WO2004031243A1 - タンパク質ポリマー及びその製造方法 - Google Patents

タンパク質ポリマー及びその製造方法 Download PDF

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WO2004031243A1
WO2004031243A1 PCT/JP2003/012596 JP0312596W WO2004031243A1 WO 2004031243 A1 WO2004031243 A1 WO 2004031243A1 JP 0312596 W JP0312596 W JP 0312596W WO 2004031243 A1 WO2004031243 A1 WO 2004031243A1
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protein
ubiquitin
receptor
sum0
enzyme
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Inventor
Hisato Saitoh
Mitsuyoshi Nakao
Yasuhiro Uchimura
Original Assignee
Kumamoto Technology & Industry Foundation
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Definitions

  • the present invention relates to a protein polymer and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a novel protein polymer utilizing the isotopic binding of ubiquitin-like protein (SUM0), and a method for producing the same.
  • the present invention further provides a recombinant vector for high level expression of a protein conjugate or protein polymer in a host cell such as a bacterium, and a method for high level expression of a protein conjugate or protein polymer using the same. It is about. Background art
  • Protein molecules such as enzymes, antibodies, and receptors are immobilized in bioreactors and biosensors, and are used for the production, separation and purification of useful substances, detection and function elucidation of unknown substances, and drug screening. Therefore, if these protein molecules can be polymerized, the functions and performance of existing bioreactors and biosensors can be improved, and they can be applied to drug discovery, regenerative medicine, food processing, etc.
  • Ubiquitin is covalently bound to the target protein by a complex enzyme system consisting of an activating enzyme (El), a conjugating enzyme (E2), and a ligase (E3).
  • El activating enzyme
  • E2 conjugating enzyme
  • E3 ligase
  • the carboxyl group at the C-terminus of ubiquitin Bond to the ⁇ -amino group of the lysine residue of the protein.
  • the C-terminus of another ubiquitin repeats the isopeptide binding to the lysine residue at the 48th position of the ubiquitin bound to the lysine residue of the target protein, thereby forming a polyubiquitin chain.
  • SUMC small ubiquitin-related modulator is a small ubiquitin-like protein that is highly conserved in evolution from yeast to humans, plays an important role in cell growth control, and is located near the nuclear pore complex. There are many in the. It has been reported that SUM0 also binds to other proteins via isopeptide bonds by the same mechanism as ubiquitin, resulting in polymerization (MH Tatham et al., J. Biol. Chem. Vol. 276, p. 35368, 2001; A. Pichier et al., Cell, Vol. 108, p. 109, 2002; and ES Johnson & AA Gupta, Cell, Vol. 106, p. 735, 2001).
  • a first object of the present invention is to provide a protein polymer that can exert various physiological activities and enzyme activities using the ubiquitin-like protein SUM0.
  • a second object of the present invention is to provide a system capable of producing a protein conjugate ⁇ protein polymer in large amounts in host cells such as bacteria.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the first object, and as a result, a ubiquitin-like protein (SUM0) to which the target protein is directly or via an receptor has been converted into a polymer by an isopeptide bond reaction by an enzyme.
  • SUM0 ubiquitin-like protein
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the second object, and consequently found that SUM0-enzymes (ie, two types of SUM0-E1 and E2 enzymes), SUM0 and Axep Co-expressed in Escherichia coli, and succeeded in forming isopeptidic bonds in the cells, and developed a technology to produce large amounts of protein conjugate polymers.
  • SUM0-enzymes ie, two types of SUM0-E1 and E2 enzymes
  • SUM0 and Axep Co-expressed in Escherichia coli succeeded in forming isopeptidic bonds in the cells, and developed a technology to produce large amounts of protein conjugate polymers.
  • SUMO ubiquitin-like protein
  • the receptor is RanGAPl-C2 (Ran GTPase activating protein- C2), RanBP2 ⁇ IR (Ran binding protein 2-Internal Repeat domain), TDG (Thymine DNA Glycosylase) ⁇ TONAS (Tonal li related SP-ring protein), or The protein polymer according to any one of (1) to (3), which is PML (promyelocytic leukemia).
  • SUM0 is a ubiquitin-like protein
  • X is a target protein
  • a bold line is an isopeptide bond
  • a indicates an average degree of polymerization of 2 to 100.
  • SUMO is ubiquitin-like protein
  • X, Y, and X are target proteins
  • bold lines are isopeptide bonds
  • b, c, and d indicate average polymerization degrees of 0 to 100. And b, c, and d are not simultaneously 0
  • SUM0 is a ubiquitin-like protein
  • A is an receptor
  • X is a target protein
  • bold lines are isopeptide bonds
  • e is an average degree of polymerization of 2 to 100
  • SUM0 indicates a ubiquitin-like protein
  • X, Y, and ⁇ indicate a target protein
  • A indicates an receptor
  • bold lines indicate isopeptide bonds
  • f, g, and h indicate average polymerization degrees of 0 to 100.
  • SUMO indicates a ubiquitin-like protein
  • A indicates an receptor
  • X and Y indicate target proteins.
  • DNA that encodes an enzyme (E1) that activates ubiquitin-like protein and DNA that encodes an enzyme (E2) that binds ubiquitin-like protein to an receptor.
  • an AU is a fusion protein of an enzyme that activates Yubikichin like proteins (E1) is the Aosl and Uba, linking enzyme (E2) is Ubc 9, the recombinant expression vector according to (1 5).
  • A DNA encoding ubiquitin-like protein; and DNA encoding Z or receptor, including activator enzyme (El), conjugating enzyme (E2), ubiquitin-like protein and ubiquitin or receptor.
  • El activator enzyme
  • E2 conjugating enzyme
  • ubiquitin-like protein and ubiquitin or receptor.
  • a recombinant expression vector that can be expressed simultaneously in a host.
  • (21) Activation, including the use of the vector described in (19) in combination with a recombinant vector containing DNA encoding a ubiquitin-like protein or DNA encoding an receptor as necessary.
  • DNA encoding an enzyme (E1) that activates a ubiquitin-like protein DNA encoding a conjugating enzyme (E2) of a ubiquitin-like protein and an axceptor, and a DNA encoding a ubiquitin-like protein and an axceptor and, if desired, a target protein
  • E1 enzyme that activates a ubiquitin-like protein
  • E2 conjugating enzyme
  • E2 DNA encoding a ubiquitin-like protein and an axceptor
  • a target protein A recombinant expression vector containing DNA encoding the fusion protein, and capable of simultaneously expressing the above-mentioned activating enzyme (E1), binding enzyme (E2) and fusion protein in a host.
  • Transformation that can express an enzyme that activates ubiquitin-like protein (El), a conjugation enzyme between ubiquitin-like protein and receptor (E2), and a fusion protein of ubiquitin-like protein and receptor and, if desired, a target protein body.
  • FIG. 1 shows various structures that the protein polymer of the present invention can have.
  • FIG. 2 shows the structure of the GST-SUM0 fusion expression vector.
  • Fig. 3 shows the results of separating the polymerization reaction product of GST-SUM0 by SDS-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and detecting by Western method.
  • FIG. 4 shows the structure of the C2-SUM0 fusion expression vector.
  • FIG. 5 shows the structure of the GST-C2-SUM0 fusion expression vector.
  • Figure 6 shows the polymerization reaction of GST-C2-SUM0 by the El and E2 enzymes, and the results of separation of the reaction products by SDS-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and detection by the distan method.
  • FIG. 7 shows a structural schematic diagram of the modified SUMO-E1 enzyme (AU).
  • AU modified SUMO-E1 enzyme
  • An enzyme that forms an isopeptide bond between SUM0 and the receptor has been modified to facilitate expression in E. coli.
  • this modified enzyme is referred to as AU.
  • Conventional SUMO-E1 is an enzyme consisting of two subunit proteins, Aosl and Uba2.
  • a protein AU was prepared by fusing Aosl and Uba2 by genetic engineering. This AU protein is our original design, which fuses Aosl and Uba2 I, II, III, IV in a manner that preserves the domain structure. Cys indicates the position of cystine residues essential for enzyme activity.
  • FIG. 8 schematically shows a method of synthesizing a conjugate of target proteins X and Y in E. coli.
  • a specific experimental example is shown in Example 3.
  • X is the T7-domain and Y is the HIS-domain.
  • the C2 sequence is used as receptor A.
  • FIG. 9 is a diagram of the expression vector used in Example 3.
  • FIG. 10 shows the results of Example 3.
  • Figure 11 shows a schematic diagram of a method for synthesizing a polymer of target protein X in E. coli. Shown in A specific experimental example is shown in Example 4. In the fourth embodiment, X is a GST-domain, and C2 is used as the acceptor A.
  • FIG. 12 is a diagram of the expression vector used in Example 4.
  • FIG. 13 shows the results of Example 4.
  • FIG. 14 shows the results of Example 5 (analysis using various receptor sequences).
  • the protein polymer of the present invention is a protein polymer containing, in its main chain, a ubiquitin-like protein (SUM0: small uiquitin-related modifer) to which a target protein is bound directly or via an receptor.
  • a ubiquitin-like protein SUM0: small uiquitin-related modifer
  • SUM0 as used in the protein polymer of the present invention means ubiquitin-like protein, and includes all members of the group of modulators having high homology to ubiquitin. The origin does not matter. Preferably, they are derived from mammals, but may be those other than mammals such as yeast, insects, amphibians, reptiles, and plants. Examples of SUM0 that can be used in the present invention include SUM0-1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SUM0-2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and SUM0-3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. However, the present invention is not limited thereto.For example, as long as it has SUM0 protein activity and function, one to several amino acids may be deleted, replaced and / or inserted in the amino acid sequence. .
  • the “Aceptor” in the protein polymer of the present invention is a protein having an amino acid sequence containing a lysine residue capable of binding to SUM0 and an isopeptide, and is generally -F-Lys-H-Glu- (F: hydrophobic H: any amino acid).
  • F hydrophobic H: any amino acid
  • the receptor for example, RanGAPl (Ran GTPase activating protein), RanBP2-IR (Ran binding protein 2-Internal Repeat domain), PML (promyelocytic leukemia) and the like are used.
  • RanGAPl preferably used in the present invention GTPase activating protein
  • GTPase activating protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the lysine residue at position 121 binds to SUM0 with isopeptide (RanGAPl has a total length of 580 amino acids, of which the C-terminal region The amino acid sequence at positions 379 to 580 in the above is the C2 sequence).
  • the above-mentioned acceptors may be used alone or in an appropriate combination of two or more.
  • the main chain of the polymer may take a branched structure.
  • the main chain of the polymer may take a cyclic structure such as a triangle or a hexagon.
  • FIG. 1 shows various structures that the protein polymer of the present invention can have.
  • target protein in the protein polymer of the present invention is not particularly limited, and may be any protein.
  • enzymes, cytodynamics, hormones, antibodies, receptors, bioactive peptides, and the like may be used.
  • These target proteins contained in the polymer may be one kind or two or more kinds.
  • Examples of the enzyme include lipase, elastase, perokinase, protease, J3-amylase, isoamylase, glucanase, and ratatase.
  • Cytokines include, for example, interferon- ⁇ , _ ⁇ , - ⁇ Shammore necrosis factor ⁇ , ⁇ , macrophage migration inhibitory factor, colony ⁇ IJ intense factor, transfer factor, interleukin, growth factor (epithelial cell growth Factors, fibroblast growth factor, nerve cell growth factor) and the like.
  • hormone examples include insulin, growth hormone, prolatatin, erythropoietin, follicle-stimulating hormone and the like.
  • the antibody examples include human immunoglobulin and the like, and may be an active fragment of the antibody such as F (ab ') 2 , Fab', or Fab.
  • a substance having a similar function as an antibody for example, a substance having a single-chain antigen-binding activity, specifically, a single-chain It may be a Fab peptide.
  • the receptor examples include a hormone receptor, a cytodynamic receptor, a receptor for a growth factor, a receptor for a neurotransmitter, an antibody receptor (Fc receptor), and a complement receptor.
  • physiologically active peptide examples include amyloid, angiotensin, endothelin, canolecitosine, neuropeptide Y, neurocun II, human xytocin, PCAP, and the like.
  • the molecular weight (kDa) of the target protein is in the range of 2 to 1000 kDa, preferably 2 to 100 kDa, particularly 10 to 50 kDa. When the molecular weight of the target protein is in this range, a fusion with SUMO may occur. It is preferable because it does not cause steric hindrance.
  • Protein polymers of the present invention when represented by the formula), an average degree of polymerization represented by a is 2-1 0 0, preferably 2-5 0, more preferably 3 to 0.
  • the average degree of polymerization represented by b, c, and d is 0 to 100, preferably 0 to 50, more preferably 0. 110 (except when b, c, and d are simultaneously 0).
  • the average degree of polymerization represented by e is from 2 to 100, preferably from 2 to 50, and more preferably from 3 to 10.
  • the average degree of polymerization represented by f, g, and h is 0 to 100, preferably 0 to 50, and more preferably 0 to 10 (except when f, g, and h are simultaneously 0).
  • the structural units X-A-SUM0, YA-SUMO, or Z-A-SUMO may be randomly bonded, or may be bonded in a block. You can do it.
  • X-A-SUM0, YA-SUMO and Z or Z-A-SUMO are charged to the reaction system from the beginning, a random polymer is obtained.
  • X-A-SUM0 or Y-A_SUM0 or Z-A- When one of SUM0 is charged, and then the other constituent units are charged sequentially, a block polymer can be produced.
  • ubiquitin-like protein SUM0 target protein X
  • (I) Protein treasure conjugate represented by the formula: 511—10-81 ⁇ in which a fusion protein of A and target protein Y is bound is also within the scope of the present invention.
  • the target protein ( ⁇ ) to be bound to the receptor may be bound to either the amino or carboxy terminal side of the receptor or to both. it can.
  • a reaction substrate to be a monomer is prepared.
  • a method for preparing a reaction substrate a method of connecting a gene encoding a ubiquitin-like protein (SUM0), a target protein, and an receptor and introducing the gene into an appropriate expression system to express the protein as a fusion protein, or expressing each protein as a fusion protein Any method may be used, in which the components are separately prepared and then chemically bonded using a crosslinking agent or the like.
  • fusion refers to a reaction substrate prepared by a method of expressing a fusion protein by genetic engineering
  • conjuggate refers to a reaction substrate prepared by ligated binding. Shall be referred to. Any reaction substrate prepared by genetic engineering or chemical bonding is a substrate with good polymerization.
  • a DNA fragment containing a gene encoding SUM0, the target protein, or the receptor is constructed, and then the DNA fragment is inserted downstream of the promoter of the expression vector.
  • a suitable host cell Into a suitable host cell.
  • the target protein is a gene such as GST (daltathione S-transferase), MBP (maltose binding protein), histidine hexamer, or thioredoxin, or downstream of a reporter gene such as a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). And expressed as a fusion protein with these. Also, the target protein itself is GST, MBP, histidine Hexomer, thioredoxin, and fluorescent protein.
  • the host cell used is not particularly limited as long as it can express the target gene, and examples thereof include bacteria, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • the expression vector those capable of autonomous replication in the above-mentioned host cell or integration into the chromosome and containing a promoter at a position where the above-mentioned target DNA can be transcribed are used.
  • the introduction of the recombinant vector may be performed by a method conventionally used depending on the host cell to be used.
  • the transformant into which the recombinant vector has been introduced is cultured in a medium, a SUM0-protein fusion is produced and accumulated in the culture, and the SUM0-protein fusion is collected from the culture to obtain a SUM0-protein fusion. Protein fusions can be isolated.
  • the transformant can be cultured according to a conventional method.
  • the culture medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be utilized by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used for culturing the transformant.
  • Culture conditions, cultivation temperature, cultivation time, and culture medium pH may be adjusted according to commonly used conditions depending on the host cell used.
  • a conventional enzyme isolation and purification method may be used. For example, when the SUM0-protein fusion is expressed in a lysed state in the cells, after culturing, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with an ultrasonic disrupter or the like. Crush to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting method, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange port using resin such as minoethyl (DEAE) Sepharose Chromatography, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Bulmasia), hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose, gel filtration using a molecular sieve, and affinity chromatography.
  • a purified sample can be obtained by using alone or in combination with the two-take mouth matography method, the chromatophoresis method, and the electrophoresis method such as isoelectric focusing.
  • the SUM0-protein fusion When the SUM0-protein fusion is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a precipitate according to a conventional method. After the recovery of the fusion, the insoluble form of the fusion is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the lysate into a solution containing no protein denaturant or a dilute solution in which the protein denaturant concentration is low enough not to denature the protein, the fusion is made into a normal three-dimensional structure. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the fusion can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • the synthesis of the SUM0-protein fusion may be performed using a cell-free protein synthesis system that extracts a protein-synthesizing component from appropriate cells and synthesizes the target protein using the extracted solution. .
  • a cell-free protein synthesis system contains liposomes, initiation factors, elongation factors, tRNA, and other elements necessary for the transcription / translation system.
  • the SUM0-protein fusion was converted to SUM0 activating enzyme El (Asol / Uba2), SUMO-binding enzyme H2 (Ubc9), ATP, It is polymerized by isopeptide bonds in the reaction solution in the presence of metal ions.
  • the polymerization reaction should be performed using purified enzyme components. Since the El and E2 enzymes involved in the conversion reaction have high substrate specificity, they can be used even if their purification purity is not particularly high.
  • the concentration of the substrate in the reaction solution may be any concentration as long as the reaction is not hindered.
  • the concentration is preferably 0.01 mM to 1 M.
  • the concentration of the enzyme used in the reaction is not particularly limited, but is preferably 0.01 mg / ml to 100 mg / ml.
  • the ATP concentration is preferably in the range of 0.01 to 10.
  • a divalent metal ion such as a magnesium ion and a calcium ion is preferably used.
  • the concentration is preferably in the range of 0.01 to: LOmM.
  • reaction promoting substance may be appropriately added to the reaction system.
  • reaction promoting substance include, but are not limited to, a group of protein families called SP-RING protein or SIZ / PIAS, RanBP2 / Nup358, and the like.
  • the reaction temperature may be within a temperature range that does not inhibit the activity of E1 and E2, and is preferably in a range including the optimum temperature.
  • the reaction temperature is usually from 10 ° C to 60 ° C, preferably from 30 ° C to 40 ° C.
  • a ⁇ base protein '' refers to a protein having an amino acid sequence containing a lysine residue capable of isopeptide binding to the C-terminus of SUM0, for example, RanGAPl (Ran GTPase activating protein), RanBP2-IR ( Ran binding protein 2-Internal Repeat domain, PML (promyelocytic leukemia), Spl00, p53, etc. can be suitably used.
  • the reaction product can be separated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) or the like, and then subjected to Immnoplot analysis using an appropriate antibody to detect a decrease in the substrate and an increase in the reaction product.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the SUM0 protein polymer of the present invention can be used for various purposes as it is. However, in order to facilitate handling or to improve the reactivity per unit weight, it is preferable to use the carrier in a state of being supported on various inorganic or organic compound carriers.
  • the method of the present invention relates to a recombinant expression system that enables overexpression of a protein conjugate or a polymer by using a biosynthesis system in Escherichia coli for a reaction conventionally performed in a test tube.
  • the first expression vector encodes SUM0, the receptor and the target protein
  • the second expression vector encodes enzymes (E1 and E2 enzymes) that catalyze the reaction of isopeptide binding between SUM0 and the receptor. I have.
  • SUM0 is a ubiquitin-like protein.
  • El SUM0 activating enzyme
  • ⁇ E2 SUM0 conjugating enzyme
  • SUM0-E1 is a heterocomplex of two proteins called Aosl and Uba2 It becomes.
  • Aosl and Uba2 were cloned from mouse cDNA by PCR, and the fusion protein was designed by ligating the two fragments in series.
  • This Aosl-Uba2 fusion gene (AU gene) was introduced into the BamHI-EcoRI site of the pGEX expression vector, and a system for expressing the GST-AU protein in E. coli was developed.
  • Ubc9 which is SUM0-E2
  • Ubc9 was introduced independently of AU to produce pGEX-AU / Ubc9 as shown in FIG.
  • GST-AU is linked downstream of the Taq promoter
  • Ubc9 is linked downstream of the T7 promoter
  • the two gene products are designed to be inducible by IPTG.
  • the vector used here has an origin of replication derived from pBR322 and is ampicillin drug resistant.
  • the plasmid name was pGEX-AU / Ubc9.
  • GST-AU and Ubc9 expressed from this plasmid vector have E1 and E2 enzyme activities, respectively, and have the ability to catalyze the SUM0-forming reaction.
  • the C-terminal domain C2 of the protein called RanGAPl (the total length of RanGAPl is 580 amino acids, of which the amino acid sequence from the 397th to 580th amino acid in the C-terminal region is the C2 sequence) is specific in cells. It is known that SUM0 conversion will occur.
  • FIG. 9 shows an expression vector in which genes encoding the two products have been introduced downstream of the T7 promoter.
  • SUM0-1 was obtained by PCR from human cDNA, and C2 was obtained by cDNA from Xenopus laevis.
  • the vector used here is a modified version of pACYC, has a P15A origin of replication, and is resistant to chloramphenicol drug. Expression of the two genes can be induced by IPTG.
  • the plasmid name was pT-SUM0 / C2.
  • the above-mentioned pGEX AU / Ubc9 and P T- SUM0 / C2 simultaneously into a host (e.g., E. coli, etc.). Cells that have taken up these two plasmids simultaneously can be selected on a medium containing both ampicillin and chloranphenicol.
  • the obtained colonies are cultured in a separate liquid medium under suitable conditions, and further cultured by adding IPTG to induce expression.
  • the cells are sedimented by a centrifugal separator, and then the cells are disrupted by ultrasonic treatment or the like. I do. After centrifugation, take out the supernatant, incubate with -Accelagarose beads, and elute the proteins bound to the beads.
  • T7-domain-SUM0-1 and His-domain-C2 can be recovered.
  • Various protein conjugates can be prepared by modifying the vector used above. As shown in Fig. 8, when the target protein X is introduced in place of the T7-domain and the target protein Y is introduced in the case of the His-domain, X-SUM0-C2-Y
  • C2 was used as an acceptor, but an acceptor sequence other than C2 can be used.
  • SUM0-1 related sequences such as SUM0-2 and SUM0-3 can also be used. There are no restrictions on these combinations.
  • GST protein (27 kDa) is used as X of X-A-SUM0, and C-terminal domain C2 of a protein called RanGAPl is used as A sequence (GST-C2-SUM0_1).
  • the vector incorporates GST-C2-SUMO-1 into pACYC and calls this plasmid pT-GST-C2-SUM0 (see Figure 12).
  • the above-described pGEX-AU / Ubc9 and pT-GST-C2-SUM0 are simultaneously introduced into a host (eg, E. coli).
  • a host eg, E. coli
  • Cells that have taken up these two plasmids simultaneously can be selected on a medium containing both ampicillin and chloramphenicol.
  • the obtained colony is cultured under a suitable condition in a separate liquid medium, and further cultured by adding IPTG to induce expression.
  • the cells are sedimented by a centrifuge, and then the cells are disrupted by sonication or the like. After centrifugation, remove the supernatant, incubate with Daltathione Sepharose beads, and elute the proteins bound to the beads.
  • GST-C2-SUM0 polymer obtained by polymerizing GST-C2-SUMO can be recovered.
  • various proteins X can be introduced into the polymer instead of GST. That is, as shown in FIG. 11, by introducing various target proteins X as C2-SUM0 fusion proteins, large quantities of C2-SUM0-based X polymers can be produced in Escherichia coli.
  • C2 was used as an acceptor, but it is also possible to use an acceptor sequence other than C2.
  • acceptor sequence other than C2.
  • related sequences such as SUM0-2 and SUM0-3 can be used, and the shape of the polymer base axis can be modified. There is no particular limitation on the combination of the acceptor and SUM0.
  • a group of proteins having a ubiquitin-like structure such as ubiquitin, SUMO, NEDD8 / Rubl, and Apgl2, are called ubiquitin families. These ubiquitin-family proteins have the property of being bound to the receptor site of another protein by an activating enzyme (E1) and a conjugating enzyme (E2).
  • E1 activating enzyme
  • E2 conjugating enzyme
  • Ubal as Yubikichin E1 is, terrorist dimer to Aosl / Uba2 as SUM0-E1 is
  • NEDD8 - E1 as the APP-BPl / Uba3 is terrorist dimer
  • Ap g 7 is known as E1 of Apgl2.
  • Ubcl -8, 10, 11, 13 are known as ubiquitin E2
  • Ubc9 is known as SUMO-E2
  • Ubcl2 is known as NEDD8-E2
  • ApglO is known as E2 of Apgl2.
  • the ubiquitin-like protein used in the present method means a ubiquitin-like protein, and includes all of a group of modifiers having high homology with ubiquitin, and specific examples thereof include ubiquitin, SUMO, NEDD8 / Rubl, Apgl2, and the like.
  • the origin is not limited, and it is preferably derived from mammals, but may be other than mammals such as yeast, insects, amphibians, reptiles, and plants.
  • S-cap 0 examples include SUM0-1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SUM0-2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and SUM0 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. -3, but is not limited thereto.For example, as long as it has SUM0 protein activity and function, one to several amino acids may be deleted, substituted, and / or inserted in the amino acid sequence. Good.
  • the “Axceptor” used in the present method is a protein having an amino acid sequence containing a lysine residue capable of isotopically binding to the above-mentioned ubiquitin-like protein, and is generally -F-Lys-H-Glu- (F: hydrophobic Amino acid, H: any amino acid).
  • F hydrophobic Amino acid, H: any amino acid.
  • the receptor those described in the section of “1. the protein polymer of the present invention” in the present specification can be used.
  • target protein used in the present invention is not particularly limited, and may be any protein.
  • target protein those described in the section of “1. the protein polymer of the present invention” in the present specification can be used.
  • the present invention includes:
  • DNA that encodes an enzyme (E1) that activates ubiquitin-like protein and DNA that encodes an enzyme (E2) that binds ubiquitin-like protein to sacceptor. ) Can be expressed simultaneously in the host W vector one;
  • DNA encoding the enzyme (E1) that activates ubiquitin-like protein DNA encoding the enzyme that binds ubiquitin-like protein to the receptor (E2); DNA encoding the ubiquitin-like protein; and DN encoding Z or the receptor A, a recombinant expression vector capable of simultaneously expressing an activator enzyme (El), a conjugating enzyme (E2), a ubiquitin-like protein and Z or an X-ceptor separately in a host; a combination of a ubiquitin-like protein and an Axceptor A recombinant expression vector containing a DNA encoding the fusion protein and capable of expressing a fusion protein of a ubiquitin-like protein and an receptor in a host;
  • DNA encoding the enzyme that activates ubiquitin-like protein (E1) DNA that encodes the enzyme that binds ubiquitin-like protein and sceptor (E2), and fusion protein between ubiquitin-like protein and sceptor and, if desired, the target protein
  • a recombinant expression vector comprising a DNA encoding a protein, and capable of simultaneously expressing the activating enzyme (E1), the conjugating enzyme (E2) and the fusion protein in a host;
  • the above-mentioned various recombinant expression vectors can be constructed by inserting a desired gene into an appropriate transgene insertion site in an ordinary expression vector.
  • the expression vector those capable of autonomous replication in the host cell or integration into the chromosome and containing a promoter at a position capable of transcribing the target nucleotide sequence described above are used.
  • the expression vector for example, various expression vectors commercially available from Promega, QIAGEN, Strategne, Pharmacia, Takara Shuzo, and the like can be used.
  • the host cell used to introduce the expression vector according to the above (3) is not particularly limited as long as it can express the target gene.
  • examples thereof include bacteria, yeast, animal cells, plant cells, and insects. Cells and the like can be mentioned.
  • bacteria for example, bacteria belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micropacterium, etc.
  • bacteria for example, bacteria belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micropacterium, etc.
  • bacteria for example, bacteria belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micropacterium, etc.
  • the introduction of the recombinant expression vector may be carried out by a method conventionally used depending on the host cell to be used. Examples thereof include a calcium phosphate method, a protoplast method, an electoporation method, a spheroblast method, a lithium acetate method, and a lipofection method. And so on.
  • the transformant into which the recombinant expression vector has been introduced is cultured in a medium, a SUM0-protein fusion is produced and accumulated in the culture, and the ubiquitin-like protein-protein fusion is collected from the culture.
  • a ubiquitin-like protein-protein fusion can be isolated.
  • the method for culturing the transformant, the isolation and purification of the ubiquitin-like protein-protein fusion of the present invention from the culture of the transformant, and the separation and quantification of the target substance are described in 2. of the present specification. You can do as street.
  • a ubiquitin-like protein / Axceptor conjugate or a ubiquitin-like protein / Axceptor polymer can be produced and isolated.
  • a fusion protein in which the target proteins X and Y are bound to receptor (A) and SUM0, respectively, can be used. This creates a conjugation of X-SUM0-YA.
  • the target protein to be bound to the receptor may be on the amino terminal side or the lipoxy terminal side of the receptor, or may be attached to both.
  • the protein polymer produced by the method of the present invention is a protein polymer containing, in its main chain, a ubiquitin-like protein (eg, SUMO: small uiquitin-related modulator) to which a target protein is bound directly or via an receptor.
  • a ubiquitin-like protein eg, SUMO: small uiquitin-related modulator
  • SUM0 is a ubiquitin-like protein
  • A is an receptor
  • X is a target protein
  • bold lines are isopeptide bonds
  • e is an average degree of polymerization of 2 to 100.
  • Another example of a protein polymer includes the following formula (IV):
  • SUM0 is a ubiquitin-like protein
  • X, Y, and ⁇ are target proteins
  • A is an acceptor
  • bold lines are isopeptide bonds
  • f, g, and h indicate average polymerization degrees of 0 to 100. However, unless f, g, and h are 0 at the same time).
  • the average degree of polymerization represented by e is from 2 to 100, preferably from 2 to 50, and more preferably from 3 to 10.
  • the average degree of polymerization represented by f, g, and h is 0 to 100, preferably 0 to 50, and more preferably 0 to 10 (except when f, g, and h are simultaneously 0).
  • the structural units XA-SUMO, YA-SUM0 or ZA-SUM0 may be bonded at random or may be bonded at a block. Good.
  • a DNA encoding X-A-SUM0, YA-SUM0 or ZA-SUMO is incorporated into the same or a different expression vector to prepare a recombinant expression vector, which is then used as a host. And expression can be carried out.
  • X-A-SUM0, YA-SUM0 and Z or Z-A-SUM0 in the transformed host from the beginning gives a random polymer, which is initially X-A-SUM0 or Y-A-SUM0 or Z -By expressing one of A-SUM0 and then expressing other structural units in the next step, a block polymer can be produced.
  • DNA fragments encoding GST (glutathione binding protein: 27 kDa) and SUMO were each synthesized by PCR and ligated to an expression vector, pGEX (Amersham Pharmacia) (Fig. 2). Extracts were prepared from E. coli transformed with the recombinant plasmid, placed on daltathione binding ram, and equilibrated with phosphate buffered saline. After washing the column with the same buffer, the GST-SUM0 fusion was eluted with the same buffer containing 20 reduced daltathione and subjected to gel filtration on a Sephadex G-75 column.
  • the GST-SUM0 fusion obtained above was about 50 kDa. 0.2 ⁇ g of this GST-SUM0 fusion was added in the presence of 0.02 gEl, 0.02 ⁇ g E2, 5 mM ATP, and 20 ⁇ l of 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, The reaction was carried out at 37 ° C for 10 minutes in a solution of 20 mM NaCl, 0. ImM DTT, and 5 mM MgCl 2 . After the reaction products were separated by SDS polyacrylamide denaturing gel electrophoresis, the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane, and GST-SUM0 was detected by GST antibody. (Fig. 3).
  • This band exists at an interval of about 50 kDa, and the difference in molecular weight almost coincides with one molecule of GST-SUM0.
  • the C-terminal region of RanGAPl (RanGTPase Activating Protein 1) called C2 was selected as the receptor.
  • RanGAPl is a protein that promotes the hydrolysis of the low-molecular-weight GTP-binding protein Ran, and is involved in nuclear-cytoplasmic mass transport.
  • DNA fragments encoding C2 and SUMO were each synthesized using PCR and ligated to an expression vector, pET28 (Novagen) (FIG. 4). Extracts were prepared from E. coli cells transformed with the recombinant plasmid, placed on M (nickel) plates, and equilibrated with phosphate buffered saline. After washing the column with the same buffer, the C2-SUM0 fusion was eluted with the same buffer containing 250 mM imidazole and subjected to gel filtration on a Sephadex G-75 column.
  • GST-C2-SUM0 fusion obtained above was about 60 kDa.
  • GST-C2-SUM0 fusion 0. in the presence of 0.1 l ⁇ gEl, 0.1 // ⁇ ⁇ 2, 5 ⁇ 20, 20 ⁇ 1 20raM Tris-HC1, pH 7.5, 20 mM NaCl, 0. ImM
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes in a DTT, 5 mM MgCl 2 solution.
  • SDS-polyacrylamide denaturing gel electrophoresis multiple step-like bands were detected toward the high-molecular region (Fig. 6).
  • the amplified PCR fragment was cloned into the EcoRI site of a pGEX vector (Amersham Pharmacia Biotech), and the resulting plasmid constructs were named pGEX-Aosl and pGEX-Uba2, respectively.
  • the nucleotide sequence of Mouse Aosl cDNA is shown in SEQ ID NO: 5
  • the nucleotide sequence of Mouse Uba2 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Aosl-Uba2 chimeric construct Aosl and Uba2 were amplified by PCR using the following oligonucleotides.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of mouse AU cDNA (GMTTC is the binding region between Aos1 and Uba2).
  • Xenopus (African algae) Ubc9 (base sequence is shown in SEQ ID NO: 8) was cloned and inserted into pT7-7 vector (Saitoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol94, 3736- 3741, 1997).
  • the amino acid sequence of Ubc9 in African frog is 100% homologous to the amino acid sequence of human and mouse Ubc9. PCR was performed using the following primers.
  • pT-Trx (Chang, ACY & Cohen, SN: J. Bacteriol., 134, 1141-1156, 1978; Yasukawa, T. et al .: J. Biol. Chem., 270, 25328-25331, 1995).
  • the resulting plasmid is called pT-T7-SUMO-1.
  • the C-terminal region of RanGAPl (RanGTPase Activating Protein 1) called C2 was selected as the receptor.
  • RanGAPl is a protein that promotes the hydrolysis of the low-molecular-weight GTP-binding protein Ran, and is involved in nuclear-cytoplasmic mass transport.
  • DNA fragments encoding C2 and SUM0 were synthesized using PCR, respectively, and ligated to the expression vector pET28 (Novagen). This plasmid vector is called pET28-His-C2.
  • This plasmid contains the His-C2 fusion protein I'm doing it. The following sequence is fused to the N-terminal upstream of the C2 sequence.
  • PCR was performed using the following primers.
  • the amplified fragment was digested with Bglll, it was ligated with the above pT-T7-SUM0-1 which was also treated with Bglll.
  • the resulting plasmid pT-SUMO-1 / C2 is designed to simultaneously express two fusion proteins, His-C2 and T7-SUMO-1, by inducing the T7 promoter with IPTG.
  • the above-described pGEX-AU / Ubc9 and pT-SUM0 / C2 are simultaneously introduced into E. coli BL21DE3.
  • Cells that have taken up the two plasmids simultaneously can be selected on a medium containing both ampicillin and chloranphenicol. Independently of this, the cells into which only ⁇ ⁇ -SUM0 / C2 has been introduced are selected on a chloramphene-col medium.
  • Lane 21 shows the transfection with BL21DE3
  • lane 2 shows the transfection with pT-SUM0 / C2.
  • a protein of 40 kda is clearly observed in the latter, and in the latter, a protein of 25 kda is clearly observed by Coomassie blue staining.
  • the former band is reactive with His and SUM0-1 antibodies, while the latter is reactive only with His antibody.
  • About 0.2 mg of 4 Okda protein can be obtained from 1 L of culture.
  • Each DNA fragment was synthesized using PCR and ligated to the expression vector pGEX (Amersham Pharmacia).
  • the obtained plasmid is called pGEX-C2-SUM0-1.
  • pGEX-C2-SUM0-1 as type I DNA
  • a GST-C2-SUM0-1 fragment was amplified by PCR using the following primers.
  • the obtained plasmid pT-GST-C2-SUM0-1 is designed to express a fusion protein of GST, C2 and SUM0-1 by inducing the ⁇ 7 promoter with IPTG.
  • the above-described pGEX-AU / Ubc9 and pT-GST-C2-SUMO are simultaneously introduced into E. coli BL21DE3.
  • Cells that have simultaneously taken up the two plasmids are ampicillin and chloranfe. Selection can be performed on a medium containing both of the two calls. Independently of this, cells into which only pT-GST-C2-SUM0 has been introduced are selected on a chloranphenicol medium.
  • the cells are sedimented in a centrifugal separator, and then spun into 1 O ml of PBS buffer, and then disrupted by sonication. After centrifugation, remove the supernatant and incubate with 1 ml of Glutathione Sepharose beads for 1 hour at 4 ° C. After washing the beads with PBS, the proteins bound to the beads are eluted with PBS containing 2 OmM glutathione. The protein is analyzed by 10% SDS-PAGE and the ⁇ stan method.
  • pGEX-AU / Ubc9 and pT-GST-C2-SUM0 were simultaneously introduced into E. coli -BL21DE3 and induced for 12 hours, and lane 2 was induced for 6 hours. Is shown.
  • lane 3 shows that only pT-GST-C2-SUM0 was induced and expressed for 12 hours.
  • a step-like band of about 60 kda is clearly observed by Coomassie-bleeding, but in lane 3 these are not observed.
  • the former band is considered to be a band in which GST-C2-SUM0 is polymerized, because it shows reactivity to SUMO-1 antibody. About 0.1 mg of these proteins can be obtained from 1 L of culture.
  • TDG Thymine DNA Glycosylase
  • T0NAS1 Thymine DNA Glycosylase
  • RanBP2-IR Internal repeat domain in Ran binding protein 2
  • T0NAS Tional li related SP-ring protein
  • SEQ ID NO: 30 amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 30 linked to the C-terminus of GST (GST-TDG, GST-BP2-IR, GST-T0NAS) was reacted with SUMO enzyme El and E2, ATP, SUM0-1 at 30 ° C for 30 minutes.
  • the reaction was performed without adding the enzyme as a control.
  • the reaction product was purified by adding GST beads, subjected to electrophoresis, stained, and the protein was detected. The results are shown in FIG. Specifically, the procedure was as follows.
  • GST-TDG 70kDa 1 / ig in the presence of lg SUMO-1, l // g El, E2, 5mM ATP, 100 ⁇ l of 20raM Tris-HCl, pH7.5, 20mM NaCl, 0.ImM DTT, 5mM MgCl
  • the two solutions were reacted at 30 ° C. for 30 minutes.
  • 30 ⁇ l of glutathione beads was added to the reaction solution, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Analysis of the protein bound to the beads by SDS polyacrylamide denaturing gel electrophoresis revealed a band at 90 kDa (A in FIG. 14).
  • TDG is an receptor that binds one molecule of SUM0-1.
  • GST-TONASldelta 60 kDa 1 zg with 1 g SUMO-1, 1 / ig El, 1 ⁇ g E2, 5 mM ATP, 100 ⁇ l of 20 mM Tris-HCl, pH7.5, 20 mM NaCl, 0.ImM DTT, The reaction was carried out at 30 ° C. for 30 minutes in a 5 mM MgCl 2 solution. After the reaction, 30 // 1 daltathione beads were added to the reaction solution and reacted at room temperature for 30 minutes. The protein bound to the beads is converted to SDS Analysis by polyacrylamide denaturing gel electrophoresis revealed a step-like band (C in Fig. 14). This suggests that T0NAS is an receptor that binds multiple molecules of SUM0-1. This axceptor is likely to build branched or laminated polymers. Industrial potential
  • a protein polymer capable of introducing a plurality of types of proteins and exhibiting various physiological activities and enzyme activities.
  • the protein polymer of the present invention can be used in a bioreactor nanosensor or the like to efficiently produce useful proteins and recognize trace chemical substances, and is useful in the fields of food production, pharmaceutical production, and the like.
  • the protein polymer of the present invention can be used for basic research or regeneration of general molecular biology, such as elucidation and control of functions of molecules involved in various biological mechanisms such as immunity, information transmission, neurotransmission, and cancer cell proliferation. Medical ⁇ Can be applied to cancer treatment.

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Abstract

　本発明の目的は、ユビキチン様タンパクSUMOを用いて多様な生理活性や酵素活性を発揮しうるタンパク質ポリマーを提供すること、並びにタンパク質コンジュゲイトやタンパク質ポリマーを細菌などの宿主細胞において大量に生産できる系を提供することである。本発明によれば、目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（SUMO）を主鎖に含むタンパク質ポリマーが提供される。

Description

明細書
タンパク質ポリマー及びその製造方法 技術分野
本発明は、 ュビキチン様タンパク質 (SUM0)のィソぺプチド結合性を利用した新 規タンパク質ポリマー、及びその製造方法に関するものである。さらに本発明は、 細菌などの宿主細胞中でのタンパク質コンジュゲイトもしくはタンパク質ポリマ 一の高レベルの発現のための組み換えべクターおょぴそれを用いたタンパク質コ ンジュゲイトもしくはタンパク質ポリマーの高レベルの発現方法に関するもので ある。 背景技術
酵素、 抗体、 受容体などのタンパク質分子は、 バイオリアクターやバイオセン サーなどに固定化され、有用物質の生産や分離精製、未知物質の検出や機能解明、 薬剤のスクリーニングなどに利用されている。 従ってこれらのタンパク質分子を ポリマー化することができれば既存のバイォリアクタ一やバイォセンサ一の機 能 ·性能を向上させることができ、 また創薬や再生医療、 食品加工等に応用でき る。
従来からタンパク質分子を重合させる方法としては架橋剤を用いる方法が一般 的である。 しかしながら、 この方法では重合する分子の方向性を制御することが 困難であったり、 重合させたい分子の活性中心に架橋剤が結合し、 その結果、 タ ンパク質の変性や活性損失が起こるなどの問題があった。 従って、 これまでタン パク質の機能を保ちつつ生化学的に均一なポリマーを合成する手法は存在しない。 一方、ュビキチンは 76個のアミノ酸からなり、酵母からヒトに至るまで非常に 良く保存された小さなタンパク質である。ュビキチンは活性化酵素（E l )、結合 酵素 （E 2 )、 リガーゼ （E 3 ) 力 ら構成される複合酵素系によって標的タンパク 質に共有結合する。 つまりュビキチンの C末端のカルボキシル基が標的タンパク 質のリジン残基の ε—ァミノ基にイソペプチド結合する。 さらに、 標的タンパク 質のリジン残基に結合したュビキチンの 48番目のリジン残基に別のュビキチン の C末端がィソぺプチド結合を繰り返すことにより、 ポリュビキチン鎖が形成さ れる。
また、 SUMC small ubiquitin- related mod er)は小さなュビキチン様タンパク 質で、 酵母からヒトに至るまで進化上極めてよく保存されており、 細胞増殖制御 に重要な役割を果たし、核膜孔複合体の近くに多く存在している。 SUM0もまたュ ビキチンと同様な機構によりイソペプチド結合を介して他のタンパク質に結合し、 ポリマー化が起こることが報告される （M. H. Tatham et al. , J. Biol. Chem. Vol. 276, p. 35368, 2001； A. Pichier et al. , Cell, Vol. 108, p. 109, 2002；及 ぴ、 E. S. Johnson & A. A. Gupta, Cell, Vol. 106, p. 735, 2001 を参照）。 また、 ュビチキンと融合したタンパク質は分解されやすいのに対し、 SUM0と融合したタ ンパク質は安定になることが知られている （J. M. Desterro et al. , Mol. Cell, Vol. 2, p. 8660, 1998 ;及び T. Buschmann st al. , Cell, Vol. 101, p. 753, 2000 を参照）。 しかしながら、 目的タンパク質を融合させた SUMOをポリマー化させた 例は今まで報告がない。 発明の開示
本発明の第一の目的は、ュビキチン様タンパク SUM0を用いて多様な生理活性や 酵素活性を発揮しうるタンパク質ポリマーを提供することにある。 本発明の第二 の目的は、 タンパク質コンジュゲイトゃタンパク質ポリマーを細菌などの宿主細 胞において大量に生産できる系を提供することである。
本発明者らは上記第一の目的を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 目的タンパ ク質が直接またはァクセプターを介して結合したュビキチン様タンパク質 (SUM0) を、 酵素によるイソペプチド結合反応によりポリマー化することに成功した。 さ らに本発明者らは、 上記第二の目的を解決するために鋭意検討した結果、 哺乳動 物の SUM0化酵素 （即ち、 SUM0化 E1酵素と E2酵素の 2種類） と SUM0とァクセプ ターとを大腸菌で同時に発現させることにより、 菌体内でィソぺプチド結合を形 成させることに成功し、 タンパク質コンジュゲイトゃポリマーを多量に生産する 技術を開発した。 本発明はこれらの知見に基づレ、て完成したものである。
すなわち、 本発明によれば、 以下の （1) 〜 （30) の発明が提供される。
(1) 目的タンパク質が直接またはァクセプターを介して結合したュビキチ ン様タンパク質 （SUMO) を主鎖に含むタンパク質ポリマー。
(2) 目的タンパク質がポリマー中に 1種又は 2種以上含まれる、 （1) に記 載のタンパク質ポリマー。
(3) 主鎖が直鎖状、 分枝状、 環状、 又は自己集合によるチューブ形状であ る （1) 又は （2) に記載のタンパク質ポリマー。
(4) ァクセプターが、 ポリマ一中に 1種又は 2種以上含まれる （1) から (3) のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
(5) ァクセプターが RanGAPl - C2 (Ran GTPase activating protein- C2) 、 RanBP2~IR (Ran binding protein 2 - Internal Repeat domain)、 TDG (Thymine DNA Glycosylase) ^TONAS (Tonal li related SP-ring protein)、又は PML (promyelocytic leukemia) である （1) から （3) のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
(6) 下記式 （I)： 画 ，
X-SUMOJa (I)
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 Xは目的タンパク質、 太線はイソぺプ チド結合、 aは 2〜100の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
(7) 下記式 （II)： W
Z-SUMO
I
Y-SUMO
(M)
讓
X-SUMO
I b
(式中、 SUMOはュビキチン様タンパク質、 X、 Y、 及ぴ Ζは目的タンパク質、 太 線はィソぺプチド結合、 b、 c、 及び dは 0から 1 0 0の平均重合度を示す。 但 し、 b、 c、 及ぴ dが同時に 0の場合は除く）
で表されるタンパク質ポリマー。
( 8 ) 下記式 （III)：
Figure imgf000006_0001
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 Aはァクセプター、 Xは目的タンパク 質、 太線はィソぺプチド結合、 eは 2〜 1 0 0の平均重合度を示す。） で表されるタンパク質ポリマー。
( 9 ) 下記式 （IV)：
Figure imgf000006_0002
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 X、 Y、 及び Ζは目的タンパク質、 A はァクセプター、 太線はイソペプチド結合、 f、 g、 及び hは 0から 1 0 0の平 均重合度を示す。 但し、 i、 g、 及ぴ hが同時に 0の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマー。 (10) 下記式： X— SUMO— A— Y
(式中、 SUMOはュビキチン様タンパク質、 Aはァクセプター、 X及ぴ Yは目的タ ンパク質を示す。）
で表されるタンパク質コンジュゲイト。
(1 1) 下記の工程：
(a) ュビキチン様タンパク質 （SUMO) と目的タンパク質の融合体又は結合体 を作製する工程；
(b) 前記融合体又は結合体をィソぺプチド結合により重合する工程； を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
(12) 下記の工程：
(a) ュビキチン様タンパク質 （SUM0) とァクセプターと目的タンパク質の融合 体又は結合体を作製する工程；
(b) 前記融合体又は結合体をィソぺプチド結合により重合する工程； を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
(13) SUM0活性化酵素 E 1、 SUM0結合酵素 E 2、 AT P、 及ぴ金属ィオン の存在下に重合反応を行うことを特徴とする、（ 1 1 )又は（ 12)に記載の方法。
(14) 反応促進物または基盤ペプチド、 もしくはその両方の因子をさらに 反応系に添加する、 （1 1) から （13) のいずれかに記載の方法。
(15) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) をコードする DN A、 及ぴュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DNAを含み、 活性化酵素 （E1) と結合酵素 （E2) とを宿主内で同時に発現でき る組み換え発現ベクター。
(16) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) が Aoslと Ubaとの 融合タンパク質である AUであり、 結合酵素 （E2) が Ubc9である、 （1 5) に記載 の組み換え発現ベクター。
(1 7) ュビキチン様タンパク質をコードする DNA及ぴァクセプターをコ 一ドする DNAを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとを個別に宿主 內で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
(18) ュビキチン様タンパク質をコードする DNA及ぴ Z又はァクセプタ 一をコードする DNAに隣接して 1種以上の目的タンパク質をコードする DNA をさらに含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプター （このうちの両方又は片 方には上記目的タンパク質が融合している） とを個別に宿主内で同時に発現でき る、 （17) に記載の組み換え発現ベクター。
(19) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) をコードする DN
A；ュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DN
A；ュビキチン様タンパク質をコードする DNA；及び Z又はァクセプターをコ ードする DN Aを含み、 活性化酵素 （El)、 結合酵素 （E2)、 ュビキチン様タンパ ク質及ぴノ又はァクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる、 組み換え発 現べクター。
(20) (1) 又は （2) に記載の組み換えベクターと、 （17) 又は （18) に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することを含む、 活性化酵素 (E1) と結合酵素 （E2) とュビキチン様タンパク質とァクセプターとを宿主内で 同時に発現する方法。
(21) (19) に記載のベクターを使用し、 必要に応じ、 ュビキチン様タ ンパク質をコードする DNA又はァクセプターをコードする DNAを含む組み換 えベクターを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（E1)と結合酵素（E2) とュビキチン様タンパク質とァクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
(22) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （El)、 ュビキチン様タン パク質とァクセプターの結合酵素（E2)、 目的タンパク質が結合していてもよいュ ビキチン様タンパク質、 及ぴ目的タンパク質が結合していてもよいァクセプター を発現できる形質転換体。
(23) (15)又は （16) に記載の組み換えベクターと、 （17)又は （1 8) に記載の組み換えベクターとを有する、 （22) に記載の形質転換体。
(24) (22) 又は （23) に記載の形質転換体を培養して、 該形質転換 体内においてュビキチン様タンパク質とァクセプターとの結合体を産生すること を含む、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの結合体の製造方法。
(25) ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク質をコー ドする D N Aを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク 質を宿主内で発現できる、 組み換え発現ベクター。
(26) ュビキチン様タンパク質をコードする DNA及ぴァクセプターをコ 一ドする DNAに隣接して 1種以上の目的タンパク質をコードする DNAをさら に含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターと目的タンパク質との融合タン パク質を宿主内で発現できる、 （25) に記載の組み換え発現ベクター。
(27) (15) 又は （16) に記載の組み換えベクターと、 （25)又は （2 6) に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することにより、 活性化酵 素 （El)、 結合酵素 (E2) 及びュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タ ンパク質を宿主内で同時に発現させることを含む、 ュビキチン様タンパク質とァ クセプターとの融合タンパク質のポリマーの製造方法。
(28) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) をコードする DN A、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DN A、 及びュビキチン様タンパク質とァクセプターと所望により目的タンパク質と の融合タンパク質をコードする DN Aを含み、 上記の活性化酵素 （E1) と結合酵 素 （E2) と融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
(29) ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （El)、 ュビキチン様タン パク質とァクセプターの結合酵素（E2)、及びュビキチン様タンパク質とァクセプ ターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質を発現できる形質転換体。
(30) (15) 又は （16) に記載の組み換えベクターと、 （25) 又は （2 6) に記載の組み換えベクターとを有する、 （29) に記載の形質転換体。
(3 1) (29) 又は （30) に記載の形質転換体を培養して、 該形質転換 体内においてュビキチン様タンパク質とァクセプターと所望により目的タンパク 質との融合タンパク質のポリマーを産生することを含む、 タンパク質ポリマーの 製造方法。 図面の簡単な説明
図 1は、.本発明のタンパク質ポリマーがとりうる様々な構造を示す。
図 2は、 GST - SUM0融合体発現べクターの構造を示す。
図 3は、 GST-SUM0のポリマー化反応産物を SDS-変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動で分離し、 ウェスタン法で検出した結果を示す。
図 4は、 C2- SUM0融合体発現べクターの構造を示す。
図 5は、 GST - C2-SUM0融合体発現べクターの構造を示す。
図 6は、 El、 E2酵素による GST-C2-SUM0のポリマー化反応、 ならびに反応産物 を SDS -変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、 ゥエスタン法で検出した 結果を示す。
図 7は、 改変型 SUMO- E1酵素 （AU) の構造模式図を示す。 SUM0とァクセプター 間にィソぺプチド結合を形成する酵素を改変し、 大腸菌体内での発現を容易にし たものである。本明細書において、この改変型酵素を AUと称する。従来の SUMO- E1 は Aosl と Uba2の 2つのサブュニットタンパク質からなる酵素である。 Aosl と Uba2を遺伝子工学的手法で融合させたタンパク質 AUを作製した。 この AUタンパ ク質は本発明者らのオリジナルのデザィンであり、Aoslおよび Uba2の I、 II、 III、 IVをドメイン構造を保存する形で融合させてある。 Cysは酵素活性に必須のシス ティン残基の位置を示してある。
図 8は、 大腸菌体内で目的タンパク質 Xと Yのコンジュゲイトを合成する方法 を模式的に示してある。具体的な実験例は実施例 3に示した。実施例 3において、 Xは T7- domainであり、 Yは HIS- domainである。 また、 ァクセプター Aとして C2 配列を用いている。
図 9は、 実施例 3で用いた発現ベクターの線図である。
図 1 0は、 実施例 3の結果を示す。
図 1 1は、 大腸菌体内で目的タンパク質 Xのポリマーを合成する方法を模式的 に示す。 具体的な実験例は実施例 4に示した。 実施例 4おいて、 Xは GST- domain であり、 ァクセプター Aとして C2酉己列を用いている。
図 1 2は、 実施例 4で用いた発現ベクターの線図である。
図 1 3は、 実施例 4の結果を示す。
図 1 4は、 実施例 5 (各種ァクセプター配列を用いた解析） の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
1 . 本発明のタンパク質ポリマー
本発明のタンパク質ポリマーは、 目的タンパク質が直接またはァクセプターを 介して結合したュビキチン様タンパク質 （SUM0: small uiquitin - related modife r)を主鎖に含むタンパク質ポリマーである。
本発明のタンパク質ポリマーに使用する 「SUM0」 は、 ュビキチン様タンパク質 を意味し、 ュビキチンと高い相同性を有するモデイブィァ一群の全てを含む。 ま た、 その由来は問わない。 哺乳動物由来のものが好ましいが、 酵母、 昆虫、 両生 類、 ハ虫類、 植物など哺乳動物以外のものでもよい。 本発明に用いることのでき 'る SUM0としては、 例えば配列番号 1のァミノ酸配列を有する SUM0- 1、 配列番号 2のアミノ酸配列を有する SUM0- 2、 配列番号 3のアミノ酸配列を有する SUM0-3 が挙げられるが、 これらに限定はされず、例えば SUM0タンパク質活性 ·機能を有 する限りにおいて、 当該アミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置 換及ぴ Z又は挿入していてもよい。
本発明のタンパク質ポリマーにおける「ァクセプター」 とは上記の SUM0とイソ ぺプチド結合可能なリジン残基を含むァミノ酸配列を有するタンパク質であって、 一般に - F - Lys-H - Glu -（F:疎水性アミノ酸、 H:任意のアミノ酸） で表される。 ァク セプターと しては、 例えば、 RanGAPl (Ran GTPase activating protein)、 RanBP2-IR (Ran binding protein 2-Internal Repeat domain)、 PML (promyelocytic leukemia) などが使用される。 本発明において好適に使用される RanGAPl (Ran GTPase activating protein)は配列番号 4のアミノ酸配列を有し、 121 番目のリ ジン残基が SUM0とィソぺプチド結合する （なお、 RanGAPlの全長は 5 8 0ァミノ 酸で、このうち C末端領域の 3 9 7から 5 8 0番目のァミノ酸配列が C2配列であ る)。
上記のァクセプターは、 単独であってもよいが、 2種以上を適宜組み合わせて もよい。 2種以上のァクセプターを使用すると、 ポリマーの主鎖が枝分かれ構造 をとりうる。 また、 6 0度又は 1 2 0度の折れ曲がりを持つ構造配列を有するァ クセプターを使用すると、 ポリマーの主鎖が三角形や六角形などの環状構造をと りうる。 さらに、 環状構造をとる場合において、 互いに相互作用するタンパク質 をァクセプターを介して SUM0に結合させると、該タンパク質の相互作用により自 己集合を起こし、 ポリマーの主鎖がチューブ状構造をとりうる。 図 1は、 本発明 のタンパク質ポリマーがとりうる様々な構造を示す。
本発明のタンパク質ポリマーにおける 「目的タンパク質」 としては特に限定は されず、 任意のタンパク質であってよいが、 例えば酵素、 サイト力イン類、 ホル モン、 抗体、 受容体、 生理活性ペプチド等を用いることができる。 ポリマー中に 含まれるこれら目的タンパク質は 1種であっても 2種以上であってもよい。
酵素としては、例えばリパーゼ、エラスターゼ、 ゥロキナーゼ、プロテアーゼ、 J3 -アミラーゼ、ィソアミラーゼ、グルカナーゼ、及びラタターゼ等が挙げられる。 サイ トカイン類としては、例えばインターフェロン一 α、 _ β、 - γ ッモア · ネクロシス .ファクタ α、 一 β、 マクロファージ遊走阻止因子、 コロニー牵 IJ 激因子、 トランスファーファクター、 インターロイキン、 成長因子 （上皮細胞成 長因子、 繊維芽細胞成長因子、 神経細胞成長因子） 等が挙げられる。
ホルモンとしては、 例えばインシュリン、 成長ホルモン、 プロラタチン、 エリ トロポェチン、 卵胞刺激ホルモン等が挙げられる。
抗体としては、 ヒト免疫グロブリン等を挙げることができ、 抗体の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 又は F a b等の活性断片であってもよい。 また、 抗体としての類似 機能をもつ物質、 例えば一本鎖状の抗原結合活性をもつ物質、 具体的には一本鎖 F a bぺプチドであってもよい。
受容体としては、 例えばホルモン受容体、 サイト力イン受容体、 増殖因子に対 する受容体、神経伝達物質に対する受容体、抗体受容体（F c受容体）、補体受容 体等が挙げられる。
生理活性ペプチドとしては、 -アミ ロイド、アンジォテンシン、エンドセリン、 カノレシトシン、 ニューロペプチド Y、 ニューロキュン Α、 才キシトシン、 P A C A P等が挙げられる。
上記の目的タンパク質の分子量（kDa)は、 2〜1000 kDa、好ましくは 2〜； 100 kDa、 特に 10〜50 kDaの範囲であり、目的タンパク質の分子量がこの範囲にあると SUMO との融合体が立体障害を起こさないため好ましい。
本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 ） で表される場合、 aで示される 平均重合度は 2〜1 0 0、好ましくは 2〜5 0、より好ましくは 3〜1 0である。 本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 （π) で表される場合、 b , c , 及び dで表される平均重合度は、 0〜1 0 0、 好ましくは 0〜5 0、 より好ましくは 0〜1 0である （但し、 b , c , 及び dが同時に 0の場合は除く）。
本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 （ΠΙ) で表される場合、 eで示される 平均重合度は 2〜 1 0 0、好ましくは 2〜 5 0、より好ましくは 3〜 1 0である。 本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 （IV) で表される場合、 f , g , 及ぴ hで表される平均重合度は、 0〜1 0 0、 好ましくは 0〜5 0、 より好ましくは 0〜1 0である （但し、 f ， g， 及ぴ hが同時に 0の場合は除く）。
また、 前記式 （IV) で表されるタンパク質ポリマーにおいて、 構成単位である X - A- SUM0、 Y-A-SUMOあるいは Z- A- SUMOは、それぞれランダムに結合してもよく、 またプロック的に結合していてもよレ、。 反応系に最初から X- A - SUM0、 Y-A-SUMO 及ぴ Z又は Z - A - SUMOとを仕込むとランダムなポリマーが得られ、最初に X - A - SUM0 又は Y- A_SUM0又は Z- A- SUM0のいずれかを仕込み、 次いで他の構成単位を順次仕 込むとブロック的なポリマーを製造することができる。
さらに、ュビキチン様タンパク質 SUM0と目的タンパク質 X、およぴァクセプタ 一 Aと目的タンパク質 Yの融合タンパク質が結合した、 式'： ー511¾10—八一¥で 表されるタンパク寶コンジュゲイトも本発明の範囲内である。 Xおよび Υの種類 と数には制限はなく、 特にァクセプターに結合させる目的タンパク質 （Υ) は、 ァクセプターのァミノ末端側あるいはカルボキシ末端側のいずれに結合していて もよく、 両方に結合することもできる。
2 . 本発明のタンパク質ポリマーの製造方法
( 1 ) 反応基質の作製
次に、 本発明のタンパク質ポリマーの製造方法について説明する。 本発明のタ ンパク質ポリマーを製造するには、 まずモノマーとなる反応基質を作製する。 反応基質を作製する方法としては、ュビキチン様タンパク質（SUM0)、 目的タン パク質、 ァクセプターをコードする遺伝子を連結させて適当な発現系に導入して 融合タンパク質として発現させる方法、 あるいはそれぞれのタンパク質を別個に 作製し、後に架橋剤等を用いて化学的に結合させる方法のいずれであってもよい。 本明細書において 「融合体」 というときは、 遺伝子工学的に融合タンパク質と して発現させる方法により作製した反応基質をいい、 「結合体」 というときは、ィ匕 学的結合により作製した反応基質をいうものとする。 遺伝子工学的に又は化学的 結合により作製した反応基質は、 いずれもポリマー化のよい基質となる。
融合体を作製するには、 SUM0、 目的タンパク質、 又はァクセプターをコードす る遺伝子を含む DNA断片をそれぞれ構築した後、 発現ベクターのプロモーターの 下流に該 DNA断片を挿入し、 次いで該発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入す る。
上記目的タンパク質は、 G S T (ダルタチオン Sトランスフェラーゼ）、 MB P (マルトース結合タンパク質）、 ヒスチジンへキサマー、チォレドキシンなどの遺 伝子、 あるいは緑色蛍光タンパク質 （G F P ) をはじめとする蛍光タンパク質な どのリポーター遺伝子の下流につなぎ、 これらとの融合タンパク質として発現さ れることが好ましい。 また、 目的タンパク質自体が、 G S T、 MB P、 ヒスチジ ンへキサマー、 チォレドキシン、 蛍光タンパク質であってもよい。
ュビキチン様タンパク質 (SUM0) と目的タンパク質との融合体、 又はュビキチ ン様タンパク質 （SUM0) とァクセプターと目的タンパク質の融合体 （以下、 これ らを総称して SUM0 -タンパク質融合体という） を遺伝子工学的に作製する場合、 用いる宿主細胞としては、目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、 例えば、 細菌、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞等を挙げることができる。 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組込みが可能で、 上記目的とする DNAを転写できる位置にプロモーターを含 有しているものが用いられる。
組換えベクターの導入は、 用いる宿主細胞に応じて常套的に用いられる方法で 行えばよい。
組換えベクターを導入した形質転換体を培地に培養し、 培養物中に SUM0-タン パク質融合体を生成蓄積させ、 該培養物より該 SUM0-タンパク質融合体を採取す ることにより、 SUM0 -タンパク質融合体を単離することができる。
形質転換体の培養方法は、 通常の方法に従って行うことができる。 形質転換体 が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真核生物である場合、 これら微生物を培養す る培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転 換体の培養には天然培地、 合成培地のいずれでもよい。 培養形式、 培養温度、 培 養時間、 培地 p Hは、 用いる宿主細胞に応じて通常行われる条件を採用すればよ レ、。
上記形質転換体の培養物から本発明の SUM0 -タンパク質融合体を単離精製する には、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。 例えば、 SUM0-タンパク質融合 体が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離によ り回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破碎機等により細胞を破碎し、 無細胞抽出 液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 通常の 酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、塩祈法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、 ジェチルァミノエチル（DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰ィオン交換ク口 マトグラフィ一法、 S— Sepharose FF (ブアルマシア社製）等のレジンを用いた陽ィ オン交換クロマトグラフィ一法、 ブチルセファロース等のレジンを用いた疎水性 クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二テイク口マトダラ フィ一法、 クロマトフォー力シング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法 を単独あるいは組み合わせて用レ、、 精製標品を得ることができる。
また、 SUM0-タンパク質融合体が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同 様に細胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通 常の方法により該融合体を回収後、 該融合体の不溶体をタンパク質変性剤で可溶 化する。 該可溶化液を、 タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤 の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該 融合体を正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単離精製法により精製標 品を得ることができる。
本発明で用いる SUM0-タンパク質融合体が細胞外に分泌された場合には、 培養 上清に該融合体を回収することができる。 即ち、 培養物を上記と同様の遠心分離 等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上 記と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。 あるいは、 SUM0 -タンパク質融合体の合成は、適当な細胞よりタンパク質合成能 を有する成分を抽出し、 その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋 白質合成系を用いて行ってもよい。 このような無細胞蛋白質合成系には、 リポゾ ーム、 開始因子、 伸長因子及び t R N A等の転写 .翻訳系に必要な要素が含まれ ている。
( 2 ) タンパク質ポリマーの製造
次に、 得られた SUM0 -タンパク質融合体からタンパク質ポリマーを製造するに は、 SUM0-タンパク質融合体を SUM0活性化酵素 E l (Asol/Uba2)、 SUMO結合酵素 H2 (Ubc9)、 ATP、及ぴ金属イオンの存在下、反応液中でイソペプチド結合によって ポリマー化する。
重合反応は一般に精製した酵素成分を用いて行うのが良いが、 SUM0のポリマー 化反応に関わる El及び E2酵素は基質特異性が高いので、 精製純度は特別に高く ないものでも使用できる。
反応液中の基質の濃度は反応に支障がない限りどのような濃度であってもよい 力 好ましくは 0. 01mM〜l Mである。 反応に用いる酵素濃度は特に限定されない 力 好ましくは 0. 01mg/ml〜100mg/mlである。 また、 ATP濃度は 0. 01〜10 の範 囲にあることが好ましい。
金属イオンとしては、 好ましくはマグネシウムイオン、 カルシウムイオン等の 二価金属イオンが用いられる。 反応液中にマグネシウムイオンを添加する場合、 濃度は 0. 01〜： LOmMの範囲にあることが好ましい。
また、 上記反応系に反応促進物質を適宜添加してもよい。 反応促進物質として は、例えば SP - RINGタンパク質又は SIZ/PIASと呼ばれる一群のタンパク質フアミ リー、 RanBP2/Nup358などが挙げられるがこれらに限定はされない。
反応温度は、 E1及ぴ E2の活性を阻害しない温度範囲であればよく、 最適温度 を含む範囲の温度が好ましい。 反応温度は通常 10°C〜60°Cであり、 好ましくは 30°C〜40°Cである。
また、 上記のポリマー化反応を効率的に行うために基盤タンパク質上で行うこ とが好ましい。 本発明において 「基盤タンパク質」 とは、 SUM0の C末端とイソべ プチド結合可能なリジン残基を含むァミノ酸配列を有するタンパク質をいい、 例 えは RanGAPl (Ran GTPase activating protein)、 RanBP2-IR (Ran binding protein 2 - Internal Repeat domain)、 PML (promyelocytic leukemia)、 Spl00、 p53 など が好適に使用できる。
目的物質を分離定量する方法として、 例えば、 必要に応じて高速液体クロマト グラフィー（HPLC)等を挙げることができる。 あるいは、 反応生成物をポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE)などで分離した後、 適当な抗体を用いてィムノ プロット分析を行うことにより基質の減少と反応生成物の増加を検出することが できる。
本発明の SUM0 タンパク質ポリマーはそのままで各種用途に使用することがで きるが、 取扱いを容易にするため、 あるいは単位重量当りの反応性を向上させる ため、 種々の無機化合物担体又は有機化合物担体に担持させた状態で使用するこ とが好ましい。
3 . 菌体内の生合成システムを用いる本発明のタンパク質コンジュゲイトもしく はポリマーの製造方法
これまでは細菌宿主細胞内でィソぺプチド結合によるタンパク質コンジュゲイ トを過剰発現させたり蓄積したりすることはできなかった。 最も大きな理由は、 細菌はィソぺプチド結合を触媒する酵素群を体内に持ちあわせていないことがあ げられる。 本発明者らは、 哺乳動物の SUM0化酵素 （E1及び E2酵素） と SUM0と ァクセプターとを大腸菌で同時に発現させることで、 菌体内でィソぺプチド結合 を形成させることに成功し、 タンパク質コンジュゲイトを多量に生産する技術を 開発した。
即ち、 本発明の方法は、 従来は試験管内で行っていた反応を大腸菌体内の生合 成システムを用いることで、 タンパク質コンジュゲイトもしくはポリマーの過剰 発現を可能にした組み換え発現システムに関するものである。
本発明の実施例 3及ぴ 4においては、 2種類の発現ベクターを使用した。 第一 の発現ベクターは SUM0 とァクセプターと目的タンパク質をコードするベクター であり、第 2の発現ベクターは、 SUM0とァクセプターとをイソペプチド結合する 反応を触媒する酵素 （E1及び E2酵素） をコードしている。 この 2種類のベクタ ーを菌体内に取り込ませ、 ベクター上の遺伝子群を同時発現させることで、 目的 タンパク質を含むコンジュゲイトもしくはポリマーを高レベルで発現させること ができる。
SUM0はュビキチン様タンパク質で、 ATP- Mg2+存在下、 El (SUM0活性化酵素）およ ぴ E2 (SUM0結合酵素）と呼ばれる酵素により、 SUM0の C末端のグリシン残基と了 クセプター配列中のリジン残基のァミノ基側鎖がィソぺプチド結合する。
本来、 SUM0 - E1は Aosl と Uba2と呼ばれる 2つのタンパク質のヘテロ複合体よ りなる。 本明細書に記載する実施例 3においては、 Aoslおよび Uba2は PCRによ りマウス cDNAよりクロ-ン化し、 その後、 2つの断片を直列にライゲーシヨンす ることで融合タンパク質をデザィンした。この Aosl- Uba2融合遺伝子（AU遺伝子） を pGEX発現ベクターの BamHI - EcoRI部位に導入し、 GST-AUタンパク質を大腸菌 で発現させる系を開発した。この pGEXベクターの Xbal部位には、 AUとは独立に、 SUM0-E2である Ubc9を導入し、 図 9に示すような pGEX- AU/Ubc9を作製した。 こ のベクターでは、 GST-AUが Taqプロモーター下流に連結し、 Ubc9は T7プロモー タ一下流に連結しており、 2つの遺伝子産物が IPTGにより発現誘導可能となるよ うに設計されている。 ここで用いたベクターは pBR322由来の複製起点を持ち、ァ ンピシリン薬剤耐性である。プラスミド名は pGEX- AU/Ubc9とした。 このプラスミ ドベクターより発現される GST - AUと Ubc9は、 それぞれ E1およぴ E2の酵素活性 を有し、 SUM0化反応を触媒する能力を持っている。
一方、 RanGAPlと呼ばれるタンパク質の C末端ドメイン C2 (RanGAPlの全長は 5 8 0アミノ酸で、 このうち C末端領域の 3 9 7から 5 8 0番目のアミノ酸配列 が C2配列である） が細胞内で特異的に SUM0化を受けることが知られている。 C2 ドメインに（His) 6 を含むアミノ酸配列を融合したタンパク質 HIS- domain - C2 と SUMO- 1 に T7 - tag 配列を含むァ ミ ノ酸配列を融合したタ ンパク質 T7-domain-SUM0-lの 2つの産物をコードする遺伝子をそれぞれ T7プロモーター 下流に導入した発現ベクターが図 9に示してある。 SUM0 - 1はヒト cDNAより、 C2 はアフリカッメガエルの cDNAより PCRで得た。 ここで用いたベクターは pACYC を改変したもので、 P15A複製起点を持ち、クロランフエ二コ-ル薬剤耐性である。 2つの遺伝子発現は IPTGにより誘導できる。プラスミド名は pT - SUM0/C2とした。 上述の pGEX- AU/Ubc9および PT- SUM0/C2を同時に宿主 （例えば、 大腸菌など） に導入する。 この 2つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとク ロランフエ二コールの両方を含む培地で選別できる。 得られたコロニーを別個の 液体培地で好適な条件下で培養し、さらに IPTGを加えて発現を誘導しながら培養 する。 菌体を遠心分離器で沈澱させ、 その後、 超音波処理などにより菌体を破砕 する。 遠心分離の後、 上澄み液を取り出し、 -ッケルァガロースビーズとインキ ュベーションし、 ビーズに結合したタンパク質を溶出する等の操作により、
T7 - domain - SUM0 - 1と His - domain- C2のコンジュゲイトを回収することができる。 上記で用いたベクターを改変することで、 様々なタンパク質コンジュゲイトを 作製できる。 図 8に示したように、 T7- domainに変えて、 目的タンパク質 Xを導 入し、 His- domainに変えて目的タンパク質 Yを導入すれば、 X - SUM0-C2 - Yという
X - Yのコンジュゲイトを作製できる。
また、 この実験では C2をァクセプターとして用いているが、 C2以外のァクセ プター配列を用いることも可能である。 さらに、 SUM0 - 1の他に、 SUM0 - 2や SUM0 - 3 といった、 関連配列を用いることも可能である。 これらの組み合わせに制限はな い。
さらに従来においては、 細菌宿主細胞内でタンパク質を共有結合させることで ポリマー化することはできなかった。 タンパク質ポリマーを過剰発現させ蓄積さ せる技術も開発されていない。本発明においては、哺乳動物の SUM0関連因子を大 腸菌で発現させることで、 菌体内でィソぺプチド結合を形成することに成功し、 タンパク質ポリマーを多量に生産する技術を提供することが可能になった。
本明細書に記載する実施例 4においては、 X- A - SUM0の Xとして GSTタンパク質 (27kDa)、 A配列として RanGAPlと呼ばれるタンパク質の C末端ドメイン C2を用 いている（GST- C2-SUM0_1)。 GST- C2 - SUMO- 1をベクターは pACYCに組み込んで、 こ のプラスミドを pT- GST- C2- SUM0と呼ぶ （図 1 2を参照）。
上述の pGEX- AU/Ubc9およぴ pT- GST- C2- SUM0を同時に宿主 （例えば、 大腸菌な ど） に導入する。 この 2つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリン とクロランフヱ二コールの両方を含む培地で選別できる。 得られたコロニーを別 個の液体培地で好適な条件下で培養し、さらに IPTGを加えて発現を誘導しながら 培養する。 菌体を遠心分離器で沈澱させ、 その後、 超音波処理などにより菌体を 破碎する。 遠心分離の後、 上澄み液を取り出し、 ダルタチオンセファロースビー ズとインキュベーションし、 ビーズに結合したタンパク質を溶出する等の操作に より、 GST- C2 - SUMOがポリマー化した GST-C2- SUM0ポリマーを回収することがで きる。
上記で用いたベクターを改変することで、 GSTの代わりに様々なタンパク質 X をポリマーに導入できる。 すなわち、 図 1 1に示したように、 様々な目的タンパ ク質 Xを C2 - SUM0の融合タンパク質として導入することで、 C2-SUM0を基軸とす る Xのポリマーを大腸菌で多量に生産できる。
また、 この実験ではァクセプターとして C2を用いているが、 C2以外のァクセ プター配列を用いることも可能である。 さらに、 SUMO- 1の他に、 SUM0- 2や SUM0-3 といった、 関連配列を用いることも可能で、 ポリマーの基軸の形を改変すること も可能である。 ァクセプターと SUM0との組み合わせに特に制限はない。
以下、 菌体内の生合成システムを用いる本癸明のタンパク質コンジュゲイトも しくはポリマーの製造方法の実施方法 （以下、 本方法とも称する） についてさら に詳細に説明する。
( 1 ) E 1酵素及び E 2酵素
ュビキチン、 SUMO, NEDD8/Rubl, Apgl2などのュビキチン様の構造を持つタン パク質群はュビキチンフアミリーと呼ばれている。 これらュビキチンフアミリー タンパク質は活性化酵素（E1)および結合酵素 (E2)により、 別のタンパク質のァク セプター部位にィソぺプチド結合する性質を持つ。ュビキチン E1として Ubalが、 SUM0-E1として Aosl/Uba2へテ口ダイマーが、 NEDD8 - E1として APP-BPl/Uba3へテ 口ダイマーが、 Apgl2の E1として Apg7が知られている。ュビキチン E2として Ubcl 〜8， 10， 11, 13が、 SUMO- E2として Ubc9が、 NEDD8 - E2として Ubcl2が、 Apgl2 の E2として ApglOが知られている （田中啓二 ·大隈良典 （編集） 、 実験医学 「タ ンパク質分解の最前線 2 0 0 1」 Vol. 19, No2, 2001を参照） 。
本方法では特に E 1酵素として、 図 7に示すような Aosl及ぴ Uba2の融合タン パク質である AUを使用することが好ましく、 E 2酵素として Ubc9を使用するこ とが好ましい。
( 2 ) ュビキチン様タンパク質、 ァクセプター、 及ぴ目的タンパク質、 本方法で使用するュビキチン様タンパク質は、 ュビキチン様タンパク質を意味 し、 ュビキチンと高い相同性を有するモディフィァ一群の全てを含み、 その具体 例としては、 ュビキチン、 SUMO, NEDD8/Rubl, Apgl2 などが挙げられる。 また、 その由来は限定されず、哺乳動物由来のものが好ましいが、酵母、昆虫、両生類、 ハ虫類、 植物など哺乳動物以外のものでもよい。 本発明に用いることのできる S覆 0としては、例えば配列番号 1のァミノ酸配列を有する SUM0- 1、配列番号 2の ァミノ酸配列を有する SUM0-2、 配列番号 3のァミノ酸配列を有する SUM0- 3が挙 げられるが、 これらに限定はされず、例えば SUM0タンパク質活性 ·機能を有する 限りにおいて、 当該アミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及 び /又は挿入していてもよい。
本方法で用いる 「ァクセプター」 とは上記のュビキチン様タンパク質とイソべ プチド結合可能なリジン残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であって、 一般に - F-Lys - H - Glu - （F:疎水性アミノ酸、 H:任意のアミノ酸） で表される。 ァク セプターとしては、 本明細書中上記の 「1 . 本発明のタンパク質ポリマー」 の項 目に記載したものを使用することができる。 ァクセプターとしては中部に SUM0 結合部位が 1つである場合と複数個ある場合の大きくわけると 2つのグループが ある。 1つの場合 （例えば RanGAPl- C2や TDG) は直鎖状に、 複数ある場合 （例え ば RanBP2 - IRや T0NAS) は積層、 あるいは房状のポリマーが形成されると考えら れる。
本発明で用いる 「目的タンパク質」 としては特に限定はされず、 任意のタンパ ク質であってよい。 「目的タンパク質」 としては、 本明細書中上記の 「1 . 本発明 のタンパク質ポリマー」 の項目に記載したものを使用することができる。
( 3 ) 発現ベクター
本発明は；
ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素（E1) をコードする D NA、及ぴュビ キチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 (E2)をコードする D N Aを含み、 活性化酵素 （E1) と結合酵素 （E2) とを宿主内で同時に発現できる組み換え発現 W ベクタ一；
ュビキチン様タンパク質をコードする DNA及ぴァクセプターをコードする D N Aを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとを個別に宿主内で同時に 発現できる組み換え発現ベクター；
ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) をコードする DNA；ュビキチ ン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DNA；ュビキチ ン様タンパク質をコードする DNA；及び Z又はァクセプターをコードする DN Aを含み、 活性化酵素 （El)、 結合酵素 （E2)、 ュビキチン様タンパク質及び Z又 はァクセプタ一とを個別に宿主内で同時に発現できる、 組み換え発現べクタ一； ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク質をコードする DN Aを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク質を宿主内 で発現できる、 組み換え発現ベクター；並びに
ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) をコードする DNA、 ュビキ チン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DNA、 及びュ ビキチン様タンパク質とァクセプターと所望により目的タンパク質との融合タン パク質をコードする DNAを含み、 上記の活性化酵素 （E1) と結合酵素 （E2) と 融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター；
に関するものである。
上記した各種の組み換え発現べクターは、通常の発現ベクター中の適当な導入遺 伝子挿入部位に所望の遺伝子を挿入することにより構築することができる。発現べ クタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込 みが可能で、 上記した目的とする塩基配列を転写できる位置にプロモーターを含 有しているものが用いられる。 発現ベクターとしては、 例えば、 P r ome g a 社、 Q I AG E N社、 S t r a t a g e n e社、 Ph a rma c i a社、 宝酒造 社などから巿販されている各種の発現べクタ一を使用できる。
( 4 ) 形質転換体とそれを用いたュビキチン様タンパク質とァクセプターとの結 合体及ぴタンパク質ポリマーの生産 本発明において上記 （3 ) に記載の発現ベクターを導入するために用いる宿主 細胞としては、 目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、 例えば、 細菌、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞等を挙げることができる。 本発明で は、 上記の中でも細菌 （例えば、 エッシェリヒァ属、 セラチア属、 コリネバクテ リウム属、 ブレビバクテリウム属、 シユードモナス属、 バチルス属、 ミクロパク テリゥム属等に属する細菌） を使用することが好ましく、 大腸菌を使用すること が特に好ましい。
組換え発現ベクターの導入は、 用いる宿主細胞に応じて常套的に用いられる方 法で行えばよく、 例えば、 リン酸カルシウム法、 プロトプラスト法、 エレクト口 ポレーシヨン法、 スフエロブラスト法、 酢酸リチウム法、 リポフエクシヨン法な どが挙げられる。
組換え発現ベクターを導入した形質転換体を培地に培養し、 培養物中に SUM0 - タンパク質融合体を生成蓄積させ、該培養物より該ュビキチン様タンパク質-タン パク質融合体を採取することにより、ュビキチン様タンパク質 -タンパク質融合体 を単離することができる。
形質転換体の培養方法、 形質転換体の培養物から本発明のュビキチン様タンパ ク質-タンパク質融合体の単離精製、並びに目的物質の分離定量については、本明 細書中上記 2 . に記載した通り行うことができる。
( 5 )ュビキチン様タンパク質/ァクセプター結合体、およぴュビキチン様タンパ ク質/ァクセプターのポリマー （タンパク質ポリマー）
上記（4 ) の方法により、ュビキチン様タンパク質/ァクセプター結合体または ュビキチン様タンパク質/ァ久セプターのポリマー （タンパク質ポリマー） を生 産 ·単離することができる。
ュビキチン様タンパク質 Zァクセプター結合体の具体例としては、 ァクセプタ 一 (A) と SUM0に目的タンパク質 Xと Yをそれぞれ結合させた融合タンパク質を 用いることができる。 これにより X - SUM0 - Y- Aというコンッジュゲイトができる。 SUM0ゃァクセプターに結合させる Xおよび Yの種類と数には制限はなく、特にァ クセプターに結合させる目的タンパク質は、 ァクセプターのァミノ末端側あるい は力ルポキシ末端側の 、ずれであってもかまわないし、 両方に取り付けてもかま わない。
本発明の方法で生産されるタンパク質ポリマーは、 目的タンパク質が直接また はァクセプターを介して結合したュビキチン様タンパク質（例えば、 SUMO : small uiquitin - related mod erなど）を主鎖に含むタンパク質ポリマーである。
タンパク質ポリマーの一例としては、 下記式 （Π Ι) ： 画
X-A-SUMO
I 」e
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 Aはァクセプター、 Xは目的タンパク 質、 太線はィソぺプチド結合、 eは 2〜 1 0 0の平均重合度を示す。） で表されるタンパク質ポリマーが挙げられる。
タンパク質ポリマーの別の例としては、 下記式 （IV) ：
Z-A-SUMO
厘
Y-A-SU O
(IV)
匪 g
X-A-SUMO
匿 f
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 X、 Y、 及ぴ Ζは目的タンパク質、 A はァクセプター、 太線はイソペプチド結合、 f 、 g、 及び hは 0から 1 0 0の平 均重合度を示す。 但し、 f 、 g、 及び hが同時に 0の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマーが挙げられる。
本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 （III) で表される場合、 eで示される 平均重合度は 2〜1 0 0、好ましくは 2〜5 0、より好ましくは 3〜1 0である。 本発明のタンパク質ポリマーが、 前記式 （IV) で表される場合、 f ， g， 及び hで表される平均重合度は、 0〜1 0 0、 好ましくは 0〜5 0、 より好ましくは 0〜1 0である （但し、 f ， g , 及び hが同時に 0の場合は除く）。
また、 前記式 （IV) で表されるタンパク質ポリマーにおいて、 構成単位である X-A-SUMO, Y-A-SUM0あるいは Z-A-SUM0は、それぞれランダムに結合してもよく、 またブロック的に結合していてもよい。 式 （III)のタンパク質ポリマーを製造す る場合は、 X - A - SUM0、 Y-A-SUM0あるいは Z-A-SUMOをコードする DNAを同一又は 異なる発現ベクターに組み込んで組み換え発現ベクターを作製し、 それを宿主に 導入して発現させることにより行なうことができる。 形質転換宿主内に最初から X- A - SUM0、 Y-A-SUM0及び Z又は Z- A - SUM0を発現させるとランダムなポリマーが 得られ、最初に X - A - SUM0又は Y - A-SUM0又は Z - A-SUM0のいずれかを発現させ、次 レ、で他の構成単位を順次発現させていくとブロック的なポリマーを製造すること ができる。
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記の実施 例に限定されることはない。 実施例
(実施例 1 ) SUM0-目的タンパク質融合体を構成単位とするタンパク質ポリマー の製造
( 1 ) SUM0-目的タンパク質融合体の作製
GST (グルタチオン結合蛋白質： 27 kDa)、 及ぴ SUMOをコードする DNA断片をそ れぞれ PCRを用いて合成し、 発現ベクター、 pGEX (アマシャムフアルマシア） に 連結した（図 2 )。組換えプラスミドで形質転換した E. coliから抽出物を調製し、 ダルタチオン結合力ラムにのせ、 リン酸緩衝液生理食塩水で平衡化した。 カラム を同じ緩衝液で洗浄した後、 GST- SUM0融合体を 20 還元型ダルタチオンを含む 同じ緩衝液で溶出し、 セフアデックス G- 75カラムでゲル濾過させた。
( 2 ) SUM0-目的タンパク質融合体のポリマー化
上記で得られた GST- SUM0融合体は約 50 kDaであった。 この GST- SUM0融合体 0. 2 μ gを、 0. 02 gEl、 0. 02 μ gE2、 5mM ATPの存在下、 20 μ 1の 20mM Tris-HCl, pH7. 5, 20mM NaCl, 0. ImM DTT, 5mM MgCl2溶液中で 37°Cにて 10分間反応させた。 反応産 物を SDSポリアクリルアミ ド変性ゲル電気泳動で分離した後、 タンパク質を二ト ロセルロース膜に移行させ、 GST抗体により GST - SUM0を検出したところ、 階段状 のバンドが高分子領域に向かって複数検出された （図 3 )。 このバンドは約 50kDa の間隔で存在しており、この分子量の差は GST- SUM0の 1分子にほぼ一致するもの であった。 このことから、 階段状のパンドは、 GST-SUM0分子 （n=l) の C末端が 別の GST- SUM0分子内のリジン残基にィソぺプチド結合し（n=2)、 さらにこの反応 が 2回 （n=3)、 3回 （n=4) と繰り返した反応産物と考えられた。 すなわち、 この 反応によって、 GST- SUM0の繰り返し構造を有する新規の蛋白質ポリマーが合成し たことが示された。 この反応条件下においては、 η=4程度のポリマーの合成が可 能であることが示された。
(実施例 2 ) SUM0 -ァクセプタ一-目的タンパク質融合体を構成単位とするタンパ ク質ポリマーの製造
( 1 ) 目的タンパク質 （GST) -ァクセプター（C2)- SUM0融合体の作製
ァクセプターとして C2と呼ばれる RanGAPl (RanGTPase Activating Protein 1) の C末端領域を選択した。 RanGAPlは低分子量 GTP結合タンパク質 Ranの加水分 解を促進する活性を持つタンパク質で、 核一細胞質間の物質輸送に関わる。 C2-SUM0融合体を得るために、 C2、及ぴ SUMOをコードする DNA断片をそれぞれ PCR を用いて合成し、発現ベクター、 pET28 (ノバジェン）に連結した（図 4 )。組換えプ ラスミドで形質転換した大腸菌 (E. coli) 力 ら抽出物を調製し、 M (ニッケル)力 ラムにのせ、 リン酸緩衝液生理食塩水で平衡化した。 カラムを同じ緩衝液で洗浄 した後、 C2- SUM0融合体を 250mMィミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出し、 セフ アデックス G- 75カラムでゲル濾過させた。
上記で得られた C2- SUM0融合体、及び GST (グルタチオン結合蛋白質： 27 kDa)、 をコードする DNA断片をそれぞれ PCRを用いて合成し、 発現ベクター、 pGEX (ァ マシャムフアルマシア） に連結した （図 5 )。 組換えプラスミ ドで形質転換した E. coliから抽出物を調製し、 グルタチオン結合カラムにのせ、 リン酸緩衝液生理 食塩水で平衡化した。 カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、 GST-C2-SUM0融合体を 20mM還元型グルタチオンを含む同じ緩衝液で溶出し、 セフアデックス G- 75カラ ムでゲル濾過させた。
( 2 ) 目的タンパク質 （GST) -ァクセプター（C2) - SUM0融合体のポリマー化 上記で得られた GST- C2- SUM0融合体は約 60kDaであった。 GST- C2- SUM0融合体 0. を、 0. l ^ gEl、0. 1 // §Ε2、5ιηΜ ΑΤΡの存在下、 20 ^ 1の 20raM Tris- HC1, pH7. 5, 20mM NaCl, 0. ImM DTT, 5mM MgCl2溶液中で 37°Cにて 10分間反応させた。 反応産 物を SDSポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、 階段状のパン ドが高分子領域に向かって複数検出された（図 6 )。 このバンドは約 60kDaの間隔 で存在しており、 この分子量の差は GST- C2 - SUM0の 1分子にほぼ一致するもので あった。 このことから、 階段状のパンドは、 GST - C2- SUM0分子 （n=l) の C末端が 別の GST-C2- SUM0分子の C2配列内のァクセプターリジン残基にィソぺプチド結合 し （n=2)、 さらにこの反応が 2回 （n=3)、 3回 （n=4) と繰り返した反応産物と考 えられた。 この反応条件下においては、 n=ll程度のポリマーの合成が可能である ことが示された。
(実施例 3 ) SUM0とァクセプターとの結合体の生産
( 1 ) E1および E2酵素を発現する発現ベクターの構築
マウス Aosl 及ぴ Uba2 の cDNA をクローユングするために、 先ず、 BLAST (丽 . ncbi. nlm. nih. gov)検索を行い、 マウス Aosl と Uba2 の cDNAを見出した (Genebank登録番号：丽- 019748 (マウス Aosl) 及ぴ丽 -016682 (マウス Uba2) )。 Aoslと Uba2のコード領域を、鏡型として BALB/MKマウス上皮ケラチノサイト cDNA ライブラリーを使用し、 プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用して PCRにより増幅した。
5 ' -AGGAATTCCCATGGTAGAGAAGGAGGAGGCTGGC-3 ' (Aosl のコード鎖） （配列番号 1 0 ) 5 ' -AGGAATTCCTGGGGACCAAGGCACTC-3， （Aos 1のアンチコ一ド鎖） （配列番号 1 1 ) 5 ' -AGGAATTCATGGCACTGTCGCGGGGGTTG-3 ' (Uba2のコード鎖） （配列番号 1 2 ) 5， -AGGAATTCTCAGTCTAACGCTATGACGTCA-3， (Uba2のアンチコ一ド鎖） （配列番号 1 3 )
増幅した PCR断片を pGEXベクター（Amersham Pharmacia Biotech)の EcoRI 部 位にクローニングし、 得られたプラスミ ド構築物をそれぞれ pGEX - Aosl 及び pGEX-Uba2と命名した。 Mouse Aosl cDNAの塩基配列を配列番号 5に示し、 Mouse Uba2の塩基配列を配列番号 6に示す。
Aosl-Uba2キメラ構築物を作製するために、 Aosl及び Uba2を以下のオリゴヌク レオチドを用いて PCRにより増幅した。
5， -AGGAATTCCCATGGTAGAGAAGGAGGAGGCTGGC-3' (Aoslのコード鎖）（配列番号 1 4 ) 5 ' -AGGAATTCTGGGGACCAAGGCACTCCACAATTCC-3 ' (Aoslのアンチコード鎖） （配列番 号 1 5 )
5， -AGGAATTCCCATGGCACTGTCGCGGGGGTTGCCC-3' (Uba2のコード鎖）（配列番号 1 6 ) 5， -AGGAATTCTCAGTCTAACGCTATGACGTCATCT-3， (Uba2のアンチコ一ド鎖）（配列番号 1 7 )
増幅した断片を BamHI+EcoRI及ぴ EcoRIでそれぞれ切断し、 BamHI+EcoRIで消化 pGEXベクターに挿入した。得られたプレスミ ド pGEX - AUは GST- Aosl - Uba2融合タ ンパク質をコードしている。マウス AU cDNAの塩基配列を（GMTTCは Aos 1と Uba2 の結合領域） を配列番号 7に示す。
Xenopus (アフリカッメガエル） の Ubc9 (塩基配列を配列番号 8に示す） をク ローニングし pT7 - 7 vectorに挿入した （Saitoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Vol94, 3736-3741, 1997)。 ちなみに、 アフリカッメガエルの Ubc9のアミ ノ酸配列はヒトおよびマウスの Ubc9のアミノ酸配列と 1 0 0 %相同である。 以下のプライマーを用いて PCRを行った。
5U9-Nhe : 5' -AAGGAACTATGCTAGCCGATTCGAACTTCTCGATTCGAACTT-3' (配列番号 1 8 ) 3U9-N e： 5， -AAGGAACTATGCTAGCATCGATGATAAGCTTGGGCTGCAGGT-3， （配列番号 1 9 ) 増幅した DNA断片を Nhelで切断後、 Xholで処理した pGEX- AUとライゲーショ ンした。 作製されたプラスミドを解析したところ、 図 8に示すように、 それぞれ の配列が N末端から C末端に向かう形で順向きにタンデムに並ぶ構造をしていた。 このプラスミ ドベクターを PGEX- AU/Ubc9 と名付けた。 GST- AUタンパク質は tac プロモーターの、 Ubc9は T7プロモーターの制御を受け、 IPTGにより誘導される。
( 2 ) T7- domain- SUMO- 1を発現する発現ベクターの pT - SUM0 - 1/C2プラスミドべ クタ一の作製
human SUM0-1 cDNA (塩基配列を配列番号 9に記載する） と以下のプライマーを 用いて、 T7-SUM0-1をコードする DNA断片を PCRで増幅する。 このタンパク質は T7 - tag配列（met-ala-ser-met-thr-gly-gly-gln-gln) (配列番号 2 0 ) カ SUMO- 1 の N末端にある融合タンパク質である。
5' -T7-SUM0-NdeI
5， -AGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGTCTGACCAGGAGGCAAAACCTT-3 ' (配列 番号 2 1 )
3， -SUM0 - Hind
5' -ACAAGCTTTCAACCCCCCGTTTGTTCCTGATAAAC-3' (配列番号 2 2 )
増幅断片を Ndel+Hindlllで切断後、 同じく Ndel+Hindlllで処理した pT- Trx (Chang, A. C. Y. & Cohen, S. N.： J. Bacteriol. , 134, 1141-1156, 1978； Yasukawa, T. et al.： J. Biol. Chem. , 270, 25328 - 25331, 1995)とライゲーシヨンする。 得られたプラスミドを pT- T7 - SUMO- 1と呼ぶ。
ァクセプターとして C2と呼ばれる RanGAPl (RanGTPase Activating Protein 1) の C末端領域を選択した。 RanGAPlは低分子量 GTP結合タンパク質 Ranの加水分 解を促進する活性を持つタンパク質で、 核一細胞質間の物質輸送に関わる。 C2 - SUM0融合体を得るために、 C2、及ぴ SUM0をコードする DNA断片をそれぞれ PCR を用いて合成し、発現ベクター pET28 (ノバジェン）に連結した。 このプラスミドべ クタ一を pET28- His- C2と称する。このプラスミドは His - C2融合タンパク質をコ - ドしている。 C2配列の N末端上流に以下の配列が融合している。
Met - gly— ser - ser - nis— his- his- his - his—his—ser—ser—gly-leu-val—pro—arg—gly— ser-nis- met - ala- ser - met- thr - gly- gly - gin - gin- met - gly - arg - gly - ser - (酉己列番 号 2 3 )
このプラスミドを铸型として、 以下のプライマーを用いて PCRを行った。
5UppET-Bgl
5， -AGGAAAAGATCTCGATCCCGCGAAATTATT-3 ' (配列番号 2 4 )
Bgl-T7Termmator
5' -GAAGATCTCAAAAAACCCCTCAAGACCCG-3 ' (配列番号 2 5 )
増幅断片を Bglllで切断後、同じく Bglllで処理した上述の pT - T7-SUM0-1とラ ィゲーシヨンした。 得られたプラスミ ド pT- SUMO- 1/C2は、 T7プロモターを IPTG で誘導することで、 His- C2と T7- SUMO- 1の 2種類の融合タンパク質を同時に発現 するようにデザインされている。
( 3 ) 大腸菌での発現とタンパク質の部分精製
上述の pGEX- AU/Ubc9およぴ pT- SUM0/C2を同時に大腸菌 BL21DE3株に導入する。 2つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフエニコー ルの両方を含む培地で選別できる。 これとは独立に、 ΡΤ - SUM0/C2のみを導入した ものをクロランフエ-コール培地で選別する。
それぞれの培地で得られたコロニーを別個の LB液体培地 1 Lで 3 7 °Cで 1 6時 間震盪培養する。 0. 02mM IPTGを加え、 2 5 °Cでさらに 1 6時間震盪培養する。 菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、 1 0 mlの PBSバッファーに懸濁した後、 超音波処理により菌体を破碎する。 遠心分離の後、 上澄み液を取り出し、 ニッケ ルァガロースビーズ l mlと 1時間 4 °Cでインキュベーションする。 ビーズを PBS で洗浄後、 250mMィミダゾールを含む PBSでビーズに結合したタンパク質を溶出 する。 タンパク質は 12%SDS- PAGEおよびウェスタン法で解析する。
図 1 0のレーン 1には pGEX- AU/Ubc9および pT- SUM0/C2を同時に大腸菌 BL21DE3株に導入したもの、 レーン 2には pT- SUM0/C2を導入したものを示してあ る。 前者では 4 O kdaのタンパク質が、 後者では 2 5 kdaのタンパク質がクマシ - ブル-染色で明瞭に観察される。 前者のバンドは His抗体および SUM0-1抗体に反 応性を示すが、 後者は His抗体のみに反応性がある。 4 O kdaタンパク質は 1 L の培養から約 0. 2mg得ることができる。
これらの結果は、前者において、 T7- domain - SUM0 - 1と His - domain- C2のコンジ ュゲイトが大腸菌体内で大量に生産されたことを示している。
(実施例 4 ) SUM0とァクセプターを構成単位とするポリマーの生産
( 1 ) GST-C2-SUM0-1を発現する pT - GST- C2- SUMO- 1プラスミ ドベクターの作製 C2- SUM0融合体、 及び GST (ダルタチオン結合蛋白質： 27 kDa；)、 をコードする
DNA断片をそれぞれ PCRを用いて合成し、 発現ベクター pGEX (アマシャムフアル マシア） に連結した。 得られたプラスミ ドを pGEX - C2 - SUM0 - 1 と称する。 この PGEX-C2-SUM0-1 を铸型 DNA として、 以下のプライマーを用いて PCR で、 GST-C2-SUM0-1の断片を増幅した。
5GST- Notl
5， -ATATGCGGCCGCATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3' (配列番号 2 6 )
S1G97 - Notl
5' -ATATGCGGCCGCCTAACCCCCCGTTTGTTCCTG-3' (配列番号 2 7 )
増幅断片を Notlで切断後、 同じく Notlで処理した pT- Trx (Chang, A. C. Y. &
Cohen, S. N.： J. Bacteriol. , 134, 1141-1156, 1978 ; Yasuka a, T. et al.： J.
Biol. Chem.， 270, 25328-25331, 1995)とライゲーシヨンする。 得られたプラス ミド pT- GST - C2-SUM0- 1は、 Τ7プロモーターを IPTGで誘導することで、 GSTと C2 と SUM0 - 1の融合タンパク質を発現するようにデザインされている。
( 2 ) 大腸菌での発現とタンパク質の部分精製
上述の pGEX- AU/Ubc9および pT- GST- C2- SUMOを同時に大腸菌 BL21DE3株に導入 する。 2つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフエ 二コールの両方を含む培地で選別できる。 これとは独立に、 pT- GST- C2- SUM0のみ を導入したものをクロランフエニコール培地で選別する。
それぞれの培地で得られたコ口ユーを別個の LB液体培地 1 Lで 3 7。(：で 1 6時 間震盪培養する。 0. 02mM IPTGを加え、 2 5 °Cでさらに 6時間または 1 2時間震 盪培養する。
菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、 1 O mlの PBSバッファーにけんだく後、 超音波処理により菌体を破碎する。 遠心分離の後、 上澄み液を取り出し、 グルタ チオンセファロースビーズ l mlと 1時間 4 °Cでインキュベーションする。 ビーズ を PBSで洗浄後、 2 O mMグルタチオンを含む PBSでビーズに結合したタンパク質 を溶出する。 タンパク質は 1 0 %SDS- PAGEおよびゥエスタン法で解析する。
図 1 3のレーン 1には pGEX- AU/Ubc9およぴ pT- GST- C2-SUM0を同時に大腸菌- BL21DE3株に導入し 12時間発現誘導したもの、 レーン 2には 6時間発現誘導した ものを示してある。 コントロールとして、 レーン 3には pT- GST- C2-SUM0のみを 1 2時間誘導発現したものを示してある。レーン 1および 2では約 60 kdaの階段状 のバンドがクマシ-ブル-染色で明瞭に観察されるが、 レーン 3ではこれらが認め られない。前者のパンドは SUMO- 1抗体に反応性を示すこと力ゝら、 GST - C2-SUM0が ポリマー化したバンドであると考えられる。 こうしたタンパク質は 1 Lの培養か ら約 0. 1 mg得ることができる。 以上の結果は、 GST-C2-SUM0ポリマーが大腸菌体 内で大量に生産されたことを示している。
(実施例 5 ) 各種ァクセプター配列を用いた解析
ァクセプター配列 C2 に加えて、 Thymine DNA Glycosylase (TDG) , T0NAS1, RanBP2- IRのァクセプター配列としての性質を解析した。 即ち、 TDG (Thymine DNA Glycosylase) (ァミノ酸配列は配列番号 2 8に示す）、 RanBP2-IR (internal repeat domain in Ran binding protein 2) (アミノ酸配列は配列番号 2 9に示す） 、 T0NAS (Tonal li related SP- ring protein) (ァミノ酸配列は配列番号 3 0に示す） を GSTの C末端に結合した形の融合タンパク質（GST- TDG, GST-BP2-IR, GST-T0NAS) を SUMO酵素 Elおよび E2, ATP, SUM0-1と 30 °Cで 30分反応させた。 コント口 ールとして酵素を加えずに反応させた。 反応後 GSTビーズを加えて反応物を精製 し、 電気泳動に供し、 染色し、 タンパク質を検出した。 結果を図 14に示す。 具 体的には以下の通り行った。
(1) GST-TDG
GST-TDG (70kDa) 1/igを l g SUMO- 1、 l//g El、 E2、 5mM ATP存在下、 100μ 1の 20raM Tris-HCl, pH7.5, 20mM NaCl, 0. ImM DTT, 5mM MgCl2溶液中で 3 0°Cにて 30分間反応させた。 反応後、 反応溶液中に 30μ1のグルタチオンビー ズを加え、 室温にて 30分間反応させた。 ビーズに結合した蛋白質を SDSポリア クリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、 90kDa の位置にバンドが確認 された （図 14の A)。 このバンドと反応前の GST- TDG の分子量の差は約 20kDa で一分子の SUMO - 1にほぼ一致するものであった。 このことから、 TDGは C2と同 様に 1分子の SUM0 - 1を結合するァクセプターと考えられる。
(2) GST-RanBP2-IR
GST-RanBP2-IR (70kDa) 1 gを 1 g SUMO— 1、 l/zg El、 1 μ g E2、 5mM ATP存 在下、 100^1の 20mM Tris - HC1, pH7.5, 20mM NaCl, 0. ImM DTT, 5mM MgCl2溶液 中で 30°Cにて 30分間反応させた。 反応後、 反応溶液中に 30μ1のグルタチォ ンビーズを加え、 室温にて 30分間反応させた。 ビーズに結合した蛋白質を SDS ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、 階段状にバンドが確認 された （図 14の Β)。 このことから、 RanBP2 - IRは複数分子の SUM0 - 1を結合す るァクセプターと考えられる。 このァクセプターは枝分かれタイプあるいは積層 タイプのポリマーを構築する可能性が高い。
(3) GST-TONASldelta
GST-TONASldelta (60kDa) 1 zg を 1 g SUMO- 1、 1/ig El、 1 μ g E2、 5mM ATP 存在下、 100μ 1の 20mM Tris-HCl, pH7.5, 20mM NaCl, 0. ImM DTT, 5mM MgCl2溶 液中で 30°Cにて 30分間反応させた。 反応後、 反応溶液中に 30 //1のダルタチ オンビーズを加え、室温にて 30分間反応させた。ビーズに結合した蛋白質を SDS ポリアクリルアミ ド変性ゲル電気泳動で解析したところ、 階段状にパンドが確認 された （図 1 4の C )。 このことから、 T0NASは複数分子の SUM0-1を結合するァ クセプターと考えられる。 このァクセプターは枝分かれタイプあるいは積層タイ プのポリマーを構築する可能性が高い。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 複数種のタンパク質の導入も可能で、 多様な生理活性や酵素 活性を発揮しうるタンパク質ポリマーが提供される。 本発明のタンパク質ポリマ 一は、パイオリアクターノ ィォセンサ一等に利用すれば有用タンパク質の生産、 微量化学物質の認識を効率的に行うことができ、 食品製造、 医薬品製造分野等に おいて有用である。 また、 本発明のタンパク質ポリマーは、 免疫、 情報伝達、 神 経伝達、 癌細胞の増殖などの各種の生体機構に関与する分子の機能解明や制御な ど、 分子生物学全般の基礎研究、 あるいは再生医療 ·癌治療に応用できる。 さら に本発明によれば、 タンパク質コンジュゲイトゃタンパク質ポリマーを細菌など の宿主細胞において大量に生産できる系を提供することが可能になる。
本願が主張する優先権の基礎となる日本特許出願である特願 2 0 0 2 - 2 8 8 5 6 6号及ぴ特願 2 0 0 3 - 6 4 7 1 3号に記載の内容は全て、 本明細書の開示 の一部として本明細書中に引用により取り込まれるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 目的タンパク質が直接またはァクセプターを介して結合したュビキチン 様タンパク質 （SUM0) を主鎖に含むタンパク質ポリマー。
2 . 目的タンパク質がポリマー中に 1種又は 2種以上含まれる、 請求項 1に 記載のタンパク質ポリマー。
3 . 主鎖が直鎖状、 分枝状、 環状、 又は自己集合によるチューブ形状である 請求項 1又は 2に記載のタンパク質ポリマー。
4 . ァクセプターが、 ポリマー中に 1種又は 2種以上含まれる請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
5 . ァクセプターが RanGAPl - C2 (Ran GTPase activating protein - C2) 、 RanBP2-IR (Ran binding protein 2 - Internal Repeat domain) N TDG (Thymine DNA Glycosylase)、T0NAS (Tonal li related SP-ring protein)、又は PML (promyelocytic leukemia) である、 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
6 . 下記式 （I) ： (I)
Figure imgf000036_0001
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 Xは目的タンパク質、 太線はイソぺプ チド結合、 aは 2〜1 0 0の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
7 . 下記式 （Π) ： ： -SUMO
面
Y-SUMO
(II)
匿
X-SU O
謹 b
(式中、 SUMOはュビキチン様タンパク質、 X、 Y、 及び Ζは目的タンパク質、 太 線はィソぺプチド結合、 b、 c、 及び dは 0から 1 0 0の平均重合度を示す。 伹 し、 b、 c、 及ぴ dが同時に 0の場合は除く）
で表されるタンパク質ポリマー。
8 . 下記式 （III) ：
Figure imgf000037_0001
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 Aはァクセプター、 Xは目的タンパク 質、 太線はィソぺプチド結合、 eは 2〜 1 0 0の平均重合度を示す。） で表されるタンパク質ポリマー。
9 . 下記式 （IV) ：
： -A-SUMO
函
Y-A-SUMO (IV)
謹 Jg
X-A-SUMO
麗 f
(式中、 SUM0はュビキチン様タンパク質、 X、 Y、 及び Ζは目的タンパク質、 A はァクセプター、 太線はイソペプチド結合、 f 、 g、 及び hは 0から 1 0 0の平 均重合度を示す。 但し、 i、 g、 及び hが同時に 0の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマー。
10. 下記式： X—SUMO— A— Y
(式中、 SUMOはュビキチン様タンパク質、 Aはァクセプター、 X及び Yは目的タ ンパク質を示す。）
で表されるタンパク質コンジュゲイト。
1 1. 下記の工程：
(a) ュビキチン様タンパク質 （SUM0) と目的タンパク質の融合体又は結合体 を作製する工程；
(b) 前記融合体又は結合体をィソぺプチド結合により重合する工程； を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
12. 下記の工程：
(a) ュビキチン様タンパク質 （SUM0) とァクセプターと目的タンパク質の融合 体又は結合体を作製する工程；
(b) 前記融合体又は結合体をィソぺプチド結合により重合する工程； を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
13. SUM0活性化酵素 E 1、 SUM0結合酵素 E 2、 A T P、 及ぴ金属ィオンの 存在下に重合反応を行うことを特徴とする、 請求項 1 1又は 12に記載の方法。
14. 反応促進物または基盤ペプチド、 もしくはその両方の因子をさらに反 応系に添加する、 請求項 1 1から 13のいずれかに記載の方法。
15. ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素（E1)をコードする DNA、 及ぴュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする DN Aを含み、 活性化酵素 （E1) と結合酵素 （E2) とを宿主内で同時に発現できる組 み換え発現ベクター。
16. ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （E1) が Aoslと Ubaとの融 合タンパク質である AUであり、 結合酵素 （E2) が Ubc9である、 請求項 15に記 載の組み換え発現べクター。
1 7. ュビキチン様タンパク質をコードする DNA及ぴァクセプターをコー ドする DNAを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとを個別に宿主内 で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
1 8 . ュビキチン様タンパク質をコードする D N A及び/又はァクセプター をコードする D NAに隣接して 1種以上の目的タンパク質をコードする D N Aを さらに含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプター （このうちの両方又は片方 には上記目的タンパク質が融合している）とを個別に宿主内で同時に発現できる、 請求項 1 7に記載の組み換え発現ベクター。
1 9 . ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素（E1)をコードする D NA； ュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする D NA ; ュビキチン様タンパク質をコードする D N A；及び/又はァクセプターをコード する D NAを含み、 活性化酵素 （El)、 結合酵素 （E2)、 ュビキチン様タンパク質 及ぴノ又はァクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる、 組み換え発現べ クタ一。
2 0 . 請求項 1又は請求項 2に記載の組み換えべクターと、 請求項 1 7又は 1 8に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することを含む、 活性化酵 素 （E1) と結合酵素 （E2) とュビキチン様タンパク質とァクセプターとを宿主内 で同時に発現する方法。
2 1 . 請求項 1 9に記載のベクターを使用し、 必要に応じ、 ュビキチン様タ ンパク質をコードする D NA又はァクセプターをコードする D NAを含む組み換 えベクターを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（E1)と結合酵素 (E2) とュビキチン様タンパク質とァクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
2 2 . ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素（El)、ュビキチン様タンパ ク質とァクセプターの結合酵素（E2)、 目的タンパク質が結合していてもよいュビ キチン様タンパク質、 及ぴ目的タンパク質が結合していてもよぃァクセプターを 発現できる形質転換体。
2 3 . 請求項 1 5又は請求項 1 6に記載の組み換えべクターと、 請求項 1 7 又は 1 8に記載の組み換えベクターとを有する、請求項 2 2に記載の形質転換体。
2 4 . 請求項 2 2又は 2 3に記載の形質転換体を培養して、 該形質転換体内 においてュビキチン様タンパク質とァクセプターとの結合体を産生することを含 む、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの結合体の製造方法。 '
2 5 . ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク質をコード する D N Aを含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融合タンパク質 を宿主内で発現できる、 組み換え発現ベクター。
2 6 . ュビキチン様タンパク質をコードする D N A及びァクセプターをコー ドする D NAに隣接して 1種以上の目的タンパク質をコードする D NAをさらに 含み、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターと目的タンパク質との融合タンパ ク質を宿主内で発現できる、 請求項 2 5に記載の組み換え発現ベクター。
2 7 . 請求項 1 5又は請求項 1 6に記載の組み換えべクターと、 請求項 2 5 又は 2 6に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することにより、 活性 化酵素 （El)、 結合酵素 （E2) 及びュビキチン様タンパク質とァクセプターとの融 合タンパク質を宿主内で同時に発現させることを含む、 ュビキチン様タンパク質 とァクセプターとの融合タンパク質のポリマ一の製造方法。
2 8 . ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素（E1)をコードする D NA、 ュビキチン様タンパク質とァクセプターの結合酵素 （E2) をコードする D NA、 及ぴュビキチン様タンパク質とァクセプターと所望により目的タンパク質との融 合タンパク質をコードする D N Aを含み、上記の活性化酵素（E1)と結合酵素（E2) と融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現べクタ一。
2 9 . ュビキチン様タンパク質を活性化する酵素 （El)、 ュビキチン様タンパ ク質とァクセプターの結合酵素（E2)、及ぴュビキチン様タンパク質とァクセプタ 一と所望により目的タンパク質との融合タンパク質を発現できる形質転換体。
3 0 . 請求項 1 5又は請求項 1 6に記載の組み換えべクターと、 請求項 2 5 又は 2 6に記載の組み換えベクターとを有する、請求項 2 9に記載の形質転換体。
3 1 . 請求項 2 9又は 3 0に記載の形質転換体を培養して、 該形質転換体内 においてュビキチン様タンパク質とァクセプターと所望により目的タンパク質と の融合タンパク質のポリマーを産生することを含む、 タンパク質ポリマーの製造 6S
96SZT0/C00Zdf/X3d C^ZTCO/^OOZ OAV
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