JPH11510685A

JPH11510685A - 可溶性ｃｔｌａ４分子を用いる関心とする遺伝子の発現を延長する方法

Info

Publication number: JPH11510685A
Application number: JP9501407A
Authority: JP
Inventors: エスリンスリー、ピーター; エイケイ、マーク; ビーウィルソン、クリストファー; レドベター、ジュフリー; エイアルッフォ、アレハンドロ; エルホレンバウ、ダイアン
Original assignee: ザユニバーシティオブワシントン; ブリストル−マイヤーズスクイッブカンパニー
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-09-21
Also published as: MX9709459A; CA2223412C; WO1996039514A1; DE69634297D1; EP0832227A1; DE69634297T2; EP0832227B9; EP0832227B1; ES2236735T4; ES2236735T3; ATE288487T1; CA2223412A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞による関心とする遺伝子の発現を高める方法を提供し、その細胞は（ａ）関心とする遺伝子をコード化する組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）関心とする遺伝子を発現することができ、前記方法は、前記細胞と前記細胞による関心とする遺伝子の発現を高めるのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４分子とを接触させる工程を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性ＣＴＬＡ４分子を用いる関心とする遺伝子の発現を延長する方法遺伝子治療は、現在特別の治療法のない多くの疾病の治療に非常に有望である（フリードマン（Friedmann T.）、ヒト遺伝子治療の進歩、Science １９８９；２４４：１２７５；ベルマ（Verma IM．）遺伝子治療、Sci.Am １９９０；２６３：６８；ミラー（Miller AD.）、ヒト遺伝子治療の進歩、Blood １９９０；７６：２７１；カールソン（Karson,EM.）、遺伝子治療の展望、Biol Reprod １９９０；４２：３９）。例えばヒトの癌は異常な遺伝子発現または特定の遺伝子における突然変異と関連することが多く、そして新生物（腫瘍）のプロセスは遺伝子治療によって変えることができる。或いは遺伝子治療によって変えられた腫瘍細胞は、毒性遺伝子の挿入、または腫瘍細胞を化学療法剤に対して感受性にする遺伝子の挿入によって、破壊できるかも知れない。新生物細胞を不活性化するその他のアプローチは、アンチセンス癌遺伝子を腫瘍細胞に挿入することである。これらの遺伝子は癌遺伝子に対して逆方向に翻訳される。塩基配列は相補的であるから、ｍＲＮＡはハイブリッド化し；癌遺伝子活性はなくなるが、なぜならばその遺伝子は翻訳されないからである（フリードマン、ヒト遺伝子治療の進歩、Science １９８９；２４４：１２７５）。骨髄は遺伝子治療に適した標的部位であり、なぜならばそれは i n vitro で容易にアクセスし操作することができ、変化した遺伝子型を永続させる幹細胞を含むからである。肝および中枢神経系も遺伝子治療のための可能性のある標的である（ミラー、ヒト遺伝子治療の進歩、Blood １９９０；７６：２７１）。遺伝子治療の主な目的は、付加的遺伝子要素を生体細胞に導入し、または生体細胞のＤＮＡにおいて欠失しているかまたは機能不全の分子要素を置換して、ヒトに病気をおこす生体細胞内の変化を標的とし、修復することである（カルバー（Culver）ら、マウスおよびヒトにおける遺伝子治療のための細胞ビークルとしてのリンパ球、PNAS USA、８８：３１５５（１９９１））。治療しようとする病気に依って、遺伝子治療の３つの戦略が採用される。異機能遺伝子は置換され、変えられて、機能的になり、または細胞内の異なる座で働く健康遺伝子で増強される。これらのオプションのうちで、遺伝子増強治療が現在最も有望である。遺伝子増強の一例は、重症複合免疫不全症患者からの細胞に機能性アデノシンデアミナーゼ遺伝子を付加するものである（フリードマン、ヒト遺伝子治療の進歩、Science １９８９；２４４：１２７５；ベルマ、遺伝子治療、Sci.Am １９９０；２６３；６８；ミラー、ヒト遺伝子治療の進歩、Blood、１９９０；７６：２７１；カールソン、遺伝子治療の展望、Biol Reprod １９９０；４２：３９）。遺伝子治療に必要なことは、その疾病の欠損を理解し、正常な機能性遺伝子をクローン化し、特徴づけることである。遺伝子はいくつかの方法で挿入される。遺伝子治療は、培養細胞に遺伝子を伝達し、その後その培養細胞を対象に移植するか（ex vivo アプローチ）、または遺伝子を直接対象に供給し、生体内で細胞に遺伝子を伝達する（in vivo アプローチ）ことを含むことができる。 In vivo および ex vivo どちらの方法でも、ウィルスベクターが関心とする遺伝子のデリバリービークルとして用いられる。ウィルスゲノムを変化させ、無毒性ではあるが、特定の細胞型には感染できるようにする。レトロウィルスベクターの利点は、挿入されたＤＮＡがホスト染色体に効率的に組み込まれることである。機能性置換遺伝子は、ウィルスゲノムが適切な組織に入った後にその遺伝子が発現できるような、ウィルスゲノム内の位置に挿入される。そのウィルスをその後患者または標的細胞に投与し、所望の機能性表現型に転換させる。レトロウィルスベクターの欠点は、効率的遺伝子伝達のためには細胞を複製しなければならないことである。対照的に、アデノウィルスベクターは細胞複製の必要はないが、挿入されたＤＮＡがホスト染色体に組み込まれない。これらの、アデノウィルスを含む組換えウィルスベクターは、遺伝子を効率的に体組織に伝達するが、遺伝子発現の急速な喪失をおこし、かつ二次的伝達を阻止する免疫学的要因のために、臨床的遺伝子治療への使用は制限される。すなわち、形質導入された細胞に向かって細胞免疫反応が起きるため、遺伝子発現は一過性で、通常、数週間しか続かない（ヤング（Y.Young）ら（１９９４）、Proc. Natl.Acad.Sci.,USA ９１、４４０７；ヤング、エルトル（H.C.J.Ertl）、ウィルソン（J.M.Wilson）（１９９４）、Immunity １、４３３）。この制限は、遺伝子発現を延長する可溶性ＣＴＬＡ４分子の使用によって回避される。ＣＴＬＡ４は、通常、Ｔ細胞に見いだされる細胞表面抗原である。ＣＴＬＡ４はＢ細胞活性化抗原Ｂ７に結合する。可溶性ＣＴＬＡ４分子、すなわちＣＴＬＡ４IgはＴおよびＢ細胞間の相互作用に依存する免疫反応を阻害することが判明している（リンスレイ（Linsley）ら、J.Exp.Med. １７３：７２１− ７３０ページ（１９９１））。免疫治療における可溶性ＣＴＬＡ４分子の使用は、組換えウィルスベクターがヒト遺伝子治療に有用となる可能性を著しく高める。発明の概要本発明は細胞による関心とする遺伝子の発現を延長する方法に関する。この方法において、細胞は、関心とする遺伝子をコード化する組換え核酸塩基配列を含み、関心とする遺伝子を発現することができる。この方法は、その細胞と、その細胞による関心とする遺伝子の発現を延長するのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４分子との接触工程を提供する。別法において、その細胞が対象に存在する場合は、この方法はその対象に、細胞による関心とする遺伝子の発現を延長するのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４分子を投与することを含む。本発明は疾病にかかった対象を治療する方法をも提供する。この方法によると、その対象の少なくとも１つの細胞は（ａ）関心とする遺伝子のための組換え核酸塩基配列を含み、かつ（ｂ）その疾病、またはその疾病に関連する症状を阻害することができる関心とする遺伝子によってコード化されたタンパク質を発現することができる。この方法は、その対象による関心とする遺伝子の発現の量または持続期間を高めるのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４をその対象に投与することを含んでなる。図面の簡単な説明図１Ａ〜Ｄは、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇを同時投与した場合のアデノウィルス仲介性遺伝子発現を示す線グラフである。各線は個々の動物をあらわす。図２Ａ〜Ｃは脾臓増殖検定の結果を示す線グラフである。図３は免疫組織化学による肝炎症性細胞を確認する写真である。発明の詳細な説明定義本明細書に用いる下記の単語または句は下記に説明する意味を有する。ここに用いる“関心とする遺伝子”とは、タンパク質または核酸配列をコード化するあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。ここに用いる“非- ＣＴＬＡ４タンパク質配列”とは、Ｂ７に結合せず、ＣＴＬＡ４のそのＢ７抗原標的への結合を妨害しない分子を意味する。ここに用いる“ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン”とは、Ｂ７抗原を認識し、結合する、ＣＴＬＡ４の部分である。例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、リンスレイら、J.Exp.Med. １７３：７２１−７３０（１９９１）；リンスレイら、 “可溶性型ＣＴＬＡ４細胞活性化分子による in vivo 免疫抑制”、Science（１９９２）２５７（５０７１）７９２−７９５、に説明されている。ここに用いる“可溶性ＣＴＬＡ４”とはＢ７に結合できる循環ＣＴＬＡ４を意味する。例としてはＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、または生物学的または化学的に活性な分子に（遺伝的に、または化学的に）融合したＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、例えばＣＴＬＡ４Ig、ＣＴＬＡ４- ｅｎｖｇｐ１２０、ＣＴＬＡ４−ｐ９７、ＣＴＬＡ４−ｏｖａ、およびＣＴＬＡ４−Ｅ７などが含まれるが、これらに制限するものではない。ここに用いる“遺伝子治療”とは、遺伝子操作によって疾病を治す方法である。ここに用いる“ウィルスベクター”とは、（１）関心とする遺伝子を、それが発現されるホスト細胞に導入するために挿入することができ、かつ（２）ウィルスに由来する、担体核酸分子である。ここに記載した発明がより完全に理解されるように以下に説明する。発明の方法本発明は、有効量の可溶性ＣＴＬＡ４が、延長された（長期の）または持続的な遺伝子発現を可能にすることによって、細胞による関心とする遺伝子の発現が高められるという発見に関する。本発明の好適な実施態様において、関心とする遺伝子は、例えば組換えウィルスベクターのような組換え核酸配列の１部である。組換えウィルスベクターは本明細書に記載されている。本発明の一実施態様において、遺伝子発現の増強は、細胞と所定量の可溶性ＣＴＬＡ４分子とを接触させ、免疫反応を阻害することによって起きる。別法として、遺伝子発現の増強は、対象に所定量の可溶性ＣＴＬＡ４を投与し、免疫反応を阻害し、それによって長期の免疫抑制をおこすことなく持続的なウィルス遺伝子発現を実現することによって起きる。その他に、可溶性ＣＴＬＡ分子と抗ＣＤ４０リガンド（ＭＲＩ）との組合わせは遺伝子発現を延長し、二次的遺伝子伝達を可能にする。抗ＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０リガンドを認識して結合する分子、例えば抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、人体適応性抗体、もしくはそれらのフラグメント）、または組換え結合タンパク質、例えば融合タンパク質である。可溶性ＣＴＬＡ４分子は遺伝子治療中、遺伝子治療前または遺伝子治療後に投与することができる。さらに、可溶性ＣＴＬＡ４の投与は、その後の in vivo または ex vivo アプローチによる遺伝子の投与後でさえ有効である。可溶性ＣＴＬＡ４分子の使用は、in vivo または ex vivo アプローチによる関心とする遺伝子の二次的投与後の二次的遺伝子発現を成功させ、これは免疫反応のために不可能であるのが普通である。可溶性ＣＴＬＡ４は経口的手段、経皮的手段、静脈内手段、筋肉内手段または皮下投与によって投与することができる。或いはＣＴＬＡ４は、関心とする遺伝子とともにウィルスベクターに挿入し、同時発現させてもよい。本発明の方法は、欠陥、疾病または損傷細胞の被害を被っている対象の治療に有用である。特に、可溶性ＣＴＬＡ４の使用は疾病患者における遺伝子治療を拡大する（１９９５年３月２１日に発行された米国特許第５，３９９，３４６号）。遺伝子治療の成功の見込みは遺伝子発現の増強の結果改善され、疾病にかかっている対象は遺伝子治療前、−後および／または−最中に可溶性ＣＴＬＡ４を使用しない場合に比べてより効果的に治療される。本発明の一実施態様において、対象の少なくとも１つの細胞が、関心とする遺伝子のための組換えＤＮＡを含んでいなければならない。さらに、その細胞は、関心とするその遺伝子によってコード化されるタンパク質を発現することができ、その結果疾病またはそれに関連する症状が阻害されなければならない。本発明の実施により、対象物は動物対象、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、サカナ、トリ、ブタ、またはウシである。現在幾つかのグループが癌治療に遺伝子治療を用いている（フリードマン、ヒト遺伝子治療の進歩、Science １９８９；２４４：１２７５−１２８１；ロス（ Roth JA）、ムコパドヒエイ（Mukhopadhyay T．）、テインスキー（Tainsky MA ）ら、気道消化管癌の予防および治療のための分子的アプローチ、研究論文、Mo nogr Natl Cancer Inst １９９２；１３：１５−２１；ムコパドヒエイ、テインスキー、キャベンダー（Cavender AC）、ロス、肺癌細胞のK-ras発現および腫瘍原性のアンチセンスＲＮＡによる特異的阻害、Cancer Res １９９１；５１、１７４４−１７４８）。研究者らは、ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を担うレトロウィルス粒子を産生する細胞を脳腫瘍に直接注入するという実験的脳腫瘍の治療プロトコルを開発した（クルヴァー（Culver KW）、ラム（Ram Z）、ウォルブリッジ（ Wallbridge S）ら、実験的脳腫瘍治療のためのレトロウィルスベクター−プロデューサー細胞を用いる in vivo遺伝子伝達、国家保健機構、国立癌研究所、細胞免疫学部、ベセスダ(Bethesda)、ＭＤ、Science １９９２；２５６；１５５０− １５５２）。ＴＫ遺伝子の腫瘍細胞への取り込みは、腫瘍細胞に薬剤ガンシクロヴィル(gancyclovir)に対する感受性を与える。可溶性ＣＴＬＡ４の使用はＴＫ遺伝子の発現を高めることができる。本発明はさらに、対象の欠陥、疾病または損傷細胞を治療する方法であって、Ａｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡまたはＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４ Ig（ｈｕ）−ＢＰＡベクターを細胞に挿入し、それらの細胞が関心とする遺伝子によってコード化されるタンパク質と、可溶性ＣＴＬＡ４分子とを、中枢神経系の欠陥、疾病または損傷細胞を改善するのに十分な量産生することを含んでなる治療法を提供する。本発明はさらに、ドナー細胞を対象に移植することを含む、対象中の欠陥、疾病、または損傷細胞の治療法を提供する。本発明の実施により、ドナー細胞は遺伝的に改質される。すなわちこのようなドナー細胞にＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４ Ig（ｍｕ）−ＢＰＡまたはＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡを挿入し、このようなドナー細胞が、関心とする遺伝子によってコード化されるタンパク質と、可溶性ＣＴＬＡ４分子とを、中枢神経系の欠陥、疾病または損傷細胞を改善するのに十分な量を産生するようにする。本発明は、細胞による、関心とする遺伝子の発現を延長するための薬学的組成物をも提供する；ここでその細胞は（ａ）関心とする遺伝子のための組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）関心とする遺伝子によってコード化されたタンパク質を発現することができる。その組成物は薬学的有効量のＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４ Ig（ｍｕ）−ＢＰＡおよび許容できる担体を含む。或いは、組成物は薬学的有効量のＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡと許容できる担体とを含む。細胞関心とする遺伝子を含む細胞は、例えば上皮細胞および結合細胞など、いかなる真核細胞でもよい。上皮細胞は動物体のあらゆる表面領域にあり、血管または胃の内壁のような内面にもある。結合細胞は骨組織、軟骨組織および血液−すなわち白血球細胞と赤血球細胞の両方−を構成する細胞を含む。細胞は、関心とする遺伝子をコード化し、in vitro および in vivoで関心とする遺伝子を発現できる組換えＤＮＡを含む。細胞は動物細胞、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、サカナ、トリ、ブタまたはウシからの細胞などである。ドナー細胞はプロデューサー細胞であってもよい。さらにドナー細胞は自己細胞でも異種の（ヘテロ）細胞でもよい。異種遺伝子の細胞内導入細胞にＤＮＡまたはＲＮＡを導入するために種々の技術が使用できる。一般的に、遺伝子治療は（１）遺伝子を培養細胞に伝達し、その後その培養細胞を対象に移植するか（ex vivo アプローチ）、または（２）遺伝子を対象に直接供給し、その場で遺伝子を細胞に伝達する（in vivo アプローチ）ことを含む。例えば、関心とする遺伝子を組換えウィルスベクターとして直接細胞に挿入する。その他の挿入法も可能である。例えば ex vivo法では、例えばリン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、ＤＮＡと複合体化したポリカチオンもしくは脂質の使用、ＤＮＡの脂質小胞または赤血球ゴーストでの包囲、または細胞を高電圧電流の急速なパルスにさらす（すなわちエレクトロポレーション）などの遺伝子伝達法を用いて遺伝子を細胞に挿入することができる。また、ＤＮＡは、直接マイクロインジェクションによって、または高速タングステンマイクロプロジェクタイルの使用によって細胞に導入される。これらの技術はＤＮＡの複数のコピーをゲノムに一体化することができるが、一体化の効率は技術、異なる遺伝子、および異なる細胞型によって広範囲に変動する。最近、ウィルスベクターを用いてＤＮＡを哺乳動物細胞に導入する技術が開発された。これらの技術は、そのウィルスにさらされるすべての細胞を感染させる可能性を有する。ウィルスベクターを使用するための技術の開発において、標的細胞に安定的に挿入され、しかもその細胞を損傷しないベクターを開発することが必要であった。適したウィルスベクターは、パポバウィルス、シミアンウィルス４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、マウスおよびトリレトロウィルスを含む。ウィルスベクターは多くの細胞型に感染し得る。ベクター受容体に仲介されることによっては細胞に入らないベクターと比較して、ウィルスベクターはその効率の観点から好ましい。適したウィルスベクターの例は、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、または狂犬病ウィルスベクターがあるが、これらに制限されるものではない。選択されるウィルスベクターは下記のクリテリアに合わなければならない：１）ベクターは関心とする細胞に感染することができなければならない、そのため適切なホスト範囲を有するウィルスベクターを選択しなければならない；２）伝達された遺伝子は細胞内で或る長期間存続し、発現されなければならない；かつ３）ベクターはホストにとって安全でなければならず、そのベクターによる細胞の形質転換は最小でなければならない。レトロウィルスベクターおよびアデノウィルスは異種遺伝子を効率的に哺乳動物細胞に導入し発現する効率的で有用なかつ現在最もよく特徴づけられた手段を提供する。これらのベクターは非常に広いホストおよび細胞型範囲を有し、遺伝子を安定的、効率的に発現する。これらのベクターの安全性は多くの研究グループによって証明されている。実際、多くが臨床試験中である。疾病を治すために細胞に遺伝子伝達するために用いられるその他のウィルスベクターは、ヘルペスウィルスパポバウィルス、例えばＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマなど；エプスタイン−バー（Epstein-Barr）ウィルス（ＥＢＶ）；パピローマウィルス、例えばウシパピローマウィルスＩ型（ＢＰＶ）；ポリオウィルスならびにその他のヒトおよび動物ウィルスを含む。アデノウィルスは、それらをクローニングビークルとして魅力的にする幾つかの特性を有する（バチェティス（Bachettis）ら：精製単純ヘルペスウィルスＤＮＡによるチミジンキナーゼ欠乏ヒト細胞への遺伝子伝達、PNAS USA、１９７７、７４、１５９０；バークナー（Berkner,K.L.）：異種遺伝子の発現のためのアデノウィルスベクターの開発、Biotechniques、１９８８６：６１６；ゴーシュークドハリー（Ghosh-Choudhury G.）ら、感染性細菌性プラスミドに基づくヒトアデノウィルスクローニングベクター、Gene １９８６；５０：１６１；ハグ−アーマンド（Hag-Ahmand Y．）ら、ヘルパー−非依存性ヒトアデノウィルスベクターの開発および単純性ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子の伝達におけるその使用、J Virol １９８６；５７：２５７；ローゼンフェルド（ Rosenfeld M.）ら、組換えα₁−アンチトリプシン遺伝子の in vivo 肺上皮へのアデノウィルス仲介性伝達、Science １９９１；２５２：４３１）。例えば、アデノウィルスは細胞核において複製する中間サイズのゲノムを有する；多くの抗原型は臨床的に無害である；アデノウィルスゲノムは異種遺伝子の挿入にもかかわらず安定であるようにみえる；異種遺伝子は損失または再配列なく、維持されるように見える；そしてアデノウィルスは、数週間ないし数カ月の発現期間をもつ高レベルの一過性発現ベクターとして使用できる。包括的生化学および遺伝研究は、生存可能の、条件つき、ヘルパー非依存性ベクターを生成する天然のアデノウィルス配列の代わりに、７〜７．５kbの異種配列で置換できることを示唆している（カウフマン（Kauf man R.J.）；アデノウィルス翻訳調節のために必要な成分の確認およびｃＤＮＡ発現ベクターにおけるその使用、PNAS USA、１９８５、８２：６８９）。例えば、本発明はＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡおよびＡｄ／ＲＳＶ− ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡと呼ばれるアデノウィルスベクターを提供する。ＡＡＶは約５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さいヒトパルボウィルスである。このウィルスは組み込まれたプロウィルスとして数種のヒト細胞型で繁殖することができる。ＡＡＶベクターはヒト遺伝子治療のために幾つかの利点を有する。例えば、それらはヒト細胞にとって栄養性であるが、他の哺乳動物細胞にも感染できる；（２）ヒトまたは他の動物においてＡＡＶによる病気は起きない；（３）組み込まれたＡＡＶゲノムはそれらのホスト細胞において安定であるようにみえる；（４）ＡＡＶの組込みがホスト遺伝子またはプロモーターの発現を変えるとか、それらの再配列を促進するという証拠はない；（５）アデノウィルスのようなヘルパーウィルスの感染によって、イントロデュース遺伝子がホスト細胞から救助される。ＨＳＶ−１ベクター系は実質上すべての遺伝子の、非有糸分裂細胞への導入を容易にする（ゲラー（Geller）ら、欠陥単純ヘルペスウィルスベクターのための効率的欠失突然変異体パッケイジイング系：ヒト遺伝子治療および神経生理学への応用の可能性、PNAS USA、１９９０８７：８９５０）。哺乳動物遺伝子伝達のための他のベクターは、ウシパピローマウィルスを基礎にしたベクターである（サーヴァー（Sarver N）ら、ウシパピローマウィルスＤＮＡ：新規の真核クローニングベクター、Mol Cell Biol １９８１；１：４８６）。ワクシニアおよびその他のポックスウィルスを基礎にしたベクターは哺乳動物遺伝子伝達系を提供する。ワクシニアウィルスは１２０キロダルトン（ｋｄ）ゲノムサイズの大きい二本鎖ＤＮＡウィルスである（パニカリ（Panicali D．）ら、クローニングベクターとしてのポックスウィルスの作成：チミジンキナーゼ遺伝子の単純ヘルペスウィルスから感染性ワクチンウィルスのＤＮＡへの挿入、Pr oc Natl Acad Sci USA １９８２；７９；４９２７；スミス（Smith）ら、B 型肝炎ウィルス表面抗原を発現する感染性ワクシニアウィルス組換え体、Nature，１９８３３０２：４９０）。レトロウィルスはウィルスゲノムを効率的にホスト細胞に挿入する（ギルド（ Guild B）ら、培養マウス胚細胞および造血細胞にin vivo で遺伝子を発現させるために有用なレトロウィルスの開発、J Virol １９８８；６２：７９５；ホック（Hock RA）ら、ヒト造血前駆細胞中の薬剤耐性遺伝子のレトロウィルス仲介性伝達および発現、Nature １９８６；３２０：２７５；クリーグラー（Krieg ler M）、遺伝子伝達および発現、実験室的マニュアル、New York:Stockton P ress、１９９０：１−２４２；ギルボア（Gilboa E）、エグリティス（Eglitis MA）、カントフ（Kantoff PW）ら、レトロウィルスベクターを用いるクローン化遺伝子の伝達および発現、 Biotechniques １９８６、４、５０４−５１２；エグリティス、アンダーソン（Anderson WF）、遺伝子を哺乳動物細胞に挿入するためのレトロウィルスベクター、Biotechniques １９８８；６：６０８−６１４；アダム（Adam MA）、ミラー（Miller AD）、非レトロウィルスＲＮＡをヴィリオンにパッケイジするために十分な、マウスレトロウィルスにおけるシグナルの確認、J Virol １９８８；６２：３８０２−３８０６；アルメンタノ（Armentano D）、ユー（Yu SF）、カントフ（Kantoff PW）ら、内部ウィルス配列のレトロウィルスベクターの有用性に及ぼす影響、J Virol １９８７；６１：１６４７−１６５０；ベンダー（Bender M A）、パルマー（Palmer TD）、ゲリナス（Gelinas RE）ら、モロニーマウス白血病ウィルスのパッケイジングシグナルがｇａｇ領域に広がるという証拠、J Vi rol １９８７；６１：１６３９−１６４６；ダノス（Danos O）、ムリガン（Mul ligan RC）、アンホトロピックおよびエコトロピックホスト範囲を有する組換えレトロウィルスの安全かつ効率的生成、Proc Natl Acad Sci USA １９８８；８５：６４６０−６４６４；マルコウィッツ（Markowitz D.）、ゴフ（Goff S．）、バンク（Bank A．）、安全かつ効率的アンホトロピックパッケイジング細胞系の構築および利用、Virol １９８９；１６７：４００−４０６；ミラー、バッチモア（Buttimore 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、１９９２、１２６（１−４）：２５３−６９）。適切な酵素には大腸菌（E.coli）からのチミジンキナーゼ（ＴＫ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子、または大腸菌シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が含まれる。適切な癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子には、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ、Ｋ、およびＮｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽細胞腫瘍抑制遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス(Wilm's)腫瘍遺伝子プロダクト、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）、およびｎｍ２３を含む。適切な毒素はシュードモナス（Pseudomo nas ）外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；大腸菌ＬＴ毒素、シガ毒素、シガ様毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、サポリン、およびゲロニンなどである。可溶性ＣＴＬＡ４分子の投与本発明の分子の最も有効な投与形態および投与量は、治療すべき組織の位置または疾病、医学的障害の重症度および経過、対象の健康および治療に対する反応、ならびに治療医の判断によって決まる。従って、その分子の投与量は個々の対象で測定して決められるべきである。フライライヒ（Freireich E.J.）らは、種々の大きさおよび種々の種の動物および人と投与量との関係をｍｇ／ｍ²表面積であらわして報告した（Cancer Chem other.,Rep.５０（４）：２１９−２４４（１９６６））。投与量を調節して腫瘍細胞増殖阻害および死滅反応を最適化する、例えば投与量を１日ベースで分割し、投与する、または投与量を状況に応じて比例的に減少させる（例えば１日に数回に分けた投与量を投与し、または特殊の治療状況に応じて比例的に減らした）。本発明の実施によると、対象の治療に有効な量は約０.１〜約１０ｍｇ／kg（対象の体重）とすることができる。また、有効な量は約１〜１０ｍｇ／対象の体重ｋｇとすることができる。治癒に導くための本発明の組成物の投与量がスケジュールの最適化でさらに減るかも知れないことは明らかであろう。可溶性ＣＴＬＡ４分子可溶性ＣＴＬＡ４の例は、ＣＴＬＡ４Ig、活性化Ｂ細胞上に発現されたＢ７抗原に結合するＣＴＬＡ４分子のあらゆる機能性部分を含む。例えば、機能性ＣＴＬＡ４分子は、位置１のアラニンで始まり、位置１８７のアスパラギンで終わる配列番号１４に示される１８７個のアミノ酸を含む。別法として、機能性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列の位置１のアラニンで始まり、位置１２５のアスパラギンで終わる配列番号１３に示される１２５個のアミノ酸を含む。機能性ＣＴＬＡ４分子は、例えば免疫グロブリン分子の１部のような、非- ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合してもよい。可溶性ＣＴＬＡ４分子の例は可溶性ＣＴＬＡ４−ｐ９７分子；可溶性ＣＴＬＡ４−ｅｎｖｇｐ１２０分子；可溶性ＣＴＬＡ４−Ｅ７分子；および可溶性ＣＴＬＡ４−ｏｖａ分子を含む。一実施態様において、可溶性ＣＴＬＡ４分子はＣＴＬＡ４Ig 融合タンパク質に相当するアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４Igであり、１９９１年５月３１日にブダペスト条約の規定に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ロックヴィル、メリーランド）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８６２９を与えられた。発明の利点：遺伝子治療は今世紀および次世紀におけるヒトの健康に多大の影響を有するであろう分子医学の新規の形態である。遺伝子治療は先天性遺伝病、例えば膿胞性線維症、血友病、家族性高コレステロール血症、癌、ＡＩＤＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、および感染症を治す可能性を有する。組換えウィルスベクターは遺伝子治療のための魅力的ビークルである、なぜならばそれらは遺伝子を効率よく体組織に伝達するからである。しかし出願人の発明以前には、臨床的遺伝子治療におけるそれらの使用には制限があった、なぜならば導入遺伝子発現は時の経過につれて一過性になるからである。さらに、ウィルスの第２のまたはその後の投与によって一過性発現を回避しようとすると、遺伝子伝達は著しく低下する。出願人の発見は、in vivo または ex vivoにおける細胞への遺伝子伝達の前、後、および最中に可溶性ＣＴＬＡ４Igを投与すると、対象において長期の免疫抑制をおこさずに組換えウィルスベクターによる持続的遺伝子発現がおきることを見いだしたことによる。次に記す例は、本発明を説明し、熟練せる当業者によるその作成および使用に役立つために示される。例は本発明の範囲をそれに制限するものでは決してない。例１本実験は、可溶性ＣＴＬＡ４Ig分子の使用がアデノウィルス仲介性遺伝子伝達後の遺伝子発現を延長することを確認した。すべての動物試験はワシントン大学によって示された研究所ガイドラインに従って行われた。全動物は特殊な微生物の存在しない（ＳＰＦ）施設で飼育された。マウス（例えばＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス）に、ＤＭＥＭメジウム（Hyclone）中１００μｌに希釈した組換えアデノウィルスを尾静脈注射によって注入した。これまでの研究は、肝細胞の８０％〜９０％がこの量のアデノウィルスで形質導入されることを示している（リー（Q.Li）、ケイ（M.A.Kay）、ファインゴールド（M.Finegold）、ストラトフォード- ペリコーデット（L.D.Stratford-Perricau det）、ウー（S.L.C.Woo）、（１９９３）Human Gene Therapy、４、４０３）。マウスｍｕＣＴＬＡ４Ig、またはＬ６（プラセボ）をパイロジェンを含まない生理食塩水で希釈し、２００〜４００μｌを腹腔内（ＩＰ）注射で投与した。血液試料はレトロオービタル法によって得た。動物を頸部をひねって殺した。組換えＥ１欠乏Ａｄ５ベクター（Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴ）の作成、産生および精製は記載されているように行った(ケイ（Kay）ら、Hepatology ２１：８１５ −８１９(１９９５))。Ｌ６対照およびｍｕＣＴＬＡ４Ig実験動物に単一組換えウィルス標本を用いた。すべてのウィルス標本には記載の混入野生型ウィルスは存在しないことが判明した（バール（D.Barr）ら、（１９９５）、Gene Therapy 、２：１５１−１５５）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴによって、形質導入肝細胞にヒトアルファ１−アンチトリプシンを発現させるアデノウィルスを注入し、ｍｕＣＴＬＡ４IgまたはＬ６（対照モノクローナル抗体）で処置した。個々の動物における遺伝子発現の持続性を定期的血清中ヒトアルファ１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）定量によって測定した。図１において、齢６〜８週間の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス１６匹にＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴアデノウィルス５×１０⁹ｐｆｕを０日目に尾静脈から注射した。パネルＡおよびＣにおいて、動物は、マウスＣＴＬＡ４Ig（ＩＰ）２００μｇを２日目（ｎ＝４、黒丸）または０、２、１０日目（ｎ＝４、白丸）に受けた。対照動物は等量の対照抗体（Ｌ６）を２日目（ｎ＝４）（黒四角）または０、２、１０日目（白四角）（ｎ＝４）に受けた。図１のパネルＢおよびＤは反復実験である。マウス１０匹にＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴアデノウィルスを０日目に注射した。動物は可溶性ＣＴＬＡ４Ig（ｎ＝５、白丸）またはＬ６（ｎ＝５、白四角）を０、２、１０日目に受けた。定期的血清試料で（Ａ）ｈＡＡＴ、（Ｂ）ｈＡＡＴ（ケイら、１９９５、同上）または（Ｃ）ＣＴＬＡ４Ig、（Ｄ）ＣＴＬＡ４Ig をＥＬＩＳＡ法によって分析した。各線は個々の動物をあらわす。ＥＬＩＳＡアッセイは各測定で少なくとも２回は行った。マウスＣＴＬＡ４Ig血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。ヒトＢ７- １- Ｉｇ（ｐＨ９．６炭酸水素緩衝液５０μｌ中５０ｎｇ）を９６ウェルのイムロン−２ (Immulon-2)プレート上に塗付した。洗って、ブロックしたウェルに希釈血清試料または希釈標準ｍｕＣＴＬＡ４Igを接種した。結合および洗浄後、ヤギ抗マウスIgＧ２ａ Suouthern Bio technology、Birmingham，AL）で標識したホースラディッシュペルオキシダーゼ５０μｌ（１／５０００希釈）を室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼを３，３’，５，５’テトラメチルベンチジン（Sigma）を用いて検出した。１Ｎ硫酸５０μｌを用いて反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度（標準６３０ｎｍ）をミクロタイタープレートリーダー（ Biorad）を用いて測定し、濃度は標準曲線の線型回帰を用いて測定した。感度は０．１ｎｇ／ｍｌであった。図２は、Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴ投与後４日目（図２、パネルＡ）、１１日目（図２、パネルＢ）または１８日目（図２、パネルＣ）の脾臓増殖検定結果である。脾細胞は低張性溶解によって分離し、平底９６ウェル・プレートで記載のように培養した（ルイス(D.B.Lewis)ら、（１９９１）J.Exp.Med. １７３、８９）。図２Ａ〜Ｃでは、３×１０⁶／ｍｌ濃度の細胞を種々濃度のＵＶ不活性化Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴとともに記載のようにインキュベートした。リンホカイン検定のために７２時間目に上澄液を収穫し、または細胞を³Ｈ−チミジンで標識化し、２４時間後に収穫して増殖を測定した。リンホカイン検定は、モノクローナル抗体Ｒ４６Ａ２およびＸＭＧ１．２をそれぞれ捕獲試薬および検出試薬として使用してマウスインターフェロン−γをＥＬＩＳＡ法により検出することを含む。マウスＩＬ−４はファーミンゲン（Phar mingen）からのモノクローナル抗体ペアを用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。組換えマウスＩＦＮ- γおよびＩＬ−４を各検定の標準として用いた。図３において、動物に０日目にＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴ５×１０⁹ｐｆｕを注入した。動物を０、２、１０日目にＬ６（パネルｂおよびｅ）またはｍｕＣＴＬＡ４Ig（パネルｃおよびｆ）で処置した。正常動物からの肝臓を平行して処理した（パネルａおよびｄ）。１８日目に殺した動物からの凍結肝切片を抗ＣＤ３（パネルａ〜ｃ）または抗ＣＤ８（パネルｄ〜ｆ）抗体とともにインキュベートした。ヤギホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ハムスター（パネルａ〜ｃ）または抗ラット（パネルｄ〜ｆ）抗体で染色した。倍率は５０×である。免疫組織化学的染色を、ＯＣＴ中で凍結し、切片にした肝組織で行った。次に示す抗体を用いた：ＣＤ３−ビオチン（１４５２Ｃ１１、Pharmingen，San Dieg o，CA）、ＣＤ４（ＧＫ１．５、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））、ＣＤ８（５３−６．７ＡＴＣＣ）、ＮＫ（ウサギ抗-asialo ＧＭ１．Dako）、抗- クラスＩ- ビオチン（抗−Ｈ２Ｋ^K、11-4.1 Pharmigen）、抗- クラスII- ビオチン（抗−Ｉ−Ｅ^K１４．４−４５、ＡＴＣＣ）。ビオチニル化抗体はストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートで適切に検出された。非特異的染色では対照として、マッチする無関係のラットまたはウサギ抗体を用いた。門炎症のスコアリングシステムはクノーデル（R.G. Knodell）らの報告に基づく（（１９８１）、Hepatology １，４３１）。８匹の正常動物を対照として用い、スコア０とした。実験群のスコアは、門炎症を段階づけるために他の研究者らが用いたスコアリング系に平行する、正常動物に比較して０から４のスケールを用いる相対的染色に基づいてスコアをつけた（ヤングら（１９９４）免疫、同上）。各肝切片の２つのスコアの平均値をまとめた。２匹のマウス、＃１４および＃２３は多分Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴウィルスの不十分な注入のために、血清ｈＡＡＴが５０ｎｇ／ｍｌ以下であった。括弧内の数字は動物１４および２３を除いた平均値である（ＮＡ＝得られず）。使用した動物は図２に示し、ここに説明したものである。遺伝子発現は、ＣＴＬＡ４Ig 投与動物では対照と比較して著しく延びた（図１Ａ〜Ｄ）。すべてのＬ６対照動物（ｎ＝８）はアデノウィルス投与後２〜７週間に血清ｈＡＡＴ濃度が１００分の１以下に減少し（図１Ａ）、バックグラウンドより高くない数値になった；これらのデータはこれまでの研究（バール、同上）に見られるものと類似している。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物はすべて、少なくとも１４週間は高いｈＡＡＴ発現レベルを維持し（ｎ＝８）、８匹のマウス中６匹は実験期間である５カ月より長期にわたって高いｈＡＡＴレベルの発現を示した（図１Ａ）。ｍｕＣＴＬＡ４Ig 各２００μｇを１回投与したマウスと３回投与したマウスとではｈＡＡＴの持続性に差はなかった。図１Ｂに示す第２の実験組も同様な結果を与えた。アデノウィルス仲介性遺伝子発現期間が、抗原特異性免疫が欠如している先天性（congenic）Ｃ３Ｈ scid マウスを用いた以前の研究に見られたもの（バール、同上）、およびＴ−細胞欠乏ヌードマウスにおけるアデノウィルス形質導入ベーターガラクトシダーゼ発現の持続期間と同様であることが際立っていた（ヤング（Y.Yang）、エルトル（H. C.J.Ertl）、ウイルソン（J.M.Wilson）（１９９４）Immunity １、４３３；エングルハルト（J.F.Englehardt）、イェー（X.Ye）、ドランツ（B.Doranz）、ウイルソン（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１、６１９６）。長期アデノウィルス仲介性遺伝子発現は持続的免疫抑制の結果ではなかった。ｍｕＣＴＬＡ４Igの血清濃度は４０〜７０日の期間に約１００μｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ以下に劇的に低下した（図１ＣおよびＤ）。ＣＴＬＡ４Igによる上首尾の免疫抑制は、１μｇ／ｍｌより大きい血清濃度に関係する。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物は異なる抗原に対する免疫反応を高めることができた。これを確認するために、ｍｕＣＴＬＡ４IgおよびＬ６処置動物を最初のアデノウィルス注入後１０週目に新抗原、バクテリオファージφＸ１７４、で攻撃した（ノノヤマ(S.Nonoyama)、スミス（F.O.Smith）、ベルンスタイン（I.D.Berns tein）、オクス（H.D.Ochs）（１９９３）J.Immunology、１５０、３８１７）。ノノヤマら（同上）が報告したように、バクテリオファージφＸ１７４を増殖させ、収穫し、精製した。アデノウィルス形質導入後１０および１４週目に２．５×１０⁸ｐｆｕ／２００μｌを静脈内注入した。抗体タイターを中和するファージを、記載のように、第１回のファージ注入後８週間にわたって毎週測定した。タイターはＫｖまたは時間の経過につれてのファージ不活性化率としてあらわした。ｍｕＣＴＬＡ４IgおよびＬ６処置マウスでは、第１回後２週間の平均Ｋｖはそれぞれ２．２（範囲２．０〜１４）および３．９（範囲１．５〜３３）であった。第２回のファージ注入後２週間目にはｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物の平均Ｋｖは４９（範囲３．６〜１０４３）およびＬ６処置動物では９８（範囲１５〜１４６９）であった。この時点に、ＩｇＧ抗体のパーセンテージはｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスでは７０％から１００％まで変化し、Ｌ６処置マウスでは５０％から１００％まで変化した。バクテリオファージφＸ１７４に反応した増幅およびＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプ・スイッチを含む十分な抗体産生のためには、Ｔ細胞の助けが必要である（ノノヤマら（1993）J.Exp.Med. 178,1097）。Ｔ細胞依存性Ｂ細胞反応はＣＴＬＡ４Igによってブロックされるから、これは残留ｍｕＣＴＬＡ４Igの高感度の尺度となる（フィンチ（B.K.Finch）、リンスリー（P.S.Linsley）、およびウォフシー（D.Wofsy）（１９９４）Science ２６５、１２２５；リンスリーおよびレドベター（J.A.Ledbetter）（１９９３）Ann.Rev.Immunol. １１、１９１）。ｍｕＣＴＬＡ４IgおよびＬ６処置動物はすべて、第１および第２のバクテリオファージφＸ１７４免疫感作に反応して抗体を中和する正常量のＩｇＭおよびＩｇＧを産生し、生物学的に活性なｍｕＣＴＬＡ４Igが存在しないことを示唆した（ノノヤマ、スミス、ベルンスタイン、オクス（１９９３）J.Immunol. １５０、３８１７）。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物からのｈＡＡＴ遺伝子発現の長期持続性は、Ｔ−細胞のコースティミュラトリー活性化の阻害が、ウィルス抗原に対する細胞免疫の阻害をおこすことを示唆した。アデノウィルス抗原のＴ細胞免疫性認識がＣＴＬＡ４Ig治療で阻害されたかどうかを確認するために、Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴで形質導入し、ｍｕＣＴＬＡ４IgまたはＬ６で処置した動物で脾細胞増殖検定を行った。アデノウィルス注入の１１日または１８日後にマウスを殺し、単離した脾細胞を種々濃度のＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴで刺激した。アデノウィルスプライムＴ細胞による細胞増殖を７２時間目に３Ｈ−チミジン取り込みによって検定した（図２）。どちらの群でも４日目に最小の３Ｈ−チミジン取り込みがあった。１１および１８日目に、用量依存的、抗原誘起性の脾細胞増殖がＬ６処置対照で検出されたが、ＣＴＬＡ４Ig処置動物ではそれはないかまたは著しく少なかった（図２ＢおよびＣ）。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスにおける反応は、アデノウィルスを受けなかったナイーブな動物に認められるものと同様であった。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスにおける反応の減損は特異的であったが、なぜならば抗−ＣＤ３刺激に反応した増殖はｍｕＣＴＬＡ４Ig処置、Ｌ６処置およびナイーブ対照マウスで同様だったからである。ヤングらは、アデノウィルスベクター形質導入肝細胞に対する免疫反応がタイプ１またはＴＨ１リンホカイン反応の特徴を有することを見いだした、すなわちインターフェロン−γおよびＩＬ−２は抗原で刺激された脾細胞によって産生されたが、ＩＬ−４は産生されなかった（ヤング、エルトル、ウィルソン（１９９４）Immunity１、４３３）。予備的データーは、インターフェロン−γが９匹のＬ６処置マウスのうち５匹からのＡｄ／ＲＳＶｈＡＡＴ刺激培養物において誘導された（＞２０ｎｇ／ｍｌ）が、ＩＬ−４は検出されなかった（＜５０ｐｇ／ｍｌ）という点でこれと一致する。インターフェロン−γもＩＬ−４もｍｕＣＴＬＡ４Igマウスまたはナイーブ対照マウスからの抗原刺激−培養物では誘導されなかった。 In vitro検定の結果と一致して、アデノウィルス形質導入肝細胞に対するＴ細胞反応は in vivoで著しく減少した。白血球増殖研究と平行して行われた検定において、正常対照動物および、Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴを４、１１および１８日前に投与したマウスからの肝切片を検査した。細胞浸潤の性質を調べるために、切片を、すべてのＴ細胞を検出するＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブセット、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣに反応するモノクローナル抗体、ならびにＮＫ細胞に対するポリクローナル抗血清と反応させた。ＣＤ３およびＣＤ８に対する抗体と反応した代表的切片を図３に示し、全結果を表１にまとめる。４日後、どの群にも細胞浸潤はほとんどまたは全くなかった。しかし１１日および１８日後にはＬ６動物にＴ細胞の確実な（最初は門周囲の）浸潤があったが、ｍｕＣＴＬＡ４Ig 投与マウスではほとんどまたは全く浸潤はなかった。Ｔ細胞は主としてＣＤ８サブセットであった。クラスII ＭＨＣ発現の誘発もｍｕＣＴＬＡ４Ig処置群ではＬ６処置群に比較して減少したが、それらの結果はＴ細胞マーカーの場合より変動した。どちらの群にもＮＫ細胞浸潤はほとんどなかった。アデノウィルスで形質導入した動物ではそれらがＣＴＬＡ４IgまたはＬ６を受けたことには関係なく、クラスＩＭＨＣの肝細胞染色が増加した。細胞免疫はアデノウィルス形質導入遺伝子発現の持続期間を制限すると考えられる一方、抗体仲介性液性免疫は二次的アデノウィルス形質導入を制限すると考えられる（ヤングら、（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci. 、USA ９１、４４０７；ヤング、エルトル、ウイルソン（１９９４）Immunity １、４３３；スミスら（１９９３）Nature Geneti cs ５、３９７；バールら、同上）。抗体産生を図１Ａに示されるマウスで調べたとき、ｍｕＣＴＬＡ４Igはアデノウィルスベクターに対する抗体の産生を著しく阻止するが、除去はしないことが判明した。表２に示すように、すべてのＬ６処置動物には注入後４週間までにアデノウィルスに対する中和抗体が発生し、一方、ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物ではその反応は遅れ、減退した。それにもかかわらずＣＴＬＡ４Ig処置マウス２匹には注入後１０週間目までに１６以上の中和タイターが発生し、検出可能な中和抗体が何も発生しなかったマウスはたった２匹であった。アデノウィルスに対する中和−およびアイソタイプ特異的抗体を図１ＡおよびＣで研究したマウスで調べた。中和抗体およびＩｇＧ２ａタイターをメジアン逆数（１／Ｘ）タイターとして列挙する。各群の範囲は括弧内に示す（ｎｄ＝測定せず）。中和抗体タイター測定値を（バール、同上）から変形した。つまり、５×１０⁴ ２９３細胞を９６ウェルプレートに培養した。血清試料を５５℃で４０分間加熱不活性化し、ＤＭＥＭ／１％コウシ血清中、１００ｕｌ血清（４倍）希釈液（最小希釈は１／１６）をＡｄ．ＲＳＶβｇａｌ（３×１０⁵ｐｆｕ）１０μｌと３７℃で１時間混合した。混合物を２９３細胞上に６０分間重ね合わせ、その後そのウィルス混合物を新鮮培地に移した。１６〜２４時間後に細胞をβ−ｇａｌで染色し、タイターを、２９３細胞の染色を７５％阻害する希釈と決めた。このクリテリアにより、アデノウィルスを投与したすべてのＬ６対照は１／３２以上の中和タイターを有し、一方ｍｕＣＴＬＡ４Igマウスではたった２匹だけが１／１６以上の中和タイターを示した。２匹のｍｕＣＴＬＡ４Ig処置動物からの血清は１／１６希釈ではβｇａｌ染色を阻害しなかったが、一方これら動物の４匹からの血清は１／１６血清希釈でβｇａｌ染色を７５％未満に阻害し；これは低タイターアデノウィルス中和抗体の存在を示唆した。ミクロタイタープレート（Dynatech Immunolon）のウェルに炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中のＵＶ不活性化Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴの適量（５０ｎｇ／ウェル）を塗付することによって、ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を測定した。プレートを遮断した後、それらを血清試料（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの場合は１：１００〜１：６４００に希釈、ＩｇＭの場合は１：１００〜１：８００に希釈）とともに引き続きインキュベートし、その後マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ（Southern Biotechnology）またはＩｇＭ（Tago）に対するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗体で検出した。ナイーブ対照からの血清で得られた光学密度より＞０．１００（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）または＞０．０５０（ＩｇＭ）高い光学密度を与えた最も低い希釈をタイターと決めた。６および１０週目にアイソタイプ−特異的ＥＬＩＳＡによって検出された実質上すべてのウィルス特異的抗体がＩｇＧ２ａアイソタイプのものであった。８匹の各Ｌ６処置マウスにＩｇＧ２ａ抗体の高いタイターが発生した。ＩｇＧ２ａ反応はｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスでは著しく減少したが、最後には８匹のうち６匹に検出可能な抗体タイター（≧１００）が発生した。６および１０週試料で、１匹のＬ６処置マウスには測定可能なＩｇＧ１アイソタイプ抗体（１：４００）が、１匹のｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスには測定可能なＩｇＭ抗体（１：４００）が検出された。ＩｇＧ２ａアイソタイプが優勢であることは、Ｔ細胞によるタイプＩまたはＴＨ１リンホカイン反応と一致する、なぜならばこのようなＴ細胞はインターフェロン−γを産生し、それはこのアイソタイプの産生を促進し、一方ＩｇＧ１産生を阻害するからであり、一方タイプIIまたはＴＨ２Ｔ細胞によって産生するＩＬ−４は反対の効果を有する（ポール（W.A.Paul）およびセダー（W.E.Seder）（１９９４）Cell ７６、２４１；ヌグエン（L.Nguyen ）、クナイプ（D.M.Knipe）、フィンバーグ（R.W.Finberg）（１９９４）J.Immu nol. １５２、４７８）；これらの結果は上記のリンホカイン結果と一致する。マウスの両群におけるＩｇＧ２ａ抗体の優勢は―ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置群の方においてはるかに低い量であるとはいえ―、この作用物質が、発生した液性免疫反応の性質を著しく弱めるが、その性質を変えなかったことを示唆する。ｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスにおける低レベルの抗体が、二次的アデノウィルスベクターによる遺伝子発現を十分阻止するかどうかを確認するために、図１に示したものと似た別の実験を行った。Ａｄ／ＲＳＶｈＡＡＴの第１回目の投与の９週間後（そのときｍｕＣＴＬＡ４Igはもう検出されなかった）、動物にイヌ因子ＩＸを発現するＡｄ．ＲＳＶｃＦＩＸを注入した（ケイ（M.A.Kay）ら、（１９９４）Pro.Natl.Acad.Sci.,USA ９１、２３５３）；ｍｕＣＴＬＡ４Igの２回目の処置は行う場合もあったし、行わない場合もあった。イヌ因子ＩＸを発現したマウスは１匹もいなかった。これは恐らく、最初の遺伝子産物ｈＡＡＴの連続的発現にもかかわらず、ｍｕＣＴＬＡ４Ig 処置マウスに存在する低レベルの抗体によるアデノウィルスベクターの中和を反映するものであろう。この研究からの結果は、全身的ベクター投与時周辺の短期間におけるｍｕＣＴＬＡ４Igの投与が、持続性アデノウィルス仲介性遺伝子発現に導いたことを示す。ｍｕＣＴＬＡ４Igによる一過性免疫抑制は in vivoでは主要な標的器官である肝臓へのＴ細胞浸潤を、 in vitro 検定では抗原誘起性Ｔ細胞反応を、著しく減少させた。これらのＴ細胞反応性に与える影響が原因となって、対照で認められた免疫仲介性クリアランスと比較して長期の、アデノウィルス形質導入肝細胞の持続性をおこすらしい。これは in vivoにおけるアデノウィルス仲介性遺伝子発現の本質的な治療的増強の最初の報告である。これらの結果は、肝臓からのアデノウィルス仲介性遺伝子発現の、シクロスポリンＡの連日投与で得られる最小の増強（エングルハルト、イェー、ドランツ、ウィルソン（１９９４）Proc.Natl.Acad.Sci.,USA ９１、６１９６）とは明らかに異なる。これらの結果は、ヌード、ｓｃｉｄまたはＲＡＧ２突然変異によるＴ細胞またはＴおよびＢ細胞機能の持続的遺伝的欠陥で得られたものと非常に密接に平行している（ヤングら（１９９４）ＰＮＡＳ；ヤングら（１９９４）Immunity；バールら、同上）。彼らはｍｕＣＴＬＡ４Ig処置マウスと同様に、形質導入遺伝子を観察期間の５〜６カ月以上発現し続けた。注目すべきことに、長期間のアデノウィルス仲介性遺伝子発現を実現するために必要なｍｕＣＴＬＡ４Ig誘起性免疫抑制の一過性の性質は、これらの遺伝的欠陥によってもたらされる連続的免疫抑制とは対照的であり、持続的遺伝子発現が長期免疫抑制なしに、したがってその結果としての不都合な副作用もなしに達せられることを示唆している。形質導入遺伝子の長期発現に十分な阻害にもかかわらず、二次的な遺伝子導入は不可能であった。これは低レベルの残留循環中和抗体による二次的ベクターの効率的中和を反映するようである。多分より抗原性の小さいアデノウィルスベクターと組み合わせて行われるその他の免疫学的治療（エングルハルトら、同上）が、真の抗原耐性の発生のためには必要であるかも知れず、この抗原耐性によって反復性全身アデノウィルスデリバリーは可能となる。肝臓は正常状態では沈黙の組織であり、非染色体、非統合アデノウィルスゲノムがどの程度長く免疫破壊なしに肝細胞またはその他の組織に存続するかを正確に予想することはできない。ここに記載したもののような免疫治療を受けている免疫コンピテント動物と免疫不全動物とのアデノウィルス仲介性遺伝子発現の持続性を比較する研究は、ゲノムターンオーバーの非免疫メカニズムと比べて、遺伝子発現の持続性に対する免疫系によって課される制限を確認するために役立つであろう。本研究の結果は、in vivo における長期間の遺伝子発現のためにアデノウィルスを用いることに向けた大きな前進であって、かつ、将来の臨床的遺伝子治療試験を開発するために有用であろう。例２ＣＴＬＡ４Igアデノウィルスの調製：ＨｉｎｄIII／ＸｂａｌヒトおよびマウスＣＴＬＡ４Igフラグメントをきれいに精製した遺伝子を、左末端アデノウィルスプラスミドＡｄ／ＲＳＶ−ＢＰＡ（ＰＸＣＪＬ．１由来）のＢＰＡ（ウシポリアデニル化シグナル）とＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ）プロモーターとの間のＨｉｎｄIII/Ｘｂａｌ部位に、直接クローニングすることによって、構築物Ａｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ） −ＢＰＡおよびＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡを調製した。その後これら２つの左末端アデノウィルスプラスミドの各々を、標準的リン酸カルシウム形質導入プロトコルを用いて右末端アデノウィルスプラスミドｐＢＨＧ１０と同時トランスフェクトし、１４〜１８日後に組換えアデノウィルスを救出した。アデノウィルスをそれからプラーク精製し、ＥＬＩＳＡ検定によってヒトおよびマウスＣＴＬＡ４Igタンパク質を発現することが判明した各々のクローンを拡大させ、２つの塩化セシウム勾配で精製した。ビシストロニックＨＡＡＴ（ヒトアルファ- １- アンチトリプシンタンパク質）／ヒトおよびマウスＣＴＬＡ４Ig左末端ベクターは、精製されＴ４ＤＮＡポリメラーゼで研磨された（polished）ＨｉｎｄIII／ＸｂａｌヒトおよびマウスＣＴＬＡ４Igフラグメントを、ＲＳＶ−ＨＡＡＴ−ＰＯＬＩＯ（ＳＭＡＩ）−ＢＰＡを含むｐＫＳプラスミド内のＢＰＡとポリオウィルス内部リボソーム結合配列（ＰＯＬＩＯ）との間のユニークＳｍａｌ部位に、クローン化することによって調製した。適切な方向でＣＴＬＡ４フラグメントを含むことが判明した組換え体をＸｈｏｌで消化し、ＲＳＶ−ＨＡＡＴ−ＢＰＡ−ＣＴＬＡ４Ig- ＢＰＡ精製フラグメントをｐＸＣＪＬ．１左末端アデノウィルスプラスミド（Ａｄ／ＲＳＶ左末端プラスミドと同じ骨格）のユニークＸｈｏｌ部位にクローン化した。組換えウィルスは現在上記のように救出される。４×１０⁹ＰＦＵのＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡ組換えアデノウィルスを３匹のＣ３Ｈマウスの尾静脈に注射し、注射後３週間目には最大血清レベルの２３６９、２１６８および１７６２ｎｇ／ｍｌ血漿を産生した。Ａｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡアデノウィルスを数匹のＣ３Ｈマウスに注射し、ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）の血漿レベルを評価した。例３アデノウィルスベクターに向けられる液性免疫はＣＴＬＡ４Ig投与によって鈍くなるが、消失はしない。そのため、我々はＣＴＬＡ４Ig を抗ＣＤ４０リガンド（ＭＲ１）とともに用い、遺伝子発現を延長し、二次的遺伝子伝達を可能にした。動物にアデノウィルス（Ａｄ／ＲＳＶ−ｈＡＡＴ、５×１０⁹ｐｆｕ）を０日目に投与し、ＣＴＬＡ４Ig（２００μｇ）を０、２、１０日目に投与し、ＭＲ１（２５０μｇ）を０、２、４、および６日目に投与した。Ｌ６（プラセボ）をパイロジェンを含まない生理食塩水で希釈し、２００〜４００μｌを腹腔内投与した。全動物は持続的遺伝子発現を示した。Ｌ６対照のすべてにおいて２〜６週間までに遺伝子発現は０になった。動物の半数は検出可能な中和抗体をもたない。同様に、動物の半数は２回目に組換え体アデノウィルスベクター（Ａｄ．ＲＳＶ− ｃＦＩＸ）で形質導入することができた。そこで、組み合わせたＭＲＩ／ＣＴＬＡ４Ig治療は遺伝子発現を延長し、第２の遺伝子伝達を可能にすることができる。後者は液性免疫のブロックの結果である。表３に、少なくとも動物の半数で第２回目のウィルス投与を行い、アデノウィルス遺伝子伝達を成功させることができることを示すデータを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者リンスリー、ピーターエスアメリカ合衆国 98119 ワシントン州シアトルナインスアヴェニューウェスト 2430 (72)発明者ケイ、マークエイアメリカ合衆国 98115 ワシントン州シアトルナインティーンスアヴェニューノースイースト 8032 (72)発明者ウィルソン、クリストファービーアメリカ合衆国 98109 ワシントン州シアトルフォーティーサードアヴェニューノースイースト 3832 (72)発明者レドベター、ジュフリーアメリカ合衆国 98117 ワシントン州シアトルノースウェストワンハンドレッドサーティーンスプレイス 306 (72)発明者アルッフォ、アレハンドロエイアメリカ合衆国 98020 ワシントン州エドモンズスプルース 1012 (72)発明者ホレンバウ、ダイアンエルアメリカ合衆国 98117 ワシントン州シアトルトゥエルフスノースウェスト 9612

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞による関心とする遺伝子の発現を延長する方法であって、前記細胞は（ａ）関心とする遺伝子のための組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）関心とする遺伝子によってコード化されたタンパク質を発現することができ、前記方法は、前記細胞とその細胞による関心とする遺伝子の発現を延長するのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４分子とを接触させる工程を含んでなる方法。２．請求項１に記載された関心とする組換え遺伝子でトランスフェクトした細胞からの関心とする遺伝子によってコード化された組換えタンパク質の発現を高めることによって、対象の欠陥、疾病または損傷細胞を治療する方法。３．疾病にかかっている対象を治療する方法であって、対象の少なくとも１つの細胞が（ａ）関心とする遺伝子の組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）疾病またはそれに関連した症状を阻害することができる関心とする遺伝子によってコード化されたタンパク質を発現することができ、前記方法は、前記対象による関心とする遺伝子の発現を高めるのに有効な量の可溶性ＣＴＬＡ４を対象に投与する工程を含んでなる方法。４．細胞を、ＣＤ４０リガンドを認識して結合する抗体と接触させる工程をさらに含む請求項１記載の方法。５．対象に、ＣＤ４０リガンドを認識して結合する抗体の有効量を投与する工程をさらに含む請求項３記載の方法。６．抗体がモノクローナル抗体である請求項４または５記載の方法。７．対象が動物対象である請求項３記載の方法。８．動物対象がヒトである請求項７記載の方法。９．細胞が動物細胞である請求項１記載の方法。１０．動物細胞がヒト細胞である請求項９記載の方法。１１．関心とする遺伝子が組換えベクターに挿入される請求項１記載の方法。１２．組換えベクターがウィルスベクターである請求項１１記載の方法。１３．ウィルスベクターがレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターまたはワクシニアウィルスベクターである請求項１２記載の方法。１４．アデノウィルスベクターがＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡである請求項１２記載の方法。１５．アデノウィルスベクターがＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡである請求項１２記載の方法。１６．関心とする遺伝子がタンパク質をコード化する請求項１または３記載の方法。１７．タンパク質がサイトカインであり、かつ血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＩＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＮＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群から選択される請求項１６記載の方法。１８．可溶性ＣＴＬＡ４が、活性化Ｂ細胞上で発現されるＢ７抗原を結合する機能性ＣＴＬＡ４分子である請求項１または３記載の方法。１９．可溶性ＣＴＬＡ４分子がＣＴＬＡ４Igである請求項１または３記載の方法。２０．機能性ＣＴＬＡ４分子がＣＴＬＡ４の細胞外ドメインである請求項１８記載の方法。２１．機能性ＣＴＬＡ４分子が非−ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合する請求項１８記載の方法。２２．非−ＣＴＬＡ４タンパク質配列が免疫グロブリン分子の少なくとも１部である請求項２１記載の方法。２３．細胞が結合細胞である請求項１または３記載の方法。２４．細胞が線維性結合組織細胞である請求項１または３記載の方法。２５．細胞が血球である請求項１または３記載の方法。２６．細胞が筋細胞である請求項１または３記載の方法。２７．細胞が神経細胞である請求項１または３記載の方法。２８．血球が赤血球である請求項２２記載の方法。２９．血球が白血球である請求項２２記載の方法。３０．関心とするタンパク質をコード化する第１の遺伝子、およびＡｄ／ＲＳＶ −ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡと呼ばれる可溶性ＣＴＬＡ４分子をコードする第２の遺伝子を含んでなるベクター構築物。３１．関心とするタンパク質をコード化する第１の遺伝子、およびＡｄ／ＲＳＶ −ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡと呼ばれる可溶性ＣＴＬＡ４分子をコードする第２の遺伝子を含んでなるベクター構築物。３２．細胞による関心とする遺伝子の発現を延長するための薬学的組成物であって、細胞は（ａ）関心とする遺伝子のための組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）関心とする遺伝子にコード化されたタンパク質を発現することができ、前記組成物は、薬学的有効量のＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｍｕ）−ＢＰＡと、許容できる担体とを含んでなる薬学的組成物。３３．細胞による関心とする遺伝子の発現を延長するための薬学的組成物であって、細胞が（ａ）関心とする遺伝子のための組換え核酸配列を含み、かつ（ｂ）関心とする遺伝子にコード化されたタンパク質を発現することができ、前記組成物は、薬学的有効量のＡｄ／ＲＳＶ−ＣＴＬＡ４Ig（ｈｕ）−ＢＰＡと、許容できる担体とを含んでなる薬学的組成物。３４．対象の欠陥、疾病または損傷細胞を治療する方法であって、請求項３２または３３に記載された薬学的組成物を対象の細胞に投与して、中枢神経系の欠陥、疾病または損傷細胞を改善するのに十分な量の機能性分子を産生せしめる工程を含んでなる方法。