KR100756164B1 - 플로르페니콜 및 타이로신을 유효 성분으로 함유하는 복합 항생제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물의 세균성 설사 및 호흡기 질환의 치료에 사용하는 동물용 항생제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 동물용 항생제 조성물은 플로르페니콜과 타이로신을 1:4 내지 4:1의 중량비로 포함한다. 본 발명에 의하면 폴로르페니콜과 타이로신을 단독으로 사용하는 경우보다 상승 효과가 나타나서 소량의 투약으로 동물의 세균성 설사 및 호흡기 질환을 치료 및 예방할 수 있는 효과가 있다.

플로르페니콜, 타이로신, 덱사메타손, 동물

Description

플로르페니콜 및 타이로신을 유효 성분으로 함유하는 복합 항생제 조성물{Complex antimicrobial composition comprising florfenicol and tylosin}

도1은 FTD-주사제 무처치군에 대한 돼지 폐의 사진,

도2은 FTD-주사제 권장투여 용량군에 대한 돼지 폐의 사진,

도3은 FTD-주사제 고용량 투여군에 대한 돼지 폐의 사진,

도4는 각개 이동상에서 HLPC 분석을 실시한 플로르페니콜 최대 흡수 파장도를 보여주는 도표,

도5는 각개 이동상에서 HLPC 분석을 실시한 덱사메타손 최대 흡수 파장도를 보여주는 도표,

도6은 각개 이동상에서 HLPC 분석을 실시한 타이로신의 최대 흡수 파장도를보여주는 도표,

도7은 플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 덱사메타손 및 타이로신에 대한 눈금 곡선,

도8은 1㎖/10㎏/day로 3일 동안 투여한 후의 타이로신의 시간-농도 곡선,

도9는 1㎖/10㎏/day로 3일 동안 투여한 후의 플로르페니콜의 시간-농도 곡선,

도10은 돼지에 플로르페니콜을 4㎖/10㎏/일로 3일간 주사하였을 때의 근육 시료(주사부위) 중의 플로르페니콜 소실을 보여주는 도표,

도11은 돼지에 타이로신을 4㎖/10㎏/일로 3일간 주사하였을 때의 근육 시료(주사부위) 중의 플로르페니콜 소실을 보여주는 도표.

본 발명은 플로르페니콜(Florfenicol)과 타이로신(Tylosin)이 1:4∼4:1 중량비로 혼합된 조성물을 유효 성분으로 함유하는 동물용 복합 항생제 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게 설명하면 플로르페니콜, 타이로신 및 덱사메타손을 유효성분으로 함유하는 복합 항생제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 복합 항생제 조성물은 가축 및 어류의 세균성 질병 치료와 예방에 유용할 뿐만 아니라, 고가의 신규 항균 물질을 대체할 수 있어 궁극적으로는 축산 농가의 생산 원가를 절감시키고 약품의 축체내 잔류도 효율적으로 최소화시킬 수 있는 효과가 있는 것이다.

지금까지 동물용 복합 항생제에 대한 특허등록을 보면 다음과 같다.

즉 특허 제10-0295742, 2000. 11. 15에는 노르플록사신과 타이로신이 1:4∼4:1 중량비로 혼합된 동물용 복합 항생제 조성물이 공개되었으며, 특허 제10-0215738에는 항 병원성 세균 및 내독소 중화능을 갖는 새로운 동물용 복합 항생제 조성물이 공개되었으며, 특허 제10-0131515에는 옥시테트라사이클린과 티아물린이 6:1∼18:1의 중량비로 혼합된 동물, 특히 돼지의 세균성 설사 또는 기관지 폐렴의 치료와 예방에 유용한 동물용 약제 조성물이 공개되었다.

동물용 항생제들은 많이 개발되었으나 두 종류의 유효 성분을 배합하였을 때 상승 효과가 나타나는 복합 항생제의 개발은 많이 개발되지 않았다. 대부분의 복합 항생제 조성물은 단일 제제와는 달리 유효 성분의 배합에 따른 상승 효과를 시험하는데 장시간의 기일과 자금을 필요로 하므로 복합 항생제 조성물에 대한 연구는 많이 이루어지지 않은 것이 현실이다.

본 발명은 플로르페니콜과 타이로신을 동물, 특히 돼지의 대장균증, 기관지폐렴의 예방 및 치료에 사용하였을 때의 예방 및 치료 효과를 연구하는 과정에 이러한 유효 성분을 특정 비율로 배합하여 사용하면 특정한 종류의 병원균에 대하여 각개 유효 성분을 단독으로 사용하는 경우 보다 상승 효과가 나타남을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 특히 돼지에 사용하였을 경우 대장균증, 돈적리, 폐렴 등의 발생을 현저히 감소시켰다.

플로르페니콜은 미국, 쉐링-플로우사에서 1979년도에 합성에 성공한 치암페니콜 유도체이다. 이 항생제는 넓은 항균 범위를 가지고 있으며, 치암페니콜과 클로람페니콜에 대한 내성이 있는 균주에도 유용하게 사용되고 있으며, 경구투여 시 흡수가 뛰어나다는 등의 특성을 갖고 있다. 돼지의 폐렴 치료에는 페니실린계(PCG, ABPC등), 아미노배당체계(KM), 테트라싸이클린계(OTC, CTC), 치암페니콜(TP)등의 주사제가 주로 사용되고 있으나 원인균들의 내성으로 인해 이들 약제에 대하여 저 감수성화 되어 가고 있는 실정이다. 따라서 이러한 원인균에 대한 내성 및 저 감수성 균에 대해서도 뛰어난 항균 활성을 나타내는 약제가 임상수의로부터 요구되고 있는 실정이다. 또한 클로람페니콜은 사람에 대하여 재생 불량성 빈혈을 유발하는 독성 을 갖고 있는 반면에 플로르페니콜은 이러한 독성 작용이 없어 동물에서 많이 사용하고 있다. 특히 이 항균제는 파수퉤렐라 ( Pastuerella spp.,), 마이코플라즈마 (Mycoplasma spp.,) 살모넬라 ( Salmonella spp.,), 크렙시엘라 ( Klebsiella spp.) 등 병원성 균주에 효력이 있는 것으로 알려져 있다. 특히 플로르페니콜은 돼지에서 10mg/kg를 근육 내 투여하였을 때, 혈장중 플로르페니콜 농도는 투여후 1∼2시간에 피크치가 4.2㎍/㎖에 도달하고, 8시간 후에는 1.5㎍/㎖, 24시간 후에는 0.2㎍/㎖이하로 저하하였다. 소실반감기는 5.2시간으로 알려져 있다 (월간양돈진흥, “플로르콜100주사에 대하여” 참조).

타이로신은 마크로라이드(macrolide) 항균제로 오랫동안 가축에 사용하여 온 안전한 항균제로 호흡기 균주에 특히 그람양성균, 일부 그람음성균, 그외의 트레포네마(Treponema), 마이코플라즈마(Mycoplasma) 등에 대해서도 생물 활성을 나타내는 특징적인 물질이다. 현재 이 두 항생물질은 단일 제제로 어류를 포함한 가축에 사용을 하고 있다.

그러나 전술한 항생제들을 복합제제로 하여 동물용 항생제로 사용한 예는 나타나지 않고 있다.

새로운 신규 항균제를 개발하고 임상에 적용하는 데에는 많은 어려움이 있고 많은 시간과 연구비용을 지불하여야 한다. 이미 개발된 항생제에 있어서도 새로운 복합 처방으로 새로운 기능이 추가된 복합 항균제를 만들거나 새로운 복합 처방으로 상승 작용을 일으키는 복합 항생제의 개발은 매우 어려운 연구 중의 하나이다.

본 발명자들은 전술한 두 항생제를 여러 농도 범위에서 배합하여 항균 효력 을 검정하였으며, 항균력을 높이기 위하여 연구한 결과 플로르페니콜과 타이로신의 혼합 중량비를 4:1 내지 1:4로 조절함으로써 경제적이면서 가축의 병원성 미생물의 억제 효과가 우수함을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 플로르페니콜과 타이로신을 유효 성분으로서 특정 비율로 배합하여 특정 병원균에 대하여 우수한 상승 효과가 나타나는 동물용 복합 항생제 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 플로르페니콜과 타이로신을 유효 성분으로 하여 4:1 내지 1:4의 중량비로 배합하여서 된 본 발명의 동물용 복합 항생제 조성물에 의하여 달성된다.

본 발명은 플로르페니콜과 타이로신을 1:4 ∼ 4:1의 중량비로 배합하여서 된 혼합물을 유효 성분으로 포함하는 동물용 복합 항생제 조성물로 구성된다.

본 발명의 조성물은 동물, 특히 돼지의 세균성 설사 또는 기관지 폐렴의 치료와 예방에 유용한 탁월한 효과를 나타낸다.

본 발명에 사용하는 유효 성분인 플로르페니콜은 그람 양성 및 음성균 모두에 작용하는 광범위 항균제로 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 작용기작을 갖는 정균제이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 항생 물질인 플로르페니콜과 타이로신의 혼합 비율을 조정하여 경제적이면서도 병원성 균주에 대한 항균 활성이 우수한 새로운 조성의 동물 약제조성물에 관한 것으로서, 플로르페니콜과 타이로신 사이의 상호 작용을 규명하고 혼합 비율 간의 상관 관계를 알아보기 위해 항생제 다제 내성균주(multi-resistant microorganism), 즉 각종 세균성 질병에 이환된 닭, 돼지 및 소로부터 분리한 그람양성 및 음성 세균에 대한 플로르페니콜과 타이로신의 복합 제제의 항균 효과를 최소 발육저지 농도(Minimum Inhibition Concentration: MIC)로 시험하여 측정한 결과 플로르페니콜과 타이로신을 4:1 내지 1:4의 비율로 배합하였을때 우수한 항균 효과가 있음을 알게 되었다.

본 발명에서 플로르페니콜과 타이로신의 혼합비율이 중량비로 4:1 미만이면 타이로신에 대한 호흡기 병원성균에 대한 항균 효력이 저하되는 문제점이 나타나고 1:4을 초과하면 호흡기 병원성균에 대한 항균력은 증가하나 소화기 증상의 개선 효과는 기대하기가 어렵게 된다.

본 발명은 상기한 바와 같이 플로르페니콜과 타이로신을 상기 비율로 혼합하여 제조함으로써 소화기 및 호흡기 질환의 병원성 세균의 감염증 치료 및 예방을 할 수 있게 된다. 또한 병용 투여시 용량을 감소시킴으로써 단독 투여시보다 독성을 감소시킬 수 있으며 복합 감염 질병이 발생하였을때 보다 효과적으로 작용할 수 있을 뿐 아니라 두 항균제의 함량을 줄이면서도 병원균에 대한 항균 효력이 우수한 효과가 있어 해당 동물의 질병의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 복합 항생제 조성물은 경구 투여용으로 제제 할 수도 있고 주사제로 제제 할 수도 있다.

본 발명의 복합 항생제를 경구 투여용으로 사용하는 경우에는 본 발명의 조성물을 락토우스, 결정성 셀룰로우스, 마그네슘 스테아레이트와 같은 의약용으로 허용되는 첨가제와 함께 적당량의 보조 성분 및 부형제와 배합하여 사료와 함께 투여한다. 경구 투여용으로 사용하는 경우에는 사료 1톤당 혼합된 유효성분 500g 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 복합 항생제 조성물은 주사액으로 제제하여 사용할 수도 있는데, 주사약으로 사용하는 경우에는 복합 항생제를 덱사메타손과 함께 증류수에 용해시켜 주사액으로 만들 수 있다. 주사액으로 사용하는 경우에는 플로르페니콜과 타이로신을 2:1의 비율로 배합하고 배합된 복합 항생제 조성물 100 중량부에 덱사메타손 10 중량부 정도를 배합하고 증류수 100 내지 150 중량부에 용해시켜 주사액으로 사용한다. 주사제는 본 발명의 유효성분 함량을 기준으로 하여 동물 체중당 1ml/일 정도의 용량으로 사용하는 것이 바람직하다.

전술한 경구 투여용 또는 주사액을 제제 할 때 사용하는 부형제나 용해제들은 동물 의약품에 허용되는 다른 부형제나 용해제를 사용할 수도 있으며, 투여량은 예방용이냐 치료용이냐에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

2005년 10월부터 12월까지 호흡기 및 장염증세를 보인 돼지로부터 분리된 세균을 경상북도 가축위생시험소로부터 분양받아 시험에 사용하였다, 분리균주는 에 스케리치아 콜리 ( Escherichia coli ), 살모넬라 spp. ( Salmonella spp. : EC), 파스 퉤렐라 멀토시다 ( Pasteurella multocida : PM), 액티노바실러스 플루로프노이모니 아 ( Actinobacillus pleuropneumonia : AP), 헤모필러스 파라수이스 ( Haemophilus parasuis : HP), 스트렙트코커스 수이스 ( Streptococcus suis : SS)으로서 분리균의 항균 효과 시험을 위하여 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)의 방법에 따라 디스크확산법 (disc diffusion method) 및 최소발육억제농도 (minimal inhibitory concentration : MIC) 시험을 실시하였다.

디스크확산법은 분리된 세균의 전반적인 항생제감수성 양상을 파악하기 위하여 BBL사에서 판매하는 엔로프록사신(enrofloxacin: ENO), 노르푸록사신(norfloxacin; NOR), 스트렙토마이신 (SM), 콜리스틴(colistin; CL) 및 페니실린 (P) 디스크를 사용하였다.

시험방법은 맥파랜드(McFarland) 0.5 표준 탁도로 조절한 균액을 면봉으로 뮐러-힌톤(Mueller-Hinton) 고체배지 표면에 선획을 그으면서 접종한 후, 15분 이내에 항생제 디스크를 접종하였으며, 37℃에서 16∼18시간 배양하여 균 억제 대의 크기를 관찰하여 감수성 여부를 판정하였다. 최소발육억제농도 시험은 시그마 사에서 판매하는 엔로플록사신, 노르플록사신, 타이로신, 플로르페니콜과 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 페니실린 및 플로르페니콜과 타이로신으로 조성된 본 발명의 복합항생제를 사용하였다. 시험방법은 96 웰 라운드 보톰 플레이트(well round bottom plate)를 이용하여 항생제 최종농도가 0.06∼32㎍/㎖이 되게 2진 희석하여 50㎍씩 넘겼으며, 균액은 0.5 맥파랜드에 맞춘 후 100배 희석하여 웰 당 50㎕씩 분 주하여 최종 100㎕가 되게 하였다. 모든 플레이트에는 양성대조 웰과 음성대조 웰을 두었으며 37℃에서 18∼24시간 배양한 다음 육안으로 확인하였을 때 증식이 완전히 억제된 웰의 항균제 농도를 MIC로 판정하였다.

실험결과

[표 1] 디스크 확산법에 의한 분리 균주의 항생제 감수성

균주명	균주번호	항균제명*
		ENO (5㎍)	NOR (10㎍)	S (10㎍)	CL (10㎍)	P(10㎍)
에스코리치아 콜리	EC-1	R**	R	R	R	-
	EC-2	R	R	R	R	-
	EC-3	R	R	R	R	-
	EC-4	I	I	R	I	-
	EC-5	S	S	R	I
살모넬라 spp.	SA-1	R	R	R	I	-
	SA-2	I	I	R	I	-
	SA-3	S	S	R	I	-
파스퉤렐라 멀토시다	PM-1	S	S	R	I	-
	PM-2	S	S	R	I	-
	PM-3	S	S	R	I	-
	PM-4	S	S	R	I	-
	PM-5	S	S	R	R	-
악티노바실러스 플루로프노이모니아	AP-1	I	I	R	R	-
	AP-2	I	I	R	R	-
헤모필러스 파라수이스	HP-1	R	R	R	S	-
	HP-2	R	R	S	S	-
스트렙토고커스 수이스	SS-1	I	I	R	R	S
	SS-2	I	I	R	R	S
	SS-3	I	I	R	R	S
	SS-4	I	I	R	R	S

*ENO: 엔로플록사신, NOR: 노르플록사신, S: 스트렙토마이신, CL: 콜리스틴,

P: 페니실린

**R: 내성, I: 중간치, S: 감수성 있음.

디스크확산법에 의한 분리 균주의 항생제감수성 시험 결과, 에스코리치아 콜 리 1주, 살모넬라 1주 및 파스퉤렐라 멀토시다 5주는 ENO와 NOR에만 감수성을 나타 내었다. 헤모필러스 파라수이스 1주는 CL에만, 1주는 S 및 CL에만 감수성을 나타내었다. 스트렙토코커스 수이스 4주는 P에만 감수성을 나타내었으며, 기타 나머지 분리 균주는 시험약제 모두에 대하여 내성을 보였다.

[표 2] 최소발육억제농도 시험에 의한 분리 균주의 항균효과

균주명	균주번호	항균제 최소발육억제농도(㎍/㎖)*
		FT (2:1)	ENO	NOR	S	CL	P	TL	FL
에스페리치아 콜리	EC-1 EC-2 EC-3 EC-4 EC-5	16 16 8 8 8	>32 >32 >32 4 1	>32 >32 >32 16 2	>32 >32 >32 >32 >32	>32 >32 >32 8 4	- - - - -	>32 >32 >32 >32 32	16 16 32 8 8
살모넬라 spp.	SA-1 SA-2 SA-3	0.25 0.25 0.25	16 4 1	32 4 2	>32 >32 >32	2 2 4	- - -	16 32 >32	0.5 0.5 0.25
파스퉤렐라 멀토시다	PM-1 PM-2 PM-3 PM-4 PM-5	0.25 0.25 0.25 0.25 0.25	0.5 0.5 0.25 0.5 0.25	1 0.5 0.5 1 1	16 16 32 16 32	2 4 2 2 16	- - - - -	0.5 0.5 16 8 0.5	0.5 0.25 0.25 0.5 0.25
악티노바실러스 플르로프노이모니아	AP-1 AP-2	0.25 0.06	8 8	8 8	32 32	16 32	- -	4 8	1 0.12
헤모필러스 파라수이스	HP-1 HP-1	0.06 <0.06	8 4	16 8	16 1	0.5 0.5	- -	0.25 0.25	0.25 0.25
스트렙토코커스 수이스	SS-1 SS-2 SS-3 SS-4	0.12 0.12 0.25 0.12	4 4 4 4	8 8 8 4	>32 32 16 32	4 4 4 8	0.06 <0.06 0.06 <0.06	4 8 8 4	0.5 0.5 0.5 0.5

식 중, FT는 플로르페니콜과 타이로신의 복합제를 의미하며,

FL는 타이로신,

TL은 타이로신을 의미함.

[표 2]는 [표 1]과 유사한 결과를 보여주었다. MIC를 보면 TL은 에스페리치 아 콜리 및 살모넬라 spp.는 16~>32㎍/㎖, 기타 분리 균주는 0.25~16㎍/㎖의 MIC 범위를 나타내었다. 플로르페니콜은 에스페리치아 콜리에 대하여 8~32㎍/㎖, 나머 지 분리 균주는 0.25~1㎍/㎖의 MIC 범위를 나타내었다. FT 복합제는 에스페리치아 콜리에서 8~16㎍/㎖, 기타 균주에 대하여는 <0.06~0.25㎍/㎖의 MIC 범위를 나타내어 FL 및 TL 단일 약제보다 FL와 TL 복합제제인 FTD-주사제에서 분리 균주 모두 전반적으로 낮은 MIC를 나타내어 단일 투여보다 복합 항생제가 낮은 MIC와 넓은 항균 범위를 보여주어 FL과 TL을 혼합하였을 때 단일 성분을 사용하는 경우보다 상승 효과가 있음을 보여주었다.

[표 3] 플로르페니콜과 타이로신의 배합비율에 따른 MIC의 비교

균주명	균주번호	항균제 최소발육억제농도(F:T) (㎍/㎖)*
		1:1	1:2	1:3	1:4	2:1	3:1	4:1	3:2	2:3
에스페리치아 콜리	EC-1 EC-2 EC-3 EC-4 EC-5	16 16 8 8 8	16 16 16 4 1	16 >32 4 16 4	8 16 16 16 16	4 4 8 8 8	16 8 8 8 8	8 8 8 4 4	4 4 4 4 8	4 8 8 4 4
살모넬라 spp.	SA-1 SA-2 SA-3	2 2 2	16 4 1	4 4 2	8 4 4	0.25 0.25 0.25	0.12 0.06 0.12	0.25 0.12 0.12	0.12 0.5 0.12	0.5 0.12 0.5
파스퉤렐라 멀토시다	PM-1 PM-2 PM-3 PM-4 PM-5	0.5 0.5 1 2 1	1 2 2 1 0.5	1 0.5 0.5 1 1	0.5 0.25 0.5 0.5 32	0.25 0.25 0.25 0.25 0.25	0.25 0.25 2 1 1	2 1 1 2 0.5	0.5 0.25 0.25 0.5 0.25	2 0.25 0.25 0.25 0.5
악티노바실러스 플르로프노이모니아	AP-1 AP-2	0.5 2	8 8	8 8	4 2	0.25 0.06	0.25 0.25	2 1	1 0.12	0.5 0.5
헤모필러스 파라수이스	HP-1 HP-2	2 4	8 4	16 8	2 1	0.06 <0.06	0.25 0.25	0.5 0.25	1 2	0.5 1
스트렙토코커스 수이스	SS-1 SS-2 SS-3 SS-4	2 2 2 2	4 4 4 4	8 8 8 4	4 4 2 2	0.12 0.12 0.25 0.12	0.5 1 1 2	1 2 2 2	1 2 2 2	0.5 1 1 1

플로르페니콜과 타이로신 배합 비율에 따른 항균 효과를 비교하기 위하여 단독의 플로르페니콜과 단독의 타이로신을 사용한 경우([표 2]참조)두 물질을 1:4에서 4:1로 배합하여 MIC를 비교한 결과 복합 항생제로 처방된 경우 길항작용은 보이지 않았다. 특히 2:1 배합비, 3:1 배합비, 2:3 배합비, 3:2 배합비는 단일 제제와 비교시 낮은 MIC를 보여 상승 작용이 있음을 알 수 있었다. 이 중 플로르페니콜과 타이로신이 2:1의 배합비가 가장 탁월한 항균 효과를 보여주었다. 따라서 플로르페니콜과 타이로신의 적절한 배합비는 항균 작용을 증가시키는 새로운 사실을 알 수 있어 진보성과 신규성을 동시에 시켜주는 결과를 실시예 1의 실험 결과에서 알 수 있었으며, 이 배합비의 효능은 현장에서 확인되었다.

실시예 2

밀집 사육되고 있는 자돈에서는 소화기 및 호흡기 감염증의 발생은 한 농장에서 동시 다발적으로 발생하는 경향이 많아 동일 군에서 시험을 실시하는 것은 개체 치료 효과의 추적이 편리하다. 따라서 본 발명에서는 소화기 및 호흡기 감염증에 대한 동시 연구가 현실적으로 매우 유리함을 고려하여, 시험 약제인 플로르페니콜과 타이로신을 2:1의 중량비로 배합한 주사제 FTD(2:1)-주사제를 실제 투여 조건에 맞추어 소화기 및 호흡기 감염증에 대한 예방 및 치료 효과를 실시하였다. 1차(둥지농장) 시험은 2005년 11월 2일부터 2005년 12월 6일까지 5주간 실시를 하였다. 공시동물은 육성돈 후기에 해당되는 체중 35∼42㎏ (생후 13주령)으로 LYD (랜드레이스 암컷과 라지 화이트 수컷을 교배시켜 생산된 F1으로 모돈에 듀록 수컷의 정액을 사용하여 생산된 3원 교잡종) 3원 교잡 비육돈 42두였다. 둥지농장에서는 돼지 소화기 및 호흡기 감염증을 보이는 돼지를 3군으로 나누어 1번, 2번 그리고 3번 돈방에 각각 20두씩 배정하여 일주일간 돈방에 적응을 시킨 후 각 돈방에 14마리씩 배치를 하여 효능 및 효과를 구하였다. 시험구의 배치는 [표 4]에 나타내었 다. 즉 1번 돈방의 돼지는 평균체중이 47.86㎏으로 추천용량인 체중 10㎏당 1㎖로 3일간 연속주사를 하였다. 2번 돈방은 체중 10㎏당 4㎖을 1일 1회 3일 동안 근육 주사를 실시하였다. 3번 돈방은 평균체중 35.00㎏으로 생리적 식염수를 1일 1회 3일 동안 근육주사를 하였다.

[표 4] 시험구의 배치

구간	체중	두수	평체	주사량	주사량
1번방 (T1)	670	14	47.86	X1	5
2번방 (T2)	535	14	38.21	X4	16
3번방 (대조군)	490	14	35.00	X0	0

관찰 항목으로는 첫 번째 임상 증상을 보이는 돼지를 대상으로 실험전과 본 발명의 FTD-주사제를 복합 항생제 투여 3일 후에 미생물학적 검사를 실시하고 기침, 비루, 체온 등을 매일 관찰하였다. 체중의 측정은 투여전, 투여 후 1일, 7일, 14일, 23일에 측정을 하였다. 사료 섭취량, 증체량과 사료 요구율 측정은 7일 간격으로 실시를 하였다. 사료는 둥지농장 자체 주문배합사료인 젖 뗀 돼지 사료를 투여하고 물은 자유 섭취토록 하였으며, 매주 수요일 오후 체중 측정과 동시에 사료 섭취량을 조사하였다. 시험개시부터 종료시까지 일반증상, 호흡기, 소화기 증상을 파악하여 기록한 후 시험 종료 후 분석하였다.

시험결과

본 발명의 조성물을 주사한 권장 투여 용량과 4배의 고용량을 투여한 처리군과 약물을 투여하지 않은 대조군을 비교하여 활동성을 관찰하였으며, 그 결과 일주 일 안에 약물 투여받은 돼지는 활기를 되찾으며 건강한 상태를 유지하였다. 그러나 항생제를 투여받지 못한 돼지는 활동성이 호전되지 않고 모든 돼지가 침울한 상태를 유지하였다. 기침과 호흡 곤란 등의 만성호흡기 질환으로 이전이 되는 것으로 나타났다. 대조군, 권장 투여 용량군과 4배의 고 용량군 모두에서 설사에 대한 증상의 호전은 관찰되지는 않았다. 이러한 결과는 FTD-주사제의 유효성분이 플로르페니콜과 타이로신임을 감안할 경우 이들 항균제는 호흡기 질환에 효과가 있으며, 위장관 질환인 설사를 기준으로 할 경우 대조군에 비하여 상당한 효과가 있는 것으로 나타났다. 기침 등 호흡기 증상을 검토한 결과로 대조군, 권장 투여 용량군, 4배의 고 용량군에서 돼지들의 기침 증상에 대하여 조사하였다. 그 결과 FTD-주사제를 투여 전에 모든 군의 돼지에서 기침 등의 호흡기 증상을 보여주었다. FTD-주사제를 투여 후 대조군과 비교시 권장 투여 용량군과 4배의 고 용량 투여군 모두 현저한 호흡기 개선 효과를 보여주었다.

FTD-주사제는 플로르페니콜과 타이로신 및 덱사메타손으로 조성된 본 발명의 주사액을 의미함.

[표5] 사료효율 및 체중변화 Unit:Kg

주		미처리(C), n=14	권장투여용량(T1), n=14	고용량(T2), n=14
0 ~ 1W	개시체중 (kg)	490	670	535
	종료시체중 (kg)	532	728	600
	증체량 (kg)	42	58	65
	사료섭취량 (kg)	115	150	150
	사료요구율(kg)	2.74	2.59	2.31*
1 ~ 2W	개시체중 (kg)	531	728	600
	종료시체중 (kg)	592	806	672
	증체량 (kg)	57	78.4	71.5
	사료섭취량 (kg)	168	195	175
	사료요구율(kg)	2.80	2.49*	2.45*

주: C 미처리 대조군을 나타냄.

사료요구율: 사료섭취량(kg)/증체량(kg), 사료섭취량(kg): 14마리 돼지가 7일 동안 사료섭취량(kg).

항생제의 효과를 직접적으로 보여주는 복합 항생제 투여 후 정확한 사양실험결과는 [표 5]에 나타나 있다. FTD-주사제를 투여 후 사료요구율을 비교하면 FTD-주사제를 투여하지 않은 대조군의 경우 시험 1주에는 2.74 그리고 2주는 2.80으로 시간이 지날수록 더 좋지 않은 결과를 보였으나 FTD-주사제를 투여한 그룹인 T1과 T2에서는 FTD-주사제를 투여 후 처음 7일간은 2.59와 2.31의 결과를 보여주었으며 이러한 결과는 2주째에도 지속되어 FTD-주사제를 투여하지 않은 군과 투여한 군을 비교시 투여한 군에서 증체량 및 사료 요구량이 현저히 개선되는 결과를 보여주었다.

14일째 각각의 시험군에서 5 마리의 돼지를 무작위로 착출하여 폐의 병변을 육안적으로 관찰하고 비강을 포함한 기관지와 폐에서 균 분리를 시도하였다. FTD-주사제를 투여한 대조군에서는 호흡기질환이 급성형으로 나타나고 사료섭취가 현저하게 줄어든 것을 볼 수 있었다. 부검 결과 폐의 병변이 출혈를 동반한 경결병소를 보이고 있으며, 섬유소성, 괴사성의 흉막폐렴, 폐흉막은 황갈색, 늑흉막이나 심낭과 유착, 전신 패혈증. 세균을 진단한 결과도 복합감염으로 나타났다([도 1]참조). 그러나 FTD-주사제를 권장투여용량과 고용량으로 투여한 돼지에서는 임상적으로 치료효과를 확인할 수 있었으며 호흡기증상의 뚜렷한 개선효과를 보여주었다.

무처리 대조군과 권장용량 투여군 및 고용량 투여군에 대한 폐의 사진을 도 1, 2 및 3에서 보여준다.

실시예 3

랫드에서 “ FTD -주사제”의 급성경구 및 근육주사 후 독성시험

“FTD-주사제”의 급성경구독성을 조사하기 위하여, SD계통의 랫드에 본 발명의 주사제 조성물인 FTD-주사제를 0, 20, 40, 80㎖/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하여 2주간 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰한 결과는 다음과 같다.

1) 사망 동물은 각 용량별로 수컷은 0, 0, 0 및 0례가, 암컷은 0, 0, 0 및 0례가 관찰되었다.

2) 일반증상 및 제반 소견은 고용량의 투여에 의해서도 이상소견이 거의 인정되지 않았다.

3) 고용량에서 초기 1∼3일간 경미한 설사 증세를 일부 동물에서 나타내었으나 4일 후 정상으로 회복되었고 다른 이상 현상은 인정되지 않았다.

4) 부검 소견으로는 간장, 신장, 비장, 폐장 등 실질장기와 일부 다른 장기에서 특이한 병변이 관찰되지 않았다.

이상의 결과 본 시험에서 독성의 표적 장기는 특이적으로 관찰할 수 없었으며 LD50값은 웅성과 자성 모두에서 사망한 예가 없어서 산출할 수 없었으며 최소한 경구 투여하였을 때의 치사량은 80㎖/㎏이상으로 판단되었다.

“FTD-주사제”의 급성 독성을 조사하기 위하여, SD계통의 랫드에 본 시험물 질인 FTD-주사제를 0, 0.1, 1.0, 10.0㎖/㎏의 용량으로 1회 근육 내 투여하여 2주간 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰한 결과는 다음과 같다.

1) 사망동물은 각 용량별로 수컷은 0, 0, 0 및 0례가, 암컷은 0, 0, 0 및 0례가 관찰되었다.

2) 일반증상 및 제반 소견은 고용량의 투여에 의해서도 이상소견이 거의 인정되지 않았다.

3) 저용량과 고용량에서 모두 이상증상은 인정되지 않았다.

4) 부검소견으로는 간장, 신장, 비장, 폐장 등 실질장기와 일부 다른 장기에서 특이한 병변이 관찰되지 않았다.

이상의 결과 본 시험에서 독성의 표적 장기는 특이적으로 관찰할 수 없었으며 LD50값은 웅성과 자성 모두에서 사망한 예가 없어서 산출할 수 없었으며 최소한 근육내 투여시 치사량은 10㎖/㎏이상으로 판단되었다.

실시예 4

돼지에서 안전성 시험

“FTD-주사제”의 급성 독성을 조사하기 위하여, 육성돈에 본 시험물질인 FTD-주사제를 0, 1 및 4 ㎖/10㎏의 용량으로 1회 근육투여 하여 2주간 사망률, 소화기증상, 호흡기증상 및 체중 변화를 관찰한 결과는 다음과 같다.

1) 사망동물은 시험한 수컷 및 암컷 전군에서 관찰되지 않았다.

2) 일반증상으로는 시험한 수컷 및 암컷 전군에서 관찰되지 않았다.

3) 호흡기증상은 시험한 수컷의 전군에서 1마리씩 관찰되었으나 FTD-주사제 를 투약 후 증상이 소멸되었다.

수컷 투약대조군에서는 기침의 증상이 14일까지 지속되었으나, 암컷의 경우는 투약대조군에서 1마리 관찰되었으나 시험 3일 후에 자연 회복되었다.

이상의 결과 본 시험에서 FTD-주사제를 투여한 후 돼지에서 권장 투여 경로인 근육으로 고용량인 4배를 투여하여도 치사한 동물은 한 마리도 관찰할 수 없었으며 투여 후 14일에 혈액 및 혈청분석결과도 모두 정상범위를 보여주었다.

실시예 5

돼지에서의 잔류성 시험

FTD-주사제의 2:1의 비율로 구성된 조성물을 권장 용법 용량으로 투여하였을 때 구성 약물이 돼지의 각종 조직에 잔류하는 정도를 알아보았다. 본 발명의 주사제인 “FTD-주사제”는 미황갈색의 투명한 액체로 주사액 1㎖에는 플로르페니콜 50㎎, 타이로신 25㎎, 덱사메타손 디소듐포스페이트 0.33㎎이 포함되었다.

1) 시험농장 및 시험동물

시험은 2005년 12월 01일부터 2005년 12월 30일까지 실시를 하였다. 공시동물은 육성돈 후기에 해당되는 체중 35∼42㎏ (생후 13주령)으로 LYD 3원 교잡 비육돈 42두였다. 시험농장은 전진농장으로 3군으로 나누어 1번, 2번 그리고 3번 돈방에 각각 10두씩 배정하여 일주일간 돈방에 적응을 시켰다.

2) 잔류성 시험

FTD-주사제의 잔류성 분석을 실시하기 위하여 분석법을 설정하였다. 분석법은 재현성, 정확성, 민감성을 혈액과 근육에서 먼저 설정을 하였다.

(2-1) 잔류성 시험: 잔류성 시험은 대조구, 임상 사용용량(x1), 그리고 고용량(x4)으로 근육 주사에 의하여 1일 1회, 3일간 투여한 후 28일간 관찰하였다. 돼지는 대구 인근의 양돈장에서 항균물질이 함유되지 않은 사료로 사육되고 있는 30㎏의 돼지를 이용하여 매 도축 시기별로 4마리를 사용하였으며, 특정 시기에 시험약물이 검출되지 않을 경우 그 이후 도축 예정 동물에서의 시험은 생략하였다.

[표 6] 잔류성 시험결과

일수(days)	대조용	치료 권장용량(×1)	고용량(×4)
0	4	4	4
1		4	4
7		4	4
21		4	4
28		4	4

(2-2) 시료의 채취

시료의 채취는 도축 시기별로 각 시험 군당 4마리의 돼지를 무작위로 살처분하여, 혈액 및 가식 부위 (근육, 간장, 신장, 소장, 피부+지방)를 채취하였다. 대조군의 경우 시험시작시 도살하여 위의 시료를 채취하였으며, 채취한 모든 시료는 냉동(-20℃) 보관한 후 신속하게 분석하였다.

(2-3) 혈청 및 조직에서 항생물질의 분석

분석 성분은 크게 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 타이로신 및 덱사메타손으로 이것을 동시에 분석하는 것은 매우 어렵다. 그 이유는 흡수단 및 이동상의 차이에서 기인한다. 따라서 분석 시료를 3개 부분으로 나누어서 분석하였다. 이들 물질에 대한 최대 흡수율을 먼저 이동상을 배경으로 최고 UV 흡수를 측정하였다. 플로르페니콜과 그 대사산물인 플로르페니콜 아민은 224nm에서 HP1100 시리즈인 HPLC로 분석하였다. 시료의 분리를 위해서 컬럼은 와처스ⓡ 120-ODS-BP (5㎛, 4.6mm x 150mm, 와처스는 일본국, 다시오의 등록상표임) C18 역상컴럼을 이용하였으며, 이동상은 10mM 암모늄아세테이트(A용액)와 아세토니트릴(B용액)을 이용하여, 55:45 (A:B, v/v) 비율로 1㎖/min의 유속으로 흘려주었다. 타이로신은 280nm에서 같은 컬럼을 이용하였다.

그러나 타이로신의 감도는 떨어지기 때문에 이동상은 경사 흐름을 이용하여 처음부터 2분까지는 10mM 암모늄아세테이트(A용액)와 아세토니트릴(B용액)을 이용하여, 70:30 (A:B, v/v)으로 하고 그 이후 10분까지 B의 비율을 점차 증가시켜 B를 100으로 하여 2분간 지속시켰으며 10분 동안의 역의 상태로 이동상의 유속을 1㎖/min로 하였다. 질량 분석을 위하여 질량 분석기는 양이온 모드에서 타이로신을 M+H로 하여 선택성 이온 모니터링 모드(SIM mode)를 분석하였다. 이와 더불어 잔류문제에 매우 민감한 수용체를 이용한 고감도의 챰 II(Charm II) 방법으로 정성분석도 동시에 실시를 하였다.

(2-4) 혈청 및 조직에서 항생물질의 분석

각각의 표준물질 항균제 10㎎을 취하여 100㎖ 갈색플라스크에 넣고 아세토니트릴을 가하여 완전히 녹인 다음 1,000㎍/㎖ 농도로 만들어 표준원액으로 하였다. 또 표준원액을 증류수로 희석하여 10㎍/㎖로 만들어 표준용액으로 사용하였다. 분석법의 정확도와 정밀도를 확인하기 위한 첨가시료 (spiked sample)는 각 조직을 1 g을 취하여 각각의 표준 항균제를 0.2 (200ng), 0.1 (100ng) 및 0.05㎖ (50ng) 씩을 첨가하여 200, 100 및 50ng/g으로 조제하였다.

(2-5) 혈청 및 조직에서 항생물질의 HLPC 분석

3종의 표준용액 (10㎍/㎖)을 100㎖ 용량 플라스크에 10, 5, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.63, 0.31㎖씩 취하고 이동상으로 표시선까지 채워 1,000, 500, 100, 50, 12.5, 6.3, 3.1ng/㎖로 희석하였다. 희석된 표준용액을 50ul씩 3회 반복 주입하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 항균물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X축을 농도,Y축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성하였다.

각개 이동상에서 HLPC 분석을 실시한 플로르페니콜, 덱사메타손 및 타이로신에 대한 최대 흡수파 파장 시헌결과는 도 4, 5 및 6에 나타내었다.

3) 조직에서 항생물질의 분석

HPLC 분석에서 조직으로부터 각각의 항균물질을 회수 및 농축과정에서 일어날 수 있는 실수를 보정하기 위하여 정성분석의 하나인 고감도 분석으로 식육 중 항균 물질 검사를 위한 챰 II 시험방법을 이용하였다. 이 분석법은 베타-락탐, 마크로리드, 설파 드럭스, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜의 항균물질을 계열별로 분리 분석할 수 있다. 챰 시험의 원리는 미생물 수용체를 이용한 분석 방법으로 항생물질의 잔류검사를 실행하기 위해서는 2개의 정제시약이 필요하다. 즉, [14C] 또는 [3H]로 표식된 항균물질(Tracer), 그리고 수용체 (항균물질에 대한 수용력이 있는 미생물 세포) 또는 특이항체(미생물 세포에 결합할 수 있다) 시약(Receptor)이 필요하다. 보로실리케이트로로 코팅된 시험관에 수용체 시약을 넣고 검사 시료를 넣은 다음 트레이서 시약을 넣고 각 계열별로 적정온도에서 배양한다. 이때 수용체에 검사시료와 트레이서 시약이 경쟁적 또는 순차적으로 결합하게 된다. [14C] 또는 [3H]이 결합 된 수치는 챰 II 분석장치에 의해 측정하였다. 타이로신은 10ppb, 그리고 플로르페니콜은 100ppb 이상에서 검출된다.

(3-1) 시료의 전 처리

각 돼지의 각 장기 2g을 칭량하여 50㎖ 원심튜브에 넣고 20% 초산이 포함된 아세토니트릴 10㎖을 넣고 혼합기(IkA)에서 완전하게 균질액을 만들었다. 이 균질액은 10분 동안 초음파로 처리하고 소듐설페이트 2g을 첨가한 후 다시 10분간 진탕시켰다. 이 혼합물에 8㎖의 아세토니트릴을 첨가하여 10분간 혼합하고, 5,000rpm에서 20분간 원심분리 한 후 상층액만 10㎖ 취한 후 남은 잔류물에 아세토니트릴 10㎖을 더하여 10분간 진탕시킨 후 5,000rpm에서 원심 한 후에 상층액만을 분리하여 이전에 분리한 상층액과 합쳤다. 합해진 상층액 20㎖중 5㎖을 C-18 세팍 칼럼(Sepak column)을 이용하여 전처리하고, 50℃에서 질소로 농축을 실시하였다. 농축된 시료는 0.5㎖의 이동상에 녹인 후 0.22um 필터로 여과한 후에 각각의 분석조건에서 분석을 실시하였다. 플로르페니콜과 플로르페니콜 아민은 HPLC로 분석하고 타이로신은 LC/Mass로 분석을 실시하였다.

(3-2) 안전 휴약기간의 설정

LOQ, 잔류성적 및 여러 독성학적 지표를 이용하여 안전휴약기간을 설정하였다. 플로르페니콜에 대한 국내 휴약기간 및 최대잔류허용농도에 대한 설정이 없어, 유럽연합에서 제시한 플로르페니콜에 대한 잔류허용농도(CVMP No 2377/90)를 기준으로 휴약기간을 설정하였다([표7]). 휴약기간의 설정은 통계학적 방법을 통해서 실시하였으며, 대수변환시킨 조직농도의 선형회귀분석에 의해 조직의 잔류농도가 95% 신뢰범위구간의 상위 허용 한계 내의 잔류허용치 미만의 농도로 떨어진 시점을 휴약기간으로 설정하였다. 개체간의 잔류농도에 차이에 따른 휴약기간의 설정의 오류를 최소화하고 신뢰성을 확보하기 위해, 개체 간 잔류농도의 정규분포를 초크란 시험(Chochran test), 바틀렛 시험(Battlet test) 및 샤피로/윌크 시험(Shapiro/Wilk test)을 이용하여 통계학적 분석 실시하여 유의성을 검증하였다.

[표 7] 동물 조직내의 플로르페니콜과 타이로신의 최대 잔류 한계치(MRLs)

화합물	표식 잔류	동물종류	MRLs(㎍/㎏)	표적 조직
플로르페니콜	플로르페니콜과 플로르페니콜 아민의 합계량	돼지	500 1,000 3,000 1,000	근육 피부+지방 간장 신장
타이로신	타이로신 A, B 및 C의 합계	돼지	100 100 100 100	근육 피부+지방 간장 신장
덱사메타손		소	300 200 3,000 500	근육 피부+지방 간장 신장

4) 시험결과

(4-1) 표준 검량 곡선의 직선성

플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 덱사메타손 및 타이로신을 3.1 ng/㎖에서 1,000ng/㎖의 농도범위로 HPLC에 주입하여 HPLC 검출기로 검출하였다. 그 결과 플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 덱사메타손 및 타이로신에 대한 r2=0.99 이상의 매우 양호한 직선성을 나타내었다.

플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 덱사메타손 및 타이로신에 대한 눈금 곡선에 대한 HPLC 시험결과는 도7에 표시하였다.

(4-2) HPLC 크로마토그램 분석조건

(4-2-1) 혈청 중 플로르페니콜의 분석

드럭 칼럼: HP ODS 하이퍼실 5㎛, 200×4.6㎜

이동상:

A: 아세토니트릴-----------------------------------22%

B: 10mM 인산암모늄--------------------78%

유속: 1㎖/min

칼럼 온도: 25℃

주사 용량: 20㎕

UV: 224nm

(4-2-2) 조직 중의 플로르페니콜 및 플로르페니콜 아민의 분석

칼럼: HP ODS 하이퍼실 5㎛, 200×4.6㎜

이동상:

A: 아세토니트릴----------------------------------22%

B: 10mM 초산암모늄(?5.0) ----------------78%

유속: 1㎖/min

칼럼 온도: 30℃

주사 용량: 20㎕

UV: 224nm

(4-2-3) 타이로신의 분석

칼럼: HP ODS 하이퍼실 5㎛, 200×4.6㎜

이동상:

A: 아세토니트릴 B: 10mM 초산암모늄 (?7.9)

유속: 1㎖/min

칼럼 온도: 30℃

주사용량: 20㎕

UV: 280nm

[표 8] 타이로신에 대한 경사 프로그램

시 간	A:아세토니트릴	B:초산암모늄	유속(㎖/min)
0	30%	70%	1
2	30%	70%	1
8	70%	30%	1
12	70%	30%	1
16	30%	70%	1
20	30%	70%	1

(4-2-4) 덱사메타손의 분석

칼럼: HP ODS Hypersil 5㎛, 200×4.6㎜

이동상:

A: 아세토니트릴 B: 증류수

유속: 1mL/min

칼럼 온도: 30℃

주사용량: 20㎕

UV: 242nm

[표 9] 덱사메타손에 대한 경사 프로그램

시간	A:아세토니트릴	B:증류수	유속(mL/min)
0	10%	90%	1
6	35%	65%	1
18	35%	65%	1
19	10%	90%	1
25	10%	90%	1

(4-3) 정확도 및 정밀도

플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 덱사메타손 및 타이로신에 대한 정확도 및 정밀도를 근육시료를 이용하여 측정하였다. 돼지 근육의 음성시료에 2.5, 50, 100ng/g 농도로 첨가한 후 정확도 및 정밀도를 측정하였다. 항균물질의 회수율은 플로르페니콜은 89.3에서 91%, 플로르페니콜 아민은 88.2에서 89.3%, 타이로신은 84.3에서 87.4%, 그리고 덱사메타손은 83.4에서 88.3% 범위였다. 실험실내 평균변이계수 (CV)는 0.9에서 8.5로 이때의 C.V.는 잔류성 시험지침의 허용범위인 20% 이 내로 만족스러운 재현성을 나타내었다.

돈육 조직 내의 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민 및 덱사메타손의 정확도와 반복성에 대한 시험결과는 [표 10]에 표시한다.

[표 10] 스파이크드 돈육 조직내의 플로르페니콜, 플로로페니콜 아민, 타이로신 및 덱사메타손의 정확도와 반복성

화 합 물	회복율(%, n=3)			평균	편차계수(%, n=3)
	2.5 ng/g	50 ng/g	100 ng/g		2.5 ng/g	50 ng/g	100 ng/g
플로르페니콜	90.6	91.0	9.3	90.3	2.7	2.6	1.9
플로르페니콜 아민	89.3	88.2	88.5	88.7	0.9	2.2	1.1
타이로신	84.3	87.4	84.7	85.5	6.1	8.5	5.4
덱사메타손	88.3	84.7	83.4	85.5	1.1	6.6	5.4

(4-4) 검출한계 및 정량한계

돼지 근육에서 플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 타이로신 및 덱사메타손에 대한 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 플로르페니콜이 2.5 및 6.9ppb, 플로르페니콜 아민은 2.5 및 7.4, 타이로신이이 4.3에서 8.3ppb, 덱사메타손이 2.5ppb 및 5.4ppb로 나타났다. 타이로신의 경우는 LC/Mass로 측정한 결과 낮은 LOD와 LOQ를 구할 수 있었다.

돼지 근육 조직 내의 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 타이로신 및 덱사메타 손의 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)에 대한 시험결과를 [표 11]에 표시한다.

[표 11] 스파이크드 돈육 조직 내의 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 타이로신 및 덱사메타손의 검출한계(LOD)

화합물	LOD(ppb)	LOQ(ppb)
플로르페니콜	2.5	6.9
플로르페니콜 아민	2.5	7.4
타이로신	4.3	8.3
덱사메타손	2.5	5.4

LOD, S/N=3; LOQ, S/N=10

(4-5) 경시별 혈청 및 조직에서의 잔류 농도 변화

수의과학검역원의 동물 약품 등의 잔류성 시험지침(수의과학검역원 예규 7호 1996.5.6.)의 기준에 따라 시험하였다. 대조군으로 사용한 돼지의 모든 시료 (혈액, 간장, 신장, 근육, 피부+지방, 소장)에서 플로르페니콜 아민, 플로르페니콜, 타이로신 및 덱사메타손은 검출되지 않았으며, 권장 용량군의 경우 조직내 플로르페니콜 아민 및 플로르페니콜의 잔류농도는 권장 용량군의 4배 용량으로 투여한 고용량군의 잔류농도보다 모든 장기에서 낮게 나타났다. 이는 타이로신도 같은 경향을 보여주었다. 따라서 투여용량과 돼지 조직 잔류 농도는 밀접한 상호관련성이 있음이 확인되었다. 플로르페니콜의 경우 권장 용량군에서는 3일간 연속투여 후에 1일째에 간장에서의 농도는 3.40±0.92㎍/g으로 신장의 2.02±0.45㎍/g보다 높게 나 타났다. 근육 주사를 실시하였음에도 소장에서 2.11±0.34㎍/g로 분석되는 것으로 보아 플로르페니콜은 넓은분포용적과 대변으로 배설되는 특성을 지닌 항균제로 추정이 되며 소화기 감염증에도 효과가 있는 증거가 된다. 타이로신은 권장투여 용량군에서 주사부위인 근육에서는 8.17±5.27㎍/g으로 투여 후 일정기간은 주사액이 머무는 형태를 보여주었다. 피부 및 지방은 0.19±0.18㎍/g으로 나타났다. 약물 투여 후 14일째에는 플로르페니콜과 플로르페니콜 아민은 검출이 되었지만 MRL 이하의 농도에서 검출되었다. 그 이후 21일째에는 더 이상 플로르페니콜과 플로르페니콜 아민은 검출되지 않았다. 4배 고용량 투여군에서도 권장 투여 용량군과 같은 현상을 보였으며 투여용량의 증가로 1일째 권장 투여 용량군보다는 높은 농도로 검출이 되었다. 그러나 14일째에 MRL 이하의 농도로 검출이 되었으며 21일째에는 더 이상 측정되지는 않았다. 타이로신의 경우는 플로르페니콜의 1/4 용량으로 권장 투여용량에서는 1㎖당 25㎎으로 체중㎏당 2.5㎎에 해당되는 용량이다. 3일간 연속투여 후 1일째 각 장기별 잔류성 분석 실시하였다. 분석결과 [표 14]와 [표 15]에 나타내었다. 권장 투여 용량군과 고용량 투여군은 유사한 장기 분포를 나타났으며, 간장 (0.12±0.02㎍/g, 0.25±0.02㎍/g), 신장 (0.86±0.44㎍/g, 0.96±0.09㎍/g), 소장 (0.21±0.09㎍/g, 0.48±0.33㎍/g), 피부 및 지방 (0.19±0.18㎍/g, 0.1±0.05㎍/g), 주사부위인 근육은 (8.27±5.12㎍/g, 14.32±2.37㎍/g)순으로 높게 나타났다. 각 장기내의 타이로신은 시간에 따라 급속히 감소하는 추세를 나타내었으며, 권장용량 및 고 용량군에서 투여 종료 후 14일째까지 검출되었으나 21일째에는 잔류 허용 농도 보다 현저히 낮은 수준의 농도로 검출되었으며 약물투여 후 21일째 에는 검출이 되지 않았다. 그러나 덱사메타손의 경우는 주사부위 및 투여 1일째부터 약물이 검출되지를 않았다.

혈장에서 약물농도의 변화는 약동학적으로 주요한 자료이며 효능효과를 설명할 수 있는 분야로 본 시험에서 분석 실시하였다. 즉 3일 동안 연속 투여시 혈장에서 항균제의 약물농도의 변화를 분석하였다. 그 결과 플로르페니콜과 타이로신은 소화기 및 호흡기 병원성 세균을 살균 및 정균 할 수 있는 농도 이상을 치료기간에 유지시키는 것으로 나타났다.

시험 결과는 다음의 [표 12]에서 [표 15]에 표시하였다. 1㎖/10㎏/day 로 3일 동안 투여한 후의 타이로신과 플로르페니콜의 시간-농도 곡선은 도 8 및 9에 표시하였다.

[표 12] FTD-주사제를 1㎖/10㎏ b.w./day의 속도로 3일 동안 투여한 후에 얻은 돼지의 각종 조직에서 나타난 플로르페니콜의 잔류 농도

항생제	조직	처리 후(일수)
		1	14	21	28
플로르페니콜과 플로르페니콜 아민의 총량(㎍/g)	창자	2.11±0.34	-	-	-
	신장	2.02±0.45	0.05±0.01	-	-
	간	3.40±0.92	-	-	-
	피부+지방	2.26±0.95	-	-	-
	근육	3.91±1.23	0.09±0.01	-	-
	혈청	1.34±0.78	-	-	-

[표 13] FTD-주사제를 4㎖/10㎏ b.w./day의 속도로 3일 동안 투여한 후에 얻은 돼지의 각종 조직에서 나타난 플로르페니콜의 잔류 농도

항생제	조직	처리 후 경과 일수
		1	14	21	27
플로르페니콜과 플로르페니콜 아민의 총량(㎍/g)	창자	5.26±2.35	0.06±0.03	-	-
	신장	6.88±1.10	2.35	-	-
	간	6.76±1.67	0.35	-	-
	피부+지방	9.76±2.21	0.5이하	-	-
	근육	22.56±11.10	0.46±0.02	-	-
	혈청	7.83±3.82	-	-	-

[표 14] FTD-주사제를 1㎖/10㎏ b.w./day의 속도로 3일 동안 투여한 후에 얻은 돼지의 각종 조직에서 나타난 타이로신의 잔류 농도

항생제	조직	처리 후의 경과 일수
		1	14	21	28
타이로신 (㎍/g)	창자	0.21±0.09	0.03±0.01	-	-
	신장	0.86±0.44	0.08±0.021)	-	-
	간	0.12±0.02	0.06±0.061)	-	-
	피부+지방	0.19±0.18	0.19±0.01	-	-
	근육	8.17±5.27	0.04±0.01	-	-
	혈청	0.21±0.13	-	-	-

[표 15] FTD-주사제를 4㎖/10㎏ b.w./day의 속도로 3일 동안 투여한 후에 얻은 돼지의 각종 조직에서 나타난 플로르페니콜의 잔류 농도

항생제	조직	처리 후의 경과 일수
		1	14	21	27
타이로신 (㎍/g)	창자	0.48±0.03	0.15±0.03	-	-
	신장	0.96±0.09	0.42±0.04	-	-
	간	0.25±0.02	0.18±0.01	-	-
	피부+지방	0.10±0.05	0.09±0.01	-	-
	근육	14.32±2.37	0.53±0.02	-	-
	혈청	0.83±0.12	-	-	-

5. 챰Ⅱ 시험(Charm Ⅱ Test)

HPLC 분석에서 조직으로부터 각각의 항균물질을 회수 및 농축과정에서 일어날 수 있는 실수를 보정하기 위하여 정성분석의 하나인 고감도 분석으로 식육 중 항균 물질검사를 위한 챰Ⅱ 시험을 이용하였다. 타이로신은 100ppb, 그리고 플로르페니콜은 10ppb 이상에서 검출되므로 MRL 기준을 충족시키는 검출 한계를 갖고있다. 그 결과 4배의 고용량 투여군에서 약물투여 후 21일째에 타이로신 및 플로르페니콜은 각각 100ppb 및 10ppb 이하로 나타났다.

(5-1) 안전농도, MRL 및 휴약기간의 설정

플로르페니콜에 대한 미생물학적 1일 섭취허용량(ADI)은 EU에서 계산하기를 미생물학적 ADI=[MIC(푸소박테리움 sp 에 대하여 0.36㎍/㎖)]x 분내 볼루스/[I.m.의 분획 x 평균 인간 체중]=[0.36x150]/[1x60]=3㎍/㎏ bw=180㎍/인간체중/일로 계산하고 있다. 이 농도는 독성학적 ADI (600㎍ per person per day) 보다 낮다.

타이로신의 경우 미생물학적 ADI=[기하평균 MIC50 x CF2/CF1 x 일일 분내 볼루스 (0.151)/미생물학적 경구 용량의 분획 x 인간 체중 (60㎏) = 0.602x2/1 x 150/ (1-0.5) x 60㎏ = 6.06㎍/㎏ bw (363.3 ㎍/인간 체중)으로 약 6㎍/㎏ bw로 360 ㎍/인간체중/일로 계산되었다. 이 농도는 동물학적 ADI의 500 ㎍/㎏보다 낮은 농도이다. 따라서 플로르페니콜과 타이로신에 대한 안전농도와 MRL은 표16에 표시한다.

[표 16] 플로르페니콜과 타이로신에 대한 안전농도

가식부위 일일 섭취량	CODEX(g)	플로르페니콜 안전농도(㎍/g)	MRL(㎍/g)
근육	300	0.6	0.5
지방	50	3.6	1
간장	100	1.8	3
신장	50	3.6	1
유	1500	0.12	0.1
가식부위 일일 섭취량	CODEX	타이로신 안전동도(㎍/g)	MRL(㎍/g)
근육	300	1.2	0.1
지방	50	7.2	0.1
간장	100	3.6	0.1
신장	50	7.2	0.1
유	1500	0.24	0.05

* 안전농도 (ppm, ㎍/g) = ADI(㎍/㎏/day)x60㎏/가식부위별 1일 섭취량(g/day)

휴약기간의 설정을 위해서 타이로신, 플로르페니콜 및 대사물질 (플로르페니콜아민) 농도의 합을 대상으로 통계학적 처리를 실시하였으며, 이때 잔류 허용 농도는 [표 16]에 나타낸 각 장기별 잔류 허용 농도를 기준으로 하여, 휴약기간을 설정하였다. 돼지에서 고용량군 (권장용량의 4배용량)의 경우, 타이로신과 플로르페니콜이 간장, 신장, 주사부위에서 장기간 검출되었으나, 이는 잔류 허용치 보다 현저히 낮은 농도이다. 유럽 연합에서 제시한 타이로신과 플로르페니콜은 100㎍/g으로 플로르페니콜에 대한 잔류 허용치(CVMP No 2377/90)에서 가장 낮은 농도로 설정되어 있는 근육을 기준으로 플로르페니콜의 안전 휴약기간을 산정하였다.

FTD-주사제를 3 일간 1회 권장 용량군의 4배로 투여할 경우 휴약기간은 주사부위를 기준으로 할 경우 타이로신은 21일, 그리고 플로르페니콜은 16일로 나타났다. 그 결과를 코크란 시험 및 바틀렛 시험을 이용하여 통계학적 분석을 시행한 결과, p > 0.05로 유의성을 나타내지 않았다. 그러나 국내에서 (주)이글벳의 타이로신 100주 및 200주를 근육 주사하였을 때의 휴약 기간은 28일로 되어있고 (주)민우의 플로르페니콜의 파워풀 20주는 휴약 기간이 돼지에서 14일로 되어있어 FTD-주사제의 경우 수적인 방법으로 28일로 휴약기간을 산정하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.

도 10, 11에는 돼지에 플로르페니콜과 타이로신을 4ml/10kg/일로 주사하였을 때의 주사부위 근육 시료 중의 플로르페니콜 소실량이 나타나 있다.

제조예 1: 동물용 경구투여 복합항생제의 제조

동물용 소화기 감염증 예방 및 치료제를 위한 복합항균제(플로르페니콜 : 타이로신=2:1) 50g을 락토오스 50g, 결정성 셀룰로오스 20g, 마그네슘 스테아레이트 10g과 함께 혼합하였다. 이 혼합물을 사료 부형제와 혼합하여 직경 0.01cm-0.1cm 크기의 펠렛 사료로 만들어 제제화하였다. 사용은 복합제제 500g을 사료 1 톤에 혼합하여 보조 사료로 투여한다.

상기 분말제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 .................. 50g

락토오스 .................. 50g

결정성 셀룰로오스 .......... 20g

마그네슘 스테아레이트 ...... 10g

보조성분 ................... 적당량

부형제(말분) .............. 나머지

제조예 2 : 주사액제의 제조

복합항생제(플로르페니콜:타이로신=2:1)는 아래에 표시된 처방으로 플로르페니콜 50mg, 타이로신 25mg, 덱사메타손 0.25mg을 1ml에 녹여 주사액을 만든다.

상기 주사제의 구성은 다음과 같다.

복합제(플로르페니콜:타이로신=2:1) ............... 3.75g : 15g

덱사메타손 ...................................... 12.5mg

증류수 잔부

(전체 50 ml)

본 발명에 따른 복합항생제 조성물은 동물의 소화기감염증, 호흡기감염증의 원인이 되는 세균에 대해서 각각의 단일 항균제로 투여되는 용량을 감소시켜 독성 및 잔류성을 현저하게 낮추는 동시에 두 항생제의 상승작용으로 항균작용을 현저히 상승시키는 작용을 하는 효과가 있다.

또한, 각각 단일의 항균제에 대하여 내성을 갖고 있는 세균에 대하여 본 발명의 복합제 투여는 유효성분 상호간의 작용에 의하여 탁월한 효과를 나타내어 항균제 치료의 치유효과 및 예방 효과를 높이게 된 효과가 있다.

Claims (4)

1. 유효성분으로서 플로르페니콜과 타이로신을 2:1 중량비로 포함함을 특징으로 하는 플로르페니콜과 타이로신을 포함하는 동물용 복합항생제 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 이 조성물이 보조 성분으로 락토오스, 결정성 셀룰로오스 및 마그네슘 스테아레이트 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 포함함을 특징으로 하는 경구용으로 사용하기 위하여 분말로 조성된 플로르페니콜과 타이로신을 포함하는 동물용 복합항균제 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 이 조성물이 보조 성분으로 락토오스, 결정성 셀룰로오스 및 마그네슘 스테아레이트 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상 및 액체 보조제를 포함함을 특징으로 하는 경구용으로 사용하기 위하여 액상으로 조성된 플로르페니콜과 타이로신을 포함하는 동물용 복합항균제 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 이 조성물이 보조성분으로 덱사메타손을 포함함을 특징으로 하는 주사제로 사용하기 위한 플로르페니콜과 타이로신을 포함하는 동물용 복합항생제 주사제 조성물.

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