WO2006059709A1 - 新規ｇｓｔタグ配列及びその利用 - Google Patents

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WO2006059709A1
WO2006059709A1 PCT/JP2005/022165 JP2005022165W WO2006059709A1 WO 2006059709 A1 WO2006059709 A1 WO 2006059709A1 JP 2005022165 W JP2005022165 W JP 2005022165W WO 2006059709 A1 WO2006059709 A1 WO 2006059709A1
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protein
amino acid
recombinant protein
acid sequence
dartathione
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PCT/JP2005/022165
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French (fr)
Inventor
Yoshiko Katsura
Kenji Abe
Original Assignee
Cellfree Sciences Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag

Definitions

  • the present invention relates to a wheat-derived dartathione-binding tag peptide, a recombinant protein obtained by fusing the tag peptide and a desired protein, a polynucleotide encoding the same, and a wheat germ extract, The use of the polynucleotide to express the recombinant protein.
  • Glutathione-S-transferase (GST) fusion system is a system in which the target gene is incorporated in the 3'-side of the GST gene sequence on the vector in frame and expressed as a fusion protein in E. coli.
  • the pGEX vector series is commercially available (Amersham Biosciences).
  • the fusion protein is purified using affinity chromatography using a GST moiety (GST tag), and the target protein can be recovered after cleavage with a protease.
  • a GST fusion protein is bound to a carrier (for example, dartathione sepharose 4B, etc.) to which DALTHATHION, which is a GST substrate, is bound, and the above-mentioned slag carrier is mixed with an elution buffer containing reduced DALTATHION.
  • a carrier for example, dartathione sepharose 4B, etc.
  • DALTHATHION which is a GST substrate
  • Fusion protein expression using a GST tag can also be performed using a cell-free protein synthesis system, for example, wheat germ extract.
  • a cell-free protein synthesis system for example, wheat germ extract.
  • at least six GST families with different detoxifying activities against various herbicides have been reported in plant-derived GST families (for example, Non-patent Document 1). It is not clear whether or not these plants have a low homology with GST derived from Schistosoma japonicum, which is generally used as a GST tag, and bind to dartathione.
  • Non-Patent Document 1 Dixon D. et al, The Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, No.26, pp.23930-23935
  • an object of the present invention is to identify a dartathione-binding protein inherent in a wheat germ extract and provide an efficient gene expression and purification method for a fusion protein using the protein.
  • the present inventors have found that there exists a protein (wGST) that exhibits the same behavior as a GST fusion protein when a protein expressed in a wheat germ extract is purified with a glutathione column.
  • the amino acid sequence of this protein was determined. Based on the obtained amino acid sequence, the wGST is a protein having 222 amino acids from wheat belonging to the GST family, and a gene encoding the protein cloned from the wheat cDNA library As a result of expression in a cell-free system using wheat germ extract, it was found that wGST specifically binds to the dartathione column.
  • the recombinant protein of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence.
  • a tag peptide containing and having a dartathione binding activity is fused with a desired protein.
  • the present invention provides a polynucleotide characterized by encoding the recombinant protein.
  • the tag peptide in the recombinant protein is preferably encoded by DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide can be used to prepare a recombinant protein in a cell-free protein synthesis system using a wheat germ extract.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence, and a dartathione bond
  • the recombinant protein is preferably expressed in a cell-free protein synthesis system using wheat germ extract.
  • novel GST tag sequence according to the present invention is a protein derived from wheat, it can be efficiently expressed in a cell-free system using a wheat germ extract, and can be used for purification of a fusion protein using a dartathione column. Is also suitable.
  • FIG. 1 A comparison of the amino acid sequences of wGST, which is useful in the present invention, and GST, which has been used in the past.
  • FIG. 2 shows the results of expression of wGST according to the present invention and GST-GFP used as a control experiment in a wheat germ extract and purification using dartathion oil.
  • the dartathione-binding tag peptide of the present invention is a protein wG ST present in wheat germ, and was isolated using the binding activity to the dartathione column as an index, and the partial sequence of the amino acid was determined. As a result of searching the database using the obtained partial amino acid sequence, it was found that the protein was derived from wheat belonging to the GST family (GenBank Acc. No. CAC94002, SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 1 shows the homology between the wGST sequence and GST derived from Schistosoma japonicum that is generally used as a tag.
  • the homology between these two sequences is clear whether wGST has dartathione-binding activity or not even with the sequence homology of as low as 20% in the 2Z3 region on the N-terminal side. is not.
  • the 8 amino acid residues underlined on the C-terminal side of wGST in Fig. 1 are the partial sequences determined above. Therefore, the wGST cDNA was cloned from a wheat cDNA library, expressed in a wheat germ cell-free extract, and examined for its binding to GST. In a wheat germ cell-free expression system, The expression level is high, indicating that the expression level is equivalent to that of DHFR and that the purification efficiency is equal to or higher than that of conventional GST tags. won. Therefore, by combining a desired amino acid sequence to be expressed in wGST, a fusion protein that has high expression efficiency in a barley germ extract and can be easily purified using a dartathion column is provided.
  • the recombinant protein of the present invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (wGST sequence), or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and dartathione.
  • a tag peptide having binding activity and a desired protein are fused.
  • the number of deletions, substitutions or additions of the amino acid sequence is not particularly limited as long as the tag sequence has dartathione binding activity, but is usually 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably 1 to Two.
  • the daltathione-binding tag peptide of the present invention has at least 50%, preferably 70%, 80%, 85%, 90%, 97%, 98% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid IJIJI. It may be a tag peptide having at least% homology and having dartathione binding activity.
  • the degree of protein homology can be expressed as a percentage of identity when the amino acid sequences of the two proteins are properly aligned, and the appearance of an exact match between the sequences. Means rate. Appropriate alignment between sequences for identity comparison can be determined using various algorithms, such as the BLAST algorithm (Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10).
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention.
  • “Polynucleotide” generally refers to both polyribonucleotides or polydioxyribonucleotides, which may be modified. Examples thereof include DNA, cDNA, genomic DNA, mRNA, unprocessed RNA, and fragments thereof, and their length is not particularly limited.
  • the “polynucleotide encoding the recombinant protein of the present invention” means that any nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code can be selected as long as it can encode the recombinant protein of the present invention.
  • DNAZRNA neurons may be double-stranded or single-stranded.
  • DNAZRNA neurons are DNAZRNA neurons.
  • These polynucleotides are chemically synthesized by various methods known to those skilled in the art. Alternatively, PCR can be performed by using all or part of cDNA or genomic DNA containing the polynucleotide as a cage. Thus, the polynucleotide can be amplified. It is also possible to synthesize mRNA by translating with SP6 RNA polymerase.
  • a recombinant vector can be obtained by ligating (inserting) the polynucleotide of the present invention into an appropriate vector.
  • the vector for inserting the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
  • Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24).
  • fage DNA include ⁇ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gtlO, gtl1, ⁇ ZAP, etc.).
  • animal winoles such as retrovirus or vaccinia virus and insect winoles vectors such as baculoinores can be used.
  • the recombinant vector can express the recombinant protein of the present invention using the host by transforming the host cell.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the recombinant protein of the present invention. Examples thereof include bacteria such as coliforms, Bacillus subtilis, and Syudomonas. Also, Saccharomyces cerevisiae (3 ⁇ 4accharomyces cerevisiae pombe) and animal cells such as COS cells and CHO cells. Alternatively, insect cells such as Sf9 and Sf21 can be used.
  • the recombinant protein of the present invention is preferably expressed using a cell-free protein synthesis system, particularly a wheat germ extract.
  • a cell-free protein synthesis system particularly a wheat germ extract.
  • a method for preparing such an extract is described in Madin K et al. Et al. (Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97, 559-556,), Patent No. 3255784. , JP 2000-236896, WO00Z68412, Sawasaki T. et al. Et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002), 99, 14652-14657) and the like. [Method for purifying recombinant protein of the present invention]
  • the recombinant protein of the present invention can be purified by affinity chromatography using, for example, a carrier (Dartathione 'Sepharose 4B) to which Dartathione, which is a substrate of GST, is bound via an epoxy bond. It can also be performed by a batch method, a column method, or a microspin method. Furthermore, the eluted fusion protein has a GST-tag sequence separated by a protease such as thrombin or active factor X by inserting a specific amino acid sequence between the tag peptide and the target protein in advance. It is also possible to isolate only the target protein. Reduced dartathione used for elution can be removed by a desalting column. Since the purification method of the present invention uses a GST tag peptide derived from wheat, it is particularly suitable for purification of a GST fusion recombinant protein synthesized in a cell-free system using a wheat germ extract.
  • PCR was performed under the following conditions: 98 ° C for 1 minute (1 cycle), 98 ° C for 10 seconds, 58 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes (30 cycles) ), 72 ° C for 5 minutes (1 cycle).
  • the PCR product containing the amplified cDNA was incorporated into a pEU vector whose ends were treated with restriction enzymes using EcoRV and BamHI restriction enzyme sites. This is introduced into E. coli, amplified and The curry was extracted by the SDS method and prepared by density gradient centrifugation using a salt solution. Transcription was performed using SP6 polymerase with the prepared plasmid as a saddle type. The precipitate produced during the transcription reaction was removed by centrifugation, the transcription product in the supernatant was ethanol precipitated, air-dried, and used as a translation reaction type.
  • the method for isolating intact (having germination ability) from seeds using mill, flotation, and sieve is the method of Johnston et al. (Johnston, FB et al. (1957) Nature, 179, 160-161). Improved and used. Chihoku wheat seeds (unsanitized) from Hokkaido were added to a mill (Fritsch Rotor Speed Mill pulverisette type 14) at a rate of 100 grams per minute, and the seeds were gently crushed at a rotation speed of 8000 rpm.
  • the germinated embryos were collected from the floated fraction by flotation, and the organic solvent was removed by drying at room temperature. Impurities such as seed coats mixed in this germ fraction were removed, and wheat germ was selected visually.
  • the selected wheat germ fraction is suspended in a 0.5% solution of Nodet P40 strength lye tester), and washed with an ultrasonic cleaner until the washing solution does not become cloudy. Wheat germ was purified.
  • the following wheat germ extract was prepared according to a conventional method (Erickson, A. H. et al., (1996) Methods in Enzymology, Vol. 96, pp. 38-50). The following operations were performed at 4 ° C.
  • a pure wheat straw embryo frozen in liquid nitrogen was ground in a mortar and 1 ml of the extracted solution obtained by partially modifying the method of Patterson et al. (80 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 200 mM) Potassium acetate, 2 mM magnesium acetate, 4 mM calcium chloride, 8 mM dithiothreitol, 20 kinds each containing 0.6 mM L-type amino acid) were added, and the mixture was stirred with care not to generate bubbles.
  • a translation reaction was performed by a dialysis method.
  • Dialysis (Dialysis solution: final concentration 80OD, mRNA corresponding to transcription reaction solution 500, 40 ⁇ g / 1 creatine kinase, 30mM HEPES—KOH, pH 7.8, lOOmM potassium acetate, 2.7mM magnesium acetate, 4 mM dithiothreitol, 0.4 mM spermidine, 16 mM creatine phosphate, 0.3 mM 20 amino acids, 1.2 mM ATP, 0.25 mM ⁇ ) 500; ⁇ 1, dialysate (30 mM HEPES—KOH pH 7.8, lOOmM acetic acid rhodium, 2.7mM magnesium acetate, 4mM dithiothreitol, 0.4mM spermidine, 16mM creatine acid, 0.3mM 20 amino acids, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP) , 26 °
  • a fusion protein (GFP-GST) of GST derived from Schistosoma japonicum and green fluorescent protein (GFP) was used.
  • GFP-GST fusion protein
  • the dartathione resin used here was equilibrated in advance with a phosphate buffer. After sucrose was precipitated by centrifugation and the supernatant was removed, the phosphate buffer was added and stirred gently, and the supernatant was removed again by centrifugation. This process was repeated 4 times to remove unbound protein.
  • Trit-HCl buffer (pH 8.0) / 10 mM reduced type dartathion was added to the dartathione resin precipitated in the centrifuge tube, gently stirred, centrifuged, and the supernatant was collected. After the protein recovered in the supernatant was separated by SDS-PAGE, specific binding to dartathione resin was confirmed by CBB staining.
  • lane 1 is the molecular weight marker
  • lanes 2 to 4 are the GST-GFP used as a control experiment
  • the protein in the translation reaction (lane 2), and the unbound protein recovered from the supernatant of the dartathione resin.
  • (Lane 3) and the protein eluted by adding reduced dartathione (Lane 4).
  • lanes 5-7 the wGST synthesized above is supplemented with the protein in the translation reaction solution (lane 5), the unbound protein recovered from the supernatant of dartathion resin (lane 6), and reduced dartathione. Shown is the protein (lane 7) that was eluted in a column.
  • wGST has the same or higher ability to bind to fat as GST GFP and is eluted from the fat by reduced glutathione like GST-GFP. Therefore, wGST is one In general, the GST and the purification process show the same behavior, so the possibility of being used as a tag has increased.

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Abstract

　小麦胚芽抽出液に内在するグルタチオン結合タンパク質を同定し、これを用いた融合タンパク質の効率的な遺伝子発現及び精製方法を提供する。配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオン結合活性を有するタグペプチドと、所望のタンパク質とを融合させる。

Description

明 細 書
新規 GSTタグ配列及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、小麦由来のダルタチオン結合タグペプチド、該タグペプチドと所望のタ ンパク質とを融合させた組換えタンパク質、及びこれらをコードするポリヌクレオチド、 並びに小麦胚芽抽出液中にぉ 、て組み換えタンパク質を発現させるための前記ポリ ヌクレオチドの使用等に関する。
背景技術
[0002] 組換えタンパク質の有効な発現方法の 1つに融合タンパク質の発現がある。グルタ チオン— S—トランスフェラーゼ (GST)融合システムは、 目的遺伝子をベクター上の GST遺伝子配列の 3'—側にフレームを合わせて組み込み、大腸菌内で融合タンパ ク質として発現させるシステムであり、例えば、 pGEXベクターシリーズが市販されて いる（アマシャムバイオサイエンス社)。融合タンパク質は、 GST部分 (GSTタグ）を利 用したァフィユティークロマトグラフィーの手法を用いて精製され、 目的タンパク質は プロテアーゼによって切断後、回収することができる。具体的には、 GSTの基質であ るダルタチオンを榭脂に結合させた担体 (例えば、ダルタチオンセファロース 4B等） に GST融合タンパク質を結合させ、還元型ダルタチオンを含む溶出バッファ一により 上記榭脂担体に結合した融合タンパク質を溶出させる。
[0003] また、 GSTタグを用いる融合タンパク質の発現は、無細胞タンパク質合成系、例え ば、小麦胚芽抽出液を用いて行うこともできる。し力しながら、植物由来の GSTフアミ リーには、種々の除草剤に対する解毒活性の異なる少なくとも 6種類の GSTファミリ 一が報告されている（例えば、非特許文献 1)。これらは、一般的に GSTタグとして利 用されている日本住血吸虫由来の GSTとの相同性は低ぐ植物由来の GSTのすベ て力 ダルタチオンと結合する力否かは明らかではない。
[0004] 非特許文献 1： Dixon D. et al, The Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, No.26, pp.23930- 23935
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] 一般的に、無細胞系、例えば小麦胚芽抽出液中で合成した GSTは、大腸菌等の 細胞内で合成した GSTに比べて、ダルタチオン結合担体に対する結合能力が低！、 ことが知られている。従って、本発明は、小麦胚芽抽出液に内在するダルタチオン結 合タンパク質を同定し、これを用いた融合タンパク質の効率的な遺伝子発現及び精 製方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題に鑑みて、本発明者らは小麦胚芽抽出液中で発現させたタンパク質をグ ルタチオンカラムで精製する際に GST融合タンパク質と同じ挙動を示すタンパク質（ wGST)が存在することに着目し、このタンパク質のアミノ酸配列を決定した。得られ たアミノ酸配列に基づ 、て、この wGSTが GSTファミリーに属する小麦由来の 222個 のアミノ酸力 なるタンパク質であること、及び小麦の cDNAライブラリーよりクローン 化した該タンパク質をコードする遺伝子を、小麦胚芽抽出液を用いる無細胞系で発 現させた結果、 wGSTがダルタチオンカラムに特異的に結合することを見出した。
[0007] すなわち、一つの視点において、本発明の組換えタンパク質は、配列番号 2に示す アミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダルタチオン結合活性を有するタグぺプ チドと、所望のタンパク質とを融合させたことを特徴とする。
[0008] 別の視点において、本発明は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とする ポリヌクレオチドを提供する。前記組換えタンパク質中のタグペプチドは、配列番号 1 に示す塩基配列力もなる DNAによりコードされることが好ましい。また、前記ポリヌク レオチドは、小麦胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系にお 、て組み換えタ ンパク質を調製するために使用することができる。
[0009] 本発明の他の視点において、配列番号 2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列 にお ヽて 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含 み、かつダルタチオン結合活性を有するタグペプチドと、所望のタンパク質とを融合さ せた組換えタンパク質を発現させる工程と、前記組換えタンパク質を、ダルタチオン 結合担体と接触させて該担体に吸着させる工程と、前記組換えタンパク質の吸着し た担体と還元型ダルタチオン溶液とを接触させて、前記担体から前記組換えタンパク 質を溶出する工程と、を含むことを特徴とする組換えタンパク質の精製方法が提供さ れる。前記組換えタンパク質は、小麦胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系 にお 、て発現させることが好ま U、。
発明の効果
[0010] 本発明にかかる新規 GSTタグ配列は、小麦由来のタンパク質であるため小麦胚芽 抽出液を用いた無細胞系で効率よく発現させることができ、かつダルタチオンカラム を用いる融合タンパク質の精製にも適したものである。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]本発明に力かる wGSTと従来力 用いられて 、る GSTとのアミノ酸配列を比較 して表わしたものである。
[図 2]本発明にかかる wGSTと対照実験として用いた GST— GFPを小麦胚芽抽出液 中で発現させダルタチオン榭脂を用いて精製した結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] [小麦胚芽抽出液中に存在するダルタチオン結合タグペプチドの同定]
本発明のダルタチオン結合タグペプチドは、小麦胚芽中に存在するタンパク質 wG STであって、ダルタチオンカラムへの結合活性を指標として単離し、そのアミノ酸の 部分配列を決定した。得られたアミノ酸の部分配列にっ 、てデータベース検索を行 つた結果、 GSTファミリーに属する小麦由来のタンパク質 (GenBank Acc. No.CAC94 002、配列番号 2)であることが分力つた。該 wGST配列と、一般的にタグとして利用さ れて 、る日本住血吸虫由来の GSTとの相同性を図 1に示した。図 1に示したように、 これら両配列の相同性は、 N末端側の 2Z3の領域において 20%程度と低ぐ配列 の相同性力もだけでは、 wGSTがダルタチオン結合活性を有する力否かは明らかで はない。なお、図 1の wGSTの C末端側に下線を付した 8アミノ酸残基が上記で決定 された部分配列である。そこで、小麦の cDNAライブラリーより該 wGSTの cDNAをク ローンィ匕し、小麦胚芽無細胞抽出液で発現させてその GSTとの結合性を調べたとこ ろ、小麦胚芽の無細胞発現系にお 、て発現量が高!、とされて 、る DHFRと同等の 発現量を示し、また従来の GSTタグと比べて同等以上の精製効率を有することが分 かった。従って、 wGSTに発現させたい所望のアミノ酸配列を結合することにより、小 麦胚芽抽出液中での発現効率が高ぐかつダルタチオンカラムで容易に精製可能な 融合タンパク質が提供される。
[0013] [本発明の組換えタンパク質及びポリヌクレオチド]
従って、本発明の組換えタンパク質は、配列番号 2に示すアミノ酸配列 (wGST配 列）、又は該アミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付 加されたアミノ酸配列を含み、かつダルタチオン結合活性を有するタグペプチドと、 所望のタンパク質とを融合させたものである。前記アミノ酸配列の欠失、置換若しくは 付加される個数は、該タグ配列がダルタチオン結合活性を有する限り特に限定され ないが、通常は 1〜9個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜2個である。また、 本発明のダルタチオン結合タグペプチドは、配列番号 2に示したアミノ酸配列又は当 該アミノ酸酉己歹 IJと少なくとも 50%、好ましくは 70%、 80%、 85%、 90%、 97%、 98% 以上の相同性を有し、かつダルタチオン結合活性を有するタグペプチドであってもよ い。タンパク質の相同性 (ホモロジ一）の程度は、 2つのタンパク質のアミノ酸配列同 士を適切に整列（ァライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、 当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適 切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、 BLASTアルゴリズムを用いて決定すること ができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403- 10)。
[0014] また、本発明は、上記本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関 する。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチド又はポリデォキシリボヌク レオチドの両方をいい、それらは修飾されていてもよい。例えば、 DNA、 cDNA、ゲ ノム DNA、 mRNA、未プロセッシング RNA及びそれらの断片などが挙げられ、それ らの長さは特に限定されない。「本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオ チド」とは、本発明の組換えタンパク質をコードし得る限り、遺伝暗号の縮退に基づく 任意の塩基配列を選択することができ、このようなポリヌクレオチドとしては、二本鎖で あっても一本鎖であってもよい。 DNAZRNAノヽイブリツドも含まれる。これらのポリヌ クレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。または当該ポリ ヌクレオチドを含む cDNA又はゲノム DNAの全部又は一部を铸型とした PCRによつ て当該ポリヌクレオチドを増幅することができる。さらに SP6RNAポリメラーゼにより翻 訳させて mRNAを合成することも可能である。
[0015] 本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターに連結 (挿入)することにより組換えべク ターを得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿 主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
[0016] プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pRSET、 pBR322、 pBR 325、 pUC118、 pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110、 pTP5等 )、酵母由来のプラスミド (例えば YEp 13、 YEp24、 YCp50等）などが挙げられ、ファ ージ DNAとしては λファージ（Charon4A、 Charon21A、 EMBL3、 EMBL4、 λ g tlO、 gtl l、 λ ZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウィル スなどの動物ゥイノレス、バキュロウイノレスなどの昆虫ウイノレスベクターを用いることもで きる。
[0017] 前記組換えベクターは、宿主細胞を形質転換することによって、本発明の組換えタ ンパク質を当該宿主を用いて発現させることができる。宿主としては、本発明の組換 えタンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸 菌、枯草菌、シユードモナス属等の細菌が挙げられる。また、サッカロミセス'セレビシ ェ (¾accharomyces cerevisiae八
Figure imgf000006_0001
pom be)等の酵母、さらに COS細胞、 CHO細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいは Sf 9、 Sf21等の昆虫細胞を用いることもできる。
[0018] 本発明の組換えタンパク質は、無細胞タンパク質合成系、特に小麦胚芽抽出液を 用いて発現させることが好ましい。特に、胚乳部分をほぼ完全に除去した胚芽を使用 することにより内因性の特異的阻害物質を完全に取り除き、高効率の無細胞タンパク 質合成用抽出液を使用することが好ましい。このような抽出液の調製方法は、 Madin K et al.らの報告（Madin K. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000),97, 559-556,)、 特許第 3255784号、特開 2000— 236896号、 WO00Z68412号、 Sawasaki T. et al.らの報告（Proc. Natl.Acad. Sci. USA (2002),99, 14652-14657)等に記載されてい る。 [0019] [本発明の組換えタンパク質の精製方法]
本発明の組換えタンパク質は、 GSTの基質であるダルタチオンを、例えば、ェポキ シ結合を介して結合させた担体 (ダルタチオン'セファロース 4B)を用いて、了フィニ ティークロマトグラフィーにより精製することができる。バッチ法、カラム法、又はマイク ロスピン法により行うこともできる。さらに溶出された融合タンパク質は、予めタグぺプ チドと目的タンパク質の間に特定のアミノ酸配列を挿入しておくことにより、トロンビン や活性ィ匕第 X因子等のプロテアーゼにより GST—タグ配列を切り離し、 目的とするタ ンパク質のみを単離することも可能である。溶出に用いた還元型ダルタチオンは、脱 塩カラムにより除去することができる。本発明の精製方法は、小麦由来の GSTタグべ プチドを使用して 、るため、特に小麦胚芽抽出液を用いた無細胞系で合成された G ST融合組み換えタンパク質の精製に適して 、る。
実施例 1
[0020] 以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かか る実施例により何ら限定されるものではない。
[0021] (l)wGSTタンパク質の合成
コムギの cDNAライブラリー（コムギ由来の cDNAの混合物）の中に含まれる wGST の cDNAだけを増幅するために、かつ、当該 cDNAのコムギ胚芽発現用ベクター pE U (東洋紡製)への組み込みを容易にするため センスプライマーに EcoRV認識部 位、アンチセンスプライマーに BamHI認識部位を付加したプライマーを以下の通り 5X十し 7
[0022] 5 -CCGGATATCATGGCGGGCGAGAAGGGGC-3，（センスプライマー、配列番号 4)
5 '— CGCGGATCCCTACTCGATGCCGTACTTCTTC— 3 ' (アンチセンスプライマー、 配列番号 5)
[0023] これらを用いて以下の条件で PCRを行った： 98°Cで 1分（1サイクル）、 98°Cで 10 秒、 58°Cで 1分、 72°Cで 3分（30サイクル）、 72°Cで 5分（1サイクル)。増幅された cD NAを含む PCR産物は EcoRVと BamHIの制限酵素部位を利用して、末端を制限 酵素で処理した pEUベクターに組み込んだ。これを大腸菌に導入し、増幅後、アル カリー SDS法により抽出し、塩ィ匕セシユームを用いた密度勾配遠心法により調製した 。調製したプラスミドを铸型として SP6ポリメラーゼを用いて転写を行った。転写反応 中に生成される沈澱物を遠心で除去後、上清中の転写産物をエタノール沈澱させ、 風乾後、翻訳反応の铸型とした。
[0024] ミル、浮選、篩 、を用いる種子から無傷 (発芽能を有する）の単離方法はジョンスト ンらの方法（Johnston,F.B. et al. (1957) Nature, 179, 160-161)を改良して用いた。 北海道産のチホクコムギ種子 (未消毒）を 1分間に 100グラムの割合でミル (Fritsch社 製 Rotor Speed Mill pulverisette 14型)に添カ卩し、回転数 8000rpmで種子を温和に 破砕した。篩いで粗胚芽画分 (メッシュサイズ 0. 7mm- 1. 00mm)を得た後、四塩 化炭素とシクロへキサン混液（四塩ィ匕炭素：シクロへキサン = 2. 5： 1)を用いた浮選 によって、発芽能を有する胚芽を浮上画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒 を除去した。この胚芽画分に混在する種皮等の不純物を除去し、 目視によってコムギ 胚芽を選別した。次に、選別したコムギ胚芽画分をノ-デット P40け力ライ 'テスタ社 製)の 0. 5%溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗 浄し、コムギ胚芽を純ィ匕した。
[0025] 以下のコムギ胚芽抽出液の調製は常法（Erickson,A.H. et al.,(1996) Methods in E nzymology, Vol.96, pp.38-50)に準じた。以下の操作は 4°Cで行った。液体窒素で凍 結した純ィ匕コムギ胚芽を乳鉢中で粉砕し、得た粉体 lg当たり、 1mlのパターソンらの 方法を一部改変した抽出溶液（80mMの HEPES—KOH、 pH7. 6、 200mM酢酸 カリウム、 2mM酢酸マグネシウム、 4mM塩化カルシウム、 8mMジチオスレィトール、 各 0. 6mMの L型アミノ酸 20種類を含む）を加えて、泡が発生しないように注意しな 力 攪拌した。 30kX g、 15分間の遠心によって得られる上清を胚芽抽出液として回 収し、あらかじめ溶液（40mMの HEPES— KOH、 pH7. 6、 lOOmM酢酸カリウム、 5mM酢酸マグネシウム、各 0. 3mMの L型アミノ酸 20種類、 4mMジチオスレイト一 ルで平衡化してぉ 、たセフアデックス G— 25カラム（アマシャムバイオサイエンス社製 )でゲル濾過を行った。試料の濃度は、 260nmにおける光学密度 (O. D. ) (A260) 力 170〜250A (A260/A280 = 1. 5)となるよう調製した。
[0026] 上記で調製されたコムギ胚芽抽出液を用い、透析法により翻訳反応を行った。透析 は、透析内液 (抽出液：終濃度 80OD、転写反応液 500 に相当する mRNA、 40η g/ 1クレアチンキナーゼ、 30mM HEPES— KOH、 pH7. 8、 lOOmM酢酸カリ ゥム、 2. 7mM酢酸マグネシウム、 4mMジチオスレィトール、 0. 4mMスペルミジン、 16mMクレアチンリン酸、 0. 3mM 20種類アミノ酸、 1. 2mM ATP, 0. 25mM ΘΤΡ) 500 ;ζ 1、透析外液（30mM HEPES— KOH pH7. 8、 lOOmM酢酸力リウ ム、 2. 7mM酢酸マグネシウム、 4mMジチオスレィトール、 0. 4mMスペルミジン、 1 6mMクレアチンジン酸、 0. 3mM 20種類アミノ酸、 1. 2mM ATP, 0. 25mM G TP) 5mlを用い、 26°C、 20時間行った。
[0027] (2)ダルタチオン樹脂への特異的結合試験
ダルタチオン樹脂との特異的な結合を検討するためのコントロールとして、 日本住 血吸虫由来の GSTと緑色蛍光タンパク質（GFP)との融合タンパク質（GFP - GST) を用いた。翻訳反応液の 5分の 1量のダルタチオン榭脂を翻訳反応液に添加し、室 温で 1時間、ゆるやかに混和した。ここで用いたダルタチオン榭脂は予めリン酸緩衝 液で平衡ィ匕しておいた。遠心により、榭脂を沈殿させ、上清を除去した後、リン酸緩 衝液をカ卩え、ゆるやかに攪拌し、再び、遠心により、上清を除去した。この工程を 4回 繰り返し、非結合タンパク質を除去した。遠心チューブ内で沈殿したダルタチオン榭 脂にトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0) /10mM還元型ダルタチオンを添カ卩して、ゆるやか に攪拌し、遠心後、上清を回収した。上清中に回収されたタンパク質を SDS— PAG Eで分離後、 CBB染色により、ダルタチオン樹脂への特異的結合の確認を行った。
[0028] その結果を図 2に示した。図 2においてレーン 1は分子量マーカー、レーン 2〜4は 対照実験として用いた GST— GFPにつ 、て、翻訳反応液中のタンパク質 (レーン 2) 、ダルタチオン樹脂の上清から回収された非結合タンパク質 (レーン 3)、及び還元型 ダルタチオンを添カ卩して溶出したタンパク質（レーン 4)を示す。一方、レーン 5〜7は 上記で合成した wGSTについて、翻訳反応液中のタンパク質（レーン 5)、ダルタチォ ン榭脂の上清から回収された非結合タンパク質 (レーン 6)、及び還元型ダルタチオン を添カ卩して溶出したタンパク質（レーン 7)を示す。これらの結果より、 wGSTは GST GFPと同程度以上の榭脂への結合能があり、また GST— GFPと同様に還元型グ ルタチオンによって榭脂から溶出されることが確認された。したがって、 wGSTは一 般的に用いられて 、る GSTと精製過程にぉ 、て同じ挙動を示すことから、タグとして 利用できる可能性が濃厚となった。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダルタチオン結合活 性を有するタグペプチドと、所望のタンパク質とを融合させたことを特徴とする組換え タンパク質。
[2] 請求項 1に記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
[3] 前記組換えタンパク質中のタグペプチド力 配列番号 1に示す塩基配列からなる D
NAによりコードされることを特徴とする請求項 2に記載のポリヌクレオチド。
[4] 小麦胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系にお 、て組み換えタンパク質を 調製するための請求項 2又は 3に記載のポリヌクレオチドの使用。
[5] 配列番号 2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダルタチオン結合活 性を有するタグペプチドと、所望のタンパク質とを融合させた組換えタンパク質を発現 させる工程と、
前記組換えタンパク質を、ダルタチオン結合担体と接触させて該担体に吸着させる 工程と、
前記組換えタンパク質の吸着した担体と還元型ダルタチオン溶液とを接触させて、 前記担体カゝら前記組換えタンパク質を溶出する工程と、
を含むことを特徴とする組換えタンパク質の精製方法。
[6] 前記組換えタンパク質を、小麦胚芽抽出液を用 、る無細胞タンパク質合成系にお Vヽて発現させることを特徴とする請求項 5に記載の方法。
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