CN104448004A - 一种融合抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合抗菌肽及其制备方法，根据抗菌肽YFGAP的氨基酸序列，优化设计其基因序列，连接至pUC19得到pUC19-YFGAP；将pUC19-YFGAP连接至pET-22b-S-ELPs得到pET-22b-YSELP；将pET-22b-YSELP转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP；接种，培养，加入IPTG诱导YSELP的表达。本发明的融合抗菌肽YSELP不需要从标签蛋白上切下即可对多种测试菌株具有抑制作用，且对宿主菌本身没有杀伤力，有望解决现有抗菌肽大规模应用的问题。

Description

一种融合抗菌肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种融合抗菌肽及其制备方法。

背景技术

水产养殖是我国农业和农村发展的重要支柱。20世纪70年代以来世界水产养殖产量增长迅速，在水产业中的比重也正在日益提高。我国水产养殖同样存在巨大的发展潜力，淡水养殖主要有两种类型：一是池塘精养，以投饵、施肥取得高产，并将各种不同食性的鱼类进行混养，以充分发挥水体生产力；另一类型是在湖泊、水库、河沟、水稻田等大、中型水域中放养。淡水养殖对象除传统的鲤科鱼类外，还有非鲫、白鲫、虹鳟、银鲑、罗氏沼虾、中华绒螯蟹等。人工繁殖技术和网箱培育方法的采用，为养殖提供了大量苗种。我国淡水养殖总产量多年来一直居世界首位。海水养殖主要集中沿海城市的浅海、滩涂等地，养殖种类有石斑鱼、鲈鱼、大黄鱼、罗非鱼、遮目鱼、对虾、鲍、扇贝等。但是近年来，随着养殖业集约化、规模化的发展，养殖病害成为制约水产养殖业发展的重要难题。

水产养殖环境中富含多种微生物，导致养殖鱼类不断遭受致病微生物的侵害，时常引起鱼类的大量死亡，造成巨大的经济损失。近些年来，养殖规模盲目扩大，造成局部养殖密度过大，水流不畅，水体交换严重不足，同时养殖户饵料的盲目投入，造成水体的富营养化，水中氮、磷含量超标，直接导致了水质的恶化，为疾病的孳生和传播创造了条件。根据全国水产技术推广总站对水产养殖病害预测报告，养殖鱼类常见的疾病有细菌性败血症、烂鳃病、肠炎病、链球菌病、刺激隐核虫病、瓣体虫病和细菌性溃疡等；虾类易发生白斑综合征、纤毛虫病、红腿病和弧菌病等；贝类如鲍鱼易受到弧菌感染所导致脓疱病，造成鲍鱼活力差甚至死亡；爬行类如中华鳖等易发生腐皮病、白底板病等。养殖病害多发生在水温较高的4～10月份，发病周期长、涉及范围广、病情复杂，控制难度大。水产疾病防治大量使用抗生素，破坏水体中微生态平衡，导致耐药性病原体的产生，使抗生素药物作用减弱；同时，由于在水产养殖药物如氯霉素、呋喃唑酮、孔雀石绿等的残留，危害人体健康。因此，抗生素在动物饲料中的添加受到严格的限制，我国开始严格限制饲料添加抗生素。现代水产养殖业急需无残留、健康安全的新型抗生素替代品。

如今，抗菌肽(Antimicrobial polypeptides，AMPs)作为抗生素的替代品受到众多学者的广泛关注。抗菌肽的作用机理不同于抗生素，病原微生物不易产生耐药性，而且多肽可被动物消化代谢，不会产生残留等问题，因而抗菌肽可作为抗生素的理想替代物。动物饲喂试验证明，抗菌肽不仅可以促进动物发挥免疫调节功能，还可以提高养殖动物的存活率。抗菌肽是两性带电分子，分子量一般小于10kDa，广泛存在于多种生物体内，具有广谱抗菌、调节免疫等多种生物学功能，一些抗菌肽不仅对耐药性的病原细菌有很好的抑制和杀灭作用，而且还对真菌、原生动物、肿瘤细胞、病毒等有很好的抑制作用。

抗菌肽YFGAP是2012年Seo等从黄鳍金枪鱼皮肤酸化后的提取液中分离出的分子量为3.4kDa的多肽，蛋白质序列比对分析表明该抗菌肽与其他种类鱼体内的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的N-端相似度高达91％，因此被称为黄鳍金枪鱼GAPDH相关抗菌肽YFPAD。该抗菌肽对多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均表现出较强的抗菌活性，对部分鱼类病原菌也表现出强效的抗菌活性。

近年来研究发现抗菌肽在动物自身免疫防御机制作为抵抗病原微生物的第一道防线发挥重要作用，抗菌肽作为抗生素的替代品具有巨大的研究潜力和在药物上的应用价值。然而，生物体表达的抗菌肽有限，直接从生物体中提取会耗费大量原材料，并且分离步骤繁琐，提取率低；化学合成抗菌肽缺乏氨基酸的修饰，活性可能会受到影响，同时合成费用昂贵。随着分子生物学和基因工程技术的发展，通过异源表达抗菌肽，解决其产量低、价格昂贵等问题逐渐成为研究热点。但由于抗菌肽一般是阳离子多肽，易被蛋白酶降解，且对宿主有杀伤作用，因此，异源表达抗菌肽时经常添加一些蛋白标签，不仅消除抗菌肽对宿主的毒性，提高蛋白表达量，同时可简化分离纯化过程。抗菌肽融合表达经常使用的标签有CMP-KDO synthetase、Elastin-like polypeptides、Glutathione S-transferase、Green fluorescent protein、6×His、Ketosteroid isomerase、Protein PaP3.30、Site-mutated coat protein、Small ubiquitin-related modifier和Thioredoxin等。融合表达抗菌肽通常需要蛋白酶或化学裂解将目标肽从标签蛋白上切下。有些纯化标签(SrtAc、FrpC、pH intein等)具有自剪切作用，通过改变环境条件，如温度、pH或离子强度等，目标蛋白可自行与标签蛋白分离。

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides，ELPs)是一类对环境温度敏感的人造基因工程蛋白质聚合物，由五肽重复序列单元构成，即Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，其中Xaa可以是除Pro以外的任一氨基酸。ELPs可以进行可逆相变过程，若环境温度低于某一值时，该多肽在水溶液中为高度可溶，聚合物保持无序结构，且多肽链相当伸展。当温度高于这一值2～3℃时，多肽链结构发生改变，并开始聚集，形成不溶物，可离心收集ELPs聚集物。该过程称为可逆相变循环(Inverse Transition Cycling，ITC)，这一关键性的温度点被定义为反转变温度(Inverse temperature transition，ITT)。由于ELPs融合蛋白也具有与ELPs类似的对环境温度敏感的性质，能通过可逆相变循环收集ELPs融合蛋白，因此ELPs已广泛应用于蛋白质纯化过程。目前已有制备抗菌肽-ELPs融合蛋白的报道，但如此进行融合表达抗菌肽，都需要蛋白酶或者改变环境条件将抗菌肽从标签蛋白上切下才可发挥抗菌作用，而由于蛋白酶价格昂贵、酶切或者自剪切效率低下，极大地限制了融合抗菌肽的使用。因此，迫切需要开发一种新的抗菌肽制备方法，解决抗菌肽应用时产量低，价格昂贵等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种融合抗菌肽及其制备方法，得到的融合抗菌肽YSELP不需要从标签蛋白上切下即可对多种测试菌株具有抑制作用，且对宿主菌本身没有杀伤力，有望解决现有抗菌肽大规模应用的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种融合抗菌肽，所述融合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合抗菌肽通过二硫键形成的二聚体。

一种融合抗菌肽，所述融合抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种含有如SEQ ID NO.1所示的融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。

一种融合抗菌肽的制备方法，用含有如SEQ ID NO.1所示的融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体转化宿主细胞，培养转化子，从转化子培养物中获得融合抗菌肽。

一实施例中：所述宿主细胞为原核表达载体或真核表达载体。

一实施例中：包括：

1)pET-22b-YSELP表达载体的构建：根据抗菌肽YFGAP的氨基酸序列，以E.coli标准密码子优化设计抗菌肽YFGAP的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Nde I与EcoR I酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.5所示的基因序列；用NdeI和EcoR I分别双酶切合成的基因序列，连接至经同样双酶切的pUC19质粒并转化至E.coli DH5α感受态细胞，得到pUC19-YFGAP克隆载体；

将pUC19-YFGAP克隆载体用Nde I和EcoR I双酶切后连接至经同样双酶切的pET-22b-S-ELPs表达载体，得到表达载体pET-22b-YSELP；将pET-22b-YSELP转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛选，得到E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP；

2)YSELP的表达：E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP按照1:98～1:102接种含氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜，次日按照1:98～1:102接种至含氨苄青霉素的TB培养基中，培养至600nm处OD值约为1.4～1.6，加入IPTG使其终浓度为0.9～1.1mmol/L以诱导融合抗菌肽的表达，该融合抗菌肽命名为YSELP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一实施例中：还包括：

3)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞总蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；沉淀重悬；取等体积细胞破碎上清液和重悬后沉淀合并，加入5×SDS Loading Buffer，煮沸，SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

一实施例中：还包括：

4)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；取细胞破碎上清液进行ITC纯化，即冰浴14～16min后离心，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为1.8～2.2mol/L，48～52℃水浴14～16min后离心，弃上清；沉淀重悬，冰浴14～16min后离心，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物；重复上述ITC纯化步骤，得二轮ITC纯化产物；SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

一实施例中：还包括：

5)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎后包涵体蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；取下层沉淀，用洗涤缓冲液重悬，室温温育后离心，弃上清；重复重悬-温育-离心一次，洗涤沉淀；沉淀重悬于溶解液中，3～5℃溶解3.5～4.5h后离心弃沉淀；将上清液装入透析袋中，先用含有5.8～6.2mol/L Urea的透析外液3～5℃透析2.5～3.5h，再用Urea含量分别为3.8～4.2、1.8～2.2、0mol/L的透析外液各透析2.5～3.5h，最后将透析袋放入去离子水透析除盐，测定透析外液电导率，透析完全后收集透析袋内的蛋白质溶液，冷冻干燥后重悬，冰浴溶解14～16min后离心收集上清液进行ITC纯化，即取上清液冰浴14～16min后离心，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为1.8～2.2mol/L，48～52℃水浴14～16min后离心，弃上清；沉淀重悬，冰浴14～16min后离心，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物，SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明所提供的一种融合抗菌肽及其制备方法，得到的融合抗菌肽YSELP不需要从标签蛋白上切下即可对多种测试菌株具有抑制作用，且对宿主菌本身没有杀伤力，有望解决现有抗菌肽大规模应用的问题。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1所示为pUC19-YFGAP克隆载体示意图。

图2所示为pET-22b-S-ELPs表达载体示意图。

图3所示为pET-22b-YSELP表达载体示意图。

图4所示为SDS-PAGE分析YSELP蛋白表达示意图。

图中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为未诱导E.coli BL21(DE3)/pET-22b细胞总蛋白；泳道2为诱导后E.coli BL21(DE3)/pET-22b细胞总蛋白；泳道3为未诱导E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞总蛋白；泳道4为诱导后E.coliBL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞总蛋白；泳道5为诱导后E.coliBL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白；泳道6为诱导后E.coliBL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎后包涵体蛋白。

图5所示为SDS-PAGE分析纯化后YSELP蛋白示意图。

图中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为诱导后E.coliBL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白经一轮ITC纯化；泳道2为诱导后E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白经两轮ITC纯化；泳道3为诱导后E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎后包涵体蛋白经一轮ITC纯化；泳道4为牛血清蛋白(4μg)。

图6所示为表达载体pET-22b-YSELP的鉴定结果示意图。

图中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为表达载体pET-22b-YSELP；泳道2为表达载体pET-22b-YSELP经Nde I和Bgl I双酶切。

图7所示为YSELP表达对宿主菌E.coli BL21(DE3)生长影响示意图。

图8所示为YSELP对嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的抑菌活性检测示意图。

图9所示为YSELP对迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda的抑菌活性检测示意图。

图10所示为YSELP对副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus 1A02609的抑菌活性检测示意图。

图11所示为YSELP对创伤弧菌Vibrio vulnificus 1H00066的抑菌活性检测示意图。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1：融合抗菌肽的制备

1)pET-22b-YSELP表达载体的构建：根据抗菌肽YFGAP的氨基酸序列(如SEQID NO.4所示)，以E.coli标准密码子优化设计抗菌肽YFGAP的基因序列，并在基因序列的5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入EcoR I酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.5所示的基因序列；用Nde I和EcoR I分别双酶切合成的基因序列，用T4DNA连接酶连接至经同样双酶切的pUC19质粒并转化至E.coli DH5α感受态细胞(具体转化条件参照《分子克隆实验指南》)，筛选出的阳性克隆子由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的命名为pUC19-YFGAP克隆载体(如图1所示)；

将pUC19-YFGAP克隆载体用Nde I和EcoR I双酶切后，用T4 DNA连接酶连接至经同样双酶切的pET-22b-S-ELPs表达载体(如图2所示)，得到表达载体pET-22b-YSELP(如图3所示)；将pET-22b-YSELP转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞(具体转化条件参照《分子克隆实验指南》)，涂布含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆，得到E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP；

所述pET-22b-S-ELPs表达载体的构建过程为：全基因合成SoxB-M2-S-ELP，用EcoR I和HindⅢ酶切后连接到pUC19上，得到克隆载体pUC19-S-ELP(参见：以类弹性蛋白多肽为标签的表达质粒构建及其用于木聚糖酶的非色谱纯化；付晓平，王文研，张光亚；微生物学报，2012，52(1)：90-95)；用PflM I与Bgl I双酶切pUC19-S-ELPs(即上文中pUC19-S-ELP)，获得ELPs片段基因，将此片段插入到经Sfi I酶切后的pET-22b(+)修饰表达载体，得到重组质粒pET-22b-ELPs(即pET-22b-S-ELPs)(参见：类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应；黄凯宗，李晶晶，李巍，等；生物工程学报，2011,27(4)：661-666)。

2)YSELP的表达：E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP按照1:100接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜，次日按照1:100接种至1L含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，37℃，200r/min培养至600nm处OD值(吸光值)约为1.5，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mmol/L，诱导4h以诱导融合抗菌肽的表达，该融合抗菌肽命名为YSELP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.2所示为融合抗菌肽YSELP的DNA序列与氨基酸序列对照表。

3)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞总蛋白的纯化：IPTG诱导4h后，在4℃下6000r/min离心10min，弃上清，菌体用PBS缓冲液(pH 7.3，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄)洗涤两次，然后用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为300W，工作2s，间隔2s，共4min；超声破碎后在4℃下12000r/min离心10min，分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；沉淀用相同体积PBS缓冲液重悬；取等体积细胞破碎上清液和重悬后沉淀合并，加入5×SDS Loading Buffer，煮沸5min，用15％的SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

4)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白的纯化：取步骤3)中超声破碎后得到的细胞破碎上清液进行ITC纯化，即冰浴15min后在4℃下12000r/min离心10min，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为2mol/L，50℃水浴15min后12000r/min离心10min，弃上清；向沉淀中加入500μL预冷的PBS缓冲液充分重悬沉淀，冰浴15min后在4℃下12000r/min离心10min，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物；重复上述纯化步骤，得二轮ITC纯化产物；15％的SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

5)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎后包涵体蛋白的纯化：取步骤3)中超声破碎后得到的下层沉淀，用洗涤缓冲液(pH 7.3，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，1％TritonX-100，1mmol/LEDTA，2mol/L Urea)重悬沉淀，室温温育30min后12000r/min离心30min，弃上清；重复重悬-温育-离心一次，再用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于溶解液(pH 7.3，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，1mmol/L EDTA，8mol/L Urea)中，4℃溶解4h后12000r/min离心30min，弃沉淀；将上清液装入透析袋中，先用透析外液(pH 7.3，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，6mol/L Urea)4℃透析3h，再用Urea含量分别为4、2、0mol/L的透析外液各透析3h，最后将透析袋放入去离子水透析除盐，测定透析外液电导率，透析至透析外液电导率与透析之前去离子水的电导率相等时即为透析完全，透析完全后收集透析袋内的蛋白质溶液，-80℃冷冻干燥，加入预冷的PBS缓冲液充分重悬，冰浴溶解15min后，在4℃下12000r/min离心10min，收集上清液进行ITC纯化，即取上清液冰浴15min后在4℃下12000r/min离心10min，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为2mol/L，50℃水浴15min后12000r/min离心10min，弃上清；向沉淀中加入500μL预冷的PBS缓冲液充分重悬沉淀，冰浴15min后在4℃下12000r/min离心10min，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物，15％的SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

步骤3)～5)的15％的SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定结果如图4所示，YSELP蛋白主要以包涵体形式表达，分子量约为38kDa，为ProtParam预测YSELP分子量19kDa的二倍，这是由于得到的融合抗菌肽YSELP中含有一个半胱氨酸，因此单体YSELP-1通过二硫键形成了二聚体YSELP-2。

图5所示为SDS-PAGE分析E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白及包涵体蛋白经ITC纯化后的示意图，Bandscan 5.0软件分析蛋白纯度，结果表明细胞破碎上清液蛋白经过两轮ITC纯化后，YSELP蛋白纯度可达到92.5％，从1L发酵液中获得了0.16mg YSELP蛋白；包涵体蛋白经一轮ITC纯化，获得YSELP蛋白6.8mg，纯度达88.9％。

实施例2：表达载体pET-22b-YSELP的鉴定

操作同实施例1之步骤1)，将pET-22b-YSELP转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆后，挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃，200r/min培养12h后提取质粒DNA(即表达载体pET-22b-YSELP)，Nde I和Bgl I双酶切验证，结果如图6所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切条带分子量与载体基因大小吻合，三条条带分别为2583、2050、1502bp；生工生物工程(上海)股份有限公司测序结果也显示基因序列正确，重组表达载体构建成功。

实施例3：YSELP表达对宿主菌E.coli BL21(DE3)生长影响

E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP按照1:100接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜，接种TB培养基，37℃，200r/min培养4h，加IPTG诱导，每隔1h(12h后每隔2h)取菌液测其600nm处OD值；以未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP为对照。

结果如图7所示，加入IPTG诱导表达后宿主菌E.coli BL21(DE3)生长受到抑制。培养8h，菌液浊度开始有所下降，12h后，菌液浊度逐渐增加，菌体浓度增大，E.coli BL21(DE3)再次迅速生长，表明YSELP蛋白的表达并末完全杀伤宿主本身，而是使宿主菌生长受到一定程度抑制。

实施例4：YSELP的抑菌活性检测

采用微量稀释法分析融合抗菌肽YSELP的的抑菌活性，测试菌株为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila，迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda，副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus 1A02609和创伤弧菌Vibrio vulnificus 1H00066，收集上述测试菌株对数期细菌细胞，用新鲜TSB培养基稀释成104～105CFU/mL的菌悬液，向96孔酶标板中加入100μL上述菌悬液，再加入100μL系列稀释的YSELP溶液，以无菌的PBS缓冲液为对照，于30℃恒温培养箱培养24h，酶标仪测定600nm处OD值，结果如图8～图11所示，融合抗菌肽YSELP对四种测试菌株均有抑制作用，对E.tarda的抑制作用最强，对V.vulnificus 1H00066的抑制作用较弱，但都具有良好的抑制效果。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种融合抗菌肽，其特征在于：所述融合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种融合抗菌肽通过二硫键形成的二聚体。

3.根据权利要求1所述的一种融合抗菌肽，其特征在于：所述融合抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种含有根据权利要求3所述的融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。

5.一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化子，从转化子培养物中获得融合抗菌肽。

6.根据权利要求5所述的一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为原核表达载体或真核表达载体。

7.根据权利要求6所述的一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括：

1)pET-22b-YSELP表达载体的构建：根据抗菌肽YFGAP的氨基酸序列，以E.coli标准密码子优化设计抗菌肽YFGAP的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Nde I与EcoR I酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.5所示的基因序列；用Nde I和EcoR I分别双酶切合成的基因序列，连接至经同样双酶切的pUC19质粒并转化至E.coli DH5α感受态细胞，得到pUC19-YFGAP克隆载体；

将pUC19-YFGAP克隆载体用Nde I和EcoR I双酶切后连接至经同样双酶切的pET-22b-S-ELPs表达载体，得到表达载体pET-22b-YSELP；将pET-22b-YSELP转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛选，得到E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP；

2)YSELP的表达：E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP按照1:98～1:102接种含氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜，次日按照1:98～1:102接种至含氨苄青霉素的TB培养基中，培养至600nm处OD值约为1.4～1.6，加入IPTG使其终浓度为0.9～1.1mmol/L以诱导融合抗菌肽的表达，该融合抗菌肽命名为YSELP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求7所述的一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括：

3)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞总蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；沉淀重悬；取等体积细胞破碎上清液和重悬后沉淀合并，加入5×SDS LoadingBuffer，煮沸，SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

9.根据权利要求7所述的一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括：

4)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎上清液蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；取细胞破碎上清液进行ITC纯化，即冰浴14～16min后离心，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为1.8～2.2mol/L，48～52℃水浴14～16min后离心，弃上清；沉淀重悬，冰浴14～16min后离心，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物；重复上述ITC纯化步骤，得二轮ITC纯化产物；SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。

10.根据权利要求7所述的一种融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括：

5)E.coli BL21(DE3)/pET-22b-YSELP细胞破碎后包涵体蛋白的纯化：所述步骤2)中加入IPTG诱导3.5～4.5h后，离心，弃上清，菌体洗涤1～3次后重悬，置冰浴中超声破碎；所述超声破碎条件为280～320W，工作1～3s，间隔1～3s，共3.5～4.5min；超声破碎后离心分离得到细胞破碎上清液和下层沉淀；取下层沉淀，用洗涤缓冲液重悬，室温温育后离心，弃上清；重复重悬-温育-离心一次，洗涤沉淀；沉淀重悬于溶解液中，3～5℃溶解3.5～4.5h后离心弃沉淀；将上清液装入透析袋中，先用含有5.8～6.2mol/L Urea的透析外液3～5℃透析2.5～3.5h，再用Urea含量分别为3.8～4.2、1.8～2.2、0mol/L的透析外液各透析2.5～3.5h，最后将透析袋放入去离子水透析除盐，测定透析外液电导率，透析完全后收集透析袋内的蛋白质溶液，冷冻干燥后重悬，冰浴溶解14～16min后离心收集上清液进行ITC纯化，即取上清液冰浴14～16min后离心，向离心后上清液中添加NaCl至终浓度为1.8～2.2mol/L，48～52℃水浴14～16min后离心，弃上清；沉淀重悬，冰浴14～16min后离心，弃沉淀，上清液即为一轮ITC纯化产物，SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定。