JP2007503211A - 植物から組換えタンパク質を精製するための非変性プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は生化学およびタンパク質技術の分野にあり、そしてトランスジェニック植物材料からの異種タンパク質の単離および精製の改善法に関する。
タンパク質に基づく生物薬剤は、深刻な疾患に対する、より特異的で、そして組織特異的であるか、または細胞特異的な薬剤治療を提供するのに、きわめて有望である(概説に関しては、“Recombinant Protein Drugs” P. Buckel監修 2001を参照されたい)。
先行技術の例(米国特許第6,331,416号)では、Shaniらは、宿主植物細胞壁のあまり明確でないセルロースに結合する多糖結合ドメインを持つ組換えタンパク質を発現する方法、および宿主植物セルロースへのこのタンパク質のアフィニティーを利用して、可溶性混入タンパク質から分離可能な細胞壁−タンパク質複合体を生じる、タンパク質精製プロセスを記載する。結合強度は、セルロース性植物物質からタンパク質を遊離させるのに、タンパク質を変性させ、精製中の組換えタンパク質の活性に負の影響を有する劇的な条件が必要でありうる程度である可能性もある。したがって、植物材料からタンパク質を精製する方法を提示したものの、リガンド/細胞壁結合を破壊するのに厳しい条件が必要であり、これには抗体−プロテインA溶出に関して上述したものに匹敵する厄介な問題および懸念が伴う。
本発明の主な目的は、植物、植物由来組織または植物細胞で産生された高価値の異種タンパク質のタンパク質精製のための、改善された非変性法を提供することである。
精製プロセスの重要な工程は、細胞壁断片由来のCBM融合タンパク質としての目的のタンパク質およびあまり明確でない他の植物由来固体物の分離であり、これは本発明のCBM−融合タンパク質がこれらの構成要素に結合しないためである。この工程は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の前に別個に行うことも可能であるし、またアフィニティー・クロマトグラフィー工程と同時に行うことも可能である。
トランスジェニック植物材料を破壊し;
前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し;
細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し;
前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ;
結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、1以上の適切な水溶液、例えば1以上の緩衝溶液で洗浄し、すなわち洗浄は、勾配を用いて1つの工程で行うことも、または一連の異なる洗浄溶液として行うことも可能である;そして
特徴的に穏やかな条件下で、マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記多糖マトリックスから融合タンパク質を溶出する
ことを含む。
しかし、特定の有用な態様において、目的のタンパク質であるCBM−融合タンパク質からの細胞壁断片およびあまり明確でない他の植物由来固体物の前記分離、並びに多糖マトリックスへの該CBM融合タンパク質のアフィニティー結合は、適切で安価な多糖マトリックスを伴う吸着流動床クロマトグラフィー(EBA)を用いた、単一の強力な精製工程で行うことも可能である。この特徴は、下流プロセシングを経済的に合理化し、そして改善する。
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、CBMに連結された異種タンパク質を指す。
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、CBMに連結された異種タンパク質を指す。
「分子農業」は、野外または閉ざされた施設において、いずれかの種類の植物を用いて、その組織中で異種タンパク質を発現させ、そして産生する作業を指す。
「好熱性」は、最適増殖温度が45℃を超える生物を指す。
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
(1)プロセスの出発材料は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の材料、またはトランスジェニック植物細胞であり、限定されるわけではないが、植物細胞の懸濁培養物とともに、カルスの未分化細胞も含まれる。材料は、限定されるわけではないが、アグロバクテリウムが仲介する形質転換または微粒子銃が仲介する形質転換または植物ウイルスベクターが仲介する形質転換などの、当業者に知られるプロセスを通じて、植物細胞に導入されている、CBMオープンリーディングフレームに機能可能であるように連結された異種遺伝子(単数または複数)を、調節された方式で発現するという意味でトランスジェニックである。出発材料は、好ましくは、本発明が記載するプロセスを開始する前に、当業者によってRNAまたはタンパク質レベルの解析によって判断されるように、融合タンパク質が満足できる発現レベルであることに基づいて選択される。
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
(実施例1)
バイオマス相互作用研究:CBM9−2および製粉オオムギ種子
乾燥オオムギ種子を、細かい粉になるまで、Retsch製粉装置中で細かく粉砕した。バイオマス相互作用研究に干渉しうるすべての水溶性構成要素を、試料から取り除く手段として、5mlの低塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.02)を用い、種子から水溶性構成要素を抽出するため、製粉した種子1gを用いた。混合物をボルテックスし、そして5分間反転させ(tumbled)液体および製粉したオオムギ種子材料が完全に混合されていることを確実にした。この混合に続いて、試料を5000xgで4分間遠心分離して、固体物をペレットにした。遠心分離後、上清を廃棄した。低塩緩衝液を用いて、この手順を3回繰り返し、各遠心分離後、上清を廃棄した。次いで、高塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.02、1M NaCl)を用いて、洗浄手順を3回繰り返し、前と同様、上清を廃棄した。生じた洗浄固体物は、大部分の植物細胞壁断片および不溶性デンプンに相当する。洗浄した固体物を、上述のような低塩緩衝液で3回洗浄して平衡化して、アフィニティー・クロマトグラフィーにおいて、セルロース性マトリックスへのCBM9−2のアフィニティー結合を支持するのと同じ条件を得た。バイオマス相互作用研究前の固体物の代表的な試料を、SDS−PAGE解析のために取り置いた(レーン3)。細菌で産生し、セルロース(Avicel(商標))−アフィニティー・カラム上で精製したCBM9−2(O.D.@280nm 0.394)10μlを、後のSDS−PAGEのために取り置いた(レーン2)。精製されたCBM9−2は、あらかじめ、タンパク質のセルロース結合アフィニティー特性を回復するように、CBM9−2に結合したいかなるグルコースも脱着するための立証された方法として、希釈および限外ろ過モジュール中の濃縮の繰り返し(4x)に供されていた。
(実施例2)
製粉オオムギ種子抽出物からのCBM9−2の精製
商業的に入手可能な製粉装置(Aarslev Maskinfabrik, Erhvervsvangen 11, 5792 Aarslev, DK)を用いて、オオムギ種子を細かく挽いて粉にした。低塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.02)中、オオムギ粉:緩衝液がそれぞれ2:3の体積比で、生じたオオムギ粉を湿らせた。液体と粉を容器中で徹底的に混合し、そして4℃で一晩沈降させた。細菌から精製したCBM9−2をオオムギ種子上清に添加した。翌日、CBM9−2を含有するスパイク処理した上清(100ml)を、セルロース(Avicel(商標))を含有するStreamline 25(Amersham Biotech)クロマトグラフィー・カラムに装填した。装填適用は、流動床モードで流速184cm/時間で行い、その後、5カラム体積の高塩緩衝液(50mM KPO4、pH7.02中の1M NaCl)、その後、5カラム体積の低塩緩衝液(50mM KPO4、pH7.02)の洗浄工程を行った。流動床カラムは、沈降を可能にし(沈降した床の高さ=20cm)、そして92cm/時間、溶出緩衝液:50mM KPO4、pH7.02中の1Mグルコース300mlで溶出を行った。溶出条件は、CBM9−2タンパク質を含有する小さいピークを生じた(図3を参照されたい)。
抽出物中のCBM9−2の熱安定性および濃縮
1.5グラムの製粉オオムギを、7.5mlの低塩緩衝液(50mM KPO4、pH7.02)に溶解した。反転装置中で溶液を1時間連続して混合し、そして6000rpmで10分間回転して落とした。Bradfordアッセイで、タンパク質含量に関して、上清(抽出物)を測定し、そして可溶性種子タンパク質1.93mg/mlを含有することを見出した。抽出物350μlを精製CBM9−2タンパク質(0.238mg/ml)350μlと混合し、そしてエッペンドルフ試験管にアリコットし、これを続いて、水槽中で異なる温度(室温、50℃、60℃、70℃および90℃)に10分間曝露した。熱処理後、試料を11,000rpmで10分間回転して落とし、そして異なる熱処理由来の試料をSDS−PAGEで解析した。熱安定性試験由来の試料をSDS−PAGE用に調製し、そしてPhastSystem(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、12.5% SDS−PAGEゲル(PhastGels均質12.5)上で泳動した。泳動完了後、ゲルをクーマシーブルーR−250で染色し、そして脱染色した。結果を図4に例示する。熱に曝露したCBM9−2に関するさらなる試験を行って、CBM9−2がセルロースに結合する能力が、熱への曝露によって、いかなる点でも不都合に影響を受けないことを確認した。
製粉された単一のオオムギ種子抽出物からのCBM9−2に付着した異種タンパク質の精製
上述の精製法の規模縮小型において、異種タンパク質を発現しているトランスジェニック・オオムギ植物の単一の種子を用いた。室温で30秒間〜5分間の範囲でインキュベーションした。青色が発色したら、100μlの0.2M硫酸を添加した。色は黄色になり、そしてマイクロプレート読み取り装置中、450nmで吸光度を測定した。
CBM9−2に特異的であることがあらかじめ示されたELISA解析は、まず;個々の種子中の異種融合タンパク質集積を達成し、そして検証可能であり;上述の方法は、小規模の場合であっても、切断部位を持つ異種融合タンパク質を単離するよう働き、精製プロセスの規模変更が可能であることを裏付け;CBM9−2に付着した目的の異種タンパク質が、抽出中、溶液において維持されることに成功し、そしてあまり明確でない植物細胞壁セルロースに結合したために失われることがないことを示し;再生工程を伴わない、特異抗体による溶出後に認識されるように、異種融合タンパク質が、クロマトグラフィー・プロセス中、変性に曝露されないことを示し、上に議論するように、いくつかの他のより厳しいアフィニティー・クロマトグラフィー法よりも本発明が好適であることを強調し;上述の精製法が、CBM9−2に付着したいかなる異種融合タンパク質にも適用可能であることを示す。
CBM−プロテアーゼの精製および活性測定
CBM9−2タグが付着した部位特異的プロテアーゼを産生するため、以下の方法にしたがった:
構造的プロモーター直後のエンテロキナーゼcDNA、該cDNAに付着した、CBM9−2に対応するcDNA、小胞体(ER)にターゲティングするシグナル配列、および該タンパク質をERに保持する保持シグナルで構成される発現構築物を所持するバイナリー・プラスミドを含有するように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株AGL0を構築した。このアグロバクテリウム株を選択条件下、YEB培地中で、まず10ml中、O.D.600が0.8になるまで28℃で2日間増殖させた。小規模培養物を、20μMアセトシリンゴンを含有する500ml培養に1:50に希釈し、28℃で2〜3日間、そして激しく振盪しながらO.D.600nmが2.5になるまで培養した。この細菌を6,000rpmで10分間回転して落とし、そしてOD600が2.5になるようにMS溶液(55g/lスクロースを含有する)中に再懸濁した。アセトシリンゴン(10mM)を最終濃度200μMになるように添加した。次いで、細菌懸濁物を室温に1時間維持し、そしてTween−20(10%)を最終濃度0.005%になるように添加した。
続いて植物を真空チャンバーに入れ、そして0.4バール圧を20分間適用し、その後、吸気口を開放して、圧を迅速に均一にした。水道水のボウルに連続して浸漬することによって、葉表面の過剰な細菌を洗い落とした。レタス植物を16時間明期/8時間暗期の光周期、22℃で、増殖チャンバーに4日間入れた。
標準的アプローチ(Grant& Hermon−Taylor、1979)にしたがい、特異的合成基質を用いてエンテロキナーゼ活性をアッセイする:合成基質:Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−β−ナフチルアミド(GD4K−na);アッセイ条件37℃。反応体積は1.5mlである。反応混合物は:25μlの10mM GD4K−na(0.5mM)、125μlの100mM Tris−HCl、pH8.4(25mM)、50μlの100% DMSO(10%)、50μlの100mM CaCl2(10mM)、(20〜100)μlエンテロキナーゼ、250μl蒸留水―(20〜100)μlからなる。λex=337nmおよびλem=420nm間の蛍光の増分からβ−ナフチルアミン形成速度を決定した。これを5分間連続して監視した。
Claims (21)
- セルロース結合性モジュール(CBM)を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する方法であって
(a)トランスジェニック植物材料を破壊し;
(b)前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し;
(c)細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し;
(d)前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ;
(e)結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、1以上の適切な水溶液で洗浄し;そして
(f)前記多糖マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記マトリックスから融合タンパク質を溶出し、
それによって実質的に精製された可溶性異種融合タンパク質を得る
ことを含む、前記方法。 - 前記トランスジェニック植物または植物細胞が、双子葉植物および単子葉植物の群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞またはトランスジェニック植物が、タバコ(tobacco)、ナタネ(rape seed)、ダイズ(soy bean)、アルファルファ(alfalfa)、レタス(lettuce)、オオムギ(barley)、トウモロコシ(maize)、コムギ(wheat)、カラスムギ(oat)およびイネ(rice)を含む植物群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 分離工程(c)が、吸着流動床(expanded bed adsorption)(EBA)、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(d)における前記多糖マトリックスへのアフィニティー結合が、クロマトグラフィー工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質抽出物からの細胞壁材料および固体物の分離、並びに多糖マトリックス上への前記CBM融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための手段として、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含む、プロセス工程中の工程(c)および(d)を組み合わせた、請求項1に記載の方法。
- マトリックスからの前記融合タンパク質の溶出を達成する前記条件が、中性条件または酸性条件であることも可能な非変性条件であるか、あるいは炭水化物への曝露を伴うか、あるいはその組み合わせのいずれかである、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多糖マトリックスがセルロースを含む、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セルロースマトリックスが、薬学的に適合するセルロースを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記セルロースがAvicel(商標)である、請求項9に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物または植物細胞が、CBMをコードする核酸配列を含む、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CBMが熱安定性であり、そして上昇した温度で可溶性のままである、請求項11に記載の方法。
- CBMをコードする前記領域が、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)由来のキシラナーゼ10A遺伝子の領域である、請求項12に記載の方法。
- CBMをコードする前記領域が、配列番号1として示す配列を含むか、あるいは前記配列と同一のアミノ酸配列、または前記配列と実質的な配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項13に記載の方法。
- プロセス中、前記タンパク質抽出物を、37℃〜100℃の範囲の温度に、1分間〜120分間の範囲の期間、加熱する、請求項1に記載の方法。
- 固体物の分離および加熱した抽出物由来の前記CBM融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含むプロセス工程に、前記の加熱した抽出物を供する、請求項16に記載の方法。
- 前記異種融合タンパク質がプロテアーゼを含む、請求項1ないし16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが哺乳動物エンテロキナーゼ(EK)またはそのエンテロキナーゼ活性部分である、請求項17に記載の方法。
- 前記EKがウシEK触媒性ドメイン(EKc)を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記ウシEKcが配列番号2として示す核酸配列にコードされる、請求項19に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、タンパク質分解性切断部位に遮断される、CBMおよび目的の異種ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
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