ES2211899T3 - Producto para la inhibicion de la apoptosis, compuestos adecuados para ello y preparacion de los mismos. - Google Patents

Producto para la inhibicion de la apoptosis, compuestos adecuados para ello y preparacion de los mismos.

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ES2211899T3 ES95909730T ES95909730T ES2211899T3 ES 2211899 T3 ES2211899 T3 ES 2211899T3 ES 95909730 T ES95909730 T ES 95909730T ES 95909730 T ES95909730 T ES 95909730T ES 2211899 T3 ES2211899 T3 ES 2211899T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN MEDIO PARA LA INHIBICION DE APOPTOSIS, CONTENIENDO DESDE UNO HASTA TODOS LOS COMPONENTES DE A) UN COMPUESTO INHIBIDOR APO - 1; B) UN COMPUESTO QUE INHIBE O INTERCEPTA LA LIGANDURA APO-1; Y C) UN COMPUESTO QUE INHIBE LA VIA DE SEÑAL INTRACELULAR APO-1, NO SIENDO CONSIDERADO EL COMPONENTE O LOS COMPONENTES COMO EXTRAÑOS EN UNA DISPOSICION INDIVIDUAL, ADEMAS DE LAS DISPOSICIONES AUXILIARES HABITUALES. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN COMPUESTO, ADECUADO PARA SU UTILIZACION EN LA INHIBICION DE APOPTOSIS, CON AL MENOS UN DOMINIO EXTRACELULAR APO-1 Y UN PORTADOR, NO SIENDO CONSIDERADO EL DOMINO O LOS DOMINIOS Y EL PORTADOR COMO EXTRAÑOS EN UNA APLICACION INDIVIDUAL.

Description

Producto para la inhibición de la apoptosis, compuestos adecuados para ello y preparación de los mismos.
La invención se refiere a un producto para inhibir la apoptosis. La invención se refiere además a compuestos adecuados para la inhibición de la apoptosis así como a procedimientos para la preparación de los mismos.
El término apoptosis es la denominación utilizada para la muerte celular programada. Esta se produce, por ejemplo, durante el desarrollo de órganos y la metamorfosis, la atrofia hística y la regresión tumoral. La apoptosis está asociada con una condensación del citoplasma, una pérdida de vellosidades de la membrana plasmática, una segmentación del núcleo y una degradación extensiva de ADN cromosómico (véase Oehm, A. y col., The Journal of Biological Chemistry, tomo 267, nº 15 (1992), páginas 10.709 - 10.715).
En células habilitadas para entrar en apoptosis se encuentra frecuentemente una proteína de superficie denominada APO-1. Esta proteína se incluye en la familia de receptores factor de necrosis tumoral/factor de crecimiento nervioso. Mediante entrecruzamiento de APO-1 a través de un anticuerpo anti-APO-1 se induce la apoptosis en dichas células (véase más arriba Oehm, A. y col.). La unión de APO-1 con una proteína soluble o unida a membrana denominada ligando de APO-1 parece tener el mismo efecto (véase Suda, T. y Nagata, S., J. Exp. Med., The Rockefeller University Press, tomo 179 (1994), páginas 873-879). En Dhein, J. y col., The Journal of Immunology, tomo 149, nº 10 (1992), páginas 3.166 - 3.173, se describe un fragmento anti-APO-1-F(ab)_{2}.
Sin embargo, no se sabe nada sobre la inhibición de la apoptosis. Conocer esta inhibición sería aun más necesario teniendo en cuenta que trabajos recientes del solicitante muestran que también se produce apoptosis celular en el caso de diferentes enfermedades, como el SIDA y enfermedades autoinmunes. En el caso del SIDA, la apoptosis parece ser la responsable de la fuerte disminución de las células CD4-T.
Por consiguiente, la presente invención tiene por objetivo poner a disposición un producto con el que se pueda inhibir la apoptosis.
De acuerdo con la invención, esto se logra mediante la utilización de uno o más compuestos inhibidores o captores del ligando de APO-1, compuestos que no son considerados como extraños en un individuo y que se seleccionan de entre:
-
un anticuerpo de ligando anti-APO-1,
-
un APO-1,
-
un dominio APO-1 extracelular,
-
un compuesto con como mínimo un dominio APO-1 extracelular y un soporte,
-
un péptido que presenta un sitio de unión de ligando APO-1, y
-
un compuesto con como mínimo un péptido que presenta un sitio de unión de ligando APO-1 y un soporte,
con el fin de producir un medicamento para inhibir la apoptosis en caso de una enfermedad asociada con una infección por VIH o de una enfermedad autoinmune.
La preparación de un compuesto de este tipo tiene lugar de forma habitual. Para preparar un anticuerpo de ligando anti-APO-1, los especialistas partirán, por ejemplo, del ligando APO-1 descrito en Suda, T. y Nagata, S., véase más arriba. Deberán prestar atención a que el fragmento Fc del anticuerpo no sea considerado como extraño por el individuo. Además, para preparar APO-1 o un dominio extracelular de APO-1, los especialistas partirán, por ejemplo, de la APO-1 descrita en el documento EP-92 107 060.3 o de su dominio extracelular. Por otra parte, para preparar un péptido que presente un sitio de unión de ligando APO-1 aprovecharán, por ejemplo, la combinación del ligando APO-1 anteriormente mencionado y de la APO-1 o su dominio extracelular anteriormente mencionados.
A continuación se describe, a modo de ejemplo, la preparación de un compuesto con como mínimo un dominio de APO-1 extracelular y un soporte. Análogamente se puede preparar un compuesto con como mínimo un péptido que presenta un sitio de unión de ligando APO-1 y un soporte.
Otro aspecto de la invención se refiere a una proteína de fusión en la que un dominio de APO-1 extracelular está fusionado a través de una zona bisagra de anticuerpo con un fragmento Fc de un anticuerpo humano, consistiendo el dominio de APO-1 en los aminoácidos 1 - 171 de la molécula APO-1 humana.
De acuerdo con la invención, el producto anteriormente mencionado se utiliza para la inhibición de la apoptosis en caso de una enfermedad asociada con una infección por VIH especialmente. El producto resulta especialmente ventajoso si además contiene entre uno y todos los siguientes componentes:
(a)
un compuesto inhibidor de receptor TAT,
(b)
un compuesto inhibidor o captor TAT,
(c)
un compuesto inhibidor de la ruta de señales de receptor TAT intracelular,
(d)
un compuesto inhibidor de receptor CD4,
(e)
un compuesto inhibidor o captor de gp120, y
(f)
un compuesto inhibidor de la ruta de señales de receptor CD4 intracelular,
no siendo considerados éste o el resto de los compuestos como extraños en un individuo.
La expresión "un compuesto inhibidor de receptor TAT" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición del receptor TAT. Preferentemente consiste en un anticuerpo de receptor anti-TAT. La preparación de éste se realiza modo habitual. Los especialistas deberán prestar atención a que el fragmento Fc del anticuerpo no sea considerado como extraño en un individuo. Los especialistas conocen procedimientos adecuados para conseguirlo.
Otro "compuesto inhibidor de receptor TAT" preferente es un análogo de TAT. Este se une igualmente al receptor TAT, pero no induce la ruta de señales de receptor TAT intracelular. La preparación de un análogo de este tipo se lleva a cabo del modo habitual y, para ello, los especialistas parten por ejemplo del TAT descrito en Arya, S., K., y col., Science, tomo 229 (1985), páginas 69-73.
La expresión "un compuesto inhibidor o captor TAT" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición o la captura de TAT. Preferentemente consiste en uno de los siguientes compuestos:
-
un anticuerpo anti-TAT,
-
un receptor TAT,
-
un dominio de receptor TAT extracelular,
-
un compuesto con como mínimo un dominio de receptor TAT extracelular y un soporte,
-
un péptido que presenta un sitio de unión TAT,
-
un compuesto con como mínimo un péptido que presenta un sitio de unión TAT y un soporte,
-
un sitio de unión TAT a base de ácido nucleico, y
-
un mutante TAT transdominante.
La preparación de estos compuestos tiene lugar de la forma habitual. Para preparar un anticuerpo anti-TAT, los especialistas partirán, por ejemplo, del TAT descrito en Arya, S., K. y col., véase más arriba. Deberán prestar atención a que el fragmento Fc del anticuerpo no sea considerado como extraño en el individuo. Los especialistas conocen procedimientos adecuados para ello. Para preparar un sitio de unión TAT a base de ácido nucleico partirán, por ejemplo, de la secuencia TAT-LTR descrita en Feng, S. y Holland, E., C., Nature, tomo 334 (1988), páginas 165-167. Además, para preparar un mutante TAT transdominante, los especialistas partirán, por ejemplo, del mutante descrito en Echetebu, C., O. y Rice, A., P., J. Acquir. Immune Def. Syndrome, tomo 6, (1993), páginas 550-557.
La expresión "un compuesto inhibidor de la ruta de señales de receptor TAT intracelular" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición de la ruta de señales de receptor TAT intracelular.
La expresión "un compuesto inhibidor de receptor CD4" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición del receptor CD4. Preferentemente, consiste en un anticuerpo de receptor anti-CD4. La preparación de éste se realiza del modo habitual y los especialistas partirán, por ejemplo, del receptor CD4 descrito en Capon, D., J. y Ward, R., H., R., Annu. Rev. Immunol. 9, (1991), páginas 649-678. Los especialistas deberán prestar atención a que el fragmento Fc del anticuerpo no sea considerado como extraño en el individuo. Los especialistas conocen procedimientos adecuados para ello.
Otro "compuesto inhibidor de receptor CD4" preferente es un análogo de gp 120. Este se une igualmente al receptor CD4, pero no induce la ruta de señales de receptor CD4 intracelular. La preparación de un análogo de este tipo tiene lugar de modo habitual y, para ello, los especialistas parten, por ejemplo, del gp 120 descrito en Capon, D., J. y Ward, R., H., R., véase más arriba.
La expresión "un compuesto inhibidor o captor de gp 120" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición o la captura de gp 120.
Preferentemente consiste en uno de los siguientes compuestos:
-
un anticuerpo anti-gp 120,
-
un receptor CD4,
-
un dominio de receptor CD4 extracelular,
-
un compuesto con como mínimo un dominio de receptor CD4 extracelular y un soporte,
-
un péptido que presenta un sitio de unión de gp 120, y
-
un compuesto con como mínimo un péptido que presenta un sitio de unión de gp 120 y un soporte.
La preparación de estos compuestos se lleva a cabo de la forma habitual. Para preparar un anticuerpo anti-gp 120, los especialistas partirán del gp 120 descrito en Capon, D. J. y Ward, R., H., R., véase más arriba. Deberán prestar atención a que el fragmento Fc del anticuerpo no sea considerado como extraño en el individuo. Los especialistas conocen procedimientos adecuados para ello. Además, para la preparación de un receptor CD4 o de un dominio de receptor CD4 extracelular, los especialistas partirán, por ejemplo, del receptor CD4 o su dominio extracelular descritos en Capon, D. J. y Ward, R., H., R., véase más arriba. Por otra parte, para preparar un péptido que presente un sitio de unión de gp 120, aprovecharán, por ejemplo, la combinación del gp 120 anteriormente mencionado y el receptor CD4 o su dominio extracelular anteriormente mencionados.
La preparación de un compuesto con como mínimo un dominio de receptor CD4 extracelular o un péptido que presente al menos un sitio de unión de gp 120 y un soporte puede tener lugar de forma análoga, tal como se describe más abajo en relación con un compuesto con como mínimo un dominio APO-1 extracelular y un soporte.
La expresión "un compuesto inhibidor de la ruta de señales de receptor CD4 intracelular" comprende cualquier compuesto adecuado para la inhibición de la ruta de señales de receptor CD4 intracelular.
Se entiende que los productos anteriormente mencionados pueden presentar uno o más compuestos de un solo componente.
De acuerdo con la invención, también se prepara un compuesto con como mínimo un dominio de APO-1 extracelular y un soporte, no siendo el o los dominios y el soporte considerados como extraños en un individuo.
La expresión "soporte" comprende cualquier compuesto en el que se puedan unir uno o más dominios de APO-1 extracelulares.
En una forma de realización preferente, el soporte es una proteína, por ejemplo albúmina sérica, hemoglobina, fibrinógeno, colágeno o un fragmento Fc de un anticuerpo, siendo preferente ésta último. En una forma de realización totalmente preferente, el compuesto según la invención es una proteína de fusión.
Los compuestos según la invención se pueden producir de forma habitual. En caso de una proteína de fusión, el siguiente procedimiento de preparación resulta ventajoso:
(a)
amplificación de un ADN mediante una técnica PCR habitual, codificando el ADN como mínimo un dominio de APO-1 extracelular y una zona de unión dispuesta en el extremo 3' de éste,
(b)
amplificación de un ADN mediante una técnica PCR habitual, codificando el ADN un soporte de proteína y una zona de unión dispuesta en el extremo 5' del soporte de proteína,
(c)
unificación de los ADN amplificados de (a) y (b) y amplificación adicional conjunta de éstos mediante técnica PCR habitual, utilizando un cebador correspondiente al extremo 5' del ADN del dominio de APO-1 y un cebador correspondiente al extremo 3' del ADN del soporte de proteína, con lo que se obtiene un fragmento de ADN amplificado que contiene los dos ADN en fusión, e
(d)
inserción del fragmento de ADN de (c) en un vector de expresión y expresión del fragmento de ADN del modo habitual.
En una forma de realización preferente, la zona de unión de (a) y (b) es una zona bisagra de anticuerpo o una parte de ésta. También puede consistir en un sitio de disociación de trombina.
En el procedimiento de preparación anteriormente mencionado, se amplifican diferentes ADN mediante técnica PCR habitual. Como ADN codificador de como mínimo un dominio de APO-1 extracelular, los especialistas utilizarán como base, por ejemplo, el ADN descrito en el documento EP-92 107 060.3, véase más arriba. Después unirán al extremo 3' de éste un ADN codificador de una zona de unión. En caso de un ADN codificador de una zona bisagra de un anticuerpo humano o de una parte de la misma, los especialistas recurrirán, por ejemplo, al ADN descrito en Dübel, S., y col., Methods in Molecular and Cellular Biology, tomo 3 (1992), páginas 47-52. En cuanto al ADN codificador de soporte de proteína, por ejemplo el fragmento Fc de un anticuerpo humano, los especialistas recurrirán, por ejemplo, también a este ADN descrito en Dübel, S. y col., véase más arriba.
La expresión del fragmento de ADN amplificado tiene lugar en los vectores habituales, tales como pCDN83, pCEV4 y pCDM8 para la expresión en células animales, pGEMEX y pUC para la expresión en E. coli, y pY100 e YCpAD1 para la expresión en levadura. Como células animales son especialmente adecuadas las células L, COS y CHO, mientras que como microorganismos procariotas se pueden mencionar las cepas de E. coli en particular y como células de levadura en particular las de Saccharomyces y Pichia pastoris.
La presente invención abre una nueva vía de tratamiento terapéutico para enfermedades asociadas con una infección por VIH o para enfermedades autoinmunes.
Breve descripción de la figura
Figura 1 muestra la inhibición de la apoptosis mediante hu APO-1-Ig o anti-APO-1F(ab')_{2'}.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1 Preparación de una proteína de fusión en la que un dominio de APO-1 extracelular está fusionado a través de una zona bisagra de anticuerpo con un fragmento Fc de un anticuerpo humano
Para preparar la proteína de fusión arriba mencionada, un ADNc codificador de dominio de APO-1 extracelular (véase más arriba Oehm, A. y col.) y un fragmento Fc de un ADNc codificador de anticuerpo humano (véase más arriba Dübel, S. y col.) se sometieron a una amplificación por PCR habitual.
Como cebadores para el ADNc del dominio de APO-1 extracelular se utilizaron:
5' GCG AAG CTT GCC ACC ATG GTG GGC ATC TGG ACC CTC 3',
con lo que se introduce un sitio HindIII "corriente arriba" de una zona de consenso Kozak completa que rodea el iniciador metionina, y
5' GAC ACA ACA TTT GCG CTC GTT AGA TCT GGA TCC TTC 3',
que codifica el extremo 3' del dominio de APO-1 extracelular y los primeros 19 pares de bases de la zona bisagra.
Como cebadores para el ADNc del fragmento Fc se utilizaron:
5' GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC 3',
que codifica los primeros 18 pares de bases de la zona bisagra y el extremo 5' del fragmento Fc, y
5' ATT AAG CAT TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3',
que codifica el extremo 3' del fragmento Fc y un sitio Xbal "corriente abajo" del codón de terminación.
Los productos de PCR obtenidos se separaron en un gel de agarosa "de bajo punto de ebullición" y los fragmentos de gel que contenían las moléculas de ADN con el tamaño requerido se purificaron. Con una muestra de éstos se llevó a cabo otra amplificación por PCR. Como cebadores se utilizaron únicamente los cebadores anteriormente mencionados correspondientes al extremo 5' del dominio de APO-1 extracelular o al extremo 3' del fragmento Fc. De este modo, el dominio de APO-1 extracelular se pudo fusionar con el fragmento Fc en toda la zona bisagra conjunta. Se obtuvo un fragmento de ADN "de fusión".
Este fragmento se disoció con HindIII y Xbal, se purificó a través de un gel de agarosa y se clonó en el vector pCDM8. La secuencia del inserto de pCDM8 se determinó mediante secuenciación con didesoxinucleótido.
Ejemplo 2 Inhibición de apoptosis mediante hu APO-1-Ig o anti-APO-1F(ab')_{2}
Las células SKW 6.4 (véase más arriba, Oehm, A. y col.) son células habilitadas para apoptosis, es decir, en ellas se puede inducir la apoptosis mediante unión de un anticuerpo anti-APO-1, por ejemplo.
Células SKW 6.4 se incubaron durante 24 h con un anticuerpo anti-APO-1 en presencia de diferentes cantidades de la proteína de fusión del Ejemplo 1 (hu APO-1-Ig) o de anti-APO-1-F(ab)_{2} (véase más arriba). Se determinó la inhibición de la apoptosis (véase la Figura 1).
Se comprobó que la proteína de fusión del Ejemplo 1 y el anti-APO-1-F(ab)_{2} presentan un fuerte efecto inhibidor de la apoptosis. Este es especialmente fuerte en el caso de la proteína de fusión.

Claims (6)

1. Utilización de uno o más compuestos inhibidores o captores del ligando APO-1, compuestos que no son considerados como extraños en un individuo y que se seleccionan entre:
-
un anticuerpo de ligando anti-APO-1,
-
un APO-1,
-
un dominio APO-1 extracelular,
-
un compuesto con como mínimo un dominio APO-1 extracelular y un soporte,
-
un péptido que presenta un sitio de unión de ligando APO-1, y
-
un compuesto con como mínimo un péptido que presenta un sitio de unión de ligando APO-1 y un soporte,
con el fin de producir un medicamento para inhibir la apoptosis en caso de una enfermedad asociada con una infección por el VIH o de una enfermedad autoinmune.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que, en el caso del compuesto con como mínimo un dominio APO-1 extracelular y un soporte, el o los dominios y el soporte no son considerados como extraños en un individuo.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la que el soporte es una proteína.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la que la proteína es un fragmento Fc de un anticuerpo.
5. Utilización según una de las reivindicaciones 3-4, en la que el compuesto es una proteína de fusión.
6. Proteína de fusión en la que un dominio APO-1 extracelular está fusionado a través de una zona bisagra de anticuerpo con un fragmento Fc de un anticuerpo humano, consistiendo el dominio APO-1 en los aminoácidos 1 - 171 de la molécula APO-1 humana.
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