DE10035292A1 - Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus Pflanzen in reiner Form - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus Pflanzen in reiner Form

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DE10035292A1 DE2000135292 DE10035292A DE10035292A1 DE 10035292 A1 DE10035292 A1 DE 10035292A1 DE 2000135292 DE2000135292 DE 2000135292 DE 10035292 A DE10035292 A DE 10035292A DE 10035292 A1 DE10035292 A1 DE 10035292A1
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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten nativen oder rekombinanten Proteins aus einer Pflanze in reiner Form, wobei nach Gewinnung eines Rohextrakts mittels eines geeigneten Extraktionsmittels das gewünschte Protein über Ionenaustausch-Chromatographie in "Expanded bed"-Technologie aus dem Rohextrakt aufgereinigt wird, wobei es sich bei dem gewünschten Protein beispielsweise um Napin, Napin-ähnliches 2S Albumin, Cruciferin, Legumin-ähnliches 11S Globulin oder einen rekombinanten scFv-Antikörper handelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten nativen oder rekombinanten Proteins aus einer Pflanze in reiner Form, wobei nach Gewinnung eines Rohextrakts mittels eines geeigneten Extraktionsmittels das gewünschte Protein über Ionenaustausch-Chromatographie in "Expanded bed"-Technologie aus dem Rohextrakt aufgereinigt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Napin, Napin­ ähnlichem 2S Albumin, Cruciferin, Legumin-ähnlichem 11S Globulin oder einem rekombinanten scFv-Antikörper verwendet.
Pflanzliche Proteine sind ein bisher kaum genutztes Reservoir nachwachsender Rohstoffe. In besonders großen Mengen fallen pflanzliche Speicherproteine z. B. bei der Ölproduktion aus Raps, Sonnenblumen und anderen Ölpflanzen, oder aus Lupinen bzw. auch bei anderen landwirtschaftlichen Prozessen an. Zumeist werden sie als Abfallprodukt in die Tierfütterung gegeben, da keine reinen und damit technisch verwertbaren Komponenten mit technisch und wirtschaftlich einsetzbaren Methoden erhältlich sind. Andere pflanzliche Proteine kommen in geringeren Mengen vor, sind aber von ihrer Funktionalität her äußerst interessant. Bisher sind allerdings nur wenige pflanzliche Proteine einer wirtschaftlichen Nutzung zugeführt worden. Dies ist u. a. durch aufwendige und damit unwirtschaftliche, aber auch nicht für einen größeren Maßstab geeignete Reinigungsverfahren bedingt. Demgegenüber stehen die äußerst interessanten Eigenschaften, z. B. isolierter pflanzlicher Speicherproteine für verschiedene Anwendungsbereiche. Die beiden vorherrschenden Speicherproteine in Raps, Napin und Cruciferin, die technisch bisher nur als Rohproteinfraktion gewonnen werden konnten, eignen sich z. B. aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften als isolierte Komponenten für Verwendungen als Schäume oder Klebstoffe (Napin) oder für die Folienherstellung (Cruciferin). Weiterhin sind sie aufgrund dieser Eigenschaften ebenfalls für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie geeignet, z. B. als Schäumer und Stabilisatoren.
Bisher wurden lediglich Fällungs- und Extraktionsverfahren eingesetzt, um Rohproteinfraktionen oder angereicherte Verbindungen in technischem Maßstab gewinnen zu können. In diesem Zusammenhang wird auf die US-Patente Nr. 4370267 und 4368151 verwiesen, in denen die Anreicherung einer pflanzlichen Speicherproteinkomponente nach isoelektrischer Fällung durch Extraktion unter geeigneten Bedingungen beschrieben wird. Alle diese Verfahren zeichnen sich durch eine geringe Effizienz aus. Außerdem sind auf diesen Wegen keine Reinkomponenten, sondern lediglich angereicherte Fraktionen erhältlich und zumeist können solche Verfahren nur auf die Gewinnung einer einzigen Komponente aus einem Proteingemisch hin optimiert werden. Reinere Substanzen konnten bisher lediglich in komplizierten, eine Kombination einer Vielzahl von unterschiedlichen. Reinigungsgschritten beinhaltenden Prozessen im Labormaßstab gewonnen werden, z. B. 12S Globuline aus Raps durch eine Kombination aus Fällung, Dialyse, Gelchromatographie und Anionenaustausch- Chromatographie.
Weiterhin entwickeln sich durch das "Molecular Farming" (Fremdproteinproduktion in transgenen Pflanzen) neue Anwendungsgebiete für Protein-Werk- und -Wirkstoffe, für die technisch und wirtschaftlich effiziente Reinigungsverfahren, auch in großtechnischem Maßstab, notwendig sind. Während die Produktion von therapeutisch wertvollen. Proteinen zumeist hohe Gewinnspannen zuläßt, ist dies für "Massenproteine", z. B. Serumproteine, oder Diagnostika sowie für technisch einsetzbare Proteine nicht der Fall. Hierfür sind demzufolge umsomehr robuste, einfach skalierbare und wirtschaftlich effiziente Verfahren zur Proteinaufreinigung aus pflanzlichem Gewebe notwendig.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, ein Reinigungsverfahren für Proteine aus Pflanzen zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nicht aufweist, d. h. vor allem einfach, effizient und in großtechnischem Maßstab durchführbar ist und außerdem gewährleistet, daß die gewünschten Proteine eine hohe Reinheit aufweisen und damit vorzugsweise weitere Reinigungsschritte nicht erforderlich sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sowohl native als auch rekombinante Proteine aus pflanzlichem Gewebe mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, das einen Extraktionsschritt und eine nachfolgende selektive Adsorption an Kationen- und Anionenaustauscher in der "Expanded bed"-Technologie umfaßt, mit hoher Effizienz in Reinstoffe aufgetrennt bzw. als Reinstoffe isoliert werden können. Hierbei hat sich gezeigt, daß der Reinheitsgrad der Proteine so hoch ist, daß auch eine wirtschaftlich konkurrenzfähige Produktion neuer Proteinwerkstoffe im Vergleich zu auf fossilen Rohstoffen basierender Kunststoffproduktion ermöglicht wird. Ferner hat sich gezeigt, daß die ansonsten notwendigen Vorbehandlungsschritte, wie Entfettung von ölhaltigem Saatgut, oder Vorfällungsschritte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht notwendig sind, jedoch gegebenenfalls damit kombiniert werden können. Des weiteren hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren in großtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann. Dies wurde u. a. durch die Trennung von Napin (Albumin) und Cruciferin (Globulin) aus Rapssamen gezeigt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch geeignet ist, Fremdproteine, z. B. scFv-Antikörper, aus transgenen Pflanzen zu isolieren und zu reinigen. Es wird auf die nachstehenden Beispiele verwiesen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten nativen oder rekombinanten Proteins aus einer Pflanze in reiner Form, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • a) Aufschluß der Pflanze zur Gewinnung eines Rohextrakts mittels eines geeigneten Extraktionsmittels; und
  • b) Abtrennung des gewünschten Proteins über Ionenaustausch- Chromatographie in "Expanded bed"-Technologie, wobei die Bindung des Rohextrakts bei einem definierten pH-Wert erfolgt.
Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren nur die Schritte (a) und (b), d. h. es sind keine Vorbehandlungs- und/oder weitere Reinigungsschritte insbesondere solche, die auf spezifischen physikochemischen Charakteristika des gewünschten Proteins, z. B. Molekulargewicht, Sedimentationskoeffizient, pI-Wert, basieren, notwendig. Vorbehandlungs- und/oder Reinigungsschritte können jedoch gegebenenfalls angefügt werden.
Geeignete Verfahren zum Aufschluß der Pflanze sind dem Fachmann bekannt und dieser kann entsprechend dem gewünschten Protein und der verwendeten Pflanze geeignete Aufschlußverfahren auswählen. Diese können z. B. eine Homogenisierung, wie in einem Mahlwerk oder Mixer, und/oder eine Lyse mit geeigneten Lysemitteln umfassen. Es wird auf die nachstehenden Beispiele verwiesen.
Der Fachmann kennt auch geeignete Extraktionsmittel und wählt diese u. a. entsprechend den bekannten Eigenschaften des gewünschten Proteins aus. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Extraktionsmittel um eine wäßrige Lösung, insbesondere Phosphatpuffer, TRIS-Puffer, MOPS-Puffer oder ein ethanolisches Extraktionsmittel. Gegebenenfalls erfolgt in dem erfindungsgemäßen Verfahren vor oder nach dem Extraktionsschritt ein Denaturierungs- und evtl. Renaturierungsschritt, falls das gewünschte Protein in unlöslicher Form vorliegen sollte. Geeignete Denaturierungsverfahren und Renaturierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und dieser kennt auch die Bedingungen, die erforderlich sind, daß bei diesen Verfahren das gewünschte Protein seine biologische Aktivität nicht verliert bzw. diese wiedergewinnt.
Erfindungsgemäß wird eine Ionenaustausch-Chromatographie in "Expanded bed"-Technologie durchgeführt, um das gewünschte Protein zu reinigen. Bei der "Expanded bed"-Technologie handelt es sich um ein sehr robustes Verfahren, bei dem keine organischen Lösungsmittel oder sonst notwendigen hohen Salzmengen benötigt werden. Außerdem ist die "Expanded bed"- Technologie leicht in den großtechnischen Maßstab übertragbar und benötigt keine aufwendige Apparatetechnik. Die Adsorbentien zeigen keine Anzeichen von "Fouling", so daß lange Standzeiten der Chromatographie-Säulen gewährleistet sind. Ergänzend wird auf Straetkvern et al., Bioseparation 7 (1999), 333-345 verwiesen. Erfindungsgemäß wird allerdings die "Expanded bed"-Technologie nicht in Zusammenhang mit Affinitäts-Chromatographie sondern, zum ersten Mal, mit Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt. Je nach den bekannten Eigenschaften des gewünschten Proteins, z. B. hinsichtlich des pI-Wertes, wird für das erfindungsgemäße Verfahren entweder eine Anionenaustausch- oder Kationenaustausch-Chromatographie durchgeführt. Von diesen Eigenschaften hängt auch die Wahl des definierten pH-Werts für die Bindung des Proteins an das Chromatographie-Material (Beladung) ab. Der Fachmann wählt z. B. den pH-Wert anhand des pI-Wertes des gewünschten Proteins aus, wobei der pI-Wert entweder aus der Proteinsequenz berechnet oder mittels isoelektrischer Fokussierung bestimmt werden kann. Günstig ist es, wenn der pH-Wert so gewählt wird, daß das gewünschte Protein eine Oberflächenladung mit entgegengesetztem Vorzeichen zur Hauptkontamination hat und der Fachmann wird dann das zur Oberflächenladung des gewünschten Proteins passende Sorbens, d. h. einen Kationen- bzw. Anionenaustauscher auswählen. Jedenfalls ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Einstellung eines definierten pH-Werts, so daß die in dem Extrakt enthaltenen Proteinkomponenten eines Rohproteingemisches selektiv an das vorgegebene Chromatographie-Material gebunden werden können, von entscheidender Bedeutung. Damit ist z. B. die Aufreinigung von zwei oder mehreren Proteinkomponenten, deren pI-Werte sich ausreichend unterscheiden, aus einem Gemisch möglich.
Der hier verwendete Ausdruck "in reiner Form" bedeutet, daß das Protein im wesentlichen frei von Verunreinigungen ist, vorzugsweise eine Reinheit von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens 95%, noch mehr bevorzugt von mindestens 98% und am meisten bevorzugt von mindestens 99% aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Reinigung eines gewünschten Proteins aus einer Pflanze jeder beliebigen Pflanzenspezies, d. h. es kann sowohl eine monokotyle als auch eine dikotyle Pflanze sein. Der Ausdruck "Pflanze" umfaßt auch Gramineen, Chenopodien, Leguminosen, Brasicaceen, Solanaceen, Pilze, Moose und Algen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, z. B. um Pflanzen, wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen, Flachs, Erbse, Bohne, Lupine, Tabak und Kartoffel.
Für die Gewinnung des Proteins kann jedes Pflanzenteil bzw. Gewebe der Pflanze verwendet werden, wobei die Auswahl entsprechend der unterschiedlicher. Konzentration des gewünschten Proteins in den einzelnen Pflanzenteilen bzw. - Geweben erfolgt. Vorzugsweise wird das gewünschte Protein aus Samen, Blättern, Knollen, Wurzelstücken, Säumlingen, Stecklingen, etc. gewonnen, wobei Kartoffelknollen besonders bevorzugt sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewünschte Protein aus einem Speicherproteingemisch gewonnen. Beispiele für Speicherproteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert und gereinigt werden können, sind Napin, Cruciferin, Patatin, Legumin und Vicillin.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Bindung des gewünschten Proteins an das Ionenaustauschermaterial bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9, am meisten bevorzugt erfolgt eine Elution des gewünschten Proteins mit einem NaCl enthaltenden Puffer definierter Molarität oder mittels eines NaCl- Gradienten. Der Fachmann kann die optimalen Elutionsbedingungen anhand der bekannten Charakteristika des gewünschten Proteins und/oder durch Vorversuche im Labormaßstab ermitteln.
Entsprechend des pI-Wertes des gewünschten Proteins wählt der Fachmann eine (a) Anionenaustausch-Chromatographie oder (b) Kationenaustausch-Chromatographie, wobei für (a) vorzugsweise ein Chromatographiematerial mit den Eigenschaften von Streamline DEAE™ oder Streamline QXL (Amersham Pharmacia, Upsala, Schweden) gewählt wird und für (b) vorzugsweise Streamline SP XL™ (Amersham Pharmacia).
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt u. a. die Isolierung und Reinigung von nativen Proteinen, z. B. Napin, Napin-ähnliche 2S Albumin-Proteine, Cruciferin und Legumin-ähnliche 11S Globulin-Proteine aus pflanzlichen Samen. Bei den Napin- ähnlichen Proteinen handelt es sich um Proteine mit einem isoelektrischen Punkt, der bei 8,0 oder darüber liegt, einer Molmasse zwischen 10 und 20 kDa und einer Zusammensetzung aus zwei heterodimeren Untereinheiten (α- und β-Ketten), die über eine oder mehrere Disulfidbrücken verknüpft sind. Legumin- ähnliche 11S Globulin-Proteine sind durch einen isoelektrischen Punkt zwischen 4,0 und 8,0 charakterisiert, einer Molmasse zwischen 250 und 400 kD und einer Zusammensetzung als Hexamere aus Untereinheiten, die jeweils aus einer α- und β-Untereinheit zusammengesetzt sind, die wiederum über eine oder mehrere Disfuldbrücken verknüpft sind. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind somit die gewünschten zu isolierenden Proteine Napin, Napin-ähnliche 2S Albumin- Proteine, Cruciferin und Legumin-ähnliche 11S Globuline, die z. B. unter den in dem nachstehenden Beispiel 1 angegebenen Bedingungen aus nicht-entfettetem Rapssamen isoliert und gereinigt werden können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können z. B. die Proteine Napin und Cruciferin aus demselben Rohextrakt isoliert und aufgereinigt werden, wobei durch Variation des pH-Wertes die Oberflächenladungen der Proteine so eingestellt werden, daß jeweils nur eine der beiden Hauptkomponenten (Napin und Cruciferin) eines wässrigen Rapssamenextraktes selektiv mit An- bzw. Kationenaustauschern wechselwirkt. Somit kann eine effiziente adsorptionschromatographische Trennung erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt alternativ auch die Isolierung und Reinigung von rekombinanten Proteinen, vorzugsweise von scFv-Antikörpern, die z. B. wie in den nachstehenden Beispielen 2 bis 4 angegeben, isoliert und gereinigt werden können, bei denen ein wäßriger Extrakt von Kartoffelblättern hergestellt wurde, der dann ohne Fällungs- oder andere Vorreinigungsschritte in ein "Expanded bed"- Verfahren eingeleitet wurde.
Insgesamt gesehen zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber herkömmlichen Verfahren in vielerlei Hinsicht aus. Vor allem sind seine Einfachheit, technische Skalierbarkeit ohne hohen Apparate-Aufwand, die Robustheit der Säulenmaterialien, der mögliche Verzicht auf eine Entölung ölhaltiger Pflanzengewebe, wie Samen, und auf umfangreiche Vorbehandlungsschritte vor dem Auftrag des wäßrigen Extrakts auf das Chromatographie-Material und die erzielbare hohe Reinheit der nativen bzw. rekombinanten Proteine und damit deren Verfügbarkeit zu wirtschaftlich günstigen Bedingungen. Desweiteren kann die Reihenfolge der Isolierung von mehreren Proteinen aus demselben Proteingemisch unter Beachtung der physikochemischen Charakteristika der jeweiligen Proteine beliebig gewählt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1: Ergebnisse der SDS-PAGE des nach Beispiel 1(A) gereinigten Napin
Es wurde ein 10% Novex-Gel der Fa. Invitrogen (Groningen, NL) eingesetzt; Laufpuffer: MES, Färbung: Coomaassie Brilliant Blue. In den Spuren 1 und 2 sind die Waschfunktionen mit 150 mM NaCl von der Streamline SP XL™-Säule gezeigt. Spur 3 ist der SDS-7 Molekulargewichtsmarker der Fa. Sigma (Deisenhofen, Deutschland). Die Spuren 4-7 zeigen gereinigtes Napin in den Elutionsfraktionen (Peakspitze und Peakschulter).
Fig. 2: Ergebnisse der SDS-PAGE des nach Beispiel 1(B) gereinigten Cruciferin
Es wurde ein 10% Novex-Gel der Fa. Invitrogen (Groningen, NL) eingesetzt; Laufpuffer: MES, Färbung: Coomaassie Brillant Blue. Die Spur 1 zeigt den Durchlauf der Streamline DEAE Säule, die Spur 2 ist der SDS-7 Molekulargewichtsmarker der Fa. Sigma (Deisenhofen). Die Spuren 3-5 zeigen gereinigtes Cruciferin in den Elutionsfraktionen (Peakspitze und Peakschulter).
Fig. 3: Ergebnisse der SDS-PAGE des nach Beispiel 2 gereinigten scFv-Antikörpers
SDS-Page aus transgenen Kartoffelblättern. Es wurde ein 10% Novex-Gel der Fa. Invitrogen (Groningen, NL) eingesetzt; Laufpuffer: MES, Färbung: Silber. Die Spur 1 zeigt den Blattextrakt, die Spur 2 den Durchlauf der Streamline QXL Säule, die Spur 3 das Eluat aus der Streamline Q XL Säule, die Spur 4 ist die Waschfraktion mit 0,5 M NaCl. Die Spur 5 ist der SDS-7 Molekulargewichtsmarker der Fa. Sigma (Deisenhofen).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Aufreinigung von Napin und Cruciferin aus nicht-entöltem Rapssamen (A) Extraktion
Rapssamen (100 g) wurden in einem Mahlwerk auf mittlerer Mahlstärke vermahlen und mit der fünffachen Menge an Puffer (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5) extrahiert. Dazu wurde die Mischung etwa 30 min. gerührt und anschließend wurden die festen Anteile abzentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstands in ein Sammelgefäß wurde der Niederschlag mit der gleichen Puffermenge wie zuvor ein zweites Mal extrahiert und wie vorstehend beschrieben weiterverarbeitet. Die vereinigten Flüssigphasen wurden auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und dann direkt der Fließbettadsorption ("Expanded bed"- Technologie) zugeführt.
(B): Gewinnung von Napin
Aus dem Rapssamenextrakt wurde zunächst Napin an einen starken Kationenaustauscher (Streamline SP XL™; Amersham Pharmacia, Uppsala, Schweden) adsorbiert. Dazu wurde die Flüssigphase mit einem Fluß von 200 cm/Std. durch das äquilibrierte Fließbett gepumpt. Es wurde eine Streamline 25 Säule mit einem Bett von 2,5 × 11,5 cm = 56,5 ml verwendet. Anschließend wurde im expandierten Zustand (durch das Ausströmen dehnt sich das Bett aus, bei 200 cm/h ca. zweifach) mit 10 Säulenvolumina Ladungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5) gewaschen. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden im sedimentierten Zustand des Betts durchgeführt. Das Bett wird jetzt nicht mehr von unten, sondern von oben angeströmt, so daß es auf die ursprüngliche Betthöhe von 11,5 cm zurückkehrt. Zunächst wurde mit 3 Säulenvolumina Waschpuffer (20 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl) gewaschen, danach erfolgte die Elution mit Elutionspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,5 M NaCl). Das damit gereinigte Napin wurde mit dem Fachmann bekannten Verfahren entsalzt und lyophilisiert. Die Säule wurde anschließend durch Waschen mit je 3 Säulenvolumina 0,2 M NaOH und 0,2 M HCl regeneriert.
(C): Gewinnung von Cruciferin
Aus dem Durchlauf der Napin-Adsorption aus (B) wurde das Cruciferin durch "Expanded bed"-Adsorption gewonnen. Die Durchlauffraktion aus (B) wurde auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und an einen Anionenaustauscher (Streamline DEAE™; Amersham Pharmacia) adsorbiert. Dazu wurde die Flüssigphase mit einem Fluß von 200 cm/Std. durch das äquilibrierte Fließbett gepumpt (Säulenvolumen: 2,5 × 11,5 cm = 56,5 ml). Anschließend wurde im expandierten Zustand mit 10 Säulenvolumina Ladungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 8,5) gewaschen. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden im sedimentierten Zustand des Betts durchgeführt. Zunächst wurde mit 3 Säulenvolumina Ladungspuffer gewaschen, danach erfolgte die Elution mit Elutionspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,2 M NaCl). Das damit gereinigte Cruciferin wurde mit dem Fachmann bekannten Verfahren entsalzt und lyophilisiert. Die Säule wurde anschließend durch Waschen mit je 3 Säulenvolumina 0,5 M NaCl und 0,2 M HCl regeneriert.
(D): Bestimmung der Reinheit der in (B) und (C) gewonnenen Proteine
Die gereinigten Speicherproteine Napin und Cruciferin wurden einer Reinheitsanalyse mittels SDS-PAGE unterzogen (siehe Fig. 1 für Napin und Fig. 2 für Cruciferin). In beiden Fällen beträgt die Reinheit der Proteine 99%.
Beispiel 2 Isolierung von rekombinanten scFv-Antikörpern aus transgenen Kartoffelblättern
Transgene, mit einem einen scFv-Antikörper kodierenden Vektor transformierte Kartoffelblätter wurden im Verhältnis 1 : 1 (Masse : Volumen) mit 20 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) gemischt und in einem "Warring-Blender" 3 × 6 Sekunden homogenisiert. Der erhaltene grüne Saft wurde durch Zentrifugation (15 min. 10000 UpM) von Partikeln befreit, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit einem Fluß von 200 cm/Std. durch das äquilibrierte (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0) Fließbett ("Expanded bed") gepumpt (Säulenvolumen: 2,5 × 11,5 cm = 56,5 ml). Die Adsorption erfolgte an Streamline Q XL™ (Amersham Pharmacia). Nach dem Beladen wurde im expandierten Zustand mit 10 Säulenvolumina Ladungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) und 3 Säulenvolumina Ladungspuffer im sedimentierten Zustand des Betts gewaschen, danach erfolgte die Elution der scFv-Antikörper unter Verwendung eines linearen Salzgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0. Die gereinigten Antikörper wurden mit dem Fachmann bekannten Verfahren entsalzt und lyophilisiert. Über SDS-PAGE konnte nachgewiesen werden, daß die Hauptproteinkomponente der Blätter, Ribulosebiphosphat- Carboxylase, vollständig in einem Schritt abgetrennt und Antikörper mit einer Reinheit von 90% erhalten werden konnten (Fig. 3).
Beispiel 3 Isolierung von rekombinanten scFv-Antikörpern aus transgenem Rapssamen
Rapssamen (100 g) wurden wie in Beipiel 1 beschrieben homogenisiert und mit der fünffachen Menge an Puffer (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5) extrahiert. Dazu wurde die Suspension 15 Min. gerührt. Nach Dekantieren der Flüssigphase wurde die Extraktion in der beschriebenen Weise einmal wiederholt. In den vereinigten Flüssigphasen wurde der pH-Wert auf 7,5 eingestellt und diese wurden dann mit einem Fluß von 200 cm/Std. durch das äquilibrierte (20 mM Phosphatpuffer, pH- Wert 7,5) Fließbett ("Expanded bed") gepumpt (Säulenvolumen: 2,5 × 11,5 cm = 56,5 ml). Die Adsorption erfolgte an Streamline Q XL™ (Amersham Pharmacia). Nach dem Beladen wurde im expandierten Zustand mit 10 Säulenvolumina Ladungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pM 7.0) und 3 Säulenvolumina Ladungspuffer im sedimentierten Zustand des Betts gewaschen, danach erfolgte die Elution der scFv-Antikörper mit 6 Säulenvolumina Waschpuffer (Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5) mit 0,5 M NaCl. Die hochgereinigten scFv-Antikörper wurden mit dem Fachmann bekannten Verfahren entsalzt und lyophilisiert.
Beispiel 4 Isolierung von rekombinanten scFv-Antikörpern aus entfettetem transgenem Rapssamen
Rapssamen (100 g) wurden mit dem Fachmann bekannten Verfahren zerkleinert und schonend mit Hexan entfettet. Nach der Hexan- Behandlung wurden die Samen pulverisiert. Das Samenpulver wurde mit der fünffachen Masse an Puffer (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5) extrahiert. Dazu wurde die Suspension 15 Min. gerührt. Nach Dekantieren der Flüssigphase wurde die Extraktion in der beschriebenen Weise einmal wiederholt. In den vereinigten Flüssigphasen wurde der pH-Wert auf 7,5 eingestellt und dann mit einem Fluß von 200 cm/Std. durch das äquilibrierte (20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5) Fließbett ("Expanded bed") gepumpt (Säulenvolumen: 2,5 × 11,5 cm = 56,5 ml). Die Adsorption erfolgte an Streamline Q XL™ (Amersham Pharmacia). Nach dem Beladen wurde im expandierten Zustand mit 10 Säulenvolumina Ladungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5) und 3 Säulenvolumina Ladungspuffer im sedimentierten Zustand des Betts gewaschen, danach erfolgte die Elution der scFv-Antikörper mit 6 Säulenvolumina Ladungspuffer mit 0,5 M NaCl. Die hochgereinigten scFv- Antikörper wurden mit dem Fachmann bekannten Verfahren entsalzt und lyophilisiert.

Claims (14)

1. Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten nativen oder rekombinanten Proteins aus einer Pflanze in reiner Form, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • a) Aufschluß der Pflanze zur Gewinnung eines Rohextrakts mittels eines geeigneten Extraktionsmittels; und
  • b) Abtrennung des gewünschten Proteins über Ionenaustausch-Chromatographie in "Expanded-Bed"- Technologie, wobei die Bindung des Rohextrakts bei einem definierten pH-Wert erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine Graminee, eine Chenopodie, eine Leguminose, eine Brassicacee, eine Solanacee, ein Pilz, ein Moos oder eine Alge ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei dpe Pflanze Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Raps, Senf, Rübsen, Flachs, Erbse, Bohne, Lupine, Tabak oder Kartoffel ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das gewünschte Protein aus Samen, Blättern, Knollen, Wurzelstöcken, Sämlingen oder Stecklingen gewonnen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das gewünschte Protein aus einem Speicherproteingemisch gewonnen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Extraktionsmittel Phosphatpuffer, TRIS-Puffer, Mops- Puffer oder ein ethanolisches Extraktionsmittel ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei bei Schritt (b) der pH-Wert im Bereich von 7, 5 bis 9,0 liegt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in Schritt (b) die Elution des gewünschten Proteins mit einem NaCl enthaltenden Puffer definierter Molarität, mittels eines NaCl-Gradienten oder durch Veränderung des pH-Wertes erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Ionenaustausch-Chromatographie eine Anionenaustausch- Chromatographie ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Material für die Anionenaustausch-Chromatographie Streamline DEAE™ oder Streamline QXL ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Ionenaustausch-Chromatographie eine Kationenaustausch- Chromatographie ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Material für die Kationenaustausch-Chromatographie Streamline SP XL™ ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das gewünschte Protein Napin, Napin-ähnliches 2S Albumin, Cruciferin oder Legumin-ähnliches 11S Globulin ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das gewünschte Protein ein scFv-Antikörper ist.
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