WO2011017910A1 - 用于诱导人多功能干细胞的融合蛋白混合物及其制备方法 - Google Patents

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WO2011017910A1
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protein
ptd
nes
sum0
fusion protein
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PCT/CN2010/001223
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刘程
蔡丽君
丁剑锋
赵智祥
梁岩
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上海近岸科技有限公司
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    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Definitions

  • the present invention relates to recombinant protein fusion techniques, and in particular to a protein mixture. Furthermore, the present invention relates to a process for the preparation of the protein mixture. Background technique:
  • Yamanaka Laboratories of Japan used reverse virus transduction of four transcription factors (KLF4, c-Myc, S0X2, OCT-4) into mouse embryos and adult fibroblasts, and successfully obtained a pluripotent stem cell.
  • the characteristics are very similar to mouse embryonic stem cells.
  • iPS cells induced from cells of a variety of genetic patients were also obtained.
  • iPS cells have very similar characteristics to embryonic stem cells.
  • Embryonic stem cells can differentiate into all types of somatic cells. These differentiated somatic cells can be used to repair tissue damage caused by disease or injury.
  • embryonic stem cells are very important in the field of regenerative medicine. Wide application prospects.
  • immune rejection after transplantation and (2) ethical issues using human embryos.
  • embryonic stem cells obtained by the method of somatic cell nuclear transfer have ethical problems.
  • the induced human pluripotent stem cells can be obtained from the patient's cells without the problem of immune rejection. Since there is no need to destroy human embryos or use human egg cells, there is no ethical problem of using embryonic stem cells.
  • the required reprogramming factor genes were introduced into the cells using a replication-defective retrovirus or lentiviral vector, and these viral vectors were integrated into the genome of the host cell. Although these foreign genes are silent in most cases in iPS cells. But once reactivated, it can cause tumors. Leakage expression of these genes may also result in incomplete differentiation and maturation of iPS cells, leading to an increased risk of immature teratoma formation. Viral integration also has the potential to activate or terminate the expression of endogenous genes. In the history of gene therapy, the use of retroviral integration technology has also led to leukemia due to activation of proto-oncogenes.
  • TAT PTD HIV TAT protein
  • the ubiquitin-like modification is capable of covalently modifying the protein.
  • SUM0 modification can regulate a variety of cellular processes including nuclear transfer, signal transduction, and protein stability.
  • Ulpl a SUMO protease, specifically recognizes the tertiary structure of SUM0 and cleaves where SI 0 is attached to its modified protein.
  • Ulpl also specifically cleaves SUM0 to release the target protein intact.
  • reprogramming factor proteins KLF4, c-Myc, S0X2, OCT-4
  • KLF4, c-Myc, S0X2, OCT-4 reprogramming factor proteins
  • a laboratory from the Scripps Institute successfully used mouse recombination of four recombination factors expressed in E. coli plus a chemical (HDAC inhibitor) to obtain mouse iPS cells.
  • the recombinant reprogramming factors they used were 0CT-4, LF4, Sox2, and C-Myc o. These four reprogramming factors were introduced into cells using the c-terminally fused polyarginine.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a protein mixture having potential medical application value, which can greatly reduce the possibility of non-specific binding to genomic DNA, and has transcriptional activation after transduction into cells. Active, can be used to induce human pluripotent stem cells. To this end, the present invention also provides a process for the preparation of the protein mixture.
  • the present invention provides a protein mixture consisting of a fusion protein of C-myc, S0X2, KLF4, 0CT-4, each of which is used at a concentration of 1 ng/ml to 1 mg/ml; It has the following composition: PTD-SUMO-Protein ; PTD is a protein transduction region representing HIV-TAT, HSV-VP22, AntP or polyarginine; SUMO is a ubiquitin-like modification representing yeast SMT3p or its A homolog of a species is the recognition region in which the fusion protein is cleaved after entering the cell; Protein is C- myc, S0X2, KLF4 or OCT-4.
  • the protein transduction region PTD is the TAT PTD region of the HIV TAT protein, or other amino acid sequence having a protein transduction function; the protein transduction region PTD enables the protein mixture to enter human cells.
  • the ubiquitin-like modification SUM0 is yeast SMT3p, or other amino acid sequence whose tertiary structure can be recognized and cleaved by the SUM0 protease, and the ubiquitin-like modification SUM0 enables the protein transduction polypeptide to be excised from the fusion protein.
  • NES can be inserted between the PTD and SUM0, the fusion protein having the following structure: PTD-NES- SUMO-protein, NES is an optional nuclear export sequence that determines the cytoplasmic localization of the fusion protein.
  • the optional nuclear transport sequence NES is a nuclear transport sequence of human IkBa, or has a nuclear transport sequence Functional amino acid sequence.
  • the PTD-NES-SUM0 has the DNA sequence shown in SEQ ID NO. 1, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.
  • the PTD-NES-SUM0-S0X2 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 3;
  • PTD-NES-SUMO-CTT-4 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 4;
  • PTD- NES- SUMO- KLF4 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 5;
  • PTD-NES- SUMO-C- myc has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO.
  • histidines are inserted between the PTD and the NES for purification.
  • the present invention also provides a method for preparing a protein mixture, comprising the following steps:
  • the PTD-NES-SUMO-Protein expression plasmid obtained in the step (1) is transformed into the BL21 host strain, and the high expression clone is screened in a small amount;
  • the protein mixture obtained by the present invention can solve the defects existing in the prior art from the transcript (non-specific changes in gene expression may lead to a decrease in the efficiency of inducing pluripotent stem cells, and may also result in permanent expression of certain genes. Sexual changes affect the subsequent differentiation and maturation of iPS cells).
  • the fusion of PTD allows the fusion protein to enter the cell.
  • the presence of SUM0 in the fusion protein allows the protein transduction polypeptide to be excised from the fusion protein, removing the fused PTD, NES, SUM0.
  • Example 1 is a schematic diagram of a PCR reaction for constructing PTD-NES-SUMO in Example 1 of the present invention
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the results of transduction experiments and intracellular cleavage of the fusion protein of Example 2 of the present invention (using western immunoblotting);
  • Fig. 3 is a view showing the results of experiments on the transcriptional activity of the fusion protein of Example 3 of the present invention. The best way to implement the invention:
  • the amino acid sequence of the nuclear exporting sequence of human IkBa conjugates the codon to facilitate high level expression in E. coli Arranged in the order of TAT- NES-SMT3p, and insert 6 Histidine (6-histidine) between TAT and NES for purification.
  • the coding sequence of this part of the fusion protein was synthesized by an oligonucleotide-based, PCR-assembled method, and the 5' end contained an Ndel site.
  • the experimental methods were as follows: Six oligonucleotide primers of about 75 bp in length and 20 bp overlapping each other were synthesized, and after three overlapping PCRs (see Fig. 1): 1 primer a (sequence shown in SEQ ID NO. 7) and Primer b (SEQ ID NO. 8), primer c (SEQ ID NO. 9) and primer d (SEQ ID NO. 10), primer e (SEQ ID NO. 11) And the primer f (the sequence shown in SEQ ID NO. 12) is mixed and subjected to a PCR reaction to obtain the products ab, cd, and ef.
  • the primers &, d are mixed with the previous round of PCR products ab and cd, and then amplified.
  • 3 The primers &, f were mixed with the previous round of PCR product ad and the first round of product ef for PCR amplification to obtain the product af.
  • the amplified product was separated by agarose gel electrophoresis, and the target band was recovered.
  • the PCR uses a high-fidelity amplification system from Roche, and the reaction system is configured according to the specifications.
  • the reaction conditions are: Step 1 95 ° C 5 minutes; Step 2 94 ° C 45 seconds, 55 45 seconds, 72 ° C 55 seconds, 30 Cycles; Step 3 72 ° C for 7 minutes.
  • ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGCCCCTCAACGTTAGCTTC SEQ ID NO. 13
  • the 5' primers contain 20 bases identical to the 3' end of the TAT-NES-SMT3p fragment, making it easy to assemble.
  • each cDNA and synthetic TAT-NES-SUM0 was assembled by PCR (reaction conditions were the same as those for assembly of TAT-NES-SUM0, using primer a and 3, primers of each cDNA).
  • the obtained product was cloned into the Ndel/Xhol site of the pET-24a (+) vector (Novagen).
  • TAT-NES-SUM0 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO.
  • TAT-NES-SUM0 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2;
  • TAT-NES-SUM0-S0X2 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 3;
  • TAT-NES-SUM0-0CT-4 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 4; TAT-NES-SUM0-KLF4 has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO. 5; TAT-NES-SUMO-C-myc has the DNA coding sequence shown in SEQ ID NO.
  • the fusion expression plasmid was transformed into the BL21 (DE3) host strain, and the high expression clone was screened in a small amount.
  • E. coli Into 3 ml of 0D 0. 6 E. coli was added with 0.1 mM IPTG to induce expression. After 3 hours of induction, the cells were collected, and the cells were added to the loading buffer for 5 minutes, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie blue staining. The clone with the highest expression was selected as a large-scale expression strain. Further analysis of highly expressed strains revealed that most of the expressed fusion proteins were present in inclusion bodies.
  • the expression strain was inoculated into 10 L of LB, and cultured at 37 degrees to 0D 0. 6, and induced by 0.1 M IPTG for 3 hours. At this time, the concentration of the bacterial liquid is 0D 600 at about 1.0.
  • the culture obtained above was centrifuged, and the medium was discarded to obtain about 27.4 g of the cells.
  • the cells were resuspended by adding 300 ml of lysate (50 mM pH 8. 0 Tris-Cl, 500 mM NaCl).
  • the bacteria were lysed by 4 degrees ultrasound. Centrifuge at 4 ° 6000 rpm and discard the supernatant.
  • the precipitate was washed with 300 ml of lysate and the supernatant was discarded by centrifugation.
  • the inclusion bodies were solubilized with an increasing solution (50 mM pH 8. 0 Tris-Cl, 500 mM NaCl, 8 M Urea).
  • the affinity chromatography was performed by IMAC. After the loading, the non-specifically bound components were washed with a rinse solution (8M Ur «a, 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM Imidazole), and then used. (8M Urea PH 8. 0 50 mM Tris-Hcl, 500 mM NaCl 250 mM Imidazole) Elution, UV 280 nM absorption detection, protein peak collection, total eluate collection. 80 ml.
  • the target protein was adjusted to pH 6.0 with 1 M acetic acid and diluted three times with no heat source, and loaded onto an equilibrated SP-HP column in equilibration buffer (10 mM NaAc-HAc, pH 6.0) to gradually increase the NaCl concentration for washing.
  • the target protein is collected as a purified fusion protein. 0. 22 micron microporous membrane filtration and sterilization for functional testing.
  • Example 2. Transduction experiment of fusion protein
  • Hela cells were cultured in high-glucose DMEM (10% fetal bovine serum). About 30% of the cells are covered, TAT-NES- SUMO-reprogramming factor (5 ug/ml for each fusion protein) was added. After 12 hours, the medium was changed and culture was continued for 12 h, 24 h, and 72 h. The cells were washed twice with cold PBS. The cells were lysed in lysate (13 ⁇ 4 7.
  • Example 4 Activity of fusion protein in cells
  • 0CT4 reporter plasmid 8 tandem 0CT4 binding site (ATGCAAAT).
  • Primer A SEQ ID NO. 21
  • Primer B SEQ ID NO. 22 was annealed and inserted into the PGL3_promoter luciferase plasmid Kpnl/Bgl ll site.
  • KLF4 reporter gene plasmid 8 tandem KLF4 binding site (AGGGTGC).
  • Primer A SEQ ID NO. 23 was inserted into the PGL3-promoter luciferase plasmid Kpnl/Bgl ll site after annealing.
  • Sox2 reporter gene plasmid Hesxl gene Upstream 570-bp PCR fragment of Hesxl translation initiation site Kpnl was digested and inserted into pGL3- basic vector (Promega) Kpnl/Smal site. Primer 5 '-CGAGGTACCGAGTTCTCTGTTCTATA 'AAC-3 ' (SEQ ID NO. 25) and 5 '-CGACCCGGGCCTCTCGTGGTCTGCACAGA-3 ' ' (SEQ ID NO. 26).
  • C-myc reporter gene plasmid Primer A (5'-CCGGTACCGG GTTGTGGCAG CCAGTCACGT GCCCGCCGCG TAGCCACACC TCTGCTCCTC AGAGCAATGT CAAGCGGTCA CGTGTGATAG CAACAGATCA CGTGGCTGCC ATCGCCCCTC-3') (SEQ ID NO. 27) and primer B (5'-ATGAATTCCG GACGTTCTGG GCACGTGACC GCCACCCATG CGCTGAGGGG CGGACAGGAG GTGCTTCGAC TGGGAGGAGG GCGAAGAGTG TAAGGGGGCG GAGGCGAT GGCAGCC-3') (SEQ ID NO. 28) was annealed and inserted into PGL3-promoter luciferase plasmid Kpnl/Sraal site after Kpnl digestion.
  • Hela cells were transfected with fugene6 (purchased from Roche) with fugene6 (purchased from Roche) in a 12-wel l cell culture plate at approximately 50% confluence of the firefly luciferase and the internal reference reporter plasmid pRL-TK-luc (pRL-TK-luc) Promega, Reni l la luciferase).
  • pRL-TK-luc the internal reference reporter plasmid pRL-TK-luc
  • reporter Lysis Buffer reporter Lysis Buffer
  • luciferase activity was measured using a dual-luciferase kit (double luciferase kit) purchased from Promega.
  • the fusion protein obtained by the present invention had a significant increase in the activity of the reporter gene luciferase 12 hours after the addition of the medium, and continued until 72 hours. It is indicated that the fusion protein obtained by the present invention has transcriptional activation activity after being transduced into a cell, and the protein mixture of the present invention can be used for inducing human pluripotent stem cells, and has a great application prospect in the regenerative medicine neighborhood.

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Description

用于诱导人多功能干细胞的融合蛋白混合物及其制备方法 技术领域：
本发明涉及重组蛋白融合技术， 具体地涉及一种蛋白质混合物。此外， 本发 明还涉及该蛋白质混合物的制备方法。 背景技术：
1.人诱导多功能干 （iPS) 细胞
2006 年， 日本 Yamanaka 实验室利用逆病毒转导四种转录因子 (KLF4, c-Myc, S0X2, OCT- 4) 进入小鼠胚胎和成年成纤维细胞， 成功地获得了 一种多功能干细胞， 其特性与小鼠胚胎干细胞非常相似。不久， 使用同样的方法 转导人成纤维细胞， 诱导的人多功能干细胞也被成功获得。 随后， 从多种遗传病 病人细胞诱导的 iPS cells也被获得。 iPS cells 具有与胚胎干细胞非常相似的 特征，胚胎干细胞能够分化成所有类型的体细胞， 这些分化的体细胞可以被用于 修复由于疾病或受伤造成的组织损伤，因此胚胎干细胞在再生医学领域有非常广 泛的应用前景。 但是， 胚胎干细胞在医学上的应用有两个重要的障碍： （1 )移植 后的免疫排斥； （2)使用人类胚胎的伦理学问题。 即便使用体细胞核转移的方法 获得的胚胎干细胞，也存在伦理学方面的问题。而诱导的人多功能干细胞可以从 病人细胞获得， 不存在免疫排斥的问题。又由于不需要破坏人胚胎或者使用人卵 细胞， 因此不存在使用胚胎干细胞的伦理问题。这些优点使得 iPS细胞技术有更 好的再生医学应用前景。
2.诱导多功能干细胞的技术
最早人们在诱导多功能干细胞时，使用复制缺陷的逆转录病毒或慢病毒载体 将所需的重编程因子基因导入细胞，这些病毒载体都会整合到宿主细胞的基因组 中。虽然这些外源基因在 iPS细胞中在绝大多数情况下是静默的。但是一旦被重 新激活， 可能会导致肿瘤。 这些基因的泄漏表达， 也有可能使 iPS 细胞分化和 成熟的不完全， 导致形成未成熟的畸胎瘤危险性大增。病毒整合也有可能激活或 终止内源基因的表达。在基因治疗的历史上， 使用逆转录病毒整合技术也曾由于 激活原癌基因导致白血病。许多实验室都尝试使用非病毒整合技术诱导多功能干 细胞。腺病毒和质粒以及质粒都曾被用来载体将重编程因子导入细胞， 成功获得 iPS细胞。 但是 iPS细胞产生的机率非常低。 OriP/EBNA-1质粒附加体也被用来 作为载体来诱导 iPS细胞。 有一些实验室利用 Cre/l0Xp， 转座子 /转座酶， 在获 得 iPS细胞之后，将整合到基因组的外源基因切除。另外一种避免外源基因基因 组整合的方法是用化学物质来代替重编程转录因子， 从目前已发表的结果来看， 还没有找到能完全替代重编程转录化学物质或组合，只能替代一到两种重编程因 子。即使 iPS细胞没有整合的外源基因，上述方法也不能完全避免基因组的改变， 比如用质粒转化的方法会有低机率的基因组整合， 化学物质可能会导致突变。
3.蛋白转导
蛋白转导最初来自于对于 HIV TAT蛋白的研究， 人们发现全长 HIV TAT 蛋 白能够进入细胞激活病毒基因的转录。 进一步研究表明， HIV TAT蛋白的一个区 域 （TAT PTD) 负责进入细胞的功能。 人们发现将 TAT PTD与大分子偶联或融合 能够将大分子送入细胞。研究表明带正电荷的精氨酸对于 TAT PTD穿膜进入细胞 质是必须的， 任何一个精氨酸的突变都会导致转导功能的丧失。在此基础上， 人 们发现多聚精氨酸同样具有转导的功能。利用 TAT PTD和其他蛋白转导多肽的蛋 白质转导技术在解决于大分子药物进入细胞发挥功能方面具有巨大的潜力。
4. SUM0 融合蛋白的切割
泛肽样修饰物 （SUM0) 能够共价修饰蛋白。 SUM0 修饰能够调控多种细胞进 程包括核转移， 信号转导和蛋白稳定性。 Ulpl， 一种 SUMO 蛋白酶， 能够特异性 地识别 SUM0 的三级结构， 在 SI 0 与其修饰蛋白相连的位置切割。 当 SUM0 与 其他蛋白融合时 （相当于 SUM0修饰目标蛋白的 N端氨基）， Ulpl 也能特异性地 将 SUM0切除， 将目标蛋白完整地释放。
5.蛋白诱导多功能干细胞
用蛋白转导的技术将重编程因子蛋白 （KLF4, c-Myc， S0X2, OCT - 4) 直接导 入细胞， 是一种可以避免以上提到安全性问题的方法。 一个来自 Scripps 研究 所的实验室成功的使用大肠杆菌表达的四种重编裎因子的重组蛋白加上一种化 学物质（HDAC抑制剂）得到小鼠 iPS 细胞。他们使用的重组重编程因子是 0CT-4, LF4, Sox2, C-Myc o 利用 c端融合的多聚精氨酸将这四种重编程因子导入细 胞。这种技术能够完全排除所有利用 DNA将重编程因子导入细胞的弊端， 从而使 得 iPS 细胞在再生医学上的应用的可能性向前推进了一大步。 但是， 他们使用 的蛋白转导多肽-多聚精氨酸与重编程因子直接融合，由于转导多肽带强正电荷， 存在与带负电荷的基因组的 DNA非特异性结合的可能性，与转导多肽融合的转录 因子可能会非特异地改变基因表达。_这种非特异的基因表达的改变， 可能会导致 诱导多功能干细胞的效率降低， 还有可能导致某些基因表达的永久性改变， 影响 iPS 细胞随后的分化和成熟。 因此， 获得一种能够克服上述缺点的制剂， 来诱 导人的多功能千细胞， 对于人 IPS细胞在再生医学中的实际应用具有重大意义。
发明内容： - 本发明要解决的技术问题在于提供一种具有潜在医学应用价值的蛋白质混 合物， 该蛋白质混合物能大大降低与基因组 DNA 非特异性结合的可能性， 在转 导到细胞内后具有转录激活活性， 可用于诱导人多功能干细胞。 为此， 本发明还 提供该蛋白质混合物的制备方法。
为了解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种蛋白质混合物， 该蛋白质混和物 由 C-myc， S0X2, KLF4, 0CT-4的融合蛋白组成， 每一种融合蛋白的使用浓度为 lng/ml- lmg/ml ; 这些融 合蛋白具有以下构成： PTD-SUMO-Protein ; PTD 是一个蛋白转导区，代表 HIV-TAT, HSV-VP22, AntP或者多聚精氨酸； SUMO是泛肽样修饰物，代表酵母 SMT3p 或者其在各个物种的同源物，是融合蛋白进入细胞后被切割的识别区域； Protein 是 C- myc， S0X2, KLF4或者 OCT- 4。
所述蛋白转导区 PTD为 HIV TAT蛋白的 TAT PTD区域， 或者其他具有蛋白转 导功能的氨基酸序列； 该蛋白转导区 PTD使该蛋白质混合物能够进入人细胞。
所述泛肽样修饰物 SUM0为酵母 SMT3p， 或者其他氨基酸序列， 其三级结构 能被 SUM0蛋白酶识别并切割， 该泛肽样修饰物 SUM0使蛋白转导多肽能够从融 合蛋白切除。
优选地， 在所述 PTD和 SUM0之间可以插入 NES， 所述融合蛋白具有以下构 成： PTD-NES- SUMO- Protein, NES是一个可选的核运出序列， 决定融合蛋白的细 胞质定位。
所述可选的核运出序列 NES为人 IkBa的核运出序列， 或者具有核运出序列 功能的氨基酸序列。
所述 PTD-NES-SUM0具有 SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列， 具有 SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。 所述 PTD- NES- SUM0-S0X2 具有 SEQ ID NO. 3 所示的 DNA 编码序列； PTD-NES- SUMO- 0CT-4具有 SEQ ID NO. 4所示的 DNA编码序列； PTD- NES- SUMO- KLF4 具有 SEQ ID NO. 5所示的 DNA编码序列； PTD-NES- SUMO-C- myc具有 SEQ ID NO. 6 所示的 DNA编码序列。
优选地， 在所述 PTD和 NES之间插入 6个组氨酸以便纯化。
此外， 本发明还提供一种蛋白质混合物的制备方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 构建 PTD-NES- SUMO-Protein的表达质粒： 首先， 分别合成 8段长为 75bp 且相互间有 20bp 重叠的寡核苷酸引物， 经过三次重叠 PCR， 合成 PTD-NES-SUM0; 然后，从人胚胎干细胞总 RNA 中扩增得到人 0CT_4， S0X2, KLF4, C-myc cDNA, 3' 端含有 Xhol位点，与合成的 TAT- NES- SUM0的顺序通过 PCR进行 组装， 获得的产物克隆到 pET-24a (+)载体的 Ndel/Xhol 位点上；
(2) 筛选表达菌株： 将步骤 （1 ) 得到的 PTD-NES-SUMO-Protein表达质粒 转化到 BL21宿主菌中， 小量培养筛选高表达克隆；
(3) 融合蛋白的大规模表达： 将表达菌种接种于瓶中， 培养至 0D 0. 6, 加 入 IPTG诱导 3小时；
(4) 分离纯化融合蛋白： 采用疏水层析和离子交换来分离纯化上述融合蛋 白。
本发明获得的蛋白质混合物， 能从裉本上解决现有技术所存在的缺陷（非特 异的基因表达的改变， 可能会导致诱导多功能干细胞的效率降低，还有可能导致 某些基因表达的永久性改变， 影响 iPS细胞随后的分化和成熟）。 PTD的融合使 得融合蛋白能够进入细胞。 SUM0在融合蛋白中的存在， 使得蛋白转导多肽能够 从融合蛋白切除， 去除融合的 PTD, NES, SUM0。 这种混合物如果应用于诱导人 多功能干细胞， 能最大限度地降低在诱导多功能干细胞的过程中， 由于加入的诱 导物对于最终得到的 iPS细胞的不利影响， 使得到的 iPS 细胞更加适合于在再 生医学应用以及其他相关领域中的应用。 附图说明：
图 1是本发明实施例 1中构建 PTD- NES- SUMO的 PCR反应示意图；
图 2是本发明实施例 2融合蛋白的转导实验和细胞内切割结果示意图（采用 western免疫印迹的方法）；
图 3是本发明实施例 3融合蛋白的转录活性实验结果示意图。 实现本发明的最佳方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 应理解， 这些实施 例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或 按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 蛋白质混合物的制备
1. TAT-NES-SUM0 -重编程因子的表达质粒的构建
根据文献报道所报道的 HIV TAT PTD 和酵母 SMT3p (SUM0), 人 IkBa的核运 出顺序 NES的氨基酸序列对密码子进行优化，以便于在大肠杆菌中进行高水平表 达。 按照 TAT- NES-SMT3p 的顺序进行排列， 并在 TAT 和 NES 之间插入 6 个. Histidine (6聚组氨酸） 以便纯化。 这部分融合蛋白的编码序列通过基于寡聚 核苷酸， PCR组装的方法合成， 5' 端含有一个 Ndel位点。 实验方法如下： 分别 合成 6段长为 75bp左右且相互间有 20bp重叠的寡核苷酸引物， 经过三次重叠 PCR (见图 1 ): ①将引物 a (SEQ ID NO. 7所示序列） 和引物 b (SEQ ID NO. 8所 示序列）， 引物 c (SEQ ID NO. 9所示序列) 和引物 d (SEQ ID NO. 10所示序列） , 引物 e (SEQ ID NO. 11所示序列） 和引物 f (SEQ ID NO. 12所示序列） 分别混合 进行 PCR反应， 得到产物 ab、 cd、 ef. ②将引物&、 d与上一轮 PCR产物 ab、 cd 相混合后进行扩增， ③将引物&、 f 与上一轮 PCR产物 ad、 第一轮产物 ef 相混 合进行 PCR扩增， 得到产物 af, 琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物， 回收目的条带。 PCR采用 Roche公司的高保真扩增系统， 反应体系按照说明书的要求配置。 反应 条件均为： 步骤① 95°C 5分钟； 步骤② 94°C 45秒， 55 45秒， 72°C 55秒， 30 个循环； 步骤③ 72°C 7分钟。
用 Invitrogen公司的 Trizol Reagent提取 5 X 106人胚胎干细胞总 RNA。 按 照 Invitrogen公司的 Superscript II I逆转录 PCR试剂盒的说明书用随机引物 将 RNA反转录成 cDNA, OCT-4, S0X2, KLF4， C-myc cDNA使用下列引物扩增得到： C-myc 5，
ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGCCCCTCAACGTTAGCTTC ( SEQ ID NO. 13 )
C-myc 3， ■
CGACTCGAGTTACGCACAAGAGTTCCGTA ( SEQ ID NO. 14)
lf4 5，
ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCTGTCAGCGACGCGCT ( SEQ ID NO. 15 )
Klf4 3，
CGACTCGAGTTAAAAATGCCTCTTCATGTG (SEQ ID NO. 16 )
Nanog5 '
ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGAGTGTGGATCCAGCTTG ( SEQ ID NO. 17 )
Nanog 3，
CGACTCGAGTCACACGTCTTCAGGTTGCA ( SEQ ID NO. 18 )
Oct- 4 5，
ATCGCGAACAGATTGGAGGTATGGCGGGACACCTGGCTTC ( SEQ ID NO. 19 )
Oct- 4 3，
CGACTCGAGTCAGTTTGAATGCATGGGAG ( SEQ ID NO. 20 )
这些引物中， 5 ' 引物都含有 20个碱基与 TAT-NES-SMT3p片段 3 ' 端完全相 同， 便于拼装。
每个 cDNA 与合成的 TAT- NES-SUM0 的顺序通过 PCR (反应条件与拼装 TAT-NES-SUM0的条件相同， 使用引物 a和各 cDNA的 3， 引物） 进行组装。 获得 的产物克隆到 pET- 24a (+)载体 （Novagen) 的 Ndel/Xhol 位点上。
TAT-NES-SUM0 具有 SEQ ID NO. ί'所示的 DNA编码序列；
TAT- NES-SUM0具有 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；
TAT-NES-SUM0-S0X2具有 SEQ ID NO. 3所示的 DNA编码序列；
TAT-NES-SUM0-0CT-4具有 SEQ ID NO. 4所示的 DNA编码序列； TAT-NES-SUM0-KLF4具有 SEQ ID NO. 5所示的 DNA编码序列； TAT- NES-SUMO- C- myc具有 SEQ ID NO. 6所示的 DNA编码序列。
2.表达菌株的筛选
将融合表达质粒转化到 BL21 (DE3) 宿主菌中， 小量培养筛选高表达克隆。 在 3ml 0D 0. 6 的大肠杆菌中加入 0. ImM 的 IPTG 诱导表达， 诱导 3小时后收 集菌体， 菌体加入上样缓冲液煮沸 5分钟， SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 考马斯亮 蓝染色，选择表达量最高的克隆作为大规模表达用菌种。对高表达菌种的进一步 分析发现， 表达的融合蛋白大部分存在于包涵体中。
3.融合蛋白的大规模表达
将表达菌种接种于 10L LB中， 37度培养至 0D 0. 6， 加入 0. 1M IPTG诱导 3小时。 此时菌液浓度为 0D 600在 1. 0左右。
将上述获得的培养物离心，弃去培养基， 获得大约 27. 4g 菌体。加入 300ml 裂解液 （50mM PH 8. 0 Tris- Cl， 500mM NaCl ) 重悬菌体。 4度超声裂解菌体。 4 度 6000rpm离心， 弃去上清。 用 300ml 裂解液洗涤沉淀， 离心弃去上清。 用增 溶液 （50mM PH 8. 0 Tris-Cl, 500mM NaCl , 8M Urea) 溶解包涵体。 包涵体溶解 后， 用 IMAC 进行亲和层析， 上样完毕后先用冲洗液（8M Ur«a, 500mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH8. 0, 20mM Imidazole)清洗非特异性结合的成分， 然后用（8M Urea PH 8. 0 50mM Tris-Hcl , 500mM NaCl 250mM Imidazole) 洗脱， 紫外 280nM吸收检 测， 收集蛋白峰， 共收集洗脱液 .80ml。
疏水层析。 上述洗脱液补加 NaCl固体到 2M， 充分溶解后， 10， 000RPM离心 15分钟， 弃沉淀。 上清直接上样到平衡缓冲液 ( 2M NaCl, 50mM Tris-HCl pH8. 0) 充分平衡的 Phenyl Sepharose FF。 上样完成后， 平衡缓冲液进一步冲洗 3个柱 长， 洗脱缓冲液 （50mM Tris-HCl pH8. 0) 洗脱目标峰。
目标蛋白用 1M醋酸调节 pH至 6. 0并用无热源^ ^稀释三倍， 上样到平衡缓冲 液（10mM NaAc-HAc, pH6. 0)充分平衡的 SP-HP柱，逐步提高 NaCl浓度进行洗脱， 收集目标蛋白为纯化的融合蛋白。 0. 22微米微孔滤膜过滤除菌后用于功能检测。 实施例 2.融合蛋白的转导实验
Hela 细胞培养于 high-glucose DMEM (10%胎牛血清）。在细胞大约铺满 30%， 加入 TAT-NES- SUMO-重编程因子（每种融合蛋白浓度均为 5 ug/ml)， 12小时后， 更换培养基， 继续培养 12h， 24h, 72h。 细胞用冷 PBS洗两次。 在裂解液（1¾ 7. 5 20mM Tris-Cl, 200mM NaCl, 1% NP-40, ImM PMSF) 中裂解细胞， 取含 40ug总 蛋白细胞裂解液， 加 5X上样缓冲液， SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 转 PVDF膜， 用 anti-0CT4, S0X2 , c-Myc, (cel l signal ing) KLF4 (santa Cruz)进行免疫印迹 实验。 。
结果表明 （见图 2 ): 本发明的融合蛋白能够进入细胞内。 实施例 3.融合蛋白的细胞内切割
实验过程同实施例 2。 结果表明 (、见图 2)， 本发明所获得的融合蛋白能够在 细胞内被切割， 从而降低由于融合转导区的 DNA 结合活性所导致的非特异转录 改变。 实施例 4.融合蛋白在细胞内的活性
Luciferase (荧光素酶） 报告基因的构建
0CT4报告基因质粒： 8 串联 0CT4 结合位点 （ATGCAAAT)。 引物 A ( SEQ ID NO. 21 ) 引物 B (SEQ ID NO. 22)退火后插入 PGL3_promoter luciferase plasmid Kpnl/Bgl ll位点。
KLF4报告基因质粒： 8串联 KLF4结合位点（AGGGTGC)。引物 A (SEQ ID NO. 23) 弓 i物 B ( SEQ ID NO. 24 ) 退火后插入 PGL3-promoter luciferase plasmid Kpnl/Bgl ll位点。
Sox2 报告基因质粒： Hesxl基因 Hesxl翻译起始位点上游 570-bp PCR 片 段 Kpnl 酶切后插入 pGL3- basic vector (Promega) Kpnl/Smal 位点。 引物 5 ' -CGAGGTACCGAGTTCTCTGTTCTATA'AAC-3 ' ( SEQ ID NO. 25 ) 和 5 ' - CGACCCGGGCCTCTCGTGGTCTGCACAGA-3 ' ' ( SEQ ID NO. 26)。
C-myc 报告基因质粒： 引物 A ( 5' -CCGGTACCGG GTTGTGGCAG CCAGTCACGT GCCCGCCGCG TAGCCACACC TCTGCTCCTC AGAGCAATGT CAAGCGGTCA CGTGTGATAG CAACAGATCA CGTGGCTGCC ATCGCCCCTC- 3' ) ( SEQ ID NO. 27 ) 和引 物 B ( 5' -ATGAATTCCG GACGTTCTGG GCACGTGACC GCCACCCATG CGCTGAGGGG CGGACAGGAG GTGCTTCGAC TGGGAGGAGG GCGAAGAGTG TAAGGGGGCG GAGGGGCGAT GGCAGCC- 3' ) ( SEQ ID NO. 28 ) 退火补齐， Kpnl 酶切后插入 PGL3-promoter luciferase plasmid Kpnl/Sraal 位点。
Hela细胞在大约铺满 50%的时候， 在 12- wel l 细胞培养板用 fugene6 (购 自 Roche)转染重编程转录因子的转录报告基因 （firefly luciferase)和内参报 告质粒 pRL-TK-luc (promega, Reni l la luciferase)。 转染后 6小时， 更换培 养基， 加入 5ug/ml融合蛋白。 继续培养 12h, 24h, 48h, 72h。 细胞用 PBS洗 两次， 用购自 promega的 reporter lysis buffer (报告基因裂解缓冲液） 裂解 细胞， 细胞裂解液用购自 Promega 的 dual - luciferase kit (双荧光素酶试剂 盒） 检测 luciferase 的活性。
实验结果表明（见图 3)， 本发明得到的融合蛋白在加入培养基 12小时后， 报告基因 luciferase的活性就有就有较大的提升， 一直持续到 72h。 说明本发 明得到的融合蛋白在转导到细胞内后具有转录激活活性，本发明的蛋白质混合物 可用于诱导人多功能干细胞， 在再生医学邻域有巨大的应用前景。

Claims

权利要求书
1.一种蛋白质混合物，其特征在于，该蛋白质混和物 由 C- myc， S0X2, KLF4, OCT- 4的融合蛋白组成， 每一种融合蛋白的使用浓度为 lng/ml- lmg/ml ; 这些融 合蛋白具有以下构成： PTD-SUMO-Protein； PTD 是一个蛋白转导区，代表 HIV-TAT, HSV-VP22, AntP或者多聚精氨酸； SUMO是泛肽样修饰物，代表酵母 SMT3p 或者其在各个物种的同源物，是融合蛋白进入细胞后被切割的识别区域； Protein 是 C- myc， S0X2, KLF4或者 0CT-4。
2.如权利要求 1 所述的蛋白质混合物， 其特征在于， 所述蛋白转导区 PTD 为 HIV TAT蛋白的 TAT PTD区域， 或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列; 该 蛋白转导区 PTD使该蛋白质混合物能够进入人细胞。
3.如权利要求 1所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述泛肽样修饰物 SUM0 为酵母 SMT3p， 或者其他氨基酸序列， 其三级结构能被 SUM0蛋白酶识别并切割， 该泛肽样修饰物 SUM0使蛋白转导多肽能够从融合蛋白切除。
4.如权利要求 1所述的蛋白质混合物， 其特征在于， 在所述 PTD和 SUM0之 间插入 NES， 所述融合蛋白具有以下构成： PTD-NES-SUMO-Protein， NES是一个 可选的核运出序列， 决定融合蛋白的细胞质定位。
5.如权利要求 4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述可选的核运出序列 NES为人 IkBa的核运出序列， 或者具有核运出序列功能的氨基酸序列。
6.如权利要求 4所述的蛋白质混合物， 其特征在于， 所述 PTD- NES-SUM0具 有 SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列， 具有 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
7.如权利要求 4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述 PTD-NES-SUM0-S0X2 具有 SEQ ID NO. 3所示的 DNA编码序列； PTD- NES- SUM0-0CT- 4具有 SEQ ID NO. 4 所示的 DNA编码序列； PTD-NES- SUM0-KLF4具有 SEQ ID NO. 5所示的 DNA编码序 列； PTD-NES- SUMO-C-myc具有 SEQ ID NO. 6所示的 DNA编码序列。
8.如权利要求 4所述的蛋白质混合物，其特征在于，所述 PTD和 NES之间插 入 6个组氨酸。
9.一种蛋白质混合物的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤：
( 1 ) 构建 PTD-NES- SUMO- Protein的表达质粒： 首先， 分别合成 8段长为 75bp 且相互间有 20bp 重叠的寡核苷酸引物， 经过三次重叠 PCR， 合成 PTD-NES-SUMO;然后，从人胚胎干细胞总 RNA 中扩增得到人 OCT- 4， S0X2, KLF4, C-myc cDNA, 3' 端含有 Xhol位点，与合成的 TAT- NES-SI 0的顺序通过 PCR进行 组装， 获得的产物克隆到 pET-24a (+)载体的 Ndel/Xhol 位点上；
(2 ) 筛选表达菌株： 将步骤 （1 ) 得到的 PTD-NES-SUMO-Protein表达质粒 转化到 BL21宿主菌中， 小量培养筛选高表达^:隆；
(3) 融合蛋白的大规模表达： 将表达菌种接种于瓶中， 培养至 0D 0. 6, 加 入 IPTG诱导 3小时；
(4) 分离纯化融合蛋白： 采用疏水层析和离子交换来分离纯化上述融合蛋 白。
10.一种如权利要求 1-8任一项所述的蛋白质混合物在诱导人多功能干细胞 中的应用。
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