CN101993495B

CN101993495B - 一种蛋白质混合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101993495B
Application number: CN200910057744.6A
Authority: CN
Inventors: 刘程; 蔡丽君; 丁剑锋; 赵智祥; 梁岩
Original assignee: SHANGHAI JINAN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Huihe Biotechnology Shanghai Co ltd; Novoprotein Scientific Shanghai Inc
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2029-08-12
Also published as: CN101993495A; WO2011017910A1; US20120196328A1; US8609373B2

Abstract

本发明公开了一种蛋白质混合物，由C-myc，SOX2，KLF4，OCT-4的融合蛋白组成，每一种融合蛋白的使用浓度为1ng/ml-1mg/ml；融合蛋白中包含PTD(蛋白转导区)，SUMO(泛肽样修饰物)与上述四种蛋白质的融合。PTD的融合使得融合蛋白能够进入细胞。融合的SUMO使得融合蛋白在进入细胞后能被切割，去除融合的PTD、SUMO。此外，本发明还公开了上述蛋白质混合物的制备方法。这种具有生物活性的蛋白质混合物，有可能应用于体外诱导人多功能干细胞，在再生医学领域有巨大的应用前景。

Description

一种蛋白质混合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白融合技术，具体地涉及一种蛋白质混合物。此外，本发明还涉及该蛋白质混合物的制备方法。

背景技术

1.人诱导多功能干(iPS)细胞

2006年，日本Yamanaka实验室利用逆病毒转导四种转录因子(KLF4，c-Myc，SOX2，OCT-4)进入小鼠胚胎和成年成纤维细胞，成功地获得了一种多功能干细胞，其特性与小鼠胚胎干细胞非常相似。不久，使用同样的方法转导人成纤维细胞，诱导的人多功能干细胞也被成功获得。随后，从多种遗传病病人细胞诱导的iPS cells也被获得。iPS cells具有与胚胎干细胞非常相似的特征，胚胎干细胞能够分化成所有类型的体细胞，这些分化的体细胞可以被用于修复由于疾病或受伤造成的组织损伤，因此胚胎干细胞在再生医学领域有非常广泛的应用前景。但是，胚胎干细胞在医学上的应用有两个重要的障碍：(1)移植后的免疫排斥；(2)使用人类胚胎的伦理学问题。即便使用体细胞核转移的方法获得的胚胎干细胞，也存在伦理学方面的问题。而诱导的人多功能干细胞可以从病人细胞获得，不存在免疫排斥的问题。又由于不需要破坏人胚胎或者使用人卵细胞，因此不存在使用胚胎干细胞的伦理问题。这些优点使得iPS细胞技术有更好的再生医学应用前景。

2.诱导多功能干细胞的技术

最早人们在诱导多功能干细胞时，使用复制缺陷的逆转录病毒或慢病毒载体将所需的重编程因子基因导入细胞，这些病毒载体都会整合到宿主细胞的基因组中。虽然这些外源基因在iPS细胞中在绝大多数情况下是静默的。但是一旦被重新激活，可能会导致肿瘤。这些基因的泄漏表达，也有可能使iPS细胞分化和成熟的不完全，导致形成未成熟的畸胎瘤危险性大增。病毒整合也有可能激活或终止内源基因的表达。在基因治疗的历史上，使用逆转录病毒整合技术也曾由于激活原癌基因导致白血病。许多实验室都尝试使用非病毒整合技术诱导多功能干细胞。腺病毒和质粒以及质粒都曾被用来载体将重编程因子导入细胞，成功获得iPS细胞。但是iPS细胞产生的机率非常低。OriP/EBNA-1质粒附加体也被用来作为载体来诱导iPS细胞。有一些实验室利用Cre/loxp，转座子/转座酶，在获得iPS细胞之后，将整合到基因组的外源基因切除。另外一种避免外源基因基因组整合的方法是用化学物质来代替重编程转录因子，从目前已发表的结果来看，还没有找到能完全替代重编程转录化学物质或组合，只能替代一到两种重编程因子。即使iPS细胞没有整合的外源基因，上述方法也不能完全避免基因组的改变，比如用质粒转化的方法会有低机率的基因组整合，化学物质可能会导致突变。

3.蛋白转导

蛋白转导最初来自于对于HIV TAT蛋白的研究，人们发现全长HIV TAT蛋白能够进入细胞激活病毒基因的转录。进一步研究表明，HIV TAT蛋白的一个区域(TAT PTD)负责进入细胞的功能。人们发现将TAT PTD与大分子偶联或融合能够将大分子送入细胞。研究表明带正电荷的精氨酸对于TAT PTD穿膜进入细胞质是必须的，任何一个精氨酸的突变都会导致转导功能的丧失。在此基础上，人们发现多聚精氨酸同样具有转导的功能。利用TAT PTD和其他蛋白转导多肽的蛋白质转导技术在解决于大分子药物进入细胞发挥功能方面具有巨大的潜力。

4.SUMO融合蛋白的切割

泛肽样修饰物(SUMO)能够共价修饰蛋白。SUMO修饰能够调控多种细胞进程包括核转移，信号转导和蛋白稳定性。Ulp1，一种SUMO蛋白酶，能够特异性地识别SUMO的三级结构，在SUMO与其修饰蛋白相连的位置切割。当SUMO与其他蛋白融合时(相当于SUMO修饰目标蛋白的N端氨基)，Ulp1也能特异性地将SUMO切除，将目标蛋白完整地释放。

5.蛋白诱导多功能干细胞

用蛋白转导的技术将重编程因子蛋白(KLF4，c-Myc，SOX2，OCT-4)直接导入细胞，是一种可以避免以上提到安全性问题的方法。一个来自Scripps研究所的实验室成功的使用大肠杆菌表达的四种重编程因子的重组蛋白加上一种化学物质(HDAC抑制剂)得到小鼠iPS细胞。他们使用的重组重编程因子是OCT-4，KLF4，Sox2，c-Myc。利用c端融合的多聚精氨酸将这四种重编程因子导入细胞。这种技术能够完全排除所有利用DNA将重编程因子导入细胞的弊端，从而使得iPS细胞在再生医学上的应用的可能性向前推进了一大步。但是，他们使用的蛋白转导多肽-多聚精氨酸与重编程因子直接融合，由于转导多肽带强正电荷，存在与带负电荷的基因组的DNA非特异性结合的可能性，与转导多肽融合的转录因子可能会非特异地改变基因表达。这种非特异的基因表达的改变，可能会导致诱导多功能干细胞的效率降低，还有可能导致某些基因表达的永久性改变，影响iPS细胞随后的分化和成熟。因此，获得一种能够克服上述缺点的制剂，来诱导人的多功能干细胞，对于人IPS细胞在再生医学中的实际应用具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种具有潜在医学应用价值的蛋白质混合物，该蛋白质混合物能大大降低与基因组DNA非特异性结合的可能性，在转导到细胞内后具有转录激活活性，可用于诱导人多功能干细胞。为此，本发明还提供该蛋白质混合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白质混合物，该蛋白质混和物由C-myc，SOX2，KLF4，OCT-4的融合蛋白组成，每一种融合蛋白的使用浓度为1ng/ml-1mg/ml；这些融合蛋白具有以下构成：PTD-SUMO-Protein；PTD是一个蛋白转导区，代表HIV-TAT，HSV-VP22，AntP或者多聚精氨酸；SUMO是泛肽样修饰物，代表酵母SMT3p或者其在各个物种的同源物，是融合蛋白进入细胞后被切割的识别区域；Protein是C-myc，SOX2，KLF4或者OCT-4。

所述蛋白转导区PTD为HIV TAT蛋白的TAT PTD区域，或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列；该蛋白转导区PTD使该蛋白质混合物能够进入人细胞。

所述泛肽样修饰物SUMO为酵母SMT3p，或者其他氨基酸序列，其三级结构能被SUMO蛋白酶识别并切割，该泛肽样修饰物SUMO使蛋白转导多肽能够从融合蛋白切除。

优选地，在所述PTD和SUMO之间可以插入NES，所述融合蛋白具有以下构成：PTD-NES-SUMO-Protein，NES是一个可选的核运出序列，决定融合蛋白的细胞质定位。

所述可选的核运出序列NES为人IkBa的核运出序列，或者具有核运出序列功能的氨基酸序列。

所述PTD-NES-SUMO具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

所述PTD-NES-SUMO-SOX2具有SEQ ID NO.3所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-OCT-4具有SEQ ID NO.4所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-KLF4具有SEQ ID NO.5所示的DNA编码序列；PTD-NES-SUMO-C-myc具有SEQ ID NO.6所示的DNA编码序列。

优选地，在所述PTD和NES之间插入6个组氨酸以便纯化。

此外，本发明还提供一种蛋白质混合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建PTD-NES-SUMO-Protein的表达质粒：首先，分别合成8段长为75bp且相互间有20bp重叠的寡核苷酸引物，经过三次重叠PCR，合成PTD-NES-SUMO；然后，从人胚胎干细胞总RNA中扩增得到人OCT-4，SOX2，KLF4，C-myc cDNA，3’端含有XhoI位点，与合成的TAT-NES-SUMO的顺序通过PCR进行组装，获得的产物克隆到pET-24a(+)载体的NdeI/XhoI位点上；

(2)筛选表达菌株：将步骤(1)得到的PTD-NES-SUMO-Protein表达质粒转化到BL21宿主菌中，小量培养筛选高表达克隆；

(3)融合蛋白的大规模表达：将表达菌种接种于瓶中，培养至OD0.6，加入IPTG诱导3小时；

(4)分离纯化融合蛋白：采用疏水层析和离子交换来分离纯化上述融合蛋白。

本发明获得的蛋白质混合物，能从根本上解决现有技术所存在的缺陷(非特异的基因表达的改变，可能会导致诱导多功能干细胞的效率降低，还有可能导致某些基因表达的永久性改变，影响iPS细胞随后的分化和成熟)。PTD的融合使得融合蛋白能够进入细胞。SUMO在融合蛋白中的存在，使得蛋白转导多肽能够从融合蛋白切除，去除融合的PTD，NES，SUMO。这种混合物如果应用于诱导人多功能干细胞，能最大限度地降低在诱导多功能干细胞的过程中，由于加入的诱导物对于最终得到的iPS细胞的不利影响，使得到的iPS细胞更加适合于在再生医学应用以及其他相关领域中的应用。

附图说明

图1是本发明实施例1中构建PTD-NES-SUMO的PCR反应示意图；

图2是本发明实施例2融合蛋白的转导实验和细胞内切割结果示意图(采用western免疫印迹的方法)；

图3是本发明实施例3融合蛋白的转录活性实验结果示意图。

优选实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1蛋白质混合物的制备

1.TAT-NES-SUMO-重编程因子的表达质粒的构建

根据文献报道所报道的HIV TAT PTD和酵母SMT3p(SUMO)，人IkBa的核运出顺序NES的氨基酸序列对密码子进行优化，以便于在大肠杆菌中进行高水平表达。按照TAT-NES-SMT3p的顺序进行排列，并在TAT和NES之间插入6个Histidine(6聚组氨酸)以便纯化。这部分融合蛋白的编码序列通过基于寡聚核苷酸，PCR组装的方法合成，5’端含有一个NdeI位点。实验方法如下：分别合成6段长为75bp左右且相互间有20bp重叠的寡核苷酸引物，经过三次重叠PCR(见图1)：①将引物a(SEQ ID NO.7所示序列)和引物b(SEQ ID NO.8所示序列)，引物c(SEQID NO.9所示序列)和引物d(SEQ ID NO.10所示序列)，引物e(SEQ ID NO.11所示序列)和引物f(SEQ ID NO.12所示序列)分别混合进行PCR反应，得到产物ab、cd、ef.②将引物a、d与上一轮PCR产物ab、cd相混合后进行扩增，③将引物a、f与上一轮PCR产物ad、第一轮产物ef相混合进行PCR扩增，得到产物af，琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，回收目的条带。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应体系按照说明书的要求配置。反应条件均为：步骤①95℃5分钟；步骤②94℃45秒，55℃45秒，72℃55秒，30个循环；步骤③72℃7分钟。

用Invitrogen公司的Trizol Reagent提取5×10⁶人胚胎干细胞总RNA。按照Invitrogen公司的SuperscriptIII逆转录PCR试剂盒的说明书用随机引物将RNA反转录成cDNA，OCT-4，SOX2，KLF4，C-myc cDNA使用下列引物扩增得到：

C-myc 5’

ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGCCCCTCAACGTTAGCTTC(SEQ ID NO.13)

C-myc 3’

CGACTCGAGTTACGCACAAGAGTTCCGTA(SEQ ID NO.14)

Klf45’

ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCTGTCAGCGACGCGCT(SEQ ID NO.15)

Klf43’

CGACTCGAGTTAAAAATGCCTCTTCATGTG(SEQ ID NO.16)

Nanog5’

ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGAGTGTGGATCCAGCTTG(SEQ ID NO.17)

Nanog 3’

CGACTCGAGTCACACGTCTTCAGGTTGCA(SEQ ID NO.18)

Oct-45’

ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCGGGACACCTGGCTTC(SEQ ID NO.19)

Oct-43’

CGACTCGAGTCAGTTTGAATGCATGGGAG(SEQ ID NO.20)

这些引物中，5’引物都含有20个碱基与TAT-NES-SMT3p片段3’端完全相同，便于拼装。

每个cDNA与合成的TAT-NES-SUMO的顺序通过PCR(反应条件与拼装TAT-NES-SUMO的条件相同，使用引物a和各cDNA的3’引物)进行组装。获得的产物克隆到pET-24a(+)载体(Novagen)的NdeI/XhoI位点上。

TAT-NES-SUMO具有SEQ ID NO.1所示的DNA编码序列；

TAT-NES-SUMO具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

TAT-NES-SUMO-SOX2具有SEQ ID NO.3所示的DNA编码序列；

TAT-NES-SUMO-OCT-4具有SEQ ID NO.4所示的DNA编码序列；

TAT-NES-SUMO-KLF4具有SEQ ID NO.5所示的DNA编码序列；

TAT-NES-SUMO-C-myc具有SEQ ID NO.6所示的DNA编码序列。

2.表达菌株的筛选

将融合表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中，小量培养筛选高表达克隆。在3ml OD 0.6的大肠杆菌中加入0.1mM的IPTG诱导表达，诱导3小时后收集菌体，菌体加入上样缓冲液煮沸5分钟，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，选择表达量最高的克隆作为大规模表达用菌种。对高表达菌种的进一步分析发现，表达的融合蛋白大部分存在于包涵体中。

3.融合蛋白的大规模表达

将表达菌种接种于10L LB中，37度培养至OD 0.6，加入0.1M IPTG诱导3小时。此时菌液浓度为OD 600在1.0左右。

将上述获得的培养物离心，弃去培养基，获得大约27.4g菌体。加入300ml裂解液(50mM PH 8.0Tris-Cl，500mM NaCl)重悬菌体。4度超声裂解菌体。4度6000rpm离心，弃去上清。用300ml裂解液洗涤沉淀，离心弃去上清。用增溶液(50mM PH 8.0Tris-Cl，500mM NaCl，8M Urea)溶解包涵体。包涵体溶解后，用IMAC进行亲和层析，上样完毕后先用冲洗液(8M Urea，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM Imidazole)清洗非特异性结合的成分，然后用(8M Urea PH 8.050mM Tris-Hcl，500mM NaCl250mM Imidazole)洗脱，紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰，共收集洗脱液80ml。

疏水层析。上述洗脱液补加NaCl固体到2M，充分溶解后，10,000RPM离心15分钟，弃沉淀。上清直接上样到平衡缓冲液(2M NaCl，50mMTris-HCl pH8.0)充分平衡的Phenyl Sepharose FF。上样完成后，平衡缓冲液进一步冲洗3个柱长，洗脱缓冲液(50mM Tri s-HCl pH8.0)洗脱目标峰。

目标蛋白用1M醋酸调节pH至6.0并用无热源水稀释三倍，上样到平衡缓冲液(10mM NaAc-HAc，pH6.0)充分平衡的SP-HP柱，逐步提高NaCl浓度进行洗脱，收集目标蛋白为纯化的融合蛋白。0.22微米微孔滤膜过滤除菌后用于功能检测。

实施例2.融合蛋白的转导实验

Hela细胞培养于high-glucose DMEM(10％胎牛血清)。在细胞大约铺满30％，加入TAT-NES-SUMO-重编程因子(每种融合蛋白浓度均为5ug/ml)，12小时后，更换培养基，继续培养12h，24h，72h。细胞用冷PBS洗两次。在裂解液(PH 7.520mM Tris-Cl，200mM NaCl，1％NP-40，1mM PMSF)中裂解细胞，取含40ug总蛋白细胞裂解液，加5X上样缓冲液，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜，用anti-OCT4，SOX2，c-Myc，(cellsignaling)KLF4(santa Cruz)进行免疫印迹实验。

结果表明(见图2)：本发明的融合蛋白能够进入细胞内。

实施例3.融合蛋白的细胞内切割

实验过程同实施例2。结果表明(见图2)，本发明所获得的融合蛋白能够在细胞内被切割，从而降低由于融合转导区的DNA结合活性所导致的非特异转录改变。

实施例4.融合蛋白在细胞内的活性

Luciferase(荧光素酶)报告基因的构建

OCT4报告基因质粒：8串联OCT4结合位点(ATGCAAAT)。引物A(SEQID NO.21)引物B(SEQ ID NO.22)退火后插入PGL3-promoter luciferaseplasmid KpnI/BglII位点。

KLF4报告基因质粒：8串联KLF4结合位点(AGGGTGC)。引物A(SEQ IDNO.23)引物B(SEQ ID NO.24)退火后插入PGL3-promoter luciferaseplasmid KpnI/BglII位点。

Sox2报告基因质粒：Hesx1基因Hesx1翻译起始位点上游570-bp PCR片段KpnI酶切后插入pGL3-bas ic vector(Promega)KpnI/SmaI位点。引物5′-CGAGGTACCGAGTTCTCTGTTCTATAAAC-3′(SEQ ID NO.25)和5′-CGACCCGGGCCTCTCGTGGTCTGCACAGA-3′(SEQ ID NO.26)。

C-myc报告基因质粒：引物A (5’-CCGGTACCGG GTTGTGGCAGCCAGTCACGT GCCCGCCGCG TAGCCACACC TCTGCTCCTC AGAGCAATGT CAAGCGGTCACGTGTGATAG CAACAGATCA CGTGGCTGCC ATCGCCCCTC-3’)(SEQ ID NO.27)和引物B(5’-ATGAATTCCG GACGTTCTGG GCACGTGACC GCCACCCATGCGCTGAGGGG CGGACAGGAG GTGCTTCGAC TGGGAGGAGG GCGAAGAGTG TAAGGGGGCGGAGGGGCGAT GGCAGCC-3’)(SEQ ID NO.28)退火补齐，KpnI酶切后插入PGL3-promoter luciferase plasmid KpnI/SmaI位点。

Hela细胞在大约铺满50％的时候，在12-well细胞培养板用fugene6(购自Roche)转染重编程转录因子的转录报告基因(firefly luciferase)和内参报告质粒pRL-TK-luc(promega，Renilla luciferase)。转染后6小时，更换培养基，加入5ug/ml融合蛋白。继续培养12h，24h，48h，72h。细胞用PBS洗两次，用购自promega的reporter lysis buffer(报告基因裂解缓冲液)裂解细胞，细胞裂解液用购自Promega的dual-luciferase kit(双荧光素酶试剂盒)检测luciferase的活性。

实验结果表明(见图3)，本发明得到的融合蛋白在加入培养基12小时后，报告基因luciferase的活性就有就有较大的提升，一直持续到72h。说明本发明得到的融合蛋白在转导到细胞内后具有转录激活活性，本发明的蛋白质混合物可用于诱导人多功能干细胞，在再生医学邻域有巨大的应用前景。

序列表

<110>上海欣百诺生物科技有限公司

<120>一种蛋白质混合物及其制备方法

<130>NP-09-13208

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>381

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tacggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtatgggtc atcaccatca tcatcacatg 60

gtgaaagaac tgcaggaaat tcgtctgggg tcggactcag aagtcaatca agaagctaag 120

ccagaggtca agccagaagt caagcctgag actcacatca atttaaaggt gtccgatgga 180

tcttcagaga tcttcttcaa gatcaaaaag accactcctt taagaaggct gatggaagcg 240

ttcgctaaaa gacagggtaa ggaaatggac tccttaagat tcttgtacga cggtattaga 300

attcaagctg atcaggcccc tgaagatttg gacatggagg ataacgatat tattgaggct 360

catcgcgaac agattggagg t 381

<210>2

<211>128

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

MYGRKKRRQR RRMGHHHHHH MVKELQEIRL GSDSEVNQEA KPEVKPEVKP ETHINLKVSD 60

GSSEIFFKIK KTTPLRRLME AFAKRQGKEM DSLRFLYDGI RIQADQAPED LDMEDNDIIE 120

AHREQIGG 128

<210>3

<211>1338

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac 60

atggtgaaag aactgcagga aattcgtctg gggtcggact cagaagtcaa tcaagaagct 120

aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 180

ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 240

gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt 300

agaattcaag ctgatcaggc ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 360

gctcatcgcg aacagattgg aggtatgtac aacatgatgg agacggagct gaagccgccg 420

ggcccgcagc aaacttcggg gggcggcggc ggcaactcca ccgcggcggc ggccggcggc 480

aaccagaaaa acagcccgga ccgcgtcaag cggcccatga atgccttcat ggtgtggtcc 540

cgcgggcagc ggcgcaagat ggcccaggag aaccccaaga tgcacaactc ggagatcagc 600

aagcgcctgg gcgccgagtg gaaacttttg tcggagacgg agaagcggcc gttcatcgac 660

gaggctaagc ggctgcgagc gctgcacatg aaggagcacc cggattataa ataccggccc 720

cggcggaaaa ccaagacgct catgaagaag gataagtaca cgctgcccgg cgggctgctg 780

gcccccggcg gcaatagcat ggcgagcggg gtcggggtgg gcgccggcct gggcgcgggc 840

gtgaaccagc gcatggacag ttacgcgcac atgaacggct ggagcaacgg cagctacagc 900

atgatgcagg accagctggg ctacccgcag cacccgggcc tcaatgcgca cggcgcagcg 960

cagatgcagc ccatgcaccg ctacgacgtg agcgccctgc agtacaactc catgaccagc 1020

tcgcagacct acatgaacgg ctcgcccacc tacagcatgt cctactcgca gcagggcacc 1080

cctggcatgg ctcttggctc catgggttcg gtggtcaagt ccgaggccag ctccagcccc 1140

cctgtggtta cctcttcctc ccactccagg gcgccctgcc aggccgggga cctccgggac 1200

atgatcagca tgtatctccc cggcgccgag gtgccggaac ccgccgcccc cagcagactt 1260

cacatgtccc agcactacca gagcggcccg gtgcccggca cggccattaa cggcacactg 1320

cccctctcac acatgtga 1338

<210>4

<211>1467

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac 60

atggtgaaag aactgcagga aattcgtctg gggtcggact cagaagtcaa tcaagaagct 120

aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 180

ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 240

gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt 300

agaattcaag ctgatcaggc ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 360

gctcatcgcg aacagattgg aggtatggcg ggacacctgg cttcggattt cgccttctcg 420

ccccctccag gtggtggagg tgatgggcca ggggggccgg agccgggctg ggttgatcct 480

cggacctggc taagcttcca aggccctcct ggagggccag gaatcgggcc gggggttggg 540

ccaggctctg aggtgtgggg gattccccca tgccccccgc cgtatgagtt ctgtgggggg 600

atggcgtact gtgggcccca ggttggagtg gggctagtgc cccaaggcgg cttggagacc 660

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gagccctgca ccgtcacccc tggtgccgtg aagctggaga aggagaagct ggagcaaaac 780

ccggaggagt cccaggacat caaagctctg cagaaagaac tcgagcaatt tgccaagctc 840

ctgaagcaga agaggatcac cctgggatat acacaggccg atgtggggct caccctgggg 900

gttctatttg ggaaggtatt cagccaaacg accatctgcc gctttgaggc tctgcagctt 960

agcttcaaga acatgtgtaa gctgcggccc ttgctgcaga agtgggtgga ggaagctgac 1020

aacaatgaaa atcttcagga gatatgcaaa gcagaaaccc tcgtgcaggc ccgaaagaga 1080

aagcgaacca gtatcgagaa ccgagtgaga ggcaacctgg agaatttgtt cctgcagtgc 1140

ccgaaaccca cactgcagca gatcagccac atcgcccagc agcttgggct cgagaaggat 1200

gtggtccgag tgtggttctg taaccggcgc cagaagggca agcgatcaag cagcgactat 1260

gcacaacgag aggattttga ggctgctggg tctcctttct cagggggacc agtgtccttt 1320

cctctggccc cagggcccca ttttggtacc ccaggctatg ggagccctca cttcactgca 1380

ctgtactcct cggtcccttt ccctgagggg gaagcctttc cccctgtctc cgtcaccact 1440

ctgggctctc ccatgcattc aaactga 1467

<210>5

<211>1797

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac 60

atggtgaaag aactgcagga aattcgtctg gggtcggact cagaagtcaa tcaagaagct 120

aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 180

ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 240

gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt 300

agaattcaag ctgatcaggc ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 360

gctcatcgcg aacagattgg aggtatggct gtcagcgacg cgctgctccc atctttctcc 420

acgttcgcgt ctggcccggc gggaagggag aagacactgc gtcaagcagg tgccccgaat 480

aaccgctggc gggaggagct ctcccacatg aagcgacttc ccccagtgct tcccggccgc 540

ccctatgacc tggcggcggc gaccgtggcc acagacctgg agagcggcgg agccggtgcg 600

gcttgcggcg gtagcaacct ggcgccccta cctcggagag agaccgagga gttcaacgat 660

ctcctggacc tggactttat tctctccaat tcgctgaccc atcctccgga gtcagtggcc 720

gccaccgtgt cctcgtcagc gtcagcctcc tcttcgtcgt cgccgtcgag cagcggccct 780

gccagcgcgc cctccacctg cagcttcacc tatccgatcc gggccgggaa cgacccgggc 840

gtggcgccgg gcggcacggg cggaggcctc ctctatggca gggagtccgc tccccctccg 900

acggctccct tcaacctggc ggacatcaac gacgtgagcc cctcgggcgg cttcgtggcc 960

gagctcctgc ggccagaatt ggacccggtg tacattccgc cgcagcagcc gcagccgcca 1020

ggtggcgggc tgatgggcaa gttcgtgctg aaggcgtcgc tgagcgcccc tggcagcgag 1080

tacggcagcc cgtcggtcat cagcgtcagc aaaggcagcc ctgacggcag ccacccggtg 1140

gtggtggcgc cctacaacgg cgggccgccg cgcacgtgcc ccaagatcaa gcaggaggcg 1200

gtctcttcgt gcacccactt gggcgctgga ccccctctca gcaatggcca ccggccggct 1260

gcacacgact tccccctggg gcggcagctc cccagcagga ctaccccgac cctgggtctt 1320

gaggaagtgc tgagcagcag ggactgtcac cctgccctgc cgcttcctcc cggcttccat 1380

ccccacccgg ggcccaatta cccatccttc ctgcccgatc agatgcagcc gcaagtcccg 1440

ccgctccatt accaagagct catgccaccc ggttcctgca tgccagagga gcccaagcca 1500

aagaggggaa gacgatcgtg gccccggaaa aggaccgcca cccacacttg tgattacgcg 1560

ggctgcggca aaacctacac aaagagttcc catctcaagg cacacctgcg aacccacaca 1620

ggtgagaaac cttaccactg tgactgggac ggctgtggat ggaaattcgc ccgctcagat 1680

gaactgacca ggcactaccg taaacacacg gggcaccgcc cgttccagtg ccaaaaatgc 1740

gaccgagcat tttccaggtc ggaccacctc gccttacaca tgaagaggca tttttaa 1797

<210>6

<211>1704

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtatgg gtcatcacca tcatcatcac 60

atggtgaaag aactgcagga aattcgtctg gggtcggact cagaagtcaa tcaagaagct 120

aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 180

ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 240

gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa gattcttgta cgacggtatt 300

agaattcaag ctgatcaggc ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 360

gctcatcgcg aacagattgg aggtatgccc ctcaacgtta gcttcaccaa caggaactat 420

gacctcgact acgactcggt gcagccgtat ttctactgcg acgaggagga gaacttctac 480

cagcagcagc agcagagcga gctgcagccc ccggcgccca gcgaggatat ctggaagaaa 540

ttcgagctgc tgcccacccc gcccctgtcc cctagccgcc gctccgggct ctgctcgccc 600

tcctacgttg cggtcacacc cttctccctt cggggagaca acgacggcgg tggcgggagc 660

ttctccacgg ccgaccagct ggagatggtg accgagctgc tgggaggaga catggtgaac 720

cagagtttca tctgcgaccc ggacgacgag accttcatca aaaacatcat catccaggac 780

tgtatgtgga gcggcttctc ggccgccgcc aagctcgtct cagagaagct ggcctcctac 840

caggctgcgc gcaaagacag cggcagcccg aaccccgccc gcggccacag cgtctgctcc 900

acctccagct tgtacctgca ggatctgagc gccgccgcct cagagtgcat cgacccctcg 960

gtggtcttcc cctaccctct caacgacagc agctcgccca agtcctgcgc ctcgcaagac 1020

tccagcgcct tctctccgtc ctcggattct ctgctctcct cgacggagtc ctccccgcag 1080

ggcagccccg agcccctggt gctccatgag gagacaccgc ccaccaccag cagcgactct 1140

gaggaggaac aagaagatga ggaagaaatc gatgttgttt ctgtggaaaa gaggcaggct 1200

cctggcaaaa ggtcagagtc tggatcacct tctgctggag gccacagcaa acctcctcac 1260

agcccactgg tcctcaagag gtgccacgtc tccacacatc agcacaacta cgcagcgcct 1320

ccctccactc ggaaggacta tcctgctgcc aagagggtca agttggacag tgtcagagtc 1380

ctgagacaga tcagcaacaa ccgaaaatgc accagcccca ggtcctcgga caccgaggag 1440

aatgtcaaga ggcgaacaca caacgtcttg gagcgccaga ggaggaacga gctaaaacgg 1500

agcttttttg ccctgcgtga ccagatcccg gagttggaaa acaatgaaaa ggcccccaag 1560

gtagttatcc ttaaaaaagc cacagcatac atcctgtccg tccaagcaga ggagcaaaag 1620

ctcatttctg aagaggactt gttgcggaaa cgacgagaac agttgaaaca caaacttgaa 1680

cagctacgga actcttgtgc gtaa 1704

<210>7

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cgacatatgt acggtcgtaa aaaacgtcgt cagcgtcgtc gtatgggtca tcaccatcat 60

catcacatgg tgaaagaa 78

<210>8

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

ctggcttagc ttcttgattg acttctgagt ccgaccccag acgaatttcc tgcagttctt 60

tcaccatgtg atgat 75

<210>9

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

caatcaagaa gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag cctgagactc acatcaattt 60

aaaggtgtcc gatgg 75

<210>10

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

catcagcctt cttaaaggag tggtcttttt gatcttgaag aagatctctg aagatccatc 60

ggacaccttt aaatt 75

<210>11

<211>110

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

ctcctttaag aaggctgatg gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa atggactcct 60

taagattctt gtacgacggt attagaattc aagctgatca ggcccctgaa 110

<210>12

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

acctccaatc tgttcgcgat gagcctcaat aatatcgtta tcctccatgt ccaaatcttc 60

aggggcctga tcagctt 77

<210>13

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

atcgcgaaca gattggaggt atgcccctca acgttagctt c 41

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

cgactcgagt tacgcacaag agttccgta 29

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

atcgcgaaca gattggaggt atggctgtca gcgacgcgct 40

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

cgactcgagt taaaaatgcc tcttcatgtg 30

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

atcgcgaaca gattggaggt atgagtgtgg atccagcttg 40

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

cgactcgagt cacacgtctt caggttgca 29

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

atcgcgaaca gattggaggt atggcgggac acctggcttc 40

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

cgactcgagt cagtttgaat gcatgggag 29

<210>21

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

catgcaaata tgcaaatatg caaatatgca aatatgcaaa tatgcaaata tgcaaatatg 60

caaata 66

<210>22

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

ctagaatgca aatatgcaaa tatgcaaata tgcaaatatg caaatatgca aatatgcaaa 60

tatgcaaatg gtac 74

<210>23

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

cagggtgcag ggtgcagggt gcagggtgca gggtgcaggg tgcagggtgc agggtgca 58

<210>24

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

ctagagcacc ctgcaccctg caccctgcac cctgcaccct gcaccctgca ccctgcaccc 60

tggtac 66

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>25

cgaggtaccg agttctctgt tctataaac 29

<210>26

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>26

cgacccgggc ctctcgtggt ctgcacaga 29

<210>27

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>27

ccggtaccgg gttgtggcag ccagtcacgt gcccgccgcg tagccacacc tctgctcctc 60

agagcaatgt caagcggtca cgtgtgatag caacagatca cgtggctgcc atcgcccctc 120

<210>28

<211>117

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>28

atgaattccg gacgttctgg gcacgtgacc gccacccatg cgctgagggg cggacaggag 60

gtgcttcgac tgggaggagg gcgaagagtg taagggggcg gaggggcgat ggcagcc 117

Claims

1.一种蛋白质混合物，其特征在于，该蛋白质混和物由C-myc，SOX2，KLF4，OCT-4的融合蛋白组成，每一种融合蛋白的使用浓度为1ng/ml-1mg/ml；这些融合蛋白具有以下构成：PTD-NES-SUMO-Protein；PTD是一个蛋白转导区，PTD为HIV TAT蛋白的TAT PTD区域；NES为人IkBa的核运出序列，决定融合蛋白的细胞质定位；SUMO是泛肽样修饰物，SUMO为酵母SMT3p，是融合蛋白进入细胞后被切割的识别区域；Protein是C-myc，SOX2，KLF4或者OCT-4；所述PTD-NES-SUMO的DNA序列如SEQID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述蛋白转导区PTD为HIV TAT蛋白的TAT PTD区域；该蛋白转导区PTD使该蛋白质混合物能够进入人细胞。

3.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述泛肽样修饰物SUMO为酵母SMT3p，其三级结构能被SUMO蛋白酶识别并切割，该泛肽样修饰物SUMO使蛋白转导多肽能够从融合蛋白切除。

4.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述PTD-NES-SUMO-SOX2的DNA编码序列如SEQ ID NO.3所示；PTD-NES-SUMO-OCT-4的DNA编码序列如SEQ ID NO.4所示；PTD-NES-SUMO-KLF4的DNA编码序列如SEQ ID NO.5所示；PTD-NES-SUMO-C-myc的DNA编码序列如SEQID NO.6所示。

5.如权利要求1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述PTD和NES之间插入6个组氨酸。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的蛋白质混合物在诱导人多功能干细胞中的应用。