MXPA97009459A - Metodo para prolongar la expresion de un gen de interes usando moleculas de ctla4 solubles - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para aumentar la expresión de un gen de interés por una célula, la célula (a) comprende una secuencia deácido nucleico recombinante que codifica y (b) es capaz de expresar el gen de interés, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad de una molécula de CTLA4 soluble efectiva para aumentar la expresión del gen de interés por la célula.

Description

MÉTODO PARA PROLONGAR IA EXPRESIÓN DE UN GEN DE INTERÉS USANDO MOLÉCULAS DE CTLA4 SOLUBLES La terapia genética alberga grandes promesas para el tratamiento de muchas enfermedades que ahora carecen de terapias especificas (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244 : 1275; Ver a IM. Gene therapy, Sci. Am 1990;263:68; Miller AD. Progress toward gene therapy. Blood 1990;76:271; Karson, EM. Prospects for gene therapy. Biol. Reprod 1990;42:39). Por ejemplo, el cáncer humano con frecuencia se asocia con la expresión de genes aberrantes o mutaciones con genes específicos, y es posible que los procesos neoplásticos puedan ser alterados por la terapia genética. De manera alternativa, las células tumorales alteradas por la terapia genética pueden ser destruidas por la inserción de genes tóxicos o genes que las vuelvan sensibles a agentes quimioterapéuticos. Otro método para inactivar células neoplásticas, es insertar un oncogen antisentido en las células tumorales. Esos genes son transcritos en orientación invertida al oncogen. Debido a que las secuencias son complementarias, los ARNm se hibridan; la actividad del oncogen es disminuida debido a que el gen no puede ser traducido (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989;244: 1275) .

REF: 26192 La médula ósea es un tejido objetivo adecuado para la terapia genética, debido a que es fácilmente accesible y manipulable in vitro y contiene células no diferencias para perpetuar el genotipo imperado. El higado y el sistema nervioso central son también objetivos potenciales para la terapia genética (Miller A-D. Progress toward human gene therapy. Blood 1990;76:271) . La meta principal de la terapia genética es introducir elementos genéticos adicionales a una célula viviente o reemplazar elementos moleculares perdidos o no funcionales en el ADN de una célula viviente con el objetivo de hacer blanco y reparar alteraciones dentro de las células vivientes que conducen a enfermedades en el hombre (Culver et al., Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in ouse and man, PNAS USA, 8J3-3155 (1991)). Dependiendo de la enfermedad que esté siendo tratada, pueden adoptarse tres estrategias para la terapia genética. Los genes disfuncionales pueden ser reemplazados, alterados para ser funcionales, o amplificados con genes sanos que trabajan en diferentes lugares dentro de la célula. De esas opciones, la terapia de amplificación genética es comúnmente la más factible. Un ejemplo de amplificación genética es la adición de un gen de la adenosin desaminasa funcional a células de pacientes con inmunodeficiencia combinada severa (Friedman T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244 : 1275; Verma IM. Gene therapy. Sci. Am 1990;263:68; Miller AD. Progress toward human gene therapy. Blood 1990;76:271; Karson, EM. Prospects for gene therapy. Biol Reprod. 1990; 42: 39). Los prerrequisitos para la terapia genética son comprender el defecto de la enfermedad y tener un gen normal clonado y caracterizado. Los genes se introducen por varios métodos . La terapia genética puede implicar transferir genes en células en cultivo y a continuación transplantar las células cultivadas en un sujeto (método ex vivo) o liberar directamente los genes en un sujeto para la transferencia del gen in si tu en las células (método in vivo) . En ambos métodos in vivo y ex vivo, los vectores virales han sido explotados como vehículos de liberación para los genes de interés. Los genomas virales se alteran para volverlos no virulentos pero capaces de infectar ciertos tipos de células. Una ventaja de los vectores retrovirales es el hecho de que el ADN introducido se integra de manera eficiente a los cromosomas del huésped. El gen de reemplazo funcional se inserta en una posición dentro del genoma viral para hacerlo capaz de ser expresado después de que ha sido producido en el tejido apropiado. El virus se administra entonces al paciente o las células objetivo para permitir la transformación del fenotipo funcional deseado. Una desventaja de los vectores retrovirales es la necesidad de la reproducción celular para la transferencia genética eficiente. En contraste, los vectores de adenovirus no requieren la reproducción celular, pero el ADN introducido no se integra al cromosoma del huésped. Esos vectores virales recombinantes, incluyendo los vectores de adenovirus, son eficientes en la transferencia de genes en tejidos somáticos pero son de uso limitado en la terapia genética clínica por factores inmunológicos que dan como resultado una pérdida rápida de la expresión del gen e inhiben la transferencia secundaria del gen. Específicamente, la expresión del gen es transitoria, generalmente dura no más de varias semanas debido a una respuesta inmune celular dirigida contra las células transducidas (Y. Yang et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 91, 4407; Y. Yang, H.C.J. Ertl, J.M. ilson (1994) Immunity 1, 433) . Esta limitación puede ser burlada usando moléculas de CTLA4 solubles, las cuales dan como resultado una prolongación de la expresión del gen. El CTLA4 es un antígeno de la superficie celular normalmente encontrada sobre las células T. El CTLA4 se une al antígeno B7 que activa las células B. Una molécula de CTLA4 soluble, es decir, CTLA4Ig, ha mostrado inhibir respuestas inmunes dependiendo de la interacción entre las células T y B (Linsley et al, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991).

El uso de células de CTLA4 solubles en la inmunoterapia aumenta en gran medida la probabilidad de que los vectores virales recombinantes sean útiles para la terapia genética humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un método para prolongar la expresión de un gen de interés por una célula. En este método, la célula comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica para el gen de interés y es capaz de expresar el gen de interés. Este método proporciona el paso de poner en contacto la célula con una cantidad de una molécula de CTLA4 soluble, efectiva para prolongar la expresión del gen de interés por la célula. De manera alternativa, cuando la célula se localiza en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad de molécula de CTLA4 soluble, la cual prolonga efectivamente la expresión del gen de interés por la célula. La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que padece de una enfermedad. De acuerdo con el método, al menos una célula del sujeto (a) comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés que es capaz de inhibir la enfermedad o los síntomas asociados con esta. Este método comprende administrar al sujeto una cantidad de un CTLA4 soluble efectiva para aumentar la duración de la expresión del gen de interés por el sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-D son gráficas de líneas que muestran la expresión del gen mediada por adenovirus con la coadministración de CTLA4Ig soluble. Cada línea representa un animal individual . Las Figuras 2A-C son gráficas de líneas que muestran los resultados del ensayo de proliferación en bazo. La Figura 3 es una fotografía que identifica las células inflamatorias hepáticas a través de inmunohidroquímica .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIÓN Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa aquí un "gen de interés" significa cualquier molécula de ADN o ARN que codifique para una proteína o secuencia de ácido nucleico. Como se usa aquí una "secuencia de proteína no CTLA4" significa cualquier molécula que no se una al B7 y no interfiera con la unión del CTLA4 a su objetivo del antígeno B7. Como se usa aquí "el dominio extracelular del CTI-A4" es cualquier porción del CTLA4 que reconozca y se una al antígeno B7. Por ejemplo, un dominio extracelular del CTLA4 se describe en Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991); Linsley et al. "I munosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA4 cell activation molecule" Science (1992) 257 (5071)792-795. Como se usa aquí "CTLA4 soluble" significa un CTLA4 circulante capaz de unirse al B7. Los ejemplos incluyen pero no se limitan al dominio extracelular del CTLA4 o el dominio extracelular del CTLA4 fusionado (genética o químicamente) a una molécula biológica o químicamente activa tal como CTLA4Ig, CTLA4-env gpl20, CTLA4-p97, CTLA4-ova, y CTLA4-E7. Como se usa aquí "terapia genética" es un proceso para corregir una enfermedad por manipulación genética. Como se usa aquí "vector viral" es una molécula de ácido nucleico portador (1) en la cual puede insertarse un gen de interés para introducirse en una célula huésped en donde esta se expresará y (2) la cual se deriva de un virus. Para que la invención aquí descrita pueda ser comprendida de manera más completa, se da la siguiente descripción.

MÉTODOS DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el descubrimiento de que una cantidad efectiva de CTLA4 soluble aumenta la expresión de un gen de interés por una célula, permitiendo su expresión genética prolongada o persistente. En una modalidad preferida de la invención, el gen de interés es parte de una secuencia de ácido nucleico recombinante tal como un vector viral recombinante. Los vectores recombinantes son los descritos aquí. En una modalidad de la invención, la amplificación aumento de la expresión del gen se efectúa poniendo en contacto la célula con una cantidad de molécula CTAL4 soluble para inhibir una respuesta inmune. De manera alternativa, el aumento de la expresión del gen se efectúa administrando a un sujeto una cantidad de un CTLA4 soluble para inhibir una respuesta inmune logrando por lo tanto la expresión genética viral persistente sin inmunosupresión a largo plazo. De manera adicional, la combinación de una molécula CTLA soluble y un ligando antiCD40 (MRl) prolonga la expresión del gen y permite la transferencia secundaria del gen. Un ligando antiCD40 es cualquier molécula que reconozca y se una al ligando CD40, por ejemplo, un anticuerpo (anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o fragmentos de los mismos) o una proteína de unión recombinante, por ejemplo, una proteína de fusión. Las moléculas de CTLA4 solubles pueden ser administradas durante la terapia genética, antes de la terapia genética, o después de la terapia genética. Además, la administración de CTLA4 soluble es útil aún después de administraciones posteriores de genes a través de los métodos in vivo o ex vivo. El uso de moléculas de CTLA4 solubles puede permitir la expresión secundaria exitosa del gen después de una segunda administración de un gen de interés a través de los método in vivo o ex vivo, que normalmente no podría ser posible debido a una respuesta inmune. El CTLA4 soluble puede ser administrado por medios orales, medios transdérmicos, medios intravenosos, medios intramusculares, o por administración subcutánea. De manera alternativa, el CTLA4 puede ser insertado junto con el gen de interés en un vector viral y coexpresado. Los métodos de la invención son útiles en el tratamiento de un sujeto que padezca de células defectuosas, enfermas o dañadas. En particular, el uso del CTLA4 soluble puede aumentar la terapia genética en pacientes que padecen de una enfermedad (Patente Estadounidense No. 5,339,346, expedida el 21 de Marzo de 1995) . La prueba de unidad de éxito en la terapia genética se mejora como resultado del aumento de la expresión del gen y el sujeto que padece de una enfermedad es tratado de manera más efectiva que sin el uso de CTLA4 soluble antes, después y/o durante la terapia genética. En una modalidad de la invención, al menos una célula en el sujeto debe comprender ADN recom inante para un gen de interés. Además, la célula debe ser capaz de expresar la proteína codificada por ese gen de interés, de modo que la enfermedad o síntomas asociados con ella se inhiban. De acuerdo con la práctica de la invención, el sujeto puede ser un sujeto animal, tal como un humano, perro, gato, oveja, caballo, pez, ave, cerdo, o vaca. Actualmente, varios grupos están usando la terapia genética en el tratamiento del cáncer (Friedmann T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244:1275-1281; Roth JA, Mukhopadhyay T, Tainsky MA, et al. Molecular approaches to prevention and therapy of aerodigestive tract cancers. Review article. Monogr Nati Cáncer Inst 1992; 13:15-21; Mukhopadhyay T, Tainsky M, Cavender AC, Roth JA. Specific inhibition of K-ras expression and tumorigenicity of lung cáncer cells by antisense RNA. Cáncer Res 1991; 51:1744-1748) . Los investigadores han desarrollado protocolos para el tratamiento de tumores cerebrales experimentales inyectando directamente células que producen partículas retrovirales que contienen el gen de la timidina cinasa (TK) del herpes en cánceres de cerebro (Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatments of experimental brain tumors, Cellular Immunology Section, National Cáncer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Science 1992; 256:1550-1552). La incorporación del gen de la TK en células tumorales las hará sensibles al fármaco gancyclovir. El uso de CTLA4 soluble puede aumentar la expresión del gen de la TK. La invención proporciona además un método para tratar células defectuosas, enfermas o dañadas en un sujeto, que comprende insertar el vector Ad/RSV-CTLA4Ig(mu) -BPA o Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA en las células, de modo que las células produzcan la proteína codificada por el gen de interés junto con las moléculas de CTLA4 solubles en una cantidad suficiente para aliviar las células defectuosas, enfermas o dañadas en el sistema nervioso central. La invención proporciona además un método para tratar células defectuosas, enfermas o dañadas en un sujeto, que comprende injertar células donadoras en el sujeto. De acuerdo con la práctica de la invención, las células donadoras están modificadas genéticamente. Específicamente, tales células donadoras se insertan con Ad/RSV-CTLA4Ig (mu) -BPA o Ad/RSV-CTLA4Ig(hu) -BPA, de modo que tales células donadoras produzcan la proteína codificada por el gen de interés junto con las moléculas de CTLA4 solubles en una cantidad suficiente para aliviar las células defectuosas, enfermas o dañadas en el sistema nervioso central. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas para prolongar la expresión de un gen de interés por una célula, en donde la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés. Las composiciones comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de Ad/RSV-CTLA4lg (mu) -BPA y un portador aceptable. De manera alternativa, la composición comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de Ad/RSV-CTLA4Ig (hu) -BPA y un portador aceptable.

CÉLULAS Las células que incluyen el gen de interés pueden ser cualquier célula eucariótica tales como las células epiteliales y células conectivas. Las células epiteliales se localizan sobre toda el área superficial del cuerpo animal, aún en áreas internas tales como la pared interna de un bazo sanguíneo o del estómago. Las células conectivas incluyen células las cuales constituyen el tejido óseo, tejido cartilaginoso y sangre, es decir, células tanto blancas como rojas. Las células comprenden ADN recombinante que codifica y es capaz de expresar el gen de interés in vitro e in vivo. Las células pueden ser células animales tales como las células de un humano, un perro, un gato, una oveja, un caballo, un pez, un ave, un cerdo, o una vaca. Las células donadoras pueden ser células productoras. Además, las células donadoras pueden ser células autólogas o heterólogas.

INTRODUCCIÓN A GENES EXTERNOS EN LAS CÉLULAS Existe disponibles una variedad de técnicas para la introducción de ADN o ARN en células. De manera general, la terapia genética incluye (1) transferir genes en células en cultivo y a continuación transplantar las células cultivadas en un sujeto (método ex vivo) o (2) inhibir directamente los genes en un sujeto para una transferencia genética in si tu (método in vivo) .

Por ejemplo, el gen de interés puede ser insertado en una célula directamente en un vector viral recombinante. Son posibles otros métodos de inserción. Por ejemplo, en las técnicas ex vivo, el gen puede ser insertado en una célula usando cualquier procedimiento de transferencia genética tal como la transfección mediada por fosfato de calcio, el uso de policationes o lípidos complej ados con ADN, encapsulación de ADN en vesículas lipídicas o espectros eritrocíticos, o la exposición de células a impulsos rápidos de corriente eléctrica de alto voltaje (es decir, electroporación) . El ADN también ha sido introducido en las células por microinyección directa o mediante el uso de microproyectiles de tungsteno de alta velocidad. Esas técnicas son capaces de integrar copias múltiples del ADN en el genoma aunque la eficiencia de la integración varía ampliamente con la técnica, los diferentes genes, y los diferentes tipos de células. Recientemente se han desarrollado técnicas que usan vectores virales para introducir ADN en células de mamífero. Esas técnicas tienen el potencial de infectar todas las células expuestas al virus. En el desarrollo de las técnicas para el uso de vectores virales, fue necesario desarrollar vectores que se incorporaron de manera estable en la célula objetivo sin dañarla.

Los vectores virales adecuados incluyen los papovavirus, virus de simio 40, poliomavirus, adenovirus, retrovirus murinos y avíanos. Los vectores virales puede infectar múltiples tipos de células.

VECTORES Comparados con los vectores que no entran en las células por los eventos mediados por el receptor, los vectores virales son preferidos debido a su eficiencia. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen, pero no se limitan a, un vector de retrovirus, un vector de adenvirus, un vector de vaccinia virus, un vector de virus del herpes, o un vector del virus de la rabia. El vector viral seleccionado deberá satisfacer los siguientes criterios: 1) el vector debe ser capaz de infectar las células interés y de este modo deben seleccionarse los vectores virales que tienen un intervalo de huéspedes apropiado; (2) el gen transferido deberá ser capaz de persistir y ser expresado en una célula durante un periodo de tiempo prolongado; y 3) el vector deberá ser seguro al huésped, y causar una transformación celular mínima. Los vectores retrovirales y adenovirus ofrecen medios útiles y actualmente son los mejor caracterizados, para introducir y expresar genes externos eficientemente en células de mamífero. Esos vectores tienen intervalos de huéspedes y tipos celulares muy amplios, expresan genes de manera estable y eficiente. La seguridad de esos vectores ha sido probada por muchos grupos de investigadores. En efecto, muchos son los ensayos clínicos. Otros vectores virales que pueden ser usados para transferir genes en células para la corrección de padecimientos incluyen a los papovavirus del virus del herpes tales como el JC, SV40, polioma; virus de Epstein-Barr (EBV) ; papiloma virus, por ejemplo, virus del papiloma bovino del tipo I (BPV); poliovirus y otros virus humanos y animales. Los adenovirus tienen varias propiedades que los hacen atractivos como vehículos de clonación (Bachettis et al.: Transfer of gene for thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral ADN. PNAS USA, 1977 74_:1590; Berkner, K.L.: Development of adenovirus vectors for expression of heterologus genes, Biotechniques, 1988 6:616; Ghosh-Choudhury G, et al., Human adenovirus cloning vectors based of infectious bacterial plasmids. Gene 1986; 50:161; Hag-Ahmand Y. et al., Development of a helper-independent human adenovirus vector and its use in the transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. J Virol 1986; 57:257; Rosenfeld M, et al., Adenovirus-mediated transfer of a recombinant oti-antitrypsin gene of the lung epithelium in vivo. Science 1991; 252:431).

Por ejemplo, los adenovirus poseen un genoma de tamaño intermedio que se duplica en los núcleos celulares; muchos serotipos son clínicamente inocuos; los genomas de los adenovirus parecen ser estables a pesar de la inserción de genes externos; los genes externos parecen ser mantenidos sin pérdidas o rearreglos; y los adenovirus pueden ser usados como vectores de expresión transitoria de alto nivel con un periodo de expresión de semanas a varios meses. Estudios bioquímicos y genéticos extensos sostienen que es posible sustituir hasta 7-7.5 kb de las secuencias heterólogas para que las secuencias de adenovirus nativas generen vectores viables, condicionales, independientes de ayuda (Kaufman R.J.; identification of the component necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors. PNAS USA, 1985 82:689). Como ejemplos, la invención proporciona los vectores de adenovirus designados Ad/RSV-CTLA4Ig (mu) -BPA y Ad/RSV-CTLA4Ig (hu) -BPA. El AAV es un parvovirus humano pequeño con un genoma de ADN de aproximadamente 5 kb. Este virus puede propagarse como un provirus integrado en varios tipos de células humanas. Los vectores de AAV tienen varias ventajas para la terapia genética humana. Por ejemplo, son tróficos para las células humanas, pero también pueden infectar a otras células de mamífero; (2) no se han asociado enfermedades con el AAV en humanos u otros animales; (3) los genomas de AAV integrados parecen ser estables en sus células huésped; (4) no existen evidencias de que la integración del AAV altere la expresión de los genes o promotores del huésped promueva su rearreglo; (5) los genes introducidos pueden ser rescatados por la infección con un virus auxiliar tal como el adenovirus. El sistema vectorial HSV-1 facilita la introducción de virtualmente cualquier gen en células no mitóticas (Geller et al. an eficient deletion mutant packaging system for a defecive herpes simplex virus vectors: Potential applications to human gene therapy and neuronal physiology. PNAS USA, 1990 87:8950) . Otro vector para la transferencia genética en mamíferos es el vector del virus del papiloma bovino (Sarver N, et al. Bovine papilloma virus DNA: A novel eukaryotic cloning vector. Mol Cell Biol 1981; 1:486). Los vectores de vaccinia y otros a base de poxvirus proporcionan un sistema de transferencia genética en mamíferos. El virus vaccinia es un virus de ADN de doble hebra grande de un tamaño genómico de 120 kilodaltons (kd) (Panicali D, et al., Construction of poxvirus as cloning vectors; Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccine virus. Proc Nati Acad Sci USA 1982; 79:4927; Smith et al. infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigens. Nature, 1983 302: 490) . Los retrovirus insertan eficientemente genes virales en células huésped (Guild B, et al., Development of retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonic cells and hematopoietic cells in vivo. J Virol 1988; 62:795; Hock RA, et al., Retrovirus mediated transfer and expression of drug resistance genes in human hematopoietic progenitor cells. Nature 1986; 320:275; Kriegler M. Gene transfer and expression. A laboratory manual. New York: Stockton Press, 1990:1-242; Gilboa E., Eglitis MA, Kantoff PW, et al. Transfer and expression of cloned genes using retrovial vectors. Biotechniques 1986; 4:504-512; Eglitis AM, Anderson WF. Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells. Biotechniques 1988; 6:608-614; Adam MA, Miller AD. Identification of a signal in a murine retrovirus that is sufficient for packaging of nonretroviral RNA into virions. J Virol 1988; 62:3802-3806; Armentano D, Yu SF, Kantoff PW, et al. Effect of internal viral sequences on the utility of retroviral vectors. J. Virol 1987; 61:1647-1650; Bender MA, Palmer TD, Gelinas RE, et al. Evidence that the packaging signal of Monoley murine leukemia virus extends into the gag región. J Virol 1987; 61:1639-1646; Danos O, Mulligan RC. Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc Nati Acad Sci USA 1988; 85:6460-6464; Markowitz D, Goff S, Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virol 1989; 167:400-406; Miller AD, Buttimore C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid reco bination leading to helper virus production. Mol Cell Biol 1986; 6:2895-2902; Miller AD, Trauber DR, Buttimore C. Factors involved in the production of helper virus-free retrovirus vectors. Somatic Cell Mol Genet 1986; 12:175-183; Miller AD, Rosman GJ. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques 1989; 7:980-986).

GEN DE INTERÉS El gen de interés puede ser cualquier gen de interés. El producto genético del gen de interés incluye proteínas y secuencias de ácido nucleico tales como moléculas sentido o antisentido. Por ejemplo, el gen de interés puede codificar para una proteína seleccionada del grupo que consiste de citocinas, enzimas, antibióticos, toxinas, antimetabolitos y precursores de los mismos. Las citocinas adecuadas incluyen interferones, interleucinas GM-CSF, factor de la necrosis tumoral (TNF) (Wong G, et al., Human GM-CSF: Molecular cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins. Science 1985; 228:810); WO 9323034 (1993); Herisberger MA, et al., Cloning and sequence analyses of cDNAs for interferon and virus-induced human Mx proteins reveal that they countain putative guanine nucleotide-binding sites: functional study of the corresponding gene promoter. Journal of Virology, 1990 Mar, 64 (3) : 1171-81; Li YP et al., Proinfla matory cytokines tumor necrosis factor-alpha and IL-6, but not IL-1, down regúlate the osteocalcin gene promoter. Journal of Immunology, 1992 Feb 1, 148 (3) :788-94; Pizarro TT, et al. Induction of TNF alpha anf TNF beta gene expression in rat cardiac transplants during allograft rejection. Transplantation, 1993 Agosto, 56(2) :399-404) . (Breviario F. et al., Interleukin-1-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component. Journal of Biological Chemistry, 1992 . Nov 5, 267 (31) : 22190-7; Espinoza-Delgado I, et al., Regulation of IL-2 receptor subunit genes in human monocytes. Differential effects of IL-2 and IFN-gamma. Journal of Immunology, 1992 Noviembre 1, 149(9) :2961-8; Algate PA, et al., Regulation of the interleukin-3 (IL-3) receptor by IL-3 in the fetal liver derived FL5.12 cell line. 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Las enzimas adecuadas incluyen a la timidina cinasa (TK) , gen de la xantin-guanin fosforribosiltransferasa (GPT) de E. coli o citosina desaminasa E. coli (CD) , o hipoxantin fosforribosil transferasa (HPRT) . Los oncogenes y genes supresores tumorales adecuados incluyen al neu, EGF, ras (incluyendo H, K, y N ras) , p53, gen supresor del tumor de Retinoblastoma (Rb) , Producto Genético del Tumor de Wilm, Fosfotirosin Fosfatasa (PTPasa) , y nm23. Las toxinas adecuadas incluyen a las exotoxinas A y S de Pseudomonas; toxina de la difteria (DT) ; toxinas LT de E. coli, toxina de Shiga, toxinas similares a las de Shiga (SLT-1, -2), ricina, abrina, suporina, y gelonina.

DOSIS DE LAS MOLÉCULAS DE CTLA4 SOLUBLES El medio más efectivo del régimen de administración y dosificación para las moléculas de la presente invención depende de la localización del tejido o la enfermedad que seta siendo tratada, la severidad y curso del padecimiento médico, la salud del sujeto y la respuesta al tratamiento y el juicio del médico tratante. En consecuencia, las dosis de las moléculas deberán ser tituladas al sujeto individual. La interrelación de las dosis para animales de varios tamaños y especies y humanos basados en mg/m2 de área superficial se describen en Freireich, E.J. et al. Cáncer Chemother., Rep. 50 (4) :219-244 (1966). Los ajustes en el régimen de dosificación para optimizar la inhibición del crecimiento de las células tumorales y respuesta exter inadora, es decir, que las dosis pueden dividirse y administrarse en una base diaria o la dosis se reduce proporcionalmente dependiendo de la situación (por ejemplo, pueden administrarse varias dosis diariamente o reducirse proporcionalmente dependiendo de la situación terapéutica específica) . De acuerdo con la práctica de la invención, una cantidad efectiva para tratar a un sujeto puede ser de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto. También, la cantidad efectiva puede ser una cantidad de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto. Deberá estar claro que la dosis de la composición de la invención requerida para lograr la curación puede reducirse aún más con la optimización del programa.

MOLÉCULAS DE CTLA4 SOLUBLES Los ejemplos de CTLA4 soluble incluyen al CTL4Ig, y cualquier porción funcional de una molécula de CTLA4 que se una a un antígeno B7 expresado sobe células B activadas. Por ejemplo, la molécula de CTLA4 comprende los 187 aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO. 14 que comienza con la alanina en la posición 1 y finaliza con la asparagina en la posición 187. De manera alternativa, la molécula de CTLA4 funcional comprende los 125 aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO. 13 que comienza con la alanina en la posición 1 y finaliza con la asparagina en la posición 125 de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína CTLA4. La molécula de CTLA4 funcional puede unirse a una secuencia de proteína no CTLA4 tal como una porción de una molécula de inmunoglobulina. Los ejemplos de moléculas de CTLA4 solubles incluyen a la molécula CTLA4-p97 soluble; molécula CTLA4-env gpl20 soluble; molécula CTLA4-E7 soluble; y molécula CTLA4-ova soluble. En una modalidad, la molécula de CTLA4 soluble es CTLA4Ig que tiene la secuencia de amionoácidos que corresponde a la proteína de fusión CTLA4Ig que ha sido depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) en Rockville, Maryland, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest el 31 de Mayo de 1991 y a la que se ha acordado el número de acceso: 68629.

VENTAJAS DE LA INVENCIÓN: La terapia genética es una forma novedosa de medicina molecular que tendrá su efecto principal sobre la salud humana en este y en el siguiente siglo. La terapia genética tiene la posibilidad de corregir padecimientos genéticos hereditarios tales como la fibrosis quística, hemofilia, hipercolesterolemia familiar, cáncer, SIDA, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y enfermedades infecciosas.

Los vectores virales recombinantes son vehículos atractivos para la terapia genética debido a que son eficientes para transferir genes a tejidos somáticos. Sin embargo, antes de la invención de los solicitantes, su uso se limitaba a la terapia genética clínica debido a que la expresión transgénica se vuelve transitoria con el tiempo. Además, la expresión transitoria burlando a través de una segunda o posterior administración del virus da como resultado una transferencia genética significativamente reducida. El descubrimiento de los solicitantes reposa sobre el descubrimiento de que la administración de CTLA4Ig soluble, después o durante de la transferencia genética in vivo o ex vivo, en células da como resultado una expresión genética persistente por el vector viral recombinante en el sujeto sin inmunosupresión a largo plazo. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y ayudar a un experto en la técnica a hacer uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera o de otro modo limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Este experimento determinó que el uso de moléculas CTLA4Ig solubles dan como resultado una expresión genética prolongada después de una transferencia genética mediada por adenovirus. Todos los estudios en animales se efectuaron de acuerdo a las directrices institucionales expuestas por la Universidad de Washington. Todos los animales se alojaron en instalaciones libres de patógenos (SPF) específica. Los ratones (por ejemplo, ratones C3H/HeJ) fueron inyectados con adenovirus recombinante diluido a 100 µl en medios DMEM (Hyclon) por infusión en la vena de la cola. Los estudios anteriores habían demostrado que el 80% al 90% de los hepatocitos se transdujeron con esta dosis de adenovirus (Q. Li, M.A. Kay, M. Finegold, L. D. Stratford-Perricaudet, S.L.C. Woo (1993) Human Gene Therapy 4, 403). El muCTLA4Ig murino o L6 (placebo) se diluyeron en solución salina fisiológica libre de pirógenos y se administraron en 200 a 400 µl por inyección IP. Las muestras de sangre se obtuvieron por la técnica retroorbital. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. La construcción, producción y purificación de vector Ad5 deficiente en El recombinante (Ad/RSVhAAT) fue como ya se describió (Kay et al. Hepatology 21:815-819 (1995) ) . Se usó una sola preparación de virus recombinante para animales control L6 y experimentales muCTLA4Ig. Se encontró que todas las preparaciones de virus fueron negativas a la presencia de contaminación de virus natural de acuerdo a lo descrito (D. Barr et al. (1995) Gene Therapy 2:151-155) . Se infundieron ratones C3H/HeJ con Ad/RSVhAAT, un adenovirus que dirige la expresión de la 1-antitripsina alfa humana, en hapatocitos transducidos, y se trataron ya sea con muCTLA4Ig o L6 (un anticuerpo monoclonal control) . La resistencia de la expresión genética en animales individuales se determinó mediante la cuantificación periódica en suero de la 1-antitripsina alfa humana (hAAT) . En la Figura 1, se infundieron dieciséis ratones C3H/HeJ hembra de 6 a 8 semanas de edad con 5 x 109 ufp de adenovirus Ad/RSVhAAT por la vena de la cola el día 0. En los paneles A y C, los animales recibieron 200 µg de CTLA4Ig murino (IP) el día 2 (n=4, círculos sólidos) o los días 0, 2, 10 (n=4, círculos abiertos) . Los animales control recibieron cantidades equivalentes del anticuerpo control (L6) el día 2 (n=4) (cuadros sólidos) los días 0, 2, 10 cuadros abiertos) (n=4) . Los paneles B y D de la Figura 1 fueron experimentos repetidos. Los ratones se infundieron con adenovirus Ad/RSVhAAT el día 0. Los animales recibieron ya sea CTLA4Ig soluble (n=5, círculos abiertos) o L6 (n=5, cuadros abiertos) los días 0, 2, 10. Se analizaron muestras de suero periódicamente para (A) hAAT, (B) hAAT (Kay et al. 1995, supra) o (C) CTLA4Ig, (D) CTLA4Ig por ELISA. Cada línea representa un animal individual. Los ensayos de ELISA se efectuaron cada uno por duplicado para cada medición. Las concentraciones en suero del CTLA4Ig murino se determinaron por medio del ensayo de ELISA. El B7-1-Ig humano (50 ng en 50 µl de amortiguador de bicarbonato pH 9.6) fue recubierto sobre 2 placas inmunológicas de 96 pozos. Los pozos lavados y bloqueados fueron cultivados con muestras de suero diluido o muCTLA4Ig estándar diluido. Después de unir y lavar, se incubaron 50 µl (dilución 1/5000) de IgG2a anti-ratón de cabra marcada con peroxidasa de rábano (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, la peroxidasa de rábano se decantó usando 3, 5f , 5, 5' -tetrametilbencidina (Sigma). La reacción se detuvo usando 50 µl de ácido sulfúrico ÍN. La absorbancia a 450 nm (referencia 630 nm) se efectuó usando un lector de placa tituladora (Biorad) y las concentraciones se determinaron usando una regresión lineal de la curva estándar. La sensibilidad fue de 0.1 ng/ml. La Figura 2 proporciona los resultados del ensayo de proliferación del bazo los días 4 (panel A de la Figura 2), 11 (panel B de la Figura 2) o 18 (panel C de la Figura 2) después de la administración de Ad/RSVhAAT, los esplenocitos se aislaron por lisis hipotónica y se cultivaron como se describió en placas de 96 pozos de fondo plano (D. B. Lewis et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 89). describió en placas de 96 pozos de fondo plano (D. B. Lewis et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 89). En las Figuras 2A-C, se incubaron células a una concentración de 3 x 106/ml con diferentes concentraciones de Ad/RSVhAAT inactivado por UV como se indicó. Los sobrenadantes se cosecharon a las 72 horas para los ensayos de linfocina o las células se marcaron con 3H-timidina y se cosecharon 24 horas más tarde para la determinación de la proliferación. Los ensayos de linfocina implican determinar el interferón ? murino por ELISA usando los anticuerpos monoclonales R46A2 y XMG1.2 como reactivos de captura y detección respectivamente. La IL-4 murina se determinó por ELISA usando pares de anticuerpo monoclonal de Pharmigen. El IFN-? murino recombinante y la IL-4 se usaron como estándares en cada ensayo. En la Figura 3, se infundieron animales con 5 x 109 ufp de Ad/RSVhAAT el día 0. Los animales fueron tratados ya sea con L6 (paneles b y e) o muCTLalg (paneles c y f) los días 0, 2, 10. Los hígados de los animales normales se procesaron en paralelo (paneles a y d) . Los cortes de hígados congelado de los animales sacrificados el día 18 se incubaron con anticuerpos anti-CD3 (paneles a-c) o anti-CD8 (paneles d-f) . La tinción fue con anticuerpo antihámster (paneles a-c) o antirrata (paneles d-f) conjugado con peroxidasa de rábano, de cabra. La amplificación es de 50x. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo en los tejidos de hígado que se congelaron en OCT y se seccionaron. Se usaron los siguientes anticuerpos: CD3-biotina (1452C11, Pharmigen, San Diego, CA) CD 4 (GK1.5, American Type Culture Collection (ATCC)), CD8 (53-6.7 ATCC), NK (antiasialoGMl de conejo. Dako) , antibiotina clase I (anti-H2Kk, 11-4.1 Pharmigen), antibiotina clase II (anti-I-E 14.4-45, ATCC). Los anticuerpos biotinilados se detectaron con conjugados de estreptavidiva y peroxidasa de rábano según fue apropiado. Se usaron anticuerpos de rata o conejo y relevantes equiparados como controles para la tinción no específica. El sistema de calificación para la inflamación portal se basó en lo descrito por R. G. Knodell et al., (1981) Hepatology 1, 431. Se usaron ocho animales normales como controles y se calificaron como 0. Los grupos experimentales se calificaron en base a la tinción relativa usando una escala de 0 a 4 en relación a los animales normales en paralelo a un sistema de calificación usado por otros para graduar la inflamación portal (Yang et al. (1994) Immunity, supra). Se listó el promedio de dos calificaciones para cada sección de hígado .

Dos ratones, #14 y #23 tuvieron menos de 50 ng/ml de probabilidad de hAAT en suero debido a una infusión inadecuada de virus Ad/RSVhAAT. Los números entre paréntesis representan la media si los animales 14 y 23 (NA = no disponible) . Los animales usados son aquellos que se muestran en la Figura 2 y se describen aquí.

La expresión del gen se extendió en gran medida en animales que recibieron CTLA4Ig en comparación con los controles (Figuras 1A-D). Todos los animales control con L6 (n=8) tuvieron una disminución mayor de 100 veces en la concentración de hAAT en suero entre 2 y 7 semanas (Figura ÍA) después de la administración de adenovirus a valores que no fueron superiores a los básales; esos datos son similares a aquellos observados en un estudio previo (D. Barr, supra) . Todos los animales tratados con muCTLA4Ig mantuvieron altos niveles de expresión de hAAT durante al menos 14 semanas (n=8), y 6 de 8 ratones expresaron altos niveles de hAAT durante > 5 meses, la duración del experimento (Figura ÍA) .

No hubo diferencia en la persistencia de hAAT en los ratones a los que se les dieron 1 ó 3 dosis cada una de 200 µg de muCTLA4Ig.

Un segundo conjunto de experimentos presentado en la Figura IB dio resultados similares. De manera notable, el periodo de la expresión genética mediada por adenovirus fue similar a la observada en estudios anteriores en ratones C3H es decir congénitos que carecen de inmunidad específica antigénica (D. Barr, supra) , y la duración de la expresión de beta-galactosidasa transducida por adenovirus observada en ratones desnudos deficientes en células T (Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; J. F. Englehardt, X. Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91, 6196) .

La expresión genética mediada por adenovirus a largo plazo no fue el resultado de la inmunosupresión persistente. La concentración de muCTLA4Ig en suero cayó dramáticamente de aproximadamente 100 µg/ml a menos de 10 ng/ml durante un periodo de 40 a 70 días (Figuras ÍC y D) . La inmunosupresión exitosa por el CTLA4Ig se asoció con concentraciones en suero mayores de 1 µg/ml.

Los animales tratados con muCTLA4Ig fueron capaces de montar una respuesta inmune a un antígeno diferente. Para determinar esto, los animales tratados con muCTLA4Ig y L6 fueron desafiados con un antígeno neo, bacteriófago fX 174, 10 semanas después de la infusión de adenovirus inicial (S.

Nonoyama, F. O. Smith, I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Im unol. 150, 3817) .

El bacteriófago fX174 se hizo crecer, se cosechó y purificó como en Nonoyama et al., supra se infundieron I. V. 2.5 x 108 ufp en 200 µl 10 y 14 semanas después de la transducción de adenovirus. Los títulos de anticuerpo neutralizante del fago se determinaron semanalmente para un total de 8 semanas después de la primer infusión de fago como se describió. Los títulos se expresaron como Kv o razón de inactivación del fago con el tiempo. En los ratones tratados con muCTLA4Ig y L6, la Kv media dos semanas después de la primaria fue de 2.2 (intervalo de 2.0 a 14) y 3.9 (intervalo de 1.5 a 33), respectivamente. Dos semanas después de la segunda infusión de fago la Kv media para los animales tratados con muCTLA4Ig fue de 49 (intervalo de 3.6 a 1043) y para los animales tratados con L6 fue de 98 (intervalo de 15 - 1469) . En este momento el porcentaje de anticuerpo IgG varió entre el 70% y el 100% en los ratones tratados con muCTLA4Ig y del 50% al 100% en animales tratados con L6.

Se requiere la ayuda de las células T para la producción eficiente de anticuerpo incluyendo la amplificación y la conmutación de isotipo IgM a IgG en respuesta al bacteriófago fX174 (S. Nonoyama et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1097) . Puesto que la respuesta de las células B dependientes de las células T bloqueadas por CTLA4Ig proporcionan una medida sensible de muCTLA4Ig residual (B. K.

Finck, P. S. Linsley, y D. Wofsy (1994) Science 265, 1225; P. S. Linsley y J. A. Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11, 191) .

Todos los animales tratados con muCTLA4Ig y L6 produjeron cantidades normales de anticuerpos neutralizantes IgM e IgG en respuesta a la inmunización con bacteriófago fl74 primaria y secundaria, indicando la ausencia de muCTLA4Ig biológicamente activo (S. Nonoyama, F. 0. Smith, I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Immunol. 150, 3817) .

La persistencia a largo plazo de la expresión del gen hAAT de los animales tratados con muCTLA4Ig sugirió que la inhibición de la activación coestimuladora de las células T fue responsable de la inhibición de la inmunidad celular dirigida contra antígenos virales. Para determinar si el reconocimiento inmunológico de las células T de los antígenos de adenovirus fue inhibida con la terapia con CTLA4Ig, se efectuaron ensayos de proliferación de células de bazo en animales transducidos con Ad/RSVhAAT y tratados con muCTLA4Ig o L6. 11 ó 18 días después de la infusión del adenovirus, los ratones se sacrificaron y los esplenocitos aislados se estimularon con varias concentraciones de Ad/RSVhAAT. La proliferación celular por células T cebadas con adenovirus se ensayó por absorción de 3H-timidina a las 72 horas (Figura 2) . El día 4 hubo una incorporación de 3H-timidina mínima en cualquier grupo.

Los días 11 y 18 se detectó una proliferación de esplenocitos inducida por antígeno, dependiente de la dosis, los controles tratados con L6, pero estuvo ausente o notablemente reducida en los animales tratados con CTLA4Ig (Figuras 2B y C) . Las respuestas en los ratones tratados con CTLA4Ig fueron similares a aquellas observadas en animales candidos que no recibieron adenovirus.

La mejora de la respuesta en los animales tratados con muCTLA4Ig fue específica, puesto que la proliferación en respuesta a la estimulación con anti-CD3 fue similar en los ratones tratados con muCTLA4Ig, tratados con L6 o controles candidos.

Yang et al., encontraron que la respuesta inmune a los hepatocitos transducidos con vector adenoviral tuvo las características de una respuesta de linfocina del tipo 1 o THl, en la que fue producido interferón ? e IL-2 pero no IL-4 por los esplenocitos estimulados con antígeno (Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) I munity 1, 433) . Los datos preliminares son consistentes con esto dado que se indujo (> 20 ng/ml) interferón ? en cultivos estimulados con Ad/RSVhAAT de 5 a 9 ratones tratados con L6, mientras que no se detectó IL-4 (< 50 ng/ml). Ni el interferón ? ni la IL-4 fueron inducidas en cultivos estimulados con antígeno de ratones muCTLA4Ig o ratones control candidos.

Consistente con los resultados de los ensayos in vitro, la respuesta de las células T a los hepatocitos transducidos con adenovirus fue notablemente atenuada in vivo. En los ensayos efectuados en paralelo con los estudios de proliferación linfocítica, se examinaron las secciones de hígado de animales control normales y de ratones que recibieron Ad/RSVhAAT 4, 11 y 18 días iniciales.

Para determinar la naturaleza del infiltrado celular, las secciones se hicieron reaccionar con anticuerpo monoclonal para el CD3, el cual detecta todas las células T, con anticuerpos monoclonales para los subconjuntos de células T CD4 y CD8, MHC de la clase I y la clase II y con un antisuero policlonal para células NK.

Las secciones representativas que reaccionaron con los anticuerpos para CD3 y CD8 se muestran en la Figura 3 y todos los resultados se resumen en la Tabla 1. Hubo poco o ningún infiltrado celular en cualquier grupo 4 días después.

Sin embargo, 11 y 18 días después hubo un infiltrado robusto (periport.al principalmente) de células T en los animales con L6 pero poco o ningún infiltrado en los ratones que recibieron muCTLA4Ig.

Las células T fueron predominantemente del subconjunto CD8. La inducción de la expresión el MHC de la clase II también disminuyó en el grupo tratado con muCTLA4Ig en relación al grupo tratado con L6, pero los resultados fueron, más variables que para los marcadores de células T. Hubo poca infiltración de células Nk en cualquier grupo. Los animales que fueron transducidos con adenovirus tuvieron tinción hepatocelular incrementada para el MHC de la clase I sin importar si recibieron CTLA4Ig o L6.

Aunque se cree que la inmunidad celular limita la duración de la expresión genética transducida por adenovirus, se cree que la inmunidad humoral, medida por anticuerpos, limita la transducción del adenovirus secundario (Y. Yang, et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91, 4407; Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; T. G. Smith et al. (1993) Nature Genetics 5, 397; Barr et al, supra) .

Cuando se determinó la producción de anticuerpo en los ratones mostrado en la Figura ÍA, se encontró que el muCTLA4Ig impide notablemente pero no erosiona la producción de anticuerpos para el vector de adenovirus.

Como se muestra en la Tabla 2, todos los animales tratados con L6 desarrollaron anticuerpos neutralizantes para el adenovirus 4 semanas después de la infusión, mientras que la respuesta fue retrasada y atenuada en los ratones tratados con muCTLA4Ig. No obstante, 2 de los ratones tratados con CTLA4Ig desarrollaron títulos neutralizantes mayores o iguales a 16 10 semanas después de la infusión y únicamente dos de los ratones no desarrollaron ninguna anticuerpo neutralizante detectable.

Los anticuerpos neutralizantes y específicos del isotipo dirigidos contra el adenovirus se determinaron por los ratones estudiados en las Figuras ÍA y C. Los títulos de anticuerpo neutralizante IgG2a se listaron como s, el título recíproco medio (1/x) . El intervalo de cada grupo se da entre paréntesis (nd = no determinado) . Las mediciones del título de anticuerpo neutralizante se modificaron de entre (D. Barr, supra) . De manera breve, se cultivaron 5 x 104 células 293 en placas de 96 pozos. Las muestras de suero se inactivaron con calor a 55°C durante 40 minutos y se mezclaron diluciones (de cuatro veces) de 100 ul de suero (la dilución mínima fue 1/16) en DMEM/1% de suero de carnero fetal con 10 µl de Ad.RSVßgal (3 x 105 pfu) durante 1 hora a 37°C. La mezcla se recubrió sobre las células 293 durante 60 minutos antes de reemplazar la mezcla de virus con medios frescos. Las células se tiñeron con ß-gal 16 a 24 horas más tarde y el título se definió como la dilución que inhibe el 75% de la tinción de las células 293. Mediante este criterio, todos los controles L6 que recibieron adenovirus tuvieron títulos neutralizantes mayores o iguales a 1/32 mientras que únicamente dos de los ratones muCTLA4Ig tuvieron títulos neutralizantes que fueron iguales o mayores a 1/16. Los sueros de dos animales tratados con muCTLA4Ig no tuvieron inhibición de la tinción con ßgal a una dilución 1/16, mientras que los sueros de cuatro de esos animales tuvieron menos de 75% de inhibición de la tinción con ßgal a un dilución de suero 1/16, indicando la presencia de anticuerpo neutralizante de adenovirus de título bajo. Los anticuerpos IgM, IgGl e IgG2a se determinaron recubriendo los pozos de placas microtituladoras (Dynatech Immunolon) con la cantidad óptima (50 ng/pozo) de Ad/RSVhAAT inactivado con UV en amortiguador de carbonato (pH 9.6). Después de que las placas fueron bloqueadas se incubaron secuencialmente con muestras de suero (diluidas de 1:100 a 1:6400 para IgGl e IgG2a, diluidas 1:100 a 1:800 para IgM) , a continuación se detectaron con anticuerpos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano para IgGl, IgG2a (Southern Biotechnology) o IgM (Tago) de ratón. La dilución más baja que produjo una densidad óptica >0.100 (IgGl e IgG2a) o >0.050 (IGM) superior a la que se obtuvo con el suero del control nativa se definió como el título. Virtualmente todo el anticuerpo específico del virus detectado por el ELISA específico del isotipo a las 6 y 10 semanas fue del isotipo IgG2a. Cada uno de los 8 ratones tratados con L6 desarrolló altos títulos de anticuerpos IgG2a. La respuesta del IgG2a disminuyó notablemente en los ratones tratados con muCTLA4Ig, aunque 6 de los 8 finalmente desarrollaron títulos de anticuerpos detectables de > 100. Un ratón tratado con L6 tuvo anticuerpo medible del isotipo IgGl (1:400) y un ratón tratado con muCTLA4Ig tuvo anticuerpo IgM medible (1:400) detectado en las muestras de 6 y 10 semanas. La predominancia del isotipo IgG2a es consistente con una respuesta de linfocina del tipo I o THl por las células T, puesto que tales células T producen interferon-? el cual favorece la producción de este isotipo inhibiendo a la vez la producción de IgGl, mientras que la IL-4 producida por las células T del tipo II o TH2 tuvo el efecto opuesto (W. A. Paul y W. E. Seder (1994) Cell 76, 241; L. Nguyen, D. M. Knipe y R. W. Finberg (1994) J. Inmuno1. 152, 478); esos resultados son consistentes con los resultados de linfocina presentados anteriormente. La predominancia de los anticuerpos IgG2a en ambos grupos de ratones, aunque en cantidades no reducidas en el grupo tratado con muCTLA4Ig, sugiere que este agente atenúa notablemente pero no altera la naturaleza de la respuesta inmune humoral que se desarrolló. Para determinar si los bajos niveles de anticuerpos en los ratones tratados con muCTLA4Ig fueron suficientes para mejorar la expresión genética con un vector de adenovirus secundario, se llevaron a cabo otros experimentos similares a aquellos mostrados en la Figura 1. Nueve semanas después de la primera administración de Ad/RSVhAAT (cuando el muCTLA4Ig ya no fue detectable), los animales recibieron una infusión de Ad/RSVcFIX que expresa el factor canino IX (M. A. Kay, et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 91, 2353), con o sin un segundo tratamiento con muCTLA4Ig. Ninguno de los ratones expresaron factor canino IX. Esto muy probablemente refleja la neutralización del vector adenoviral por los bajos niveles de anticuerpo presentes en los ratones tratados con muCTLA4Ig, a pesar de la expresión continua del producto del gen inicial, hAAT. Los resultados de este estudio indican que la administración de muCTLA4Ig durante un periodo breve cercano al tiempo de la administración del vector sistémico condujo a la expresión genética mediada por adenovirus persistente. La inmunosupresión transitoria por muCTLA4Ig atenuó marcadamente la infiltración de células T en el hígado, el órgano objetivo principal, in vivo y las respuestas de las células T inducidas por antígeno ensayadas in vi tro. Es probable que esos efectos sobre la reactividad de las células T estén relacionados causalmente con la persistencia a largo plazo de los hepatocitos transducidos con adenovirus, en contraste con la eliminación mediada de manera inmune observada en los controles. Este es el primer reporte de un aumento sustantivo, terapéutico, de la expresión genética mediada por adenovirus in vi vo . Esos resultados contrastan notablemente con el aumento mínimo de la expresión genética mediada por adenovirus del hígado logrado con la administración diaria continua de ciclosporina A (J. F. Englehardt, X. Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 91, 6196) . Los resultados más estrechamente paralelos a aquellos logrados con un defecto genético persistente en las células T o función de las células T y B debido a mutaciones en ratones desnudos, scid o RAG2 (Yang et al. (1994) PNAS; Yang et al. (1994) Immunity; Barr et al., supra), los cuales al igual que los ratones tratados con muCTLA4Ig, continuaron expresando el gen transducido durante >5 a 6 meses, la duración de los periodos de observación. De manera notable, la naturaleza transitoria de la inmunosupresión inducida por muCTLA4Ig requirió lograr expresión genética mediada por adenovirus a largo plazo en contraste con la inmunosupresión continua proporcionada por esos defectos genéticos y sugiere que la expresión genética persistente puede lograrse sin inmunosupresión a largo plazo y sus efectos adversos resultantes. A pesar de la inhibición suficiente para conducir a una expresión a largo plazo del gen transducido, la transducción genética secundaria no fue posible. Esto probablemente refleja la neutralización eficiente del vector secundario por los bajos niveles de anticuerpos neutralizantes circulantes residuales. Pueden ser necesarias otras terapias con bases inmunológicas, posiblemente en combinación con vectores de adenovirus menos antigénicos (Englehardt et al., supra) para el desarrollo de tolerancia antigénica verdadera que permita la liberación de adenovirus sistémica repetida. El hígado es un tejido quiescentes bajo condiciones normales y es posible predecir exactamente cómo el genoma de adenovirus no integrado, no cromosomal, persistirá a largo lazo en los hepatocitos u otros tejidos en ausencia de destrucción inmune. Los estudios que comparan la persistencia de la expresión genética medida por adenovirus en animales inmunodeficientes con animales inmunocompetentes sometidos a inmunoterapias tales como las descritas aquí ayudaran a determinar las limitaciones impuestas por el sistema inmune sobre la duración de la expresión genética en comparación a los mecanismos no inmunes del androcambio genómico. Los resultados del estudio son un avance mayor hacia el uso de adenovirus para la expresión genética a largo plazo in vivo y serán útiles para desarrollar ensayos de terapia genética clínica futuros.

Tabla 1: Identificación del Infiltrado Celular de Hígado DÍA 4 DÍA 11 DÍA 18 # CD3 CW CD6 I II NK # CD3 CD4 CD8 I II NK # CD3 CD4 CD8 I II NK L6 1 0 0 0 3 0 0 11 2 2.5 3 3 3 1.5 21 4 2.5 3 3 2 1 L6 2 0 0 0 3 0 0 12 4 1.5 4 2.5 3 2.5 22 4 1 3 2.5 2.5 0 L6 3 0 0 0 1.5 0 0 13 3 0 2 2.5 2 2 23 0 0 0 0 0 0 L6 4 1.5 0 0 3 0 0 14 0 0 0 1.5 1.5 0 24 2 1.5 2 1.5 2 0 L6 5 0 0 2 1.5 0 0 15 2.5 1.5 0 2.5 1.5 0 25 3 2 2.5 3 2 0 media 0.3 0 0.4 2.4 0 0 medi a 2.3 1.1 1.8 2.4 2.2 1.2 media 2.6 1.4 2.1 2.0 1.7 0.2 4- (2.9) (1.4) (2.3) (2.6) (2.4) (1-5) (3.3) (1.8) (2. ó) (2.5) (2.1) (0.3) CT A4 6 0 0 0 1 1 0 16 0 0 0 1 1 0 26 0 0 0 2.5 0 1 CTIA4 7 2 0 0 2.5 0 1 17 0 0 0 2 0 1 27 0 0 0 2.5 0 1 CTLA4 8 0 0 1 2.5 0 0 18 1 0 0 2.5 2 1 28 0 0 0 1.5 2 0 CTLA4 9 0 0 0 2 0 0 19 0 0 0 2 2 0 29 0 0 0 1.0 2.5 0 CT A4 10 0 0 0 1.5 0 0 20 0 0 0 2 1 1 NA media 0.4 0 0.2 1.9 0 0.2 0.2 0 0 1.9 1.2 0.6 media 0 0 0 1.9 1.1 0.5 Tabla 2 TIPO DE SEMANA 4 SEMANA 6 SEMANA 10 ANTICUERPO CTLA4Ig L6 CTLA4Ig L6 CTLA4Ig L6 Neutralizante <16 (<16) 32 (16-128; <16 (<16-64) 64 (16-128) <16 (<16-64) 32 (<16-64) IgG2a ELISA nd nd <100 (<100-400) 6400 100 6400 (1600>6400) (<100-6400) (1600>6400) CD EJEMPLO 2 Preparación de los Adenovirus CTLA4Ig: Los constructos Ad/RSV-CTLA4Ig (mu) -BPA y Ad/RSV- CTLA4Ig (hu) -BPA se prepararon por clonación direccional del gen limpio purificado de los fragmentos HindIII/Xbal humano y CTAL4Ig murino en los sitios HindIII/Xbal entre el promotor de RSV (LTR del virus del sarcoma de Rous) y BPA (señal de poliadenilación Bovina) de plásmido Ad/RSV-BPA del adenovirus del extremo izquierdo (derivado de PXCJL.l). Cada uno de esos dos plásmidos del adenovirus del extremo izquierdo se cotransfectaron entonces con el plásmido pBHGlO de adenovirus del extremo derecho usando un protocolo de transfección con Fosfato de Calcio estándar, y el adenovirus recombinante se rescató después de 14-18 días. El adenovirus se purificó en placa entonces, y las clonas que se encontró que expresan la proteína CTLA4Ig humana y murina por ensayo de ELISA se expandieron y purificaron sobre dos gradientes de Cloruro de Cesio. Los vectores del extremo izquierdo de HAAT (proteína alfa-1-antitripsina ) bicistrónica/CTLA4Ig humana y murina se prepararon clonando los fragmentos de CTLA4lg Humanos y Murinos HindIII/Xbal con ADN polimerasa T4 pulida en el sitio Smal único entre la secuencia de unión del ribosoma interna del Poliovirus (POLIO) y en BPA en el plásmido pKS que contiene RSV-HAAT-POLIO (SMAI)-BPA. Los recombinantes que se encontró contenían los fragmentos CTLA4 en la orientación apropiada se digirieron con Xhol y el fragmento purificado RSV-HAAT-BPA-CTLA4Ig-BPA se clonó en el sitio Xhol en el plásmido de adenovirus del extremo izquierdo pXCJL.l (el mismo esqueleto que el del plásmido del extremo izquierdo Ad/RSV) . Los virus recombinantes se rescataron como se describió anteriormente. Se han inyectado 4 x 109 UFP del adenovirus recombinante Ad/RSV-CTLA4Ig(mu) -BPA en la venas de las colas de tres ratones C3H y se produjeron niveles de suero máximos de 2369,2168, y 1762 ng/ml de plasma 3 semanas después de la inyección. El adenovirus Ad/RSV-CTLA4Ig(hu) -BPA se inyectó en varios ratones C3H y se evaluaron los niveles de CTLA4Ig(hu) .

EJEMPLO 3 La inmunidad humoral dirigida contra el vector de adenovirus se truncó pero no se eliminó con la administración de CTLA4Ig. De este modo, se usó CTLA4Ig con ligando antiCD40 (MRl) para prolongar la expresión genética y permitir la transferencia genética secundaria.

Los animales recibieron adenovirus (Ad/RSV-hAAT, 5 x 109 ufp) el día 0, CTLA4Ig (200 µg) ) los días 0, 2, 10 y MRl (250 µg) los días 0, 2, 4, y 6. El L6 (placebo) se diluyó en solución salina fisiológica libre de pirógeno y se administró en 200-400 µl por IP. Todos los animales tuvieron expresión genética persistente. Todos los controles con L6 tuvieron una expresión genética de 0 durante 2-6 semanas. La mitad de los animales no tuvieron anticuerpos neutralizantes detectables. Igualmente, la mitad de los animales pudieron ser transducidos una segunda vez con un vector de adenovirus recombinante (Ad.RSV-cFIX) . De este modo, la terapia con MRl/CTLA4Ig combinada tuvo potencial para prolongar la expresión genética y permitir la transferencia genética secundaria. Lo último es el resultado de bloquear la inmunidad humoral. La Tabla 3 proporciona datos que muestran que al menos a la mitad de los animales se les puede dar una segunda dosis de virus y tener una transferencia genética adenoviral exitosa.

TABLA 3 B E Cotinuación de la Tabla 3 A B Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para la prolongación de la expresión de un gen de interés por una célula, caracterizado porque la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés, el uso que comprende poner en contacto la célula con una cantidad de una molécula de CTLA4 soluble suficiente para prolongar la expresión del gen de interés por la célula.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente poner en contacto la célula con un ligando antiCD40 suficiente para prolongar la expresión del gen de interés por la célula.

3. El uso de células en contacto con la molécula de CLTA4 soluble en un sujeto para expresar un gen de interés o de utilidad, en donde la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés, para la preparación de una composición terapéutica para la prolongación de expresión del gen de interés por la célula en el sujeto .

4. El uso de células que se ponen en contacto con la molécula de CTLA4 soluble en un sujeto para expresar un gen de interés para mejorar células enfermas, defectuosas, o dañadas, en donde las células (a) incluyen una secuencia de ácido nucleico recombinante para un gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por ei gen de interés para la preparación de una composición terapéutica para la prolongación de la expresión del gen de interés por las células en el sujeto, en donde las células después del contacto liberan una molécula funcional que efectúa el mejoramiento o alivio.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, que además comprende administrar al sujeto una cantidad ligando antiC40, efectiva, para mejorar la expresión del gen de interés por el sujeto.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el sujeto es un sujeto animal.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el sujeto animal es un humano.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la célula es una célula animal.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la célula animal es una célula humana.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde el gen de interés se inserta en un vector .recombinante .

11. El uso de conformidad con la reivindicación 10 en donde el vector recombinante es un vector viral.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el vector viral es un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, un vector de virus de vaccinia, un vector de virus del herpes, o un vector de virus de rabia.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde el gen de interés codifica una proteína.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde la proteína es una citosina y se selecciona a partir del grupo que consiste de PDGF, EGF, FGF, IGF, TGF, IL, INF, y TNF. lb.

El uso de conformidad con ia reivindicación 1 ó 4, en donde CTLA4 soluble es una molécula de CTLA4 funcional la cual une o enlaza un antígeno B7 expresado en las células B activas.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la CTLA4 soluble es CTLA4Ig.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 1 6 4, en donde la molécula de CTLA4 soluble se une a una secuencia de proteína sin CTLA4.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la secuencia de proteína sin CTLA4 es una porción de Fe de una molécula de inmunoglobulina.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la célula es una célula conectiva.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la célula es una célula de tejido conectivo fibroso.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la célula es una célula sanguínea o de sangre .

22. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la célula es una célula muscular.

23. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, en donde la célula es una célula nerviosa.

24. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde la célula de la sangre es un eritrocito.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde la célula sanguínea es una célula sanguínea blanca.

26. Una construcción de vector caracterizada porque comprende un primer gen que codifica una proteína de interés y un segundo gen que codifica una molécula de CTLA4 soluble designada Ad/RSV-CTLA4Iq(mu)-BPA.

27. Una construcción de vector caracterizada porque comprende un primer gen que codifica una proteína de interés o un segundo gen que codifica una molécula de CTLA4 soluble designada Ad/RSV-CTLA4Ig (hu) - BPA.

28. El uso del vector de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, en una composición farmacéutica para el tratamiento de células defectivas, enfermas o dañadas, en un sujeto, que comprende administrar el vector de la reivindicación 26 ó 27 en las células del sujeto para producir moléculas funcionales en una cantidad suficiente para mejorar o aliviar las células aerecr-ivas, enfermas o aanaaas, en el sistema nervioso central .

29. Un método de conformidad con la reivindicación 2 ó 5, caracterizado porque el ligando antiCD40 es MRl.

30. Un constructo de vector, caracterizado porque comprende un primer gen que codifica para una proteína de interés y un segundo gen que codifica para la molécula CTLA4 soluble designada como Ad/RSV-CTLA4Ig (mu) -BPA.

31. Un constructo de vector, caracterizado porque comprende un primer gen que codifica para una proteína de interés y un segundo gen que codifica para la molécula CTLA4 soluble designada como Ad/RSV-CTLA4Ig (hu) -BPA.

32. Una composición farmacéutica para prolongar la expresión del gen de interés de una célula, en donde la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés, la composición se caracteriza porque comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de Ad/RSV-CTLA4Ig (mu) -BPA y un portador aceptable.

33. Una composición farmacéutica para prolongar la expresión del gen de interés de una célula, en donde la célula (a) incluye una secuencia de ácido nucleico recombinante para el gen de interés y (b) es capaz de expresar la proteína codificada por el gen de interés, la composición se caracteriza porque comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de Ad/RSV-CTLA4Ig(hu) -BPA y un portador aceptable.