ES2236735T4 - Procedimiento de prolongacion de la expresion de un gen de interes usando moleculas ctla4 solubles. - Google Patents

Abstract

EN LA INVENCION SE PRESENTA UN METODO PARA AUMENTAR LA EXPRESION DE UN GEN DE INTERES POR PARTE DE UNA CELULA, CUYA CELULA (A) COMPRENDE UNA CODIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS RECOMBINANTE Y (B) ES CAPAZ DE EXPRESAR EL GEN DE INTERES, CUYO METODO CONSISTE EN PONER EN CONTACTO LA CELULA CON UNA CANTIDAD DE UNA MOLECULA DE CTLA4 SOLUBLE EFECTIVA PARA AUMENTAR LA EXPRESION DEL GEN DE INTERES POR PARTE DE LA CELULA.

Description

Procedimiento de prolongación de la expresión de un gen de interés usando moléculas CTLA4 solubles.

La terapia génica se considera una importante promesa para el tratamiento de muchas enfermedades que ahora carecen de terapias específicas (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244:1275; Verma IM. Gene therapy. Sci Am 1990; 263:68; Miller AD. Progress toward human gene therapy. Blood 1990; 76:271; Karson, EM. Prospects for gene therapy. Biol Reprod 1990; 42:39).

Por ejemplo, el cáncer humano se asocia a menudo con expresiones génicas aberrantes o mutaciones en genes específicos, y es posible que los procesos neoplásicos se puedan modificar mediante la terapia génica. Por otra parte, las células tumorales modificadas mediante la terapia génica se pueden destruir mediante la inserción de genes tóxicos o genes que las hacen sensibles a los agentes quimioterápicos. Otro enfoque de la inactivación de las células neoplásicas es insertar un oncogén antisentido en las células tumorales. Estos genes se transcriben con orientación inversa al oncogén. Debido a que las secuencias son complementarias, los ARNm se hibridan; la actividad del oncogén se reduce porque el gen no se puede traducir (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244:1275).

La médula ósea es una diana adecuada para la terapia génica, porque es fácilmente accesible y manipulable in vitro y contiene células madre para perpetuar el genotipo modificado. El hígado y el sistema nervioso central también son dianas potenciales para la terapia génica (Miller AD. Progress toward human gene therapy. Blood 1990; 76:271).

La meta principal de la terapia génica es introducir elementos genéticos adicionales en una célula viva o reemplazar elementos moleculares perdidos o no funcionales del ADN de una célula viva para localizar y reparar las alteraciones de las células vivas que conducen a enfermedad en el hombre (Culver y cols., Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in mouse and man, PNAS USA, 88:3155 (1991)).

Dependiendo de la enfermedad que se va a tratar, se pueden adoptar tres estrategias para terapia génica. Los genes disfuncionales se pueden reemplazar y modificar para hacerlos funcionales, o aumentarse con genes sanos que trabajan en diferentes loci en las células. De estas opciones, la terapia de aumento génico es actualmente la más factible. Un ejemplo de aumento génico es la adición de un gen funcional de adenosín deaminasa a las células de pacientes con inmunodeficiencia combinada severa (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244:1275; Verma IM. Gene therapy. Sci Am 1990; 263:68; Miller AD. Progress toward gene therapy. Blood 1990; 76:271; Karson, EM. Prospects for gene therapy. Biol Reprod 1990; 42:39).

Los requisitos previos para la terapia génica son comprender el defecto de la enfermedad y tener un gen funcional normal clonado y caracterizado. Los genes se introducen mediante varios procedimientos.

La terapia génica puede incluir la transferencia de genes a células en cultivo y después el transplante de las células cultivadas a un sujeto (enfoque ex vivo) o directamente la introducción de los genes en un sujeto para la transferencia génica a las células in situ (enfoque in vivo).

En ambos enfoques in vivo y ex vivo, los vectores virales se han explotado como vehículos para introducir los genes de interés. Los genomas virales se modifican para hacerlos no virulentos pero capaces de infectar ciertos tipos de células. Una ventaja de los vectores retrovirales es el hecho de que el ADN introducido se integra eficazmente en el cromosoma del huésped. El gen para la sustitución funcional se inserta en una posición en el genoma viral que lo hace capaz de expresarse después de haber entrado en el tejido apropiado. El virus se administra después al paciente o a las células diana para permitir la transformación en el fenotipo funcional deseado. Una desventaja de los vectores retrovirales es la necesidad de replicación celular para una transferencia génica eficiente. Por el contrario, los vectores de adenovirus no requieren replicación celular, pero el ADN introducido no se integra en el cromosoma del
huésped.

Estos vectores recombinantes, que incluyen los vectores de adenovirus, son eficientes en la transferencia de genes en los tejidos somáticos pero están limitados para el uso en la terapia génica clínica por factores inmunológicos que dan como resultado la rápida pérdida de la expresión génica e inhiben la transferencia génica secundaria. Específicamente, la expresión génica es transitoria, no durando en general más de varias semanas debido a una respuesta celular inmune dirigida contra las células transducidas (Y. Yang y cols. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 4407; Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433). Esta limitación se puede evitar mediante el uso de moléculas de CTLA4 solubles que dan como resultado la prolongación de la expresión génica.

CTLA4 es un antígeno celular de superficie hallado normalmente en las células T. CTLA4 se une al antígeno B7 de activación de las células B. Se ha demostrado que una molécula soluble de CTLA4, es decir, CTLA4Ig, inhibe las respuestas inmunes dependientes de la interacción entre células T y B (Linsley y cols, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991); documento EP-A-613944).

Se ha publicado que la inhibición inmune selectiva de los vectores de adenovirus recombinantes usando CTLA4Ig da como resultado una expresión génica persistente (Kay MA y cols., Journal of cellular Biochemistry Supplement Nº 21 A, página 366 (1995)).

El uso de moléculas solubles de CTLA4 en inmunoterapia aumenta enormemente la probabilidad de que los vectores virales recombinantes sean útiles para la terapia génica humana.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de una molécula soluble de CTLA4 y un ligando anti-CD40 para la preparación de una combinación terapéutica para el tratamiento de sujetos que se han sometido, se están sometiendo o se someterán a terapia génica.

La presente invención se refiere además al uso de células puestas en contacto con una molécula soluble de CTLA4 y un ligando anti-CD40 para la preparación de una combinación terapéutica para el tratamiento de sujetos que se han sometido, se están sometiendo o se someterán a terapia génica, en la que las células (a) incluyen una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) son capaces de expresar el gen de interés.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la prolongación de la expresión de un gen de interés por una célula, en el que la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar el gen de interés, procedimiento que comprende el contacto de la célula con una molécula soluble de CTLA4 y un ligando anti-CD40.

El uso de la presente invención se refiere a un procedimiento para prolongar la expresión de un gen de interés por una célula. En este procedimiento, la célula comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica para el gen de interés y es capaz de expresar el gen de interés. Este procedimiento proporciona la etapa de contacto de la célula con una cantidad efectiva de moléculas solubles de CTLA4 y ligandos anti-CD40 para prolongar la expresión del gen de interés por la célula. Por otra parte, cuando las células se encuentran en un sujeto, el procedimiento comprende la administración al sujeto de una cantidad de moléculas solubles de CTLA4 y ligandos anti-CD40, que prolongan de forma efectiva la expresión del gen de interés por la célula.

La presente invención también se refiere al tratamiento del sujeto que padece una enfermedad. Por lo tanto, al menos una célula del sujeto (a) comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés que es capaz de inhibir la enfermedad o los síntomas asociados con ella. Este tratamiento comprende la administración al sujeto de una cantidad de CTLA4 soluble y ligando anti-CD40 efectiva para aumentar la cantidad o la duración de la expresión del gen de interés por el
sujeto.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-D son gráficas que muestran la expresión génica mediada por adenovirus con la coadministración de CTLA4Ig soluble. Cada línea representa un animal.

Las figuras 2A-C son gráficas que muestran los resultados de los ensayos de proliferación esplénica.

La figura 3 es una fotografía que identifica células inflamatorias hepáticas a través de inmunohistoquímica.

Descripción de tallada de la invención Definición

Como se usan en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en la presente memoria descriptiva un "gen de interés" significa una molécula de ADN o ARN que codifica para una proteína o secuencia de ácido nucleico.

Como se usa en la presente memoria descriptiva una "secuencia proteica no CTLA4" significa una molécula que no se une a B7 y que no interfiere con la unión de CTLA4 a su diana antigénica B7.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "el dominio extracelular de CTLA4" es una porción de CTLA4 que reconoce y se une al antígeno B7. Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 se describe en Linsey y cols, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991); Linsey y cols, "Immunosupression in vivo by a soluble form of the CTLA4 cell activation molecule" Science (1992) 257(5071)792-795.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "CTLA4 soluble" significa un CTLA4 circulante capaz de unirse a B7. Los ejemplos incluyen pero no se limitan al dominio extracelular de CTLA4 o al dominio extracelular de CTLA4 fusionado (genética o químicamente) con una molécula activa biológica o químicamente como CTLA4Ig, CTLA-env gp120, CTLA4-p97, CTLA4-ova, y CTLA4-E7.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "terapia génica" es un procedimiento para corregir una enfermedad mediante manipulación genética.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "vector viral" es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo (1) en la que se puede insertar un gen de interés para introducirlo en una célula huésped donde se expresará y (2) que deriva de un virus.

Para que la invención descrita en la presente memoria descriptiva se comprenda mejor, se expone la siguiente descripción.

Usos y procedimientos de la invención

Esta invención se refiere al descubrimiento de que una cantidad efectiva de CTLA4 soluble y ligando anti-CD40 aumenta la expresión de un gen de interés por una célula permitiendo su expresión génica de forma prolongada o persistente. En una forma de realización de la invención preferida, el gen de interés es parte de una secuencia de ácido nucleico como un vector viral recombinante. Los vectores virales recombinantes se describen en la presente memoria descriptiva.

En una forma de realización de la invención, el aumento de la expresión génica se efectúa mediante el contacto de la célula con una cantidad de moléculas CTLA4 solubles y ligando anti-CD40 para inhibir una respuesta inmune. Por otra parte, el aumento de la expresión génica se efectúa mediante la administración al sujeto de una cantidad de CTLA4 soluble y ligando anti-CD40 para inhibir una respuesta inmune logrando de ese modo una expresión génica viral persistente sin inmunosupresión a largo plazo. La combinación de una molécula CTLA4 soluble y un ligando anti-CD40 (MR1) prolonga la expresión génica y permite la transferencia génica secundaria. Un ligando anti-CD40 es una molécula que reconoce y se une al ligando CD40, por ejemplo, un anticuerpo (anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o fragmentos de los mismos) o una proteína de unión recombinante, por ejemplo, una proteína de fusión.

Las moléculas CTLA4 solubles se pueden administrar durante la terapia génica, antes de la terapia génica, o después de la terapia génica. Además, la administración de CTLA4 soluble es útil incluso después de administraciones posteriores de genes a través de enfoques in vivo o ex vivo. El uso de moléculas CTLA4 solubles puede permitir la expresión génica secundaria con éxito que sigue a una segunda administración del gen de interés a través de enfoques in vivo o ex vivo que normalmente no sería posible debido a la respuesta inmune.

CTLA4 soluble se puede administrar de forma oral, de forma transdérmica, de forma intravenosa, de forma intramuscular, o mediante administración subcutánea. Por otra parte, CTLA4 se puede insertar junto con el gen de interés en un vector viral y co-expresarse.

Los usos de la invención son útiles en el tratamiento de sujetos con células defectuosas, enfermas o dañadas. En particular, el uso de CTLA4 soluble puede aumentar las terapias génicas en pacientes que padecen una enfermedad (patente de EEUU nº 5399346, concedida el 21 de marzo de 1995). La probabilidad de éxito en la terapia génica mejora como resultado del aumento de la expresión génica y el sujeto que padece la enfermedad se trata de forma más efectiva que sin el uso de CTLA4 soluble antes, después y/o durante la terapia génica.

En una forma de realización de la invención, al menos una célula del sujeto debe comprender ADN recombinante del gen de interés. Además, la célula debe ser capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés de forma que la enfermedad o los síntomas relacionados con ella se inhiban.

De acuerdo con la práctica de la invención, el sujeto puede ser un sujeto animal como un humano, un perro, un gato, una oveja, un caballo, un pez, un pájaro, un cerdo, o una vaca.

En la actualidad, varios grupos están usando la terapia génica en el tratamiento del cáncer (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244:1275-1281; Roth JA, Mukhopadhyay T, Tainsky MA, y cols. Molecular approaches to prevention and therapy of aerodigestive tract cancers. Review article. Monogr Natl Cancer Inst 1992; 13:15-21; Mukhopadhyay T, Tainsky M, Cavender AC, Roth JA. Specific inhibition of K-ras expression and tumorigenicity of lung cancer cells by antisense RNA. Cancer Res 1991; 51:1744-1748).

Los investigadores han desarrollado protocolos de tratamiento de tumores cerebrales experimentales mediante la inyección directa de células que producen partículas retrovirales que transportan el gen de la timidina kinasa (TK) del herpes a los cánceres cerebrales (Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, y cols. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors, Cellular Immunology Section, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Science 1992; 256:1550-1552). La incorporación del gen TK en las células tumorales las hará sensibles al ganciclovir. El uso de CTLA4 soluble puede aumentar la expresión del gen TK.

Los usos de la invención se refieren además al tratamiento de las células defectuosas, enfermas o dañadas de un sujeto que comprende la inserción del vector Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA o Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA en las células de modo que las células produzcan la proteína codificada por el gen de interés junto con moléculas CTLA4 solubles en cantidad suficiente para mejorar las células defectuosas, enfermas o dañadas del sistema nervioso
central.

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Los usos de la invención se refieren además al tratamiento de las células defectuosas, enfermas o dañadas de un sujeto que comprende el injerto de células de donante en el sujeto. De acuerdo con la práctica de la invención, las células de donante están modificadas genéticamente. Específicamente, estas células de donante se injertan con el Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA o Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA de modo que estas células de donante producen la proteína codificada por el gen de interés junto con moléculas CTLA4 solubles en cantidad suficiente para mejorar las células defectuosas, enfermas o dañadas del sistema nervioso central.

La invención también se refiere a un procedimiento in vitro para prolongar la expresión de un gen de interés por una célula, en el que la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés. La composición comprende una cantidad efectiva farmacéuticamente de Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA y un vehículo aceptable. Por otra parte, la composición comprende una cantidad efectiva farmacéuticamente de Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA y un vehículo aceptable.

Células

Las células que incluyen el gen de interés pueden ser cualquier célula eucariota como las células epiteliales y las células conectivas. Las células epiteliales se localizan sobre toda la superficie del cuerpo, incluso áreas internas como la pared interna de los vasos sanguíneos o del estómago. Las células conectivas incluyen las células que forman el tejido óseo, el tejido cartilaginoso y la sangre, es decir, tanto las células sanguíneas blancas como las rojas. La célula comprende ADN recombinante que codifica y es capaz de expresar el gen de interés in vitro e in vivo.

La célula puede ser una célula animal como una célula de un ser humano, un perro, un gato, una oveja, un caballo, un pez, un pájaro, un cerdo o una vaca.

Las células de donante pueden ser células productoras. Además, las células de donante pueden ser células autólogas o heterólogas.

Introducción de genes extraños en las células

Están disponibles varias técnicas para la introducción de ADN o ARN en las células. En general, la terapia génica incluye (1) transferir genes a células en cultivo y después transplantar las células cultivadas a un sujeto (enfoque ex vivo) o (2) introducir directamente los genes en un sujeto para la transferencia génica a las células in situ (enfoque in vivo).

Por ejemplo, el gen de interés se puede insertar en una célula directamente en un vector viral recombinante. Son posibles otros procedimientos de inserción.

Por ejemplo, en las técnicas ex vivo, el gen se puede insertar en la célula usando cualquier procedimiento de transferencia génica como la transfección mediada por fosfato de calcio, el uso de policationes o lípidos complejos con ADN, encapsulación de ADN en vesículas lipídicas o eritrocitos fantasma, o la exposición de las células a pulsos rápidos de corriente eléctrica de alto voltaje (es decir, electroporación). El ADN también se ha introducido en las células mediante microinyección directa o mediante el uso de microproyectiles de tungsteno de alta velocidad. Estas técnicas son capaces de integrar múltiples copias de ADN en el genoma aunque la eficiencia de la integración varía ampliamente con la técnica, diferentes genes y diferentes tipos celulares.

Recientemente se han desarrollado técnicas que usan vectores virales para introducir ADN en las células de los mamíferos. Estas técnicas tienen el potencial de infectar todas las células expuestas al virus. En el desarrollo de técnicas para el uso de vectores virales, era necesario desarrollar vectores que se incorporaran de forma estable a la célula diana sin dañarla.

Los vectores virales adecuados incluyen papovavirus, virus simio 40, poliomavirus, adenovirus, retrovirus murinos y de ave. Los vectores virales pueden infectar múltiples tipos celulares.

Vectores

Los vectores virales se prefieren debido a su eficiencia, comparada con los vectores que no entran en las células mediante acontecimientos mediados por receptor. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus vaccinia, herpes virus, o virus de la rabia.

El vector viral seleccionado debería reunir los siguientes criterios: 1) el vector debe ser capaz de infectar las células de interés y por lo tanto se deben seleccionar los vectores virales que tienen un intervalo de huésped apropiado; 2) los genes transferidos deberían ser capaces de persistir y expresarse en las células durante un largo periodo de tiempo; y 3) el vector debería ser seguro para el huésped y producir la mínima transformación celular. Los vectores retrovirales y los adenovirus ofrecen unos eficientes, útiles y en la actualidad mejor caracterizados medios de introducir y expresar eficientemente genes extraños en las células de mamíferos. Estos vectores tienen unos intervalos de huéspedes y tipos celulares muy amplios y expresan genes de forma estable y eficiente. La seguridad de estos vectores ha sido demostrada por muchos grupos de investigación. De hecho muchos son ensayos clínicos.

Otros vectores virales que se pueden usar para la transferencia génica en células para la corrección de alteraciones incluyen virus herpes y papovavirus como JC, SV40, polioma; virus de Epstein-Barr (EBV); papilomavirus, por ejemplo papilomavirus bovino tipo I (BVP); poliovirus y otros virus humanos o animales.

Los adenovirus tienen varias propiedades que los hacen atractivos como vehículos de clonación (Bachettis y cols.: Transfer of gene for thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. PNAS USA, 1977 74:1590; Berkner, K. L.: Development of adenovirus vectors for expression of heterologous genes. Biotechniques, 1988 6:616; Ghosh-Choudhury G, y cols., Human adenovirus cloning vectors based on infectious bacterial plasmids. Gene 1986; 50:161; Hag-Ahmand Y, y cols., Development of a helper-independent human adenovirus vector and its use in the transfer of the herpes simolex virus thymidine kinase gene. J Virol 1986; 57:257; Rosenfeld M, y cols., Adenovirus-mediated transfer of a recombinant \alpha_{1}-antitrypsin gene to the lung epithelium in vivo. Science 1991; 252:431).

Por ejemplo, los adenovirus poseen un genoma de tamaño intermedio que se replica en el núcleo celular; muchos serotipos son clínicamente inocuos; los genomas de adenovirus parecen ser estables a pesar de la inserción de genes extraños; los genes extraños parecen mantenerse sin pérdidas ni reordenamientos; y los adenovirus se pueden usar como vectores de expresión de alto nivel de transición con un periodo de expresión de semanas a varios meses. Estudios bioquímicos y genéticos extensos sugieren que es posible sustituir secuencias heterólogas de 7-7.5 kb por secuencias de adenovirus nativas que generan vectores viables, condicionales e independientes de colaboradores (Kaufman R. J.; Identification of the component necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors. PNAS USA, 1985 82:689). Al igual que los ejemplos, la invención proporciona vectores de adenovirus designados Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA y Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA.

AAV es un pequeño parvovirus humano con un genoma de ADN monocatenario de aproximadamente 5 kb. Este virus se puede propagar como un provirus integrado en varios tipos celulares humanos. Los vectores AAV tienen varias ventajas para la terapia génica humana. Por ejemplo, tienen tropismo por las células humanas pero también pueden infectar otras células de mamíferos; (2) no se han asociado enfermedades con el AAV en humanos u otros animales; (3) los genomas de AAV integrados parecen estables en sus células huésped; (4) no hay evidencias de que la integración del AAV modifique la expresión de los genes o los promotores del huésped o promueva su reordenamiento; (5) los genes introducidos se pueden rescatar de la célula huésped mediante infección con un virus colaborador como el adenovirus.

El sistema de vector HSV-1 facilita la introducción virtualmente de cualquier gen en células no mitóticas (Geller y col. An efficient deletion mutant packaging system for a defective herpes simplex virus vectors: Potential applications to human gene therapy and neuronal physiology. PNAS USA, 1990 87:8950).

Otro vector para la transferencia génica en mamíferos es el vector basado en el papilomavirus bovino (Sarver N, y col., Bovine papilloma virus DNA: A novel eukaryotic cloning vector. Mol Cell Biol 1981; 1:486).

Los vectores basados en el virus vaccinia y otros poxvirus proporcionan un sistema de transferencia génica en mamíferos. El virus vaccinia es un virus de DNA bicatenario grande de un tamaño genómico de 120 kilodaltons (kd) (Panicali D, y col., Construction of poxvirus as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccine virus. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79:4927; Smith y col. Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigens. Nature, 1983 302:490).

Los retrovirus insertan de forma eficiente genes virales en las células huésped (Guild B, y col., Development of retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonic cells and hematopoietic cells in vivo. J Virol 1988; 62:795; Hock RA, y col., Retrovirus mediated transfer and expression of drug resistance genes in human hemopoietic progenitor cells. Nature 1986; 320:275; Kriegler M. Gene transfer and expression. A laboratory manual. New York: Stockton Press, 1990:1-242; Gilboa E, Eglitis MA, Kantoff PW, y col. Transfer and expression of cloned genes using retroviral vectors. Biotechniques 1986; 4:504-512; Eglitis AM, Anderson WF. Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells. Biotechniques 1988; 6:608-614; Adam MA, Miller AD. Identification of a signal in a murine retrovirus that is sufficient for packaging of nonretroviral RNA into virions. J Virol 1988; 62:3802-3806; Armentano D, Yu SF, Kantoff PW, y col. Effect of internal viral sequences on the utility of retroviral vectors. J Virol 1987; 61:1647-1650; Bender MA, Palmer TD, Gelinas RE, y col. Evidence that the packaging signal of Moloney murine leukemia virus extends into the gag region. J Virol 1987; 61:1639-1646; Danos O, Mulligan RC. Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:6460-6464; Markowitz D, Goff S, Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virol 1989; 167:400-406; Miller AD, Buttimore C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol 1986; 6:2895-2902; Miller AD, Trauber DR, Buttimore C. Factors involved in the production of helper virus-free retrovirus vectors. Somatic Cell Mol Genet 1986; 12:175-183; Miller AD, Rosman GJ. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques 1989; 7.980-986).

Gen de interés

El gen de interés puede ser cualquier gen de interés. El producto génico del gen de interés incluye proteínas o secuencias de ácidos nucleicos como moléculas sentido o antisentido.

Por ejemplo, el gen de interés puede codificar para una proteína seleccionada del grupo que consiste en citoquinas, enzimas, antibióticos, toxinas, antimetabolitos y precursores de los mismos. Las citoquinas adecuadas incluyen interferones, interleucinas GM-CSF, factor de necrosis tumoral (TNF) (Wong G, y col., Human GM-CSF: Molecular cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins. Science 1985; 228:810; documento WO-9323034 (1993); Horisberger MA, y col., Cloning and sequence analyses of cDNAs for interferon- and virus-induced human Mx proteins reveal that they contain putative guanine nucleotide-binding sites: functional study of the corresponding gene promoter. Journal of Virology, 1990 Mar, 64(3):1171-81; Li YP y col., Proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha and IL-6, but not IL-1, down-regulate the osteocalcin gene promoter. Journal of Immunology, 1992 Feb 1, 148(3):788-94; Pizarro TT, y col. Induction of TNF alpha and TNF beta gene expression in rat cardiac transplants during allograft rejection. Transplantation, 1993 Aug, 56(2):399-404). (Breviario F, y cols., Interleukin-1-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component. Journal of Biological Chemistry, 1992 Nov 5, 267(31):22190-7; Espinoza-Delgado I, y col., Regulation of IL-2 receptor subunit genes in human monocytes. Differential effects of IL-2 and IFN-gamma. Journal of Immunology, 1992 Nov 1; 149(9):2961-8; Algate PA, y col., Regulation of the interleukin-3 (IL-3) receptor by IL-3 in the fetal liver-derived FL5.12 cell line. Blood, 1994 May 1, 83(9):2459-68; Cluitmans FH, y col., IL-4 down-regulates IL-2-, IL-3-, and GM-CSF-induced cytokine gene expression in peripheral blood monocytes. Annals of Hematology, 1994 Jun, 68(6):293-8; Lagoo, AS, y col., IL-2, IL-4, and IFN-gamma gene expression versus secretion in superantigen-activated T cells. Distinct requirement for costimulatory signals through adhesion molecules. Journal of Immunology, 1994 Feb 15, 152(4):1641-52; Martinez OM, y col., IL-2 and IL-5 gene expression in response to alloantigen in liver allograft recipients and in vitro. Transplantation, 1993 May, 55(5):1159-66; Pang, y col.,GM-CSF, IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression and citokyne production in human duodenal fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide, IL-1 alpha and TNF-alpha. Clinical and Experimental Immunology, 1994 Jun, 96(3):437-43; Ulrich TR, y col., Endotoxin-induced cytokine gene expression in vivo. III. IL-6 mRNA and serum protein expression and the in vivo hematologic effects of IL-6. Journal of Immunology, 1991 Apr 1, 146(7):2316-23; Mauviel A, y col., Leukoregulin, a T cell-derived cytokine, induces IL-8 gene expression and secretion in human skin fibroblasts. Demonstration of enhanced NF-kappa B binding and NF-kappa B-driven promoter activity. Journal of Immunology, 1992 Nov 1, 149(9):2969-76).

Los factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento transformante-\alpha (TGF\alpha) y \beta (TGF\beta), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factores estimuladores de colonias de citoquinas (Shimane M, y col., Molecular cloning and characterization of G-CSF induced gene cDNA. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1994 Feb 28, 199(1): 26-32; Kay AB, y col., Messenger RNA expression of the cytokine gene cluster, interleukin 3 (IL-3), IL-4, IL-5, and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, in allergen-induced late-phase cutaneous reactions in atopic subjects. Journal of Experimental Medicine, 1991 Mar 1, 173(3): 775-8; de Wit H, y col., Differential regulation of M-CSF and IL-6 gene expression in monocytic cells. British Journal of Haematology, 1994 Feb, 86(2):259-64; Sprecher E, y col., Detection of IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6 gene transcription by the polymerase chain reaction in keratinocytes, Langerhans cells and peritoneal exudate cells during infection with herpes simplex virus-1. Archives of Virology, 1992, 126(1-4):253-69).

Las enzimas adecuadas incluyen el gen de la timidina kinasa (TK), xantina-guanina fosforribosiltransferasa (GPT) de E. coli o E. coli citosindeaminasa (CD), o hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT).

Los oncogenes y genes supresores tumorales incluyen neu, EGF, ras (que incluye H, K, y N ras), p53, gen supresor tumoral del retinoblastoma (Rb), gen productor del tumor de Wilm, fosfotirosina fosfatasa (PTPasa), y nm23. Las toxinas adecuadas incluyen la exotoxina A de Pseudomonas; toxina diftérica (DT); toxinas LT de E. coli, toxina Shiga, toxinas similares a Shiga (SLT-1, -2), ricina, abrina, suporina, y gelonina.

Dosis de las moléculas CTLA4 solubles

El modo más efectivo de administración y régimen de dosis para las moléculas de la presente invención depende de la localización del tejido o enfermedad que se va a tratar, la gravedad y curso de la alteración médica, la salud del sujeto y la respuesta al tratamiento y el juicio del médico que lo trata. En consecuencia, las dosis de las moléculas deberían titularse para cada sujeto.

La interrelación de dosis para animales de varios tamaños y especies y seres humanos basadas en mg/m^{2} de superficie se describe por Freireich, E. J., y col. Cancer Chemother., Rep. 50(4):219-244 (1996). Se pueden hacer ajustes en el régimen de dosis para optimizar la respuesta inhibitoria y asesina del crecimiento de las células tumorales, por ejemplo, las dosis se pueden dividir y administrar en una pauta diaria o reducirse la dosis proporcionalmente dependiendo de la situación (por ejemplo, varias divididas se pueden administrar diariamente o reducirse proporcionalmente dependiendo de la situación terapéutica específica).

De acuerdo con la práctica de la invención una cantidad efectiva para el tratamiento de un sujeto puede estar entre 0,1 y 10 mg/kg de peso del sujeto. También, la cantidad efectiva puede ser una cantidad entre 1 y 10 mg/kg de peso del sujeto.

Estaría claro que la dosis de la composición de la invención requerida para lograr la cura puede reducirse más con una optimización programada.

Moléculas CTLA4 solubles

Los ejemplos de CTLA4 solubles incluyen CTLA4Ig, una porción funcional de una molécula de CTLA4 que se une al antígeno B7 expresado en las células B activadas. Por ejemplo, la molécula CTLA4 funcional comprende los 187 aminoácidos mostrados en el documento ID SEC Nº 14 que comienzan con alanina en la posición 1 y terminan con asparagina en la posición 187. Por otra parte, la molécula CTLA4 funcional comprende los 125 aminoácidos mostrados en el documento ID SEC Nº 13 que comienzan con alanina en la posición 1 y terminan con asparagina en la posición 125 de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína CTLA4.

La molécula CTLA4 funcional se puede unir a una secuencia proteica no CTLA4 como una porción de una molécula de inmunoglobulina. Los ejemplos de moléculas CTLA4 solubles incluyen las moléculas CTLA4-p97 solubles; moléculas CTLA4-env gp120 solubles; moléculas CTLA4-E7 solubles; y moléculas CTLA4-ova solubles.

En una forma de realización la molécula CTLA4 soluble es CTLA4Ig que tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a la proteína de fusión CTLA4Ig que se ha depositado con la American Type Culture Collection (ATCC) en Rockville, Maryland, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest del 31 de mayo de 1991 y se ha concedido el número de acceso 68629 a la ATCC.

Ventajas de la invención

La terapia génica es una nueva forma de medicina molecular que tendrá un importante impacto en la salud humana en este siglo y en el próximo. La terapia génica tiene la posibilidad de corregir alteraciones genéticas hereditarias como la fibrosis quística, la hemofilia, la hipercolesterolemia familiar, el cáncer, el SIDA, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, y las enfermedades infecciosas.

Los vectores virales recombinantes son vehículos atractivos para la terapia génica porque son eficientes en la transferencia de genes en los tejidos somáticos. Sin embargo, antes de la invención de los solicitantes, su uso estaba limitado en la terapia génica clínica porque la expresión transgénica se volvía transitoria pasado un tiempo. Además, evitar la expresión transitoria a través de una segunda o más administraciones del virus da como resultado una transferencia génica significativamente reducida.

El descubrimiento de los solicitantes se basa en el hallazgo de que la administración de CTLA4Ig soluble y ligando anti-CD40 antes, después o durante la transferencia génica a las células in vivo o ex vivo, da como resultado la expresión génica persistente por el vector viral recombinante en el sujeto sin inmunosupresión a largo plazo.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la invención y para ayudar a los no expertos en la materia a hacer y usar lo mismo. Los ejemplos no tienen la intención de limitar de ninguna forma el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Este experimento determinó que el uso de moléculas CTLA4Ig solubles da como resultado una expresión génica prolongada después de la transferencia génica mediada por adenovirus.

Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las guías oficiales expuestas por la Universidad de Washington. Todos los animales se alojaron en instalaciones libres de patógenos específicas (SPF).

Se inyectó a ratones (por ejemplo, ratones C3H/HeJ) adenovirus recombinante diluido en 100 \muL de medio DMEM (Hyclone) mediante infusión en venas de la cola. Los estudios previos han demostrado que el 80% a 90% de los hepatocitos se transducen con esta dosis de adenovirus (Q. Li, M. A. Kay, M. Finegold, L. D. Stratford-Perricaudet, S. L. C. Woo (1993) Human Gene Therapy 4, 403).

muCTLA4Ig murino o L6 (placebo) se diluyeron en salino fisiológico libre de pirógenos y se administraron 200 a 400 \muL mediante inyección IP. Las muestras de sangre se obtuvieron mediante técnica retroorbitaria. Los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical.

La construcción, producción y purificación del vector Ad5 deficiente E1 recombinante (Ad/RSVhAAT) fue como se describe (Kay y col. Hepatology 21:815-819 (1995)). Se usó una sola preparación de virus recombinante para los controles L6 y los animales de experimentación muCTLA4Ig. Se encontró que todas las preparaciones virales fueron negativas para la presencia de contaminación por el virus salvaje como se describe (D. Barr y col. (1995) Gene Therapy 2:151-155).

Se infundió a los ratones C3H/HeJ Ad/RSVhAAT un adenovirus que se dirige a la expresión de la alfa-1-antitripsina humana, en los hepatocitos transducidos y tratados con muCTLA4Ig o L6 (un anticuerpo monoclonal de
control).

La persistencia de la expresión génica en los animales se determinó mediante cuantificación sérica periódica de alfa-1-antitripsina humana (hAAT).

En la figura 1, se infundió a dieciséis hembras de ratones C3H/HeJ de 6 a 8 semanas de edad 5 x 10^{9} pfu de adenovirus Ad/7RSVhAAT por las venas de la cola en el día 0. En las tablas A y C, los animales recibieron 200 \mug de CTLA4Ig murino (IP) en el día 2 (n=4, círculos llenos) o los días 0, 2, 10 (n=4, círculos vacíos). Los animales control recibieron cantidades equivalentes de un anticuerpo de control (L6) en el día 2 (n=4) (cuadrados llenos) o los días 0, 2, 10 (cuadrados vacíos) (n=4).

Las tablas B y D de la figura 1 fueron experimentos repetidos. Se infundió a diez ratones adenovirus Ad/RSVhAAT en el día 0. Los animales recibieron CTLA4Ig soluble (n=5, círculos vacíos) o L6 (n=5, cuadrados vacíos) en los días 0, 2, 10. Las muestras séricas periódicas se analizaron para (A) hAAT, (B) hAAT (Kay y cols. 1995, supra) o (C) CTLA4Ig, (D) CTLA4Ig mediante ELISA. Cada línea representa un animal. Los ensayos con ELISA se realizaron al menos por duplicado para cada medida.

Las concentraciones séricas de CTLA4Ig murino se realizaron mediante ensayo con ELISA. Se recubrieron placas de 96 pozos Immulon-2 con B7-1-Ig humana (50 ng en 50 \muL de tampón bicarbonato pH 9,6). En los pozos lavados y recubiertos se pusieron muestras de suero diluido o muCTLA4Ig estándar diluida. Después de la unión y el lavado, se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora 50 \muL (dilución 1/5000) de peroxidasa de rábano marcada con IgG2a anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Después del lavado, la peroxidasa de rábano se detectó usando 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (Sigma). La reacción se detuvo usando 50 \muL de ácido sulfúrico 1N. La absorbancia a 450 nm (referencia 630 nm) se realizó usando un lector de placa de microtítulo (Biorad) y las concentraciones se determinaron usando regresión lineal de la curva estándar. La sensibilidad fue de
0,1 ng/mL.

La figura 2 proporciona los resultados de un ensayo sobre proliferación esplénica en los días 4 (figura 2 tabla A), 11 (figura 2 tabla B) o 18 (figura 2 tabla C) después de la administración de Ad/RSVhAAT, los esplenocitos se aislaron mediante lisis hipotónica y se cultivaron como se describe en placas de 96 pozos de fondo plano (D. B. Lewis y col. (1991) J. Exp. Med. 173, 89).

En las figuras 2A-C, se incubaron células en concentración de 3 x 10^{6}/mL con concentraciones variables de Ad/RSVhAAT inactivado con UV como se indica. Los sobrenadantes se recogieron a las 72 horas para que los ensayos con linfoquinas o las células se sometieran a pulsos con timidina-^{3}H y se recogieran 24 horas después para la determinación de la proliferación.

Los ensayos con linfoquinas incluyen la determinación de interferón-g murino mediante ELISA usando los anticuerpos monoclonales R46A2 y XMG1.2 como agentes de captura y detección respectivamente. La IL-4 murina se determinó mediante ELISA usando pares de anticuerpos monoclonales de Pharmingen. Los IFN-\gamma e IL-4 murinos se usaron como estándares en cada ensayo.

En la figura 3, se infundió a los animales 5 x 10^{9} pfu de Ad/RSVhAAT en el día 0. Los animales se trataron con L6 (tablas b y e) o muCTLA4Ig (tablas c y f) en los días 0, 2, 10. El hígado de los animales normales se procesó de forma paralela (tablas a y d). Las secciones de hígado congelado de los animales sacrificados en el día 18 se incubaron con anticuerpos anti-CD3 (tablas a-c), o anti-CD8 (tablas d-f). La tinción se hizo con conjugados de peroxidasa de rábano con anticuerpos anti-hamster (tablas a-c) o anti-rata (tablas d-f) de cabra. La ampliación es 50x.

La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo sobre tejidos hepáticos que se congelaron en OCT y se seccionaron. Se usaron los siguientes anticuerpos: CD3-biotina (1452C11, Pharmingen, San Diego, CA), CD4 (GK1.5, American Type Culture Collection (ATCC)), CD8 (53-6.7 ATCC), NK (anti-asialoGM1 de conejo. Dako), anti-biotina-clase I (anti-H2K^{k}, 11-4.1 Pharmingen), anti-biotina-clase II (anti-I-E^{k} 14.4-45, ATCC). Los anticuerpos biotinados se detectaron con conjugados de peroxidasa de rábano y estreptavidina de forma apropiada. Los anticuerpos de rata o conejo encontrados irrelevantes se usaron como controles para tinciones no específicas. El sistema de puntuación para la inflamación portal se basó en el descrito por R. G. Knodell y col., (1981) Hepatology 1, 431.

Se usaron como controles ocho animales normales y puntuaron como 0. Los grupos experimentales se puntuaron basados en la tinción relativa que usa una escala de 0 a 4 en relación a los animales normales similar al sistema de puntuación usado por otros para graduar la inflamación portal (Yang y col. (1994) Immunity, supra). Se muestra en una lista la media de las dos puntuaciones para cada sección hepática.

Dos ratones, #14 y #23 tenían menos de 50 ng/mL de hAAT sérica debido probablemente a una infusión inadecuada de virus Ad/RSVhAAT. Los números entre paréntesis representan la media sin los animales 14 y 23 (NA = no disponible). Los animales usados son los mostrados en la figura 2 y descritos en la presente memoria descriptiva.

La expresión génica fue muy extensa en los animales que recibieron CTLA4Ig comparado con los controles (figuras 1A-D). Todos los animales de control L6 (n=8) tenían una disminución mayor de 100 veces de la concentración de hAAT sérica entre 2 y 7 semanas (figura 1A) después de la administración de adenovirus a valores que no estaban en los antecedentes anteriores; estos datos son similares a los vistos en estudios previos (D. Barr, supra). Todos los animales tratados con muCTLA4Ig mantuvieron altos niveles de expresión de hAAT durante al menos 14 semanas (n=8), y 6 de 8 ratones expresaron altos niveles de hAAT durante >5 meses, duración del experimento (figura 1A). No hubo diferencias en la persistencia de hAAT en los ratones a los que dio 1 ó 3 dosis de 200 mg de muCTLA4Ig.

Una segunda serie de experimentos presentada en la figura 1B dieron resultados similares. De forma llamativa, el periodo de expresión génica mediada por adenovirus fue similar al visto en estudios previos en ratones scid C3H Congenic que carecen de inmunidad específica de antígeno (D. Barr, supra), y a la expresión de beta-galactosidasa transducida de adenovirus observada en ratones desnudos deficientes en células T (Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; J. F. Englehardt, X. Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6196).

La expresión génica a largo plazo mediada por adenovirus no fue el resultado de inmunosupresión persistente. La concentración sérica de muCTLA4Ig cae dramáticamente de 100 \mug/mL a menos de 10 ng/mL pasado un periodo de 40 a 70 días (figuras 1C y D). La inmunosupresión con éxito mediante CTLA4Ig se asocia con concentraciones séricas mayores de 1 \mug/mL.

Los animales tratados con muCTLA4Ig fueron capaces de generar una respuesta inmune frente a un antígeno diferente. Para determinar esto, los animales tratados con muCTLA4Ig y L6 se expusieron a un neo antígeno, el bacteriófago \phiX174, 10 semanas después de la infusión de adenovirus inicial (S. Nonoyama, F. O. Smith, I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Immunol. 150, 3817).

El bacteriófago \phiX174 creció, se recogió y purificó como se indica en Nonoyama y col. supra. Se infundieron 2,5 x 10^{8} pfu en 200 \muL IV 10 y 14 semanas después de la transducción del adenovirus. Los títulos de anticuerpos neutralizantes del fago se determinaron semanalmente durante un total de 8 semanas después de la primera infusión del fago como se describe. Los títulos se expresaron como Kv o velocidad de inactivación del fago pasado un tiempo. En los ratones tratados con muCTLA4Ig y L6, la Kv media dos semanas después de la primera fue de 2,2 (intervalo 2,0 a 14) y 3,9 (intervalo 1,5 a 33), respectivamente. Dos semanas después de la segunda infusión del fago la Kv media para los animales tratados con muCTLA4Ig fue de 49 (intervalo 3,6 a 1043) y para los animales tratados con L6 fue de 98 (intervalo 15-1469). En este punto el porcentaje de anticuerpos IgG varió entre el 70% y el 100% en los ratones tratados con muCTLA4Ig y del 50% a 100% en los animales tratados con L6.

Se requieren células T para la producción eficiente de anticuerpos que incluye la amplificación y el cambio del isotipo IgM al IgG en respuesta al bacteriófago \phiX174 (S. Nonoyama y col. (1993) J. Exp. Med. 178, 1097). Ya que las respuestas de células B dependientes de células T se bloquean mediante CTLA4Ig proporcionan una medida sensible de la muCTLA4Ig residual (B. K. Finck, P. S. Linsley, y D. Wofsy (1994) Science 265, 1225; P. S. Linsley y J. A. Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11, 191).

Todos los animales tratados con muCTLA4Ig y L6 produjeron cantidades normales de anticuerpos neutralizantes IgM e IgG en respuesta a la inmunización primaria y secundaria del bacteriófago \phi174 indicando la ausencia de muCTLA4Ig activa biológicamente (S. Nonoyama, F. O Smith, I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Immunol. 150, 3817).

La persistencia a largo plazo de la expresión génica de hAAT de los animales tratados con muCTLA4Ig sugirió que la inhibición de la activación co-estimuladora de las células T era responsable de la inhibición de la inmunidad celular dirigida contra los antígenos virales. Para determinar si el reconocimiento inmunológico de las células T de los antígenos del adenovirus se inhibía con la terapia CTLA4Ig, se realizaron ensayos de proliferación de células esplénicas en animales transducidos con Ad/RSVhAAT y tratados con muCTLA4Ig o L6.

11 ó 18 días después de la infusión de adenovirus, los ratones se sacrificaron y los esplenocitos aislados se estimularon con concentraciones variables de Ad/RSVhAAT. La proliferación celular mediante células T preparadas con adenovirus se ensayó mediante la incorporación de timidina-^{3}H a las 72 horas (figura 2). En el día 4 hubo una mínima incorporación de timidina-^{3}H en cada grupo.

En los días 11 y 18, se detectó proliferación de esplenocitos inducida por antígenos dependiente de dosis en los controles tratados con L6, pero estaba ausente o marcadamente reducida en los animales tratados con CTLA4Ig (figuras 2B y C). Las respuestas en los ratones tratados con muCTLA4Ig fueron similares a las observadas en los animales simples que no recibieron adenovirus.

La disminución de la respuesta en los ratones tratados con muCTLAIg fue específica, ya que la proliferación en respuesta a la estimulación con anti-CD3 fue similar en los tratados con muCTLA4Ig, los tratados con L6 y los ratones de control simples.

Yang y col. encontraron que la respuesta inmune a los hepatocitos transducidos con vectores adenovirus tenía las características de una respuesta de linfoquinas tipo 1 o TH1, en la que se producía interferón-\gamma e IL-2 pero no IL-4 por los esplenocitos estimulados por antígenos (Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433). Los datos preliminares son coherentes con que el interferón-\gamma se indujo (>20 ng/mL) en los cultivos estimulados con Ad/RSVhAAT de 5 de 9 ratones tratados con L6, mientras que no se detectó IL-4 (<50 pg/mL). Ni el interferón-\gamma ni IL-4 se indujeron en los cultivos estimulados por antígenos de los ratones muCTLA4Ig o los ratones de control simples.

De forma coherente con los resultados de los ensayos in vitro, la respuesta de células T a los hepatocitos transducidos con adenovirus se atenuó marcadamente in vivo. En ensayos realizados de forma paralela a los estudios de proliferación de linfocitos, se examinaron las secciones hepáticas de los animales de control normales y de los ratones que recibieron Ad/RSVhAAT 4, 11 y 18 días antes.

Para determinar la naturaleza del infiltrado celular, las secciones se hicieron reaccionar con un anticuerpo monoclonal frente a CD3, que detecta todas las células T, con anticuerpos monoclonales frente a las subpoblaciones de células T CD4 y CD8, y MHC clase I y clase II, y con un antisuero policlonal frente a células NK.

Las secciones que reaccionaron con anticuerpos frente a CD3 y CD8 representativas se muestran en la figura 3 y todos los resultados se resumen en la tabla 1. Hubo un infiltrado pequeño o no celular en cada uno de los grupos después de 4 días. Sin embargo, después de 11 y 18 días hubo un infiltrado importante (principalmente periportal) de células T en los animales con L6 pero pequeño o no infiltrado en los ratones que recibieron muCTLA4Ig.

Las células T fueron predominantemente de la subpoblación CD8. La inducción de la expresión del MHC clase II también disminuyó en el grupo tratado con muCTLA4Ig en relación con el grupo tratado con L6, pero los resultados fueron más variables que para los marcadores de células T. Hubo una pequeña infiltración de células NK en cada grupo. Los animales que se transdujeron con adenovirus tuvieron incrementada la tinción hepatocelular para MHC clase I sin tener en cuenta si recibieron CTLA4Ig o L6.

Mientras que se piensa que la inmunidad celular limita la duración de la expresión génica transducida por adenovirus, se piensa que la inmunidad humoral, mediada por anticuerpos, limita la transducción de adenovirus secundaria (Y. Yang y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407; Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; T. G. Smith y col. (1993) Nature Genetics 5, 397; Barr y cols. supra).

Cuando la producción de anticuerpos se determinó en los ratones mostrados en la figura 1A, se encontró que muCTLA4Ig dificultaba marcadamente pero no suprimía la producción de anticuerpos frente al vector adenovirus.

Como se muestra en la tabla 2, todos los animales tratados con L6 desarrollaron anticuerpos neutralizantes frente al adenovirus durante 4 semanas después de la infusión, mientras que la respuesta se retrasó y atenuó en los ratones tratados con muCTLA4Ig. Sin embargo, 2 de los ratones tratados con CTLA4Ig desarrollaron títulos neutralizantes mayores o iguales a 16 durante 10 semanas después de la infusión y sólo dos de los ratones no desarrollaron ningún anticuerpo neutralizante detectable.

Los anticuerpos neutralizantes y específicos de isotipo dirigidos contra los adenovirus se determinaron de los ratones estudiados en las figuras 1A y C. Los anticuerpos neutralizantes y los títulos de IgG2a se muestran en la lista como el título recíproco (1/x) mediana. El intervalo para cada grupo se da entre paréntesis (nd = no determinado).

Las medidas de los títulos de anticuerpos neutralizantes se modificaron de (D. Barr, supra). Brevemente, se colocaron 5 x 10^{4} células 293 en placas de 96 pozos. Las muestras de suero se inactivaron con calor a 55ºC durante 40 minutos y se mezclaron diluciones (cuatro veces) de 100 \muL de suero (la menor dilución fue 1/16) en DMEM/suero bovino fetal 1% con 10 \muL de Ad.RSV\betagal (3 x 10^{5} pfu) durante 1 hora a 37ºC. La mezcla se extendió sobre las células 293 durante 60 minutos antes de sustituir la mezcla del virus por medio fresco. Las células se tiñeron con \beta-gal 16 a 24 horas después y el título se definió como la dilución que inhibe el 75% de la tinción de las células 293. Según este criterio, todos los controles L6 que recibieron adenovirus tenían títulos neutralizantes mayores o iguales a 1/32, mientras que sólo dos de los ratones muCTLA4Ig tenían títulos que eran iguales o mayores de 1/16. El suero de dos animales tratados con muCTLA4Ig no tenía inhibición de la tinción \betagal a una dilución de suero de 1/16, indicando la presencia de bajos títulos de anticuerpos neutralizantes de adenovirus. Los anticuerpos IgM, IgG1 e IgG2 se determinaron recubriendo los pozos de las placas de microtítulo (Dynatech Immunolon) con la cantidad óptima (50 ng/pozo) de Ad/RSVhAAT inactivado con UV en tampón carbonato (pH 9,6). Después de cerrarse las placas se incubaron de forma secuencial con muestras de suero (diluidas de 1:100 a 1:6400 para IgG1 e IgG2a, diluidas de 1:100 a 1:800 para IgM), después se detectaron con anticuerpos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano frente a IgG1, IgG2a (Southern Biotechnology) o IgM (Tago) de ratón. Se definió el título como la dilución más baja que rinde una densidad óptica >0,100 (IgG1 e IgG2a) o >0,050 (IgM) por encima de la obtenida con suero del control normal.

Virtualmente todos los anticuerpos específicos del virus detectados mediante ELISA específico de serotipo a las 6 y 10 semanas fueron del isotipo IgG2a. Cada uno de los 8 ratones tratados con L6 desarrolló títulos altos de anticuerpos IgG2a. La respuesta IgG2a disminuyó marcadamente en los ratones tratados con muCTLA4Ig, aunque 6 de 8 finalmente desarrollaron títulos de anticuerpos detectables de \geq100. Un ratón tratado con L6 tenía anticuerpos medibles del isotipo IgG1 (1:400) y un ratón tratado con muCTLA4Ig tenía anticuerpos IgM medibles (1:400) detectados en las muestras de las semanas 6 y 10. El predominio del isotipo IgG2a es coherente con la respuesta de linfoquinas tipo I o TH1 de las células T, ya que las células T producen interferón-\gamma, que favorece la producción de este isotipo mientras inhibe la producción de IgG1, mientras que la IL-4 producida por las células T tipo II o TH2 tienen el efecto contrario (W. A. Paul y W. E. Seder (1994) Cell 76, 241; L. Nguyen, D. M. Knipe y R. W. Finberg (1994) J. Immunol. 152, 478); estos resultados son coherentes con los resultados de linfoquinas presentados anteriormente.

La preponderancia de anticuerpos IgG2a en ambos grupos de ratones, aunque en cantidades muy reducidas en el grupo tratado con muCTLA4Ig, sugiere que este agente atenuó marcadamente pero no modificó la naturaleza de la respuesta inmune que desarrolló.

Para determinar si los bajos niveles de anticuerpos en los ratones tratados con muCTLA4Ig eran suficientes para dificultar la expresión génica con un vector adenovirus secundario, se llevó a cabo otro experimento similar a los mostrados en la figura 1. Nueve semanas después de la primera administración de Ad/RSVhAAT (cuando muCTLA4Ig ya no era detectable), los animales recibieron una infusión de Ad.RSVcFIX que expresa el factor IX canino (M. A. Kay, y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,2353), con o sin segundo tratamiento con muCTLA4Ig.

Ninguno de los ratones expresó factor IX canino. Esto refleja con mayor probabilidad la neutralización del vector adenovirus mediante bajos niveles de anticuerpos presentes en los ratones tratados con muCTLA4Ig, a pesar de continuar la expresión del producto del gen inicial, hAAT.

Los resultados de este estudio indican que la administración de muCTLA4Ig durante un breve periodo cercano al tiempo de la administración del vector sistémica conduce a una expresión génica mediada por adenovirus persistente. La inmunosupresión transitoria mediante muCTLA4Ig atenuó marcadamente la infiltración de células T en el hígado, el principal órgano diana, in vivo y las respuestas de células T inducidas por antígenos ensayadas in vitro. Es probable que estos efectos sobre la reactividad de estén relacionados causalmente con la persistencia a largo plazo de hepatocitos transducidos con adenovirus, en contraste con el aclaramiento mediado por inmunidad observado en los controles.

Este es el primer informe del aumento sustancial y terapéutico de la expresión génica mediada por adenovirus in vivo. Estos resultados contrastan marcadamente con el mínimo aumento de la expresión génica mediada por adenovirus del hígado lograda con la administración diaria continua de ciclosporina A (j. F. Englehardt, X. Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6196).

Los resultados más estrechamente relacionados fueron los logrados con un defecto genético persistente en la función de las células T o de las células T y B debido a las mutaciones nude, scid o RAG2 (Yang y cols. (1994) PNAS; Yang y cols. (1994) Immunity; Barr y cols., supra), que como los ratones tratados con muCTLA4Ig, continuaron expresando el gen transducido durante >5 a 6 meses, la duración de los periodos de observación. De forma llamativa, la naturaleza transitoria de la inmunosupresión inducida por muCTLA4Ig requerida para lograr la expresión génica mediada por adenovirus a largo plazo contrasta con la inmunosupresión continua proporcionada por estos defectos genéticos y sugiere que la expresión génica persistente se puede lograr sin la inmunosupresión a largo plazo y los efectos adversos resultantes. A pesar de la inhibición suficiente que conduce a la expresión a largo plazo del gen transducido, no fue posible la transducción génica secundaria.

Esto refleja probablemente la neutralización eficiente del vector secundario mediante niveles bajos de anticuerpos neutralizantes circulantes residuales. Otras terapias de base inmunológica, posiblemente en combinación con vectores adenovirus menos antigénicos (Englehardt y col., supra) pueden ser necesarias para el desarrollo de tolerancia antigénica verdadera que permitirá la introducción sistémica repetida de adenovirus.

El hígado es un tejido quiescente bajo condiciones normales y no es posible predecir con exactitud cuánto tiempo persistirá el genoma del adenovirus no integrado no cromosómico en los hepatocitos en ausencia de la destrucción inmune. Los estudios que comparan la persistencia de la expresión génica mediada por adenovirus en animales inmunodeficientes con animales inmunocompetentes que se someten a inmunoterapias como la descrita aquí serán de utilidad en la determinación de las limitaciones impuestas por el sistema inmune sobre la duración de la expresión génica comparadas con los mecanismos no inmunes de recambio del genoma. Los resultados del estudio son un avance importante hacia el uso de adenovirus para la expresión génica a largo plazo in vivo y serán útiles para el desarrollo de futuros ensayos clínicos de terapia génica.

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Ejemplo 2 Preparación de los adenovirus CTLA4Ig

Los constructores Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA y Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA se prepararon mediante clonación direccional del gen purificado HindIII/XbaI humano y fragmentos CTLA4Ig murinos en los sitios HindIII/XbaI entre el promotor de RSV (virus LTR del sarcoma de Rous) y BPA (señal de poliadenilación bovina) del plásmido de adenovirus de extremo izquierdo Ad/RSV-BPA (derivado de PXCJL.1). Cada uno de estos dos plásmidos de adenovirus de extremo izquierdo se co-transfectaron después con el plásmido de adenovirus de extremo derecho pBHG10 usando un protocolo de transfección de fosfato de calcio estándar, y el adenovirus recombinante se recuperó después de 14-18 días. El adenovirus después se purificó en placas, y los clones para cada uno en los que se encontró mediante ensayos con ELISA que expresan la proteína CTLA4Ig humana y murina, se ampliaron y purificaron sobre dos gradientes de cloruro de cesio.

La HAAT (proteína alfa-1-antitripsina humana) Bicistronic/vectores de extremo izquierdo CTLA4Ig se prepararon mediante la clonación de la polimerasa ADN T4 purificada y fragmentos de CTLA4Ig humana y murina HindIII/XbaI en el único sitio pequeño entre la secuencia ligadora de ribosomas internos del poliovirus (POLIO) y BPA en el plásmido pKS que contiene RSV-HAAT-POLIO(SMAI)-BPA. Los recombinantes en los que se encontró que contienen los fragmentos CTLA4 en la orientación apropiada se digirieron con XhoI y el fragmento purificado RSV-HAAT-BPA-CTLA4Ig-BPA se clonó en el sitio único XhoI del plásmido de adenovirus de extremo izquierdo pXCJL.1 (la misma columna vertebral que el plásmido de extremo izquierdo Ad/RSV). Los virus recombinantes se están recuperando actualmente como se describe anteriormente.

4 x 10^{9} pfu del adenovirus recombinante Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA se han inyectado en las venas de la cola de tres ratones C3H y se produjeron niveles séricos máximos de 2369, 2168, y 1762 ng/mL de plasma 3 semanas después de la inyección. Los adenovirus Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA se han inyectado en varios ratones C3H y se han evaluado los niveles plasmáticos de CTLA4Ig(hu).

Ejemplo 3

La inmunidad humoral dirigida contra el vector adenovirus se debilita pero no se elimina con la administración de CTLA4Ig. Por lo tanto, se usa CTLA4Ig con ligando anti-CD40 (MR1) para prolongar la expresión génica y permitir la transferencia génica secundaria.

Los animales recibieron adenovirus (5 x 10^{9} pfu deAd/RSV-hAAT) en el día 0, CTLA4Ig (200 \mug) en los días 0, 2, 10 y MR1 (250 \mug) en los días 0, 2, 4, y 6. L6 (placebo) se diluyó en salino fisiológico libre de pirógenos y se administro en 200-400 \muL mediante IP.

Todos los animales tienen expresión génica persistente. Todos los controles tuvieron expresión génica 0 durante 2-6 semanas. La mitad de los animales no tuvieron anticuerpos neutralizantes detectables. De forma similar, la mitad de los animales podrían transducirse una segunda vez con un vector adenovirus recombinante (Ad.RSV-cFIX). Por lo tanto, la terapia combinada MR1/CTLA4Ig tiene el potencial de prolongar la expresión génica y permitir una transferencia génica secundaria. Esto último es el resultado de bloquear la inmunidad humoral.

La tabla 3 proporciona los datos que demuestran que al menos en la mitad de los animales se es capaz de dar una segunda dosis de virus y tener una transferencia génica de adenovirus con éxito.

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TABLA 3

100

Claims (24)

1. El uso de una molécula CTLA4 soluble y una molécula que reconoce y se une al ligando CD40 (ligando anti-CD40) para la preparación de una combinación terapéutica para el tratamiento de sujetos que se han sometido, se están sometiendo o se someterán a terapia génica, en el que la terapia génica se mejora mediante la prolongación de la expresión del gen de interés.

2. El uso de células puestas en contacto con moléculas CTLA4 solubles y una molécula que reconoce y se une al ligando CD40 (ligando anti-CD40) para la preparación de una combinación terapéutica para el tratamiento de sujetos que se han sometido, se están sometiendo o se someterán a terapia génica, en el que las células (a) incluyen una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) son capaces de expresar el gen de interés y en el que la terapia génica se mejora mediante la prolongación de la expresión del gen de interés.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la terapia génica comprende la transferencia del gen de interés a y la expresión del gen de interés en un sujeto.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la terapia génica se usa para tratar a un sujeto que padece células defectuosas, enfermas o dañadas.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la terapia génica se usa para tratar la fibrosis quística, la hemofilia, la hipercolesterolemia familiar, el cáncer, el SIDA, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, o las enfermedades infecciosas.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula CTLA4 soluble es capaz de unirse al antígeno B7.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que la molécula de CTLA4 soluble comprende el dominio extracelular de CTLA4.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula CTLA4 soluble se une a una secuencia proteica no CTLA4.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que la secuencia proteica no CTLA4 es una porción de una molécula de inmunoglobulina.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula CTLA4 soluble es CTLA4Ig.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula que reconoce y se une al ligando CD40 (ligando anti-CD40) es un anticuerpo monoclonal.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que la molécula que reconoce y se une al ligando CD40 (ligando anti-CD40) es MR1.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que la célula es una célula animal.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que la célula animal es una célula humana.

15. El uso de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que la célula es una célula conectiva, una célula del tejido conectivo fibroso, una célula sanguínea, una célula muscular, o una célula nerviosa.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que la célula sanguínea es una célula sanguínea roja o una célula sanguínea blanca.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en el que el gen de interés se inserta en un vector recombinante.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que el vector recombinante es un vector viral.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que el vector viral es un vector retrovirus, un vector adenovirus, un vector virus vaccinia, un vector virus herpes, o un vector virus de la rabia.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que el vector adenovirus es Ad/RSVCTLA4Ig(mu)-BPA o Ad/
RSVCTLA4Ig(hu)-BPA.

21. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el gen de interés codifica para una proteína.

22. El uso de la reivindicación 21, en el que la proteína es una citoquina.

23. El uso de la reivindicación 22, en el que la proteína se selecciona del grupo constituido por PDGF, EGF, FGF, IGF, TGF, IL, INF y TNF.

24. Un procedimiento in vitro para prolongar la expresión de un gen de interés por una célula, en el que la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar el gen de interés, comprendiendo el procedimiento la puesta en contacto de la célula con una molécula CTLA4 soluble y una molécula que reconoce y se une al ligando CD40 (ligando anti-CD40).