JPH04506061A

JPH04506061A - Ｃｄ８に基づく製剤

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Publication number: JPH04506061A
Application number: JP2505247A
Authority: JP
Inventors: タイコシンスキー，マーク　エル．; カプラン，デイビッド　アール．
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-03-15
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1992-10-22
Also published as: EP0463080A4; AU5342290A; WO1990010385A1; EP0463080A1; US5623056A; CA2050346A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ８に基づく製斉１五立旦本発明は、都合の悪い免疫学的反応性をな（す必要のある患者、および細胞、組織および器官の移植物の生存を促進する必要のある患者を処置する為の免疫調節に関する。より詳細には、（：Ｄ８　（下記に定義する）およびその誘導体を、該治療目的を達するための免疫調節剤として使用することに関する。本発明はまた、ＣＤ８の新規に発見された阻害性のリガンド活性を、免疫系外の細胞の調節のために、より広範に治療上使用することに関する。

１１改歪ＣＤ８は、胸腺および末梢のＴリンパ球サブセットによって細胞表面結合型および可溶化型として産生される、糖タンパク質である。ＣＤ８陽性であることは、ウィルス感染、同種異系および他の細胞標的に対して夏型主要組織適合複合体（ＭＭＣ）に拘束された細胞障害作用を引き起こす、末梢の成熟Ｔりンパ球サブセットを定義する。本発明の開示以前に知られていたＣＤ８の機能は、このようなＣＤ８陽性細胞障害性Ｔリンパ球に対するこの分子の付属機能のみであった。

レセプター様および付着様活性を含む、この分子の付属機能に従って、ＣＤ８はＴ細胞活性化およびＴ細胞レセプター複合体を介する細胞障害作用を誘発する必然的な役割を果たす。

抗原認識により引き起こされる細胞障害作用に加えて、ＣＤ８陽性表現型を有するＴ　ＩＪンパ球は、免疫系での一連の調節活性を含む他のエフェクター機能を媒介することが知られている。このような細胞について記述された様々な免疫調節現象に対する分子的な説明は、長い間わからないままであった。本発明において我々は、ＣＤ８陽性リンパ球によって媒介される免疫調節活性において、ＣＤ８分子は重要な分子的決定基であることを開示する。このことは、ＣＤ８が阻害リガンドとして機能し得ること、さらに詳細には、ＣＤ８分子は、ある種の二次的な分子（以下「リガンド」と呼ぶ：下記参照のこと）によって同時に刺激される免疫細胞または他の細胞を阻害することを発見した結果である。続いて、ＣＤ８の阻害リガンド機能についての識見は、免疫細胞および非免疫細胞の調節のための製剤としてＣＤ８を使用することを可能にする。このように、本発明においては、特定の抗原に対する免疫反応の選択的抑制が必要とされる対象についての抗原特異的（以下「特異的」と呼ぶ）か免疫寛容化が、ＣＤ８またはその誘導体の薬学上の使用によって成し遂げられる。

ＣＤ８の阻害リガンド活性の発見は、ヒト造血細胞で本発明者らによってなされた遺伝子導入およびタンパク質工学の分野での最近の技術進歩により促進された。

現在、主として、付加的な物質に結合した特異的抗原の投与に関して集中している特異的免疫寛容療法は、あまり効果が無い。免疫抑制を必要とする移植、アレルギーおよび他の、ミ者のための治療には、最も一般的には、普遍的で非特異的な免疫抑制剤が使用される。Ｘ線照射、細胞障害薬、シクロスポリンＡ１　コルチフステロイド、および抗リンパ球血清を含むこれらの治療剤は、多様な免疫組織および非免疫組織を含む著しい副作用に苦しむ。さらに、臨床での移植の場合、その宿主中での生存を延長するために、インビトロで移植片を生化学的に変化させる効果的な方策は、記述されていない。

免疫調節の分野での限界は主に、天然に免疫調節を媒介する、分子的因子についての詳細な洞察に欠ける結果であった。

ＣＤ８の免疫調節分子としての重要な役割についての洞察によっテ初めて、インビボおよびインビトロで人工的な免疫調節を行う、化学的に定義され、クローン化された因子が提供された。そのクローン化形態での利用可能性は、治療に使用される有意な量の物質を提供し、活性を改善するためにプログラムされた修飾を行うための機会を与える。

本発明の目的の一つは、ＣＤ８組成物の使用を含む、選択的な免疫調節のための有効な方法を提供することである。

本発明の他の目的は、普遍的で非特異的な免疫抑制のためにＣＤ８組成物を使用する方法を提供することであり、この方法は現在の利用可能な方法に比べて副作用が少なく、現行の治療法よりも免疫系組織による特異的な標的化がなされる。

本発明のさらに他の目的は、免疫学的拒絶機構を回避し、それにより定着を促進する様式で、移植の前に移植片を生化学的に変化させる、ＣＤ８組成物の使用を含む方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、骨髄移植後の移植片対宿主疾患を防止するための、ＣＤ８組成大の使用を含む方法を提供することである。本発明のさらに池の目的は、非免疫細胞の選択的な調節のための、ＣＤ８組成物の使用を含む方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組換えＤＮＡ技術を使用することを含む、ＣＤ８を製造するための方法を提供することである。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の記載および請求の範囲を通して見い出される。

１豆旦皿丞本発明に従い、遺伝的に操作されたものを含む、膜結合性および可溶性のＣＤ８ペプチドを含む組成物、およびインビボおよびインビトロでの免疫調節と非免疫細胞の調節とに使用される方法が提供される。薬学的に活性なＣＤ８組成物は、ＣＤ８の阻害性のリガンド活性を特定の標的細胞に向ける役目をする１またはそれ以上の第２リガンドに結合された、天然のＣＤ８タンパク質か、または天然のＣＤ８のアミノ酸配列の充分な重複を有し、阻害リガンド活性を有し得るＣＤ８ペプチド誘導体を包含する。ＣＤ８ペプチドと第２リガンドとの間のこの結合は、単に共通の（細胞、リポソーム、プラナ−膜、擬細胞等の）生体膜に存在する結果としての非化学結合、あるいはＣＤ８：　リガンド複合体中の直鎖または分枝ポリペプチドキメラとしての結合である化学結合であり得る。

ＣＤ８ペプチドは、上記ＣＤ８ペプチドをコードする適当なりＮＡ配列を宿主細胞中に形質移入することにより、グリコイノシトールリン酸−修飾ＣＤ８ペプチド誘導体を外から細胞膜に組み込むことにより、またはリガンド成分に特異的な親和性を有する膜レセプターにＣＤ８：　リガンドポリペプチドを結合させることにより、細胞膜上に発現され得る。広範な一連のＣＤ８：　リガンドの組合せが使用可能であり、その各々は、ＣＤ８の調節活性が細胞の特定のサブセットを標的にすることを可能にする。本発明の、特に、特定のＴ細胞免疫寛容のために適用され得る好ましい実施態様は、天然のＣＤ８ペプチドまたは阻害性のリガンド活性を保持するＣＤ８ペプチド誘導体が、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質のペプチド誘導体に結合している、ＣＤ８組成物に関する。

確認された名義抗原ペプチド（ｎｏＩＩＩｉｎａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ；　ＮＡＰ）は、上記ＮＡＰ配列を含む親タンパク質に対し特異的な免疫寛容を誘導させるために、上記組成物のＭＭＣ成分に二次的に結合され得る。本発明の、特に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）関連のアレルギー性疾患を標的として適用され得る好ましい実施態様は、Ｆｃεレセプターを有する細胞をコートするのに使用され、ＣＤ８、または阻害性のリガンド活性を保持するＣＤ８ペプチド誘導体がＩｚＥ　Ｆｃドメインに化学結合した、可溶性ＣＤ８：　Ｆｃε複合体を包含する。本発明のさらに、他の好ましい実施態様、特に普遍的で非特異的な免疫抑制の為に適用され得る実施態様は、可溶性ＣＤ８：Ｆｃ複合体を包含する。ここでＣＤ８、または阻害性のリガンド活性を保持するＣＤ８ペプチド誘導体は、免疫グロブリン（非ＩｇＥ）に化学結合している。このＣＤ８：　Ｆｃ複合体は、Ｆｃレセプター（Ｆ　ｃ　Ｒ）を有する抗原提示細胞をコートするために使用され得、続いて、これらの細胞は非特異的な様式で免疫細胞を阻害するのに使用され得る。本発明のさらに他の好ましい実施態様、特に、移植受容者内での移植片の生存を延長するために適用され得る実施態様は、膜結合性ＣＤ８ペプチドが、移植受容者内の移植片定着を促進するために移植前に移植細胞をコートするのに使用される方法を包含する。本発明のさらに、好ましい他の実施態様、特に、骨髄移植に続（移植片対宿主疾患を防止するために適用される実施態様には、ＣＤ８ペプチドおよび移植受容者ハブロタイブに対応するＭＨＣペプチドを含む、またはＣＤ８：ＭＨＣ複合体を含む治療用生体膜調製物が、供与細胞集団の同種異系免疫細胞を阻害するために、移植前の骨髄細胞のインビトロでの処理に使用される方法が包含される。

発日を　するための　の５！Ｑ本発明は、免疫系の細胞を中心とした細胞の調節のための方法に向けられる。特異的な免疫調節と、普遍的で非特異的な免疫抑制とのための組成物および方法が、これらに限定されないが、移植ならびに自己免疫、過敏反応、アレルギーおよび他の免疫性疾患の臨床上の調節に適用され得る。

本発明は、米国特許出願第０７／３２３，７７０号および第０７／４２９，４０１号に我々が開示した、ＣＤ８分子が阻害性のリガンドとして機能し得、続いて免疫調節製剤としての新規な様式で治療に使用され得るという発見に基づく。

本発明者らは、既に、形質転換されていないクローン化ヒトＴ細胞中に、安定に遺伝子を移入する方法を開発した（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８Ｓ：４０１０−４０１４．１９８８）ｏ　この方法は、続いて、アンチセンス変異の最初の結合と、Ｔ細胞クローン化技術とを可能にした。初期の研究では、ＣＤ８のヌル変ｇのＴ細胞クローンのフェアタイプを作るためにＣＤ８が適用された時、この形質移入技術は、ＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔ細胞によって媒介される特異的活性化および障害のための、必須の付属分子として、ＣＤ８の機能を明確に表示し得る（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６８：１２３７−１２４５．１９８８）。我々の形質移入技術の他の副生成物、特にＣＤ８陰性のアンチセンス変異体を製造する能力の副生成物は、本発明に開示されているように、ＣＤ８陽性のＴ細胞により媒介される免疫調節について、ＣＤ８の既に予言されている役割に対する洞察である。

詳細には、我々は天然の、または遺伝子操作されたＣＤ８ペプチドが、他の場合、即ちＣＤ８ペプチドの非存在下では細胞活性化因子として機能する第２リガンドを、そのＣＤ８ペプチドが伴うときに、Ｔ細胞および他の細胞を阻害し得ることを確立した。例えば、Ｔ細胞の場合、第２リガンドは、同種異系ＭＨＣ分子、または自己ＭＨＣＦ分子を伴う特定の（プロセスされた）抗原であり得る。ＣＤ８の免疫調節活性は、様々なセンスおよびアンチセンスＣＤ８形質移入体と対照を用い、いくつかの型のインビトロ細胞増殖および細胞障害アッセイによって、我々のグループで実験的に評価されてきた。これらの研究のための細胞は、被検体ＪＨ（ＨＬＡ／・ロタイブ：　Ａ２，３；　Ｂ７，４４；　ＤＲ２，４）、ＤＫ　（ＨＬＡハロタイプＡ２，２４；　Ｂ１３，５０；　ＤＲ２，７）およびＭＷ（ＨＬＡハロタイプＡｌ、３１；　Ｂ８；　ＤＲ３）であった。我々の発見には、以下のことが含まれる：（ｉ）混合細胞培養中の、放射線照射された同種異系の刺激細胞に対して応答する細胞の増殖反応は、照射された刺激細胞上のＣＤ８の非存在に依存する。このような実験のひとつにおいて、ＤＫ由来の１０５個の応答性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、クローン化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞型ＪＨ，ＡＲＬ、１（ＪＨに由来し、ＨＬＡ−８３５に対する既知の同種異系特異性を有する）の２Ｘ１０’個の照射（５０００Ｒ）同種同型細胞、またはＪＨ，ＡＲＬ、１系に由来する２Ｘ１０４個の照射（５０００Ｒ）ＣＤ８陰性アンチセンスＣＤ８形質移入体を含む刺激細胞に、１０％胎児牛血清を用いたＲＰＭｌ　１６４０培地中の９６ウエルの平底マイクロタイタープレートの四つ組ウェル内で結合された。細胞は、３７℃で４から７日間共培養し、最後の１８時間は１μ Ｃｉの〔３Ｈ〕チミジンを各ウェルに加えて培養した。細胞を回収し、取り込まれた放射活性を計数した。増殖反応は、ＣＤ８陰性の刺激細胞に対しては全時点で観察されたが、ＣＤ８陽性の刺激細胞では観察されなかった。このことは、アンチセンスの代わりに、センスの性質移入による方法を用いて確かめられた。このような実験の一つにおいて、ＭＷ由来の１０Ｓ個の応答ＰＢＭＣが、２Ｘ　１０’個の照射（１５，０ＯＯＲ）非形質移入に５６２ヒト赤血球白血病細胞、または非関連の発現構築物で形質移入されたに５６２細胞を有する刺激細胞に結合された。

結合された両細胞は、上記増殖アッセイでＣＤ８陰性、または２Ｘ１０’個の照射（１５，０ＯＯＲ）センスＣＤ８　Ｋ５６２形質移入体（ＣＤ８陽性）である。再び、ＣＤ８陽性ではなく　ＣＤ８陰性のみの細胞が、増殖を刺激可能であった。

ＪＹ（ｈニドＥＢＶ−固定化Ｂ）またはＫＭ−１０２（ヒト５Ｖ−４０巨大ニー固定化骨髄ストロマ性）細胞をに５６２細胞の代わりに（非Ｔ細胞）刺激細胞として用いた時にも、同様の結果が得られ、このことはＣＤ８依存の阻害が普遍的であることを強（確立した。

（ｉｉ）照射同種異系刺激細胞に対する応答細胞の増殖反応、および同種異系標的細胞に対する細胞障害能は、もしも後者の細胞が応答細胞の認識する特異的同種異系抗原およびＣＤ８の両方を有しているならば、同時に第三群の細胞を添加することにより阻害され得、そしてこのように細胞は免疫抑制ｒｖｅｔｏ一様」の受容力で機能する（ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６：８５１２−８５１５．１９ｇ９；米国特許番号第０７／３２３．７７０号および第０７／４２９，４０１号の出願口に従って刊行された）。このような実験の一つにおいて、ＤＫ由来の１０５個の応答ＰＢＭＣが、ＣＤ８陽性またはＣＤ８陰性（アンチセンス）ＪＨ，ＡＲＬ、１形質移入体を含み、ＪＨから生じた様々なりローン化Ｔ細胞を推定阻害者として、ＪＨ白来の５Ｘ１０’個の照射（５０００Ｒ）刺激者ＰＢＭＣに結合された。増殖反応の阻害は、ＣＤ８陽性の第三群細胞についてのみ観察され、阻害の強さは１：５００およびｌ：５の阻害者：刺激音細胞比について、それぞれ３３％および７８％阻害であることが示された。結合ＪＨ応答者、ＤＫ刺激者、およびＪＨクローン化（ＣＤ８陽性）Ｔ細胞阻害者に対する阻害の無いことは、阻害が生じるためには応答者とＣＤ８陽性阻害者との間に特異的認識現象が必要であることを確立した。我々はさらに、ＭＲＬ培養物中で、細胞障害性Ｔ細胞の発生のＣＤ８依存性の阻害について示した。同種異系培養物を、２４ウエルプレートに、胎児牛血清を含有するＲＰＭ１１６４０の２ｍ１体積中に樹立した。ＭＷ由来の１０６個の応答者ＰＢＭＣ，ＪＨ由来の５Ｘ１０５個の照射（５０００Ｒ）刺激者Ｐ　ＢＭＣｌおよび１０５個の照射され（ＣＤ８陽性またはＣＤ８陰性アンチセンスフエノコピー）クローン化されたＪＨ，ＡＲＬ、１をウェルあたり添加した。３７℃で６日間インキュベーションした後、細胞を収穫し、ヒスドパ。

り密度勾配遠心分離により死細胞を除去した。［Ｓ　Ｉ　（ｒ　］　−遊離アッセイ（Ｃｅ１１．　Ｉ＋＋ａ＋ｕｎｏ１．８８：１９３−２０６．　１９８４）は、ＥＢＶ−形質転換ＪＨ（ＬＣＬ）８９７２球を標的として行った。

阻害は、ＣＤ８陽性の第三群細胞でのみ明らかであり、最大阻害は、これらの細胞を培養開始時または２日までに加えた時に得られた。阻害者としてＪＨ，ＡＲＬ、１１／ンバ細胞を用いたこれらの発見は、刺激者および阻害者としての非リンパ球に５６２細胞を用いて確立された。このような実験の一つにおいては、照射ＣＤ８陰性に５６２細胞またはＣＤ８陽性センスに５６２形質移入体を含む、ＪＨ由来の１０５個の応答者Ｐ　ＢＭＣ１５Ｘ１０’個の照射（２０，０ＯＯＲ）Ｋ５６２刺激者、および推定阻害者が用いられた。顕著なＣＤ８依存性の阻害が、わずか５Ｘ１０２個の阻害者で見られた。他の実験では、照射（１５，０ＯＯＲ）不死化ＪＹＢ細胞、または不死化ＫＭ−１０２ヒト骨髄ストロマ性細胞が、Ｋ５６２細胞の代わりに用いられ、同様の結果が得られた。

（ｉｉｉ）照射された同種異系刺激細胞に対する応答細胞の増殖反応は、照射か、あるいは代謝的に不活性化した第三群「免疫寛容原性の」細胞で応答細胞を前処理することにより、もしも後者の細胞がＣＤ８および応答細胞の認識する特異的な同種異系抗原を有するならば、プロ！りされ得る。このような実験の一つにおいては、ＪＨ由来の１０５個のＰＢＭＣ応答者が、固定された（空気乾燥され、リン酸緩衝生理食塩水中の２％バラホルムアルデヒドで３７°Ｃで２時間前処理シ、またはしない）ＣＤ８陽性またはＣＤ８陰性のに５６２またはヒト骨髄ストロマ性細胞形質移入体とともに２４時間、４連の９６ウエルプレート内で１０％胎児牛血清を補ったＲＰＭ１１６４０中でインキュベートした。このように前処理されＰＢＭＣを回収し、０．５μＣＬ／ウエルの［３Ｈ］チミジンの存在下で１８時間、ＣＤ８陰性の対同部分を用いて刺激し、　［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。データは、応答者のまさにその中に顕著な特異的ＣＤ８依存の寛容化を示し、このことはＣＤ８前処理およびＣＤ８陰性の刺激者による再刺激の間に２４時間の回収間隔が置かれた場合でさえも、明確であった。

従って、ＣＤ８による阻害は特異的な免疫寛容の誘導に使用され得る。さらに、上記と同様のアッセイは、ＣＤ８に媒介される阻害が、同種異系抗原でなく特異的抗原に対する免疫調節のためにも適用され得、さらに非免疫細胞（下記を参照のこと）のＣＤ８依存性調節の研究にも使用できることを示した。

さらに実験を行い、ＣＤ８リガンドそれ自身のための機能の必要要件が明らかにされた。ＣＤ８の２つの形態、即ちα工αホモダイマーとα：βヘテロダイマーとが、ヒトＴリンパ球表面に存在することが知られている。ＣＤ８α（以下「ＣＤ８Ｊと呼ぶ）はモノマーで阻害性リガンドとして機能し、従ってＣＤ８β鎖は阻害に必要ではない。ＣＤ８βは、天然の細胞構造の細胞表面上に効率よく発現されるためには、ＣＤ８αを必要とする。ＣＤ８ペプチドは免疫細胞それ自身に発現される必要はなく、従ってＴ細胞特異的因子はＣＤ８を介する阻害には必要でない。さらにまた、グリコイノントールリン脂質修飾ＣＤ８は、膜にアンカーとして結合゛している場合や、さらに固定化細胞にＣＤ８がアンカーとして結合している場合には、両方とも天然のＣＤ８分子の阻害能力を維持する。従って、ＣＤ８を介する阻害は応答（標的）細胞の生理的状態に依存するが、阻害細胞の生理的状態には依存しない。後者の指摘点は、リポソームまたは他の治療上の膜ビヒクルに結合した膜結合ＣＤ８誘導体、あるいは可能性ＣＤ８誘導体を包含する組成物を開発するための基礎を置く。

本発明に従うＣＤ８組成物の一つの実施態様は、ＣＤ８の完全な細胞外領域を包含する（プロセスされたヒトＣＤ８のアミノ酸１位（Ｓｅｒ）から１６０位（Ｃｙ　ｓ）を含む；ＣＤ８のコーディング配列については、Ｌｉｔｔｍａｎ、　Ｄ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１１４０：２３７−２４６．１９８５を参照）。もう一つのＣＤ８組成物は、例えばＣＤ８の免疫グロブリンＶホモログ領域に相当するような、ＣＤ８の細胞外領域内の機能ドメインを含む（プロセスされたヒトＣＤ８のアミノ酸１位（Ｓｅｔ）から１１４（Ａｌａ）を含む）。機能上活性な副成分を決めるために、ＣＤ８のようなタンパク質の分子を切り刻むための組換えＤＮＡ手段を用いたタンパク質工学手法は、当業者にはよく知られており、従って天然のＣＤ８タンパク質の阻害性のりガツト活性を保持する他のＣＤ８ペプチド機能ドメインを決めるのに使用できる。大きいブロックの欠失を介して生じるこのようなＣＤ８ペプチドドメイン誘導体の他、翻訳時に配列に組み込まれる欠失、付加または変換による一次構造そのものに対する多様な他の修飾がなされ得、ＣＤ８ペプチドの阻害性のリガンド活性を破壊する事なく様々な「変異体」が創造される。このような置換体または他の変換体は、ＣＤ８と実質的に同等なアミノ酸配列を有するペプチドを結果として生じ、これらは本発明の範囲内に含まれる。さらにまた、ここに提供される実施態様はヒトＣＤ８分子を中心とするが、池の高等を椎動物種が同様に操作され、その阻害性のリガンド活性を目的に免疫細胞および非免疫細胞の調節に使用され得る。これらもまた本発明の範囲内にある。

本発明に従うＣＤ８ペプチド組成物の他の実施態様は、ＣＤ８：リガンド複合体を包含する。ここでＣＤ８またはその機能的なペプチド誘導体が１またはそれ以上の第２リガンド分子に結合し、後者は細胞の特定のサブセットに対して特異的な標的付けを可能にし、同時刺激信号を与える。このような「二連のペプチドＣＤ８リガンド」の第２リガンド分子は、ペプチドまたは非ペプチド性の性質を有し得る。ペプチドリガンドの場合、ＣＤ８およ、び第２リガンドペプチドは、直鎖または分枝状のポリペプチドキメラとして結合し得る（下記参照）。さらに他のリガンド（第三、その他）が同様に結合され得、このような「多部分ＣＤ８リガンド」を用いることにより本発明の有効性が増大され得る。　さらに、膜結合または可溶性の形態が製造され得る。ＣＤ８：１，１ガント複合体の幾つかの例が以下に述べられ、これらは細胞調節のために製造され使用され得るこのようなＣＤ８に基づく複合体の型を説明する役割をするが、制限はしない。

ＣＤ８：　リガンド複合体の一つの例は、ＣＤ８：　ＭＨＣ複合体であり、ここでＣＤ８ペプチドは、Ｉ型またはＩＩ型ＭＨＣタンパク質またはその機能的なペプチド誘導体に化学結合している。機能的ＭＨＣタンパク質誘導体は、名義抗原ペプチド（ＮＡＰ）結合部位を構成するのに充分なドメインを含有し、合成ペプチドにその能力を保持する。多形の膜透過性αＨ鎖および非化学結合した非多形の非膜アンカーβ２−ミクログロブリンＬ鎖を含むＩ型ＭＨＣの場合、αＨ鎖の α、およびα２細胞外ドメインは、互いにＮＡＰ結合部位を構築する（Ｂｊｏｒｋｍａｎ、　Ｐ、　Ｊ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：　５０６−５１２．　１９８７）。非化学結合した多形の膜透過性αおよびβ鎖を含むＩＩ型ＭＨＣの場合、α鎖のα１ドメインおよびβ鎖のβ１ドメインはＮＡＰ結合部位を構築するのに充分である（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、　Ｈ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：　８４５−８５０．１９８８）、ＮＡＰは、複合体に抗原特異性を授けるためにＣＤ８：　ＭＨ（複合体と非共有または化学結合され得、特異的なＴ細胞の標的付けを可能にする。

ＣＤ８：　リガンド複合体の第二の例は、ＣＤ８：非プロセス抗原複合体である。ここでＣＤ８ペプチドは、プロセスされない抗原に化学結合しており、後者は特異的Ｂ細胞表面上の免疫グロブリンに対するリガンドを構成する。非プロセス抗原の例には、ペンジルフエニシロイル、インシュリン、卵白アルブミン、ラクトアルブミン、枯草花粉、サワギク花粉、サワギク抗原Ｅ１　木の花粉、）１チ毒およびノ１ウスダストダニ、および自己抗原のようなアレルゲンが含まれる。

このような複合体は、特異的Ｂ細胞の標的付けを可能とし、液性免疫反応での抗原非反応性および寛容を誘導する。

ＣＤ８：　リガンド複合体の第三の例は、ＣＤ８：　ＦＣ複合体である。ここでＣＤ８ペプチドは免疫グロブリン分子のＦｃドメインまたはその機能的なＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合する誘導体に化学結合している。免疫グロブリンの任意のイソタイプに対応するＦｃドメインがこの目的のために使用され得る。このような複合体は、Ｆｃレセプターを有する細胞の特定のクラスの標的付けを可能にする。続いてこれは、機能的見地から二つの目的の一つを与え得る。ある種のＦｃ結合細胞では、ＣＤ８：　Ｆｃ複合体によって阻害信号が変換される。阻害効果が無くても、ＣＤ８：　Ｆｃ複合体は表面レセプターに結合して、ＣＤ８により細胞表面をコートするために働く。続いてこれは、ＦｃＲ陽性抗原表現細胞を阻害細胞に変換するために働く。

ＣＤ８：’Ｊリガンド複合体第四の例は、ＣＤ８：　Ｆｖ複合体である。ここでＣＤ８ペプチドは免疫グロブリン分子の合成Ｆｖ（抗原結合）ドメインまたはＦｖ含宵ペプチドに化学結合している。Ｆｖ酸成分、Ｆｖ酸成分より結合した特異的な細胞表面結合分子のための特異性を授け、それにより、特異的細胞の標的付を可能にする。

ＣＤ８：　リガンド複合体の第五の例は、ＣＤ８：サイトカイン複合体であり、ここでＣＤ８ペプチドはペプチド性すイト力インに化学結合している。コロニー刺激因子、インターロイキンおよびホルモンを含む、一連の広範囲のサイトカインがこの目的のために使用可能である。このような複合体は、特異的なサイトカインレセブター結合細胞の標的付けを可能にする。

ＣＤ８：　リガンド複合体の第六の例は、ＣＤ８：　レクチン複合体であり、ここでＣＤ８ペプチドはレクチンに化学結合している。フンカナバリンＡおよびフィトヘマグルチニンを含む一連の広範囲のレクチンがこの目的のために使用可能である。このよう複合体は、確認されたレクチン反応性炭水化物特異性を表面上に有する特定の正常および形質転換細胞の標的付けを可能にする。

ＣＤ８：　１，１ガント複合体の第七の例は、ＣＤ８：抗１ｄｉ合体である。ここでＣＤ８ペプチドは第２リガンドの抗イデオタイブ（抗ｒｄ）部分に、以下にその一つを記載するように化学結合している。さらに抗１ｄは、以下に記載の任意のＣＤ８組成物中のＣＤ８模擬体として使用され得る。

ＣＤ８の配列のみ、またはペプチドに結合したＣＤ８配列、またはＣＤ８：　リガンド複合体中の非ペプチド性リガンドを含むＣＤ８ペプチドは、可能性または膜結合性であり得る。

コーディング配列は、位置特異的突然変異法を用いて、疎水性膜透過ドメインの上流に、ＣＤ８およびペプチドリガンドのコーディング配列中に翻訳終止コドンを導入することにより可溶性形態を創造するように遺伝子操作され得る。コーディング配列は、ＣＤ８のコーディング配列および蔦２ペプチドリガンドを、ｌ）膜透過タンパク質の疎水性伸長ペプチドをコードする配列、または２）細胞内のペプチドの直接的グリコイノントールリン脂質修飾であるコーディング配列＋＝　結合、または結合を保存することにより膜結合形態を創造するように遺伝子操作することができる。グリコイノントールリン脂質修飾されたＣＤ８ペプチドは、本発明に従い膜結合性ＣＤ８ペプチドの好ましい実施態様を表現する。生体膜に外から加えられた場合、それが容易に取り込まれ得るからである。

本発明に従うグリコイノシトールリン脂質修飾されたタンパク質中間体およびＣＤ８：’Ｊガント複合体の形態の直鎖ポれ得る。キメラの転写カモ１トは、制限エンドヌクレアーゼ部位重複またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく重複による継合せ伸長を用いて構築され得る（Ｈｏｒｔｏｎ、　Ｒ，ら、Ｇｅｎｅ、　７７：６１−６１３．１９８９）。（ｉ）グリコイノシトールリン脂質修飾されたペプチドを製造するために、目的のペプチドのコーディング配列は、天然に退化促進因子（ＤＡＦ）のようなグリコイノントールリン脂質修飾が行われるタンパク質の３′末端のコーディング配列にインフレームで結合される。このようにして製造された牛メラタンパク質は、細胞内でグリコイノシトールリン脂質による修飾を受ける。このグリコイノシトールリン脂質修飾過程は、本発明の発明者の一人により発見され、ＣＤ８に最初に適用された（Ｔｙｋｏｃｉｎｓｋｉ、　Ｍ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１１．ｓ、Ａ、　８５：３５５５−３５５９．１９８８）：平行した実験で、この過程は独立にＣＤ８以外のレセプターペプチドに適用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１２８０−１２８３．１９８７）。ホスホリパーゼ開裂のような生物学的特性の異なるグリコイノシトールリン脂質膜アンカーの様々な型が、特定の宿主細胞に指令される詳細な化学組成（即ち脂肪酸および炭水化物残基ユニ。

トの数）とともに現在知られている。このように、修飾されたＣＤ８ペプチド中のグリコイノシトールリン脂質部分の性質は、ＤＮＡ配列キメラにより形質移入される宿主細胞の適当な選択を通じて決定され得る。（ｉｆ）ＣＤ８：　リガンド複合体の製造のためには、ＣＤ８ペプチドのＤＮＡコ〜ディンク配列、好適なリンカ−ペプチド、およびリガンドペプチドが直線上にインフレームで結合される。キメラの遺伝子転写カセットのためのプロモーター、ベクターおよび宿主の選択は、キメラのタンパク質に導入される翻訳後の修飾の性質および製造されるタンパク質の量に指令される。例えば、バクロウィルスのプロモーターおよびベクターが、グリコ／ル化ＣＤ８組成物を大量に製造するために昆虫宿主細胞中で使用され得る。

種々の組換、ｔＤＮＡ配列が、グリコイノシトールリン脂質修飾され、および可溶性ＣＤ８ペプチドを作るために構築された。これらのＤＮＡ構築物の開始物質は、ヒトＣＤ８　（ヌクレオチド配列はＣｅ１ｌ　４０：２３７−２４６．１９８５；　ＡＴＣＣ寄託番号５９５６５を参Ｍ＞、ヒトＤＡＦ（ヌクレオチド配列はＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　８４：２００７−２０１１．１９８７を参照）、Ａ　２　ハ０タイプのヒト■型ＭＨＣαＨ鎖（ヌクレオチド配列はＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：２７２７−２７３３．１９８５を参照）、ヒトＧＭ　− ＣＳ　Ｆ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８：８１０．１９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：４３６０゜１９８５、　ＡＴＣＣ寄託番号３９７５４．５７５９５および５９１７１）、ヒトＩｇＧＩＨ鎖γ１　（ヌクレオチド配列はＮｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：４０７１− ４０７９．１９８２を参照）、およびヒトＩｇＥＨ鎖ε（ヌクレオチド配列はＣｅ１ｌ　２９：６９１−６９９．１９８２を参照）について得られたｃＤＮＡクローンか、または逆転写ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ由来のＰＣＲクローン化された特異的ｍＲＮＡである。ＣＤ８ペプチドの例には、制限されないが、以下のものが含まれる＝（ｉ）制限エンドヌクレアーゼを基礎とする方法により、ＣＤ８の完全な細胞外ドメイン（ａｓｐ　１６１まで）を含むグリコイノントールリン脂質修飾ＣＤ８ペプチドの製造。詳細には、ＤＡＦ　ｃＤＮＡの３′末端をＡｖａｌＩ部位（ヌクレオチド位置８５８）で切断し、この部位はクレノー断片で満たされて平滑化され、ＥｃｏＲＶ部位で切断されたＣＤ８コーディング断片をＤＡＦの平滑化されたＡｖａＩＩ部位に平滑末端ライゲートする。これにより、細胞内でグリコイノシトールリン脂質修飾を受けるＣＤ８：　ＤＡＦキメラが創造される（Ｔｙｋｏｃｉｎｓｋｉ、　Ｍ、　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：３５５５−３５５９．１９８８）。

（ｉｉ）重複によるスプライス伸長法による、ＣＤ８の免疫グロブリン■−相同ドメイン（ａｌａ　１１４まで）を含むグソコイ／シトールソン脂質修飾ＣＤ８ペプチドの製造。詳細には、ＣＤ８配列（ヌクレオチド配列位置３１〜４７０）をオリゴヌクレオチドブライマーａ　［５’　−ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣ−３′コおよびｂ［５°　−ＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧ−３’　］を用いてＰＣＲ増幅（９４℃で変性２分；５０℃でアニーリング２分；７２°Ｃでポリメライズ２分；　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒｓ−Ｃｅｔｕｓ、Ｉｎｃ、　ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ−Ａｍｐ　ｋｉｔを使用）し、ＤＡＦ配列（ヌクレオチド位置８５９〜２００８；ｖａｌ　２５８から開始）をオリゴヌクレオチドプライマーｃ　［５’　−ＣＡＧＣＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＴ−３’　コおよびｄ　［５’　−ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴ−３’　］を用いてＰＣＲ増幅させる。ブライ７−　ａは５′末端にＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、およびＸｈＯＩを加え、プライマーｂは３°末端にＨｉｎｄＩＩＩ、ｘｈｏ　１部位および５ａｃＩ部位を加える。プライマーｂおよびＣは各々ＣＤ８およびＤＡＦ配列の両者を架橋し、それらの５′末端で互いに相捕的である。従って、個別のＣＤ８およびＤＡＦのＰＣＲ産物は、１：　１００に希釈された場合、結合され、変性され、再アニールされてキメラのＣＤ８：　ＤＡＦ分子を生成し、これは次にａおよびｄプライマーを用いてＰＣＲ増幅（９４°Ｃ１２’／３７°Ｃ１２’ ／７２°Ｃ１２′１０サイクル；９４℃、２’７５０℃、２’／７２℃、２°次の２０サイクル）される。ＣＤ８：　ＤＡＦキメラをゲル精製し、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで末端消化し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ真核生物クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）のＨｉｎｄＩ　Ｉ　１部位にライゲートする。キメラのＣＤ８：　ＤＡＦ遺伝子の他の翻訳で、ＤＡＦの膜近隣の０グリコジル化領域のコーディング配列が省略されているものは、プライ？−ｅ　［５’　−ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣ−３“コおよびｆ　［５’　−ＣＡＧＣＧＣＣＡＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＴ−３’　］の代わりにそれぞれプライマーｂおよびＣを用いて製造される。ｆおよびｇプライマー対ＰＣＲは、ヌクレオチド位置１０１８〜２００８　（ｐｒｏ　３１１から開始）に伸びるＤＡＦ配列を増幅する。

（ｆｉｔ）　Ｐ　ＣＲニ基づく位置特異的突然変異法（Ｈｏ、　Ｓ、　Ｎ、ら、　Ｇｅｎｅ　７７：５Ｌ−５９，１９８９）による、ＣＤ８の■相同ドメインを含む可溶性ＣＤ８ペプチドの製造。詳細には、ＣＤ８配列（ヌクレオチド位置３１〜４７０に伸びる）を、オリゴヌクレオチドプライ？−３（前記）およびｇ　［５’　−ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＧＧ−３’　］を用いてＰＣＲ増幅する。ｇプライマーはａ１ａｌ１４のすぐ下流に終止コドンを挿入し、５ａｃＩ、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩ１１部位を３′末端に付加する。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクター内にライゲートする。

（ｉｖ）重複によるスプライス伸長法により、Ａ２／＼プロタイプのＩ型αＨ鎖およびＣＤ８の両方の完全な細胞外ドメインを含む可溶性ＣＤ８＋　ＭＨＣ複合体の製造。詳細には、好適な相補重複配列を有するプライマーは、最小二次構造を有するリンカ−ペプチドであるＡ２１型αＨ鎖（ｔｒｐ　２７４まで）のＣ１ −Ｃ２−Ｃ３細胞外多重ドメインユニットＰＣＲのコーディング配列を、ＣＤ８の細胞外ドメイン（ａｓｐ　１６１まで）にインフレームで結合させ、またはＰＣＲ増幅するために使用され得る。リンカ−ペプチドは反復コニ、ト（Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ）３を含み、オリゴヌクレオチド合成機（ＰＣＲ−Ｍａ　ｔ　ｅ、Ａｐｐ　１　ｉ　ｅ　ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）により製造された相補オリゴヌクレオチドから作成される。遺伝子操作されたＩ型β２ミクログロブリンは、■型α鎖に二次的に付随し得る。あるいは、Ｃ１− Ｃ２−Ｃ３の代わりにαｌ−α２（ｔｈｒ　ｌ　８２まで）のＭＭＣ多ｆＥドメインユニットが、このような複合体中に組み込まれ得る。これらの直鎖ポリペプチドキメラのそれぞれのアミノ末端にＣ１−α２ＭＨＣ多重ドメインユニットを置くことにより、成分α１およびα２ユニツトを天然状態のように折畳んで、抗原結合ポケットを構築することができる。

（Ｖ）重複によるスプライス伸長法による、ＣＤ８の完全な細胞外領域（ａｓｐ　１６１まで）および完全なＧＭ−ＣＳＦ（ｇｌｕ　１２７まで）を含む可溶性ＣＤ８：　ＧＭ−ＣＳＦ複合体の製造。ＣＤ８：　ＭＨＣ複合体のために使用されるのと同様の方法が使用され、可撓性リンカ−ペプチドであるＧＭ−ＣＳＦのコーディング配列がＣＤ８の細胞外領域に結合される。ＧＭ−ＣＳＦレセプターの結合能は、このキメラに保持されている。

（ｖｉ）重複によるスプライス伸長法による、ヒトＣＤ８　（ａｓｐ　１６１まで）の完全な細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖（γ１）のＦｃ領域とを含む可溶性ＣＤ８：　Ｆｃγ１複合体の製造。このＣＤ８：　Ｆｃ複合体は、前記に詳しく説明したＣＤ８：ＭＨＣおよびＣＤ８：　ＧＭ−ＣＳＦ複合体とは２つの点で異なる：　１）このＣＤ８ニ　リガンド複合体はキメラタンパク質の７ミノ末端の位置にＣＤ８成分を有する；および、２）このＣＤ８：　リガンド複合体のＣＤ８およびリガンド成分は、リンカ−ペプチドの介在無しに互いに連結している。好適な相補重複する配列を有するプライマーが、ＣＤ８の完全な細胞外ドメイン、およびａｌａ　１１４に始まるＣＨＩ・ＣＨ２・ＣＨ３多重ドメインユニットを含むヒトγＩＨ鎖の完全な定常領域のコーディング配列を、ＰＣＲ増幅およびインフレームで挿入結合するのに使用される。詳細には、ＣＤ８配列（ヌクレオチド位置３１〜６１１に伸びる）をブライｖ　−ａおよびｈ　［：５’ 　−ＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧ−３’　］を用いて、またγ１配列をプライマーｉ　［５’　−ＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴ−３’　Ｅおよび」　Ｃ５’　−ＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＧＡＣＣＧ−３’コを用いてＰＣＲ増幅する。このＣＤ８：　ＦＣ複合体は、ジスルフィド結合したポリペプチドキメラニ量体のＦｃドメインのプロティンＡに結合する能力が保持されているため、スタフィロコッカスプロティンＡのセファロースクロマトグラフィーにより単離し得る。同様の様式で、可溶性ＣＤ８：　Ｆｃｓ複合体は、ヒトＩｇＥのＣＨｌ・ＣＨ２・ＣＨ３・Ｃ）１４を取込んで構築される。詳細には、ＣＤ８断片（ヌクレオチド位置３１〜６１１に伸び、ａｓｐ　１６１に終わる）がブライｖ　− ａおよびｋ　［５’　−ＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧ−３″］を用いてＰＣＲ増幅され、ε（ヌクレオチド位置９８〜１８４７に伸び、ａｌａ　１１４に始まる）がプライマー１　［５’　−ＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣ−３’コおよびｍ　［５’　−ＧＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴ−３’コを用いてＰＣＲ増幅される。

ＣＤ８：　リガンド複合体の形態の分枝したポリペプチドキメラが、鋳型に伴う合成ペプチド（ＴＡ　Ｓ　Ｐ）法により容易に製造され得る（Ｍｕｔｔｅｒ、　Ｍ、、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１３：２６０−２６５．１９８８）、この方法によりペプチドユニットが個別に合成され、化学結合剤を用いてコアペプチドのような多官能キャリアーに共有結合される。例えば、２つの対向平行βシート断片（Ｉ　ｙｓ−ａ　ｌ　ａ−１ｙｓ）が２つのβターンによって結合している、デラミ／ジンＳの環状デカペプチドアナログが、コアペプチドとして使用され得る。断片の濃縮法が、４個のｔｙｓ側鎖のεアミノ基にＣＤ８および二次リガンドペプチドを付けるために使用され得る。あるいは、ＣＤ８およびリガンド成分は、化学架橋剤を用いて分枝構造になるように、互いに直接共有結合され得る。この方法により、例えば、ＣＤ８およびＦｃ二量体が直接結合され得る。直鎖に対して分枝したポリペプチドキメラは、ＣＤ８とリガンドとの比率の異なる多価ＣＤ８：！Ｊガント複合体く下記参照）を提供するのに特に適している。

前記の様々なＣＤ８組成物の生物学的な単離を促進するため、ＣＤ８ペプチドの一次アミノ酸配列、あるいはＣＤ８：リガンド複合体の特別な場合にはＣＤ８またはりガントペプチドの何れかの一次アミノ酸配列が、遺伝子操作法により変換され得る。特に有用な変換は、２またはそれ以上の隣接するヒスチジン残基の挿入である。この挿入は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に入れることができる。さらに、ＣＤ８：　リガンド直鎖ペプチドキメラについても、ヒスチジンをリンカ−ペプチドに挿入し得、ＣＤ８：　リガンド分枝ポリペプチドキメラについても、ヒスチジンがコアペプチドに挿入され得る。ヒスチジン残１の挿入は、ヒスチジンをコードするＣＡＴおよびＣＡＣ三組コドンをコーディング配列中の適当な位置でＰＣＲプライマーに組み入れることによる、重複によるスプライス伸長法により、容易に行うことができる。ヒスチジン修飾されたタンパク質は、ニッケルーセファロースクロマトグラフにより効率よ（量的に単離され得る。ヒスチジン−ニッケル相互作用はプロトン化を基礎とし、従ってこの相互作用は、単にｐＨをシフトすることにより、ペプチド溶離の目的で逆転し得る。

形質転換または形質移入宿主細胞からの生物学的な単離を促進するために設計されるＣＤ８ペプチドの、他の一次アミノ酸配列の変換は、疎水性伸長ペプチドを通常該ペプチドのカルボキシ末端に付加することである。与えられた伸長ペプチドに対して特異性を有する抗体は、複雑なペプチド混合物からＣＤ８ペプチドを効率よく精製するための免疫アフィニティー剤として使用され得る。好適な親水性伸長ペプチドは、コアＣＤ８ペプチドから外に突き出した最小の二次構造をとり、そして穏やかな蛋白分解消化の後、抗体に基づく精製法によりＣＤ８ペプチドから容易に開裂され得る。特異的な化学結合剤により反応性アミノ酸の挿入のような、他の一次配列の修飾もまた行い得る。

あるいは、より一般的には、免疫アフィニティーに基づ（（即ち抗ＣＤ８−次抗体）、かなり非効率的な生物学的単離法が使用され得る。

本願に記載の種々の膜結合性および可溶性ＣＤ８およびＣＤ８：リガンドペプチドは、現行の組換えＤＮＡ技術を用１．Ｘで容易に大量に製造し得る。ＤＮＡ配列の操作およびこれを細胞中に導入する技術、ならびに組換えペプチドの量的な製造に適当な、染色体に組み込まれまたは染色体外複製するＤＮＡ発現手段と原核または真核宿主細胞との組合せは、当該分野でよく知られており（例えば、米国特許第４，６７７゜０６３号、第４，６７７、　１９５号、第４，７０３，００８号、第４，７２７．　１３８号、第４，８３３．　１２７号、第４．８４７，２０１号、第４．’８５３，３３０号参照）、薬学的目的のために組換えＣＤ８の大規模の製造に容易に適用できる。

本発明に従うＣＤ８組成物の他の実施態様は、ＣＤ８　（および第二リガンド）またはＣＤ８：　リガンドペプチドでコートされた生体膜を包含する。これらの生体膜は、制限されないが、細胞、リポソーム、平面膜または疑似細胞の形態であり得る（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｓ、　Ａ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：３３８３−３３９２゜１９８６）。あるいは、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のような天然にＣＤ８を有する細胞、またはＣＤ８を有するように遺伝子操作および／またはコートされた細胞が使用され得る。血液コンパートメント中の細胞を調節するための治療剤として特に好ましい細胞形態は、オートまたはへテロの血液型適合する、ＣＤ８ペプチドでコートされた赤血球である。リポソームの薬学上の目的での適用は、米国特許出願中にさらに記載されている。本発明に記載のＣＤ８でコートされたリポソームは、特定の細胞に標的付けるためにサイトカインおよびトキシンのような有機および無機の成分を、さらに内部に負荷され得る。グリコイノシトールリン脂質修飾されたＣＤ８ペプチドは、生体膜をコートするのに使用するための、本発明に従う好ましい膜結合ＣＤ８組成物である。なぜなら、このように修飾された該ペプチドは、膜溶解させない程度の低ａ度の界面活性剤存在下で容易に膜中に組み入れられ得るからである。

遊離細胞および組織マトリックス中にある細胞の両者がグリコイノシトールリン脂質修飾されたＣＤ８ペプチドによってコートされ得る。他の膜結合性ＣＤ８組成物は、ＣＤ８二ＦｃｖＩｔ合体であり、これはＦｃレセプターを有する細胞の効率的なコート化を可能にする。他のコーティング方法は、ＣＤ８ペプチドを生体膜に結合するための架橋剤の使用を必然的に伴う。ペプチドをリポソームに化学結合するための様々な方法が開示されている（例えば米国特許第４，５６５，６９６号および第４，７６２，９１５号を参照）。ＣＤ８ペプチドでコートされた細胞を製造するさらに他の手段は、遺伝子形質移入技術を用いることによる。

これらのコーティング方法の何れかによって、ＣＤ８ペプチドの生物学的活性を促進するために多くの他の分子が生体膜に加えられ得る。以下に記載の様々な無細胞性の治療用生体膜調製物は、脱水された形態で貯蔵され、薬学的使用のためのキｙ）に包装され得る。

本発明に従うＣＤ８組成物の他の実施態様には、天然のＣＤ８ペプチドの阻害性のリガンド活性を保持しないが、天然のレセプターに対する天然ＣＤ８の結合を完全に阻害し得る短いＣＤ８ペプチドが包含される。このような短いＣＤ８ペプチドは、天然ＣＤ８に依存する免疫調節をプロ！りする非特異的な免疫促進剤として使用され得る。ＣＤ８のような特定のペプチドに対する短いペプチド阻害剤を設計するための一般的方法は、当業者によ（知られている。

本発明に従うＣＤ８に媒介される治療方法の一つの実施態様は、インビボまたはインビトロで特定の細胞を阻害するための本発明に開示されたＣＤ８ペプチドの使用が包含される。

この方法は、特定の免疫寛容化の目的のために特別な適用可能性があり、天然の免疫調節におけるＣＤ８の中心的役割についての新規な発見に由来する。ＣＤ８に媒介される阻害効果は、通常ＣＤ８非存在下で細胞の活性化に寄与する分子信号が、同時に表現されることを条件とする。この策二の信号は、ＣＤ８と同じ生体膜に存在することによりＣＤ８に非化学結合で付随し、または人工的なＣＤ８：！Ｊガント複合体中にＣＤ８と化学結合する第二の分子により提供される。第二の非化学結合または化学結合したリガンドは、阻害するべき標的細胞の性質を指定する。特異的なＴ細胞が、同種異系ＭＨＣまたはＭＨＣ：　Ｎ　Ａ　Ｐ複合体を伴うＣＤ８によって阻害され得る他の特定の標的細胞が、他の前記のＣＤ８：’Ｊガント組合せの使用により選択的に阻害され得る。阻害するべき標的細胞の処理は、患者に細胞集団を分散させる前にインビトロで、またはインビボでＣＤ８組成物を患者に直播投与することであり得る。

移植の後の移植片の免疫学的拒絶を防止するためＣＤ８に媒介される免疫調節治療法の例として、移植供与者の同種異系ＭＨＣポリペプチドについて予想される移植受容者で引き起こされる寛容を起こし得る一連の工程は、以下の通りであ（ｉ）グリコイノシトールリン脂質修飾されたペプチド誘導体ヒトｃＤ８、特異的供与者同種クラスＩＭＨＣαＨ鎖および特異的供与者同種クラスＩＩＭＨＣαおよびβ鎖の製造のため、キメラの遺伝子構築物がブルースクリプトクローニングベクター中に組み込まれる。各々の場合、各々の細胞外ドメインのコーディング配列は、３′末端ＤＡＦコーディング配列にインフレームで結合され、後者は細胞内のグリコイノシトールリン脂質修飾プロセスを指令する信号を包含する。

さらに、非多型のクラスＩＭＨＣβ２ミクログロブリンＬ鎖の完全なコーディング配列がブルースクリプトクローニングベクターにサブクローンされる。ＰＣＲに基づく重複によるスプライス伸長法が上記の様に使用され、これらの遺伝的構築物が組み込まれ、ペプチド：ＤＡＦ結合およびβ２ミクログロブリンの３“末端に４つの隣接するヒスチジン残基を挿入するように設計されたプライマーが使用される。

（１１）これらのコーディング配列が、ブルースクリプトクローニングベクターから、このベクターの多重クローニング部位内のフランキング制限エンドヌクレアーゼ部位により可動化され、各々はバクロウィルス発現ベク９−ｐＶＬ１３９２（Ｄｒ、　Ｍａｘ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得る）中に挿入される。この発現ベクターはそれ自身の翻訳開始信号を含有する遺伝子カセソｈのために好適である。

（ｉｉｉ）　タンパク質発現のための組換えウィルスを製造するために、２ｕｇの各発現構築物をＳ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ（Ｓｆ）９細胞に、Ｌ　１ｔ　ｇＡｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ペリヘドロシスウィルスＤＮＡと組み合わせて同時形質移入する。形質移入後４日までに、５０％以下の細胞が核にウィルスを取り込み、ウィルス価は約１０７ｐｆｕ／ｍｌであった。組換えウィルスはウィルスプラークの５％までを占めた。ウィルス組換え体の精製は、３回のプラーク精製により行う。

（ｉｖ）プラーク精製された組換えウィルスで感染されたＳｆ９細胞の核群を収穫し、５０μｇ　／　ｍ　ｌの合成エラスターゼ阻害剤Ｓｕｃ　（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−ＭＣＡ　（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）と１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水中の１％ＮＦ−４０で溶解する。各表面活性剤溶解物を５ｍｌのニッケルセファロースカラムに通し、この場合、高濃度で各過剰発現ペプチドを含むポリペプチド混合物はｐＨシフトニヨリニッケルセファロースマトリ／クスから溶離する。

かのように製造されたペプチドは、さらに調製され、キットに詰められ得る。

（Ｖ）グリコイノシトールリン脂質修飾されたＣＤ８、クラスＩα、クラスＩＩ α、クラスＩＩβおよび非修飾クラスＩβ２ミクログロブリンでコートされた多層リポソームは、界面活性剤透析方法により調製される（例えば、Ｍｉｌｓｍａｎｎ、　Ｍ、、ら、Ｂｉｏｃｈｆｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５１２：１４７．１９７８参照）。ここで混合物は卵レシチン、コレステロール、ジアセチルリン酸およびグリコイノントールリン脂質修飾されたペプチドを、２：１゜５：　ｏ、２：　ｏ、ｏｔの分子比で含んで調製される。混合物を、１％コール酸ナトリウムを含有するクロロホルム：メタノール溶液（２：　１）に溶解し、この脂質−界面活性剤混合物を次に、丸底フラスコ中でロータリーエバボレートして薄い乾燥膜を沈着させる。脂質膜をリン酸緩衝生理食塩水（０゜ＬＭ、ｐＨ７，３）に再溶解すると、自然にリポソームが形成される。界面活性剤および過剰の薬剤は、０．０５Ｍト’Ｊス、ｐＨ７，８に対して数回交換して透析することにより除去され、これらのペプチドコートされたリポソームの最終濃度は、この緩衝液のリン脂質含有量が１２μｍｏｌ／Ｌとなるように合わせる。広範な一連の米国特許比願に、ジアセチルリン酸以外に様々な合成レクチン、修飾コレステロールおよび陰性荷電分子を組み入れた他のリポソーム組成物、ならびに該リポソーム組成物を調製する方法が記載されており、これらは容易にＣＤ８コートされたリポソームの調製に適用され得る。リポソーム構成物の元の混合物にグリコイノシトールリン脂質修飾されたペプチドを添加する他の方法は、該ペプチドを形成されたリポソーム中に、０．００３％ＮＰ−４０の存在下で二次的に組み入れる。これらのペプチドコートされたリポソームは、脱水状態で貯蔵され、キットに詰められ（例えば米国特許第４７４６５１６号及び第４７６６０４６号参照）または直接免疫調節に使用される。

（ｖｉ）移植を行った患者は、予想される移植受容者の血に由来する末梢血単核細胞により、供与者同種ＭＨＣの同種反応性について評価される。そして、応答者としてこれらの受容者ＰＢＭＣ１刺激者として照射（５０００Ｒ）供与者ＰＢＭＣを用いて、混合リンパ球反応（Ｍ　Ｌ　Ｒ）が設立される。もしも有意な増殖反応が示されたら、供与者同種ＭＭＣに対応するペプチドコートされたリポソームを含む、薬学的組成物が、計画された移植手順の６〜８週間前に静脈内注射される。

（ｖｉｉ）　移Ｗ１ヨの３〜４週間前に、インビトロＭＬＲアッセイが反復され、もしも受容者の応答者と供与者の刺激者との間で残りの増殖反応が確執するならば、コートされたリポソーム調製物が再注射される。

（ｖｉｉｉ）移植定着をさらに促進するため、移植前に、移植片の細胞がＣＤ８でコートされる（下記参照）。

（ｉｘ）ＭＬＲアッセイが移植後６月ごとに反復され、ＣＤ８組成物のブースター量が必要に応じて計画的に投与される。

予想される移植受容者の免疫調節法の特定の例に関して注目されるのは、以下のことである：　１）ポリメラーゼ連鎖反応法は、今では、ヒト集団に存在する一連の同種ＭＭＣの迅速なりローニングを可能にする。そしてこの方法はさらに迅速なＭ　ＨＣ−Ｄ　Ａ　Ｆ遺伝子のキメラの集合を提供する。２）ＭＨＣおよび他のポリペプチドのプロセスされたペプチドを発現する名義抗原ペプチド（ＮＡＰ）がリポソームに、またはＣＤ８と自己ＭＨＣとを含む他の治療用生体膜調製物に、同種異系および他の抗原の両者の免疫調節のために添加され得る。この方法により、広範な自己免疫、アレルギー、および望まれない特定Ｔ細胞の免疫反応のある他のヒト疾病の治療が可能になる。３）個別のＣＤ８および同種Ｍ　ＨＣペプチドでコートされたリポソームを使用する以外に（または他の治療用生体膜調製物）、ＣＤ８：　ＭＨＣ（化学結合）複合体または可溶性ＣＤ８：　ＭＨＣ（化学結合）複合体が、予測される移植受容者に投与され得る。

ＣＤ８を介する免疫調節治療方法の別の例としては、自己免疫病の予防または治療において、自己抗原への免疫寛容を減少させるために行われ得る一連の工程は以下の通りである。

（ｉ）単球／マクロファージなどの抗原の進行および発現が可能な自家移植細胞を患者から得る。

（ｉｉ）これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）にインビトロにおいてＣＤ８ペプチドをコートする。これは、グリコイノ／トールリン脂質修飾されたＣＤ８ペプチド、またはＡＰＣのＦｃレセプターに結合する適切なＣＤ８：　Ｆｃ廣会合体含むＣＤ８の薬学的組成物を使用して容易に達成され得る。

（ｉｉｉ）精製ペプチド、または自己免疫゛反応の標的を含む複合ペプチド混合物をＣＤ８コートされたＡＰＣに添加し、プロセスする時間をおいて細胞を患者に注入する。この処置を一定の間隔で繰り返す。

自己免疫のためのこの治療法により、既知の標的組織からの、未プロセス抗原を含む初期の細胞抽出物でさえもＡＰＣに添加し得るため、どのペプチドが自己免疫攻撃の重要な標的であるかを予め正確に知る必要がなくなる。または、特定の病気に対して正確なペプチド標的が実際に知られている場合には（例えば、ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ　ｇｒａｖｉｓにおけるアセチルコリンレセプター、ハシモトのｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓにおけるチログロブリン）、未プロセス抗原を含む精製ペプチドをＡＰＣに添加し得る。

さらに、機能的に関連したプロセスされたペプチドが限定されている場合には、これらのペプチドを合成し、抗原発現が可能なＣＤ８陽性細胞に添加し得る。

ＣＤ８および可溶ＣＤ８：　リガンド複合体におけるソガンド成分の有効サブユニット価は、標的細胞に働（生物学的効力の強さを示す。１つ以上のＣＤ８ペプチドサブユニットおよび／または１つ以上のりガントサブユニットが各複合体分子に化学結合する多価複合体は、膜結合多分子ＣＤ８：ＩＪガント結合体の機能的に等個物である。これに対して、１つのＣＤ８ペプチドサブユニ２１−および１つのりガントサブユニットが各複合体分子に化学結合する単価複合体は、いくつかの事例においては、効力が低下する。サブユニット価を限定して特定のＣＤ８：　リガンド複合体のインビボ効力を予測するために使用され得る、混合リンパ球培養およびコロニー形成アッセイなどのインビトロによる細胞アッセイは、当業者には既知のものである。さらに、特定のＣＤ８組成物の作用のインビボにおける評価は、適切な実験用動物にて実行され得る。例えば、ヒトのＣＤ８組成物の研究は、成熟したヒト免疫細胞と腹腔内にて再組成された重症結合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のマウスにおいて行われ得る。

本発明によるＣＤ８を介する免疫調節の別の実施態様は、−級化した不特定の免疫抑制に対してＣＤ８：　Ｆｃ複合体を使用することを含む。これらの複合体は、溶解した状態で、免疫グロブリンアイソタイプに特異的な様式で、様々なＦｃＲ保持細胞上の（ＦｃＲ）に結合する。表面にＦｃＲを保持する１組の細胞である抗原提示細胞は、この方法によりＣＤ８をコートされ得、続いて、これらの細胞の抗原特異的な活性化機能が、これにより抗原特有の抑制機能に転化され得る。

これは実際には、すべての抗原提示細胞依存性の免疫反応を一般的な方法で阻止する方法を提供する。多特異性反応が広範囲に増大する臨床状態、例えば全身性の１ｕｐｕｓ　ａｒｙｔｈｅｍａｔ。

ＳＵＳにおいては、ＣＤ８：　Ｆｃ１合体の投与はポリクローナルの抑制を可能とする。

ＣＤ８：Ｆｃ複合体の別の治療への適用としては、特異的なＦｃＲ保持細胞の抑制がある。これは、ヒスタミンなどのミゾイエ−ターの遊離をおこす、ＦｃεＲ陽性マスト細胞および好塩基球のＦｃεを介する顆粒喪失が主要な発病機構である、アトピー性（Ｉ　ｇＥを介する）喘息などのアレルギー疾患の治療に特に関係がある。ＣＤ８：　Ｆｃε複合体は、これらのＦｃ８Ｒ陽性細胞、およびＢ細胞によるＩｇＥの生成を制御するＦＣ５Ｒ陽性調節Ｔ細胞の厄介な機能的反応を除去するために使用し得る。Ｆｃεの配列は膜εＨ鎖のいずれかの溶解物から引き出され得、これらＦｃε誘導体のカルボキシ末端部における相違は、調節性Ｔ細胞にもとづく分子間相互作用に影響を与え得る。例えば、ＣＤ８−ＦＣε複合体、すなわちＣＤ８およびＦｃεペプチドユニットを保持する治療用生体膜調製物は、６力月の間隔でアレルギー性患者に非経口投与される。治療反応を検査するため１年ごとにアレルギー試験が行われる。アレルギー症状が上部気管に発現する患者に対しては、鼻腔および吸入薬の処方が特に冑効である。

アレルギー症状の患者のＦｃε保持細胞を非活性化するためのＣＤ８：　Ｆｃε 複合体の使用は、ＣＤ８を介する抑制が、広いタイプの細胞配列を抑制するための薬学的状況において適用され得る。例えば、ＣＤ８：単球／マクロファージ− コノニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ　Ｆ）複合体は、通常はＭ−ＣＳＦにより活性化され得るＭ−ＣＳＦＲ保持細胞を抑制するために使用され得る。これは、正常のまたは形質転換単球が過度に生成される臨床状態を扱うための治療アプローチを提供する。同様に、ＣＤ８：　ＧＭ−ＣＳＦは顆粒性白血球−マクロファージ先駆物質を抑制するために使用され得る。標的細胞の性質、および本発明にて公開した様々なＣＤ８：’ｊガント複合体の臨床的に可能な適用方法は当業者には明かであろう。

本発明によるＣＤ８を介する治療方法の別の実施態様は、ＣＤ８ペプチドを、腎臓、心臓、皮膚および骨髄などの細胞、組織および器官の移植定着を促進するために使用することを含む。本方法の好適な実施態様によれば、移植細胞は膜結合性ＣＤ８ペプチドによりコートされ、次にＣＤ８コート細胞を含む移植片が受容者に移植される。グリコイノシトールリン脂質修飾されたＣＤ８ペプチドは、この目的に適した膜結合性ＣＤ８組成物である。これは、このように修飾されたペプチドは、膜を溶解させない程度の低濃度の界面活性剤、（例えば、０．００３％ＮＰ−４０；　Ｊ、ＥＸｐ、Ｍｅｄ、１６０：１５５８−１５７８．　１９８４）の存在下で自発的に細胞膜に組み込まれるためである。移植細胞上のＣＤ８と同種ＭＨＣとの共発現は同種反応性Ｔ細胞を抑制し、それにより拒絶プロセスの抑制を通して移植片の生存を延長させる。この方法は広い配列タイプの移植片（こ対して適用可能である。血管新生化された固体組織の移植片の場合には、器官は、移植片の内皮細胞をコートするために膜結合ＣＤ８混合物により潅流され得る。移植片の内皮細胞上の、内因性の同種ＭＨＣと結合した外因性のＣＤ８は、組織または器官に侵入する同種特異性のホスト免疫細胞を抑制するように、また内皮ライニングに対して正確な移植片拒絶プロセスを緩和するように作用する。骨髄およびその他の分散された細胞からなる移植片の場合には、移植される細胞のＣＤ８コートは、細胞および膜結合ＣＤ８組成物を、組織培養フラスコ内の懸濁液として、結合することにより実行され得る。ＣＤ８コ一ト細胞自体が免疫学的拒絶から保護されるのみならず、このようなＣＤ８コート移植細胞を特定の体の部位に移植することにより、この部位が、同種フェアタイプを共有する全ての細胞に対して免疫学的に特権を有する場所へ変換される。これは、生存期間の長い移植細胞が使用されるとき、特に有用である。例えば、アレルギー症状のヒトの骨髄のストカマ細胞はインビトロにおけるＣＤ８によりコートされ得、ホストに移植されて、ホストの骨髄を、後に移植され得る同種フェアタイプを共有する他の細胞のための免疫学的に特権を与えられた場所へと変換され得る。

腎臓移植の臨床的設定は、移植後の移植片の免疫学的拒絶を阻止するために、移植前に固体器官移植片を前処理するためのＣＤ８コーテイング法を例証するのに役立つ。この場合に行われる方法の工程は以下の通りである。

（ｉ）腎臓移植ドナーの腎臓を、グリコイノシトルホスホリピド修飾ＣＤ８ペプチド組成物（前記）を含有する溶液１　ｍ　ｌと共に、切除前の執刀の段階で、直接注入により、その腎臓を供給している腎臓動脈へ、または執刀前に直接注入により、腎臓動脈カテーテル法によりこの腎臓動脈へと潅流させる。

注入される溶液は０．００３％のＮＰ−４０含有の正常な生理食塩水希釈液に膜結合性ＣＤ８ペプチドを有するものである。

（ｉｆ）切除した腎臓を、受容者に移植するまで、０．００３％のＮＰ−４０に溶解した膜結合ＣＤ８ペプチドにより補充された潅水中に４″Ｃで保管する。

骨髄移植の臨床的設定は、移植後の移植片の免疫学的拒絶を阻止するために、移植前に分散状態にある移植細胞を前処理するためのＣＤ８コーテイング法を例証するのに役立つ。

この場合に行われる方法の工程は以下の通りである。

（ｉ）骨髄（大人で、約１５　ｃｃ／ｋｇ体重）を既知の方法（例えば米国特許第４．４８１．９４６号および第４．４８６．１８８号を参照）ドナーから吸引し、直ちにヘパリン（３０，０００Ｕ／１００　ｍｌ）で補充された冷却ＴＣ− １９９媒体（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｃ、）に移す。

（ｉｉ）？髄懸濁液を５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３にて常温で２０分間、３０００　ｒｐｍにて遠心分離機にかける。プラズマ上清を分離して、後に使用するために保存する。髄は１５ｍ１の殺菌したポリプロピレンのチューブに移し、４°Ｃでｔｓｏｏ　ｇを１０分間、遠心分離機にかける。

（ｔｉｔ）髄軟膜を取り出し、ペプチドコーティングのために２０００　ｍｌのトランスファーパックに移す。核形成した髄細胞を２　ｘ　１０７ｊｌ！１胞／鳳１の最終濃度でヘマトクリットＴＣ−１９９手段でく１０％に調製する。

（ｉｖ）ＮＰ−４０を骨髄懸濁液に添加して最終濃度を０．００３％にする。

この後直ちに０．００３％のＮＰ−４０に溶解させたグリコイフシトルホスホリピド修飾ＣＤ８ペプチド組成物を添加する。この混合物を室温で３０分間インキュベートし、トランスファーパックを５分毎に緩やかに撹拌する。

（ｙ）骨髄細胞を冷却サテライトバッグに移し、界面活性剤を洗い流し、連続遠心分離（ＲＣ−３，２２００ｇ、４°Ｃ１各回１０分間）によりＣＤ８ペプチドを分離させる。髄細胞を冷却および照射した自家移植の血漿と共に希釈して、核形成細胞が８　ｘ　１０７個／ｍｌの濃度にした。

（ｖｉ）インヒトロア・１セイのために２　ｍｌのサンプルを取り出して、冷却ＴＣ−１９９と１：３割合で希釈し、３　ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、）の上に層状に重ね、遠心分離（５００ｇ、３０分間、室温）する。この単１核細胞層を３度洗浄し、メチルセルロースにおけるコロニー”形成能力を評価する。

（Ｖｉｆ）残りのＣＤ８　：７−ト細胞を１、冷却凍結溶液（５０ｍｌ（ＤＴＣ −１９９＋　２０　ｍｌ（７）ＤＭＳＯ（Ｃｒｙｏｓｅｒｖ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　［ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｃａｒｐ、）　＋　２０　ｍｌの照射した自家移植血漿）と１：１の細胞比率で混合する。次に細胞を、コンピユータ化した冷凍技術装置（例えば米国特許第４．１０７．９３７号およ゛び第４．１１７．８８１号）を利用して漸次凍結させ、受容者へ注入するまで液体窒素中に保存する。

このＣＤ８コーテイング法はイソ移植片、ホモ移植片、ペテロ移植片、およびキセノ移植片に適用可能である。ＣＤ８コートされた細胞、組織および器官は、「普遍的な」ドナー物質を提供し、組織適合性の細胞、組織および器官に対して現在のところ可能な移植技術により制限される要件を回避し得る。例えば、ＣＤ８コートされた表皮細胞は、皮膚移植にとって普遍的な方法にて使用され得る。ＣＤ８コーテイング法は、本来の修飾されていない細胞に対してだけでなく、遺伝学的にまたは他の方法で工学操作された細胞に対しても適用され得る。これにより、限定された遺伝子生成物を、この生成物を必要とする患者に継続的に供給することが可能となる。これはＣＤ８コートされた細胞を、ホストの免疫学的拒絶機構を回避し得る細胞媒体として使用することにより行われる。例えば、適切な調節プロモータ要素により駆動されるインシュリン遺伝子を含む転写カセットは、ヒト骨髄気質性細胞に転写され得、これらの工学操作された細胞はＣＤ８によりコートされ、糖尿病の患者に移植して、この患者のインシュリンネ全を是正する。キセノ移植片の特別の場合においては、ＣＤ８コーテイング法は、実験用の動物キメラを生成する可能性を提供する。例えば、マウスを不ズミ科のＣＤ８をコートされたヒトの血液生成原種細胞と共に再構成され得る。これは、５ＣＩＤマウスをヒトの血液生成原種細胞と共に再構成させるなど、マウス−ヒトキメラを生成するために現在使用されている基準の制限を回避する。この基準によれば、免疫不全の、従って維持するのが困難である、マウスをヒト細胞のためのホストとして使用することが必要とされている。

上述のように、移植細胞にＣＤ８をコートすることに加えて、移植前に、ＣＤ８と同種Ｍ）ＩＣ，を保持する治療用生体膜調製物により、または可溶ＣＤ８：　ＭＨＣ複合体により、移植受容者に前処理を施すことで移植の能力を向上させ得る。

これにより、移植された細胞、組織または器官の同種ＭＨＣに対する特定の免疫寛容が低減される。この目的のために使用され得る生体膜組成物は、本来のまたは工学操作された細胞、リポソーム、平面膜、または擬似細胞を含む。クラス■ およびクラスＴＩのＭＨＣ成分を共に含むＣＤ８：　ＭＨＣ複合体は共に投与され（ｃｏａｄ＋＋１ｎｉｓｔｅｒｅｄ）得る〇本発明によるＣＤ８を介する治療方法のさらに別の実施態様は、ＣＤ８ペプチドを使用することを含み、これにより骨髄が非同−受容者に移植されるときの移植片対宿主病を防ぐ。

ＣＤ８およびホストＭＨＣペプチドを共に、またはＣＤ８：ＭＨＣ複合体を保持する治療用生体膜調製物が、ドナーのインビトロにおける骨髄細胞に添加され、様々なインキュベージコン期間の後、細胞は移植受容者に注入される。この処理形態は、ドナーの骨髄細胞の中の同種反応免疫細胞を排除し、骨髄を消耗させるＴ細胞に対する条件を軽減させる。

骨髄移植の臨床的状況においては、上述の様々なＣＤ８依存調節プロセスは、ホスト対移植片および移植片対ホスト反応の両方を抑制する多面的な方法において結合される。−例として、この設定において実行され得る一連の段階は以下の通りである。

（ｉ）　ＣＤ　８およびドナー同種ＭＭＣを含むＣＤ８ペプチド組成物を、移植の６〜８週間前に移植受容者に投与し、また必要であれば、３〜４週間で追加刺激投与を行い、受容者の同種反応細胞を抑制する。

（ｉｆ）骨髄をドナーから吸引し、ＮＰ−４０’）懸濁液に添加して最終濃度をＱ、００３％にする。そして１．ＣＤ　８および受容者の同種ＭＭＣを含むＣＤ８ペプチド組成物を骨髄細胞に添加して、３７”　Ｃで４時間インキュベートし、これにより骨髄細胞の同種反応細胞数を抑制する。

（ｉｉ　ｉ）骨髄細胞に、膜結合性ＣＤ８を含むＣＤ８ペプチド組酸物をコートし、細胞は使用まで液体窒素にて低温保存するか、または直ちに移植受容者へ注入される。

本発明の新規な処置方法において活性の組成物は、従来の媒体における幅広い種類の治療用投与形態において投与され得ル。ペプチド調合薬のための様々な効果的な処方は、免疫調節剤のための投与スケジュールと共に、当業者には既知であり、またここで公開したＣＤ８ペプチドに適用され得る。

カルボキシメチルセルロース（米国特許第４，４１５．５５２号）などの非免疫キャリヤーは特に可溶ＣＤ８組成物に対して適切である。ＣＤ８ベースの治療に対する治療用細胞調製物は、患者に静脈注入される。治療用リポソームおよびその他のＣＤ８に基づく治療のための平面膜調製物は、非経口または経口投与される。標的細胞の調製は、−回の投与、または所望の調整効果が達成されるまでの連続投与を患者に行うことにより、またはインビトロにて患者の細胞を処理することにより行われる。ＣＤ８を介する免疫調整の程度などの、細胞調整の効力は、従来のインビボおよびインビトロにおける免疫学的試験方法を使用して容易に検査され得る。また刺激投与を必要に応じて行い得る。

本発明の様々なＣＤ８に基づく調合薬が、特に免疫治療の分野において、産業上適用可能であることは、以上の説明および添付のクレームにより、当業者には明かであろう。

本発明の範囲および精神から離れることなく、他の様々な修正が当業者により容易に行い得ることは明かである。従つて、添付のクレームの範囲は上述の説明を制限するものではなく、クレームは、ここに公開したＣＤ８の抑制リガンド活性の公開によりもたらされ、本発明が関わる当業者により等個物としてみなされるであろう特許性を有する新規なすべての特徴を包含するものとされる。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞阻害活性を有するＣＤ８ペプチドを含有する薬剤組成物。
２．前記ＣＤ８ペプチドが、天然のプロセスされたヒトＣＤ８ペプチドの１位（Ｓｅｒ）から１６１位（Ａｓｐ）までのアミノ酸を有する、ＣＤ８の完全な細胞外ドメインを含有する、請求項１に記載の組成物。
３．前記ＣＤ８ペプチドが、天然のプロセスされたヒトＣＤ８ペプチドの１位（Ｓｅｒ）から１１４位（Ａｌａ）までのアミノ酸を有する、ＣＤ８の完全な細胞外ドメインを含有する、請求項１に記載の組成物。
４．前記ＣＤ８ペプチドが膜結合性である、請求項１に記載の組成物。
５．前記膜結合性のＣＤ８ペプチドが、膜の足場としてグリコイノシトールリン脂質部分を有する、請求項４に記載の組成物。
６．前記ＣＤ８ペプチドが可溶性である、請求項１に記載の組成物。
７．前記ＣＤ８ペプチドが、ニッケルーセファロースクロマトグラフィーによって単離し得る２個あるいはそれ以上のヒスチジン残基を有する、請求項１に記載の組成物。
８．前記ＣＤ８ペプチドが、免疫親和性に基づく方法によって単離し得る親水性の延長ペプチドを有する、請求項１に記載の組成物。
９．前記ＣＤ８ペプチドが、ＣＤ８：リガンド複合体であって、該複合体は、直鎖あるいは分枝のポリペプチドキメラの状態で、１つあるいはそれ以上の第２のペプチドリガンドを、または、１つあるいはそれ以上の第２の非ペプチドリガンドを含有する、請求項１に記載の組成物。
１０．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、あるいはその機能性のペプチド誘導体を含む、請求項９に記載の組成物。
１１．前記ＣＤ８：ＭＨＣ複合体のＭＨＣ成分がクラス１のＭＨＣペプチドを有する、請求項１０に記載の組成物。
１２．前記ＭＨＣ成分が、クラスＩＩのＭＨＣペプチドを有するＣＤ８：ＭＨＣ複合体である請求項１０に記載の組成物。
１３．前記ＣＤ８：ＭＨＣ複合体が、プロセスされないペプチド抗原の一部分に対応する名義抗原ペプチドに物理的に結合している、請求項１０に記載の組成物。
１４．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分が、プロセスされない抗原を含む、請求項９に記載の組成物。
１５．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分が、免疫グロブリンＦｃドメイン、あるいはその横能性ペプチド誘導体を含む、請求項９に記載の組成物。
１６．前記ＣＤ８：Ｆｃ複合体のＦｃ成分が、ＩｇＧＩのＨ鎖のＦｃドメイン、あるいはその機能性ペプチドの誘導体を含む、請求項１５に記載の組成物。
１７．前記ＣＤ８：Ｆｃ複合体のＦｃ成分が、ＩｇＥのＨ鎖のＦｃドメイン、あるいはその機能性ペプチドの誘導体を含む、請求項１５に記載の組成物。
１８．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分が、免疫グロブリンＦｖドメイン、あるいはその機能性ペプチドの誘導体を含む、請求項９に記載の組成物。
１９．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分がサイトカインを含む、請求項９に記載の組成物。
２０．前記ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分がレクチンを含む、請求項９に記載の組成物。
２１．前記ＣＤ８または該ＣＤ８：リガンド複合体のリガンド成分が抗イデオタイプ模擬体を含む、請求項９に記載の組成物。
２２．請求項１に記載のＣＤ８ペプチドをコードする配列を有するＤＮＡ配列。
２３．形質転換あるいは形質移入された宿主細胞で、前記コーディング配列の発現を可能にする適切な制御配列に作動可能に結合された、請求項２２に記載のＤＮＡ配列を有する発現系。
２４．宿主がＣＤ８ペプチドを発現する方法で、請求項２３に記載のＤＮＡ配列によって形質転換あるいは形質移入された原核宿主細胞あるいは真核宿主細胞。
２５．ＣＤ８ペプチドの生産に効果的な条件下で、請求項２４に記載の細胞を培養することを含む、請求項１に記載のＣＤ８ペプチドを生産する方法。
２６．請求項５に記載のグリコイノシトールリン脂質修飾のＣＤ８ペプチドを生産する方法であって、下記の工程を包含する方法：（ｉ）キメラＤＮＡ配列のＤＮＡ配列への組み込みであって、該ＤＮＡ配列は、天然のＣＤ８のペプチドのアミノ酸配列の細胞阻害という生物学的な性質を有し得るに十分な重複のあるアミノ酸配列を有するペプチドをコードし、そしてその天然型のグリコイノシトールリン酸修飾を行うペプチドの３′末端をコードする配列にフレーム内で結合している；（ｉｉ）適切な制御配列に作動可能に結合された該キメラＤＮＡ配列を含む、該キメラＤＮＡ配列の発現系への挿入；（ｉｉｉ）該組み込みＤＮＡ配列の宿主細胞への形質転換あるいは形質導入；（ｉｖ）該ペプチドを生産するための効果的な条件下での該細胞の培養；および（ｖ）核細胞からのグリコイノシトールリン脂質修飾のＣＤ８の単離。
２７．細胞阻害活性を有する、請求項１に記載の、天然ＣＤ８を有する生体膜、あるいはＣＤ８の膜結合誘導体を含有する薬剤組成物。
２８．前記生体膜が、細胞あるいはその細胞誘導体を包含する、請求項２７に記載の組成物。
２９．前記細胞が、抗原をプロセスおよび／または提示し得る細胞を含む、請求項２８に記載の組成物。
３０．前記生体膜がリボソームを含む、請求項２７に記載の組成物。
３１．ＣＤ８の阻害性のリガンド活性を競合的に阻害するペプチドを有する組成物。
３２．特異的な免疫細胞を阻害するために、請求項１に記載のＣＤ８ペプチド、または請求項２７に記載のＣＤ８ペプチドを有する生体膜の効果的な量を、患者にインビボで、あるいは患者の細胞にインビトロに投与することを含む、特異的な免疫調節のための治療法。
３３．インビボあるいはインビトロでの、請求項９に記載のＣＤ８：リガンド複合体の使用を含む、非特異的免疫調節および非免疫細胞の調節のための治療法。
３４．インビボあるいはインビトロで、ＦｃεＲを有する細胞を調節するために、請求項１７に記載のＣＤ８：Ｆｃε複合体を使用することを含む、ＩｇＥ媒介性のアレルギー疾患の患者を治療するための、請求項３３に記載の方法。
３５．移植受容者に移植する前に、請求項１に記載の膜結合性のＣＤ８ペプチドによって、移植されるべき移植組織片の細胞をコートすることを含む、移植受容者において細胞、組織および器官移植片の生存を延長させるための治療法。
３６．供与細胞集団の同種異系反応性の免疫細胞を阻害するために、ＣＤ８ペプチドと特異的宿主の同種抗原との両者を有する、請求項２７に記載の生体膜調製物を用い、あるいは請求項１０に記載のＣＤ８：ＭＨＣ複合体を用いて、供与者の骨髄細胞を前処理あるいは共に投与することを含む、骨髄移植受容者における移植片対宿主疾患を予防するための治療法。