JP4960701B2 - 組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製のためのプロセス - Google Patents
組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製のためのプロセス Download PDFInfo
- Publication number
- JP4960701B2 JP4960701B2 JP2006524529A JP2006524529A JP4960701B2 JP 4960701 B2 JP4960701 B2 JP 4960701B2 JP 2006524529 A JP2006524529 A JP 2006524529A JP 2006524529 A JP2006524529 A JP 2006524529A JP 4960701 B2 JP4960701 B2 JP 4960701B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cbm
- protein
- protease
- matrix
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は生化学およびタンパク質技術の分野にあり、そして特にトランスジェニック植物材料からの異種タンパク質の単離および精製の改善法に関する。さらに、本発明は、融合タンパク質のタンパク質分解性切断の改善され、そして経済的な方法を提示する。
タンパク質に基づく生物薬剤は、深刻な疾患に対する、より特異的で、そして組織特異的であるか、または細胞特異的な薬剤治療を提供するのに、きわめて有望である(概説に関しては、“Recombinant Protein Drugs” P. Buckel監修 2001を参照されたい)。
文献中の多くの例によって、高価値の異種ポリペプチドまたは生物薬剤を発現し、そして製造するためのトランスジェニック植物または植物細胞培養物の利用が示されてきている。こうした植物に基づく製造プロセスを、分子農業と呼ぶことも可能である。
米国特許第6,331,416号では、Shaniらは、宿主植物細胞壁のセルロースに結合する多糖結合ドメインを持つ組換えタンパク質を発現する方法、およびあまり明確でない宿主植物セルロースへのこのタンパク質のアフィニティーを利用して、可溶性混入タンパク質から分離可能な細胞壁−タンパク質複合体を生じる、タンパク質精製プロセスを記載する。結合強度は、セルロース性植物物質からタンパク質を遊離させるのに、タンパク質を変性させ、精製中の組換えタンパク質の活性に負の影響を有する劇的な条件が必要でありうる程度である可能性もある。厄介な問題は、抗体−プロテインA溶出に関して上述したものに匹敵するということである。
このことから、トランスジェニック植物材料から異種タンパク質を、効率的に、単純に、そして経済的に精製するための下流プロセスに関する、認識されている必要性がある。さらに、目的のタンパク質の生物活性を安定させ、そして収量を改善するため、穏やかで、目的のタンパク質を変性させない条件からなる下流プロセス(特に穏やかな溶出条件を持つ特異的アフィニティー精製法)の必要性がある。
本発明の主な目的は、植物、植物由来組織または植物細胞で産生された高価値の異種タンパク質をタンパク質精製するための改善された方法、および融合したアフィニティー・タグ、例えばタンパク質に融合したCBMなどから、目的の異種タンパク質を効率的にそして経済的にタンパク質分解性に分離する手段を提供することである。
精製プロセスの重要な特徴は、細胞壁断片由来のCBM融合タンパク質としての目的のタンパク質およびあまり明確でない他の植物由来固体物の固有の分離であり、これは本発明のCBM−融合タンパク質がこれらの構成要素に結合しないためである。この工程は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の前に別個に行うことも可能であるし、またアフィニティー・クロマトグラフィー工程と同時に行うことも可能である。
トランスジェニック植物材料を破壊し;
前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し;
細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し;
前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ;
結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、1以上の適切な水溶液、例えば1以上の緩衝溶液で洗浄し、すなわち洗浄は、勾配を用いて1つの工程で行うことも、または一連の異なる洗浄溶液として行うことも可能である;そして
マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記多糖マトリックスから融合タンパク質を溶出する
ことを含む。
しかし、特定の有用な態様において、目的のタンパク質であるCBM−融合タンパク質からの細胞壁断片およびあまり明確でない他の植物由来固体物の前記分離、並びに多糖マトリックスへの該CBM融合タンパク質のアフィニティー結合は、適切で安価な多糖マトリックスを伴う吸着流動床クロマトグラフィー(EBA)を用いた、単一の強力な精製工程で行うことも可能である。この特徴は、下流プロセシングを経済的に合理化し、そして改善する。
(a)タンパク質分解性切断部位に遮断され、上に定義するようなCBMに融合した前記異種タンパク質を含む融合タンパク質を提供し、
(b)CBMに融合した機能するプロテアーゼと、前記融合タンパク質を、前記プロテアーゼによるタンパク質分解性切断を促進する条件下で接触させて、目的の異種タンパク質から、融合したCBMを切断し、
(c)CBM−プロテアーゼ、遊離CBMおよび目的の異種タンパク質の溶液を、CBM−プロテアーゼおよび遊離CBMが、本明細書に定義するような多糖マトリックスに結合する条件下、そして目的の異種タンパク質が前記多糖マトリックス上に保持されない条件下で、前記多糖マトリックスに接触させ、
(d)多糖マトリックスから、結合していない目的の異種タンパク質を分離し、
(e)結合したCBM−プロテアーゼおよびCBMを伴う多糖マトリックスを、1以上の適切な水溶液で洗浄し、
(f)前記CBM−プロテアーゼのマトリックスからの遊離を達成する条件を調節することによって、マトリックスからCBM−プロテアーゼを溶出させ;そして
(g)場合によって、前記の溶出されたCBM−プロテアーゼが、前記多糖マトリックスへのアフィニティーを保持するように再条件調節して、再条件調節されたCBM−プロテアーゼが、続いて、プロセスを反復するのに再使用可能であるようにする
ことを含む、前記プロセスを提供する。
好ましい態様において、CBMに融合したプロテアーゼは、エンテロキナーゼ、好ましくは上述のようなエンテロキナーゼである。こうしたCBM−融合プロテアーゼ、EKまたは他の型を、本明細書記載の方法によって適切に産生し、そして精製することも可能である。
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、CBMに連結された異種タンパク質を指す。
「分子農業」は、野外または閉ざされた施設において、いずれかの種類の植物を用いて、その組織中で異種タンパク質を発現させ、そして産生する作業を指す。
「好熱性」は、最適増殖温度が45℃を超える生物を指す。
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
(1)プロセスの出発材料は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の材料、またはトランスジェニック植物細胞であり、限定されるわけではないが、植物細胞の懸濁培養物とともに、カルスの未分化細胞も含まれる。本発明の態様の変形において、材料は、異種タンパク質を一過性に発現する植物組織起源であってもい。材料は、限定されるわけではないが、アグロバクテリウムが仲介する形質転換または微粒子銃が仲介する形質転換または植物ウイルスベクターが仲介する形質転換などの、当業者に知られるプロセスを通じて、植物細胞に導入されている、CBMオープンリーディングフレームに機能可能であるように連結された異種遺伝子(単数または複数)を、調節された方式で発現するという意味でトランスジェニックである。出発材料は、好ましくは、本発明が記載するプロセスを開始する前に、当業者によってRNAまたはタンパク質レベルの解析によって判断されるように、融合タンパク質が満足できる発現レベルであることに基づいて選択される。
(16)CBM−プロテアーゼおよびCBMの遊離。上記の工程(7)に記載するような溶出条件を用いて、CBM−プロテアーゼを溶液に戻す。この溶液の再条件調節は、条件の中和、および/または多糖アフィニティー・マトリックスからのCBMの遊離に影響を及ぼす(effected)剤(単数または複数)(例えば糖)の除去を伴う。前記剤は、CBMプロテアーゼを含む溶液から、例えば限外ろ過、透析、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、そしてイオン交換クロマトグラフィーの特定の条件下で、除去可能である。サイズ排除クロマトグラフィーなどのこれらの方法のいくつかは、さらに、必要に応じて、残ったCBMおよびCBM−融合タンパク質からCBM−プロテアーゼを精製することも可能である。
(実施例1)
バイオマス相互作用研究:CBM9−2および製粉オオムギ種子
乾燥オオムギ種子を、細かい粉になるまで、Retsch製粉装置中で細かく粉砕した。バイオマス相互作用研究に干渉しうるすべての水溶性構成要素を、試料から取り除く手段として、5mlの低塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.02)を用い、種子から水溶性構成要素を抽出するため、製粉した種子1gを用いた。混合物をボルテックスし、そして5分間反転させ(tumbled)液体および製粉したオオムギ種子材料が完全に混合されていることを確実にした。この混合に続いて、試料を5000xgで4分間遠心分離して、固体物をペレットにした。遠心分離後、上清を廃棄した。低塩緩衝液を用いて、この手順を3回繰り返し、各遠心分離後、上清を廃棄した。次いで、高塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.02、1M NaCl)を用いて、洗浄手順を3回繰り返し、前と同様、上清を廃棄した。生じた洗浄固体物は、大部分の植物細胞壁断片および不溶性デンプンに相当する。洗浄した固体物を、上述のような低塩緩衝液で3回洗浄して平衡化して、アフィニティー・クロマトグラフィーにおいて、セルロース性マトリックスへのCBM9−2のアフィニティー結合を支持するのと同じ条件を得た。バイオマス相互作用研究前の固体物の代表的な試料を、SDS−PAGE解析のために取り置いた(レーン3)。細菌で産生し、セルロース(Avicel(商標))−アフィニティー・カラム上で精製したCBM9−2(O.D.@280nm 0.394)10μlを、後のSDS−PAGEのために取り置いた(レーン2)。精製されたCBM9−2は、あらかじめ、タンパク質のセルロース結合アフィニティー特性を回復するように、CBM9−2に結合したいかなるグルコースも脱着するための立証された方法として、希釈および限外ろ過モジュール中の濃縮の繰り返し(4x)に供されていた。
(実施例2)
製粉オオムギ種子抽出物からのCBM9−2の精製
商業的に入手可能な製粉装置(Aarslev Maskinfabrik, Erhvervsvangen 11, 5792 Aarslev, DK)を用いて、オオムギ種子を細かく挽いて粉にした。低塩緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.02)中、オオムギ粉:緩衝液がそれぞれ2:3の体積比で、生じたオオムギ粉を湿らせた。液体と粉を容器中で徹底的に混合し、そして4℃で一晩沈降させた。細菌から精製したCBM9−2をオオムギ種子上清に添加した。翌日、CBM9−2を含有するスパイク処理した上清(100ml)を、セルロース(Avicel(商標))を含有するStreamline 25(Amersham Biotech)クロマトグラフィー・カラムに装填した。装填適用は、流動床モードで流速184cm/時間で行い、その後、5カラム体積の高塩緩衝液(50mM KPO4、pH7.02中の1M NaCl)、その後、5カラム体積の低塩緩衝液(50mM KPO4、pH7.02)の洗浄工程を行った。流動床カラムは、沈降を可能にし(沈降した床の高さ=20cm)、そして92cm/時間、溶出緩衝液:50mM KPO4、pH7.02中の1Mグルコース300mlで溶出を行った。溶出条件は、CBM9−2タンパク質を含有する小さいピークを生じた(図3を参照されたい)。
製粉された単一のオオムギ種子抽出物からのCBM9−2に付着した異種タンパク質の精製
上述の精製法の規模縮小型において、CBM9−2に付着した目的の異種タンパク質を発現しているトランスジェニック・オオムギ植物の単一の種子を、細かい粉になるまで、個々にホモジナイズした。低塩抽出緩衝液(50mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.02、0.01%ポリビニルピロリドン)中、オオムギ粉:緩衝液がそれぞれ1:7の体積比で、生じた種子の粉を湿らせた。液体と単一種子の粉を徹底的に混合し、そして5分間隔で振盪しながら、水溶性タンパク質を室温で1時間、液相に抽出した。
CBM−プロテアーゼの精製および活性測定
CBM9−2タグが付着した部位特異的プロテアーゼを産生するため、以下の方法にしたがった:
構造的プロモーター直後のエンテロキナーゼcDNA、該cDNAに付着した、CBM9−2に対応するcDNA、小胞体(ER)にターゲティングするシグナル配列、および該タンパク質をERに保持する保持シグナルで構成される発現構築物を所持するバイナリー・プラスミドを含有するように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株AGL0を構築した。このアグロバクテリウム株を選択条件下、YEB培地中で、まず10ml中、O.D.600が0.8になるまで28℃で2日間増殖させた。小規模培養物を、20μMアセトシリンゴンを含有する500ml培養に1:50に希釈し、28℃で2〜3日間、そして激しく振盪しながらO.D.600nmが2.5になるまで培養した。この細菌を6,000rpmで10分間回転して落とし、そしてOD600が2.5になるようにMS溶液(55g/lスクロースを含有する)中に再懸濁した。アセトシリンゴン(10mM)を最終濃度200μMになるように添加した。次いで、細菌懸濁物を室温に1時間維持し、そしてTween−20(10%)を最終濃度0.005%になるように添加した。
続いて植物を真空チャンバーに入れ、そして0.4バール圧を20分間適用し、その後、吸気口を開放して、圧を迅速に均一にした。水道水のボウルに連続して浸漬することによって、葉表面の過剰な細菌を洗い落とした。レタス植物を16時間明期/8時間暗期の光周期、22℃で、増殖チャンバーに4日間入れた。
標準的アプローチ(Grant& Hermon−Taylor、1979)にしたがい、特異的合成基質を用いてエンテロキナーゼ活性をアッセイする:合成基質:Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−β−ナフチルアミド(GD4K−na);アッセイ条件37℃。反応体積は1.5mlである。反応混合物は:25μlの10mM GD4K−na(0.5mM)、125μlの100mM Tris−HCl、pH8.4(25mM)、50μlの100% DMSO(10%)、50μlの100mM CaCl2(10mM)、(20〜100)μlエンテロキナーゼ、250μl蒸留水―(20〜100)μlからなる。λex=337nmおよびλem=420nm間の蛍光の増分からβ−ナフチルアミン形成速度を決定した。これを5分間連続して監視した。
Claims (21)
- 目的の異種タンパク質を精製するプロセスであって
(a)タンパク質分解性切断部位に遮断され、セルロース結合性モジュール(CBM)に融合した前記異種タンパク質を含む融合タンパク質を提供し、
(b)CBMに融合した機能するプロテアーゼと、前記融合タンパク質を、前記プロテアーゼによるタンパク質分解性切断を促進する条件下で接触させて、目的の異種タンパク質からCBMを切断し、
(c)CBM−プロテアーゼ、遊離CBMおよび目的の異種タンパク質の溶液を、CBM−プロテアーゼおよび遊離CBMが多糖マトリックスに結合する条件下、そして目的の異種タンパク質が前記多糖マトリックス上に保持されない条件下で、前記多糖マトリックスに接触させ、
(d)多糖マトリックスから、結合していない目的の異種タンパク質を分離し、
(e)結合したCBM−プロテアーゼおよびCBMを伴う多糖マトリックスを、1以上の適切な水溶液で洗浄し、
(f)前記CBM−プロテアーゼのマトリックスからの遊離を達成する条件を調節することによって、マトリックスからCBM−プロテアーゼを溶出させ;そして
(g)場合によって、前記の溶出されたCBM−プロテアーゼが、前記多糖マトリックスへのアフィニティーを保持するように再条件調節して、再条件調節されたCBM−プロテアーゼが、続いて、工程(a)〜(g)に定義されるプロセスを反復するのに再使用可能であるようにする
ことを含み、ここで前記CBMは多糖マトリックスに可逆的に結合することができ、及び非変性溶出条件によってそのようなマトリックスから遊離することができ、そして不溶性細胞壁植物材料に結合しない、前記プロセス。 - CBMに融合した前記プロテアーゼが、エンテロキナーゼ、タバコ・エッチ・ウイルス(TEV)プロテアーゼ、因子Xおよびトロンビンからなるプロテアーゼ群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記プロテアーゼが哺乳動物エンテロキナーゼ(EK)またはそのエンテロキナーゼ活性部分である、請求項2に記載のプロセス。
- 前記EKが、ウシEK触媒性ドメイン(EKc)を含む、請求項3に記載のプロセス。
- 前記ウシEKcが、配列番号2として示す核酸配列にコードされる、請求項4に記載のプロセス。
- セルロース結合性モジュール(CBM)を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する方法であって
(a)トランスジェニック植物材料を破壊し;
(b)前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し;
(c)細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し;
(d)前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ;
(e)結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、1以上の適切な水溶液で洗浄し;そして
(f)前記多糖マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記マトリックスから融合タンパク質を溶出し、それによって精製された可溶性異種融合タンパク質を得る
ことを含む、前記方法によって、CBMに融合した前記プロテアーゼ、およびタンパク質分解性切断部位に遮断され、CBMに融合した前記異種タンパク質が、別個に得られる、請求項1に記載のプロセス。 - 分離工程(c)が、吸着流動床(expanded bed adsorption)(EBA)、充填モードクロマトグラフィー、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む、請求項6に記載のプロセス。
- 工程(d)における前記多糖マトリックスへのアフィニティー結合が、クロマトグラフィー工程を含む、請求項6に記載のプロセス。
- 工程(c)および(d)が、組み合わせた単一工程で同時に行われる、請求項6に記載のプロセス。
- 前記タンパク質抽出物からの細胞壁材料および固体物の分離、並びに多糖マトリックス上への前記CBM融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための手段として、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含む、プロセス工程中の工程(c)および(d)を組み合わせた、請求項6に記載のプロセス。
- 前記多糖マトリックスがセルロースを含む、請求項1ないし10のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記セルロースマトリックスが、薬学的に適合するセルロースである、請求項11に記載のプロセス。
- 前記セルロースがAvicel(登録商標)である、請求項12に記載のプロセス。
- 溶出されたCBM−プロテアーゼの前記の再条件調節が、中和、および/または前記多糖マトリックスからのCBMの遊離に影響を及ぼす剤の、CBM−プロテアーゼ溶離液からの除去を伴う、請求項1ないし12のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記の再条件調節が、中和、または溶離液からの糖などの炭水化物の除去を伴う、請求項14に記載のプロセス。
- 前記の目的の異種タンパク質を含む前記融合タンパク質が、トランスジェニック植物または植物細胞から、あるいは植物、植物組織または植物細胞における一過性発現によって、発現され、そして回収される、請求項1ないし15のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記トランスジェニック植物または植物細胞が、双子葉植物および単子葉植物の群より選択される、請求項16に記載のプロセス。
- 前記植物細胞またはトランスジェニック植物が、タバコ(tobacco)、ナタネ(rapeseed)、ダイズ(soy bean)、アルファルファ(alfalfa)、レタス(lettuce)、オオムギ(barley)、トウモロコシ(maize)、コムギ(wheat)、カラスムギ(oat)およびイネ(rice)を含む植物群より選択される、請求項17に記載のプロセス。
- 前記異種タンパク質に融合した前記CBM、および前記プロテアーゼに融合した前記CBMが、25℃以上で熱安定性であり、そして100℃以下の温度で可溶性のままである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記CBMが、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)由来のキシラナーゼ10A遺伝子のCBMである、請求項19に記載のプロセス。
- 前記CBMの一方または両方が、配列番号1として示す配列を含む核酸、配列番号1として示す配列からなる核酸、配列番号1として示す配列と少なくとも90%の配列同一性を示す配列からなり、かつ、配列番号1として示す配列からなる核酸がコードするポリペプチドと同一のセルロース結合性を持つポリペプチドをコードする核酸のいずれかによってコードされるものである、請求項19に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US49793503P | 2003-08-27 | 2003-08-27 | |
IS6929 | 2003-08-27 | ||
IS6929 | 2003-08-27 | ||
US60/497,935 | 2003-08-27 | ||
PCT/IS2004/000011 WO2005021764A2 (en) | 2003-08-27 | 2004-08-27 | A process for proteolytic cleavage and purification of recombinant proteins produced in plants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007517765A JP2007517765A (ja) | 2007-07-05 |
JP4960701B2 true JP4960701B2 (ja) | 2012-06-27 |
Family
ID=37134165
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006524529A Expired - Fee Related JP4960701B2 (ja) | 2003-08-27 | 2004-08-27 | 組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製のためのプロセス |
JP2006524528A Pending JP2007503211A (ja) | 2003-08-27 | 2004-08-27 | 植物から組換えタンパク質を精製するための非変性プロセス |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006524528A Pending JP2007503211A (ja) | 2003-08-27 | 2004-08-27 | 植物から組換えタンパク質を精製するための非変性プロセス |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7462701B2 (ja) |
EP (2) | EP1668136B8 (ja) |
JP (2) | JP4960701B2 (ja) |
CN (1) | CN1852984B (ja) |
AU (2) | AU2004269198B2 (ja) |
CA (2) | CA2537105A1 (ja) |
WO (2) | WO2005021762A2 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005021762A2 (en) * | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Orf Liftaekni Hf. | A process for proteolytic cleavage and purification of recombinant proteins produced in plants |
MX2011000047A (es) * | 2008-06-30 | 2011-06-16 | Orf Liftaekni Hf | Uso de factores de crecimiento recombinantes derivados de plantas en el cuidado de la piel. |
AU2011204391A1 (en) | 2010-01-06 | 2012-08-16 | Orf Liftaekni Hf | Method of use of stabilized plant-derived growth factor in skin care |
WO2012055986A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Philip Morris Products S.A. | Methods for capturing virus like particles from plants using expanded chromatography |
KR101321890B1 (ko) * | 2012-04-06 | 2013-10-28 | (주)엔비엠 | 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도 |
US20140066837A1 (en) | 2012-07-26 | 2014-03-06 | Ronald L. Moy | Skin care compositions and methods |
KR101507207B1 (ko) * | 2012-10-05 | 2015-03-31 | 주식회사 바이오앱 | 식물에서 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 결합 도메인을 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 |
WO2014126579A1 (en) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | Syngenta Participations Ag | A method of extraction of an enzyme from plant or animal tissue |
JP6192002B2 (ja) * | 2013-03-21 | 2017-09-06 | 国立大学法人信州大学 | セルロースへの吸着材 |
US11117929B2 (en) | 2017-03-29 | 2021-09-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Purification of an agent of interest |
KR101848082B1 (ko) * | 2017-05-11 | 2018-04-12 | 주식회사 바이오앱 | 셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 |
CN111285932B (zh) * | 2018-12-10 | 2023-07-11 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法 |
CN112844170B (zh) * | 2020-12-22 | 2022-06-28 | 福建安溪铁观音集团股份有限公司 | 一种茶叶、茶梗多成分模块化同步提取生产线 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6174700B1 (en) * | 1988-07-08 | 2001-01-16 | University Of British Columbia | Purification of a polypeptide compound having a polysaccharide binding domain by affinity phase separation |
US6048715A (en) * | 1988-07-08 | 2000-04-11 | Univ. Of British Columbia | Two-phase partition affinity separation system and affinity separated cell-containing composition |
US7176298B2 (en) * | 1998-09-25 | 2007-02-13 | Clontech Laboratories, Inc. | Polynucleotides encoding metal ion affinity peptides and related products |
US6331416B1 (en) * | 1999-06-10 | 2001-12-18 | Cbd Technologies Ltd. | Process of expressing and isolating recombinant proteins and recombinant protein products from plants, plant derived tissues or cultured plant cells |
DE10035292A1 (de) * | 2000-07-18 | 2002-02-21 | Mpb Cologne Gmbh Molecular Pla | Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus Pflanzen in reiner Form |
WO2005021762A2 (en) * | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Orf Liftaekni Hf. | A process for proteolytic cleavage and purification of recombinant proteins produced in plants |
-
2004
- 2004-08-27 WO PCT/IS2004/000010 patent/WO2005021762A2/en active Application Filing
- 2004-08-27 JP JP2006524529A patent/JP4960701B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-27 CA CA002537105A patent/CA2537105A1/en not_active Abandoned
- 2004-08-27 JP JP2006524528A patent/JP2007503211A/ja active Pending
- 2004-08-27 AU AU2004269198A patent/AU2004269198B2/en not_active Ceased
- 2004-08-27 US US10/569,792 patent/US7462701B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-27 WO PCT/IS2004/000011 patent/WO2005021764A2/en active Application Filing
- 2004-08-27 US US10/569,677 patent/US7834161B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-27 AU AU2004269199A patent/AU2004269199B2/en not_active Ceased
- 2004-08-27 EP EP04770715A patent/EP1668136B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-27 CN CN2004800246167A patent/CN1852984B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-27 EP EP04770714A patent/EP1668135B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-08-27 CA CA002537102A patent/CA2537102A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1852984B (zh) | 2011-04-20 |
EP1668135A2 (en) | 2006-06-14 |
WO2005021762A2 (en) | 2005-03-10 |
CN1852984A (zh) | 2006-10-25 |
EP1668136B8 (en) | 2012-03-21 |
AU2004269199A1 (en) | 2005-03-10 |
US20070107085A1 (en) | 2007-05-10 |
JP2007503211A (ja) | 2007-02-22 |
JP2007517765A (ja) | 2007-07-05 |
CA2537105A1 (en) | 2005-03-10 |
CA2537102A1 (en) | 2005-03-10 |
EP1668136A2 (en) | 2006-06-14 |
WO2005021764A2 (en) | 2005-03-10 |
EP1668135B1 (en) | 2011-10-26 |
US7834161B2 (en) | 2010-11-16 |
WO2005021762A3 (en) | 2005-05-19 |
US20070169223A1 (en) | 2007-07-19 |
EP1668136B1 (en) | 2011-10-19 |
AU2004269198A1 (en) | 2005-03-10 |
WO2005021764A3 (en) | 2005-05-19 |
EP1668135B8 (en) | 2012-03-21 |
AU2004269198B2 (en) | 2009-07-02 |
US7462701B2 (en) | 2008-12-09 |
AU2004269199B2 (en) | 2009-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3833719B2 (ja) | 親和性基質としての油体および会合タンパク質 | |
JP4960701B2 (ja) | 組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製のためのプロセス | |
AU709141B2 (en) | Oil body proteins as carriers of high value proteins | |
Dyr et al. | Separation used for purification of recombinant proteins | |
Desai et al. | Expression and affinity purification of recombinant proteins from plants | |
US20150020238A1 (en) | Plant producing human enterokinase light chain protein and uses thereof | |
CA2384828A1 (en) | Methods for producing recombinant proteins | |
CN1842600B (zh) | 蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法 | |
KR102155449B1 (ko) | 식물에서 LysP11의 대량생산방법 및 이를 포함하는 돼지 단독증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
AU2014331926B2 (en) | Methods for separating and purifying endogenous, exogenous and recombinant proteins/peptides from plants and animals using aqueous-free, anhydrous strategies | |
KR20240083151A (ko) | 식물로부터 인유두종 바이러스 유사 입자의 생산 | |
WO2006059709A1 (ja) | 新規gstタグ配列及びその利用 | |
Hatti-Kaul et al. | 3 Downstream Processing of Proteins | |
Piché | Expression of human protein C in transgenic Nicotiana tabacum | |
Dharmadi | Recovery of enzyme byproducts during recombinant protein recovery from transgenic plants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070615 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100624 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100922 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100930 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101224 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20110915 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111018 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120223 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120323 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150330 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |