CN116462771B - 一种利用标签制备多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程及多肽制备方法技术领域，具体涉及一种利用标签制备多肽的方法。本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签‑酶切位点‑多肽‑酶切位点‑标签；所述C端和N端的标签可以相同也可以不同；所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。本发明的技术方案可以抑制多肽自身的降解，降低多肽对宿主细胞的毒性和表达宿主的死亡率，使多肽被稳定地表达纯化，从而实现多肽的有效制备。

Description

一种利用标签制备多肽的方法
技术领域
本发明属于基因工程及多肽制备方法技术领域，具体涉及一种利用标签制备多肽的方法。
背景技术
蛋白质的制备是生物医药基础研究中必不可少的一部分，可以通过基因重组技术构建质粒载体，利用助融合标签来辅助蛋白质的表达和纯化。一般常用的辅助蛋白质表达的体系有大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞，其中大肠杆菌蛋白质表达系统具有成本低，培养简单，操作方便的优点，被广泛用于工业生产领域。
多肽具有序列短、无结构的特点，且部分多肽具有疏水性强的特点，利用助溶标签辅助疏水性强的多肽蛋白质表达是目前常用的策略，可以增强蛋白质的稳定性、提高其溶解性、实现其纯化。但部分多肽进行表达和纯化时，一端连接标签如ThioredoxinA(TrxA)、GST、MBP、SUMO、NusA和DsbA，依然会出现在蛋白质表达系统中易降解的问题。另外，制备有抗菌活性的多肽如抗菌肽时，会出现诱导表达后多肽蛋白裂解宿主细菌的问题，导致多肽蛋白的表达量低。因此，急需一种制备多肽的方法，解决多肽在表达系统中表达量低、易降解的技术问题。
发明内容
本发明的目的提供一种利用标签制备多肽的方法，应用该方法制备多肽时多肽不易降解，可以提高多肽的表达量。
本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：
将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；
所述C端和N端的标签可以相同也可以不同；
所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。
优选的，所述标签包括ThioredoxinA、GST、MBP、SUMO、NusA和DsbA中的一种或两种。
优选的，所述融合蛋白还连接有用于纯化的第二标签；所述第二标签不插入在多肽和酶切位点之间；所述酶切位点包括肠激酶酶切位点、凝血酶酶切位点、Xa因子酶切位点、烟草蚀纹病毒酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点和HRV 3C蛋白酶酶切位点中的一种或两种。
优选的，所述第二标签的数量为一个以上；
所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；或者，第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；或者，标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；或者，第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签。
优选的，所述多肽包括易降解多肽或高毒性抗菌多肽。
优选的，所述高毒性抗菌多肽包括A3K/L7K-LAH4；所述A3K/L7K-LAH4的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，靠近C端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点；靠近N端的酶切位点包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点。
优选的，所述易降解多肽包括FP；所述FP的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，酶切位点包括凝血酶酶切位点。
优选的，所述编码融合蛋白的核苷酸序列与载体连接后表达，所述载体包括pET-32a(+)。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；所述N端和C端的标签可以相同也可以不同；所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。
本发明通过基因重组技术，在多肽氨基酸序列的C端和N端分别加上一个编码标签的基因序列，通过两端添加编码标签的基因序列将多肽包裹住，从而抑制多肽自身的降解，使易降解的多肽被稳定地表达纯化，如果多肽为抗菌活性多肽，包裹后还可以减弱抗菌活性多肽对表达宿主的毒性，使多肽在宿主中被稳定地表达纯化，从而实现多肽的有效制备。之后，再利用酶切位点将标签酶切去除，使多肽易于纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为多肽K3K7重组质粒图；其中a为实施例1-1两端加TrxA的重组质粒图，b为对比例1一端添加TrxA的重组质粒图；
图2为对比例2的K3K7重组质粒图；
图3为多肽FP重组质粒图；
图4为实施例1-1和对比例1不同IPTG诱导时间下含有重组大肠杆菌菌液的OD600值结果图；
图5为实施例1-1和对比例1不同诱导时间下的SDS-PAGE胶图；
图6为对比例2不同IPTG诱导时间下含有重组大肠杆菌菌液的OD600值结果图；
图7为实施例1-1的T-K3K7-T的从诱导表达、纯化、酶切、HPLC分离的Tricine SDS-PAGE胶图；
图8为实施例1-1多肽K3K7质谱图；
图9为多肽K3K7的1H-15N HSQC谱图；
图10为对比例3和实施例2-1的融合蛋白多肽FP的SDS-PAGE凝胶检测检测图；
图11为实施例2-1多肽FP的Tricine SDS-PAGE凝胶检测酶切和纯化图；
图12为实施例2-1多肽FP质谱图；
图13为实施例2-2多肽FP进行液体核磁共振检测的二维1H-15N HSQC谱图；图13中的横坐标为1H的化学位移，纵坐标为15N的化学位移。
具体实施方式
本发明提供了一种利用标签制备多肽的方法，包括以下步骤：
将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；
所述C端和N端的标签可以相同也可以不同；
所述多肽两端的酶切位点可以相同也可以不同。
在本发明中，所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签。本发明所述多肽优选直接和酶切位点连接，所述酶切位点优选和标签直接连接，本发明对标签连接到酶切位点的方式和多肽与酶切位点的连接方式没有特殊限定，采用常规的方法即可。
在本发明中，所述标签优选包括ThioredoxinA、GST、MBP、SUMO、NusA和DsbA中的一种或两种，进一步优选为ThioredoxinA、SUMO、GST、DsbA和MBP中的一种，更优选为ThioredoxinA。本发明所述ThioredoxinA为助溶标签，本发明在多肽氨基酸的C端和N端添加助溶标签TrxA的方法能够使具有抗菌活性或易降解的多肽在大肠杆菌中表达并有效制备。
本发明所述酶切位点优选包括肠激酶酶切位点、凝血酶酶切位点、Xa因子酶切位点、烟草蚀纹病毒(TEV)酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点和HRV 3C蛋白酶酶切位点中的一种或两种，进一步优选为肠激酶酶切位点、凝血酶酶切位点、烟草蚀纹病毒(TEV)酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点和HRV 3C蛋白酶酶切位点中的一种或两种，更优选为肠激酶酶切位点和凝血酶酶切位点两种酶切位点或凝血酶酶切位点一种酶切位点。本发明所述酶切位点可以根据不同的蛋白多肽的特点进行选择，只要不影响蛋白多肽的正常折叠构象，酶切后产生的残留氨基酸尽量不对蛋白多肽产生影响即可。本发明所述酶切位点的选择对不同的蛋白的表达是有影响的，本发明所述酶切位点的选择在于利于多肽在大肠杆菌中表达，此外通过酶切位点便于酶切去除标签获得多肽。
得到融合蛋白的氨基酸序列后，本发明优选还在融合蛋白的氨基酸序列上连接用于纯化的第二标签；所述第二标签不插入在多肽和酶切位点之间。本发明所述第二标签的数量优选为一个以上，更优选为一个或两个；
当第二标签的数量为两个时，连接第二标签后，本发明所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次优选包括标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；
当第二标签的数量为一个时，连接第二标签后，所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次包括标签-酶切位点-多肽-酶切位点-第二标签-标签；或者，标签-第二标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签；或者，标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签-第二标签；或者，第二标签-标签-酶切位点-多肽-酶切位点-标签。本发明所述第二标签优选为6His、GST、MBP、CBD、Strep和SNAP中的一种，更优选为6His标签，6His标签相对较小，不容易改变蛋白多肽的溶解性，且易被酶切去除，便于镍柱纯化。本发明所述第二标签的数量只需要确保实现多肽与镍填料结合并完成纯化过程即可。
本发明对所述第二标签的连接位置也没有特殊限定，根据多肽的结构确定第二标签的位置，比如多肽的某一端结构折叠阻挡了6His标签与镍填料结合，最后纯化就会受到影响，则可以将第二标签添加在外侧。
得到连接第二标签的融合蛋白的氨基酸序列，本发明优选将连接第二标签的编码融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与载体连接得到编码融合蛋白的重组质粒，所述重组质粒转化入大肠杆菌融合表达、纯化、酶切和分离后得到所述多肽。
本发明对所述重组质粒制备时应用的载体无特殊限定，采用常规的载体保证和融合蛋白序列连接即可。本发明所述质粒制备时应用的载体优选包括pET-32a(+)。本发明之所以选择pET-32a(+)是由于pET-32a(+)上自带一个TrxA，编码融合蛋白的核苷酸序列和质粒连接比较方便。
本发明得到编码融合蛋白的重组质粒后，优选重组质粒转化至大肠杆菌得到重组大肠杆菌，对所述重组大肠杆菌进行培养实现质粒融合表达得到融合蛋白，所述融合蛋白进行纯化、酶切和分离后得到多肽。本发明所述转化优选包括热激法。本发明所述培养优选利用LB培养基和M9培养基完成，本发明所述M9培养基1L的组成优选为磷酸氢二钠6.78g、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵(15N)1g、超纯水975.4mL、Mix 24.6mL，24.6mLMix的组成为2M硫酸镁1mL、1M氯化钙0.1mL、BME 2.5mL、20％葡萄糖20mL和50mg/mL氨苄青霉素1mL(M9培养基中终浓度：50μg/ml)。本发明所述M9培养基灭菌优选为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化铵(15N)在温度为121℃的条件下高压灭菌25min；硫酸镁、氯化钙、BME、葡萄糖通过过滤除菌的方式加入M9培养基。本发明所述M9培养基的作用为制备稳定同位素标记蛋白。本发明所述M9培养基优选利用15NH4Cl作为唯一的氮源，制备的融合蛋白多肽具有15N标记，可以用于核磁分析。本发明融合蛋白(即多肽)的纯化、酶切和多肽分离采用常规的方法即可。本发明所述纯化优选利用镍柱亲和层析进行。本发明设计的融合蛋白为胞内可溶性表达，无需进行变复性，方便纯化。
在本发明中，所述多肽优选包括高毒性抗菌多肽或易降解多肽。本发明所述高毒性抗菌多肽优选包括A3K/L7K-LAH4；所述A3K/L7K-LAH4的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
当所述多肽为K3K7时，本发明靠近C端的酶切位点优选包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点；本发明靠近N端的酶切位点优选包括肠激酶酶切位点或凝血酶酶切位点。在本发明的具体实施例中，当所述多肽为K3K7时，融合蛋白K3K7的氨基酸序列优选包括TrxA-DDDDK-K3K7-LVPRGS-TrxA-6His，本发明所述DDDDK优选为肠激酶酶切位点，所述LVPRGS优选为凝血酶酶切位点。本方法技术方案可以减弱多肽K3K7的抗菌活性使其稳定地在大肠杆菌中表达。
本发明所述易降解多肽优选包括FP，本发明所述FP(融合多肽片段，fusionpeptide)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。当所述多肽为FP时，本发明所述酶切位点优选包括凝血酶酶切位点。
在本发明实施例中，融合多肽片段FP的氨基酸序列优选包括TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA，本发明所述LVPRGS优选为凝血酶酶切位点。本方法可以使易降解的多肽FP被稳定地在大肠杆菌中表达纯化，FP再经过二次镍柱亲和层析得到高纯度多肽，图11的3、4、5、6泳道是二次镍柱纯化后的，其中泳道4所示条带为FP，从该泳道来看无杂蛋白。图13为15N标记FP经过二次镍柱纯化后的二维HSQC核磁谱图，该核磁图显示出的信号峰的化学位移与FP的氨基酸所对应的化学位移一致。所以可确定所纯化出的多肽为FP。本发明所述融合肽片段(FP)是SARS-CoV-2的刺突S糖蛋白的一段序列，SARS-CoV-2通过受体依赖性内吞作用进入宿主细胞，该内吞作用经过涉及病毒刺突S糖蛋白和膜受体的多个中间步骤，其中，融合肽片段(FP)介导的膜融合至关重要。
本发明通过在多肽的氨基酸序列的C端和N端分别加上酶切位点和能够表达标签的基因片段，使具有抗菌活性或易降解的多肽在大肠杆菌中稳定表达，再经过破菌、纯化、酶切和分离得到高纯度的多肽。采用本发明提供的技术方案能够有效制备具有抗菌活性或易降解的多肽。本发明所设计的融合蛋白在大肠杆菌中为胞内可溶性表达，无需经过变复性，可直接用镍柱亲和层析而得到融合蛋白，然后通过酶切去除助溶标签。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实验中应用的M9培养基组成为(1L)：磷酸氢二钠6.78g、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵(15N)1g、超纯水975.4mL、Mix 24.6mL，24.6mL Mix的组成为2M硫酸镁1mL、1M氯化钙0.1mL、BME 2.5mL、20％葡萄糖20mL和50mg/mL氨苄青霉素1mL(M9培养基中终浓度：50μg/mL)。
实施例1-1抗菌肽A3K/L7K-LAH4(简称K3K7)的制备
以抗菌肽A3K/L7K-LAH4(K3K7)为模型验证本发明技术方案的可行性。K3K7将抗菌肽LAH4氨基酸序列的第3和第7位突变为了赖氨酸(简写：K)所以得名A3K/L7K-LAH4。
多肽K3K7由26个氨基酸组成，氨基酸序列为：KKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA(SEQID NO.1)。通过在K3K7的C端和N端同时添加TrxA实现了其在大肠杆菌中表达并有效制备。为了便于表达纯化，选择载体质粒pET-32a(+)，整合的序列结构为TrxA-DDDDK-KKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA-LVPRGS-TrxA-6His，DDDDK是肠激酶切位点，LVPRGS是凝血酶切位点，构建成的重组质粒如图1所示。利用氯化钙转化法将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，并进行诱导表达。利用6His标签经过镍柱亲和层析获得融合蛋白，随后经过一次凝血酶切反应和一次肠激酶切反应可使目标多肽K3K7从融合蛋白中游离出来，再利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)导向HPLC分离纯化便可获得抗菌肽K3K7，并用飞行时间质谱检测分子量，最后通过制备15N标记的K3K7，对所获得的多肽K3K7进行液体核磁共振检测，采集二维1H-15N HSQC谱图。
(1)构建载体质粒
pET-32a(+)上含有TrxA标签和6His标签，直接将-DDDDK-KKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA-LVPRGS-TrxA-基因序列插入到TrxA和6His之间，之后接入终止子TAA终止转录过程，从而得到重组载体质粒。重组载体质粒编码TrxA-DDDDK-KKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA-LVPRGS-TrxA(+6His Tag)融合蛋白，见图1。
编码TrxA的DNA分子的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
AGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCC。
TrxA的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
SDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQ GKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFL DANLA。
编码6His的DNA分子的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：CATCACCACCA CCACCAC。
6His的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：HHHHHH。
编码-DDDDK-KKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA-LVPRGS-TrxA-的DNA分子的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：
GATGATGACGATAAAAAGAAGAAATTACTAGCGAAGGCTTTACATCACTTGGCGCACCTGGCGCTGCATTTGGCGCTGGCGCTTAAGAAAGCCTTGGTTCCGCGCGGTTCCGGCTCTGGTAGCGGTCACAGCGACAAAATCATCCATTTAACCGATGATAGCTTTGATACCGACGTGCTGAAGGCTGACGGCGCAATTCTGGTCGATTTCTGGGCAGAATGGTGTGGTCCGTGCAAGATGATTGCACCGATCCTCGACGAGATCGCCGACGAGTACCAGGGTAAATTGACGGTTGCTAAGTTGAATATTGATCAGAACCCGGGTACTGCGCCAAAATATGGTATTCGTGGCATCCCGACCCTGCTGCTGTTTAAAAACGGCGAAGTTGCCGCGACCAAGGTGGGTGCGCTGAGCAAAGGTCAACTGAAAGAGTTCCTGGACGCTAACCTGGCG。
(2)构建的载体质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达
利用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并通过热激将重组载体质粒导入该大肠杆菌感受态中获得重组大肠杆菌。热激温度为42℃，热激时间为90s。
重组大肠杆菌在含有氨苄青霉素(氨苄青霉素的原始浓度为50mg/mL，氨苄青霉素在LB固体培养中的终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基中培养后，挑取单菌落并通过测序验证。测序结果正确的单菌落即重组阳性大肠杆菌在LB液体培养基中放大培养，随后加入质量浓度为50％的甘油(甘油终浓度为25％)，分装后置于温度为-80℃的条件下保藏。
将重组阳性大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，其中加入质量浓度为50mg/mL的氨苄青霉素(终浓度为50μg/mL)，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养过夜。过夜培养所得菌液接入500mL的LB液体培养基中，LB液体培养基中加入50mg/mL的氨苄青霉素0.5mL，菌液接入后LB液体培养基的初始OD600值为0.1，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养至菌液OD600值在0.6～0.8之间，然后加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，诱导4h后离心收集菌体置于-20℃保存。
(3)蛋白纯化以及酶切
用50mL缓冲溶液1(20mM Tris、300mMNaCl，pH 7.4)重悬步骤(2)获得的菌体，然后用高压均质仪(压力为850bar，时间为3min)破碎菌体。
破碎后，融合蛋白TrxA-DDDDK-K3K7-LVPRGS-TrxA-6His从裂解后的菌体中游离出来，通过离心(离心转速为12000rpm，离心时间为30min)后收集上清液。菌体经细胞破碎后离心，融合蛋白存在于上清液中，融合蛋白为胞内可溶性表达。
上清液利用镍柱亲和层析进行分离纯化，具体步骤为：用缓冲溶液1(20mM Tris、300mMNaCl，pH 7.4)平衡镍柱，将高速离心获得的上清液与Ni-NTA在低温下摇晃结合3h。先用缓冲溶液2(20mM Tris、300mMNaCl，40mM咪唑，pH 7.4)洗脱镍柱，再用缓冲溶液3(20mMTris、300mMNaCl，300mM咪唑，pH 7.4)洗脱镍柱，收集缓冲溶液3的洗脱液。
通过SDS-PAGE凝胶电泳判断缓冲溶液3的洗脱液中是否含有目标蛋白并确认其纯度，见图7。
对缓冲溶液3的洗脱液进行透析(透析袋截留分子量：1000Da)，透析外液为20mMTris、100mMNaCl，pH 8.0，经过若干次透析，透析至咪唑浓度忽略不计为止，每次透析时间为3h。
使用大小为10kDa的超滤离心管对透析所得含有融合蛋白的溶液进行离心浓缩。向浓缩后的含有融合蛋白的溶液中加入终酶活力为1U/μL的凝血酶在温度为37℃条件下酶切24h，得到凝血酶酶切后的缓冲溶液。所使用的凝血酶1U可酶切1mg融合蛋白。
使用缓冲溶液4(25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0)通过超滤置换凝血酶酶切后的缓冲溶液，浓缩所得物中加入肠激酶在温度为25℃条件下酶切24h，所使用的肠激酶1U可酶切0.5mg融合蛋白，得到肠激酶酶切后含有融合蛋白的溶液。肠激酶酶切后含有融合蛋白的溶液用Tricine SDS-PAGE凝胶检测酶切情况。之后用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白。
(4)LC-MS导向HPLC分离纯化
在肠激酶酶切后得到的含有融合蛋白的溶液中加入等体积的质量浓度为20％的TCA(终质量浓度为10％)，冰浴30min后进行离心(离心转速为12000rpm，离心时间为10min)收集蛋白沉淀，所得沉淀在含有质量浓度为1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液中溶解后离心，离心转速为12000rpm，离心时间为10min，收集上清液。随后用LC-MS检测目标多肽的保留时间。
根据LC-MS检测到的目标多肽的保留时间，利用HPLC对蛋白溶液做进一步的分离纯化。HPLC的具体参数为：流动相为水(含0.1％TFA)和乙腈；方法：5％～99％乙腈梯度洗脱15min，目标多肽K3K7在11min左右出峰，接取流出液，通过旋转蒸发便可得到K3K7。T-K3K7-T的从诱导，纯化，酶切，HPLC分离的Tricine SDS-PAGE胶图见图7。
(5)质谱检测
利用飞行时间质谱对步骤(4)得到的多肽K3K7分子量进行检测，质谱检测出的目标蛋白分子量为3317.9Da，与酶切后的K3K7分子量(3317.2Da)一致，多肽K3K7质谱图见图8。
(6)对缓冲液3的洗脱液中的K3K7含量进行计算
对缓冲溶液3的洗脱液进行透析(透析袋截留分子量：1000Da)，透析所得含有融合蛋白的溶液，溶液体积为50mL，融合蛋白含量为16mg，融合蛋白浓度为0.32mg/mL。使用大小为10kDa的超滤离心管对透析所得含有融合蛋白的溶液进行离心浓缩，浓缩后的蛋白浓度为2.5mg/mL，浓缩后含有融合蛋白的溶液体积为6mL，离心过程中融合蛋白损失1mg。
实施例1-1中1L液体LB培养基能培养得到32mg的TrxA-DDDDK-K3K7-LVPRGS-TrxA-6His，酶切后K3K7产量为1.6mg/每升发酵液。
实施例1-2
(1)构建载体质粒。同实施例1-1。
(2)构建的载体质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达
利用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并通过热激将重组载体质粒导入该大肠杆菌感受态中获得重组大肠杆菌。热激温度为42℃，热激时间为90s。
重组大肠杆菌在含有氨苄青霉素(氨苄青霉素的原始浓度为50mg/mL，氨苄青霉素在LB固体培养中的终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基中培养后，挑取单菌落并通过测序验证。测序结果正确的单菌落即重组阳性大肠杆菌在LB液体培养基中放大培养，随后加入质量浓度为50％的甘油(甘油终浓度为25％)，分装后置于温度为-80℃的条件下保藏。
将重组阳性大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，其中加入质量浓度为50mg/mL的氨苄青霉素(终浓度为50μg/mL)，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养过夜。过夜培养所得菌液接入500mL的LB液体培养基中，LB液体培养基中加入50mg/mL的氨苄青霉素0.5mL，菌液接入后LB液体培养基的初始OD600值为0.1，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养至菌液OD600值在0.6～0.8之间，通过离心收集菌体后转至体积为500mL的M9培养基中。为获得均一的15N标记的K3K7，在M9培养基中添加1g/L的15NH4Cl作为唯一的氮源，在温度为30℃、转速为220rpm条件下孵育30min后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)30℃下诱导融合蛋白表达，诱导4h后离心收集菌体，离心转速为4000rpm，离心时间为10min，菌体置于-20℃保存。
(3)蛋白纯化以及酶切。同实施例1-1。
(4)液体核磁检测
将步骤(3)得到的多肽K3K7溶解在体积比为1：1的氘代2、2、2-三氟乙醇和20mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐(HepesNa)中，pH值为6.5。在配备三共振低温探头的Bruker 600MHz的光谱仪上进行检测，在303K下采集15N K3K7的1H-15N HSQC谱图，如图9所示。
对比例1(TrxA-K3K7(+))
同实施例1-1，唯一的区别在于只在多肽K3K7的N端添加TrxA(T-K3K7)，即TrxA-凝血酶切位点-K3K7，重组质粒见图1；但使用该方法后K3K7仍表现出较高的抗菌活性，使重组大肠杆菌不能正常生长，因此该方法并不适用于抗菌肽K3K7在大肠杆菌中的表达，如图4和图5所示。
编码T-K3K7的DNA分子的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：
AGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTAAGAAAAAATTGCTAGCTAAAGCATTACACCACCTGGCGCATTTGGCGCTGCACCTGGCCTTGGCTCTGAAGAAAGCA。
T-K3K7的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：
SDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQ GKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFL DANLAGSGSGHMSSGLVPRGSKKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKA。
设置IPTG诱导时间为0h、1h、2h、3h、4h、5h，对实施例1-1和对比例1不同IPTG诱导时间下含有重组阳性大肠杆菌菌液的OD600值见表1和图4、图5。图5中A为T-K3K7的不同诱导时间SDS-PAGE胶图(T-K3K7的分子量为16.1KDa)。图5中B为T-K3K7-T(在K3K7的C端和N端同时添加TrxA)的不同诱导时间SDS-PAGE胶图(T-K3K7-T的分子量为29.65KDa)。
根据图4和图5可知，与只在K3K7的N端加TrxA相比，在K3K7的C端和N端同时添加TrxA实现了其在大肠杆菌中有效表达，提高了K3K7的表达量。
对比例2
(1)构建载体质粒
构建载体质粒为：直接将TAF12-6His-PSI-K3K7(-PSI-K3K7指将PSI中的一段loop替换为K3K7序列)基因序列插入到pET-28a(+)上，之后接入终止子TAA能够终止转录过程，从而得到重组载体质粒，见图2。
编码TAF12-PSI-K3K7的DNA分子的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)：
GTATTGACCAAGAAGAAATTACAGGACTTAGTAAGAGAAGTAGCGCCTAATGAGCAGCTGGATGAAGATGTGGAGGAGATGCTGCTGCAGATTGCTGATGATTTTATCGAGAGTGTGGTGACAGCAGCCTGTCAGCTTGCGCGGCATCGCAAGTCTAGCACCCTGGAGGTGAAAGATGTCCAGCTGCATTTAGAGCGCCAGTGGAACATGTGGATCATGGGCAGCAGCCATACCGGTGACGACGACGACAAACATATGGATCCGCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCATCGTATCTATGGAATGTAAGACCATTGTCTCCCAGTACGGTGAAATGATCTGGGACCTGCTGGTTTCTGGCGTACGTCCGGATCAGGTCTGCTCCCAGGCAGGTCTGAAAAAAAAACTGCTGGCGAAAGCTCTGCACCACCTGGCACACCTGGCGCTGCATCTGGCTCTGGCACTGAAAAAAGCAACCGCGTGTGAAATGGCTGTTGTTTGGATGCAGAACCAGCTGAAACAGGAAGGTACCAAGGAAAAAGTTCTGGAATACGTGAACCAGCTGTGTGAAAAAATTCCA。
TAF12-PSI-K3K7的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)：
VLTKKKLQDLVREVAPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAACQLARHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWIMGSSHTGDDDDKHMDPHHHHHHSSGLVPRGSIVSMECKTIVSQYGEMIWDLLVSGVRPDQVCSQAGLKKKLLAKALHHLAHLALHLALALKKATACEMAVVWMQNQLKQEGTKEKVLEYVNQLCEKIP。
(2)构建的载体质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达
利用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并通过热激将重组载体质粒导入该大肠杆菌感受态中获得重组大肠杆菌。热激温度为42℃，热激时间为90s。
重组大肠杆菌在含有卡那霉素霉素(卡那霉素的原始浓度为50mg/mL，卡那霉素在LB固体培养中的终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基中培养后，挑取单菌落并通过测序验证。测序结果正确的单菌落即重组阳性大肠杆菌在LB液体培养基中放大培养，随后加入质量浓度为50％的甘油(甘油终浓度为25％)，分装后置于温度为-80℃的条件下保藏。
将重组阳性大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，其中加入质量浓度为50mg/mL的卡那霉素(终浓度为50μg/mL)，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养过夜。过夜培养所得菌液接入500mL的LB液体培养基中，LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素0.5mL，菌液接入后LB液体培养基的初始OD600值为0.1，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养至菌液OD600值在0.6～0.8之间。菌液平均分成两部分，一部分加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，另一部分不进行IPTG诱导。
设置IPTG诱导时间为0h、1h、2h、3h、4h、5h，对对比例2获得的不同IPTG诱导时间下含有重组阳性大肠杆菌菌液的OD600值进行测定，结果见表1和图6。图6中，TAF12-PSI-K3K7(-)表示不进行诱导。TAF12-PSI-K3K7(+)表示进行诱导。明显可见，诱导后，菌体生长非常缓慢，可见，利用TAF12融合PSI-K3K7在大肠杆菌中诱导表达后发现K3K7仍会对宿主菌有毒性，因此该方法并不适用于K3K7在大肠杆菌中的表达，如表1、图7所示。根据图7可知，在K3K7的C端和N端同时添加TrxA可以帮助其在大肠杆菌中表达并有效制备。
表1实施例1-1和对比例1不同IPTG诱导时间下含有重组阳性大肠杆菌菌液的OD600值结果
实施例2-1
本实施例以融合多肽片段FP为模型验证本发明技术方案的可行性。
融合多肽片段(Fusionpeptide segment，FP)由35个氨基酸组成，氨基酸序列为IAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAY(SEQ ID NO.11)，具有易降解的特点。在FP的C端和N端同时添加TrxA帮助其在大肠杆菌中表达并有效制备。
为了便于FP表达纯化，选择载体质粒pET-32a(+)，整合的序列结构为TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA，LVPRGS是凝血酶切位点，构建成的重组质粒如图3所示。利用氯化钙转化法将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，并对融合蛋白TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA进行诱导表达。利用6His标签经过镍柱亲和层析获得融合蛋白，随后经过凝血酶切反应使目标多肽FP从融合蛋白中游离出来，再经过第二次镍柱亲和层析可获得目标多肽FP，并用飞行时间质谱检测FP的分子量。最后通过制备15N标记的FP，对所获得的多肽FP进行液体核磁共振检测，采集二维1H-15N HSQC谱图，如图13所示。具体如下：
(1)构建载体质粒
pET-32a(+)上含有TrxA标签，直接将-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA-基因序列插入到TrxA后，之后接入终止子TAA能够终止转录过程，从而得到重组载体质粒，见图3。
编码-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：
CACCACCATCATCATCACAGCAGCGGTCTGGTGCCGCGTGGTAGCATTGCGCAGTACACCAGCGCGCTGCTGGCGGGTACCATTACCAGCGGTTGGACCTTTGGTGCGGGTGCGGCGCTGCAGATCCCGTTTGCGATGCAAATGGCGTA TCTGGTTCCGCGTGGTAGCGGCAGCAGCCATCATCACCACCACCATGGTAGCGGTAGCGGTCACAGCGACAAGATCATTCACCTGACCGACGATAGCTTCGACACCGATGTGCTGAAAGCGGACGGCGCGATTCTGGTTGATTTTTGGGCGGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAGATGATCGCGCCGATTCTGGACGAGATCGCGGATGAATACCAGGGCAAGCTGACCGTGGCGAAACTGAACATTGACCAAAACCCGGGTACCGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATTCCGACCCTGCTGCTGTTCAAGAACGGCGAGGTGGCGGCGACCAAAGTTGGTGCGCTGAGCAAGGGTCAACTGAAAGAATTTCTGGATGCGAACCTGGCG。
-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：
HHHHHHSSGLVPRGSIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYLVPRGSGSSHHHHHHGSGSGHSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA。
(2)构建的载体质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达利用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并通过热激42℃，90s将重组质粒导入该大肠杆菌感受态中，在含有氨苄青霉素终浓度为50μg/mL的LB固体培养基中培养后，挑取单菌落并通过测序验证。测序结果正确的单菌落即重组阳性大肠杆菌在LB液体培养基中放大培养，随后LB液体培养基中加入质量浓度为50％的甘油(终浓度为25％)，分装后置于-80℃保藏。
将重组阳性大肠杆菌菌株接种于50mL LB液体培养基中，其中加入质量浓度为50mg/mL的氨苄青霉素(终浓度为50μg/mL)，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养。培养8h后，将所得菌液接入500mL的LB液体培养基中(加入50mg/mL的氨苄青霉素500μL)，LB液体培养基的起始OD600值为0.1，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养至菌液OD600值在0.6～0.8之间，然后加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，诱导12h后离心收集菌体置于-20℃保存。
(3)蛋白纯化以及酶切
用50mL缓冲溶液1(20mM Tris、300mM NaCl，pH 7.4)重悬步骤(2)获得的菌体并加入500μL的100×Protease Inhibitor和500μL 0.1M的PMSF，然后用高压均质仪破碎菌体(高压均质压力850bar，高压均质时间3min)。融合蛋白TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA从裂解后的菌体中游离出来，离心后(离心转速为12000rpm，离心时间为30min)收集上清液。
利用镍柱亲和层析进行分离纯化，具体步骤为：用缓冲溶液1(20mM Tris，300mMNaCl，pH 7.4)平衡镍柱，将高速离心获得的上清液与Ni-NTA在低温下摇晃结合2h，收集流穿液。用45mL缓冲溶液5(Buffer5)(20mM Tris、300mMNaCl，10mM咪唑，pH 7.4)洗脱镍柱后用缓冲溶液6(Buffer6)(20mM Tris、300mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.4)洗脱镍柱后，再用缓冲溶液3(Buffer3)(20mM Tris、300mM NaCl，300mM咪唑，pH 7.4)洗脱镍柱，收集缓冲溶液3的洗脱液。
通过SDS-PAGE凝胶电泳判断缓冲溶液3的洗脱液中是否含有目标蛋白并确认其纯度，如图10所示。
对缓冲溶液3的洗脱液进行透析(透析袋截留分子量：1000Da)，透析外液为20mMTris、100mMNaCl，pH 8.0，经过若干次透析至咪唑浓度可忽略不计后，得到含有融合多肽FP的溶液。
使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对含有融合多肽FP的溶液进行离心浓缩4000rpm，浓缩后融合蛋白浓度为4.2mg/mL，融合蛋白溶液的体积为12mL。
向浓缩后的融合多肽FP蛋白溶液中加入相应量的凝血酶进行酶切。所使用的凝血酶1U可酶切1mg融合蛋白。酶切温度为37℃，酶切时间为15h。
将凝血酶酶切后含有融合多肽FP的蛋白溶液与Ni-NTA结合，并加入缓冲溶液7(8MUrea，20mM Tris、300mM NaCl，pH 7.4)，置于低温下摇晃过夜。收集缓冲溶液7的流穿液、缓冲溶液8(8M Urea，20mM Tris、300mMNaCl，pH 6.3)的洗脱液、缓冲溶液9(Buffer9)(20mMTris、300mMNaCl，40mM咪唑，pH 7.4)的洗脱液和缓冲溶液3(Buffer3)(20mM Tris、300mMNaCl，300mM咪唑，pH 7.4)的洗脱液。用Tricine SDS-PAGE凝胶检测酶切和纯化情况，如图11所示。根据图11可知，凝血酶切后，经过二次镍柱纯化，FP不与镍结合，可从流穿和缓冲溶液8(Buffer8)中流出(图11中的泳道3和4)，从而得到FP。
在含有融合多肽FP的洗脱液中加入TFA(终浓度为0.1％)和等体积的20％TCA(终浓度为10％)，冰浴30min后离心，离心转速为12000rpm，离心时间为10min，离心后收集沉淀，再用质量浓度为0.01％的LMNG重悬沉淀溶解杂蛋白后离心，离心的转速为12000rpm，离心时间为10min，离心后收集沉淀即为多肽FP。
(4)质谱检测
利用飞行时间质谱对FP分子量进行检测，质谱检测出的目标蛋白分子量为4233.3Da，与酶切后的FP分子量(4232.9Da)一致，多肽FP质谱图见图12。
实施例2-1中1L液体LB培养基能培养得到100mg的TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA，酶切后FP产量为6.5mg每升发酵液。
实施例2-2
(1)构建载体质粒。同实施例2-1。
(2)构建的载体质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达
利用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并通过热激42℃，90s将重组质粒导入该大肠杆菌感受态中，在含有氨苄青霉素终浓度为50μg/mL的LB固体培养基中培养后，挑取单菌落并通过测序验证。测序结果正确的单菌落即重组阳性大肠杆菌在LB液体培养基中放大培养，随后LB液体培养基中加入质量浓度为50％的甘油(终浓度为25％)，分装后置于-80℃保藏。
将重组阳性大肠杆菌菌株接种于50mL LB液体培养基中，其中加入质量浓度为50mg/mL的氨苄青霉素(终浓度为50μg/mL)，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养。培养8h后，将所得菌液接入500mL的LB液体培养基中(加入50mg/mL的氨苄青霉素500μL)，LB液体培养基的起始OD600值为0.1，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下培养至菌液OD600值在0.6～0.8之间，通过离心收集菌体后转至体积为500mL的M9培养基中，在温度为30℃、转速为220rpm条件下孵育30min后加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，诱导12h后离心收集菌体置于-20℃保存。为获得均一的15N标记的FP，在M9培养基中添加1g/L的15NH4Cl作为唯一的氮源。
(3)蛋白纯化以及酶切。同实施例2-1。
(4)液体核磁共振检测
用缓冲溶液10(15mM DPC，20mM Tris，100mM NaCl，10％D2O，pH 7.4)溶解步骤(3)得到的多肽FP，多肽浓度为0.5mM。在配备三共振低温探头的Bruker 500MHz的光谱仪上进行检测，在298K下采集15N FP的1H-15N HSQC谱图，如图13所示。图13为15N标记FP经过二次镍柱纯化后的二维HSQC核磁谱图，该核磁图显示出的信号峰的化学位移与FP的氨基酸所对应的化学位移一致，因此，可确定所纯化出的多肽为FP。
对比例3
同实施例2-1，唯一的区别在于构建载体质粒为：直接将-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-基因序列插入到TrxA后，pET-32a(+)上含有TrxA标签，之后接入终止子TAA能够终止转录过程，从而得到重组载体质粒。
在FP的N端添加TrxA并在大肠杆菌中诱导表达后发现FP仍会降解，因此该方法并不适用于FP在大肠杆菌中的表达，如图10所示。根据图10可知，在FP的C端和N端同时添加TrxA可以帮助其在大肠杆菌中表达并有效制备。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种利用标签制备多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将编码融合蛋白的基因表达后得到多肽；所述多肽为易降解多肽或高毒性抗菌多肽；所述易降解多肽为FP；所述FP的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次为TrxA-6His-LVPRGS-FP-LVPRGS-6His-TrxA；
所述高毒性抗菌多肽为A3K/L7K-LAH4；所述A3K/L7K-LAH4的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述融合蛋白的氨基酸序列自N端到C端顺次为TrxA-DDDDK-K3K7-LVPRGS-TrxA-6His。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切位点包括凝血酶酶切位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码融合蛋白的核苷酸序列与载体连接后表达，所述载体包括pET-32a。
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