TW201619378A - 以ｃａｒ為基礎之免疫治療 - Google Patents

Abstract

本發明係提供嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors；CARs)、含此類CARs之T細胞、編碼此類CARs之核酸、及使用其之方法，例如，用於治療癌症如B細胞惡性腫瘤。

Description

以CAR為基礎之免疫治療 【參考相關申請案】

根據35 U.S.C.§119(e)，本申請案係主張於2014年5月23日提申之美國臨時專利申請號62/002,603之權益，其揭示內容在此併入本案以作為參考資料。

本發明係關於以CAR為基礎之免疫治療。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)提供癌症之過繼性T細胞免疫治療一有前景之方法。通常情況下，CARs含有抗體單鏈片段可變區(single chain fragment variable；scFv)或腫瘤相關抗原(tumor associated antigen；TAA)專一性結合結構域，其係經由鉸鏈區及跨膜區偶接至T細胞信號分子之細胞質結構域。最常見之淋巴球活化部分包括以T細胞共刺激結構域串聯T細胞效應子功能觸發部分(如CD3ζ)。CAR介導之過繼性免疫治療使得CAR接枝之T細胞以非HLA限制性方式直接識別標靶腫瘤細胞上之TAAs。

大多數患有B細胞惡性腫瘤之病患，包括B細胞急性淋巴細胞白血病(B cell acute lymphocytic leukemia；B-ALL)及慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)，會死於該病症。一種治療這類病患之方法，係以基因改造T細胞，經由CARs之表現，靶向腫瘤細胞表現之抗原。CARs為抗原受體，其經設計以人類白血球抗原(human leukocyte antigen；HLA)非依賴性方式識別細胞表面抗原。以使用基因改造之表現CARs之細胞治療該類型病患之嘗試，取得不錯成績。

於多數癌症，腫瘤專一性抗原尚未完全確認，但在B細胞惡性腫瘤，CD19為一引人注目之腫瘤標靶。CD19之表現係侷限於正常及惡性腫瘤B細胞(Uckun,et al.Blood,1988,71：13-29)，因此，CD19為廣泛被接受可安全地測試CARs之標靶。

本發明係部分有關用於治療癌症之組合物及方法，包括但不侷限於，癌症之血液類型。本發明係有關T細胞之過繼性細胞轉移策略，其係經轉導以表現嵌合抗原受體(CAR)。CARs為一種分子，其結合所需抗原(如腫瘤抗原)之以抗體為基礎之專一性與T細胞受體活化型細胞內結構域，可產生呈現專一性抗腫瘤細胞免疫活性之嵌合蛋白。

於一些具體實施例，本發明係提供一種組合物，其中CAR或其部分係完全人類的，從而最小化宿主免疫反應之風險。

於一些具體實施例，本發明一般而言係有關T細胞之用途，其係經基因改造以穩定表現所需之CAR。表現CAR之T細胞於此稱作CAR T細胞或CAR改造之T細胞。較佳地，細胞可經基因改造以於其表面穩定表現抗體結合結構域，其賦予新的抗原專一性且不依賴MHC。於一些情況下，T細胞係經基因改 造以穩定表現CAR，其結合專一性抗體之抗原辨識結構域與CD3ζ鏈或FcR蛋白之細胞內結構域，成為單一嵌合蛋白。於特定實例中，CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域，並伴隨一自我毀滅基因設計，如誘導型凋亡蛋白酶9(iCasp9)基因。於一甚而更特定之具體實施例，CAR之元件排列如下：scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9。

CD28元件可以但不一定，包含上述CAR具體實施例之跨膜結構域之至少一部分。CAR亦可包括數個鉸鏈元件及/或間隔子序列(如介於個別結構域元件之間)。

本發明之具體實施例係有關CAR，其合併新穎系列之結構域，其提供不同功能態樣，可協同作用以改進功效。舉例而言，於一些具體實施例，CAR包括抗原辨識結構域、刺激活性之抗原共信號結構域、增加T細胞存活率之存活結構域、T細胞記憶結構域、及效應子活化型結構域。或者，CAR可進一步包括誘發安全性之結構域。圖1係提供一系列達成此多功能性之結構域之實例。

於一些具體實施例，本發明之CAR包含細胞外結構域，其具抗原辨識結構域、跨膜結構域、及多功能細胞質結構域。於一些具體實施例，二CAR蛋白於體內二聚化(如形成同或異二聚體)。於一些具體實施例，CAR可包含完整人類抗體或抗體片段，如scFv。於一具體實施例，使用與CAR之結構域之一者自然地相關聯之跨膜結構域。於一些具體實施例，可選擇或由胺基酸取代修飾跨膜結構域，以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域，以最小化與受體複合體之其他成員的交互作用。於一些具體實施例，跨膜結構 域為CD8a跨膜結構域。

於一些具體實施例，本發明之CAR T細胞可藉導入慢病毒載體至細胞而產生，該慢病毒載體含有編碼靶向腫瘤抗原所需之CAR核酸。舉例而言，慢病毒載體包含編碼CAR之核酸，其包含腫瘤抗原結合結構域(如靶向CD19)、可視需要地CD8a鉸鏈、跨膜結構域、及CD28、CD137、CD27與CD3ζ信號結構域，以進入細胞。於一些具體實施例，本發明之CAR T細胞能於體內複製，造成長期持續作用，可導致持續性腫瘤控制。於一些具體實施例，本發明之CAR T細胞可藉轉染一編碼所需CAR之RNA進入細胞而產生。於一些具體實施例，CAR係於經基因改造之CAR T細胞中短暫表現。

於一些具體實施例，本發明係有關CAR，其包含人類抗體或其片段。本發明係部分基於一發現，即含有抗原辨識結構域之CAR，其包含完整人類抗體片段，可專一性識別腫瘤抗原。因此，於一些具體實施例，本發明之人類CARs可用於治療癌症及其他疾病，且避免誘導免疫反應之風險。

於一些具體實施例，本發明係有關利用淋巴球輸注，投予經基因改造之T細胞，其表現CAR，以治療患有癌症或有罹患癌症風險之病患。較佳地，自體淋巴球輸注係用於治療。自體PBMCs係收集自有治療需求之病患，且T細胞以本文所述及本領域習知之方法活化及擴增，隨後輸液回病患。

本發明可包括使用T細胞，其表現CAR，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。於一些具體實施例，本發明之CAR T細胞可經受穩健之體內T細胞擴增，且可建立專一性記憶細胞，其於一延長時間內，於血液及骨髓維持高濃度。於一些情況下，輸注本發明之 CAR T細胞至病患，可消除癌症病患體內之癌細胞。

下列本發明較佳具體實施例之詳述，將因所附圖式而有更好之理解。為說明本發明，圖式具體實施例所示內容係目前之較佳呈現。然而，應理解到，本發明未侷限於圖式具體實施例之精確安排及方法。

圖1係提供CAR-4S慢病毒之設計示意圖。

圖2係顯示CAR T細胞靶向GFP+/B-ALL細胞之一系列照片。上排顯示亮視野影像。下排顯示GFP影像。

圖3係描述CAR T(CFSE)增生試驗之一系列圖片。

圖4係顯示CAR T細胞靶向CD19+癌症細胞之共軛焦顯微鏡造影之一系列照片。箭頭指出CD19白血病細胞於0分鐘時完整且於8分鐘時凋亡。與白血病細胞相鄰且位於白血病細胞左側之細胞為抗CD19 CAR T細胞。

圖5係CAR二聚合化與細胞凋亡之合成誘導物顯示圖。

圖6係快速誘發CAR T細胞凋亡之顯示圖。

圖7係Lenti-4S-CAR T細胞療法之顯示圖。

圖8係一系列FACS數據圖，顯示有效之慢病毒(LV)基因轉移至人類T細胞。

圖9係一系列FACS數據圖，顯示第5天之LV CAR T細胞。

圖10係CAR-T輸注後之血漿IgG顯示圖。

圖11係CAR-T輸注後之血漿IgA/IgM顯示圖。

圖12係IL-6濃度、IFN-γ濃度、CAR於PBMC之拷貝數、及CAR於BM之拷貝數之一系列顯示圖。

圖13係用於個案研究2之治療方案圖解。

圖14係輸注後不同時間點之血清尿酸及肌酸酐濃度之一系列顯示圖。

圖15係輸注後不同時間點之血清IL-6及IFN-γ濃度之一系列顯示圖。

圖16係輸注後不同時間點之Ig(IgG、IgA、或IgM)濃度之顯示圖。

圖17係顯示CAR T細胞治療前、細胞輸注後20天、及細胞輸注後56天臨床反應之一系列照片。

定義

除非另有定義，本文所使用之所有技術性及科學性術語具有本領域之技術人員所能常規理解之相同意義。儘管類似或等同於本文所述之任何方法及材料可用於實施以測試本發明，現將說明較佳之材料及方法。於說明及主張本發明時，將使用下列術語。

亦應理解到，本文使用之術語，目的僅在於說明特定具體實施例，且非旨在侷限。

本文所使用之冠詞「一」與「一者」是指一或大於一(亦即，至少一者)之該冠詞語法對象。舉例而言，「一元件」是指一元件或大於一者之元件。

當指一可測量之值時，如一量、一時間期限、及其類似物，本文所使用的「約」是指該特定值涵蓋+20%或+10%之變化，更佳為+5%，甚而更佳為+1%，且又更佳為+0.1%，因此，該變化於進行所揭示方法時適用。

本文使用的「FRa結合結構域」乙詞可指本領域之技術人員習知 之任何FRa專一性結合結構域。於一實例，FRa結合結構域包含一單鏈可變片段(single-chain variable fragment；scFv)，其包含專一性結合至FRa之抗體之重鏈(V_H)及輕鏈(V_L)之可變區。抗FRa抗體、抗體片段、及其變體係本領域習知，且全部揭示於美國專利公開號U.S 20100055034；U.S.20090324594；U.S.20090274697；U.S.20080260812；U.S.20060239910；U.S.20050232919；U.S.20040235108，其全部在此併入本案以作為參考資料。於一具體實施例，FRa結合結構域為抗FRa抗體之同源物、變體、異構物、或功能片段。各可能性代表本發明之個別具體實施例。

於一些具體實施例，「蛋白質結構域」或「結構域」係指獨特之球狀單元，其可由結構決定方法如X光繞射或NMR、由其他生物物理方法如掃描熱量法，據此，蛋白質結構域熔化為不同單元(參見如Pabo et al.Proc Natl Acad Sci U S A.(1979)76(4)：1608-12)、或由已決定結構之蛋白質結構域之序列相似度進行鑑定。SCOP資料庫(Murzin et al.J Mol Biol.(1995)247(4)：536-40)係提供蛋白質結構域之鑑定，因此，一新穎蛋白之結構域組成，可由序列比較鑑定。蛋白質結構域可包含一足以驅動該多胜肽折疊成一分離結構的胺基酸序列，其中基本上沿多胜肽主鏈的所有可旋轉之鍵係侷限在約10度之內。

本文使用的「活化」是指已充分刺激以誘導可檢測之細胞增生的T細胞狀態。活化亦相關於誘導之細胞介素產生及可檢測之效應子功能。「活化之T細胞」乙詞是指，除其他事項外，經受細胞分裂之T細胞。

本文使用之「抗體」乙詞是指免疫球蛋白分子，其與抗原專一性結合。抗體可為源自天然來源或重組來源之完整免疫球蛋白，且可為完整免疫球蛋白之免疫反應性部位。抗體為典型之四聚體免疫球蛋白分子。本發明之抗 體可存在多種形式，包括例如，多株抗體、單株抗體、Fv、Fab、及F(ab)₂，以及單鏈抗體、人類抗體、及人源化抗體(Harlow等人，1999年，於：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989年，於：Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988年，Science 242：423-426)。

「抗體片段」乙詞是指一部份之完整抗體，且指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於，Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體(如scFv抗體)、及由抗體片段形成之多專一性抗體。

本文使用之「抗體重鏈」是指存在於所有自然發生構形之抗體分子之二多胜肽鏈之較大部分。

本文使用之「抗體輕鏈」是指存在於所有自然發生構形之抗體分子之二多胜肽鏈之較小部分，κ及λ輕鏈是指二主要抗體輕鏈同型。

本文使用之「合成抗體」乙詞是指以重組型DNA技術產生之抗體，像是例如，以本文所述噬菌體表現之抗體。該詞亦應理解為，以合成編碼抗體之DNA分子產生之抗體，且該DNA分子可表現抗體蛋白，或指定抗體之胺基酸序列，其中DNA或胺基酸序列係以合成DNA或胺基酸序列技術取得，其為本領域可得且習知。

本文使用之「抗原」或「Ag」等詞係定義為引發免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生、或專一性免疫勝任細胞活化、或兩者。本領域之技術人員應理解到，任何巨分子，包括幾乎所有蛋白質或胜肽，皆可作為抗原。此外，抗原可源自重組型或基因體DNA。本領域之技術人員應理解到， 任何DNA，包含編碼一引發免疫反應之蛋白之核苷酸序列或部分核苷酸序列，從而如該詞於本文中之使用，可編碼「抗原」。此外，本領域之技術人員應理解到，抗原無須僅由一基因之全長核苷酸序列編碼。顯見的是，本發明包括但不侷限於，使用一個以上之基因之部分核苷酸序列，且該些核苷酸序列係以各種組合排列，以引發所需之免疫反應。此外，本領域之技術人員應理解到，抗原無須由「基因」編碼。顯見，抗原可為合成產生或可源自生物樣本。此生物樣本可包括但不侷限於，組織樣本、腫瘤樣本、細胞、或生物流體。

本文使用之「腫瘤抗原」乙詞是指與癌症細胞相關聯之抗原。腫瘤抗原之實例包括但不侷限於，CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、醣脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、及MAGE A3 TCR。

本文使用之「抗腫瘤作用」乙詞是指可藉減少腫瘤體積、減少腫瘤細胞數目、減少轉移數目、增加預期壽命、或改善各種與癌症病況相關聯之生理症狀而表現之生物作用。「抗腫瘤作用」亦可藉本發明之胜肽、多核苷酸、細胞、及抗體之能力而表現，以於第一時間預防腫瘤發生。

根據本發明，「自體抗原」乙詞是指任何自身抗原，其經免疫系統錯誤識別為外來物。自體抗原包括但不侷限於，細胞蛋白質、磷酸化蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質、核酸、醣蛋白，包括細胞表面受體。

本文使用之「自體免疫疾病」乙詞係定義為源自自體免疫反應之疾病。自體免疫疾病係對自身抗原之不適當及過度反應所致。自體免疫疾病之實例包括但不限於，艾迪森氏病(Addision's disease)、班禿(alopecia greata)、關節黏連性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克 隆氏症、糖尿病(第一型)、失養性水皰性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa)、副睪炎(epididymitis)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、格雷氏病(Graves' disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barr syndrome)、橋本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力症(myasthenia gravis)、尋常性天皰瘡(pemphigus vulgaris)、乾癬、風濕病、類風濕性關節炎、類肉瘤病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊柱關節病變(spondyloarthropathies)、甲狀腺炎、血管炎(vasculitis)、白斑症(vitiligo)、黏液性水腫(myxedema)、惡性貧血、潰瘍性結腸炎等等。

本文使用之「自體」乙詞是指任何源自相同個體之材料，其最後重新導入個體。

「同種異體」是指源自相同物種之不同動物之移植物。「異種」是指源自不同物種之動物之移植物。

本文使用之「癌症」乙詞係定義為一疾病，其特徵為異常細胞之快速及不受控生長。癌症細胞可局部擴散或通過血流及淋巴系統至身體其他部位。各種癌症之實例包括但不限於，乳癌、攝護腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、直腸癌、腎臟癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、及其類似物。於一特定具體實施例，癌症是指B細胞相關之惡性腫瘤。

本文使用之「共刺激配體」乙詞包括抗原表現細胞(如aAPC、樹狀細胞、B細胞、及其類似物)上之分子，其專一性結合T細胞上之同族共刺激分子，從而提供一信號，除了由例如TCR/CD3複合體與負載胜肽之MHC分子結合所提供之初級信號以外，其介導T細胞反應，包括但不侷限於，增生、活化、分化、及其類似情況。共刺激配體可包括但不侷限於，CD7、B7-1(CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏著分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合鐸(Toll)配體受體之促效劑或抗體、及專一性結合於B7-H3之配體。特別的是，共刺激配體亦涵蓋抗體，其專一性結合存在於T細胞之共刺激分子，例如但不侷限於，CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能關聯性抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及專一性結合於CD83之配體。

「共刺激分子」是指T細胞上之同族結合配偶體，其專一性結合於共刺激配體，從而藉T細胞介導共刺激反應，例如但不侷限於，增生。共刺激分子包括但不侷限於，MHC第I類分子、BTLA、及鐸配體受體。本文使用之「共刺激信號」是指一種信號，其結合一初級信號，如TCR/CD3連接，導致T細胞增生及/或關鍵分子之向上調節或向下調節。

「疾病」為動物無法維持恆定的健康狀態，且其中若疾病無法改善，則動物之健康繼續惡化。相反地，「失調」為動物能維持恆定的健康狀態，但其中動物健康狀態比不存在該失調時的差。若不治療，失調不一定會造成動物健康狀態進一步之惡化。

本文使用之「有效量」是指能提供治療或預防效益之量。

「編碼」係指多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)之特定核苷酸序列之固有性質，以作為生物過程中合成其他聚合物及巨分子之模板，其具經定義之核苷酸(亦即，rRNA、tRNA、及mRNA)序列或經定義之胺基酸序列，以及由其造成之生物性質。因此，基因編碼蛋白質，代表相對應於該基因之mRNA之轉錄及轉譯，於細胞或其他生物系統中產生蛋白質。編碼股，其之核苷酸序 列係等同於mRNA序列且通常列於序列表，與非編碼股，其作為基因或cDNA轉錄之模板，兩者可指編碼該基因或cDNA之蛋白或其他產物。

本文使用之「內源性」是指源自生物體、細胞、組織、或系統，或其內部產生之任何材料。

本文使用之「外源性」乙詞是指由生物體、細胞、組織、或系統導入或其之外部產生之任何材料。

本文使用之「表現」乙詞係定義為特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯，係藉其啟動子驅動。

「表現載體」是指含有重組型多核苷酸之載體，其包含表現控制序列，其係可操作地連接至欲表現之核苷酸序列。表現載體包含足夠之同側作用元件(cis-acting elements)以用於表現；其他表現元件可由宿主細胞或體外表現系統提供。表現載體包括本領域之所有習知者，如黏質體、質體(如裸露或含於微脂體)、及病毒(如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒)，其合併重組型多核苷酸。

「同源」是指二多胜肽間或二核酸分子間之序列相似性或序列等同度。當二相比較序列兩者之一位置由相同鹼基或胺基酸單體次單元佔據時，例如，若二DNA分子之每一者之一位置由腺嘌呤佔據時，則分子之該位置為同源。二序列間之同源性百分比為一函數，係以二序列共享之相符或同源位置之數目除以相比較位置之數目再乘以100。舉例而言，若二序列中10個位置有6者相符或同源，則該二序列為60%同源。舉例而言，DNA序列ATTGCC與TATGGC共享50%同源性。一般而言，當二序列係經比對以取得最大同源性時，代表比較完成。

本文使用之「免疫球蛋白」或「Ig」等詞係定義為一類蛋白質，其功能係作為抗體。由B細胞表現之抗體有時稱作BCR(B細胞受體)或抗原受體。此類蛋白質包括五成員，係IgA、IgG、IgM、IgD、及IgE。IgA為初級抗體，其存在於身體分液物，如唾液、眼淚、乳汁、腸胃道分泌物、及呼吸道與泌尿道之黏液分泌物。IgG為最常見之循環抗體。IgM為大部分個體之初級免疫反應產生之主要免疫球蛋白。其為凝集作用、補體結合反應、及其他抗體反應之最有效免疫球蛋白，且於抵禦細菌及病毒上至關重要。IgD為抗體功能未知之免疫球蛋白，但可作為抗原受體。IgE為介導即發性過敏反應之免疫球蛋白，係藉曝露於過敏原時致使巨大細胞與嗜鹼性球釋放介質(mediators)。

本文使用之「說明材料」包括公開文獻、紀錄、圖式、或任何其他表現媒體，其可用於傳達本發明組合物及方法之用處。本發明套組之說明材料可，例如，附加於一容器內，其含有本發明之核酸、胜肽、及/或組合物，或配合容器一起運送，內含核酸、胜肽、及/或組合物。或者，說明材料與本發明容器可分開運送，該說明材料與化合物由收件人配合使用。

「分離」是指改變或從自然狀態移除。舉例而言，天然存在於活體動物之核酸或胜肽係未「分離」，但從其天然狀態之共存材料中部分或完全分開相同核酸或胜肽則為「分離」。分離之核酸或蛋白質可以實質上經純化之形式存在，或可存在於非天然環境，像是例如，宿主細胞。

於本發明全文中，常見之核酸鹼基使用下列縮寫。「A」是指腺核苷、「C」是指胞嘧啶、「G」是指鳥核苷、「T」是指胸腺核苷、及「U」是指尿核苷。

除非另有指明，「核苷酸序列編碼胺基酸序列」包括彼此為簡併 版本且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列乙詞亦可包括內含子，其程度為，該編碼蛋白質之核苷酸序列可為一些含有內含子之版本。

本文使用之「慢病毒」是指反轉錄病毒科(Retroviridae family)之一屬。

慢病毒為獨特之反轉錄病毒，係因其能感染非分裂之細胞；其可輸送一顯著量之遺傳訊息至宿主細胞DNA，因此其為基因輸送載體之最有效方法之一。HIV、SIV、及FIV為慢病毒之所有實例。源自慢病毒之載體提供達到體內顯著量之基因轉移之工具。

本文使用之「調控」乙詞是指相較於不存在治療或化合物之個體反應程度及/或相較於其他方面相同但未經治療之個體反應程度，可介導個體反應程度之可偵測之增加或減少。該詞涵蓋擾動及/或影響一原始信號或反應，從而於個體中介導一有益之治療反應，該個體較佳為人類。

「密碼子優化」是指特定胺基酸相關之密碼子係經優化，以有效率地轉譯感興趣之基因。密碼子優化典型上涉及評估感興趣之基因或序列，並以更普遍或常見之密碼子取代特定細胞或物種所使用之相同胺基酸之密碼子。本領域中用於評估密碼子優化之程式包括由Integrated DNA Technologies、EnCor Biotechnology,Inc.、JCat,OptimumGene TM(GenScript USA,Inc.，Pisataway，NJ 08854)等所提供者。編碼本文所述之CAR具體實施例之序列可經密碼子優化，以增加其轉譯效率。

除非另有指明，「核苷酸序列編碼胺基酸序列」包括彼此為簡併版本且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA之核苷酸序 列可包括內含子。

「可操作地連接」乙詞是指調節序列與異種核酸序列間之功能性連接，造成後者之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列經放置以具功能性關係時，第一核酸序列係可操作地連接於第二核酸序列。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子係可操作地連接至該編碼序列。一般而言，當必須於相同讀框連接二蛋白編碼區時，可操作地連接之DNA序列係鄰接。

「過度表現之」腫瘤抗原或腫瘤抗原之「過度表現」等詞係旨在表示病患特定組織或器官內之疾病區域(如實性瘤)細胞之腫瘤抗原異常表現程度，其係相對於該組織或器官內正常細胞之表現程度。具實性瘤或惡性血液病之病患特徵在於過度表現腫瘤抗原，可由本領域習知之標準試驗測定。

「非口服」投予免疫性組合物，包括例如，皮下(s.c)、靜脈(i.v.)、肌肉(i.m.)、或胸骨內注射、或輸注技術。

「病患」、「個體」、「個人」、及其類似語等詞於此可互換使用，且係指任何動物、或其細胞，不論體外或原位，適於本文所述之方法。於特定非侷限具體實施例，病患、個體、或個人為人類。

本文使用之「多核苷酸」乙詞係定義為核苷酸鏈。此外，核酸係核苷酸之聚合物。因此，本文使用之核酸與多核苷酸可互換使用。本領域之技術人員具常識，即核酸為多核苷酸，其可水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可水解成核苷。本文使用之多核苷酸包括但不限於，由本領域可得之任何方法取得之核酸序列，該方法包括但不侷限於，重組型方法，亦即利用普通選殖技術與PCR^TM、及其類似方法從重組型庫或細胞基因體選殖核酸序列，以及藉合成 方法。

本文使用之「胜肽」、「多胜肽」、及「蛋白質」等詞可互換使用，且係指含有藉胜肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或胜肽必須含有至少二胺基酸，且未侷限於最大數目之胺基酸，其可包含蛋白質或胜肽序列。多胜肽包括任何胜肽或蛋白質，其含有二或多個藉胜肽鍵彼此相連之胺基酸。使用於此，該詞同時指短鏈，其於本領域中亦通常稱作如胜肽、寡胜肽、及寡聚體，以及較長鏈，其於本領域中一般稱作蛋白質，其中有許多類型。「多胜肽」包括例如，生物上活性片段、實質上同源多胜肽、寡胜肽、同二聚體、異二聚體、多胜肽之變體、經修飾之多胜肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多胜肽包括天然胜肽、重組型胜肽、合成胜肽、或其結合物。

本文使用之「啟動子」乙詞係定義為藉細胞合成機制或導入之合成機制識別之DNA序列，係引發多核苷酸序列之特定轉錄作用所需。

本文使用之「啟動子/調節序列」乙詞是指核酸序列，其為可操作地連接至啟動子/調節序列之基因產物之表現所需。於一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且於其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及其他調節元件，其為基因產物之表現所需。啟動子/調節序列可，例如，以組織特異性方式表現基因產物。「持續型」啟動子為一核苷酸序列，當可操作地連接於一編碼或指定基因產物之多核苷酸時，其導致基因產物於細胞之多數或所有生理條件下，於細胞內產生。

「誘發型」啟動子為核苷酸序列，當可操作地連接於一編碼或指定基因產物之多核苷酸時，其導致基因產物實質上僅當相應於啟動子之誘導物存在於細胞時，於細胞內產生。

「組織特異性」啟動子為核苷酸序列，當可操作地連接於一編碼或由基因指定之多核苷酸時，其導致基因產物實質上僅於細胞為相應於啟動子之組織類型之細胞時，於細胞內產生。

本文使用之關於抗體之「專一性結合」乙詞是指抗體可識別樣本之特定抗原，但未實質上識別或結合其他分子。舉例而言，抗體專一性地結合至一物種之抗原，亦可能結合至一或多個物種之該抗原。但是，此跨物種反應性(cross-species reactivity)本身不改變抗體之專一性分類。於另一實例，一專一性結合至抗原之抗體亦可結合至該抗原之不同等位形式(allelic forms)。然而，此交叉反應性本身不改變抗體之專一性分類。於一些情況下，「專一性結合」或「專一性地結合」等詞可用於指抗體、蛋白質、或胜肽與第二化學物種之交互作用，意指該交互作用取決於化學物種上存在之特定結構(如抗原決定位或表位)；舉例而言，抗體識別及結合至特定蛋白質結構而非整個蛋白。若抗體特異於表位「A」，則於含有經標記之「A」與抗體之反應中存在含有表位A(或游離、未經標記之A)之分子時，會減少經標記之A結合至抗體之量。

「刺激」乙詞是指藉刺激分子(如TCR/CD3複合體)與其同族配體結合誘發之初級反應，從而介導信號傳遞事件，例如但不侷限於，經由TCR/CD3複合體之信號傳遞。刺激可介導特定分子之表現改變，如TGF-β之向下調節，及/或細胞骨架結構及其類似物之重組。

本文使用之「刺激分子」乙詞是指T細胞上之分子專一性結合於存在於抗原表現細胞上之同族刺激配體。

本文使用之「刺激配體」是指當一配體存在於抗原表現細胞(如aAPC、樹狀細胞、B細胞、及其類似物)上時，可專一性結合於T細胞上之同族 結合配偶體(於此稱作「刺激分子」)，從而藉T細胞介導初級反應，包括但不侷限於，活化、免疫反應之初始化、增生、及其類似物。刺激配體為本領域習知，且包含特別是，負載胜肽之MHC第I類分子、抗CD3抗體、超促效劑抗CD28抗體、及超促效劑抗CD2抗體。

「個體」乙詞係旨在包括可引發免疫反應之活生物體(如哺乳類動物)。個體之實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉基因物種。

本文使用之「實質上經純化之」細胞係基本上無其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦指自其他細胞類型分離之細胞，該其他細胞類型係於其自然存在狀態下與其正常相關聯。於一些情況下，一實質上經純化之細胞群係指一同源之細胞群。於其他情況下，該詞僅指自其自然狀態下與其正常相關聯之細胞中分離之細胞。於一些具體實施例，細胞係體外培養。於其他具體實施例，細胞未經體外培養。

本文使用之「治療」乙詞是指一療法及/或預防。治療效果係藉疾病狀態之抑制、緩解、或根除而取得。

「治療上有效量」乙詞是指個體化合物之量會引發研究人員、獸醫、醫師、或其他臨床人員尋求之組織、系統、或個體之生物或醫學反應。「治療上有效量」乙詞包括一定量之化合物，當投予時，其足以預防欲治療之失調或疾病之一或多個徵候或症狀發展成或減輕至某種程度。治療上有效量將因化合物、欲治療個體之疾病及其嚴重度及年齡、體重等而變。

本文使用之「治療」一疾病乙詞是指減少個體經歷之疾病或失調之徵候或症狀至少一者之頻率或嚴重度。

本文使用之「轉染」或「轉形」或「轉導」等詞是指一流程，其 中外源性核酸係轉染或導入宿主細胞。「經轉染」或「經轉形」或「經轉導」之細胞係以外源性核酸轉染、轉形、或轉導之細胞。該細胞包括初代個體細胞及其後代。

本文使用之「於轉錄控制下」或「可操作地連接」等詞是指啟動子係位於與多核苷酸相關之正確位置及方位，以控制藉RNA聚合酶之轉錄啟動及多核苷酸之表現。

「載體」為物質之組合物，其包含分離之核酸，且其可用於輸送該分離之核酸至細胞內部。許多載體係本領域習知，包括但不侷限於，線型多核苷酸、與離子或兩親化合物相關聯之多核苷酸、質體、及病毒。因此，「載體」乙詞包括自主複製質體或病毒。該詞亦應理解為包括非質體與非病毒化合物，其促進核酸轉移至細胞，像是例如，聚離胺酸化合物、微脂體、及其類似物。病毒載體之實例包括但不限於，腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、及其類似物。

範圍：綜觀本公開內容，本發明之各方面可以範圍格式呈現。應理解到，以範圍格式描述之目的僅在於便利與簡要，且不應理解為硬性侷限本發明之範疇。據此，範圍描述應視為具體揭示所有可能之子範圍，以及該範圍內之個別數值。舉例而言，範圍描述如1至6，應視為特定揭示子範圍如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、及6。其不論範圍廣度皆適用。

說明

於一些具體實施例，本發明提供用於治療癌症等疾病之組合物及方法。癌症可為惡性血液病、實性瘤、原發性或轉移性腫瘤。或者，本發明之 具體實施例可用於治療其他疾病，包括感染性疾病。

於一些具體實施例，本發明提供一細胞(如T細胞)，其係經基因工程以表現CAR，其中CAR T細胞呈現抗腫瘤性質。於一較佳具體實施例，CAR係完全人類CAR。本發明之CAR可經基因工程以涵蓋一細胞外結構域，其具抗原結合結構域融合至T細胞抗原受體複合體ζ鏈(如CD3ζ)之細胞內信號結構域。於一些具體實施例，當表現於T細胞時，本發明之CAR能基於抗原結合專一性重新定向抗原識別。一示例性抗原為CD19，係因此抗原表現於惡性腫瘤B細胞。然而，本發明並未侷限於靶向CD19。反而，本發明包括任何抗原結合部分，當結合至其同族抗原時，會影響腫瘤細胞，因此腫瘤細胞無法生長，促使其死亡，或者受影響，因此病患之腫瘤負荷減少或消除。於一些具體實施例，抗原結合部分係融合於多重共刺激分子之細胞內結構域及ζ鏈。

於一些具體實施例，本發明之CAR所含排列如下：scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9。

於一些具體實施例，上述之示例性、非侷限排列係由左至右、N端至C端之CAR。CAR可包含或進一步包含本文所述之任何其他元件之結合物。

組合物

於一些具體實施例，本發明係提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含細胞外及細胞內結構域。於一些具體實施例，本發明之CAR為完全人類。於一些具體實施例，細胞外結構域包含標靶專一性結合元件，或者稱作抗原結合部分。細胞內結構域或細胞質結構域包含共刺激信號區及ζ鏈部分。共刺激信號區係指CAR之一部分，其包含共刺激分子之細胞內結構域。共刺激分子係細胞表面抗原受體以外之分子或其配體，其為淋巴球與抗原之有效反應所需。

應理解到，CAR可包括一具本文提供之序列之區域(如抗原結合結構域、跨膜結構域、細胞質結構域、信號結構域、安全性結構域、及/或連接子、或其任何結合物)或其變體，或者其任一片段(如一變體及/或保留CAR活性所需功能之片段)可涵蓋於本文所述之CAR蛋白。於一些具體實施例，變體具相對於圖示序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸之改變。於一些具體實施例，變體之序列係至少80%、至少85%、至少90%、90%-95%、至少95%、或至少99%等同於圖示序列。於一些具體實施例，片段係比本文提供之序列短1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、或40-50個胺基酸。於一些具體實施例，片段之N端、C端、或兩端區域係比提供之序列短。於一些具體實施例，片段含有本文所提供序列之80%-85%、85%-90%、90%-95%、或95%-99%之胺基酸數目。

於CAR之細胞外結構域與跨膜結構域之間，或於CAR之細胞質結構域與跨膜結構域之間，可併入一間隔子結構域。本文使用之「間隔子結構域」乙詞通常是指任何寡或多胜肽，其功能係於多胜肽鏈中連接跨膜結構域至細胞外結構域或細胞質結構域。間隔子結構域可包含至多300個胺基酸，較佳為10至100個胺基酸，且最佳為25至50個胺基酸。

於一些具體實施例，CAR之間隔子及/或鉸鏈序列係選自於下列間隔子序列或鉸鏈序列之一或多者：

間隔子序列：

GGGGS(SEQ ID NO：1)

GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)

GGGGS x3(SEQ ID NO：3)

GS18：GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：4)

218S：GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO：5)

GS8：GGGGSGGG(SEQ ID NO：6)

鉸鏈序列：

原始型：VEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：7)

C233S：LDPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：8)

C233P：VEPKSPDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：9)

δ5：LDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：10)

抗原結合部分

於一些具體實施例，本發明之CAR包含標靶專一性結合元件，或稱作抗原結合部分或抗原結合結構域。部分之選擇取決於界定標靶細胞表面之配體類型及數目。舉例而言，可選擇抗原結合結構域以識別配體，該配體為特定疾病狀態相關聯之標靶細胞上之細胞表面標記。因此，可作為本發明CAR抗原部分結構域之配體之細胞表面標記之實例包括，該些與病毒、細菌、與寄生蟲感染、自體免疫疾病、及癌症細胞相關聯者。於一些具體實施例，本發明之CAR可經基因工程以靶向感興趣之腫瘤抗原，其係藉基因工程所需之抗原結合部分，其專一性結合至腫瘤細胞上之抗原。於本發明全文中，「腫瘤抗原」或「過度增生失調抗原」或「過度增生失調相關聯之抗原」是指抗原係常見於特定過度增生失調如癌症。本文所討論之抗原係僅包括以實例方式。所列者未旨在排他性，且進一步之實例將易於由本領域之技術人員所顯見。

CAR之抗原結合結構域可靶向，例如，CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、CD37 PSMA、醣脂質F77、HER2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、及MAGE A3 TCR。或者，CAR之抗原結合結構域部分 靶向抗原，其包括但不限於，FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌性素受體、助孕酮受體、HER-2/neu、uPA、PAI-1、及其類似物。其他可靶向之癌症專一性抗原係揭示於PCT公開號WO2013/123061(第20頁)。

抗原結合結構域可為任何結合至抗原之結構域，包括但不侷限於，單株抗體、單鏈抗體(如scFvs)、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、及其片段。於一些情況下，抗原結合結構域源自相同物種係有利，其中CAR最終將被使用。舉例而言，用於人類時，CAR之抗原結合結構域包含人類抗體或其片段是有利的。因此，於一具體實施例，抗原結合結構域部分包含人類抗體或其片段。

於人體內之抗體使用方面，較佳可使用人類抗體。完全之人類抗體係具體適合人類個體之治療。人類抗體可由多種本領域習知之方法製造，包括噬菌體顯示法，其使用衍生自人類免疫球蛋白序列之抗體庫，包括該些技術之改進。亦參見美國專利號4,444,887與4,716,111；以及PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、及WO91/10741；其之每一者係併入本案以作為參考資料。人類抗體亦可為重鏈與輕鏈係由衍生自人類DNA源之一或多者之核苷酸序列所編碼之抗體。人類抗體亦可以轉基因小鼠生產，其無法表現功能性內源性免疫球蛋白，但其可表現人類免疫球蛋白基因。舉例而言，人類重鏈與輕鏈免疫球蛋白基因複合體可隨機導入或藉同源重組進入小鼠胚胎幹細胞。或者，除了人類重鏈與輕鏈基因以外，小鼠胚胎幹細胞可導入人類可變區、恆定區、及輸送區。小鼠重鏈與輕鏈免疫球蛋白基因可藉同源重組導入人類免疫球蛋白基因座以個別或 同時呈現非功能性。舉例而言，據描述，於嵌合及生殖細胞系(germ-line)突變體小鼠，抗體重鏈連接區(JH)基因之同型組合缺失(homozygous deletion)造成內源性抗體生產之完全抑制。經改良之胚胎幹細胞係經擴增及顯微注射至胚囊以產生嵌合小鼠。嵌合小鼠隨後經飼養以產生同型組合子代，其表現人類抗體。轉基因小鼠係以經選取之抗原(如本發明多胜肽之全部或一部分)正常接種。

針對抗原之抗體，可取自接種之轉基因小鼠，其係使用常規之融合瘤技術。轉基因小鼠所含之人類免疫球蛋白轉基因於B細胞分化期間重排，且隨後經受類別轉換(class switching)及體細胞突變。因此，使用此技術，可能產生治療上適用之IgG、IgA、IgM、及IgE抗體，包括但不侷限於，IgGl(γ1)及IgG3。以此技術產生人類抗體與人類單株抗體及生產此類抗體之步驟之詳盡討論，參見如PCT公開號WO2014/055771、WO 98/24893、WO 96/34096、及WO 96/33735；以及美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；以及5,939,598，其每一者在此併入本案以作為參考資料。

「人源」抗體保留類似於原抗體之抗原專一性，亦即於本發明中，結合如CD19之能力。

於一些具體實施例，本發明之CAR之抗原結合部分靶向CD19。於一些具體實施例，較佳地，本發明之CAR之抗原結合部分係完全人類抗CD19 scFV。示例性CD19 scFVs係揭示於美國專利號US7902338與US7109304，及美國公開申請號US20070178103與US20130287748，及PCT公開申請號WO2014153270A1，其每一者在此併入本案以作為參考資料，尤其是關於CD19 scFVs之相關揭示。示例性CD19 scFVs係提供於SEQ ID NOs：34-45所示之序列。於一些具體實施例，CD19 scFV包含SEQ ID NOs：34-45之任一者所示之序列或其 變體，其係至少80%、85%、90%、95%、98%、或99%等同於SEQ ID NOs：34-45之任一者。

跨膜結構域

關於跨膜結構域，CAR可經設計以包含跨膜結構域，其係融合至CAR之細胞外結構域。於一具體實施例，使用跨膜結構域，其自然地與CAR之結構域之一者結合。於一些情況下，跨膜結構域可經選取或藉胺基酸取代修飾，以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域，減少與其他受體複合體成員之交互作用。

跨膜結構域可源自天然或合成來源。若為天然來源，結構域可源自任何膜結合或跨膜蛋白。本發明特定使用之跨膜區域可源自T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、及CD154(如包含至少該跨膜區)。於一些情況下，亦可使用多種人類鉸鏈，包括人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈。可以本領域習知或本文所述之任何方法鑑定跨膜結構域，如使用UniProt資料庫。

於一些具體實施例，跨膜結構域可為經合成，於此情況，其主要包含疏水性殘基如白胺酸及纈胺酸。較佳地，合成跨膜結構域之各端將發現苯丙胺酸、色胺酸、及纈胺酸三聯體。可視需要地，一短之寡或多胜肽連接子，較佳為介於2與10個胺基酸之長度，可於CAR之跨膜結構域與細胞質信號結構域之間形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供具體適用之連接子。

於一些具體實施例，本發明CAR之跨膜結構域係CD8跨膜結構域。為此目的，CD8之序列係揭示於PCT公開號WO2014/055771。

於一些具體實施例，本發明之CAR之跨膜結構域係CD28跨膜結構域。參見附錄A。

於一些具體實施例，本發明之CAR之跨膜結構域係CD28跨膜結構域。以下提供CD28之示例性序列，以及示例性跨膜結構域序列。於一些具體實施例，CD28跨膜結構域包含下列示例性跨膜結構域序列、或其片段或變體，其能使含該序列之CAR錨泊至細胞膜。本領域之技術人員應理解到，完整之跨膜結構域、或其部分，可與細胞質結構域、或其部分一起實施。於一些具體實施例，所使用之跨膜及細胞質結構域為CD28序列之鄰接部分。

CD28(胺基酸19-220)

(SEQ ID NO：11)

CD28(胺基酸153-179，跨膜結構域)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：12)

於一些具體實施例，本發明之CAR包含一CD28區域，其含有全部或部分之細胞外結構域、全部或部分之跨膜結構域、及全部或部分之細胞質結構域。以下提供CAR涵蓋之CD28區域之示例性序列。於一些具體實施例，CD28跨膜結構域包含下列示例性跨膜結構域序列、或其片段或變體，其能使含該序列之CAR錨泊至細胞膜。

CD28區域

(SEQ ID NO：13)

於一些具體實施例，本發明CAR之跨膜結構域係CD27跨膜結構域。以下提供CD27之示例性序列。本領域之技術人員應理解到，完整CD27之跨膜結構域、或其部分，可與細胞質結構域、或其部分一起實施。於一些具體實施例，結構域為CD27序列之鄰接部分。

CD27(胺基酸20-260)

(SEQ ID NO：14)

於一些具體實施例，本發明CAR之跨膜結構域包含鉸鏈結構域，如CD8鉸鏈結構域。參見PCT公開號WO2014/055771，其揭示一示例性CD8鉸鏈結構域序列。以下亦提供示例性CD8鉸鏈結構域序列。於一些具體實施例，CD8鉸鏈結構域包含下列示例性序列、或其片段或變體，其於CAR或連接至鉸鏈結構域之結構域能提供撓性(flexibility)或防止立體阻礙。於一些情況下，亦可使用各種人類鉸鏈，包括人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈。

CD8鉸鏈結構域

AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：15)

細胞質結構域

於一些具體實施例，本發明CAR之細胞質結構域或細胞內信號結構域係職司活化免疫細胞之正常效應子功能之至少一者，其中該免疫細胞係置入CAR。「效應子功能」乙詞是指細胞之特定功能。T細胞之效應子功能，例如，可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。因此，「細胞內信號結構域」乙詞是指傳遞效應子功能信號及導引細胞執行特定功能之蛋白質部分。雖然通常可使用整個細胞內信號結構域，但許多情況下，無須使用整個鏈。於一定程度上，使用細胞內信號結構域之一截斷部分時，此截斷部分可用於替代完整之鏈，只要其可傳遞效應子功能信號。因此，「細胞內信號結構域」乙詞是指包括足以傳遞效應子功能信號之細胞內信號結構域之任何截斷部分。

用於本發明之CAR之細胞內信號結構域之實例包括T細胞受體(TCR)及共受體之細胞質序列，其於抗原受體結合後作用一致以啟動信號傳遞，以及該些序列之任何衍生物或變體，及具相同功能能力之任何合成序列。

已知，通過單獨之TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且需要次級或共刺激信號。因此，T細胞活化可藉二不同類別之細胞質信號序列介導：彼等通過TCR啟動抗原依賴性初級活化者(初級細胞質信號序列)及彼等以抗原非依賴性方式作用以提供次級或共刺激信號者(次級細胞質信號序列)。

初級細胞質信號序列以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合體之初級活化。以刺激方式作用之初級細胞質信號序列可含有信號模體，其稱作免疫受體酪胺酸系活化模體或ITAMs。本發明特別使用之含初級細胞質信號序列之IT AM之實例包括該些源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者。具體較佳為，本發明之CAR之細胞質信號分子包含源自CD3ζ之細胞質信號序列。

CAR之細胞質結構域可經設計以包含CD3ζ信號結構域本身或結合任何其他適用於本發明之CAR所需之細胞質結構域。舉例而言，CAR之細胞質結構域可包含CD3ζ鏈部分及共刺激信號區。共刺激信號區係指CAR之一部分，其包含共刺激分子之細胞內結構域。因此，雖然本發明主要以CD28、CD137、及CD27列舉作為共刺激信號元件，但其他額外之共刺激元件係落入本發明之範疇。

於本發明之CAR之細胞質信號部分內之細胞質信號序列可以隨機或特定順序彼此連接。可視需要地，短之寡或多胜肽連接子，較佳為介於2與10個胺基酸長度之間，可形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供具體適用之連接子。

於一些具體實施例，細胞質結構域係經設計以包含CD3ζ之信號結構域及CD28、CD137、及CD27之信號結構域。

於一些具體實施例，細胞質結構域包含CD27細胞內信號結構域(如CD27細胞質信號結構域)。於一些具體實施例，CD27信號結構域顯示效應子信號功能，其增進免疫效應子活性，包括但不侷限於，細胞增生及細胞介素產生。以下提供示例性CD27信號結構域序列。於一些具體實施例，CD27信號結構域包含下列示例性序列、或其片段或變體，當包括於CAR中時，其具相同或改進之功能(如細胞溶解活性、細胞增生、或分泌細胞介素)，並可與含以下示例性序列之CAR相比較。其功能可以本領域習知之任何適用方法測試。

CD27信號結構域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：16)

於一些具體實施例，細胞質結構域包含CD137細胞內信號結構域(如CD137細胞質信號結構域)。以下提供示例性CD137信號結構域序列。

CD137信號結構域

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17)

於一些具體實施例，細胞質結構域包含CD28細胞內信號結構域(如CD28細胞質信號結構域)。以下提供示例性CD28信號結構域序列。

CD28信號結構域

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：18)

於一些具體實施例，本發明之CAR包含源自CD3ζ之細胞質信號序列。以下提供CD3ζ結構域序列之實例。於一些具體實施例，CD3ζ信號結構域包含以下CD3ζ序列之一者、或其片段或變體，當包括於CAR中時，其具相同或改進之功能(如細胞溶解活性或分泌細胞介素)，並可與含以下序列之CAR相比較。

CD3ζ信號結構域

(SEQ ID NO：19)

CD3ζ信號結構域

(SEQ ID NO：20)

CAR之細胞質結構域可經設計以包含CD3ζ信號結構域，並結合 適用於本發明之CAR之任何其他所需之細胞質結構域。舉例而言，CAR之細胞質結構域可包含CD3ζ結構域及共刺激信號區。共刺激信號區意指含共刺激分子之細胞內結構域之CAR之一部分。因此，雖然本發明主要以4-1BB、CD28、CD137、及CD27列舉作為共刺激信號元件，但其他額外之共刺激元件係落入本發明之範疇。以下顯示共刺激信號區之示例序列。

CD28(胺基酸180-220，細胞質結構域)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：21)

4-1BB(CD137)細胞內TRAF結合結構域

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：22)

ICOS細胞內結構域

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：23)

OX40細胞內結構域

ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：24)

CD27細胞內結構域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：25)

CD127細胞內結構域

(SEQ ID NO：26)

於一些具體實施例，本發明之CAR包含細胞凋亡誘導基因凋亡蛋白酶9或其結構域或截斷版本。以下為示例性凋亡蛋白酶9序列及截斷序列。於 一些具體實施例，CAR包含一連接子(如胜肽連接子)，其係介於CD3ζ結構域與凋亡蛋白酶9之間。

於一些具體實施例，本發明之CAR包含細胞凋亡誘導基因凋亡蛋白酶9或其結構域或截斷版本。以下為示例性凋亡蛋白酶9序列及截斷序列。於一些具體實施例，CAR包含一連接子(如胜肽連接子)，其係介於CD3ζ結構域與凋亡蛋白酶9之間。

凋亡蛋白酶9胺基酸序列

(SEQ ID NO：27)

截斷型凋亡蛋白酶9胺基酸序列

(SEQ ID NO：28)

於一些具體實施例，介於CD3ζ結構域與凋亡蛋白酶9結構域間之胜肽連接子為2A胜肽連接子。「2A胜肽連接子」是指編碼微小核醣核酸病毒之2A區域(如口蹄疫病毒(F2A)、馬鼻病毒A(equine rhinitis A virus；E2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna virus；T2A)、及豬鐵士古病毒-1(P2A))之胺基酸序列、或其部分。一般而言，2A胜肽連接子藉核糖體跳躍(ribosome skipping)使得多順反子(multicistronic)蛋白表現。以下提供2A連接子之實例。

F2A：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：30)

E2A：QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：31)

T2A：EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：32)

P2A：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：33)

於一些具體實施例，細胞質結構域進一步包含iCasp9結構域及/或FKBP結構域。一般而言，FK506結合蛋白(FKBP)於存在特定小分子(如FK1012、FK506、FKCsA、雷帕黴素、香豆黴素、吉貝素、HaXS等)時二聚化。因此，FKBP係適用於進行化學二聚合化。舉例而言，FKBP結構域可融合至不活化之凋亡蛋白酶9(iCasp9)。於特定小分子存在下，iCasp9-FKBP蛋白將二聚化且活化凋亡蛋白酶9，從而誘發含iCasp9-FKBP融合蛋白之細胞凋亡。以下提供示例性經突變之FK506結合蛋白模體。

FKBP f36v胺基酸序列

(SEQ ID NO：29)

於一些具體實施例，CAR包含或組成自以下序列，其係由包括於 其中之示例性結構域分解：

抗CD19 scFv鏈1(如SEQ ID NOs：34-45之任一者之鏈1)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(可視需要之連接子；SEQ ID NO：5)

抗CD19 scFV鏈2(如SEQ ID NOs：34-45之任一者之鏈2)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(可視需要之連接子；SEQ ID NO：5)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(CD28跨膜結構域；SEQ ID NO：12)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(CD137細胞質信號結構域；SEQ ID NO：17)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(可視需要之連接子；SEQ ID NO：5)

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(CD27細胞質信號結構域；SEQ ID NO：14)

(CD3ζ信號結構域；SEQ ID NO：19)

2A連接子(如SEQ ID NOs.30-33之任一者)

(截斷型凋亡蛋白酶9，SEQ ID NO：28)。

然而，應理解到，本文所述序列之其他結合物可用於CAR。

載體

於一些具體實施例，本發明涵蓋包含CAR序列之DNA構築體，其中該序列包含抗原結合部分之核酸序列，其係可操作地連接至細胞內結構域之核酸序列。可用於本發明之CAR之示例性細胞內結構域包括但不侷限於，CD3ζ、CD27、CD137、CD28之細胞內結構域及其類似物。於一些情況下，CAR可進一步包含細胞凋亡誘導基因凋亡蛋白酶9。

可以本領域習知之重組方法取得編碼所需之分子之核酸序列，像是例如，利用標準方法，藉從表現該基因之細胞之基因庫篩選、藉從習知之涵蓋該基因之載體衍生、或藉直接從含該基因之細胞與組織分離。或者，可以合成而非選殖方式產生感興趣之基因。

本發明亦提供載體，其中插入本發明之DNA。源自反轉錄病毒(如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適用工具，係因其容許長期、穩定整入轉基因及其於子細胞之增殖。慢病毒載體具額外優於源自腫瘤反轉錄病毒(如鼠科白血病病毒)載體之優勢，係因其可轉導非增生性細胞，如肝細胞。其亦具額外之低免疫原性優勢。於另一具體實施例，所需之CAR可藉轉位子表現於細胞。

簡而言之，表現編碼CARs之天然或合成核酸典型上係藉將編碼CAR多胜肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子而達成，並將構築體併入表現載體。載體可適於複製及整入真核細胞。典型之選殖載體含有適於調節所需之核酸序列表現之轉錄與轉譯終止子、起始序列、及啟動子。本發明之表現構築體亦可用於核酸預防接種及基因治療，其係使用標準基因輸送步驟。基因輸送之方法為本領域習知。參見如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，其在此皆併入本案以作為參考資料。於另一具體實施例，本發明提供基因治療 載體。

核酸可選殖至多種載體。舉例而言，可作為選殖核酸之載體包括但不侷限於，質體、噬粒(phagemid)、噬菌體衍生物、動物病毒、及黏質體(cosmid)。特別感興趣之載體包括表現載體、複製載體、探針生成載體、及定序載體。

此外，表現載體可以病毒載體形式提供予細胞。病毒載體技術係本領域習知，且描述於如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)及其他病毒學及分子生物學手冊。適合作為載體之病毒包括但不限於，反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、及慢病毒。一般而言，適用之載體含有複製起點，其於至少一生物體具功能、啟動子序列、便利之限制性內切酶位點、及一或多個可篩選標記(如WO 01/96584；WO 01/29058；以及美國專利號6,326,193)。

許多以病毒為主之系統已發展成用於基因轉移至哺乳類動物細胞。舉例而言，反轉錄病毒提供基因輸送系統便利之平台。選取之基因可插入載體並包裝成反轉錄病毒顆粒，其係使用本領域之習知技術。隨後，重組型病毒可經分離，並於體內或體外輸送至個體之細胞。許多反轉錄病毒系統係本領域習知。於一些具體實施例，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體係本領域習知。於一具體實施例，使用慢病毒載體。

額外之啟動子元件，如強化子，可調節轉錄啟動之頻率。典型而言，彼等係位於起始位點上游30-110bp區域，儘管許多啟動子近來顯示於起始位點下游亦含有功能元件。啟動子元件間之間距常具靈活性，因此當元件彼此間倒置或移動時，仍保留啟動子功能。於胸腺核苷激酶(tk)啟動子，於活性開始 下降之前，啟動子元件間之間距可增加至50bp。根據啟動子，似乎個別之元件可協同或獨立作用以啟動轉錄。

適用之啟動子之一實例為立即早期細胞巨大性病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為強持續型啟動子序列，能驅動任何可操作地連接於其之多核苷酸序列之高程度表現。適用之啟動子之另一實例為延長生長因子-la(EF-la)。然而，亦可使用其他持續型啟動子序列，包括但不侷限於，猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、EB病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，例如但不侷限於，肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子、及肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應僅侷限於使用持續型啟動子。亦考量以誘發型啟動子作為本發明之一部分。使用誘發型啟動子可提供一分子開關，當需要表現時能開啟其可操作地連接之多核苷酸序列之表現，或當不需要表現時能關閉表現。誘發型啟動子之實例包括但不侷限於，金屬硫蛋白啟動子、醣皮質素啟動子、助孕酮啟動子、及四環黴素啟動子。

為評估CAR多胜肽或其部分之表現，欲導入細胞之表現載體亦可含有選擇性標記基因或報導基因或兩者，以促使從細胞群中鑑定及篩選出經由病毒載體轉染或感染之表現細胞。於其他方面，選擇性標記可於單獨之DNA片段上進行，並用於共轉染程序。選擇性標記與報導基因兩者可側接適當之調節序列，使其表現於宿主細胞。適用之選擇性標記包括例如，抗生素抗性基因，如neo及其類似物。

報導基因係用於鑑定潛在之經轉染細胞及評估調節序列之功 能。一般而言，報導基因為不存在於或由接受者生物體或組織表現之基因，且其編碼一多胜肽，其表現顯現在一些早期可檢測性質，如酵素活性。報導基因之表現係於DNA導入接受者細胞後於適當時間下試驗。適用之報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶之基因，或綠色螢光蛋白基因(如Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479：79-82)。適用之表現系統係習知，且可以習知之技術製備或商業上購得。一般而言，具最小5'側接區之構築體且顯示最高之報導基因表現量者，視為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因，且用於評估試劑調節啟動子驅動轉錄作用之能力。

將基因導入及表現於細胞之方法係本領域習知。於表現載體之情況中，載體可藉本領域之任何方法易於導入宿主細胞，如哺乳類動物、細菌、酵母菌、或昆蟲細胞。舉例而言，表現載體可藉物理、化學、或生物方法轉入宿主細胞。

將多核苷酸導入宿主細胞之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染(lipofection)、粒子轟炸、顯微注射、電穿孔、及其類似物。用於生產含有載體及/或外源性核酸之細胞之方法係本領域習知。參見例如，Sambrook等人之說明(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。用於將多核苷酸導入宿主細胞之較佳方法為磷酸鈣轉染。

將感興趣之多核苷酸導入宿主細胞之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體，尤其是反轉錄病毒載體，已成為最廣泛使用之哺乳類動物(如人類細胞)基因插入方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒、及腺相關病毒、及其類似物。參見例如，美國專利號5,350,674及5,585,362。

將多核苷酸導入宿主細胞之化學方法包括膠體分散系統，如巨分子複合體、奈米膠囊、微球、珠粒、及脂質為主之系統，包括水包油乳劑、珠粒、混合型珠粒、及微脂體。用作體外及體內之輸送載具之示例性膠體系統為微脂體(如人工膜囊)。

於使用非病毒輸送系統之情況中，示例性輸送載具為微脂體。脂質製劑之使用係考量到將核酸導入宿主細胞(體外、離體、或體內)。於另一方面，核酸可與脂質結合。結合脂質之核酸可包封於微脂體水性內部、於微脂體脂質雙層內散佈、經由鍵聯分子接觸微脂體，其係與微脂體及寡核苷酸兩者結合、裹入微脂體、與微脂體複合、於含脂質之溶液中分散、與脂質混合、與脂質結合、含於脂質以作為懸浮液、含於或複合於微胞、或以其他方式結合於脂質。脂質、脂質/DNA、或脂質/表現載體相關聯之組合物於溶液中未侷限於任何特定結構。舉例而言，其可以雙層結構、微胞、或「摺疊」結構存在。其亦可僅散佈於溶液中，可能形成凝集體，其尺寸或形狀不一致。脂質為脂肪物質，其可為天然存在或合成之脂質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質之脂肪小滴，以及含有長鏈脂肪烴及其衍生物之化合物類別，如脂肪酸、醇類、胺類、胺基醇類、及醛類。

適用之脂質可購自商業來源。舉例而言，肉荳蔻基卵磷脂(「DMPC」)可購自Sigma，St.Louis，MO；十六烷基磷酸酯(「DCP」)可購自K & K Laboratories(Plainview，NY)；膽固醇(「Choi」)可購自Calbiochem-Behring；肉荳蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可購自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，AL)。含有脂質之氯仿或氯仿/甲醇儲液可保存於約-20℃。氯仿係作為唯一溶劑，係因其較甲醇易於揮發。「微脂體」係一通用術語，其涵蓋多 種單層及多層脂質載具，其係藉產生封閉之脂質雙層或凝集體而形成。微脂體之特徵可為具囊泡結構，內含磷脂質雙層薄膜與內部水性介質。多層微脂體具多個脂質層，其由水性介質隔開。當磷脂質懸浮於過量之水溶液時，其自發性形成。脂質成分於形成封閉結構前經受自重排(self-rearrangement)，並將水與經溶解之溶質裹入脂質雙層之間(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋溶液中之結構比正常囊泡結構更不同的組合物。舉例而言，脂質可採用微胞結構或僅以非一致之脂質分子凝集體存在。亦考慮脂質體(lipofectamine)-核酸複合體。

於本發明中，不論用於將外源性核酸導入宿主細胞之方法或以其他方式將細胞曝露於抑制劑，為確認重組型DNA序列存在於宿主細胞，可進行多種試驗。此類試驗包括例如，本領域技術人員習知之「分子生物學」試驗，如南方與北方墨點法、RT-PCR、及PCR；「生物化學」試驗，例如檢測特定胜肽之存在與否，如藉免疫學方法(ELISAs及西方墨點法)或藉本文所述之試驗，以辨別落入本發明範疇內之試劑。

RNA轉染

於一些具體實施例，本發明之基因改造T細胞係經由導入RNA而改造。於一具體實施例，一體外轉錄之RNA CAR可以短暫轉染形式導入細胞。RNA係以聚合酶鏈鎖反應(PCR)產生之模板之體外轉錄產生。源自任何來源之感興趣之DNA可直接藉PCR轉換成模板以進行體外mRNA合成，其係使用適當之引子及RNA聚合酶。DNA之來源可為，例如，基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成之DNA序列、或任何其他適當之DNA來源。體外轉錄所需之模板為本發明之CAR。舉例而言，RNA CAR之模板包含細胞外結構域，其含 有抗CD19 scFv；跨膜結構域(如鉸鏈及CD8a之跨膜結構域或CD28之跨膜結構域)；以及細胞質結構域包含CD3ζ之信號結構域及CD28、CD137、及CD27之信號結構域。

於一具體實施例，欲用於PCR之DNA含有開放讀框。DNA可源自生物體基因體之天然存在之DNA序列。於一具體實施例，DNA為基因之一部分之感興趣基因之全長。基因可包括5'及/或3'未轉譯區(UTRs)之一些或全部。基因可包括外顯子及內含子。於一具體實施例，欲用於PCR之DNA為人類基因。於另一具體實施例，欲用於PCR之DNA係人類基因，其包括5'及3' UTRs。或者，DNA可為人工DNA序列，其未正常表現於天然存在之生物體中。示例性人工DNA序列係含有連接一起之基因部分者，其形成一編碼融合蛋白之開放讀框。連接一起之DNA部分可源自單一生物體或一者以上之生物體。

可作為DNA來源以進行PCR之基因包括編碼多胜肽之基因，其提供生物體治療或預防效用或可用於診斷生物體之疾病或失調。較佳之基因為適於短期治療之基因，或其中有關於劑量或經表現基因之安全考量者。舉例而言，於癌症、自體免疫失調、寄生蟲、病毒、細菌、真菌、或其他感染之治療方面，欲表現之轉基因可編碼多胜肽，其功能係作為免疫系統細胞之配體或受體，或功能可為刺激或抑制生物體之免疫系統。於一些具體實施例，無須延長對免疫系統持續刺激之時間，亦無須於成功之治療後持續產生改變，係因其之後可能引發新問題。於自體免疫失調之治療方面，於病發期間可能需要抑制或阻斷免疫系統，但並非長期，其可能造成病患變得對感染過度敏感。

PCR係用於產生用於體外轉錄mRNA之模板，其係用於轉染。進行PCR之方法係本領域習知。用於PCR之引子係經設計以具一些區域，其實質上 互補於欲作為PCR模板之DNA區域。本文使用之「實質上互補」是指核苷酸序列，其中引子序列鹼基之多數或全部係互補，或一或多個鹼基係非互補、或失配(mismatched)。實質上互補之序列能於PCR使用之退火(annealing)條件下退火或雜合預期之DNA標靶。引子可經設計以實質上互補於DNA模板之任何部分。舉例而言，引子可經設計以放大於細胞正常轉錄之基因部分(開放讀框)，包括5'及3' UTRs。引子亦可經設計以放大編碼感興趣之特定結構域之基因部分。於一具體實施例，引子係經設計以放大人類cDNA之編碼區，包括5'及3' UTRs之全部或部分。適用於PCR之引子係藉本領域習知之合成方法產生。

「正向引子」係含一核苷酸區域之引子，其係實質上互補於DNA模板上之核苷酸，該模板為欲放大之DNA序列之上游。本文所用之「上游」是指相對於編碼股之欲放大之DNA序列之5位置。「反向引子」係含一核苷酸區域之引子，其係實質上互補於雙股DNA模板，該模板為欲放大之DNA序列之下游。本文所用之「下游」是指相對於編碼股之欲放大之DNA序列之3'位置。

適用於PCR之任何DNA聚合酶可用於本文揭示之方法。試劑及聚合酶係商業上購自許多來源。

亦可使用具促進穩定性及/或轉譯效率能力之化學結構。RNA較佳為具5'及3' UTRs。於一具體實施例，5' UTR係介於0與3000個核苷酸長度之間。欲加至編碼區之5'及3' UTR序列長度可藉不同方法修改，包括但不侷限於，設計PCR引子，其退火至UTRs不同區。以此方法，本領域之普通技術人員可改造5'及3' UTR長度，其係於轉染後使經轉錄之RNA達到理想轉譯效率所需。

5'及3' UTRs可為天然存在、感興趣基因之內源性5'及3' UTRs。或者，可加入感興趣基因之非內源性UTR序列，其係藉將UTR序列併入正向與反 向引子或藉模板之任何其他改造。使用感興趣基因之非內源性UTR序列可適於改造RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知於3' UTR序列之富含AU元件可減少mRNA穩定性。因此，3' UTRs可經選取或設計以增加經轉錄之RNA之穩定性，其係根據本領域習知之UTRs性質。

於一具體實施例，5' UTR可含有該內源性基因之科扎克(Kozak)序列。或者，當藉上述之PCR加入感興趣基因之非內源性5' UTR時，可藉加入5' UTR序列以重新設計一共通之科扎克序列。科扎克序列可增加一些RNA轉錄本之轉譯效率，但並非所有RNAs有效轉譯所需。許多mRNAs之科扎克序列之需求係本領域習知。於其他具體實施例中，5' UTR可源自RNA病毒，其中RNA基因體於細胞內係穩定。於其他具體實施例中，於3'或5' UTR可使用各核苷酸類似物，以防止核酸外切酶降解mRNA。

欲從DNA模板合成RNA而無須基因選殖，轉錄啟動子應連接至欲轉錄序列之DNA模板上游。當將一功能為RNA聚合酶啟動子之序列加至正向引子5'端時，RNA聚合酶啟動子會併入欲轉錄之開放讀框之PCR產物上游。於一較佳具體實施例，啟動子為T7聚合酶啟動子，如本文他處所述。其他適用之啟動子包括但不限於，T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3、及SP6啟動子之共通之核苷酸序列係本領域習知。

於一較佳具體實施例，mRNA具5'端之端帽及3'端之多腺苷酸尾(poly(A)tail)，其決定核糖體結合、轉譯啟動、及細胞之mRNA穩定性。於環狀DNA模板上，如質體DNA，RNA聚合酶產生長多聯體(concatameric)產物，其不適合在真核細胞表現。質體DNA之轉錄係於3' UTR端線性化，造成正常大小之mRNA，其於真核轉染不具效用，即使轉錄後經聚腺苷酸化。

於線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄本之3'端延伸超出模板之最後一鹼基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。

將多腺苷酸/胸腺苷酸(polyA/T)延伸物整入DNA模板之常規方法為分子選殖。然而，多腺苷酸/胸腺苷酸序列整入質體DNA可導致質體不穩定，此為取自細菌細胞之質體DNA模板常受缺失及其他異常高度影響之原因。其使得選殖程序不僅費力及費時且常不可靠。此為高度需要一構築DNA模板與多腺苷酸/胸腺苷酸3'端延伸方法之原因。

於藉使用含多胸腺苷酸尾(polyT tail)，如100個胸腺苷酸尾(大小可為50-5000個胸腺苷酸)，之反向引子之PCR期間，或於藉任何其他方法，包括但不侷限於DNA連接或體外重組，之PCR後，可產生轉錄DNA模板之多腺苷酸/胸腺苷酸區段。多腺苷酸尾亦提供RNAs穩定性且減少其降解。一般而言，多腺苷酸尾之長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。於一具體實施例，多腺苷酸尾係介於100與5000個腺核苷之間。

於使用多腺苷酸聚合酶(如大腸桿菌多腺苷酸聚合酶(E-PAP))之體外轉錄後，RNAs之多腺苷酸尾可進一步延伸。於一具體實施例，將多腺苷酸尾之長度從100個核苷酸增至介於300與400個核苷酸之間，造成RNA轉譯效率增加約二倍。此外，連接不同化學基團至3'端可增加mRNA穩定性。此連接體可包含修改/人工核苷酸、適配體、及其他化合物。舉例而言，ATP類似物可併入多腺苷酸尾，其係使用多腺苷酸聚合酶。ATP類似物可進一步增加RNA穩定性。

5'端帽亦提供穩定性予RNA分子。於一較佳具體實施例，本文所揭示方法產生之RNAs包括一5'端帽。5'端帽係以本領域及本文所述之習知技術提 供(Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7：1468-95(2001)；Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。

本文所揭示方法產生之RNAs亦可包含一內部核糖體進入位址(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體、或人工設計之序列，其始於端帽非依賴性核糖體結合至mRNA，且促使啟動轉譯。適於細胞電穿孔之任何溶質，其可含有促進細胞通透性及存活力之因子，可包括例如，糖、胜肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑、及界面活性劑。

可以許多不同方法之任一者將RNA導入標靶細胞，該方法例如，商業上可得之方法，其包括但不限於，電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)、Multiporator(Eppendort，Hamburg Germany)、利用脂質轉染之陽離子性微脂體介導轉染、聚合物囊裝、胜肽介導之轉染、或生物溶解顆粒(biolistic particle)輸送系統如「基因槍」(參見例如，Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001))。

基因改造之T細胞

於一些具體實施例，CAR序列(如編碼本文所述之CAR之核酸序列)係以反轉錄病毒或慢病毒載體輸送進入細胞。表現CAR之反轉錄病毒及慢病毒載體可輸送進入不同類型之真核細胞，以及進入組織與整個生物體，其係以經轉導之細胞作為載體(carrier)或無細胞之局部或系統性輸送經囊裝、經結合、或裸載體(naked vector)。所使用之方法可針對任何目的，其中穩定表現係需要且足夠。

於其他具體實施例中，CAR序列係以體外轉錄之mRNA輸送進入細胞。體外轉錄之mRNA CAR可輸送進入不同類型之真核細胞，以及進入組織與整個生物體，其係以經轉染之細胞作為載體或無細胞之局部或系統性輸送經囊裝、經結合、或裸mRNA。所使用之方法可針對任何目的，其中短暫表現係需要且足夠。

於另一具體實施例，所需之CAR可經由轉位子表現於細胞。

所揭示之方法可應用於基礎研究及治療上之T細胞活性調控，該領域如癌症、幹細胞、急性與慢性感染、及自體免疫疾病，包括評估經基因改造之T細胞殺死標靶癌症細胞之能力。

該些方法亦提供控制寬範圍內之表現量之能力，其係藉改變，例如，啟動子或RNA輸入量，使其能個別調節表現量。此外，以PCR為基礎之mRNA生產技術大大地促使嵌合受體mRNAs之設計，使成不同結構及結合其結構域。舉例而言，於相同細胞之多嵌合受體上改變不同細胞內效應子/共刺激子結構域，使得能決定受體結合物之結構，其係評估對多抗原標靶之最高細胞毒性程度，且同時對正常細胞之最低細胞毒性。

本發明RNA轉染方法之一優勢為，RNA轉染係基本上短暫且無載體：RNA轉基因可輸送至淋巴球，並於簡短之體外細胞活化後於其中表現，係因最小表現匣無須任何額外之病毒序列。於該些條件下，轉基因無法整入宿主細胞基因體。

無須進行細胞選殖，係因RNA轉染效率及其一致性改造整體淋巴球群體之能力。以體外轉錄之RNA(IVT-RNA)之T細胞基因改造係使用二不同策略，兩者已成功地於多個動物模式中測試。細胞係以體外轉錄之RNA轉染， 其係藉由脂質轉染或電穿孔。較佳地，需以多種改造方式穩定IVT-RNA，以達到長時間表現經轉移之IVT-RNA。

一些IVT載體可由文獻中習知，其係用於標準化方式，作為體外轉錄之模板，且其係以此方法基因改造，產生穩定之RNA轉錄本。

目前，本技術之步驟係基於質體載體，其具下列結構：5' RNA聚合酶啟動子，能使RNA轉錄、其後之感興趣基因，其3'及/或5'端係側接未轉譯區(UTR)、及3'端多腺苷酸匣，其含有50-70個腺嘌呤核苷酸。於體外轉錄前，環狀質體之多腺苷酸匣下游係藉第II型限制酶線性化(識別序列相符於切割位點)。因此，多腺苷酸匣相符於轉錄本後面之多腺苷酸序列。此程序之結果為，一些核苷酸於線性化後仍為酵素切割位點之一部分，且延伸或遮蔽3'端之多腺苷酸序列。目前尚不清楚的是，此構築體之非生理上懸伸(overhang)是否影響細胞內產生之蛋白量。

RNA比傳統之質體或病毒方法具更多優勢。從RNA源之基因表現無須轉錄，且蛋白產物於轉染後快速產生。此外，由於RNA係僅由細胞質獲得，而非細胞核，因此典型之轉染方法導致極高之轉染率。此外，以質體為主之方法必須是，於研究時細胞內驅動感興趣基因表現之啟動子具活性。

於另一方面，RNA構築體可藉電穿孔輸送進入細胞。參見如核酸構築體電穿孔進入哺乳類動物細胞之配方及方法學，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841 A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1之揭示。任何習知細胞類型之電穿孔所需之各參數，包括電場強度，通常可由該領域之相關研究文獻及許多專利與申請案習知。參見如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264、及美國專利號7,173,116。電穿孔之治療應用 裝置係商業上可得，如MedPulser^TM DNA Electroporation Therapy System(Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.)，且揭示於如美國專利號6,567,694、美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701、及美國專利號6,233,482等專利；電穿孔亦可用於細胞體外轉染，如揭示於US20070128708A1。電穿孔亦可用於體外輸送核酸至細胞。

據此，電穿孔介導之投予核酸(包括表現構築體)至細胞，係使用本領技術人員習知之許多可得之裝置與電穿孔系統之任一者，呈現一種輸送感興趣RNA至標靶細胞之令人振奮之新方法。

T細胞來源

於擴增及基因改造本發明T細胞之前，可從個體取得T細胞來源。T細胞可取自許多來源，包括末梢血單核細胞、骨髓、淋巴竇組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織、及腫瘤。於本發明之特定具體實施例，可使用本領域可得之任何類型之T細胞株。於本發明之特定具體實施例，T細胞可取自採集自個體之一定單位之血液，其係使用本領域技術人員習知之任何類型之技術，如Ficoll^TM分離。於一較佳具體實施例，個體循環血之細胞係藉血球分離法(apheresis)取得。血球分離產物典型上含有淋巴球，包括T細胞、單核球、顆粒細胞、B細胞、其他有核白血球細胞、紅血球細胞、及血小板。於一具體實施例，藉血球分離法收集之細胞可經清洗以移除血漿部分，並將細胞置於適當緩衝液或培養基以利後續加工步驟。於本發明之一具體實施例，以磷酸緩衝鹽液(PBS)清洗細胞。於另一具體實施例，清洗液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多二價陽離子。再次，令人驚訝地，於不存在鈣之下，初步活化步驟導致擴大活化。如本領域之普通技術人員所能易於理解的，可藉 本領域之方法完成清洗步驟，如藉使用半自動「順流(flow-through)」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)，其係根據製造商之說明。於清洗後，細胞可再懸浮於多種生物兼容性緩衝液，像是例如，無Ca²⁺、無Mg²⁺ PBS、PlasmaLyte A、或其他具或不具緩衝液之鹽液。或者，可移除血球分離樣本中不需要之成分，並直接將細胞再懸浮於培養基。

於另一具體實施例，T細胞係分離自末梢血液淋巴球，其係藉溶解紅血球細胞及破壞單核球，例如，藉通過PERCOLL^TM梯度離心或藉逆流離心淘洗。可藉正或負篩選技術進一步分離T細胞之特定子群，如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、及CD45RO⁺ T細胞。舉例而言，於一具體實施例，T細胞係藉培養於抗CD3/抗CD28(即3x28)共軛連接之珠粒(如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一段時間而分離，使得足以正篩選所需之T細胞。於一具體實施例，時間週期約30分鐘。於進一步之具體實施例，時間週期範圍為30分鐘至36小時或更長，及其間之所有整數值。於進一步之具體實施例，時間週期為至少1、2、3、4、5、或6小時。於又另一較佳具體實施例，時間週期為10至24小時。於一較佳具體實施例，培養時間週期為24小時。於從白血病病患分離T細胞方面，使用較長之培養時間，如24小時，可增加細胞產量。可使用較長之培養時間以於任何情況下分離T細胞，其中相較於其他細胞類型，T細胞較少，例如，從腫瘤組織或從免疫力低下之個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。此外，使用較長之培養時間可增加捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，藉簡單縮短或延長時間，使得T細胞結合至CD3/CD28珠粒，及/或藉增加或減少珠粒與T細胞之比例(如本文之另外說明)，可於培養初期或過程中其他時間點優先選取T細胞子群。此外，藉增加或減少珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比例，可於培養初期 或其他所需之時間點優先選取T細胞子群。本領域之技術人員將理解到，本發明亦可使用多回合篩選。於特定具體實施例，於活化及擴增過程中，可能需要進行篩選程序及使用「未經選出」之細胞。「未經選出」之細胞亦可進行進一步之篩選回合。

可以抗體結合物完成T細胞群之負篩選富集，該抗體導向經負篩選細胞之獨特表面標記。一方法為細胞分選及/或經由負磁免疫黏附篩選，或經由流式細胞術，其使用單株抗體混合物導向存在於經負篩選細胞上之細胞表面標記。舉例而言，欲藉負篩選富集CD4⁺細胞，單株抗體混合物典型上包括CDl4、CD20、CDl lb、CDl6、HLA-DR、及CD8之抗體。於特定具體實施例，可能需要富集或正篩選調節性T細胞，其典型上表現CD4⁺、CD25⁺、CD62L^hi、GITR⁺、及FoxP3⁺。

或者，於特定具體實施例，調節性T細胞係藉抗C25共軛連接之珠粒或其他類似之篩選方法耗用。

在藉正或負篩選分離所需之細胞群方面，可改變細胞與表面(例如顆粒，如珠粒)之濃度。於特定具體實施例，可能需要明顯減少體積，其中珠粒與細胞一起混合(亦即，增加細胞濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，於一具體實施例，使用每毫升20億個細胞之濃度。於一具體實施例，使用每毫升10億個細胞之濃度。於進一步之具體實施例，使用大於每毫升1億個細胞之濃度。於進一步之具體實施例，使用每毫升1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千萬個細胞之細胞濃度。於又另一具體實施例，使用每毫升7.5、8、8.5、9、9.5千萬、或1億個細胞之細胞濃度。於進一步之具體實施例，可使用每毫升1.25或1.5億個細胞之濃度。使用高濃度可造成增加之細胞產量、細胞活化、及細胞 擴增。此外，使用高細胞濃度使得更有效捕獲可能弱表現感興趣標靶抗原之細胞，如CD28陰性T細胞，或存在許多腫瘤細胞之樣本(即白血病血液、腫瘤組織等)之細胞。此類細胞群可具治療價值且預期能取得。舉例而言，使用高濃度細胞使得更有效篩選CD8⁺ T細胞，其正常情況下具較弱之CD28表現。

於相關具體實施例，可能需要使用較低濃度之細胞。藉明顯稀釋T細胞與表面(例如顆粒，如珠粒)之混合物，可最小化顆粒與細胞間之交互作用。此能篩選表現高量之欲結合至顆粒之所需抗原之細胞。舉例而言，CD4⁺T細胞表現更高量之CD28，且於稀釋濃度下比CD8⁺T細胞能更有效捕獲。於一具體實施例，所使用之細胞濃度為5 X 10⁶/ml。於其他具體實施例，所使用之濃度可為約1 X 10⁵/ml至1 X 10⁶/ml，及其間之任何整數值。

於其他具體實施例，細胞可於2-10℃或室溫下，於不同速度及不同時間長度下培養於轉子。

刺激用T細胞亦可於清洗步驟後冷凍。期望不受理論侷限，冷凍與後續解凍步驟提供更一致之產物，係藉移除細胞群中之顆粒細胞及一定程度之單核球。於清洗步驟後，其係移除血漿及血小板，細胞可懸浮於冷凍液。儘管許多冷凍液及參數為本領域習知且將適用於本發明，其中一方法涉及使用含20%DMSO與8%人類血清白蛋白之PBS、或含10%葡聚糖40與5%葡萄糖、20%人類血清白蛋白、及7.5%DMSO，或者31.25%Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45%NaCl、10%葡聚糖40與5%葡萄糖、20%人類血清白蛋白、及7.5%DMSO之培養基、或含如Hespan與PlasmaLyte A之其他適用細胞冷凍培養基，隨後細胞以每分鐘1℃之速率冷凍於-80℃，並保存於氣相液態氮儲槽。可使用其他冷凍控制方法，以及立即置於-20℃或液態氮之非冷凍控制方法。於特定具體實施例， 冷凍保存之細胞係經解凍及清洗，如本文所述，並於使用本發明之方法活化前，於室溫下靜置1小時。

當可能需要本文所述之擴增細胞時，本發明亦考量於一預先之時間週期從個體收集血樣或血球分離產物。如此，可於任何所需時間點收集欲擴增之細胞來源，且所需之細胞(如T細胞)，係經分離及冷凍，以作為後續用於任何類型疾病或病況之T細胞治療，彼等將受益於T細胞治療，如本文所述者。於一具體實施例，通常從健康個體採集血樣或血球分離物。於特定具體實施例，血樣或血球分離物通常採集自健康個體，其具患病風險，但未發展成疾病，且感興趣細胞係經分離及冷凍以供後續使用。於特定具體實施例，T細胞可經擴增、冷凍、及於稍後使用。於特定具體實施例，從診斷為本文所述之特定疾病後不久但在任何治療前之病患收集樣本。於進一步之具體實施例，細胞係分離自任何類型之相關治療方式前之個體之血樣或血球分離物，該相關治療方式包括但不侷限於，藥劑治療，如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒藥劑、化療、放射線、免疫阻斷劑，如環孢素、硫唑嘌呤(azathioprine)、胺甲喋呤、麥考酚酯(mycophenolate)、及FK506、抗體、或其他免疫消融劑(imrnunoablative agents)，如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺(Cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、及輻射。此類藥物抑制鈣依賴性磷酸水解酶鈣調神經磷酸酶(calcineurin)(環孢素及FK506)或抑制p70S6激酶，其於生長因子誘導之信號至關重要(雷帕黴素)(Liu et al.,Cell 66：807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73：316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。於進一步之具體實施例，細胞係分離自病患並冷凍供後續使用，並結合(如之前、同時、或 之後)骨髓或幹細胞移植，T細胞消融治療使用化療藥劑如氟達拉濱、外部束放射線治療(XRT)、環磷醯胺、或抗體如OKT3或CAMPATH。於另一具體實施例，細胞係預先經分離，且可冷凍供後續使用，以用於B細胞消融治療(如與CD20反應之藥劑，如Rituxan)後之治療。

於本發明之進一步具體實施例，T細胞係於治療後直接取自病患。於此方面，已觀察到，於特定癌症治療後，具體而言是以損害免疫系統之藥物治療，於治療後不久之病患從治療中恢復正常之期間，所得之T細胞品質可能為最佳或改進其離體擴增能力。同樣地，以本文所述之方法離體操控後，該些細胞可能為較佳狀態，以增進植入及體內擴增。因此，於恢復期間，本發明考慮收集血液細胞，包括T細胞、樹狀細胞、或造血系譜之其他細胞。此外，於特定具體實施例，可使用移動化(例如，以GM-CSF移動化)及調理療法，以於個體創建一條件，其中偏好特定細胞類型之重建、再循環、再生、及/或擴增，尤其是於治療後之一指定之時間窗期間。可用於說明之細胞類型包括T細胞、B細胞、樹狀細胞、及其他免疫系統細胞。

T細胞活化及擴增

是否於T細胞基因改造之前或之後表現所需之CAR，T細胞通常以下列所述方法活化及擴增，例如，美國專利號6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美國專利申請公開號20060121005。

一般而言，本發明之T細胞係藉接觸於一表面而擴增，該表面具一刺激CD3/TCR複合體相關聯信號之試劑及一刺激T細胞表面上共刺激分子之 配體連接於其上。具體而言，T細胞群可以本文所述方式刺激，如藉接觸於抗CD3抗體、或其抗原結合片段、或固定於一表面上之抗CD2抗體、或藉接觸於蛋白激酶C活化劑(如苔蘚蟲素(bryostatin))並結合鈣離子載體。於共刺激T細胞表面上之輔助分子方面，使用結合該輔助分子之配體。舉例而言，於適合刺激T細胞增生之條件下，可以T細胞群接觸於抗CD3抗體及抗CD28抗體。欲刺激CD4⁺T細胞或CD8⁺T細胞之增生，可接觸於抗CD3抗體及抗CD28抗體。可使用之抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，如同本領域習知之常見方法(Berg et al.,Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland et al.,J.Immunol Meth.227(l-2)：53-63,1999)。

於特定具體實施例，可藉不同方法提供T細胞初級刺激信號及共刺激信號。舉例而言，提供各信號之試劑可溶於溶液或耦接至一表面。當耦接至一表面時，試劑可耦接至相同表面(亦即，以「順」式)或個別表面(亦即，以「反」式)。或者，一試劑可耦接至一表面，且另一試劑溶於溶液。於一具體實施例，提供共刺激信號之試劑係結合至細胞表面，且提供初級活化信號之試劑係溶於溶液或耦接至一表面。於特定具體實施例，兩試劑可溶於溶液。於另一具體實施例，試劑可為可溶形式，且隨後交聯至一表面，如表現Fc受體之細胞，或抗體或其他結合試劑，其將結合至該試劑。於此方面，參見例如，美國專利申請公開號20040101519及20060034810揭示之人工抗原呈現細胞(aAPCs)，其係經考量以用於活化及擴增本發明之T細胞。

於一些具體實施例，二試劑係固定於珠粒上，其位於相同珠粒上，亦即「順」，或個別珠粒上，亦即「反」。舉例而言，提供初級活化信號 之試劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段，且提供共刺激信號之試劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段；以及兩試劑係以等分子數量共固定至相同珠粒。於一具體實施例，使用1：1比例之各抗體與珠粒之結合，以進行CD4⁺T細胞擴增及T細胞生長。於本發明之特定方面，以一比例之抗CD3：CD28抗體結合至珠粒，從而相較於以1：1之比例觀察到之擴增，觀察到T細胞擴增。於一特定具體實施例，相較於以1：1之比例觀察到之擴增，觀察到約1至約3倍之增加。於一具體實施例，結合至珠粒之CD3：CD28抗體比例之範圍為100：1至1：100，及其間之所有整數值。於本發明之一態樣，抗CD28抗體結合至顆粒之量比抗CD3抗體的多，亦即，CD3：CD28之比例小於1。於本發明之特定具體實施例，結合至珠粒之抗CD28抗體與抗CD3抗體之比例大於2：1。於一特定具體實施例，使用1：100 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於另一具體實施例，使用1：75 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於進一步之具體實施例，使用1：50 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於另一具體實施例，使用1：30 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於一較佳具體實施例，使用1：10 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於另一具體實施例，使用1：3 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。於又另一具體實施例，使用3：1 CD3：CD28比例之抗體結合至珠粒。

可使用之顆粒與細胞之比例為1：500至500：1及其間之任何整數值，以刺激T細胞或其他標靶細胞。如本領域之普通技術人員可易於理解的，顆粒與細胞之比例可取決於相對於標靶細胞之粒徑。舉例而言，小尺寸珠粒僅可結合少數細胞，而較大珠粒可結合多者。於特定具體實施例，細胞與顆粒之比例範圍為1：100至100：1及其間之任何整數值，且於進一步之具體實施例，該比例包含1：9至9：1及其間之任何整數值，亦可用於刺激T細胞。抗CD3與抗CD28耦接 顆粒與T細胞之比例，其造成T細胞刺激作用，可依上述變化，然而特定較佳之數值包括1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、及15：1，其中一較佳之比例為至少1：1之每個T細胞顆粒數。於一具體實施例，所使用之顆粒與細胞比例為1：1或以下。於一特定具體實施例，較佳之顆粒與細胞比例為1：5。於進一步之具體實施例，顆粒與細胞之比例可根據刺激天數而變。舉例而言，於一具體實施例，於第一天之顆粒與細胞比例為1：1至10：1，且之後每天或隔天將額外之顆粒加至細胞至多10天，其最終比例為1：1至1：10(根據添加日之細胞計數量)。於一特定具體實施例，於第一天刺激時，顆粒與細胞之比例為1：1，並於第3及5天刺激時調整至1：5。於另一具體實施例，顆粒係以每天或隔天為基礎添加，於第1天刺激之最終比例為1：1，且第3及5天刺激則為1：5。於另一具體實施例，於第1天刺激時，顆粒與細胞之比例為2：1，並於第3及5天刺激時調整至1：10。於另一具體實施例，顆粒係以每天或隔天為基礎添加，於第1天刺激之最終比例為1：1，且第3及5天刺激則為1：10。本領域之技術人員之一者應理解到，多種其他比例可適用於本發明。具體而言，比例將根據粒徑及細胞尺寸與類型而變。

於本發明之進一步具體實施例，細胞(如T細胞)係結合於塗佈試劑之珠粒，珠粒與細胞係隨後分開，之後培養細胞。於另一具體實施例，於培養前，塗佈試劑之珠粒與細胞未分開且一起培養。於進一步之具體實施例，珠粒與細胞係首先藉施加一力(如磁力)而濃縮，造成細胞表面標記之連接增加，從而誘導細胞刺激。

舉例而言，細胞表面蛋白質可經連接，係藉容許結合抗CD3與抗CD28之順磁性珠粒(3x28珠粒)接觸T細胞。於一具體實施例，細胞(例如，10⁴至 10⁹個T細胞)與珠粒(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁性珠粒，其比例為1：1)係於緩衝液中結合，較佳為PBS(無二價陽離子，如鈣及鎂)。同樣地，本領域之該些普通技術人員可易於理解到，可使用任何細胞濃度。舉例而言，樣本中之標靶細胞可能非常稀少且僅樣本或整體樣本(即100%)之0.01%可能含有感興趣之標靶細胞。據此，任何細胞數目皆落於本發明之範疇內。於特定具體實施例，可能需要明顯減少體積，其中顆粒與細胞係一起混合(亦即，增加細胞濃度)，以確保細胞與顆粒之最大接觸。舉例而言，於一具體實施例，使用每毫升約20億個細胞之濃度。於另一具體實施例，使用每毫升大於1億個細胞之濃度。於進一步之具體實施例，使用每毫升1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千萬個細胞之細胞濃度。於又另一具體實施例，使用每毫升7.5、8、8.5、9、9.5千萬、或1億個細胞之細胞濃度。於進一步之具體實施例，可使用每毫升1.25或1.5億個細胞之濃度。使用高濃度可造成增加之細胞產量、細胞活化、及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度使得更有效捕獲可能弱表現感興趣標靶抗原之細胞，如CD28陰性T細胞。於特定具體實施例，此類細胞群可具治療價值且預期能取得。舉例而言，使用高濃度細胞使得更有效篩選CD8⁺ T細胞，其正常情況下具較弱之CD28表現。

於本發明之一具體實施例，混合物可培養數小時(約3小時)至約14天或其間之任何每小時整數值。於另一具體實施例，混合物可培養21天。於本發明之一具體實施例，珠粒與T細胞係一起培養約8天。於另一具體實施例，珠粒與T細胞係一起培養2-3天。亦可能需要數週期之刺激，以使T細胞之培養時間可為60天或以上。適當之T細胞培養條件包括適當之培養基(如最小基礎培養基或RPMI Media 1640，或X-vivo 15(Lonza))，其可含有增生與存活所需之因子， 包括血清(如胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp、及TNF-a，或本領域之技術人員習知之任何其他細胞生長添加劑。其他細胞生長添加劑包括但不限於，界面活性劑、血漿注射劑(plasmanate)、及還原劑如N-乙醯基半胱胺酸及2-巰乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15、及X-Vivo 20、優化劑(Optimizer)，具添加之胺基酸、丙酮酸鈉、及維生素，無血清或補充適量之血清(或血漿)或一指定量之激素、及/或一定量之足夠T細胞生長與擴增之細胞介素。抗生素，如青黴素與鏈黴素，係僅包括於實驗用培養基，而非於欲輸注至個體之細胞培養基。標靶細胞係維持於支援生長所需之條件下，例如，適當溫度(如37℃)及大氣環境(如空氣加上5%CO₂)。

曝露於不同刺激時間之T細胞可呈現不同特性。舉例而言，典型血液或血球分離之末梢血液單核細胞產物具輔助T細胞群(¾，CD4⁺)，其係大於細胞毒性或抑制性T細胞群(T_c，CD8⁺)。T細胞藉刺激CD3與CD28受體之離體擴增產生一T細胞群，其於約第8-9天以前主要由¾細胞組成，而於約第8-9天以後，該T細胞群包含逐漸增大之Tc細胞群。據此，根據治療目的，以主要含T_H細胞之T細胞群輸注個體可具優勢。同樣地，若已分離Tc細胞之抗原專一性子群，其可能有利於擴增此子群至更大程度。

此外，除了CD4及CD8標記以外，其他表型標記變化明顯，但在很大程度上，細胞擴增過程中具再現性。因此，此再現性使得具針對特定目的量身訂製活化之T細胞產物之能力。

治療應用

於一些具體實施例，本發明涵蓋細胞(如T細胞)，其係經改造以 表現CAR，其結合專一性抗體之抗原辨識結構域與CD3ζ、CD28、CD27、或其任何結合物之細胞內結構域。因此，於一些情況下，經轉導之T細胞可引發CAR介導之T細胞反應。

於一些具體實施例，本發明提供CAR之用途，以重新定向初級T細胞對腫瘤抗原之專一性。因此，本發明亦提供一種對哺乳類動物標靶細胞群或組織刺激T細胞介導之免疫反應之方法，其包含投予T細胞至哺乳類動物之步驟，該T細胞表現CAR，其中CAR包含一結合部分，其專一性交互作用於一預定標靶，即ζ鏈部分，其包含如人類CD3ζ之細胞內結構域，及一共刺激信號區。於一具體實施例，本發明包含一類細胞療法，其中T細胞係經基因改造以表現CAR，且CAR T細胞係輸注至有需求之接受者。經輸注之細胞能殺死接受者之腫瘤細胞。不同於抗體療法，CAR T細胞係能體內複製，造成長期持續效果，其可導致持續之腫瘤控制。

於一些具體實施例，本發明之CAR T細胞可經受穩健之體內T細胞擴增且可持續一延長之時間量。於另一具體實施例，本發明之CAR T細胞進化成特殊記憶T細胞，其可經再活化以抑制任何額外之腫瘤形成或生長。舉例而言，本發明之CD19專一性CAR T細胞可經受穩健之體內T細胞擴增，並於血液及骨髓中持續高量一延長之時間量，且形成特殊記憶T細胞。期望不受任何特定理論侷限，CAR T細胞可於遭遇時於體內分化成一中樞類記憶狀態，且隨後消除表現該替代性抗原之標靶細胞。

期望不受任何特定理論侷限，由改造CAR之T細胞引發之抗腫瘤免疫性反應可為主動或被動免疫反應。此外，CAR介導之免疫反應可為過繼性免疫治療方法之一部分，其中改造CAR之T細胞誘導特異於CAR之抗原結合部分 之免疫反應。舉例而言，CD19專一性CAR T細胞引發特異於表現CD19之細胞之免疫反應。

雖然本發明之數據特定揭示含有人類抗CD19 scFv(如C4 scFv)、跨膜結構域、及CD28、CD137、CD27與CD3ζ信號結構域之慢病毒載體，但本發明應理解為涵蓋如本文他處所述之構築體組分之每一者之任何數量之變型。亦即，本發明包括使用CAR之任何抗原結合部分，以產生特異於該抗原結合部分之CAR介導之T細胞反應。舉例而言，本發明之CAR之抗原結合部分可靶向腫瘤抗原以治療癌症。

於一些具體實施例，本發明之CAR之抗原結合部分係經設計以治療特定癌症。舉例而言，CAR可經設計以靶向FRα，其中信號結構域CD28、CD137、CD27、及CD3ζ可用於治療癌症及失調，包括但不侷限於，卵巢癌、肺癌、乳癌、腎臟癌、大腸癌、其他實體癌、及其類似物。如前述，經設計以靶向CD19之CAR可用於治療癌症，如B細胞相關之癌症。

本發明之改造CAR之T細胞亦可作為一種疫苗，用於哺乳類動物之離體預防接種及/或體內治療。較佳地，哺乳類動物為人類。

關於離體預防接種，於投予細胞至哺乳類動物之前，於體外出現至少一下列情況：i)細胞擴增；ii)將編碼CAR之核酸導入細胞；及/或iii)冷凍保存細胞。

離體程序係本領域習知，且更充分說明如下。簡言之，細胞係分離自哺乳類動物(較佳為人類)，並以表現本文所揭示CAR之載體基因改造(亦即，體外轉導或轉染)。改造CAR之細胞可投予至哺乳類動物接受者，以提供治療效益。哺乳類動物接受者可為人類，且經改造CAR之細胞相對於接受者可為 自體。或者，相對於接受者，細胞可為同種異體、同系、或異種。

造血幹細胞及祖源細胞之離體擴增程序係揭示於美國專利號5,199,942，在此併入本案以作為參考資料，可應用於本發明之細胞。其他適用方法係本領域習知，因此，本發明未侷限於任何特定之細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1)從哺乳類動物之末梢血液收取物或骨髓移出物收集CD34+造血幹細胞及祖源細胞；以及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利號5,199,942揭示之細胞生長因子以外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3、及c-kit配體，可用於培養及擴增細胞。於離體預防接種方面，除了使用基於細胞之疫苗以外，本發明亦提供用於體內預防接種之組合物及方法，以引發針對病患抗原之免疫反應。

一般而言，本文所述之經活化及擴增之細胞可用於治療及預防免疫力低下個體之疾病。具體而言，本發明之改造CAR之T細胞係用於治療卵巢癌。於特定具體實施例，本發明之細胞係用於治療具發展成卵巢癌風險之病患。因此，本發明提供用於治療或預防卵巢癌之方法，包含投予有需求之個體一治療上有效量之本發明之改造CAR之T細胞。

本發明之改造CAR之T細胞可單獨投予，或作為醫藥組合物，係結合稀釋劑及/或其他組分如IL-2或其他細胞介素或細胞群。簡言之，本發明之醫藥組合物可包含本文所述之標靶細胞群，並結合一或多個醫藥上或生理學上可接受載體、稀釋劑、或賦形劑。此類組合物可包含緩衝液如中性緩衝鹽液、磷酸緩衝鹽液、及其類似物；醣類如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多胜肽或胺基酸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(如氫氧化鋁)；以及防腐劑。

本發明之組合物較佳地係配製成靜脈投予。

本發明之醫藥組合物可以適合欲治療(或預防)之疾病之方式投予。投予量及頻率將取決於病患條件等因素，以及病患疾病種類與嚴重度，儘管適用劑量可由臨床試驗決定。

當指明「一免疫學上有效量」、「一抗腫瘤有效量」、「一抑制腫瘤有效量」、或「治療量」時，欲投予之本發明組合物之精確量可由臨床醫師判定，其中考量病患(個體)於年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移程度、及病況之個體差異。一般而言，含有本文所述之T細胞之醫藥組合物之投劑量可為每公斤體重10⁴至10⁹個細胞，較佳為每公斤體重10⁵至10⁶個細胞，包括該範圍內之所有整數值。T細胞組合物亦可以該些劑量投予多次。細胞可藉使用免疫治療常見之輸注技術投予(參見如Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。特定病患之最佳劑量及治療處方可由醫學領域之技術人員易於決定，係藉監測病患病徵且據此調整療法。

於特定具體實施例，可能需要將活化之T細胞投予至個體，之後再抽血(或進行血球分離)、根據本發明活化其中之T細胞、及以該些經活化及擴增之T細胞再輸注病患。此過程可每隔幾週進行多次。於特定具體實施例，可活化10cc至400cc之抽血樣本中之T細胞。於特定具體實施例，可活化20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc之抽血樣本中之T細胞。未受理論侷限，使用此多重抽血/多重再輸注步驟，可選出特定之T細胞群。

個體組合物之投予可以任何便利方式進行，包括霧化吸入、注射、攝入、輸血、植入、或移植。本文所述之組合物可以皮下、皮內、瘤內、節點內、髓內、肌肉、靜脈(i.v.)注射、或腹腔注射投予至病患。於一具體實施 例，本發明之T細胞組合物係藉皮內或皮下注射投予至病患。於另一具體實施例，本發明之T細胞組合物較佳地係藉靜脈注射投予。T細胞組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結、或感染位置。

於本發明之特定具體實施例，細胞以本文所述之方法或本領域習知之方法活化及擴增，其中T細胞係擴增至治療量，並結合(如之前、同時、或之後)任何數量之相關治療方式投予至病患，該相關治療方式包括但不侷限於，藥劑治療，如抗病毒治療、西多福韋(cidofovir)、及介白素-2、用於MS病患之賽德薩(Cytarabine)(亦稱作ARA-C)或那他珠單抗治療、或用於乾癬病患之依法利珠單抗治療、或用於PML病患之其他治療。於進一步之具體實施例，本發明之T細胞可用於結合化療、放射線、免疫阻斷劑，如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、麥考酚酯、及FK506、抗體、或其他免疫消融劑，如CAMPATH、抗CD3抗體或其他抗體治療、細胞毒素、氟達拉濱、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素、及輻射。此類藥物抑制鈣依賴性磷酸水解酶鈣調神經磷酸酶(環孢素及FK506)或抑制p70S6激酶，其於生長因子誘導之信號至關重要(雷帕黴素)。於進一步之具體實施例，本發明之細胞組合物係投予至病患，並結合(如之前、同時、或之後)骨髓移植、T細胞消融治療使用化療藥劑如氟達拉濱、外部束放射線治療(XRT)、環磷醯胺、或抗體如OKT3或CAMPATH。於另一具體實施例，本發明之細胞組合物係於B細胞消融治療(如與CD20反應之藥劑，如Rituxan)後投予。舉例而言，於一具體實施例，個體可能經受高化療劑量之標準治療，接著為末梢血液幹細胞移植。於特定具體實施例，於移植後，個體接受本發明之經擴增之免疫細胞輸注。於另外之具體實施例，經擴增之細胞係於手術前或後投予。

上述欲投予至病患之治療劑量，將依欲治療病況及治療接受者之確切性質而變。投予人類之劑量比例可根據本領域可接受之作法進行。CAMPATH之劑量，例如，一般而言成人病患之範圍為1至約100mg，通常每天投予，為期1與30天之間。較佳之每日劑量為每天1至10毫克，儘管於一些情況下可能使用較高劑量如至多每天40毫克(揭示於美國專利號6,120,766)。CAR T細胞之投劑及調度策略已有論及(Ertl et al,2011,Cancer Res,71：3175-81；Junghans,2010,Journal of Translational Medicine,8：55)。

實驗例

本發明之態樣係進一步參考下列實驗例以詳盡說明。除非另有指明，該些實施例之提供目的僅於說明，而未旨在侷限本發明。因此，本發明不應理解為侷限於下列實施例，反而，應理解為涵蓋任何及所有變更，其將因本文提供之內容而顯見。

實施例1：CAR T細胞基因工程靶向B細胞惡性腫瘤

圖1-17係闡述多個實例數據，證實CAR具體實施例可用於治療且有效治癒B細胞惡性腫瘤。數據係進一步說明如下。

過繼性T細胞療法之侷限為，MHC限制。腫瘤逃避係藉MHC-I及MHC-II之缺失以分別躲避CD8及CD4 T細胞。CAR-T治療之三重點包括：(a)辨別標靶抗原並取得scFv；(b)高效率基因轉移至T細胞；以及(c)改進之T細胞信號及擴增以增加功效及安全性。

以慢病毒載體將CARs輸送至T細胞可能有利之原因如下：

a)容易製備

b)大的有效負載(payload)，>9kb

c)整入分裂及非分裂細胞

d)擴增趨性(VSV-G)

e)無病毒基因表現

f)無病毒啟動子(SIN-自我不活化)

g)於免疫缺乏(AIDS)病患無HIV整入相關之癌症報告

創建一CAR-4S慢病毒載體(圖1)。CAR-4S包括scFv-CD28-CD137-CD27-CD3z-2A-iCasp9。所使用之scFV為抗CD19 scFV。加入其他結構域，以輔助共信號、T細胞存活、T細胞記憶、效應子活化、及誘導之安全性。將CAR輸送至T細胞，且顯示靶向B-ALL細胞(圖2)。進行CAR T增生試驗，其顯示4S CAR於6天時具33%之數值(圖3)。抗CD19 CAR T細胞經證實能殺死標靶CD19白血病細胞，於一些情況下，於8分鐘內誘導細胞凋亡(圖4)。

欲改進CARs之安全性，可使用CAR之二聚合化及細胞凋亡之合成誘導物，如AP1903，其可與FKBp-Casp9交互作用(圖5)。此「安全性」CARs包括4S-CARs。於4S-CAR T細胞可快速誘導細胞凋亡(圖6)。該些4S-CARs可用於lenti-4S-CAR T細胞治療，例如，於第1天收集血液及活化T細胞、於第2-3天進行CAR基因轉移、於第4天擴增CAR T細胞、及於第5天將CAR T細胞輸注至人類，以靶向人類腫瘤(圖7)。如概念之證明，顯示轉移至人類T細胞之慢病毒(LV)基因具效用(圖8)。其顯示，該些LV CAR T細胞於基因轉移後第5天表現CD28與CD8或CD28與CD27(圖9)。

接著，進行二人類病患之個案研究。個案研究1病患之詳細內容如下：

a)43歲女性-復發性-難治性Ph+ALL

b)8-2007確診，hyper-CVAD：CR

c)11-2007異體造血幹細胞移植(allo-HSCT)

d)BCR/ABL+：Gleevec

e)BCR/ABL>125%

f)ALL復發性，伊馬替尼(imatinib)抗性

g)口服達沙替尼(dasatinib)，VDLD+IL-2/胸腺素

h)尼羅替尼(Nilotinib)抗性

i)帕納替尼(Ponatinib)試驗，復發性BCR/ABL

j)復發性(BM 35%)

個案研究1病患接受1.1x10⁸之CD19 CAR T輸注。於輸注後7天之CAR T輸注反應包括發燒(39.7C)、胸悶、呼吸短促、及咳嗽帶血談。於輸注後9天，病患發燒(40C，非感染性發燒)且LDH(1333U/L對比正常值114-240U/L)升高。於CAR-T輸注後監測血漿IgG，並於CAR輸注後第19天及之後每隔3週將IVIg投予至病患(圖10)。於CAR-T輸注後亦監測血漿IgA/IgM濃度(圖11)。個案研究持續總共3次輸注：0.6-3x 10e7/kg。病患於第120天時呈BCR/ABL陰性。監測IL-6、干擾素-γ之濃度、末梢血液單核細胞(PBMCs)之CAR拷貝數、及骨髓(BM)之CAR拷貝數(圖12)。

進行第二個個案研究(個案研究2)。個案研究2病患之詳細內容提供如下：

a)34歲男性

b)存在2週之腹部腫塊病史

c)活體組織切片：NHL，伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤

a. IHC：CD20(+++)、PAX-5(+++)、CD79a(+++)、CD10(+)、Bcl-6(+)、 Mum-1(-)、Ki-67(+>75%)

b. FISH：Myc轉位

個案研究2病患之治療史顯示於下表。

個案研究2病患之CAR T細胞輸注治療步驟包括：於先前第7天收集PBMC及製備CAR T細胞、於先前第6至4天投予氟達拉濱(25mg/m2)、於第8天輸注CAR T細胞(6 x 10e7)、於第3天輸注CAR T細胞(6 x 10e7)、及於第7天輸注CAR T細胞(3.0 x 10e8)。於第11天之輸注反應包括：

a)出汗、食慾不振、噁心、嘔吐、缺氧

b)發燒：39.3℃

c)低血壓：BP 75/45mmHg

d)HR：150-180bpm

e)輸液復甦，輸注多巴胺

亦監測病患之血清尿酸及肌酸酐濃度(圖14)，以及血清細胞介素IL-6及干擾素-γ之濃度(圖15)。亦監測IgG、IgA、及IgM之濃度(圖16)。亦監測病患之臨床反應，並觀察B細胞減少情形(圖17)。

總之，4S世代CAR T細胞以高效率靶向B-ALL，CAR T細胞快速擴增且於體內根除B細胞，經輸注之CAR T細胞能快速到達BM，且4S CAR之設 計係病患之重要安全性特徵。

無需進一步說明，據信，本領域之普通技術人員之一者利用前述及下列說明性實施例，可製備及利用本發明之化合物，並實踐所揭示之方法。因此，下列工作例具體指出本發明之較佳具體實施例，且不應理解為以任何方式侷限本發明揭示之其餘部分。

<110> 佛羅里達大學研究基金會公司(UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION, INC.)

<120> 以CAR為基礎之免疫治療

<130> U1197.70039WO00

<150> US 62/002,603

<151> 2014-05-23

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔子

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔子

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔子

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS18間隔子

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 218S間隔子

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS8間隔子

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 7

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C233S鉸鏈

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C233P鉸鏈

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> δ 5鉸鏈

<400> 10

<210> 11

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28胺基酸19-220

<400> 11

<210> 12

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28跨膜結構域

<400> 12

<210> 13

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28區

<400> 13

<210> 14

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27胺基酸20-260

<400> 14

<210> 15

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8鉸鏈結構域

<400> 15

<210> 16

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27信號結構域

<400> 16

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD137信號結構域

<400> 17

<210> 18

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28信號結構域

<400> 18

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD ζ信號結構域

<400> 19

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 ζ信號結構域

<400> 20

<210> 21

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28細胞質結構域

<400> 21

<210> 22

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB細胞內TRAF結合結構域

<400> 22

<210> 23

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOS細胞內結構域

<400> 23

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40細胞內結構域

<400> 24

<210> 25

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27細胞內結構域

<400> 25

<210> 26

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD127細胞內結構域

<400> 26

<210> 27

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP9結構域

<400> 27

<210> 28

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP9截斷結構域

<400> 28

<210> 29

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FKBP f36v結構域

<400> 29

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A胜？連接子

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A胜？連接子

<400> 31

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A胜？連接子

<400> 32

<210> 33

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A胜？連接子

<400> 33

<210> 34

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 34

<210> 35

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 35

<210> 36

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scFV

<400> 36

<210> 37

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 37

<210> 38

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 38

<210> 39

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 39

<210> 40

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 40

<210> 41

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 41

<210> 42

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 42

<210> 43

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 43

<210> 44

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 44

<210> 45

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 45

Claims (45)

1. 一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸序列，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28 T細胞增生信號結構域、CD137 T細胞活化信號結構域、CD27 T細胞記憶與存活信號結構域、及自我毀滅結構域。
2. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該自我毀滅結構域包含凋亡蛋白酶9(caspase 9)結構域。
3. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該抗原結合結構域為抗體或其抗原結合片段，可視需要地，該抗原結合片段為Fab或scFv或單結構域抗體sdFv。
4. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該抗原結合結構域結合至腫瘤抗原，其中該腫瘤抗原係選自於由CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、醣脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、及其任何結合物組成之群組。
5. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該核酸序列係經分離之核酸序列及/或係經合成。
6. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
7. 如申請專利範圍第6項之CAR，其中該抗原結合結構域為抗體或其抗原結合片段。
8. 如申請專利範圍第6項之CAR，其中該抗原結合結構域結合至腫 瘤抗原，其中該腫瘤抗原係選自於由CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、醣脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、及其任何結合物組成之群組。
9. 如申請專利範圍第6項之CAR，其中該CAR係經分離之形式及/或係經合成。
10. 一種含有嵌合抗原受體(CAR)之細胞，該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
11. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中該CAR進一步包含凋亡蛋白酶9(casp9)結構域。
12. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中該抗原結合結構域為抗體或其抗原結合片段，可視需要地，該抗原結合片段為Fab或scFv。
13. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中該抗原結合結構域結合至腫瘤抗原，其中該腫瘤抗原可視需要地為CD19。
14. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中該CAR係排列如下：scFv-CD28-CD137-CD27-CD3z-2A-iCasp9。
15. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中該細胞係選自於由T細胞、自然殺手(NK)細胞、胞毒型T淋巴球(CTL)、及調節性T細胞組成之群組。
16. 如申請專利範圍第10項之細胞，其中當該抗原結合結構域結合至其相對應之抗原時，該細胞呈現抗腫瘤免疫性。
17. 一種含有編碼嵌合抗原受體(CAR)核酸序列之載體，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中 該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
18. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該CAR進一步包含一凋亡蛋白酶9結構域。
19. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該抗原結合結構域為抗體或其抗原結合片段，可視需要地，該抗原結合片段為Fab或scFv。
20. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該抗原結合結構域結合至腫瘤抗原，其中該腫瘤抗原係選自於由CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、醣脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、及其任何結合物組成之群組。
21. 如申請專利範圍第20項之載體，其中該腫瘤抗原為CD19。
22. 一種用於刺激T細胞介導之免疫反應予哺乳類動物標靶細胞群或組織之醫藥組合物，其包含有效量之經基因改造以表現CAR之細胞，該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域；且其中該抗原結合結構域係經選擇以專一性識別該標靶細胞群或組織。
23. 一種用於提供哺乳類動物抗腫瘤免疫性之醫藥組合物，其包含有效量之經基因改造以表現CAR之細胞，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
24. 一種用於治療哺乳類動物患有與腫瘤抗原表現升高相關聯之疾病、失調、或病況之醫藥組合物，其包含有效量之經基因改造以表現CAR之細 胞，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
25. 如申請專利範圍第24項之醫藥組合物，其中該細胞為自體T細胞。
26. 如申請專利範圍第24項之醫藥組合物，其中該腫瘤抗原係選自於由CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、醣脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、及其任何結合物組成之群組。
27. 一種用於治療人類癌症之醫藥組合物，其包含經基因工程以表現CAR之T細胞，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
28. 如申請專利範圍第27項之醫藥組合物，其中該人類係耐受至少一化學治療劑。
29. 一種用於在經診斷為癌症之人類身上產生持續之經基因工程之T細胞群之醫藥組合物，其包含一經基因工程以表現CAR之T細胞，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域；且其中於投予後該持續之經基因工程之T細胞群於人體內持續至少一個月。
30. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中該持續之經基因工程之T細胞群包含至少一細胞，其選自於由投予至人體之T細胞、投予至人體 之T細胞後代、及其組合所組成之群組。
31. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中該持續之經基因工程之T細胞群包含記憶T細胞。
32. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中於投予後，該持續之經基因工程之T細胞群於人體內持續至少三個月。
33. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中於投予後，該持續之經基因工程之T細胞群於人體內持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、二年、或三年。
34. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中該癌症係經治療。
35. 一種用於在經診斷為癌症之人類身上擴增經基因工程之T細胞群之醫藥組合物，其包含經基因工程以表現CAR之T細胞，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域；且其中該經基因工程之T細胞於人體內產生後代T細胞群。
36. 如申請專利範圍第35項之醫藥組合物，其中人體內之該後代T細胞包含記憶T細胞。
37. 如申請專利範圍第35項之醫藥組合物，其中該T細胞為自體T細胞。
38. 如申請專利範圍第35項之醫藥組合物，其中於投予後，該後代T細胞群於人體內持續至少三個月。
39. 如申請專利範圍第35項之醫藥組合物，其中於投予後，該後代T細胞群於人體內持續至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、 十個月、十一個月、十二個月、二年、或三年。
40. 一種調控T細胞分泌之細胞介素之量的方法，該方法包含對T細胞進行基因工程以表現CAR，其中該CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號區、及CD3ζ信號結構域，其中該共刺激信號區包含CD28信號結構域、CD137信號結構域、及CD27信號結構域。
41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中調控T細胞分泌之細胞介素之量係減少調節性T細胞之增生。
42. 如申請專利範圍第1項之序列，其中該序列係經密碼子優化以表現於人類細胞。
43. 如申請專利範圍第42項之序列，其中該人類細胞為T細胞。
44. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該核酸序列係經密碼子優化以表現於人類細胞。
45. 如申請專利範圍第43項之載體，其中該人類細胞為T細胞。