JP2020519264A - セルロース結合モジュールを含む組換えベクター及び前記ベクターを用いてタンパク質を分離・精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記ステップS1の混合液をセルロースが満たされたカラムに注入してセルロース結合モジュール3及び目的タンパク質が融合された融合タンパク質をセルロースに吸着させるステップ(ステップS2);及び
前記ステップS2で前記融合タンパク質が吸着されたセルロースを遠心分離して沈澱させた後、エンテロキナーゼに懸濁して懸濁液を収得するステップ(ステップS3)。
a)前記組換えベクターを菌株に導入して形質転換菌株を製造するステップ;及び
b)前記形質転換菌株を用いて植物体を形質転換するステップを含む方法で製造されるものであってもよい。
前記ステップS1の混合液をセルロース(cellulose)が満たされたカラムに注入してセルロース結合モジュール3及び目的タンパク質が融合された融合タンパク質をセルロースに吸着させるステップ(ステップS2);及び
前記ステップS2で前記融合タンパク質が吸着されたセルロースを遠心分離して沈澱させた後、エンテロキナーゼに懸濁して懸濁液を収得するステップ(ステップS3)。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
図1のように、植物体でCBM3融合タンパク質を発現させるように組換えをした植物体の形質転換用ベクターを作製した。CBM3融合タンパク質を小胞体に移動させるようにBiP(chaperone binding protein)タンパク質のシグナルペプチドに該当するゲノムDNA配列を用いて目的タンパク質を小胞体に移動させ、融合タンパク質が小胞体に蓄積されるようにカルボキシル末端にHDEL(His−Asp−Glu−Leu)を付与して小胞体に保持した。目的タンパク質(Ag85A)をコーディングする遺伝子の前方に融合タンパク質の分離に必要なセルロース結合モジュール3(Cellulose binding module 3、CBM3)と連結ペプチド(リンカー)及びエンテロキナーゼにより認識されて切断される配列を結合し、植物発現用ベクターであるpCAMBIA 1300に挿入して組換えベクターを製造した。前記ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)LBA−4404菌株に形質転換させた。前記形質転換されたアグロバクテリウム菌株を用いてシロイヌナズナを形質転換させて目的タンパク質を生産する形質転換植物体を製造し、その後、安定的にCBM3融合タンパク質を生産する形質転換植物体を選別した。前記組換えベクターで用いられた配列は、下記表1に示した。
微細結晶セルロース(Microcrystalline cellulose、MCC)にCBM3融合タンパク質を吸着させるために、微細結晶セルロース1gを蒸留水に添加して水和させた。以後、前記実施例1の方法で製造された形質転換植物体を土壌に植えて約3週間培養した後、根部分を除いた植物体を乳鉢に入れて液体窒素を用いて粉末化させた。前記粉末化された植物体1gを新しいチューブに移し、タンパク質抽出緩衝溶液(50mM Tris(pH7.2)、150mM NaCl、0.2%Triton X−100、プロテアーゼIXインヒビター)5mLを添加してボルテックスしてよく混合した。フィルターでミラクロス(Miracloth)を用いて植物破送物を除去した後、微細結晶セルロース1gを添加した後に1時間の間4℃でよく混合してCBM3融合タンパク質が微細結晶セルロースに吸着されるようにした。その後遠心分離(14,000rpm、4℃、10分)を通じて微細結晶セルロースに結合されないタンパク質を除去した後、5mLの洗浄用緩衝溶液(50mM Tris(pH7.2)、150mM NaCl)で微細結晶セルロースを2回洗浄した。CBM3融合タンパク質の微細結晶セルロースの吸着は、CBM3抗体を用いてウエスタンブロッティングで確認した。
Ag85Aを含んだ融合タンパク質が吸着されたセルロースを、遠心分離(14,000rpm、4℃、10分)を通じて沈澱させた後、エンテロキナーゼ反応溶液(50mM Tris(pH7.2)、150mM NaCl、1mM CaCl2)にまた懸濁させた。懸濁液にエンテロキナーゼを5単位ほど添加して28℃で反応させた後、時間帯別に懸濁液を採取してSDS−PAGEを行った。エンテロキナーゼの処理時間による融合タンパク質の切断は、Ag85A抗体を用いてウエスタンブロッティングで確認した。
遠心分離(14,000rpm、4℃、10分)を通じてエンテロキナーゼと完全に切断されたAg85Aを含む反応液をセルロースから分離した(図4の左側)。反応液からエンテロキナーゼを除去するためにアフィニティークロマトグラフィーを実施した。反応液にSTI−Sepharoseを入れて4℃で1時間の間反応させた後、空のカラムに入れてSTI−Sepharoseに結合しない部分を回収した。図4の右側から確認できるように、STI−Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーを通じて反応液からエンテロキナーゼを除去して純粋分離されたAg85Aを獲得し得ることがわかる。
Claims (15)
- セルロース結合モジュール3をコードする配列番号1の塩基配列を含むことを特徴とする、組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、セルロース結合モジュール3、連結ペプチド、エンテロキナーゼの切断部位及び目的タンパク質のコード遺伝子が順次に連結されていることを特徴とする、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記目的タンパク質のコード遺伝子は、配列番号3の塩基配列で構成されることを特徴とする、請求項2に記載の組換えベクター。
- 前記連結ペプチドは、配列番号5の塩基配列で構成されることを特徴とする、請求項2に記載の組換えベクター。
- 前記エンテロキナーゼの切断部位は、配列番号6の塩基配列で構成されることを特徴とする、請求項2に記載の組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、植物細胞で目的タンパク質を小胞体にターゲティングすることができるBiP(Binding immunoglobulin protein)タンパク質をコードする遺伝子が追加的に作動可能に連結されたことを特徴とする、請求項2に記載の組換えベクター。
- 前記BiPタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号7の塩基配列で構成されることを特徴とする、請求項6に記載の組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、HDEL(His−Asp−Glu−Leu)ペプチドをコードする塩基配列が追加的に作動可能に連結されたことを特徴とする、請求項2に記載の組換えベクター。
- 下記ステップを含むことを特徴とする、目的タンパク質の分離・精製方法:
請求項1に記載の組換えベクターを用いて形質転換された植物体とタンパク質抽出緩衝溶液を混合して植物体混合液を製造するステップ(ステップS1);
前記ステップS1の混合液をセルロースが満たされたカラムに注入してセルロース結合モジュール3及び目的タンパク質が融合された融合タンパク質をセルロースに吸着させるステップ(ステップS2);及び
前記ステップS2で前記融合タンパク質が吸着されたセルロースを遠心分離して沈澱させた後、エンテロキナーゼに懸濁して懸濁液を収得するステップ(ステップS3)。 - 前記ステップS3の後、セファロースカラムに前記懸濁液を注入してエンテロキナーゼを除去するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
- 前記タンパク質抽出緩衝溶液は、10〜100mMのトリス(Tris)緩衝液、100〜200mMの塩化ナトリウム(NaCl)溶液、0.01〜0.5%のTriton X−100及びプロテアーゼインヒビターを含むことを特徴とする、請求項9に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
- 前記形質転換された植物体は、
a)請求項1に記載の組換えベクターを菌株に導入して形質転換菌株を製造するステップ;及び
b)前記形質転換菌株を用いて植物体を形質転換するステップ
を含む方法で製造されることを特徴とする、請求項9に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。 - 前記菌株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることを特徴とする、請求項12に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
- 前記植物体は、シロイヌナズナ、大豆、タバコ、ナス、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、白菜、大根、キャベツ、チシャ、桃、梨、イチゴ、スイカ、マクワウリ、キュウリ、ニンジン及びセロリからなる群より選択される双子葉植物;又は稲、麦、小麦、ライ麦、トウモロコシ、サトウキビ、エンバク及びタマネギからなる群より選択される単子葉植物であることを特徴とする、請求項9に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
- 前記セルロースは、微細結晶セルロース(Microcrystalline cellulose)であることを特徴とする、請求項9に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
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