 또는 발적이 관찰 된 개체에서는 약물 투여 개시 후 4 일째부터 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았으며, 투여 개시 후 7 일째부터는 모든 개체에서 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았다. 본 발명 연고 투여군의 원유내 소량이 침전물 또는 작은 조각이 4 일째부터 관찰되지 않았으며, 7 일째부터는 모든 개체에서 관찰되지 않았다.
세프티오퍼 연고 투여군의 경우 약물 투여 개시 후 4 일째부터 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았으며, 투여 개시 후 9 일째부터는 모든 개체에서 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았다. 세프티오퍼 연고 투여군의 원유내 소량이 침전물 또는 작은 조각이 3~4 일째부터 관찰되지 않았으며, 9 일째부터는 모든 개체에서 관찰되지 않았다. 네오마이신 연고 투여군의 경우 약물 투여 개시 후 5 일째부터 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았으며, 투여 개시 후 9 일째부터는 모든 개체에서 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았다. 네오마이신 연고 투여군 일부 개체에서는 원유내 소량이 침전물 또는 작은 조각이 4 일째부터 관찰되지 않았으며, 10 일째부터는 모든 개체에서 관찰되지 않았다.
5) 원유내 균수 측정
비유기 유방염에 걸린 소 분방 내에 본 발명 연고, 세프티오퍼 연고, 네오마이신 연고 각 1 시린지를 5 일간 주입하였으며, 약물 투여 개시 후부터 14 일간 원유내 총 세균수를 조사하였다(표 21, 도 4).
본 발명 연고, 세프티오퍼, 네오마이신 연고를 유방내에 주입하기 전 원유 내 총 세균수가 각각 12.1 ± 14.3 Х 105 CFU/mL, 18.1 ± 14.3 Х 105 CFU/mL, 15.2 ± 19.0 Х 105 CFU/mL이었으나, 약물투여 개시 후 3 일째에 원유 내 총 세균수가 1.1 ± 1.1 Х 104 CFU/mL, 2.1 ± 2.3 Х 105 CFU/mL, 2.1 ± 2.7 Х 105 CFU/mL으로 본 발명 연고 투여군에서 총 세균수가 세프티오퍼와 네오마이신 투여군 보다 유의적으로 감소하였다.
본 발명 연고 투여군의 경우 약물 투여 개시 후 6 일째에 2 두에서 세균이 검출되지 않았으며, 투여 개시 후 10 일째에는 1 두에서 633 CFU/mL 총 세균수가 검출 된 것을 제외하고 다른 개체에서 균이 검출되지 않았으며, 약물 투여 개시 후 14 일째에는 모든 개체에서 균이 검출되지 않았다.
세프티오퍼 투여군에서는 약물 투여 개시 후 6 일째와 10 일째에 4 두에서 총 세균수가 각각 3.2 ± 5.2 Х 104 CFU/mL, 972 ± 1067 CFU/mL 검출되었으며, 투여 개시 후 14 일째에는 2 두에서 200 ± 298 CFU/mL의 총 세균수가 검출되었다.
네오마이신 투여군에서는 약물 투여 개시 후 6 일째에 5 두에서 7.7 ± 15.9 Х 104 CFU/mL의 총 세균수가 검출되었으며, 투여 개시 후 10 일째에는 4 두에서 총 세균수가 4.7 ± 7.9 Х 103 CFU/mL이었으며, 투여 개시 후 14 일째에는 3 두에서 356 ± 446 CFU/mL 검출되었다.
Figure 112020032445925-pat00029
6) 결 론
본 발명 연고의 비유기 유방염에 대한 효능을 확인하고자 체세포수가 2Х105 cell/mL 이상으로 확인 된 분방에 본 발명 연고 1 시린지를 5 일간 주입하여 체세포수, 혈액학 및 원유 내 균수 변화 등을 관찰하였다. 그 결과 비유기 유방염에 걸린 소에 본 발명 연고 투여개시 후 3 일째 체세포수가 투여전 보다 약 27 % 감소하였으며, 투여 개시 후 6 일째, 10 일째 및 14 일째의 체세포 수는 투여 전 보다 각각 53 %, 75 %, 87 % 감소하여, 투여 개시 후 14 일째에는 대부분의 개체에서 체세포수가 정상범위로 회복되는 것이 확인되었다. 또한, 투여 전 총 백혈구수가 21.9 ± 5.2 Х 109/L이었으나, 투여 개시 후 3 일째부터 총백혈구수가 14.6 ± 2.7 Х 109/L으로 감소하였고, 투여 개시 후 14 일째 총백혈구 수가 10.7 ± 1.8 Х 109/L로 감소하였으며, 네오마이신 투여군 보다 유의하게 낮았다. 본 발명 연고 투여 개시 후 4 일째부터 일부 동물에서 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았으며, 투여 개시 후 7 일째부터는 모든 개체에서 유두 경결 또는 발적이 관찰되지 않았고 원유내 소량이 침전물 또는 작은 조각도 7 일째부터는 모든 개체에서 관찰되지 않았다. 또한, 본 발명 연고 투여 전 원유 내 총 세균수가 각각 12.1 ± 14.3 Х 105 CFU/mL이었으나, 약물투여 개시 후 3 일째에 원유 내 총 세균수가 1.1 ± 1.1 Х 104 CFU/mL으로 세프티오퍼와 네오마이신 투여군 보다 유의적으로 감소하였다. 본 발명 연고 투여군의 경우 약물 투여 개시 후 6 일째에 2 두에서 세균이 검출되지 않았으며, 투여 개시 후 10 일째에는 1 두에서 633 CFU/mL 총 세균수가 검출 된 것을 제외하고 다른 개체에서 균이 검출되지 않았으며, 약물 투여 개시 후 14 일째에는 모든 개체에서 균이 검출되지 않았다.
결론적으로, 비유기 유방염에 대한 본 발명 연고는 세프티오퍼와 네오마이신 단독 투여 시 보다 항균효과가 더 효과적으로 작용하여 체세포 수 감소, 원유 내 총 세균 수 감소율이 높아 비유기 유방염 치료에 유효한 약물로 평가되었다.
[조성물의 안정성 평가]
제조된 조성물의 보관에 따른 안정성을 확인하기 위하여, 본 발명의 제제예 1, 제제예 2 및 제제예 6을 얻은 후, 제조된 주사용 조성물을 온도: 25 ± 2 ℃, 상대습도 60 ± 5 % 조건에서 24 개월간 보관하였으며, 시간에 따른 세프티오퍼, 네오마이신, 덱사메타손의 함량을 고성능액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통하여 측정하였다. 상기 HPLC는 YL9101 vaccum degasser, YL9110 Quaternary pump, YL9131 Column compartment, YL9120 uv/vis detecter, YL9150 Autosampler System(영린기기), 칼럼 : Cosmosil C18, 5 μm(Nacalai tesque 사), 이동상 : 세프티오퍼(용액A+MeOH+THF-1000:200:110, 용액 A - 50 mM Ammonium acetate+10 mM Tetrabutylammonium bromide → to D.W (distilled water) 1L), 네오마이신 0.1 % Trifloracetic acid solution + ACN(95:5), 덱사메타손(이동상 A: 물+메탄올+Buffer(3.5+3.5+3), 이동상 B-메탄올+Buffer(7:3), Buffer : 초산암모늄 7 g을 물로 녹여 1 L로 하고, 초산으로 pH 4.0으로 조정한다). 파장: 세프티오퍼(290 nm), 네오마이신(굴절율 검출기, ELSD), 덱사메타손(254 nm), 유속 : 세프티오퍼 1.2 ml/min, 네오마이신 및 덱사메타손 1.0 ml/min, 주입량 : 20 ㎕를 이용하여 각각 측정하였으며, 덱사메타손은 Gradient system으로 분석하며, 분석조건은 아래 조건과 같다(표 22). 시간에 따른 세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손의 함량변화를 표 23, 24 및 25에 나타내었다.
덱사메타손 Gradient system 조건
Figure 112020032445925-pat00030
[식 1] 함량유지율(%) = {(A1/A0)×100}
상기 식 1에서, A0는 동물용 복합 항생제 조성물 중 각 성분의 초기 함량 기준이고, A은 동물용 복합 항생제 조성물을 25 ± 2 ℃ 및 상대습도 60 ± 5 %의 조건에서 0, 3, 6, 9, 12, 18 및 24 개월간 방치한 후 측정한 각 성분의 함량이다.
Figure 112020032445925-pat00031
Figure 112020032445925-pat00032
Figure 112020032445925-pat00033
[독성시험]
하기 동물용 복합 항생제 조성물에 대한 경구 투여의 독성시험을 다음과 같이 실시하였다.
복합항생제 조성물 / 8 g 중
세프티오퍼 100 mg
네오마이신 100 mg
덱사메타손 1 mg
실험동물은 SD(Spraque Dawley)계 6-7 주령 랫트를 준비하여, 동물 수는 54 마리(암컷 27 마리, 수컷 27 마리)를 사용하여 5 일간 순화 및 검역을 시리 하였고, 투여 개시 시 7-8 주령 동물 수는 50 마리(암컷 25 마리, 수컷 25 마리), 순화 및 검역기간 중 케이지에서 사료와 식수를 자유 급여하고 일반상태를 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 제공하였다.
단회 경구 노출에 의한 독성양상 및 독성 강도의 시험결과, SD 랫드 암수에 250, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg bw 용량으로 단회 경구 투여 후 14 일간 사망동물과 임상증상, 체중 변화, 사료 섭취량 및 음수섭취량의 변화를 관찰하였고, 관찰기간 종료 후에 생존한 랫드에 대하여 육안적 병리검사를 실시한 결과, 이상 소견이 관찰되지 않았다.
결론적으로 단회 경구 투여 시 반수치사량(LD50)은 랫드에서 본 발명의 복합제제 급성경구 투여 시 반수치사량(LD50)은 2,000 mg/kg 이상이었으며, 그 결과 본 제품은 경구노출에 의한 독성이 없는 안전한 물질로 확인되었다.
본 발명에 따른 동물용 복합항생제 조성물은 동물의 유방염 치료 및 예방에 탁월한 효능을 가지며, 매우 안정된 제제이다.

Claims (8)

  1. 약효유효성분으로 세프티오퍼 또는 그의 염, 네오마이신 또는 그의 염, 및 덱사메타손 또는 그의 염이 1 : 1 : 0.01의 중량비로 혼합되어 포함된 것을 특징으로 하는,연고제형의 유방염의 예방 또는 치료용 동물용 복합항생제 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손이 100 mg : 100 mg : 1 mg 혼합되어 이루어진 것을 특징으로 하는, 복합항생제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    동물이 젖소인 복합항생제 조성물.
  5. 약효유효성분으로 세프티오퍼 또는 그의 염, 네오마이신 또는 그의 염, 및 덱사메타손 또는 그이 염을 1 : 1 : 0.01의 중량비로 혼합하고, 여기에 1 종이상의 부형제를 추가함을 특징으로 하는, 연고제형의 동물의 유방염 예방 또는 치료용 복합항생제 조성물의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    세프티오퍼, 네오마이신 및 덱사메타손이 100 mg : 100 mg : 1 mg이 혼합되어 포함된 것인, 복합항생제 조성물의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서,
    동물이 젖소인 복합항생제 조성물의 제조방법.
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