JP6192002B2 - セルロースへの吸着材 - Google Patents
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(N末端):Val Ala Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile
Gly Phe Thr Gly Ser Thr Thr Cys Asp Ser
Pro Phe Val Cys Thr Val Ile Asn Ser Tyr
Tyr Tyr Gln Cys Leu:(C末端)
但し、Ala=アラニン、Asn=アスパラギン、Asp=アスパラギン酸、
Cys=システイン、Glu=グルタミン酸、Gln=グルタミン、
Gly=グリシン、Ile=イソロイシン、Leu=ロイシン、
Phe=フェニルアラニン、Pro=プロリン、Ser=セリン、Thr=トレオニン
Trp=トリプトファン、Tyr=チロシン、Val=バリン
(5′末端):gtc gct gag tgg gga caa tgt ggt ggt atc
ggc ttc act ggc tct acc acg tgt gac tct
ccc ttt gtc tgc acg gtc atc aac agc tac
tac tat cag tgc ttg:(3′末端)
但し、a=アデニン、c=シトシン、g=グアニン、t=チミン
図1は、セルロースに吸着したタンパク質の電気泳動解析結果を示す説明図である。なお、図1において、1は培養液の結果、2は非吸着画分、3は吸着したタンパク質を4℃で溶出させた画分、4は吸着したタンパク質を37℃で溶出させた画分、5は3および4の条件でも溶出しなかった画分である。Mは分子量マーカー、矢印は、本発明において吸着材として利用される結合モジュールを含むタンパク質(IpxXyn10B)のバンドである。
図2は、IpxXyn10Bの全体のアミノ酸配列を他菌(Trichoderma reesei Xylanase 3 [TrXyn3]、Agaricus bisporus Xylanase1 [Xyl1]、Penicillium citrinum Xylanase B [peniXynB])由来のキシラナーゼのアミノ酸配列と比較した説明図である。図2には、糸状菌由来のGH10に属するキシラナーゼのアミノ酸配列を1文字表記で表してあり、最上列がIpxXyn10Bであり、1段目にCBM1が存在する。2〜5段目は、触媒領域に相当し、他菌由来の酵素とアミノ酸配列が類似している。なお、黒く塗りつぶした箇所は、共通するアミノ酸残基を示す。図3は、CBM1をもつ酵素が対象材料に吸着している様子を模式的に示す説明である。なお、IpxXyn10Bが有するCBM1をIpxXyn10B-CBM1と略す。
図4は、IpxXyn10B-CBM1の遺伝子配列(塩基配列)およびアミノ酸配列を示す説明図である。図5は、IpxXyn10B-CBM1のアミノ酸配列とその他既知の酵素(Ex-1、Ex-4、En-1、EG-1、CBHII、Xylanase、Xyn-1、Xy1D、Man5D)のCBM1のアミノ酸配列とを整列させて比較した説明図である。なお、図5においては、チロシン(芳香族アミノ酸)を「Y」で示し、トリプトファン(芳香族アミノ酸)を「W」で示してある。
IpxXyn10B-CBM1(W-YYY型)、および通常のCBM1(アラゲカワラタケ由来EG1のCBM1/W-YY型)に緑色蛍光タンパク質(GFP)を連結した融合タンパク質を遺伝子操作によって作製し、各CBM1のセルロースへの吸着量を蛍光強度から測定した。その結果を図6に示す。図6は、各CBM1の吸着量の測定結果を示すグラフである。なお、図6において、黒丸および線L1はIpxXyn10B-CBM1の結果を示し、黒四角および線L2は通常のCBM1の結果を示す。また、白三角および線L3は、IpxXyn10B-CBM1に特徴的なアミノ酸残基(W-YYY型のY)を遺伝子操作によってS(Ser)に変化させたW-YYS型の変異体(IpxXyn10B-CBM1/Y52S)の結果を示す。
図7は、各CBM1の立体構造を模式的に示す説明図であり、図7(a)、(b)は、IpxXyn10B-CBM1の説明図、および通常のCBM1の説明図である。
IpxXyn10B-CBM1は、まず、組換えタンパク質のタグとして利用することができる。より具体的には、従来のヒスチジン系のタグや、GST(Glutathione S-transferase)系のタグのように、タンパク質の末端にIpxXyn10B-CBM1を遺伝子工学技術で連結させることで、目的タンパク質の検出、精製、セルロースへの担持・結合が可能になる。この場合、ヒスチジン系のタグでは、特殊で高価な担体(樹脂)や溶液を用いて吸着と脱離を行う必要があるという欠点を有していたが、IpxXyn10B-CBM1を利用したタグは、安価なセルロースを担体とし、高塩濃度で吸着し、水で簡単に溶出が可能であるという利点を有する。
Claims (6)
- 結合モジュールの立体構造上において、同一表面上に配置されたトリプトファンからなる第1芳香族アミノ酸、チロシンからなる第2芳香族アミノ酸、およびチロシンからなる第3芳香族アミノ酸と、該第3芳香族アミノ酸と隣り合うチロシンからなる第4芳香族アミノ酸とを備えた結合モジュールを備え、前記結合モジュールは、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とするセルロースへの吸着材。
(N末端):Val Ala Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile
Gly Phe Thr Gly Ser Thr Thr Cys Asp Ser
Pro Phe Val Cys Thr Val Ile Asn Ser Tyr
Tyr Tyr Gln Cys Leu:(C末端)
但し、Ala=アラニン、Asn=アスパラギン、Asp=アスパラギン酸、
Cys=システイン、Glu=グルタミン酸、Gln=グルタミン、
Gly=グリシン、Ile=イソロイシン、Leu=ロイシン、
Phe=フェニルアラニン、Pro=プロリン、Ser=セリン、Thr=トレオニン
Trp=トリプトファン、Tyr=チロシン、Val=バリン - 前記ポリペプチドは、以下の塩基配列を備えた遺伝子によってコードされることを特徴とする請求項1に記載のセルロースへの吸着材。
(5′末端):gtc gct gag tgg gga caa tgt ggt ggt atc
ggc ttc act ggc tct acc acg tgt gac tct
ccc ttt gtc tgc acg gtc atc aac agc tac
tac tat cag tgc ttg:(3′末端)
但し、a=アデニン、c=シトシン、g=グアニン、t=チミン - 組換えタンパク質のタグとして用いられることを特徴とする請求項1または2に記載のセルロースへの吸着材。
- セルロースの酵素分解性の制御に用いられることを特徴とする請求項1または2に記載のセルロースへの吸着材。
- セルラーゼに前記結合モジュールが付加されていることを特徴とする請求項1または2
に記載のセルロースへの吸着材。 - 蛍光タンパク質に前記結合モジュールが付加されていることを特徴とする請求項1または2に記載のセルロースへの吸着材。
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