JP2001521743A - 組換えベクターに対する免疫応答の阻害方法 - Google Patents

組換えベクターに対する免疫応答の阻害方法

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エス． ファルク−ペダーセン、エリック
エルコン、キース
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コーネル リサーチ ファウンデーション、インコーポレイティッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、とりわけ、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター等の組換えベクターに対する免疫応答の阻害方法を提供する。当該方法は、細胞に、(i)導入遺伝子を含む組換えベクター、好ましくはウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスベクター、および(ii)ＴＮＦ受容体融合蛋白質、Ｆａｓ受容体融合蛋白質、ＩＦＮ受容体融合蛋白質、ＴＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子、Ｆａｓ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子およびＩＦＮ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される、該組換えベクターに対する免疫応答を阻害する手段を接触させ、その結果該組換えベクターに対する免疫応答を阻害することを含む。これに関連して、本発明はまた、当該方法に使用するための組換えベクターおよび組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術的分野 本発明は、組換えベクターに対する免疫応答の阻害方法、並びに当該方法に使
用するためのベクターおよび組成物に関する。
【０００２】 発明の背景 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイル
スを含めて、広範な真核ウイルスが遺伝子治療に使用されている。各々のタイプ
のベクターは、ウイルス依存的な利点と欠点の組み合わせをはっきりと示してき
た。したがって、遺伝子治療の特定の適用においてどのベクターを使用すべきか
決定する際には、特定のタイプのベクターに固有の利点と欠点を注意深く考慮し
なければならない。
【０００３】 遺伝子治療に関するアデノウイルスの利点としては、使用が容易であること、
高力価産生（すなわち、約１０13ウイルス粒子／ｍｌまで）、複製中の細胞だけ
でなく非複製細胞にも効率よく遺伝子を導入すること（例えば、Crystalによる 総説, Science, 270, 404-410 (1995)を参照）、並びに広範な宿主タイプおよび
細胞タイプ特異性が挙げられる。このような利点により、組換えアデノウイルス
は種々の遺伝子導入応用に選択されるベクターとなる。アデノウイルスベクター
は、通常気道上皮指向性であるので、肺の体細胞遺伝子治療用にとりわけ好まし
い。
【０００４】 遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスの使用に付随する他の利点とし
て、(1)組換えが稀にしか観察されないこと；(2)感染がよく起こるにもかかわら
ず、アデノウイルス感染はいかなるヒトへの悪影響とも表面上の相関がないこと
；(3)（線状の二本鎖ＤＮＡで構成される）アデノウイルスゲノムを操作して、 約７．５ｋｂまでの外来ＤＮＡを担持させることができ、また、例えば、アデノ
ウイルスキャプシドとの接着によってより長いＤＮＡ配列を細胞に運び得る可能
性があること（Curielら, Human Gene Therapy, 3, 147-154 (1992)）；(4)該ベ
クターは染色体外の様式でそのコードした配列を発現させるので、アデノウイル
スは通常の細胞機能を邪魔しそうにないこと；および(5)生のアデノウイルスが 何年もの間ヒトのワクチンとして安全に使用されているので、ヒトでの使用に安
全であることが既に証明されていることが挙げられる。
【０００５】 アデノウイルスレポーター遺伝子構築物を用いて、種々の動物モデルにおいて
高レベルの遺伝子発現が得られ得ることが立証されている。しかしながら、その
ように得られる高レベルの遺伝子発現は一過的であり、レポーター遺伝子の発現
は感染後第１週の内にピークに達し、感染後約８０日には本質的に検出不能とな
ることもまた明らかになっている。最近の研究により、インビボでの遺伝子発現
の持続性が制限されるのは、たいていがウイルス感染細胞に対する宿主の免疫応
答のせいであるらしいことが示されている。例えば、免疫学上の特権を有するニ
ューロンもしくは網膜組織内では２ヶ月を超える期間、また、免疫不全もしくは
免疫学的に未感作の齧歯類体内では６ヶ月を超える期間、遺伝子発現を維持する
ことができる。
【０００６】 マウスにアデノウイルスを静脈内投与すると、大半のアデノウイルスが肝臓に
局在化する（Worgallら, Human Gene Therapy, 8, 37-44 (1997)）。感染の最初
の２４〜４８時間の間、導入遺伝子が最大レベルで発現するかなり前に、ベクタ
ーＤＮＡの９０％が、おそらくは肝臓内のクッパー細胞が介在する生来のウイル
ス除去経路を通じて排除される（Worgallら (1997)，上述）。大部分のウイルス
が１ないし２日以内に除去されるという事実にもかかわらず、感染後第１週の間
に起こる最大の導入遺伝子発現とともに、投入されたアデノウイルスベクターの
残存するわずかなパーセンテージによって９５％を上回る肝細胞が形質導入され
る（Liら, Human Gene Therapy, 4, 403-409 (1993)）。しかしながら、免疫能 力のある動物においては、免疫賦活化によって、導入遺伝子発現は感染２〜３週
間以内にベースラインレベルまで急速に減少する。
【０００７】 免疫系の特定の要素を欠損するマウス系統を組み合わせて使用することにより
、ウイルスベクターに感染した細胞に対する免疫応答が、免疫系の細胞性成分と
体液性成分の両方に関与することが示されている。例えば、成熟ＴおよびＢリン
パ球を欠く免疫不全マウスは、アデノウイルスに仲介された導入遺伝子を４ヶ月
を超えて発現する（Kass-Eislerら, Gene Therapy, 1, 395-402 (1994); Yangら
, Immunity, 1, 433-442 (1994a); Yangら, PNAS USA, 91, 4407-4411 (1994b);
Daiら, PNAS USA, 92, 1401-1405 (1995); Kayら, Nat. Genet., 11, 191-197
(1995); およびYangら, J. Immunol., 155, 2564-2570 (1995)）。同様に、成熟
ＢおよびＴ細胞リンパ球を欠く感染したＲＡＧ−２マウスへアデノウイルスベク
ターに感染したマウス由来のＣＤ８+もしくはＣＤ４+細胞傷害性Ｔ細胞を導入す
ると、アポトーシスにより該ベクターおよび導入遺伝子が除去されたが（Yangら
(1994a), 上述; およびYangら (1995), 上述）、免疫能力のあるマウスにおい ては、ＣＤ８+もしくはＣＤ４+細胞の免疫が枯渇して持続的に導入遺伝子が発現
する（Yangら (1994a), 上述; Kayら (1995), 上述; Yangら (1995), 上述; Kol
lsら, Hum. Gene Ther., 7, 489-497 (1996); およびGueretteら, Transplantat ion , 62, 962-967 (1996)）。パーフォリンとＦａｓが関与する経路はＴ細胞細 胞傷害性を担う主要な経路であるが（Kojimaら, Immunity, 1, 357-364 (1994);
Henkart, Immunity, 1, 343-346 (1994); Kagiら, Science, 265, 528-530 (19
94); and Kagiら, Eur. J. Immunol., 25, 3256-3262 (1995)）、パーフォリン ／グランザイム経路が抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によるアデノウイルス遺伝
子導入ベクターの除去を仲介すると報告されている（Yangら, PNAS USA, 92, 72
57-7261 (1995)）。
【０００８】 ウイルスベクターからの遺伝子発現の持続を制限するのに加えて、免疫応答は
ウイルスベクターが首尾よく再投与されるのを阻害し、遺伝子治療の有効性のあ
る期間を制限する。例えば、アデノウイルスは、抗原の交叉反応性を含む多くの
判断基準に基づいて、４７の異なる血清型と多数の亜群、すなわちＡないしＧに
分類される。最初にアデノウイルスを投与した後、主要なウイルスキャプシド蛋
白質、すなわちペントン、ヘキソンおよびファイバーのエピトープに対する血清
型特異的抗体が産生される。このようなキャプシド蛋白質は、アデノウイルス自
身が細胞に接着し、続いて細胞を感染させる媒体であるので、このような抗体は
、次いで、同じ血清型のアデノウイルスによる細胞の再感染をブロック、すなわ
ち「中和する」。このため、遺伝子治療において、次の１回もしくは２回用量以
上の外来ＤＮＡを投与するには、異なる血清型のアデノウイルスベクターを使用
する必要がある。
【０００９】 本発明は、アデノウイルス遺伝子形質導入によって仲介される免疫賦活化、並
びに免疫介在性のアポトーシスおよび遺伝子治療におけるようにウイルスベクタ
ーの首尾よい再投与を阻害する抗アデノウイルス中和抗体により生じる問題に取
り組まんとするものである。すなわち、本発明の目的は、組換えベクターに対す
る免疫応答の阻害方法、並びに当該方法を実施するためのベクターおよび組成物
を提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的および利点、並びに発
明のさらなる特徴は、後述の詳細な説明から明らかとなるだろう。
【００１０】 発明の簡単な要約 本発明は、とりわけ、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター等の組
換えベクターに対する免疫応答の阻害方法を提供する。当該方法は、細胞に、(i
)導入遺伝子を含む組換えベクター、好ましくはウイルスベクター、最も好まし くはアデノウイルスベクター、および(ii)腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体融合蛋
白質、Ｆａｓ受容体融合蛋白質、インターフェロン（ＩＦＮ）受容体融合蛋白質
、ＴＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子、Ｆａｓ受容体融合蛋白質をコー
ドする遺伝子およびＩＦＮ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子からなる群より
選択される、該組換えベクターに対する免疫応答を阻害する手段を接触させ、そ
の結果該組換えベクターに対する免疫応答を阻害することを含む。これに関連し
て、本発明はまた、当該方法に使用するためのベクターおよび組成物を提供する
。
【００１１】 発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも部分的には、免疫応答の細胞性成分は原則的にアデノウ
イルスベクター内に含まれる遺伝子の持続的発現の阻害に責任を負っており、免
疫応答の体液性成分は原則的に免疫能力のある動物における所定の血清型のアデ
ノウイルスベクターの首尾よい再投与を阻害するのに責任を負っているという理
解を基礎としている。この発見は、プログラムされた細胞死、すなわち「アポト
ーシス」に関与する１または２以上の遺伝子を欠損する動物は、アデノウイルス
の存在とその後の同じ血清型のアデノウイルスの再投与に応答しなかったという
観察に基づいている。特に、Ｆａｓ-動物は、所定のアデノウイルスの持続的存 在とその後の再投与に免疫学的に応答する能力が弱まっていた。ＴＮＦ-動物は 、所定のアデノウイルスの持続的存在とその後の再投与に対する応答において、
免疫学的にひどく損なわれていた。これらの観察から、ＴＮＦ、特にＴＮＦ−α
、Ｆａｓおよび／またはＩＦＮ遺伝子等の、細胞死と免疫賦活化に関与する１ま
たは２以上の細胞遺伝子を阻害することにより、インビボおよびインビトロ（イ
クスビボ）遺伝子治療におけるような、宿主細胞内でのベクターの持続的存在お
よび該ベクター、特にウイルスベクター、就中アデノウイルスベクター内に含ま
れる遺伝子の持続的発現、並びに同じベクターもしくは、アデノウイルスベクタ
ーの場合、同じ血清型のベクターの宿主細胞内への首尾よい再投与が可能となる
という驚くべき且つ予測し得ない発見が導かれた。
【００１２】 以上のことから、本発明は、例えばインビボおよびインビトロ（イクスビボ）
遺伝子治療におけるように、細胞を導入遺伝子を含む組換えベクターに接触させ
ている間および／または細胞内で組換えベクター内の導入遺伝子が発現している
間、組換えベクター、特にウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター
、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターもしくはレトロウイ
ルスベクター等）、好ましくはアデノウイルスベクターに対する免疫応答を阻害
する方法を提供する。「阻害」とは、組換えベクター、特にウイルスベクター、
就中アデノウイルスベクターに対する直接的もしくは間接的、部分的もしくは完
全な、先天的もしくは後天的な免疫応答（細胞性（例えば、白血球の補強）であ
れ、体液性であれ）の阻害を意味し、とりわけ該ベクターが、キャプシドに包ま
れていない核酸とは対照的に組換えウイルス粒子の形態である場合、細胞内での
組換えベクターの持続的存在およびそれに付随するベクター内に含まれる導入遺
伝子の持続的発現が可能となる。しかしながら、本発明に従って、導入遺伝子を
含む組換えベクターと該組換えベクターに対する免疫応答を阻害する手段とに宿
主を接触させるならば、そのような阻害は、望ましくは宿主の長期的な免疫性を
弱めるべきではない。「免疫応答」とは、好ましくは、例えば細胞性もしくは体
液性免疫応答のような、後天的免疫応答を意味する。「インビボ遺伝子治療」お
よび「インビトロ遺伝子治療」は、イクスビボでの適用を含めて、周知且つ当業
者により「遺伝子治療」と呼ばれているものの、過去、現在および将来における
すべての変更および修正を包含することを意図している。
【００１３】 当該方法は、細胞に、(i)導入遺伝子を含む組換えベクター、好ましくはウイ ルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスベクター、および(ii)該組換えベ
クターに対する免疫応答を阻害する手段を接触させ、その結果該組換えベクター
に対する免疫応答を阻害することを含む。当該方法は、単独で、あるいは他の活
性な薬剤、例えば、当該技術分野で知られている治療もしくは予防剤および／ま
たは免疫抑制剤の投与等の、他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００１４】 「接触させる」とは、組換えベクターと細胞との間での物理的な接触をもたら
すようなやり方および量で、該細胞に該ベクターを投与することを意味する。ウ
イルスベクターが組換えウイルス粒子であれば、ウイルスベクターによる細胞へ
の接着および細胞の感染は、そのような物理的接触によってもたらされることが
望ましい。ウイルスベクターが、キャプシドに包まれていないウイルス核酸もし
くは他の核酸のような、組換えウイルス粒子以外のものであれば、細胞の感染は
該核酸によってもたらされることが望ましい。
【００１５】 そのような「接触」は、当業者に知られ、また、本明細書に記載された、ベク
ターと細胞との外見上の接触もしくは相互接触状態をもたらし得るいかなる手法
によっても行うことができる。任意で、アデノウイルスベクター等のベクターを
、二重特異的もしくは多重特異的分子（例えば、抗体もしくはその断片）とさら
に複合体形成させることができ、その場合、「接触」はベクターおよび二重特異
的もしくは多重特異的分子の複合体と細胞との外見上の接触もしくは相互接触状
態を含む。例えば、ベクターと二重特異的（多重特異的）分子は、例えば当業者
に知られた化学的手段または他の手段により、共有結合的に連結することができ
る。好ましくは、ベクターと二重特異的（多重特異的）分子は、非共有結合的相
互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ファン・デル・ワールス力および／ま
たは非極性相互作用）により連結することができる。ベクターと二重特異的（多
重特異的）分子は、少量の同じ溶液中で混合することによって接触させることが
できるが、細胞と該複合体とは、例えば該複合体を宿主（例えば、ヒト）に投与
し、該複合体を血流によってそれが選択的に結合して入り込む細胞に運ぶ場合の
ように、必ずしも少量で接触させる必要はない。ベクターと二重特異的（多重特
異的）分子の接触は、細胞がアデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子と
の複合体に接触する前に行うことが好ましい。
【００１６】 「導入遺伝子」とは、該導入遺伝子を含むベクターと接触した細胞内で発現し
得る遺伝子であって、望ましくは、その発現が該細胞または該細胞を一部とする
組織、器官、器官系、生物もしくは細胞培養に、予防的もしくは治療的利益をも
たらすものである。治療遺伝子はＲＮＡもしくは蛋白質レベルでその効果を発揮
するものであってよい。例えば、治療遺伝子にコードされる蛋白質を、遺伝病の
治療に使用（例えば、嚢胞性繊維症の治療における嚢胞性繊維症膜貫通コンダク
タンス調節因子をコードするｃＤＮＡの使用）することができる。
【００１７】 さらに、治療遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム
、スプライシングや３’プロセッシング（例えば、ポリアデニル化）に影響する
蛋白質、あるいは、おそらくはとりわけｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送
の変化、および／または転写後調節の変化を仲介することによって、細胞内で別
の遺伝子の発現レベルに影響する蛋白質（すなわち、ここでは遺伝子発現は、転
写開始からプロセスされた蛋白質の生産までのすべての工程を含めるものと広く
解釈されている）をコードすることによって、ＲＮＡレベルでその効果を発揮す
ることができる。
【００１８】 「組換えベクターに対する免疫応答を阻害する手段」とは、細胞を接触させ得
る、「阻害」で上述したように組換えベクターに対する免疫応答を阻害する手段
を意味する。好ましくは、該組換えベクターへの免疫応答を阻害する手段は、Ｔ
ＮＦ受容体融合蛋白質、Ｆａｓ受容体融合蛋白質、ＩＦＮ受容体融合蛋白質、Ｔ
ＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子、Ｆａｓ受容体融合蛋白質をコードす
る遺伝子、またはＩＦＮ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子である。ＴＮＦ受
容体融合蛋白質は、ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体Ｉ（
ＴＮＦＩ））、およびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ（またはその機能的断片）の
いずれかを含むことが好ましい。Ｆａｓ受容体融合蛋白質は、Ｆａｓ受容体の細
胞外ドメイン、およびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ（またはその機能的断片）の
いずれかを含むことが好ましい。ＩＦＮ受容体融合蛋白質は、インターフェロン
コンセンサス配列結合蛋白質（ＩＣＳＢＰ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、
およびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ（またはその機能的断片）のいずれかを含む
ことが好ましい。好ましくは、免疫応答を阻害する手段は、ＴＮＦ受容体融合蛋
白質（またはこれをコードする遺伝子）とＦａｓ受容体融合蛋白質（またはこれ
をコードする遺伝子）との組み合わせ以外のものである。望ましくは、該融合蛋
白質は、本発明の方法に従って接触させた細胞と同じ種に由来する蛋白質／ペプ
チドの融合物である。ＴＮＦ−ＩｇＧ融合蛋白質に関する米国特許第５，４４７
，８５１号を参照のこと。同特許に記載される方法は、Ｆａｓ−ＩｇＧ融合蛋白
質の構築に適用することができる。ＩＦＮ受容体蛋白質に関して、インターフェ
ロンの機能を細胞外で、細胞膜で、あるいは転写レベルで、ブロックするのに用
いることができる種々の候補蛋白質が存在する。アプローチの１つは、ＳＴＡＴ
−３について用いられるアプローチ（Fukadaら, Immunity, 5, 449-460 (1996) ；Horvathら, J．Virol., 70, 647-650(1996)）と同様の方法で、ＳＴＡＴ−１ のドミナントネガティブ突然変異体を創製することである。該突然変異体は、Ｃ
ＯＯＨ−末端を欠くか、または重要なチロシンが置換されている。別のアプロー
チとしては、例えば、インターフェロンコンセンサス配列結合蛋白質（ＩＣＳＢ
Ｐ；Thorntonら, J.Immunol., 157, 5145-5154（1996））のような内因性遺伝子
のドミナントネガティブバージョンの創製が挙げられる。ＩＣＳＢＰは、一般に
、赤芽球系統細胞(erythroid lineage cells)中で発現され、そしてそれ自身、 ＩＦＮ誘導により制御され得る。ＩＣＳＢＰの正常な機能はＩＦＮ誘導型遺伝子
の活性化を抑制することである。それは分離可能なＤＮＡ結合ドメインとレプレ
ッサードメインを含む（該ＤＮＡ結合ドメイン（ＩＣＳＢＰ ＤＢＤと称する；
Sharfら, J.Biol.Chem., 270, 13063-13069 (1995)）を包含するＮ−末端１２１
ａａからなるＩＣＳＢＰのドミナントネガティブを有する）。安定な細胞株中で
過剰発現されると該遺伝子産物は、I型およびII型のＩＦＮにより刺激される遺 伝子発現の両方を阻害する（Thortonら, (1996), 上述）。
【００１９】 従って、免疫応答を阻害する手段は、生物学的に許容し得る蛋白質性の(prote
inaceous)組成物（例えば、ＴＮＦ受容体融合蛋白質またはＦａｓ受容体融合蛋 白質）の形態でもよく、あるいは免疫応答を阻害する手段をコードし且つ細胞内
で発現され得る遺伝子を含む、生物学的に許容し得る組成物の形態であってもよ
い。細胞内で遺伝子を発現するためのこの手段は、当分野の技術範囲内である。
この点について、導入遺伝子を含む組換えベクターは、該組換えベクターに対す
る免疫応答を阻害する手段をコードする遺伝子をさらに含んでもよい。免疫応答
を阻害する手段が遺伝子であって当該遺伝子が、導入遺伝子を含み且つ発現する
組換えベクターとは別個のベクター中に含まれている場合、あるいは該組成物が
蛋白質性である場合、接触のタイミングが細胞と接触させる該ベクターに対する
免疫応答の阻害に作用を及ぼす限りは、免疫応答を阻害する手段を含む該組成物
は、導入遺伝子を含み且つ発現する組換えベクターと該細胞と接触させる前でも
、それと同時でも、あるいはそれに続いて該細胞に接触させることができる。
【００２０】 導入遺伝子を含む組換えベクターは、好ましくは、ウイルスベクターである。
より好ましくは、該ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴
ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターか
らなる群より選択される。最も好ましくは、該ウイルスベクターはアデノウイル
スベクターである。該組換えベクターがウイルス粒子である場合、特にアデノウ
イルスベクターである場合、キャプシド（例えばアデノウイルスキャプシドのヘ
キソン蛋白質）の免疫原性は、当該分野で知られている方法に従って減じられて
いることが望ましい。
【００２１】 細胞は、単一で存在しても、より大きな細胞集団の部分であってもよい。その
ような「より大きな細胞集団」には、例えば、細胞培養（混合または純粋のいず
れか）、組織（例えば、上皮組織または他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、
肝臓、胆嚢、膀胱、眼または他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系
、消化器系、泌尿器系、神経系、外皮系または他の器官系）、または生物（例え
ば、鳥類、哺乳類（特にヒト）等）が挙げられる。好ましくは、標的となる器官
／組織／細胞は、循環器系（例えば、心臓、血管および血液が挙げられるがこれ
らに限定されない）、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気
管支、肺等）、消化器系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝
臓、胆嚢等が挙げられる）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道等）、
神経系（例えば、脳および脊髄、ならびに特別な感覚器（眼等）が挙げられるが
これらに限定されない）、および外皮系（例えば、皮膚）である。さらにより好
ましくは、該細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱および眼の細胞からな
る群より選択される。
【００２２】 特に、組換えベクター（例えば、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベク
ター）と接触させる細胞は、該接触させる細胞が、組換えベクターによりターゲ
ッティングされ得る特定の細胞表面結合部位を含むという点で、他の細胞とは異
なる。「特定の細胞表面結合部位」とは、ベクター（例えば、アデノウイルスベ
クター）が細胞に接着するために相互作用しそれによって細胞に侵入することが
できる、細胞の表面上に存在するいかなる部位（すなわち、分子または分子の組
み合わせ）をも意味する。従って、特定の細胞表面結合部位は、細胞表面受容体
を包含し、好ましくは蛋白質（改変蛋白質を含む）、炭水化物、糖蛋白質、プロ
テオグリカン、脂質、ムチン分子またはムコ蛋白質等である。可能性のある細胞
表面結合部位としては、グリコサミノグリカン上に見出されるヘパリンおよびコ
ンドロイチン硫酸部位；ムチン、糖蛋白質およびガングリオシド上に見出される
シアル酸部位；主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）糖蛋白質；膜糖蛋白質中に
見出される一般的な炭水化物分子（マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン
、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコースおよびガラクトースが挙げられる）；
糖蛋白質（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン
、Ｌ−セレクチンおよびインテグリン分子）；ならびに癌細胞上に存在する腫瘍
特異的抗原（例えば、ＭＵＣ−１腫瘍特異的エピトープ等）が挙げられるがこれ
らに限定されない。しかしながら、アデノウイルスの細胞へのターゲッティング
は、細胞相互作用（すなわち、所定の細胞表面結合部位との相互作用）のいかな
る特定の機構にも限定されない。
【００２３】 本発明において、任意の適当な組換えベクターを使用することができる。「ベ
クター」は、この用語が当業者により理解されるように、遺伝子導入のためのビ
ヒクルである。本発明のベクターとしては、プラスミド、ファージおよびウイル
スが挙げられるがこれらに限定されない。本発明のベクターは、追加の配列や変
異を含む。特に、本発明のベクターは、さらに導入遺伝子および／または組換え
ベクターへの免疫応答を阻害する手段をコードし、且つ全合成あるいは部分合成
で製せられるコード配列または他の遺伝子配列、もしくはゲノム配列または相補
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含み得、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態で提供
され得る少なくとも１つの遺伝子を含む。
【００２４】 好ましくは、該ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
ター、ヘルペスベクターまたはレトロウイルスベクター等のウイルスベクターで
ある。最も好ましくは、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
アデノウイルスベクターは、いかなるアデノウイルス由来であってもよい。「ア
デノウイルス」は、アデノウイルス科の任意のウイルスであり、望ましくは、マ
ストアデノウイルス属のウイルス（例えば、哺乳類のアデノウイルス）またはア
ビアデノウイルス属のウイルス（例えば、鳥類のアデノウイルス）である。該ア
デノウイルスは任意の血清型のものである。アデノウイルスの供給源として使用
され得るアデノウイルスストックは、現在、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション(ATCC、Rockville、MD)から入手可能なアデノウイルス血清型１〜４７、あ るいは他のいかなるソースから入手可能な他のいかなるアデノウイルス血清型か
らも増幅することができる。例えば、アデノウイルスは、Ａ亜群（例えば、血清
型１２、１８および３１）、Ｂ亜群（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６
、２１、３４および３５）、Ｃ亜群（例えば、血清型１、２、５および６）、Ｄ
亜群（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３
０、３２、３３、３６−３９および４２−４７）、Ｅ亜群（血清型４）、Ｆ亜群
（血清型４０および４１）、または任意の他のアデノウイルス血清型のものでも
よい。しかしながら、血清型２、５または９のアデノウイルスが好ましい。アデ
ノウイルスは同じ血清型のコート蛋白質（例えば、ペントンベース、ヘキソンお
よび／またはファイバー）を含むことが望ましい。しかしながら、１または２以
上のコート蛋白質は、所定のコート蛋白質の全てまたは一部が別の血清型由来で
あるという意味でキメラであっても好ましい。
【００２５】 ウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター）は、複製能力を有し
得るが、該ウイルスベクターは複製欠損であるかまたは条件的に複製欠損である
ことが好ましい。例えば、ウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクタ
ー）は、ウイルスを複製欠損にする少なくとも１つの改変を有するゲノムを含む
。ウイルスゲノムへの改変としては、ＤＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメン
トの付加、ＤＮＡセグメントのリアレンジメント、ＤＮＡセグメントの置換また
はＤＮＡ傷害の導入が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡセグメント
は、小さくて１ヌクレオチド、あるいは大きくて３６キロ塩基対（すなわち、ア
デノウイルスゲノムのおおよそのサイズ）または３８キロ塩基対（これは、アデ
ノウイルスビリオン内にパッケージングされ得る最大量である）でもよい。ウイ
ルス（特にアデノウイルス）ゲノムへの好ましい改変には、ウイルスを複製欠損
にする改変に加えて、該導入遺伝子の挿入、および付加的に且つ好ましくは、導
入遺伝子を含む組換えベクターへの免疫応答を阻害する手段をコードする少なく
とも１つの遺伝子の挿入が挙げられる。アデノウイルス等のウイルスは、また好
ましくはコインテグレート型（すなわち、アデノウイルス等のウイルスゲノム配
列の、他の配列（例えば、プラスミド、ファージまたは他のウイルスの配列）と
の連結）であってもよい。
【００２６】 アデノウイルスベクター（特に、複製欠損アデノウイルスベクター）に関して
、そのようなベクターは、完全なキャプシド（すなわちアデノウイルスゲノムの
ようなウイルスゲノム）かあるいは空のキャプシド（すなわち、ウイルスゲノム
が欠けているか、あるいは例えば物理的手段または化学的手段によって分解され
ている）かのいずれを含んでいてもよい。好ましくは、該ウイルスベクターは、
完全なキャプシド（すなわち、導入遺伝子を運ぶ手段として）、および任意に阻
害手段をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。あるいは、上述のように導
入遺伝子および少なくとも１つの阻害遺伝子は、アデノウイルスキャプシドの外
側において細胞内にと運ぶことも好ましい。
【００２７】 アデノウイルス等のウイルスを特定の細胞へとターゲッティングするのに好ま
しいあるいは望ましい程度で、該ウイルスをプラスミドＤＮＡの細胞内への導入
におけるエンドソーム分解剤(endosomolytic agent)として本質的に使用するこ とができる。このエンドソーム分解剤は、マーカー遺伝子を含み、且つ細胞結合
リガンド（例えば、トランスフェリン）に共有結合的に連結したポリリジンと複
合体形成され、縮合されている（Cottenら, PNAS（USA）， 89， 6094−6098（1
992）；およびCurielら, PNAS (USA), 88, 8850−8854（1991））。トランスフ ェリン−ポリリジン／DNA複合体とアデノウイルスのカップリング（例えば、ト ランスグルタミナーゼとともにアデノウイルス指向性抗体を用いることによる、
あるいはビオチン／ストレプトアビジン架橋による）は、遺伝子の導入を実質的
に増強することが示されている（Wagnerら, PNAS (USA), 89, 6099−6103 （199
2））。
【００２８】 あるいは、１または２以上のウイルスコート蛋白質（例えば、アデノウイルス
ファイバー）は、例えば、細胞表面受容体に対するリガンドのための配列または
二重特異的抗体（すなわち、一方の端がファイバーへの特異性を有し、且つ他方
の端が細胞表面受容体への特異性を有する分子）への結合を可能にする配列の組
み込みのいずれかによって改変することができる(PCT国際特許出願番号WO/95/26
412号(出願第'412号)およびWatkinsら、「組換え抗体を用いたターゲッティング
アデノウイルス仲介型遺伝子送達（Targeting Adenovirus-Mediated Gene Deliv
ery with Recombinant Antibodies）」、要約、第336号)。どちらの場合にも特 有のファイバー／細胞−表面受容体相互作用は廃棄され(abrogated)、アデノウ イルス等のウイルスは、そのファイバーによって新たな細胞表面受容体へと再指
向される。
【００２９】 あるいは、選択された細胞種に特異的に結合し得るターゲッティングエレメン
トは、高親和性の結合対の第１の分子へとカップリングされ得、宿主細胞へと投
与され得る（PCT国際特許出願番号第WO/95/31566号）。次いで、高親和性の結合
対の第２の分子にカップリングした遺伝子送達ビヒクルは、宿主細胞へと投与さ
れ得、ここで、この第２の分子は、第１の分子に特異的に結合し得、その結果、
この遺伝子送達ビヒクルは、選択された細胞種へとターゲッティングされる。
【００３０】 例えば、エレクトロポレーション、形質転換、接合、三親交配、（共）トラン
スフェクション、（共）感染、膜融合、マイクロプロジェクタイルの使用、リン
酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、直接的マイクロインジェ
クション等の方法が、ウイルス、プラスミドおよびファージをそれらの核酸配列
の形態（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）で導入するのに利用可能であるので、
同じ考え方に沿って、キャプシド蛋白質等のいかなる付随蛋白質の非存在下にお
いても、いかなるエンベロープ脂質の非存在下においても、ベクターも同様にＲ
ＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。同様に、リポソームは、細胞膜と融合す
ることにより細胞侵入を果たすので、ベクターは、コート蛋白質をコードする構
成的核酸とともにリポソームを含むことができる。このようなリポソームは、例
えば、Life Technologies，Bethesda，MDから市販されており、そして、製造者 の推奨に従って使用され得る。さらにリポソームを遺伝子送達を達成するのに使
用することができ、導入効率が増大した、および／またはインビボでの毒性が低
減されたリポソームを使用することができる。可溶性キメラコート蛋白質（本明
細書中に記載の方法を用いて製造されるような）を製造者の手引きに従ってリポ
ソームが調製された後かあるいはリポソームの調製の間に添加することができる
。
【００３１】 本発明によるベクターは、本発明の方法において使用することができるものだ
けに限定されないが、遺伝子導入ベクターの構築において用いることができる中
間のタイプのベクター（例えば、「導入ベクター」）もまた包含する。
【００３２】 導入遺伝子および／または免疫応答を阻害する手段をコードする遺伝子は、ｍ
ＲＮＡの発現および蛋白質の産生のために、および他の生化学的特性を評価する
ために、バキュロウイルスまたは適切な原核もしくは真核発現ベクターからウイ
ルスベクターに、あるいはウイルスベクターからバキュロウイルスまたは適切な
原核もしくは真核発現ベクターに移すことができる。
【００３３】 従って、本発明はまた、ＴＮＦ受容体（好ましくは、ＴＮＦ受容体Ｉ）の細胞
外ドメインとＣＤ８のα鎖とを含むＴＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子
を含む組換えベクターを提供する。そのようなベクターは、導入遺伝子をさらに
含んでもよい。好ましくは、該組換えベクターはウイルスベクターである。より
好ましくは、該ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからな
る群より選択される。最も好ましくは、該ウイルスベクターはアデノウイルスベ
クターである。
【００３４】 本発明によれば、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメインおよびＣＤ８のα鎖もしくは
ＩｇＧ（またはその機能的断片）のいずれかを含むＦａｓ受容体融合蛋白質をコ
ードする遺伝子を含む組換えベクターもまた提供される。そのようなベクターは
導入遺伝子をさらに含んでもよい。好ましくは、該組換えベクターはウイルスベ
クターである。より好ましくは、該ウイルスベクターは、アデノウイルスベクタ
ー、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイ
ルスベクターからなる群より選択される。最も好ましくは、該ウイルスベクター
はアデノウイルスベクターである。
【００３５】 本発明は、ＩＣＳＢＰ ＤＢＤおよびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ（またはそ
の機能的断片）のいずれかを含むＩＦＮ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を
含む組換えベクターをさらに提供する。そのようなベクターは導入遺伝子をさら
に含んでもよい。好ましくは、該組換えベクターはウイルスベクターである。よ
り好ましくは、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからな
る群より選択される。最も好ましくは、該ウイルスベクターはアデノウイルスベ
クターである。
【００３６】 導入遺伝子および／または免疫応答を阻害する手段をコードする遺伝子を含む
組換えバキュロウイルスおよび原核細胞および真核細胞のプラスミド、ならびに
発現ベクターもまた本発明により提供される。
【００３７】 本発明によるベクター（組換えアデノウイルスベクターおよび導入ベクターを
含む）の産生に関して、そのようなベクターは、当業者に知られているような、
標準的な分子技術および遺伝子技術を用いて構築することができる。ビリオンす
なわちウイルス粒子を含むベクター（例えば、組換えアデノウイルスベクター）
は適切な細胞株中でウイルスベクターを用いて製造することができる。同様に、
１または２以上のキメラコート蛋白質を含む粒子は、標準的な細胞株（例えば、
アデノウイルスベクターについて現在使用されているもの）中で製造することが
できる。次いで、所望であれば、これらの得られた粒子を特定の細胞へとターゲ
ッティングすることができる。
【００３８】 導入遺伝子としてのターゲッティングあるいは発現のための変異蛋白質および
ペプチドを製造するための天然のアミノ酸配列の改変は、例えば、当業者に知ら
れている種々の手段により行うことができる。変異ペプチドは、所定のペプチド
と実質的に相同性であるが、そのペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプ
チドである。相同性の程度（すなわち、同一性のパーセント）は、例えば、その
ような比較の為に最適化されたコンピュータプログラムを用いて（例えば、Deve
reuxらにより記載され（Nucleic Acids Res., 12, 387 (1984)）、University o
f Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から自由に入手することができ るGAPコンピュータプログラム、バージョン６．０またはより高度なバージョン を用いて）配列情報を比較することにより決定することができる。変異蛋白質お
よび／または変異ペプチドの活性は、当業者に知られている他の方法を用いて評
価することができる。
【００３９】 変異蛋白質（ペプチド）と対照蛋白質（ペプチド）との間で同一ではないアミ
ノ酸残基に関して、変異蛋白質（ペプチド）は、好ましくは、保存性のアミノ酸
置換（すなわち、所定のアミノ酸が、大きさ、電荷密度、疎水性／親水性および
／または立体配置が類似した別のアミノ酸で置換される（例えば、Ｐｈｅに対し
てＶａｌ））を含む。変異部位特異的な変異は、改変された部位を含む合成オリ
ゴヌクレオチドを発現ベクターに連結することにより導入することができる。あ
るいはオリゴヌクレオチドにより指示される部位特異的変異誘発の手順を、Wald
erら, Gene, 42, 133 (1986)；Bauerら, Gene, 37, 73 (1985)；Craik, Biotech niques, January 1995, pp12-19；および米国特許第４,５１８,５８４号および 同第４,７３７,４６２号に開示されるようにして使用することができる。
【００４０】 いかなる適当な発現ベクター（例えば、Pouwelsら, クローニングベクター： ラボラトリーマニュアル(Cloning Vectors:A Laboratory Manual) (Elsevior, N
Y:1985)に記載される）および対応する適当な宿主細胞も、宿主細胞における組 換えペプチドまたは蛋白質の産生のために使用することができる。発現宿主とし
てはエシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、サルモネラ属に属する細
菌種、哺乳動物または昆虫宿主細胞系（バキュロウイルス系（例えば、Luckowら
, Bio/Technology, 6, 47 (1988)に記載）を含む）、および樹立細胞株（例えば
、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ等）が挙げられる
がこれらに限定されない。本発明のキメラ蛋白質（ペプチド）を調製するのに特
に好ましい発現系は、バキュロウイルス発現系であり、ここではトリコプルシア
・ニイ(Trichoplusia ni,)、Ｔｎ ５Ｂ１−４昆虫細胞または他の適当な昆虫細
胞が高レベルの組換え蛋白質を産生するのに使用される。勿論、当業者は、発現
宿主の選択が産生されるペプチドの種類に派生した結果を有することは承知して
いる。例えば、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）において産
生されるペプチドのグリコシル化は、大腸菌のような細菌細胞において産生され
るペプチドのそれとは異なる。
【００４１】 共有結合した複合体は、ペプチドまたは蛋白質のアミノ酸の側鎖上、あるいは
ペプチドまたは蛋白質のN-またはC-末端の官能基に化学的部位を結合させること
により調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体に結合した細胞
表面受容体に対するリガンドを含む二重特異的または多重特異的分子の構築にお
いて、特に有用であり得る。さらなる修飾が、通常の当業者には明らかであるだ
ろう。
【００４２】 ウイルスの接着、侵入および遺伝子発現は、まず、所望の蛋白質またはＲＮＡ
とβ−ガラクトシダーゼのようなマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを生
じさせる目的のインサートを含むアデノウイルスベクターを用いて評価すること
ができる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−Ｌａｃｚ
）に感染した細胞でのβ−ガラクトシダーゼの発現は、細胞にＡｄ−Ｇｌｕｃを
添加後、２時間程度の早さで検出することができる。この手法は、組換えウイル
スの細胞侵入および遺伝子発現の迅速かつ効率的な分析を提供するものであり、
そして当業者は慣用の技術を用いて容易にこれを実施する。
【００４３】 本発明のベクターはインビトロで有用性を有する。そのようなベクターは、ウ
イルスの除去および持続性の研究における研究道具として、また免疫応答を回避
する手段の効率を評価する方法における研究道具として使用することができる。
同様に、導入遺伝子および／または免疫応答を阻害する手段をコードする少なく
とも１つの遺伝子を含むベクター（好ましくはウイルスベクター、特にアデノウ
イルスベクター）はインビボで用いることができる。
【００４４】 特に、本発明の組換えウイルス（例えば、アデノウイルス）を矯正ＤＮＡ（例
えば、欠如しているかあるいは損傷している機能をコードするＤＮＡ）を細胞に
送達することによって、多くの疾患のいずれかを治療するのに用いることができ
る。そのような治療の対象となる疾患としては、例えば、癌（例えば、黒色腫ま
たは膠腫）、嚢胞性線維症、遺伝病、およびＨＩＶ感染を含む病原性の感染が挙
げられる。
【００４５】 本発明の方法および構成要素の他の適用が当業者に明らかであろう。
【００４６】 当業者には、本発明の組換えベクター（特にアデノウイルスベクター）および
免疫応答を阻害する手段を動物に投与するのに多くの適当な方法（例えば、Rose
nfeldら, Science, 252, 431-434 (1991)；Jaffeら, Clin. Res., 39(2), 302A
(1991)；Rosenfeldら, Clin. Res., 39(2), 311A (1991)；Berkner, BioTechniq ues ，6，616-629(1988)参照）を用いることができること、２つ以上の経路を投 与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも、より迅速且つより
効果的な反応を提供し得ることがわかるであろう。組換えベクターおよび／また
は免疫応答を阻害する手段を投与するのに用いるための医薬上許容される賦形剤
もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は、組
換えベクターおよび免疫応答を阻害する手段を投与するのに用いられる特定の方
法によって部分的に決定されるであろう。従って、本発明は、免疫応答を阻害す
る手段をコードする組換えベクターを、単独または導入遺伝子とさらに組み合わ
せて適当な担体中に含む組成物を提供するものであり、本発明における使用には
非常に多様な好適な製剤がある。特に、本発明は、ＴＮＦ受容体Ｉの細胞外ドメ
インおよびＣＤ８のα鎖を含むＴＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含
む組換えベクター、ならびにその担体を含む組成物を提供する。該組換えベクタ
ーは、さらに導入遺伝子を含んでもよい。本発明はまた、Ｆａｓ受容体の細胞外
ドメインおよびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ（またはその機能的断片）のいずれ
かを含むＦａｓ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクター、な
らびにその担体を含む組成物を提供する。該組換えベクターもまた、さらに導入
遺伝子を含んでもよい。ＩＣＳＢＰ ＤＢＤおよびＣＤ８のα鎖もしくはＩｇＧ
（またはその機能的断片）のいずれかを含む組換えベクターを含む組成物もまた
提供される。同様に、この組換えベクターは導入遺伝子をさらに含むことができ
る。そのような組成物は、他の活性な薬剤（例えば、当該分野で知られている治
療剤または予防剤および／または免疫抑制剤）をさらに含んでもよい。
【００４７】 以下の方法および賦形剤は、単なる例示であって、何ら限定するものではない
。
【００４８】 経口投与に適当な製剤は、（ａ）液剤、例えば、水、生理食塩水、オレンジジ
ュースのような希釈剤中に溶解された有効量の化合物；（ｂ）各々が所定量の有
効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サッシュ剤、または錠剤；
（ｃ）適当な液体中の懸濁液剤；および（ｄ）適当な乳液剤からなり得る。錠剤
形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質
セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロー
スナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦
形剤、着色料、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、着香料、ならびに薬理学的に
適合可能な賦形剤のうちの１つまたは２以上を含み得る。トローチ形態は、有効
成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントゴム中
に含み得るし、また香錠剤は有効成分をゼラチン、グリセリンのような不活性な
基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤等は有効成分に加えて当該分野で知られているよ
うな賦形剤を含有する。
【００４９】 吸入による投与用にエアロゾル製剤を製することができる。これらのエアロゾ
ル製剤は、加圧された許容され得る推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン
、プロパン、窒素等）中に置くことができる。これらはまた、ネブライザやアト
マイザのような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。
【００５０】 非経口投与に適当な製剤としては、水性および非水性の、等張性の無菌注射溶
液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの
血液と等張にする溶質を含み得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液剤
（これは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る）が
挙げられる。当該製剤は、単位用量または複数回用量を封入した容器（例えば、
アンプルおよびバイアル）で提供され、注射用に使用直前に無菌の液状賦形剤（
例えば水）を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保
存され得る。即席の注射液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の無菌の
散剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
【００５１】 さらに、乳化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤を用いて、座剤を製する
ことができる。
【００５２】 膣投与に適当な製剤は、有効成分に加えて、当該分野で適切であると知られて
いるような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡
、またはスプレー剤として提供され得る。
【００５３】 本発明において、動物、特にヒトに投与される用量は、目的の導入遺伝子、ベ
クターの供給源、および／または免疫応答を阻害する手段、用いられる組成物、
投与の方法、ならびに治療される特定の部位および生物により変動する。しかし
ながらベクター（例えば、本発明のアデノウイルスベクター）の有効量に対応す
る用量を用いることが好ましい。「有効量」とは、宿主において所望される効果
を生じるのに十分な量であり、これは当業者に知られているいくつかのエンドポ
イントを用いてモニターすることができる。例えば、所望の効果の１つは、宿主
細胞への核酸の導入である。そのような導入は、治療効果（例えば治療すべき疾
患、病態、傷害または症候群に付随するいくつかの症状の緩和）を含むがそれに
限定されない種々の手段によって、あるいは導入された遺伝子もしくはコード配
列またはその宿主内での発現を実証することによって（例えば、ポリメラーゼ連
鎖反応、ノザンまたはサザンハイブリダイゼーション、または宿主細胞中で核酸
を検出するための転写アッセイ、あるいは導入された核酸によりコードされる蛋
白質またはポリペプチドを検出するためのイムノブロット分析、抗体を介する検
出、または特殊化されたアッセイ、あるいはこのような導入によりレベルまたは
機能における強い影響を用いて）モニターされ得る。記載されたこれらの方法が
全ての例示では決してなく、特定の適用に適合するさらなる方法が、当業者には
明らかであろう。この点に関して、ベクター（例えば、ウイルスベクター、特に
アデノウイルスベクター）ならびに免疫応答を阻害する手段をコードするベクタ
ーの導入に対する宿主の応答は、投与されるウイルスの用量、送達の部位、およ
びベクターならびに導入遺伝子の遺伝的構成、および免疫応答を阻害する手段に
依存して変動し得ることに留意すべきである。
【００５４】 一般に、本発明のベクターの効果的な導入を確実にするには、所定の投与経路
を考慮した上で、接触させるおおよその細胞数に基づけば、接触させる細胞当た
り約１〜約５，０００コピーの本発明のベクターを用いることが好ましく、細胞
に約３〜約３００ｐｆｕ入ることがいっそう好ましい。しかしながら、これは単
に一般的な目安であり、インビトロまたはインビボのいずれでも、特定の適用に
おいて許可されるようにより高いまたはより低い量の使用を決して妨げるもので
はない。同様に、免疫応答を阻害する手段の量は、蛋白質を含む組成物の形態で
ある場合、導入遺伝子を含む組換えベクターに対する免疫応答を阻害するのに十
分であるべきである。例えば、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他
の医薬組成物との組み合わせで投与されるかどうかによって、あるいは薬物動態
、薬物の性向、および代謝における個体間差によって変動し得る。同様にインビ
トロでの適用においては、ターゲッティングされる特定の細胞種やベクターを導
入する手段によって量は変動し得る。当業者は、必要に応じて特別な状況のいか
なる必要な調整を容易に行うことができる。
【００５５】 実施例 以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、いかなる場合でも本発
明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５６】 以下の実施例に関して、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）マウス、Ｃ５７ＢＬ／６−
ＦａｓIpr（Ｂ６／Ｌｐｒ）Ｂａｌｂ／ｃ／Ｊ（Ｈ２ｄ）マウスおよびＣ３Ｈ（ Ｈ２ｋ）マウスを、Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEから入手した。変異系
統ＣＢＡ／Ｌｐｒcg （ＣＢＡ／Ｋ１Ｊｍｓ／Ｌｐｒcg）、および野生型系統Ｃ
ＢＡ／＋＋ （ＣＢＡ／Ｋ１Ｊｍｓ）は、以前に記載されている (Matsuzawaら,
J. Exp. Med., 171, 519-531 (1990))。ホモ接合性Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマ ウス（George Carlson博士， Great Falls, MTにより提供された）を飼育し、Ho
spital for Special Surgery (New York,NY)の動物施設において、特定の病原体
が存在しない特定の環境下で維持した。ＴＮＦ−α発現を欠損したマウス（ＴＮ
Ｆ−α −／−）を、置換型相同組換え(Marinoら, PNAS USA, 94, 8093-8098 (
1997))により作製した。パーフォリンノックアウトマウス（ｐｅｒｆ −／−）
は、以前に記載された通りにした（Walsh et al., PNAS USA, 91, 10854-10858
(1994)）。
【００５７】 第１世代のアデノウイルスベクター由来の、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を発現する血清型５のアデノウイルス（Ａｄ５）（
すなわち、Ａｄ５−ＣＡＴ）を、全ての研究において使用した (Kass-Eislerら,
PNAS USA, 90, 11498-11502 (1993))。
【００５８】 試験サンプルを、正規分布について解析し、次いで、Studentのｔ−検定（正 規分布）またはMann-Whitneyの階級和試験(rank sum test)（非パラメータ的デ ータ）のいずれかにより比較した。複数の比較を、対での比較のためのStudent-
Newman-Keuls法を用いＡＮＯＶＡによって行った。
【００５９】 実施例１ 本実施例では、宿主からのアデノウイルスの除去に及ぼすＦａｓ、パーフォリ
ンおよびＴＮＦ−αの相対的効果について説明する。
【００６０】 マウス（ｐｅｒｆ−／−，Ｐ２，Ｂ６／＋＋，Ｂ６／Ｌｐｒ，およびＳＣＩＤ
（Ｂ細胞およびＴ細胞を欠くためアデノウイルスベクターを除去しないのでコン
トロールとなる））をメトキシフルレンで麻酔し、該麻酔下のマウスの皮膚を切
開し頚静脈を剥き出しにした。次いで、該マウスに０.５ｃｃのインスリンシリ ンジ付２８Ｇ１／２（０．３６ｍｍ×１３ｍｍ）の針を用い、リン酸緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ；137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4）で１００
μｌに希釈した５×１０9個のＡｄ５−ＣＡＴウイルス粒子を頚静脈内に注射し た。注射後、該切開部を縫合した。所定の日にマウスを実験に供して、肝臓を取
り出し組織湿重量グラムあたり２ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズし、得られたホ
モジネートについてＣＡＴアッセイを行った。
【００６１】 ＣＡＴアッセイは以前に記載されているようにして実施した（Kass-Eisler ら
(1993),上述）。最初に、全組織ホモジネートの１〜５％を調べた。該値が該ア
ッセイの有効範囲外（概して６０％を越えるアセチル化クロラムフェニコール）
の場合、ｍｌあたり１ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで
ライセートを希釈した。１つの実験で、各アッセイポイント毎に５匹の動物を用
いた。
【００６２】 頚静脈内注射によって５×１０9粒子のＡｄ５−ＣＡＴを投与することにより 、感染後７日に、調べた全系統のマウスで、均一に高レベルなＣＡＴ遺伝子発現
が引き起こされた。感染後２８日では、ＳＣＩＤマウスについては持続的に高い
ＣＡＴ発現の上昇を続けたのに対し、正常な免疫能力のあるマウス、即ちＰ２と
Ｂ６／＋＋では、ＣＡＴ発現はベースラインレベルであった。ＳＣＩＤマウスで
観察された当結果は、以前の報告（Kass-Eisler ら (1994), 上述；Kass-Eisler
ら (1993), 上述；Kass-Eisler ら, Gene Ther., 3, 154-162 (1996)）に一致 していた。驚いたことに、ＣＡＴ遺伝子発現レベルは、パーフォリン欠損マウス
（ｐｅｒｆ −／−）でも感染後２８日ではベースラインにまで減少していた。 パーフォリン欠損マウスで観察された当結果は、導入遺伝子発現の排除にパーフ
ォリンが必要ではないということを示すものであった。Ｆａｓ欠損Ｌｐｒマウス
は、感染後２８日では、対応する野生型コントロールに比べて低レベルの持続的
なＣＡＴ遺伝子発現を示した。Ｆａｓ欠損Ｌｐｒマウスで観察されたこの結果は
、Ｆａｓ経路が宿主のＡｄ５−ＣＡＴ除去にいくらかはその要因となっているこ
とを示すものであった。ＴＮＦ−α欠損（ＴＮＦ−α −／−）マウスは、感染 後２４日では、対応する野生型コントロール（ＴＮＦ−α ＋／＋）に比べて高 レベルのＣＡＴ発現を示した。しかしながら、ＴＮＦ−α欠損マウスは、感染後
６０日では完全に導入遺伝子発現を阻害することができた。ＴＮＦ−α欠損マウ
スでのこれらの結果は、別の宿主防御機構がより長い期間をかけて導入遺伝子発
現を排除していることを示している。Ｆａｓ受容体のシグナル伝達領域に点突然
変異を有するＣＢＡ Ｌｐｒcgマウスでも同様の結果が観察されたので（Watanab
e-Fukunaga ら, Nature, 356, 314-317 (1992)）、これらの知見がマウスの系統
間での違いでは説明がつかないのは明らかである。
【００６３】 実施例２ 本実施例では、ＴＮＦ−α欠損細胞傷害性Ｔ細胞による、アデノウイルス感染
線維芽細胞の細胞溶解について説明する。
【００６４】 Ａｄ５−ＣＡＴに感染したマウスから脾臓を無菌的に取り出し、単一細胞懸濁
液を調製した。脾臓細胞を、上述の補成分を含むα−ＭＥＭ中、感染多重度（ｍ
ｏｉ）５０のＡｄ５−ＣＡＴの存在下、４×１０6細胞／ｍｌ（２４ウェルプレ ートの１ウェルあたり１．５ｍｌ）の密度で培養した。培養５日後、再賦活化さ
れた細胞傷害性Ｔ細胞を回収し、洗浄し、培養培地中に所望の濃度で再懸濁した
。
【００６５】 標的細胞として使用する前に、胚線維芽細胞を５００ｍｏｉのＡｄ５−ＣＡＴ
に２４時間感染させた。感染線維芽細胞、およびコントロールとなる非感染の線
維芽細胞を培養プレートから剥がし、懸濁状態で、１.５時間51Ｃｒ（〜１００ μＣｉ／１０6細胞）で標識した。
【００６６】 細胞傷害性Ｔ細胞および標識された標的細胞（１０4細胞／ウェル）を、種々 のエフェクター：標的比でもって、丸底９６ウェルマイクロタイタープレートの
各ウェルに添加し、３７℃で５時間インキュベートした。細胞傷害性Ｔ細胞によ
って引き起こされた標的細胞溶解のパーセンテージを、標的細胞から放出された 51 Ｃｒを以下の方程式に基づいて定量することによって決定した：
【００６７】
【数１】
【００６８】 Ａｄ５−ＣＡＴで感染して２８日後の野生型、Ｌｐｒ、およびＴＮＦ−α − ／−マウスから得られた細胞傷害性Ｔ細胞を用いたアッセイでは、ウイルス感染
線維芽細胞、およびより程度は少ないが、非感染線維芽細胞に有意な溶解が見ら
れた。対照的に、ｐｅｒｆ −／−マウスから得られた細胞傷害性Ｔ細胞を用い たアッセイでは、ウイルス感染線維芽細胞にかろうじて溶解が検出されただけで
あった。
【００６９】 全系統のマウスから調製された再賦活化された細胞傷害性Ｔ細胞は、古典的な
ＮＫ標的細胞であるＹＡＣ−１細胞のかなりの溶解を引き起こした。全系統のマ
ウスから調製された再賦活化された細胞傷害性Ｔ細胞によるＹＡＣ−１細胞の溶
解は、ＮＫ細胞やリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が、再賦活化された
細胞の大量集団内に存在していることを示している。ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞が存
在することで、細胞傷害性Ｔ細胞細胞傷害アッセイにおいて非感染線維芽細胞が
死ぬ程度が低いことに説明がつく。使用したＹＡＣ−１細胞のサブクローンはか
なりのレベルでＦａｓ抗原を発現するので、パーフォリン −／− リンパ球によ
るＹＡＣ−１細胞の溶解は十中八九Ｆａｓ依存性の経路により仲介されたものと
思われる。
【００７０】 実施例３ 本実施例では、インビトロおよびインビボで、ＴＮＦ−αが、アデノウイルス
仲介型導入遺伝子発現の除去を、細胞溶解を引き起こすことによって仲介するこ
とについて説明する。
【００７１】 １２匹のＳＣＩＤマウスをＡｄ５−ＣＡＴに感染させた。感染後７日および１
４日に、半数のマウスに、８０，０００単位の組換えマウスＴＮＦ−αあるいは
生理食塩水を腹腔内注射によりそれぞれ与えた。該マウスを感染後２１日で実験
に供し、肝臓でのＣＡＴ遺伝子の発現を測定した。ＴＮＦ−αを腹腔内注射した
マウスは全て、コントロール群で見られるそれに等しいＣＡＴ発現レベルであっ
た。これらの知見は、インビボで、全身性のＴＮＦ−αが、Ａｄ５−ＣＡＴ感染
肝細胞からアデノウイルス除去を仲介しないということを示すものであった。
【００７２】 インビトロで、Ａｄ５−ＣＡＴ感染細胞からのアデノウイルスの非細胞溶解的
除去をＴＮＦ−αが仲介するか否かを決定するため、線維芽細胞アッセイを設定
した。マウス胚線維芽細胞をＣ５７Ｂｌ／６（Ｈ２b）系の胚齢１６日の胚から 、標準的な手順（Doetschman ら., J. Embryol. Exp. Morphol., 87, 27-45 (19
85)）に従い重要でないところを少し変更して調製した。要するに、胚を無菌的 に取り出し、ＰＢＳで洗浄し、小片に切断し、そして０．０５％トリプシンと１
ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／トリプシン／ＥＤＴＡ）中、４℃で一
晩インキュベートし、粒子デブリスを除去後、培養液中に遊離した胚細胞を１０
０ｍｍプレート上に撒き、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ, Hyclone Laboratories,
Inc., Logan, UT）、ペニシリン／ストレプトマイシン（５，０００ Ｕ／５０μ
ｇ／ｍｌ）および５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノールを補ったα−改変最
少必須培地（αＭＥＭ）中、３７℃で培養した。胚線維芽細胞をトリプシン処理
により回収し、洗浄し、培養を続けるもの、あるいはストックとして凍結させる
もののどちらかに分けた。ほとんどの実験では、継代して三代目の線維芽細胞を
用いた。
【００７３】 Ｈ−２b線維芽細胞を、Ａｄ５−ＣＡＴに１，０００粒子／細胞で感染させた 。感染後２４時間で、細胞を51Ｃｒで標識し、濃度を上げながらＴＮＦに曝露し
た。２時間、４時間、１０時間および１８時間で、細胞溶解を51Ｃｒ放出によっ
て評価し、ＣＡＴ導入遺伝子発現を上述のようにして定量した。細胞溶解の程度
に直接相関してＣＡＴ活性の低下が観察された。このことは、ＴＮＦ−αが細胞
溶解を引き起こすことによってその効果を発揮することを示している。
【００７４】 実施例４ 本実施例では、ＴＮＦ−α欠損（−／−）マウスに比べて、ＴＮＦ−α野生型
（＋／＋）マウスの肝臓ではリンパ球浸潤が減少していることについて説明する
。
【００７５】 ＴＮＦ−α −／−マウスおよびＴＮＦ−α ＋／＋マウスをＡｄ５−ＣＡＴに
感染させ、感染後７日で実験に供した。該マウスから肝臓を取り出し、ホルマリ
ンで固定し、パラフィン包埋し、切片を作製した。肝臓の切片をヘマトキシリン
とエオシンで染色した。野生型マウスでは、肝臓の広範なリンパ球浸潤を示し、
１低倍視野あたり平均８．６ ＋／− ２．３の炎症性病巣を示した。対照的に、
ＴＮＦ−α欠損マウスでは、顕著なリンパ球浸潤の減少を示した（すなわち、単
核性細胞クラスター、１視野あたり１．６ ＋／− １．５病巣、p<0.0005, n=5,
Studentのｔ−検定）。
【００７６】 これらの結果は、アデノウイルスベクター感染が肝臓のＣＤ４+およびＣＤ８+ リンパ球の浸潤を誘導し、そのピークが感染後７〜１０日あたりであるというこ
とを示した先の研究（Yang ら (1994a), 上述）に一致している。該結果はまた 、強力な接着分子の刺激剤として作用するＴＮＦ−αが、同様に白血球の血管へ
の接着、および経内皮的な遊走を容易にするということにも一致している（Spri
nger, Nature, 346, 425-434 (1990)）。
【００７７】 実施例５ 本実施例では、アデノウイルスに対する中和抗体の力価について述べる。
【００７８】 最近、ＴＮＦ−α −／− マウスでは抗体産生が損なわれていることが観察さ
れたので（Marino ら (1997), 上述；およびPasparakis ら, J. Exp. Med., 184 , 139-411 (1996)）、ＴＮＦ−α ＋／＋マウスおよび −／− マウスについて 、Ａｄ５−ＣＡＴに対するＩｇＧ抗アデノウイルス抗体の力価を定量した。感染
後２８日の血清について、Ａｄ５−ＣＡＴに対する中和抗体の力価をGallら（J. Virol. , 70, 2116-2123 (1996)）に記載されているようにして測定した。１ウ ェルあたり１０10粒子（およそ５０ｎｇ）のアデノウイルス（ＰＢＳ中）で４℃
、一晩コーティングした９６ウェルプレート内で、抗Ａｄ抗体をＥＬＩＳＡによ
って測定した。該ウェルを洗浄し、次いで室温で１時間、１％ＢＳＡでブロッキ
ングした。次いで、該プレートを、マウス血清(１／１，０００希釈；３％ＢＳ Ａ、１０％正常ヤギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中)、１／１ ，０００希釈アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと順にインキュベ
ートし、基質（Sigma 104 phosphatase substrate, Sigma Chemical Co., St. L
ouis, MO）で発色させた。プレートをＥＬＩＳＡリーダーを用い、４０５ｎｍで
読み取った。Ａｄ５−ＣＡＴに感染させたＴＮＦ−α欠損マウスの血清を分析す
ると、Ａｄ５−ＣＡＴを感染させた野生型マウスに比べて抗Ａｄ５抗体が顕著に
減少していることがわかった。抗Ａｄ５−ＣＡＴ抗体の力価がＴＮＦ−α欠損マ
ウスでは低いということを、インビトロ抗Ａｄ５血清中和アッセイにおける血清
中和能の不足により確認した。
【００７９】 実施例６ 本実施例では、ＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）あるいはＦａｓ受容体（Ｆａｓ
Ｒ）のどちらか一方の細胞外ドメインとＣＤ８のα鎖の細胞外ドメインとを含む
融合蛋白質の構築について述べる。
【００８０】 全ＲＮＡを肺組織からRNAzol(Tel Test, Friendswood, TX)を用い、製造元の プロトコールに従って抽出した。ｃＤＮＡをSuperscript Kit (Gibco, Gaithers
burg, MD)を用いて合成した。ＰＣＲ増幅（３０サイクル）をＴＮＦＲＩまたは Ｆａｓのどちらか一方(3')と対になったＣＤ８(5')に特異的なプライマーを用い
て行った。ハウスキーピング遺伝子コントロールとしてβ−アクチンのＲＴ−Ｐ
ＣＲを用いた。ＣＡＴ ｃＤＮＡはＰＣＲ（４０サイクル）を用いて増幅した。 一般的なプライマーを用いたＰＣＲを利用して種々の導入遺伝子を抱えるアデノ
ウイルス（Ａｄ）ベクターを増幅した。
【００８１】 マウスＴＮＦＲＩ、ＦａｓＲおよびＣＤ８のα鎖の細胞外ドメインをＰＣＲを
用いてｃＤＮＡから増幅した。外来アミノ酸の導入を回避するよう気をつけなが
らキメラＴＮＦＲＩＣＤ８およびＦａｓＲＣＤ８融合蛋白質をオーバーラップＰ
ＣＲによって作製した。
【００８２】 全ての断片をｐＡｄのHin dIIIとXho Ｉサイトの間に連結した。導入遺伝子を
含有するｐＡｄベクターをＰＪＭ１７とともに２９３細胞に共トランスフェクシ
ョンすることによってＴＮＦＲＩＣＤ８とＦａｓＲＣＤ８を発現しているウイル
スを製造した。該細胞ライセートを２９３細胞を感染させるのに用いた。変法Ｈ
ｉｒｔ法によってウイルスＤＮＡを抽出し、制限酵素消化とＰＣＲによって組換
えを確認し、該蛋白質産物をＥＬＩＳＡによって確認した。さらにウイルスをプ
ラーク精製した。各クローンを上述のように再スクリーニングした。最後に、ラ
ージスケールのウイルスを２段階のＣｓＣｌ濃度によって精製し、グリセロール
中−２０℃で、あるいはシュクロース中−７０℃で保存した。ウイルス粒子の定
量はＯＤ２６０ｎｍで測定した。
【００８３】 完全長の、機能的な蛋白質が製造されるかどうかを調べるために、ＨｅＬａ細
胞を該Ａｄベクターで一過的に感染させ、その培養培地について蛋白質発現をＥ
ＬＩＳＡとウエスタンブロット分析によって調べた。抗ＣＤ８−α鎖，ＴＩＢ １０５ ハイブリドーマ(ATCC, Rockville, MD)，マウスＹＳＴ１６９(Caltag, D
uckinggame, CA)、抗Ｆａｓ，Ｊｏ−２(Pharmingen, San Diego, CA)、Ｒ−抗Ｆ
ａｓ, ウサギポリクローナル抗体（Drappa ら., PNAS USA, 90, 10340-10344 (1
993)）、抗ＴＮＦＲ１(Genzyme, Cambridge, MA)抗体を用いた。
【００８４】 ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、抗体（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした
。該プレートを室温で１時間ＰＢＳ／３％ＢＳＡでブロッキングし、次いで被検
試料と室温で４〜５時間インキュベートした。該プレートを洗浄し、ビオチニル
化第２抗体、アビジン−アルカリホスファターゼおよび基質と順にインキュベー
トした。４０５ｎｍでＯ．Ｄ．を読み取った。別に断りのない限り、試料は以下
の希釈状態で調べた：細胞培養上清、原液；血清、１／２；気管支肺胞洗浄（Ｂ
ＡＬｓ）、原液。ＥＬＩＳＡの標準を得るために、ＦａｓＣＤ８を培養上清から
ＤＥＡＥイオン交換カラム上の段階溶離によって単離した。銀染色およびウエス
タンブロット分析で測定して純度〜７０％にまで該蛋白質を単離した。
【００８５】 ３種の蛋白質全てが、ＣＤ８に対する２種類の異なるモノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）を用いてＥＬＩＳＡによって検出できた。これらの結果は特定のものであ
る。というのは、コーティング抗体がＦａｓＲまたはＴＮＦＲＩのどちらか一方
に対して向けられたものである場合、それにかなった導入遺伝子産物のみが検出
されるからである。
【００８６】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を還元条件下１２％ゲル
上で実施した。上述のウサギ抗ＦａｓＲ抗体またはヤギ抗ＴＮＦＲ抗体を用いて
、記載（Bullard ら, J. Immunology, 159, 2058-2067 (1997)）のようにしてウ
エスタンブロッティングを実施した。非変性条件下での融合蛋白質の分子量を評
価するために、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅ
ｘ−Ｇ１００カラム(Pharmacia, Piscataway, NJ)上でゲルろ過を、ＩｇＧ、Ｂ ＳＡおよびオブアルブミン（ＯＶＡ）でのカリブレーション後、実施した。ウイ
ルス感染２９３細胞からの濃縮上清を該カラムにロードし、１ｍｌ画分を集めた
。ＦａｓＲＣＤ８またはＴＮＦＲＣＤ８を上述のようにしてＥＬＩＳＡによって
検出した。同じ上清を解離条件下（０．２％ ＳＤＳ）、同じカラム上に流した 。
【００８７】 ウエスタンブロット分析は、ＴＮＦＲＣＤ８およびＦａｓＣＤ８がそれぞれ分
子量〜６０ｋＤおよび５６ｋＤであることを示し、これはＤＮＡ配列やグリコシ
ル化から予測されるサイズに一致していた(Watanabe-Fukunagaら, Nature, 356,
314-317 (1992))。これらの融合蛋白質の天然条件（ＰＢＳ）および解離条件（
０．５％ＳＤＳ）下での分子量を調べるために、培養上清をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ゲルろ過カラムにかけ、該融合蛋白質をＥＬＩＳＡによって検出した。
天然条件下では、ＴＮＦＲＣＤ８およびＦａｓＲＣＤ８は、カラムのボイド容量
付近で溶出した。一方、解離条件下ではＴＮＦＲＣＤ８のサイズは〜４５ｋＤで
あった。
【００８８】 実施例７ 本実施例では、ＣＤ８融合蛋白質がそのコグネイトリガンドをインビトロで特
異的に阻害することについて説明する。
【００８９】 該融合蛋白質が真正リガンドと結合する機能を保持していることを確かめるた
めに、各蛋白質を含有する該培養上清をインビトロ機能アッセイで調べた。
【００９０】 ＦａｓＲＣＤ８機能を評価するために、ＦａｓＲＣＤ８またはＣＤ８上清を可
溶性の機能的なヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ；Orlinickら, J. Biol. Chem., 272 , 32221-32229 (1997)）と４℃で６時間インキュベートした。次いで、該上 清をＦａｓＬ感受性細胞株Ａ２０(Onelら, Eur. J. Immunol., 25, 2940-2947 (
1995))とインキュベートし、１２〜１６時間後に、生存度のalamar blue アッセ
イ(Onel ら (1995), 上述)によってアポトーシスを定量した。ＦａｓＣＤ８はＢ
細胞リンパ腫Ａ２０のＦａｓＬ仲介型アポトーシスを減じた。
【００９１】 ＴＮＦＲＩＣＤ８機能を評価するために、組換えＴＮＦ−α(Genzyme)をＴＮ ＦＲＩＣＤ８あるいはＦａｓＲＣＤ８上清とともに４℃で６時間インキュベート
した。１６時間の時点でシクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、Ｌ９２
９細胞株を用い細胞傷害性をalamar blue アッセイによって評価した。ＴＮＦＲ
ＣＤ８は、ＴＮＦ−αによって引き起こされるＬ９２９細胞の死を効果的に阻害
した。
【００９２】 ＣＤ８はそのＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメインを介してＭＨＣ Ｉに結合する ことができるので、起こりうる可溶性ＣＤ８の妨害についても、古典的な同種Ｃ
ＴＬ反応によって評価した。Ｃ３ＨマウスにＣ３Ｈ Ｂ６／Ｆ１脾臓細胞を注射 することによって同種ＣＴＬ反応を起こした。脾臓細胞を７日目で回収し、51Ｃ
ｒで標識したＥＬ４細胞(Ｈ２b)標的に対する細胞傷害性について調べた。溶解 のパーセントを式：[(cpm 試料−cpm 自然発生的)／(cpm 最大−cpm 自然発生的
)]×１００％、に従って算出した。ＦａｓＲＣＤ８またはＴＮＦＲＩＣＤ８を含
有する上清を添加してもこのインビトロでの反応は阻害されなかった。さらに、
フローサイトメトリー分析では、これらの融合蛋白質がいくつかのＭＨＣ I陽性
細胞株(AE7, EL4)に結合するという証拠は観察されなかった。
【００９３】 実施例８ 本実施例では、可溶性ＦａｓおよびＴＮＦ融合蛋白質がインビボで発現し、且
つ機能的であることを説明する。
【００９４】 精製したウイルスをＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射し、注射して１週間後に
導入遺伝子の発現について血清を調べた。該導入遺伝子産物のマウス血清中での
発現のレベルはインビトロでの上清に匹敵するものであった。
【００９５】 分泌された可溶性融合蛋白質が機能的なものであるかどうか確かめるために、
感染後１週間でＡｄ感染ＳＣＩＤマウスに細胞死の誘導剤を投与した。６μｇの
抗Ｆａｓ抗体Ｊｏ−２のＳＣＩＤマウスへの静脈注射によってＦａｓ受容体(Oga
sawara ら, Nature, 364, 806-809 (1993))を通じて肝細胞のアポトーシスを誘 導した。２４時間マウスを観察して、生存しているマウスを全て実験に供した。
対照のＡｄＣＡＴウイルスに感染させたＳＣＩＤマウスでは、６μｇのＪｏ２で
重度の肝細胞アポトーシスが引き起こされた（２４時間までに３匹全て死んだ）
。一方、ＡｄＦａｓＲＣＤ８に感染させたマウスはかなり保護された（２４時間
では死んだマウスはいなかった、この時点で実験に供した）。
【００９６】 ＴＮＦＲＩＣＤ８融合蛋白質のインビボでの機能的能力を研究するために、全
身的に細菌のＬＰＳに曝露した際の致死ショックに対するマウスの高い感受性を
利用した。記載(Marino ら, (1997), 上述)のようにして、Ｃ３ＨｅＳｎＪマウ スを感作し、次いでＬＰＳを該マウスに注射することによってＴＮＦ−α仲介型
の敗血性ショックを引き起こした。要するに、１群あたり３匹のＣ３Ｈ／ＨｅＳ
ｎＪマウスに２．４×１０8 ｐｆｕのＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８またはＡｄＣＡＴコ
ントロールを注射し、５日後、それらを２５ｍｇのＤ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇ
ａｌ）で感作し、続いて０．３μｇのＬＰＳを腹腔内に投与した。３日間該マウ
スを観察し、その後生き残ったマウスを実験に供した。死亡した時点で肝臓を回
収し、液体窒素中ですばやく凍結するかホルマリンで固定した。ホルマリン固定
した組織をパラフィンに包埋し、切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、光
学顕微鏡で調べた。ＡｄＣＡＴを注射したマウス３匹全てがＬＰＳ注射後６時間
以内に死亡した。全く対照的なことに、ＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８を注射したマウス
は３匹とも全て生き残った。解剖（死亡直後）によれば、ＡｄＣＡＴを注射した
マウスは、肝臓の広範な出血性融解(hemorrhagic liquification)を示し、一方 でＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８を投与したマウスは保護されていた。
【００９７】 実施例９ 本実施例では、肝臓における導入遺伝子発現の持続期間について説明する。
【００９８】 ＣＤ８、ＴＮＦＲＩＣＤ８またはＦａｓＲＣＤ８を発現しているＡｄベクター
で感染させたＳＣＩＤマウスはかなりのレベルで可溶性産物を血清中に産生して
いると思われるので、ＳＣＩＤ血清中の種々の蛋白質についてＥＬＩＳＡの感度
を比較した。ＣＤ８単独の場合に比べて、ＦａｓＲＣＤ８およびＴＮＦＲＩＣＤ
８では捕捉ＥＬＩＳＡ(capture ELISA)の感度は数倍高かった。従って、ＡｄＦ ａｓＲＣＤ８およびＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８のみで更なる研究を行った。Ｆａｓま
たはＴＮＦ−αの阻害が個々の融合蛋白質の正常マウスでの発現を延長させてい
るのかどうかを決定するために、マウスを静脈内感染させ、ＥＬＩＳＡによって
融合蛋白質の発現を調べた。ＦａｓＣＤ８の血清レベルは第１週でピークになり
、２週間後にはバックグラウンドに近づいた。部分精製した標準品に照らし合わ
せると、融合蛋白質の血清中の濃度は〜４μｇ／ｍｌと見積もられた。ＴＮＦＲ
ＩＣＤ８の場合、血清レベルは第２週まで持続し、３週目で下降した。ＡｄＦａ
ｓＲＣＤ８とＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８とを一緒に注入する効果を調べるために、両
ベクターを静脈内注入し、血清中のＦａｓＲＣＤ８のレベルをモニタリングした
。両融合蛋白質が共に発現すると、ＦａｓＲＣＤ８はおおよそＴＮＦＲＩＣＤ８
レベル程度に持続した。
【００９９】 実施例１０ 本実施例では、ＴＮＦαがないか、あるいはブロックされると肺での導入遺伝
子の発現が延長されるということについて説明する。
【０１００】 気道内での免疫応答が肝臓での免疫応答と同様であるのかを決定するために、
ＡｄＣＡＴをＴＮＦ−α欠損マウスおよびＦａｓ欠損マウスに気管内経路によっ
て投与し、肺でのＣＡＴ発現を定量した。注入後４週間では、野生型マウスに比
べＴＮＦ−α欠損マウス由来の肺組織では顕著により高いＣＡＴ活性であったが
、Ｆａｓ欠損マウスではそうでなかった。可溶性融合蛋白質が肺でのウイルス持
続性を促進するか否かもまた調べた。Ｂ６マウスをＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８、Ａｄ
ＦａｓＲＣＤ８またはＡｄＣＤ８に気管内経路によって感染させた場合、投与後
４週間でＢＡＬ中にかなり高レベル（ＳＣＩＤコントロールに比べて）のＴＮＦ
ＲＩＣＤ８蛋白質が検出されたが、ＦａｓＲＣＤ８あるいはＣＤ８蛋白質は検出
されなかった。ＥＬＩＳＡの感度の違いを考慮して、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写
を導入遺伝子を創製するのに使用したのと同じプライマーを用いて評価した。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲで、５匹中４匹にＴＮＦＲＩＣＤ８導入遺伝子ｍＲＮＡの持続的な転
写を確認し、ＦａｓＲＣＤ８では０／４マウスであった。一方、ＣＤ８ｍＲＮＡ
は５匹のマウス全てにかろうじて検出されただけだった。ありふれたベクタープ
ライマーをＰＣＲに使用しても、同様の結果が得られた。これらの知見は、肺で
のＴＮＦ−αの妨害は、肝臓で見られたように免疫排除に同様の保護効果を有し
ているが、肺では、肝臓で先に観察されたそれよりもＦａｓの果たす役割が低い
ことを示している。
【０１０１】 実施例１１ 本実施例では、ＴＮＦＲＩＣＤ８が第２の遺伝子産物をトランスに保護するこ
とについて説明する。
【０１０２】 ＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８およびＡｄＣＡＴを静脈内に一緒に注入し、ＣＡＴ発現
を２１日目で評価した。ＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８をＡｄＣＡＴと共発現させると、
２１日目で、ＡｄＣＡＴ単独の場合と比べてＣＡＴ発現が著しく増強された。こ
の効果が、肺でも見られるのかを決定するために、３つの導入遺伝子を気管内に
ＡｄＣＡＴと一緒に投与し、ＣＡＴの発現を２８日目で定量した。ＴＮＦＲＩＣ
Ｄ８は他の導入遺伝子に比べ、ＣＡＴ発現に顕著に大きな保護を与えた。転写の
レベルで分析すると、ＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８に感染させた肺のみで、ＣＡＴｍＲ
ＮＡが検出された。ＡｄＣＡＴ単独で感染させたマウスの肺ではＣＡＴｍＲＮＡ
発現は検出されなかった。これらの知見を併せると、ＴＮＦＲＩＣＤ８が外来の
導入遺伝子産物の発現を拡大すること、およびこの発現が持続した転写によるも
のであることがわかる。
【０１０３】 実施例１２ 本実施例では、ＴＮＦＲＩＣＤ８がアデノウイルスに対する体液性免疫応答を
弱めることを説明する。
【０１０４】 感染後４週間での肝臓や肺における、Ａｄに対する体液性免疫に及ぼすＴＮＦ
−α妨害の効果を調べた。本質的に実施例５で述べたようにして、抗アデノウイ
ルスＩｇＧの定量を実施した。要するに、プレートを精製アデノウイルス（１０ 8 粒子／ウェル）で４℃、一晩コーティングし、３％ＢＳＡでのブロッキング後 、血清試料を１／１０〜１／２０００に希釈し、抗原とともにインキュベートし
た。該プレートを順次、３％ＢＳＡでブロッキングし、血清（静脈内感染させた
マウスでは１／２，０００希釈、気管内感染させたマウスでは１／２００希釈）
およびアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧとインキュベートした。静脈
内投与後、ＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８マウスにおけるＩｇＧ応答は、コントロールに
比べて実質的に減少した。対照的に、ＡｄＦａｓＣＤ８単独であるいは両ベクタ
ーを同時に感染させたマウスでは、コントロールと同様の抗体応答だった。マウ
スをＡｄＴＮＦＲＩＣＤ８に気管内経路によって感染させた場合、感染後４週間
のコントロールに比べ、抗Ａｄ抗体について統計学上有意に減少した。これらの
知見は、正常なマウスで、肝臓および肺におけるＴＮＦ−α作用の阻害が、Ｉｇ
Ｇ抗Ａｄ抗体産生を著しく減少させることを明らかにしている。
【０１０５】 実施例１３ 本実施例では、ＣＤ８（受容体遺伝子）とＩＣＳＢＰ−ＤＢＤを発現している
二機能性のアデノウイルスベクターの構築について述べる。
【０１０６】 ＩＣＳＢＰ−ＤＢＤを標準的な発現カセットであるｐＡｄＳＣＭＶ−ＨＳｇＤ
のHind III／Sal I 部位、ならびに発現カセットｐＡｄＴＣＭＶ−ＣＤ８内に挿
入した。２９３細胞へトランスフェクションし、核ライセートを単離することに
よって、各発現カセットをまず同定する。トランスフェクト抽出物のゲル移動度
シフトアッセイおよび免疫沈降アッセイを用いて、ＩＣＳＢＰ−ＤＢＰを機能的
に特徴付ける。いったんＩＣＳＢＰ−ＤＢＤのポジティブが証明されれば、標準
的なＥ３欠失ウイルスバックボーンを用いてウイルスベクターが構築される。
【０１０７】 実施例１４ 本実施例では、インビトロでのＡｄ５ＣＭＶ−ＩＣＳＢＰ−ＤＢＤの特徴づけ
について述べる。
【０１０８】 ウイルス用量を増加させながらのウイルス感染後の経時的なＩＣＳＢＰ−ＤＢ
Ｄ発現、経時的、用量的応答後の核抽出物のゲル移動度シフト、およびＡｄ−ｓ
ＣＤ８感染後の経時的なＲＮＡの単離によって、Ａｄ５−ＣＭＶ−ＩＣＳＢＰ−
ＤＢＤでの感染をＡｄ５−ＣＭＶ−ＩＣＳＢＰ ＤＰ／ｓＣＤ８に対してインビ トロでまず特徴付けた。いったん発現が確認されたら、ＲＮアーゼプロテクショ
ンアッセイを用いて、ウイルス感染に応答して活性化されるインターフェロン誘
導型遺伝子（ＩＳＧ−１５／５４）に及ぼすＩＣＳＢＰ−ＤＢＤ発現の影響を特
徴付ける。次いで可溶性ＴＮＦＲＣＤ８の発現もしくはＥ３の発現を伴った二重
ベクターを作製し、ＴＮＦ−αとＩＦＮの相乗的抑制について調べる。もしくは
共感染を使用することができる。
【０１０９】 ここに述べられた特許、特許出願、刊行物、および他の引例の全ては、ここに
言及したことで、引用により組み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここに
その全てが明示されたと同程度に明細書中に組み込まれるものである。 本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様が
変更され得ることが当業者には明白であろう。本発明はここで詳細に記載された
以外の方法で実行され得ることを意図するものである。したがって、本発明は添
付の請求の範囲の精神と範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１２月２２日（１９９９．１２．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ファルク−ペダーセン、エリック エス． アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10522、ドッブズ フェリー、ブエナ ヴ ィスタ ドライヴ 8714 (72)発明者 エルコン、キース アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 10538、ラーチモント、ケイン アヴェニ ュー 16 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 DA02 EA02 FA20 GA11 HA17 4C084 AA13 ZB071

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換えベクターに対する免疫応答の阻害方法であって、細胞
    に、(i)導入遺伝子を含む組換えベクター、および(ii) ＴＮＦ受容体融合蛋白質
    、Ｆａｓ受容体融合蛋白質、ＩＦＮ受容体融合蛋白質、ＴＮＦ受容体融合蛋白質
    をコードする遺伝子、Ｆａｓ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子およびＩＦＮ
    受容体融合蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される、該組換えベク
    ターに対する免疫応答を阻害する手段を接触させ、その結果該組換えベクターに
    対する免疫応答を阻害することを含む方法。
  2. 【請求項２】 該ＴＮＦ受容体融合蛋白質が、ＴＮＦ受容体Ｉの細胞外ドメ
    インおよびＣＤ８のα鎖を含む、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 該ＴＮＦ受容体融合蛋白質が、ＴＮＦ受容体Ｉの細胞外ドメ
    インおよびＩｇＧもしくはその機能的断片を含む、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 該Ｆａｓ受容体融合蛋白質が、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメイ
    ンおよびＣＤ８のα鎖を含む、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 該Ｆａｓ受容体融合蛋白質が、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメイ
    ンおよびＩｇＧもしくはその機能的断片を含む、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 該ＩＦＮ受容体融合蛋白質が、インターフェロンコンセンサ
    ス配列結合蛋白質（ＩＣＳＢＰ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＣＤ８
    のα鎖を含む、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 該ＩＦＮ受容体融合蛋白質が、ＩＣＳＢＰ ＤＢＤおよびＩ ｇＧもしくはその機能的断片を含む、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 該導入遺伝子を含む組換えベクターが、該ＴＮＦ受容体融合
    蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 該導入遺伝子を含む組換えベクターが、該Ｆａｓ受容体融合
    蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 該導入遺伝子を含む組換えベクターが、該ＩＦＮ受容体融
    合蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 該導入遺伝子を含む組換えベクターがウイルスベクターで
    ある、請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ
    随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクタ
    ーからなる群より選択される、請求項１１の方法。
  13. 【請求項１３】 該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請
    求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 ＴＮＦ受容体Ｉの細胞外ドメインおよびＣＤ８のα鎖を含
    むＴＮＦ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 さらに導入遺伝子を含む請求項１４の組換えベクター。
  16. 【請求項１６】 Ｆａｓ受容体の細胞外ドメインおよびＣＤ８のα鎖を含む
    Ｆａｓ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  17. 【請求項１７】 さらに導入遺伝子を含む請求項１６の組換えベクター。
  18. 【請求項１８】 Ｆａｓ受容体の細胞外ドメインおよびＩｇＧもしくはその
    機能的断片を含むＦａｓ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベク
    ター。
  19. 【請求項１９】 さらに導入遺伝子を含む請求項１８の組換えベクター。
  20. 【請求項２０】 ＩＣＳＢＰ ＤＢＤおよびＣＤ８のα鎖を含むＩＦＮ受容 体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  21. 【請求項２１】 さらに導入遺伝子を含む請求項２０の組換えベクター。
  22. 【請求項２２】 ＩＣＳＢＰ ＤＢＤおよびＩｇＧもしくはその機能的断片 を含むＩＦＮ受容体融合蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  23. 【請求項２３】 さらに導入遺伝子を含む請求項２２の組換えベクター。
  24. 【請求項２４】 該組換えベクターがウイルスベクターである、請求項１４
    〜２３のいずれかの組換えベクター。
  25. 【請求項２５】 該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ
    随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクタ
    ーからなる群より選択される、請求項２４の組換えベクター。
  26. 【請求項２６】 該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求
    項２５の組換えベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項１４〜２６のいずれかの組換えベクターおよびその
    担体を含む組成物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006520604A (ja) * 2003-03-19 2006-09-14 アイソジェニス・インコーポレイテッド ＣＤ８α鎖に基づき免疫原性が減少した遺伝子治療ベクター
JP2010537645A (ja) * 2007-08-31 2010-12-09 エーラス グローバル ティービー ワクチン ファウンデーション Ｉ型インターフェロン応答抑制剤類の発現によるウイルスベースワクチンベクター類からのトランスジーン発現の増強
JP2010538649A (ja) * 2007-09-12 2010-12-16 エーラス グローバル ティービー ワクチン ファウンデーション 真核生物ｉ型インタフェロン応答サプレッサー類の共発現による細菌ベースデリバリシステムからのトランスジーン発現の増強方法
JP2012529440A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 デフィルス、インコーポレイテッド 病原体感染を予防又は治療するためのインターフェロン投与

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2062601A (en) * 1999-12-06 2001-06-12 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Peptides that stabilize protein antigens and enhance presentation to CD8+ T cells
CA2376719A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-07 London Health Sciences Centre Research Inc. A method to improve the safety of gene therapy
WO2006012416A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Isogenis, Inc. Specific inhibition of autoimmunity and diseases associated with autoantigens
EP2342321B1 (en) 2008-09-17 2018-04-11 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
JPH04506061A (ja) 1989-03-15 1992-10-22 タイコシンスキー，マーク　エル． Ｃｄ８に基づく製剤
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
CA2109398A1 (en) 1992-10-30 1994-05-01 Alejandro A. Aruffo Extracellular matrix receptor ligands that modulate leukocyte function
CA2114168A1 (en) 1993-03-05 1994-09-06 Zlatko Dembic Chimeric human interferon-gamma-receptor/immunoglobulin polypeptides
DE4447484C2 (de) * 1994-04-08 1997-07-17 Deutsches Krebsforsch Mittel zur Hemmung von Apoptose
FR2724945B1 (fr) 1994-09-27 1996-12-27 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
FR2725726B1 (fr) 1994-10-17 1997-01-03 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique
FR2730411B1 (fr) 1995-02-14 1997-03-28 Centre Nat Rech Scient Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes
ES2236735T4 (es) 1995-06-05 2007-03-01 University Of Washington Procedimiento de prolongacion de la expresion de un gen de interes usando moleculas ctla4 solubles.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006520604A (ja) * 2003-03-19 2006-09-14 アイソジェニス・インコーポレイテッド ＣＤ８α鎖に基づき免疫原性が減少した遺伝子治療ベクター
JP2010537645A (ja) * 2007-08-31 2010-12-09 エーラス グローバル ティービー ワクチン ファウンデーション Ｉ型インターフェロン応答抑制剤類の発現によるウイルスベースワクチンベクター類からのトランスジーン発現の増強
JP2010538649A (ja) * 2007-09-12 2010-12-16 エーラス グローバル ティービー ワクチン ファウンデーション 真核生物ｉ型インタフェロン応答サプレッサー類の共発現による細菌ベースデリバリシステムからのトランスジーン発現の増強方法
US8658136B2 (en) 2007-09-12 2014-02-25 Aeras Global Tb Vaccine Foundation Methods to increase transgene expression from bacterial-based delivery systems by co-expressing suppressors of the eukaryotic type I interferon response
JP2012529440A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 デフィルス、インコーポレイテッド 病原体感染を予防又は治療するためのインターフェロン投与

Also Published As

Publication number Publication date
US6525029B1 (en) 2003-02-25
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CA2308017A1 (en) 1999-05-14
WO1999023229A1 (en) 1999-05-14
AU1288099A (en) 1999-05-24

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