JP2000516098A

JP2000516098A - 短シャフトアデノウイルスファイバーおよびその用途

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Publication number: JP2000516098A
Application number: JP10510960A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ウィッカム、トーマス; ダヴリュー．ロウエルヴィンク、ぺトラス; コウベスディ、イムリ
Original assignee: ジェンベク，インコーポレティッド
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2000-12-05
Also published as: EP0920524B1; AU4155597A; DE69734930T2; WO1998007877A1; AU734515B2; ATE313640T1; US5962311A; CA2263189A1; EP0920524A1; DE69734930D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、短シャフトアデノウイルスファイバー、短シャフトファイバーを含む組換えアデノウイルス、短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含むベクター、並びに短シャフト組換えアデノウイルスの細胞への侵入をもたらすように、該短シャフト組換えアデノウイルスの該細胞への接着をターゲッティングする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】短シャフトアデノウイルスファイバーおよびその用途発明の技術分野本発明は、短シャフトアデノウイルスファイバー、短シャフトファイバーを含む組換えアデノウイルス、短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含むベクター、並びに短シャフト組換えアデノウイルスの細胞内への侵入をもたらすように、該短シャフト組換えアデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングする方法に関する。発明の背景アデノウイルスは、２つの属、すなわち、マストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられるアデノウイルス科に属する（個々にHorwitz,Shenk およびMurphy，「ウイルス学」，第３版，Fieldsら編中，それぞれ2149-2171，2 111-2148および15-57頁(Raven Press，New York(1996))。ヒトアデノウイルスは、種々の動物種由来の赤血球の赤血球凝集反応パターンに基づいて、６つの亜群、すなわち、ＡからＦに分類され、さらに４９を超える血清型に分類される（Ho rwitzら，上述；およびSchnurrら，Intervirol.，36，79-83(1993)）。アデノウイルスはエンベロープのない、直径約６５ないし８０ｎｍの正二十面体である。アデノウイルスのキャプシド２５２個のキャプソマーを含み、そのうち２４０個がヘキソンで、１２個がペントンである。ヘキソンおよびペントンは３つの異なるウイルスポリペプチドに由来する（Maizelら，Virology，36，115- 125（1968）;Weberら，Virology，76，709-724(1977)）。ヘキソンはそれぞれ９６７アミノ酸の３つの同一のポリペプチド、すなわち、ポリペプチドIIを含む（ Robertsら，Science，232，1148-1151(1986)）。ペントンは、キャプシドへの接着点を提供するペントンベースと、ペントンベースに非共有結合し且つそこから突き出した三量体のファイバー蛋白質を含む。ペントンベースは、それ自身、ポリペプチドIIIの５つの同一の蛋白サブユニット（５７１アミノ酸）を含む環状の複合体である（Boudinら，Virology，92， 125-138(1979)）。ペントンベース配列は配列決定されている種々のアデノウイルス血清型間で保存されている（Neumannら，Gene，69，153-157(1988)）。ファイバー蛋白質は、ボリペプチドIVの３つの同一の蛋白サブユニット（５８２アミノ酸）を含み、テール、シャフトおよびノブを含む（Devauxら，J.Molec ．Biol. ，215，567-588(1990)）。ファイバーシャフトは、２つの交互にあるβ 鎖およびβベンドを形成すると信じられている１５アミノ酸の繰り返し配列を含む（Greenら，EMBO J.，2，1357-1365(1983)）。ファイバーシャフトの全長および１５アミノ酸繰り返し配列の数はアデノウイルスの血清型間で変動する。例えば、Ａｄ２ファイバーシャフトは長さ３７ｎｍで２２個の繰り返し配列を含むが、Ａｄ３ファイバーは長さ１１ｎｍで６個の繰り返し配列を含む。血清型の異なるアデノウイルスから１０を超えるファイバー蛋白質の配列が決定されているが、それにより他のアデノウイルス蛋白質において観察されるよりも配列の多様性が大きいことが明らかになっている。例えば、非常に近縁なＡｄ２とＡｄ５血清型由来のファイバー蛋白質のノブ領域はアミノ酸レベルで６３％しか類似していないのに対し（Chroboczekら，Virology，186，280-285(1992)）、これらのペントンベース配列は９９％同一である。しかしながら、Ａｄ２およびＡｄ５ファイバー蛋白質は、細胞受容体への結合をお互いに交叉妨害するので、どちらも同じ細胞受容体に結合するらしい。対照的に、Ａｄ２とＡｄ３ファイバーとは２０％しか同一でなく（Signasら，J ．Virol.，53，672-678(1985)）、異なる受容体に結合する（Deferら，J ．Virol.，64(8)，3661-3673(1990)）。他の蛋白質、すなわち、プロテインIX、VIおよびIIIaもまたアデノウイルスのキャプシドに存在する。これらの蛋白質はウイルスキャプシドを安定化させると考えられている（Stewartら，Cell，67，145-154(1991)；Stewartら，EMBOJ. ，12(7)，2589-2599(1993)）。あるアデノウイルス、すなわち血清型２（Ａｄ２）は、ファイバーとペントンベースを用い、はっきりと区別される細胞受容体と相互作用して細胞に接着し、効率よく細胞を感染させることがわかっている（Wickhamら，Cell，73，309-319 (1993)）。第一に、該ウイルスは、ファイバーノブに局在する受容体結合ドメイン（Henryら.，J ．Virol.，68(8)，5239-5246(1994)）を用いて、現在のところまだ同定されていない細胞表面受容体に接着する（Phil1ipsonら，J.Virol.，2 ，1064-1075(1968)；Wickhamら，Cell，73，309-319(1993)；Svenssonら，J ．Vi rol. ，38，70-81(1981)；Hennacheら，Biochem ．J.，116，237-247(1977)；Defe rら(1990)，上述；およびDiGuilmiら，Virus Res.，38，71-81(1995)）。それから、ウイルスの接着に引き続き、ペントンベースがインテグリンと呼ばれるヘテロダイマーの細胞表面受容体ファミリーのある特定のメンバーと結合する。シャフトの長いファイバーを有するＡｄ２およびＡｄ５血清型に関しては、ペントンベースは宿主細胞へのウイルスの接着に重大には関与しない（Wickhamら(1993) ，上述）。アデノウイルスペントンベースがインテグリンに結合する特異性は、対をなすインテグリンのαおよびβサブユニットの機能である。例えば、Ａｄ２ペントンベースはインテグリンα_Vβ₃およびα_Vβ₅に結合する（Wickhamら(1993)，上述；Nemerowら，「ビトロネクチンとその受容体の生物学」Preissnerら編中，177- 184頁（Elsevier Science Publishers(1993)）；およびVargaら，J.Virol.，65 ，6061-6070(1991)）。α_Vインテグリンのように、刺激されていない造血細胞を除いてほとんどすべての細胞表面上に存在するインテグリンもあるが（Gladson ら，「インテグリン」Y．Takada編中，83-99頁（CRCPress，BocaRaton，FL(1994 ))）、より狭い組織分布を有するインテグリンもある。特に、β₂インテグリンは好中球やマクロファージのような白血球上にのみ存在し、α₄ インテグリンはリンパ球や線維芽細胞上にのみ存在し、α_IIbβ₃インテグリンは血小板や巨核球上にのみ存在する。したがって、ある意味では、細胞のインテグリンサブユニット相補体が、種々の血清型のアデノウイルスのその細胞への感染能を制限する。ほとんどのインテグリンは、大多数の細胞外マトリックスリガンドに見られるトリペプチドＲＧＤ（すなわち、Arg Gly Asp）のような、リガンド中の短い直鎖状のアミノ酸部分を認識する。インテグリンα_IIBβ₃はアミノ酸配列ＫＱＡＧＤ（すなわち、Lys Gln Ala Gly Asp；配列番号１）を介してフィブリノーゲンと結合し（Kloczewiakら，Biochemistry，23，1767-1774(1984)）、α₄β₁はコア配列ＥＩＬＤＶ（すなわち、Glu Ile Leu Asp Val；配列番号２）を介してフィブロネクチンと結合する（Komoriyaら，J ．Biol．Chem.，226，15075-15079(1 991)）。α_V含有インテグリンのβサブユニットに存在する別の構造モチーフＮＰＸＹ（すなわち、Asn Pro Xaa Tyr；配列番号３）もまた、インテグリンを介する内部移行に重要であることが分かっている（Suzukiら，PNAS(USA)，87，535 4(1990)）。ＲＧＤトリペプチドはまた、アデノウイルスペントンベースとα_Vインテグリンとの相互作用においても機能するらしい。外部から添加されたＲＧＤペプチドは、ペントンベースが細胞に結合するのをブロックし（Wickhamら(1993)，上述）、ペントンベースのＲＧＤ配列中に点変異を有するアデノウイルスは細胞感染能を制限される（Baiら，J ．Virol.，67，5198-5205(1993)）。ＲＧＤトリペプチド配列はＡｄ２およびＡｄ５（どちらもＣ亜群である）ペントンベースの超可変領域に存在するが、該超可変領域はＲＧＤトリペプチド配列の領域において同一である。Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ１２（Ａ亜群）のＲＧＤ含有ペントンベースの超可変領域の二次構造解析から、それぞれの場合について、ＲＧＤモチーフはαヘリックスのそばにあることが予測され、これらがＡｄ２ペントンベースの凍結電子顕微鏡写真(cryo-EM；凍結電顕)の画像に見られる鋭く尖った部分を形成すると信じられている（Stewartら，EMBO J.，12(7),25 89-2599(1993)）。ＲＧＤトリペプチドは、Ａｄ３（Ｂ亜群；アカゲザル赤血球を強く凝集させるが、ラット赤血球は凝集させない）およびＡｄ４（Ｅ亜群）のペントンベースにも存在する。Ａｄ２またはＡｄ５がそのファイバーを介していったん細胞に接着すると、ウイルスは、ペントンベースとインテグリンの結合によって、クラスリンで被覆されたエンドサイトーシス小胞へと受容体を介して内部移行される。Ａｄ２またはＡｄ５（Ｃ亜群）ペントンベースは、おそらくはそれらのファイバーシャフト（これがα_Vインテグリンへの最初の接着を立体的に妨害するのだろう）の長さ（３７ｎｍ）のせいで、宿主細胞へのウイルス接着に重大には関与しない（Wickha mら(1993)，上述）。最終的に、ウイルス粒子は細胞の核孔複合体に輸送され、そこでウイルスゲノムは核に入り、そうして感染を開始する。アデノウイルスが効率よく細胞に侵入できることにより、治療を必要とする罹患細胞または組織に、１または２以上の組換え遺伝子をアデノウイルスを介してターゲッティング導入することが可能となっている。実際、アデノウイルスベクターは高力価（すなわち、約１０¹³ウイルス粒子／ｍｌに達する）で生産することができ且つ複製する細胞だけでなく複製しない細胞にも効率よく遺伝子を導入するので（例えば、Crystalの総説，Science，270，404-410(1995)を参照）、遺伝子治療に一般的に用いられる他のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）よりも好適である。アデノウイルスベクターは通常向気道上皮性であるのでそれらは肺の体細胞遺伝子治療に特に好適である。遺伝子治療用ベクターとしてアデノウイルスを使用することに付随する他の利点としては、(1)組換えが稀にしか見られない；(2)感染がよく起こるのにも関わらず、アデノウイルス感染がヒトに悪影響を及ぼすという顕著な相関はない；(3 )アデノウイルスゲノム（それは直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなる）は、約７．５ｋｂまでの外因性ＤＮＡを担持するのに操作することができ、例えば、アデノウイルスキャプシドに接着させることによって、より長いＤＮＡ配列を細胞内に運ぶことも可能である（Curielら，Human Gene Therapy，3，147-154(199 2)）；(4)アデノウイルスベクターは染色体外でコードする配列の発現を命令するので、アデノウイルスはおそらく細胞の通常の機能を妨げない；および（5）多年にわたり、生のアデノウイルスがヒトワクチンとして安全に使用されていることが挙げられる。しかしながら、アデノウイルスを遺伝子治療に用いることの欠点は、アデノウイルスファイバーおよびペントンベースに対する受容体を含むすべての細胞がアデノウイルスを内部移行させ、したがって、遺伝子は治療を必要としない細胞にも投与されるということである。また、ファイバー受容体またはペントンベース受容体のいずれか（例えば、インテグリン）を欠く細胞はアデノウイルスを介した遺伝子送達が損なわれるだろう（Silverら，Virology，165，377-387(1988)； Horvathら，J ．Virol.，62，341-345(1988)；およびHuangら，J.Virol.，69，22 57-2263(1995)）。同様に、アデノウイルスファイバー受容体を欠くらしい他の細胞は、アデノウイルスにより、あったとしても非常に低い効率でしか形質導入されない（Curielら(1992)，上述；cottonら，PNAS(USA),87，4033-4037(1990) ；Wattelら，Leukemia，10，171-174(1996)）。したがって、特定の細胞へのアデノウイルスの侵入を制限することおよび／またはアデノウイルスを介した遺伝子治療に従順な細胞の範囲を拡大することは現在の技術を越える意義ある進歩となるだろう。このような正確に「ターゲッティングされた」アデノウイルス遺伝子の送達はまた、ターゲッティングされた細胞内での遺伝子発現を得るのに必要なアデノウイルスベクターの量を減少させ、そうしてアデノウイルス投与量の増加に伴う副作用や合併症を減少させる可能性があるだろう。細胞ターゲッティングを達成するための努力において、アデノウイルスは、本質的に、マーカー遺伝子を含み且つ細胞結合リガンド（例えば、トランスフェリン）に共有結合したポリリジンと複合体形成して濃縮されたプラスミドＤＮＡの細胞への導入におけるエンドソーム溶解剤として使用されている（cottonら，PN AS(USA) ，89，6094-6098(1992)；およびCurielら，PNAS(USA)，88，8850-8854(1 991)）。トランスフェリンーポリリジン／ＤＮＡ複合体とアデノウイルスのカップリング（例えば、アデノウイルス指向性抗体によるか、トランスグルタミナーゼによるか、あるいはビオチン／ストレプトアビジン架橋を介して）が遺伝子導入を十分に増進することが実証されている（Wagnerら，PNAS(USA)，89，6099-61 03(1992)）。しかしながら、これらのアプローチは、リガンド（例えば、トランスフェリン）とポリリジンとを連結し且つトランスフェリンーポリリジン／ＤＮＡ複合体を前もって調製する必要があるという点で、幾分望ましくない。さらに、アデノウイルスと形成する複合体は、細胞のアデノウイルス受容体またはトランスフェリン受容体のいずれかと結合することによってエンドサイトーシスされるだろう。加えて、ポリリジンはそれ自身で細胞に結合することができ、それによってこのアプローチの特異性を妨害する。このようなアデノウイルスの非特異的結合を回避するために、アデノウイルスファイバーは、細胞表面受容体に対するリガンドの配列または二重特異的抗体（すなわち、ファイバーに対する特異性を有する一端と細胞表面受容体に対する特異性を有する他端を有する分子）への結合を可能にする配列を組み込むことによつて改変されてきた（ＰＣＴ国際特許出願WO 95/26412号（'412出願）；Watkins ら，「組換えアデノウイルスを用いたターゲッティングアデノウイルス仲介遺伝子導入」，要約No．336）。どちらの場合にも、通常のファイバー／細胞表面受容体相互作用は排除され、そのファイバーがアデノウイルスを新しい細胞表面受容体に指向し直す。ファイバーの改変を要する'412出願のアプローチに伴ういくつかの失敗の原因は、そのようなファイバーの改変がウイルスを繁殖させるのに異なる細胞株（すなわち、改変されたウイルスが現時点でターゲッティングされる受容体を有する細胞株）を必要とし、および／またはアデノウイルスを細胞内に導入するのに異なる細胞送達手段（例えば、リポソームを介した送達）を必要とするかもしれないということである。さらに、Watkinsらと'412出願のアプローチは細胞ターゲッティングにおいてアデノウイルスファイバーを使用することに制限されるらしい。ターゲッティングされた遺伝子送達への別のアプローチは、高親和性結合対の第一分子とカップリングするターゲッティング因子を投与することを含む。ここで該ターゲッティング因子は選ばれた細胞種と特異的に結合し得る（ＰＣＴ国際特許出願WO 95/31566号）。次いで、高親和性結合対の第二分子とカップリングした遺伝子送達ビークルを投与する。ここで該第二分子は、該遺伝子送達ビークルが該選ばれた細胞種にターゲッティングされるように、該第一分子と特異的に結合し得る。例えば、ターゲッティング因子がベクターを認識するドメインについて多価である場合、おそらく種々の成分の逐次投与が、形質導入効率を減少させるであろうベクター粒子の凝集を防ぐためになされるだろう。しかしながら、ベクターと複合体を形成する前にターゲッティング因子の内部移行を可能にするので、そのような逐次投与は不利である。さらに、予め投与されたターゲッティング因子の内部移行により細胞表面から受容体が一掃され、それによって複合体を形成したターゲッティング因子とベクターの効率的なターゲッティングが妨げられ、また、該受容体により制御される細胞プロセスの不全が引き起こされる可能性もある。その上、そのような早まった内部移行は比較的高レベルのターゲッティング因子の使用を必要とするだろう。本発明は組換えアデノウイルス遺伝子治療への前記アプローチの問題点の多くを克服せんとするものである。すなわち、本発明の目的は、細胞侵入のためのアデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングする方法、並びに該方法を行うための組換えアデノウイルス、ベクターおよび他の構成物を提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的、および利点、並びに本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明から明らかとなるだろう。発明の簡単な要約本発明は、本明細書に記載されるような短シャフトアデノウイルスファイバー、短シャフトファイバーを含む組換えアデノウイルス、短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含む組換えバキュロウイルス、短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含むベクター、特にウイルス導入ベクター、好ましくはアデノウイルス導入ベクター、または原核もしくは真核の発現ベクター、並びに短シャフト組換えアデノウイルスの細胞への侵入をもたらすために、該短シャフト組換えアデノウイルスの該細胞への接着をターゲッティングする方法を提供する。該方法は、アデノウイルスファイバーとその細胞表面受容体との結合のレベルまたは効率を減少させ、アデノウイルスペントンベースとその細胞表面受容体との結合を増加させ、そうして所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性を増大させる。あるいは、該方法は、非天然の（nonnative）アミノ酸配列をペントンベースもしくはファイバーノブのいずれかに導入することにより、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスのターゲッティングを可能にする。非天然アミノ酸配列は、アデノウイルスと所望の細胞表面受容体との直接または間接的（すなわち、二重または多重特異的結合剤による）結合を可能にするようなものであればよい。組換えアデノウイルスは、好ましくは、該組換えアデノウイルスが接着するかまたは該組換えアデノウイルスが内部移行する細胞内で発現し得る非天然の遺伝子を、最も好ましくは、天然のペントンベースまたはファイバーノブのアミノ酸配列に加えてまたはそれに代えて、非天然のアミノ酸配列をさらに含む。該非天然アミノ酸配列はアデノウイルスのアッセンブリを妨げず、二重特異的または多重特異的な蛋白質結合配列（例えば、抗体結合部位）や細胞受容体結合配列であってよく、ファイバーノブの露出したループ中に、あるいはＣ末端の延長としてファイバーノブのＣ末端に位置することができる。短シャフトファイバーは、テール、約１２個以下のβリピート、好ましくは約６〜約１２個のβリピート、およびノブを含むことが好ましい。短シャフトファイバーのシャフトとノブは、同じ血清型のものであっても異なる血清型のものであってもよい。短シャフトファイバーのシャフトは、天然に存在するアデノウイルスファイバー中のテールに隣接する部分（例えば、テールに隣接するシャフトの３〜６個のβリピート）のような、シャフトの一部であってよい。細胞侵入のためのアデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングする方法は、細胞に上記組換えアデノウイルスを、該細胞への該アデノウイルスの侵入をもたらすように接触させることを含む。組換えアデノウイルスが、二重特異的または多重特異的蛋白質結合配列（例えば、抗原結合部位）である非天然アミノ酸配列を含む場合、まず、(i)アデノウイルス中の二重特異的または多重特異的蛋白質結合配列とそれぞれ選択的に結合する第一成分と、(ii)細胞上の細胞表面結合部位と選択的に結合する第二成分とを含有する二重特異的または多重特異的結合剤を該組換えアデノウイルスに接触させて、アデノウイルスと二重特異的または多重特異的結合剤との複合体を形成させる。次いで、アデノウイルスの細胞への侵入をもたらすように、該細胞に該複合体を接触させる。図面の簡単な説明図１Ａは、競合非標識ファイバー２（■）および非標識ファイバー５（●）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ａｄ２の結合（コントロールに対する％）のグラフである。図１Ｂは、競合非標識ファイバー２（■）および非標識ファイバー５（●）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ａｄ５の結合（コントロールに対する％）のグラフである。図２Ａは、競合非標識ファイバー３ノブ（Ｆ３Ｋ）（■）、ファイバー５ノブ（Ｆ５Ｋ）（●）およびファイバー９ノブ（Ｆ９Ｋ）（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ａｄ２の結合（コントロールに対する％）のグラフである。図２Ｂは、競合非標識Ｆ３Ｋ（■）、Ｆ５Ｋ（●）およびＦ９Ｋ（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ａｄ３の結合（コントロールに対する％）のグラフである。図２Ｃは、競合非標識Ｆ３Ｋ（■）、Ｆ５Ｋ（●）およびＦ９Ｋ（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ａｄ９の結合（コントロールに対する％）のグラフである。図３Ａは、競合非標識Ｆ３Ｋ（■）、Ｆ５Ｋ（●）およびＦ９Ｋ（◆）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ｆ５Ｋの結合（コントロールに対する％）のグラフである。図３Ｂは、競合非標識Ｆ３Ｋ（■）、Ｆ５Ｋ（●）およびＦ９Ｋ（◆）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ／ｍｌ）に対する標識Ｆ９Ｋの結合（コントロールに対する％）のグラフである。図４Ａは、コントロール（ＣＴＲＬ）、Ｆ５Ｋ、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｌ２３０、ペントンベース（ＰＢ）およびＰＢ＋Ｆ５Ｋに対する標識Ａｄ２の結合（コントロールに対する％）の棒グラフである。図４Ｂは、ＣＴＲＬ、Ｆ９Ｋ、Ｌ２３０、ペントンベース（ＰＢ）およびＰＢ＋Ｆ９Ｋに対する標識Ａｄ９の結合（コントロールに対する％）の棒グラフである。図５Ａは、ＣＴＲＬ、Ｆ５Ｋ、Ｆ９Ｋ、ＰＢおよびＰＢ＋Ｆ５Ｋに対するＡｄ２の感染能（ＦＦＵ／１０⁶細胞）の棒グラフである。実験は抗ＰＢ抗体を用いて２回行った。図５Ｂは、ＣＴＲＬ、Ｆ５Ｋ、Ｆ９Ｋ、ＰＢおよびＰＢ＋Ｆ５Ｋに対するＡｄ９の感染能（ＦＦＵ／１０⁶細胞）の棒グラフである。実験は抗ＰＢ抗体を用いて２回行った。図６Ａは、ＣＳ−１についての、ＣＴＲＬ、Ｆ５Ｋ、ＰＢおよびＦ５Ｋ＋ＰＢに対する標識Ａｄ２の結合（コントロールに対する％）のグラフである。示された結果は３サンプルの平均で、コントロールを１００として標準化している。すべてのサンプルにおいて平均値の標準偏差は１０％以下であった。図６Ｂは、ＣＳ−１−α_Vβ５についての、ＣＴＲＬ、Ｆ５Ｋ、ＰＢおよびＦ５Ｋ＋ＰＢに対する標識Ａｄ２の結合（コントロールに対する％）のグラフである。示された結果は３サンプルの平均で、コントロールを１００として標準化している。すべてのサンプルにおいて平均値の標準偏差は１０％以下であった。図６Ｃは、ＣＳ−１についての、ＣＴＲＬ、Ｆ９Ｋ、ＰＢおよびＦ９Ｋ＋ＰＢに対する標識Ａｄ９の結合（コントロールに対する％）のグラフである。示された結果は３サンプルの平均で、コントロールを１００として標準化している。すべてのサンプルにおいて平均値の標準偏差は１０％以下であった。図６Ｄは、ＣＳ−１−α_Vβ５についての、ＣＴＲＬ、Ｆ９Ｋ、ＰＢおよびＦ９Ｋ＋ＰＢに対する標識Ａｄ９の結合（コントロールに対する％）のグラフである。示された結果は３サンプルの平均で、コントロールを１００として標準化している。すべてのサンプルにおいて平均値の標準偏差は１０％以下であった。図７は、プラスミドp193 F5F9K-Shortのマップである。図８は、コントロール、ファイバー、ＰＢおよびファイバー＋ＰＢに対するアルカリホスフェート発現（ＲＬＵ）の棒グラフである。図９は、AdSe.F5F9Kshort（■）およびAdSe（□）についての、コントロールおよび競合体ペントンおよび擬感染（mock）に対するアルカリホスフェート発現（ＲＬＵ）の棒グラフである。すべての図面について、エラーバーは標準偏差を示す。図１Ａ−４Ｂについては、数値は３回の平均である。発明の詳細な説明本発明は、少なくとも部分的には、著しく異なる指向性を示すはっきりと区別された亜群のアデノウイルス血清型が、著しく異なる結合特性を有するにも関わらず、同じ細胞ファイバー受容体を認識するという発見に基づく。例えば、Ｃ亜群ウイルスであるＡｄ２およびＡｄ５は、Ｄ亜群ウイルスであるＡｄ９と同じ細胞ファイバー受容体を認識する。しかしながら、Ｂ亜群ウイルスであるＡｄ３は、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ９血清型により認識されるものとははっきり区別される受容体を認識する。もつとも、Ａｄ２とＡｄ９は著しく異なる結合特性を示す。Ａｄ２とＡｄ９との間の結合特性における相違は、Ａｄ９がα_Vインテグリンを介して細胞と直接結合することから生じるらしい。Ａｄ２と異なり、Ａｄ９の多くの細胞株との結合はファイバー９ノブ（Ｆ９Ｋ）を競合させても排除されなかった。しかしながら、α_Vインテグリンを発現するファイバー受容体欠損細胞とのＡｄ９の結合は、α_Vンテグリンに対するモノクローナル抗体によってブロックされた。対照的に、ファイバー受容体を発現するα_Vインテグリン欠損細胞とのＡｄ９の結合は、Ｆ９Ｋによってブロックされた。同様に、α_Vβ５インテグリン欠損細胞株をβ５インテグリンサブユニットを発現するプラスミドでトランスフェクトすると、α_Vβ５インテグリンが発現し、Ｆ９Ｋによっては有意にブロックされないが、Ｆ９Ｋとペントンベースとの組み合わせではブロックされるＡｄ９の結合が起こった。これらの結果は、ファイバー５とともにＣ亜群のメンバーであり、長さが３７ｎｍのファイバー２に比べて、Ｄ亜群のメンバーとして１２〜１３ｎｍの範囲にあるファイバー９のより短い長さが、Ａｄ９ペントンベースのα_Vインテグリンとのファイバーに依存しない結合を可能にすることを示している。Ａｄ９ファイバーのシャフトの長さがより短いことは、ＨｅｐＧ２肝細胞のような、ある特定の細胞とのファイバーを介した結合の効率が減じていることとも相関がある。ファイバーの長さにおける相違により、種々のアデノウイルス血清型の著しく異なる組織指向性および結合特性も説明される。本発明は、ペントンベースまたはファイバーノブに非天然の結合配列を直接または間接的に（すなわち、二重特異的または多重特異的結合配列を介して）付加することにより、ファイバーの長さを相違させることを利用して細胞にアデノウイルスをターゲッティングする手段、および／またはファイバーとその細胞受容体との結合のレベルまたは効率を減少させ、ペントンベースとその細胞受容体との結合レベルを増加させることにより、アデノウイルスと所定の細胞との結合特異性を増大させる手段を提供する。したがって、本発明は、特に、本明細書で定義するような短シャフトアデノウイルスファイバー、そのような短シャフトファイバーを含む組換えアデノウイルス、並びに短シャフト組換えアデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングして、該短シャフト組換えアデノウイルスの細胞への侵入をもたらす方法を提供する。本発明の短シャフトアデノウイルスファイバー蛋白質は、その生化学的性質により特徴づけることができる。例えば、シャフトの長さ以外は野生型ファイバー蛋白質と同一である短シャフトアデノウイルスファイバー蛋白質は、該短シャフトファイバー蛋白質がいかなるウイルスからも離れている場合は、コグネイトファイバー受容体と効率よく結合するだろう。しかしながら、それが野生型ウイルス（例えば、Ａｄ５）中に組み込まれた場合は、アデノウイルスファイバー受容体と効率よく結合せず、したがって、それが親和性を有する細胞へのそのウイルスの結合を実質的に指示しないだろう。さらに、短シャフトファイバー蛋白質のみを有する組換えアデノウイルスの特定の細胞による取り込みは、大過剰の（例えば、飽和またはウイルス結合蛋白に対して１０００倍モル過剰の遊離蛋白）同タイプの短シャフトファイバー蛋白質によって実質的に阻害されないだろう（もちろん、該短シャフトファイバー蛋白質が、受容体または二重特異的な結合部位に特異的であり且つ組換えウイルスが結合する非天然のアミノ酸配列（例えば、組換えペントンベース中に含まれる非天然のアミノ酸配列など）を含むようにさらに改変されなければであるが）。この場合、「実質的に阻害されない」とは、ウイルスの取り込みが５０％を超えて減少しないこと、好ましくは１０％を超えて減少しないこと、いっそう好ましくは５％を超えて減少しないことを意味する。本発明において、「アデノウイルス」は、アデノウイルス科に属するいかなるウイルスであってもよく、望ましくはマストアデノウイルス属（例えば、哺乳類のアデノウイルス）またはアビアデノウイルス（例えば、鳥類のアデノウイルス）に属するものである。アデノウイルスはいかなる血清型のものでもよい。アデノウイルスまたはアデノウイルスコート蛋白質（例えば、ファイバーおよび／またはペントンベース）のソースとして用いることのできるアデノウイルス保存株は、現在アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC,Rockville，MD ）から入手できるアデノウイルス血清型１ないし４７、あるいは他のいかなるソースから入手できる他のいかなるアデノウイルス血清型からも増幅することができる。例えば、アデノウイルスは、Ａ亜群（例えば、血清型１２、１８、３１）、Ｂ亜群（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５）、Ｃ亜群（例えば、血清型１、２、５、６）、Ｄ亜群（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４７）、Ｅ亜群（血清型４）、Ｆ亜群（血清型４０、４１）または他のいかなるアデノウイルス血清型のものでもよい。しかしながら、好ましくは、アデノウイルスはＡｄ２、Ａｄ５またはＡｄ９血清型のものである。最も好ましくは、アデノウイルスは、Ｃ群のもの（特にＡｄ２およびＡｄ５血清型）−それは他の血清群（非Ｃ群）に特異的な中和抗体によって該ウイルスが中和されないことを意味する−である。Ｂ亜群の血清型は最も好ましくない。望ましくは、アデノウイルスは、同じ血清型のコート蛋白質（例えば、ペントンベース、ヘキソンおよび／またはファイバー）を含む。しかしながら、ペントンベースやファイバーのようなコート蛋白質は、（ここにさらに定義するように）そのすべてまたは一部が別の血清型由来であるという意味でキメラであっても好ましい。アデノウイルスは複製能力のあることが好ましい。あるいはそして好ましくは、アデノウイルスは、その中に少なくとも１つの改変、最適にはウイルス複製を欠損させる改変を有するゲノムを含む。アデノウイルスゲノムへの改変としては、ＤＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグメントのリアレンジメント、ＤＮＡセグメントの置換またはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるが、それらに限定されない。ＤＮＡセグメントは、小さくて１ヌクレオチド、大きくて３６キロ塩基対（すなわち、アデノウイルスゲノムのおよその大きさ）またはアデノウイルスビリオン（すなわち、約３８ｋｂ）中にパッケージングすることができる最大量である３８キロ塩基対であってよい。アデノウイルスゲノムへの好適な改変としては、ファイバーシャフト、ファイバーノブおよびペントンベースに影響を与える改変が挙げられる。好ましくは、アデノウイルスをコインテグレーション、すなわち、アデノウイルスゲノム配列と他の配列、例えば、他のウイルス、ファージまたはプラスミド配列を連結することもできる。組換えアデノウイルス本発明は、(a)短シャフトファイバー、(b)組換えアデノウイルスが接着するかまたは組換えアデノウイルスが内部移行される細胞内で発現し得る非天然の遺伝子、および最適には、天然のペントンベースまたはファイバーノブアミノ酸配列に加えて、あるいはそれに代えて、非天然のアミノ酸配列（ここで、該非天然アミノ酸配列はアデノウイルスのアッセンブリを妨げない）を含む組換えアデノウイルスを提供する。「短シャフトファイバー」とは、そのシャフトが、天然に存在する、すなわち野生型の、所定のアデノウイルスに存在するものよりも短いファイバーを意味する。短シャフトファイバーは、好ましくはテール、シャフトおよびノブを含む。ファイバーがその細胞表面受容体と結合するレベルまたは効率が減少し、ペントンベースとその細胞表面受容体との結合が増加し、それによってアデノウイルスと所定の細胞との結合特異性が増大するように、シャフトは所定のアデノウイルスの野生型シャフトよりも十分に短くあるべきである。例えば、シャフトはＡｄ２またはＡｄ５中に存在するものよりも短くあるべきである。シャフトは、より長いファイバーを、異なる血清型のものであってよいより短いファイバーで置き換えることによつて短くすることができる。もしファイバー全体（またはファイバーシャフトおよびノブ）を置き換えることによってシャフトを短くするのであれば、Ａｄ２またはＡｄ５のようなＣ亜群のファイバーをＡｄ９のようなＤ亜群のファイバーで置き換えることが好ましい。この点に関して、ファイバーシャフトとノブは同じ血清型のものであってもよく、あるいはシャフトがある血清型のものでノブが別の血清型のものであってもよい。しかしながら、Ｂ亜群のファイバーは、その長さが短いにも関わらず、その細胞表面受容体となおも強く結合するので、最も好ましくない。しかしながら、もし、例えばそのノブをＡｄ９血清型に代えたなら、Ｂ亜群のファイバーを使用することができるだろう。しかしながら、好ましくはシャフトは、該シャフトの一部、好ましくはテールに対して遠位の欠失によって短縮される。さらに、あるいは別の選択肢として、ノブをシャフトの血清型とは異なる血清型のものにすることもできる。したがって、短縮されたＡｄ２またはＡｄ５ファイバーを使用することもできるし、あるいはＡｄ９ファイバーを使用することもできる。さらに、短縮されたＡｄ２またはＡｄ５ファイバーシャフトをＡｄ９ノブとともに用いることもできるし、あるいはＡｄ９ファイバーシャフトをΛｄ２またはＡｄ５ノブとともに用いることもできる。好ましくは、シャフトは約１２個以下のβリピート、より好ましくは約６〜約１２のβリピートを含む。短シャフトファイバーのシャフトは、対応の天然に存在するアデノウイルスのファイバー中でテールに隣接するシャフトの部分のような、シャフトの一部であってよい。短シャフトファイバーはキメラであってよい。さらに短シャフトファイバーは非天然配列を介してα_Vインテグリンと結合することができる。「非天然の遺伝子」とは、対応の天然に存在する（すなわち、野生型）アデノウイルス中には見られないいかなる遺伝子をも意味する。非天然遺伝子はいかなる遺伝子でもよいが、望ましくは治療遺伝子またはリポーター遺伝子であり、それは好ましくはアデノウイルスが侵入する細胞内で発現し得るものである。治療遺伝子はＲＮＡまたは蛋白レベルでその効果を発揮するものであればよい。例えば、治療遺伝子によってコードされる蛋白質を遺伝病の治療に使用することができる（例えば、嚢胞性線維症の治療における嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子をコードするｃＤＮＡの使用）。あるいは、治療遺伝子によってコードされる蛋白質は、細胞死を誘導することによってその治療効果を発揮することができる。例えば、ジフテリア毒素Ａの発現のように、蛋白質の発現自体が細胞死を導くこともできるし、あるいは蛋白質の発現が細胞をある特定の薬剤に対して選択的に感受性にすることもできる（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子の発現は、細胞をアシクロビル、ガンシクロビルおよびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）のような抗ウイルス化合物に対して感受性にする）。さらに、治療遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム、スプラィシングもしくは３’プロセッシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を及ぼす蛋白質、または細胞内の別の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす蛋白質（すなわち、ここで遺伝子発現は、転写開始からプロセッシングされた蛋白質の産生までのすべての工程を包含すると広く解される）をコードすることによって、おそらくは特にｍＲＮＡの蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化および／または転写後調節の変化を仲介することによって、ＲＮＡレベルでその効果を発揮することができる。したがって、「治療遺伝子」なる語の使用は、当業者に知られているように、より一般的に遺伝子治療と呼ばれるものの、これらのおよび他のいかなる態様をも包含することを意図する。「非天然のアミノ酸配列」とは、所定のアデノウイルスのペントンベースまたはファイバーノブ中に見られず、遺伝子発現のレベルでそのアデノウイルスのファイバーまたはペントンベースに導入されるいかなるアミノ酸配列をも意味する。「非天然のアミノ酸配列」としては、短シャフトファイバーを有するアデノウイルスの血清型以外、特に、短シャフトファイバーを有するアデノウイルスのファイバーシャフトまたはノブまたはペントンベースの血清型以外のアデノウイルス血清型由来のアミノ酸配列が挙げられる。好ましくは、非天然アミノ酸配列は、直接または、二重特異的もしくは多重特異的結合剤（例えば、抗体もしくはその断片）を介して間接的に、標的受容体または標的受容体のクラス、好ましくは細胞特異的または組織特異的受容体に結合する能力を、短シャフトファイバーのペントンベースまたはノブに与える。好ましくは、非天然アミノ酸配列はペントンベース中に導入される。しかしながら、非天然アミノ酸配列がファイバーノブ中に導入される場合には、ファイバーノブの露出したループまたはＣ末端に導入されるのが好ましい。「受容体」とは、膜結合型および可溶性蛋白を含めて、細胞の表面上に存在する蛋白質、炭水化物、脂質または他の分子または部分を意味する。本発明において「二重特異的結合剤」は、少なくとも２つの分子（すなわち、それは３つ以上、したがって多重特異的であってもよい）に対して特異性を有する結合剤である。二重特異的結合剤は、本明細書でさらに記載するように、抗体および／または接着配列のいかなる組み合わせであってもよい。そのような二重特異的（多重特異的）結合剤は、好ましくは(i)アデノウイルス中の該二重特異的（多重特異的）蛋白結合配列に選択的に結合する第一成分および(ii)アデノウイルスが接触に至る細胞上に存在する特定の細胞表面結合部位のような、所望の細胞表面結合部位に選択的に結合する第二成分を含む。「成分」（すなわち、第一または第二成分）は、ペントンベースまたはファイバーノブ上あるいは細胞表面結合部位上の二重特異的または多重特異的蛋白結合部位と、（例えば、共有結合または非共有結合により）相互作用し得るあらゆる分子である。最適には、二重特異的結合剤の第一および第二成分は、あるやり方で、例えば、共有結合による相互作用（例えば、化学的架橋および／または２以上の蛋白ドメインの融合）または非共有結合による相互作用によって、お互いに結合している。好ましくは、成分は抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異的および／または一本鎖抗体）および／または接着配列（例えば、細胞結合部位に対するリガンド等）である。接着配列である成分は、好ましくはリガンド（例えば、受容体のような細胞表面結合部位に対する）である。二重特異的（多重特異的）結合剤中（例えば、最適には第二成分中）の細胞表面結合部位に対するリガンドの存在は、その表面上に該リガンドに対する特異的結合部位を有する細胞へのアデノウイルスのターゲッティングを提供する。好適な結合部位およびそれらのリガンドまたは接着配列の例としては、アミノ酸残基接着配列ＥＤＰＧＦＦＮＶＥ（すなわち、Glu AspP ro Gly Phe Phe Asn Val Glu；配列番号４）およびＥＰＧＫＱＬＹＮＶＥ（すなわち、Glu Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu；配列番号５）と結合するＣＲ２受容体；ＨＩＶｇｐ１２０のＶ３ループを認識するＣＤ４受容体；トランスフェリン受容体とそのリガンド；低密度リポ蛋白受容体およびそのリガンド；肺の上皮および内皮細胞上のＩＣＡＭ−１受容体とそのリガンド；および脱グリコシル化蛋白リガンドを認識するアシアロ糖蛋白が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、さらなるリガンドおよびそれらの結合部位として、好ましくは、（それらに限定されないが）直鎖状のアミノ酸部分、例えばトリペプチドＲＧＤ（すなわち、Arg Gly Asp）およびＬＤＶ（すなわち、Leu AspVal）、配列ＫＱＡＧＤ（すなわち、Lys Gln Ala Gly Asp；配列番号１）および配列ＥＩＬＤＶ（すなわち、Glu Ile Leu Asp Val；配列番号２）、並びにポリリジン（すなわち、Lys Lys Lys Lys Lys；配列番号６，但し、該配列は１ないし１０回存在してよい）およびポリアルギニン配列（すなわち、Arg Arg Arg Arg Arg；配列番号７，但し、該配列は１ないし１０回存在してよい）を認識するインテグリンが挙げられる。複数のリジンおよび／またはアルギニンの挿入はヘパリンおよびＤＮＡの認識を提供する。抗体、例えば、特定の細胞表面結合部位またはキメラもしくは野生型ペントンベースもしくはファイバーノブ上に存在するエピトープに対して指向される抗体である成分は、二重特異的結合剤、好ましくは第一成分中に組み込むことができる。そのような抗体は、該抗体が、例えば、完全な免疫グロブリン分子または当該分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)₂およびＦ(ｖ)として知られるようなその部分を含むように、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性なその部分（例えば、パラトープ（すなわち、抗原結合部位）を含む部分）を包含するが、それらに限定されない。該抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体（例えば、パラトープに加えてリガンドまたは接着配列をさらに含んでもよい）および二重特異的抗体（例えば、それ自身の中に、そしてそれ自身だけで、野生型またはキメラペントンベースまたはファイバーノブのエピトープに指向されるパラトープおよび細胞表面結合部位のエピトープに指向される別のパラトープを有する二重特異的分子であってもよい）であってもよい。本発明において、好適な抗体は、いかなる細胞表面結合部位にも指向されるもの、特に前述のものであり、また、野生型（すなわち、天然の）またはキメラのペントンベースまたはファイバーノブ中に存在するエピトープを構成するいかなる結合ドメインにも指向されるものである。したがって、最適には、抗体はＣＲ２受容体、ＣＤ４受容体、トランスフェリン受容体、低密度リポ蛋白受容体、ＩＣＡＭ−１受容体、アシアロ糖蛋白および他のいかなるインテグリンにも指向される。また、好ましくは抗体は、ペントンベースまたはファイバーノブの露出した領域（露出したループまたはＣ末端）、例えば、キャプシド蛋白から外側に突き出し且つ二重特異的抗体との結合のために立体配座的に接近可能なものに指向される。したがって、いずれかのタイプの（すなわち、細胞表面結合部位、または野生型もしくはキメラのペントンベースもしくはファイバーノブに指向される）さらなる好適な抗体としては、α_Vインテグリンに指向されるＬ２３０モノクローナル抗体；ＦＬＡＧオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫ（すなわち、Asp Ty r Lys Asp Asp Asp Asp Lys；配列番号８）に指向されるＭ２モノクローナル抗体；Ｌ２３０およびＭ２モノクローナル抗体を組み込んだＬ２３０：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；ＣＤ３−Ｔ細胞受容体に指向される抗体に結合したＦＬＡＧモノクローナル抗体を組み込んだＯＫＴ３：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；ＩＣＡＭ−１受容体に指向される抗体に結合したＦＬＡＧモノクローナル抗体を組み込んだＩＣＡＭ：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；インテグリンα_Vβ₅に指向されるＰ１Ｆ６抗体；α_Vインテグリンのαｖサブユニットに指向される１Ｂ１．３．２モノクローナル抗体；および赤血球凝集素ペプチドに指向される１２ＣＡ５モノクローナル抗体が挙げられるが、それらに限定されない。抗体は、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、一本鎖および二重特異的抗体調製用の慣用的技術、並びに当業者には周知のより最新の組換えＤＮＡ技術などの、いかなる適切な技術により製造されてもよい。例えば、特にアデノウイルスに指向される抗体は、例えば米国特許第4,487,829号に記載されるようにして製造することができる。免疫グロブリン定常領域に結合したリガンド成分を有するキメラ分子および他の免疫結合体（例えば、二重特異的抗体）は、米国特許第4,816,567号、第5,349,053号、第5,332,567号および第5,443,953号、並びにＰＣＴ国際特許出願WO 90/14424号、WO 91/05805号、WO 91/05871号、WO 92/02553 号およびWO 95/16037号；Cookら，J ．Immunol．Methods，171，227-237(1994)；およびSpoonerら，Human Pathol.，25，606-614(1994)に記載されるようにして製造することができる。特に、二重特異的抗体は、種々の手段、例えば、化学的技術（例えば、Kranzら，PNAS(USA)，78，5807(1981)を参照）、例えばＩｇＧ全体または、好ましくはＦ(ａｂ’)₂断片のジスルフィド切断再形成；２以上の特異性を有する免疫グロブリンを産生するポリオーマを形成するための２以上のクローンの融合（例えば、米国特許第4,474,893号；Segal ら，「免疫学における最新プロトコール」，Coliganら編中，第１巻，2.13.1-2. 13.16（John Wiley & Sons，Inc．(1995))を参照）；または遺伝子工学（例えば、米国特許第4,816,567号およびＰＣＴ国際特許出願WO 90/14424号を参照）によって製造することができる。二重特異的分子を含む抗体および／または接着配列のような成分は、それが、他の結合ドメインおよび／または細胞表面結合部位に比べて、アデノウイルスペントンベースまたはファイバーノブの結合ドメインおよび／または細胞表面結合部位とより大きな親和性で相互作用するとき、すなわち、その結合ドメインおよび／または細胞表面結合部位により特異的であるか、より大きな特異性を有するとき、その結合ドメインおよび／または細胞表面結合部位に「選択的に結合する」。「に特異性を有する」および「に特異的である」という語は、蛋白質が相互作用する反応物の数および種類およびこれらの反応の速度および程度に関してペプチドまたは蛋白質により示される選択性の程度、抗体が結合する抗原の数および種類およびこれらの反応の速度および程度に関して抗体により示される選択性の程度をいうか、あるいは細胞表面結合蛋白により膜を通過して輸送される物質に対する透過性の種類および程度をいう。この関連において「選択的に結合する」という語は、本発明の方法に有用であるのに十分な結合をすることを意味する。当該分野で知られているように、例えば、受容体との有用な選択的結合は、受容体付近で達成し得る結合親和性およびリガンドの濃度の両方に依存する。したがって、治療される細胞または組織が、例えば細胞表面受容体との結合と競合するのに十分な添加リガンド濃度に耐え得る限り、天然に存在するいかなる競合リガンドに対して見られるよりも低い結合親和性は有用である。「二重特異的または多重特異的蛋白結合配列」は、成分が相互作用するペントンベースまたはファイバーノブ（露出したループまたはＣ末端中の）上の領域である。この相互作用は、共有結合によるかまたは非共有結合による相互作用のいずれであってもよい。二重特異的または多重特異的蛋白結合配列は、エピトープ（すなわち、抗原決定基つまり抗原抗体反応において抗体と結合する抗原の部分）を含んでもよい。二重特異的または多重特異的蛋白結合配列はまた、好ましくは、細胞表面結合部位を認識し得るペプチド配列または蛋白ドメインである。それはまた、好ましくは、ファイバーノブまたはペントンベースに他のタンパク質をカップリングさせるのに使用される「カップラー」蛋白配列である。このような一例は、当該分野で記載されるように、ビオチンーアビジン（ストレプトアビジン）結合(例えば、Saggioら，Biochem ．J.，293，613-616(1993)；Alon，Eur ．J．Immunol. ，23，893-898(1993)；Millerら，Biochem ．J.，278，573-585(19 91)に記載)を仲介し、アビジンおよびビオチン結合蛋白に対する接着部位として働く配列である。したがって、好ましくは、二重特異的または多重特異的蛋白結合ドメインは、上記の接着配列、例えば、ＣＲ２受容体によって認識されるＥＤＰＧＦＦＮＶＥ（すなわち、Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu；配列番号４）およびＥＰＧＫＱＬＹＮＶＥ（すなわち、Glu Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu；配列番号５）；ＣＤ４受容体によって認識されるＨＩＶｇｐ１２０のＶ３ループ；トランスフェリン受容体によって認識されるリガンドトランスフェリン；低密度リポ蛋白受容体に対するリガンド；肺上皮および内皮細胞上のＩＣＡＭ−１受容体に対するリガンド；アシアロ糖蛋白によって認識される脱グリコシル化蛋白リガンド；トリペプチドＲＧＤ（すなわち、Arg Gly Asp）およびＬＤＶ（すなわち、Leu Asp Val）、配列ＫＱＡＧＤ（すなわち、Lys Gln Ala Gly Asp；配列番号１）および配列ＥＩＬＤＶ（すなわち、Glu Ile Leu Asp Val；配列番号２）のようなインテグリンによって認識される直鎖状のアミノ酸部分、並びにヘパリンおよびＤＮＡの認識を提供するポリリジン（すなわち、Lys Lys Lys Lys Ly s；配列番号６，但し、該配列は１ないし１０回存在してもよい）およびポリアルギニン（すなわち、Arg Arg Arg Arg Arg；配列番号７，但し、該配列は１ないし１０回存在してもよい）配列のいずれかを含む。また、好ましくは、二重特異的または多重特異的蛋白結合ドメインは、ＦＬＡＧオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫ（すなわち、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys；配列番号８）に指向されるＭ２モノクローナル抗体；Ｌ２３０およびＭ２モノクローナル抗体を組み込んだＬ２３０：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；ＣＤ３− Ｔ細胞受容体に指向される抗体に結合したＦＬＡＧモノクローナル抗体を組み込んだＯＫＴ３：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；ＩＣＡＭ−１受容体に指向される抗体に結合したＦＬＡＧモノクローナル抗体を組み込んだＩＣＡＭ：ＦＬＡＧ二重特異的抗体；または赤血球凝集素ペプチドに指向される１２ＣＡ５モノクローナル抗体に対するエピトープを含む。該結合ドメインは、いくぶんは野生型配列の一部を含み、いくぶんは非野生型配列の一部を含んでもよい。同様に、該結合配列を含む配列（天然のおよび／または非天然の）は、必ずしも該蛋白質のアミノ酸鎖に隣接する必要はない。言い換えれば、該結合配列は、該蛋白質の特定の立体配座によって、例えば、隣接する配列および／または隣接しない配列が相互に極めて接近するに至らしめるような蛋白質のフォールディングを通じて生じ得るものである。ベクター短シャフトファイバーを含む組換えアデノウイルスおよび特定の細胞内で１つまたは複数の非天然遺伝子を発現し得る組換えアデノウイルスは、ウイルス導入ベクター、好ましくはアデノウイルス導入ベクターを、本発明に従って使用することにより生成することができる。該ウイルス導入ベクター、好ましくはアデノウイルス導入ベクターは、本明細書で定義されるような短シャフトファイバーをコードする遺伝子配列を含む。好ましくは、短シャフトファイバー遺伝子配列は、（野生型に比べて）より短いファイバーの遺伝子、より好ましくはファイバー遺伝子の一部を含む。好ましくは、該ファイバー遺伝子配列は、約１２個以下の βリピート、好ましくは約６〜約１２のβリピートをコードするファイバー遺伝子の部分を含む。好ましくは、シャフトをコードするファイバー遺伝子の部分は、天然に存在する、すなわち野生型アデノウイルスのファイバー中のテールに隣接するβリピートをコードするファイバー遺伝子の部分である。したがって、本発明はまた、本明細書で定義されるような短シャフトファイバーをコードする遺伝子配列を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、この語が当業者に理解されているように、遺伝子導入用のビークルである。本発明のベクターとしては、プラスミド、ファージおよびウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである。好適なベクターの一例はAdSe.F5F9Kshortである。本発明のベクターは、本発明の方法に使用することができるものだけに限定されず、遺伝子導入ベクターの構築に使用することができる中間タイプのベクター（例えば、「導入ベクター」）も包含する。そのような導入ベクターの例は下記実施例において提供される。好ましくは、該ベクターは上記のような非天然遺伝子をさらに含む。アデノウイルスベクター（特に、複製欠損アデノウイルスベクター）に関して、このようなベクターは完全なキャプシド（すなわち、アデノウイルスゲノムのようなウイルスゲノムを含む）または空のキャプシド（すなわち、ウイルスゲノムがないか、例えば物理的または化学的手段により分解している）のいずれを含んでいてもよい。好ましくは、該ウイルスベクターは完全なキャプシドを、すなわち、１以上の非天然遺伝子を運ぶ手段として含む。あるいは、上述のように、非天然遺伝子をアデノウイルスキャプシドの外側に置いて細胞内に運ぶことも好ましい。方法はウイルス、プラスミドおよびファージを、それらの核酸配列の形態（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）で導入するのに利用可能であるので、同じ考え方に沿って、ベクターも同様に、キャプシド蛋白のようないかなる付随蛋白の非存在下においても、またいかなるエンベロープ脂質の非存在下においてもＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。同様に、リポソームは細胞膜との融合によって細胞侵入を果たすので、ベクターはコート蛋白をコードする構成的核酸とともにリポソームを含むことができる。そのようなリポソームは、例えば、 Life Technologies，Bethesda，MDから市販されており、製造者の推奨に従って使用することができる。さらに、リポソームを遺伝子送達を達成するのに使用することができる。製造者の手引きに従ってリポソームを調製した後か、あるいはリポソームの調製中に、（本明細書に記載する方法を用いて製造されるような）可溶性キメラコート蛋白質を、該リポソームに添加することができる。本発明のベクターは、付加的な配列および変異を、例えば、ノブおよび／またはペントンベース蛋白質および／または非天然遺伝子配列のようなアデノウイルスの短シャフトファイバー内に含むことができる。特に、本発明のベクターは、好ましくは、上記のように全合成または部分合成により製造されたコード配列もしくは他の遺伝子配列またはゲノミックもしくは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことができ、且つＤＮＡまたはＲＮＡの形態で提供され得る非天然遺伝子を含む核酸配列をさらに含む。ｍＲＮＡの発現および蛋白質の生産のために、および受容体または蛋白質の特異性およびアビディティー、三量体化能力、ペントンベース結合および他の生化学的特徴の評価のために、短シャフト組換えアデノウイルスファイバー遺伝子配列は、バキュロウイルスまたは適切な原核もしくは真核発現ベクターからアデノウイルスベクターに、あるいはアデノウイルスベクターからバキュロウイルスまたは適切な原核もしくは真核発現ベクターに移すことができる。特に、Wickham ら(1995)，上述，に記載されるようなバキュロウイルスにおける蛋白質の製造方法を使用することができる。したがって、本発明はまた、組換えバキュロウイルスおよび原核および真核プラスミド、並びに本明細書で定義されるような短シャフトファイバーをコードする遺伝子配列を含み、本明細書で定義されるような「導入ベクター」でもある発現ベクターを提供する。短シャフトファイバー遺伝子配列は、天然アミノ酸配列に加えて、あるいはそれに代えて、得られる短シャフトキメラファイバーが所望の細胞表面受容体と直接または間接的に（すなわち、二重特異的または多重特異的結合剤を介して）結合することを可能にする、非天然配列を含むことができる。アデノウイルスベクター、ＰＣＲ産物またはクローニングベクターからバキュロウイルスまたは原核もしくは真核発現ベクターに該キメラ遺伝子を移すことにより、高い蛋白質の発現を達成することができる（総蛋白のおよそ５〜５０％がキメラファイバーである）。本発明のベクターは、本明細書に記載するような短シャフトファイバーをコードする遺伝子配列のコード配列の内部に、あるいはそれに代えるかまたはその外側に、例えば短シャフトファイバー蛋白が三量体化する能力に強い影響を与える付加的な配列をさらに含むことができる。三量体化能力に強く影響する配列とは、本発明においては、短シャフトキメラファイバーの三量体化を可能にする配列である。本発明のベクター（組換えアデノウイルスベクターおよび導入ベクターを含めて）の製造に関して、導入ベクターは、当業者に知られているような標準の分子的および遺伝学的技術を用いて構築することができる。ビリオン、すなわちウイルス粒子を含むベクター（例えば、組換えアデノウイルスベクター）は、適当な細胞株内でウイルスベクターを用いて製造することができる。同様に、ファイバーキメラ含有粒子は、標準的な細胞株、例えば、現在アデノウイルスベクター用に使用されている細胞株内で製造することができる。得られたこれらの粒子は、次いで、本明細書に記載するような非天然アミノ酸配列を含み得るペントンベースを介して、あるいはそのノブが本明細書に記載するような非天然アミノ酸配列を含み得るファイバーを介して、特定の細胞にターゲッティングすることができる。このターゲッティングは直接的であっても、例えば、二重特異的または多重特異的結合剤、例えば抗体またはその断片を介して、間接的であってもよい。短シャフトアデノウイルスファイバーしたがって、本発明はまた、短シャフトアデノウイルスファイバーを提供する。望ましくは、短シャフトアデノウイルスファイバーは、例えば、より長いファイバーまたはより長いシャフトおよびノブをより短いファイバーまたはより短いシャフトおよびノブで置き換えることによって、あるいは、好ましくは、野生型アデノウイルスファイバーのシャフトの一部、好ましくはテールに対して遠位を欠失させることによって、野生型アデノウイルスファイバー（またはそれをコードする核酸配列）から誘導される。さらに、あるいは別の選択肢として、ノブはシャフトの血清型と同じかまたは異なる血清型のものであってよい。いかなるアデノウイルスの血清型もファイバーのソースとして（すなわち、組換え手段により該蛋白質を生じるためのＤＮＡソースとして、または該蛋白質のソースとしてそれ自身を）使用することができるが、Ａｄ２またはＡｄ５のようなＣ亜群、あるいはＡｄ９のようなＤ亜群由来の血清型が好ましく、Ｂ亜群由来の血清型は最も好ましくない。当業者は蛋白質の製造手段によく精通している。短シャフトファイバーはＡｄ２またはＡｄ５のファイバーよりも短いことが望ましく、好ましくは約１２個以下のβリピート、通常は少なくとも約６個のβリピート（例えば、約６〜約１２のβリピート）を含む。理想的には、これらの繰り返し配列は、天然に存在するアデノウイルスのテールに隣接するファイバーシャフトの領域から得られる。短シャフトファイバーは、野生野生型蛋白質へのアミノ酸配列の付加または該蛋白質中のアミノ酸配列の置換をさらに含んでもよい。そのような付加または置換は、好ましくは、短シャフトキメラファイバーが二重特異的または多重特異的な蛋白結合配列（すなわち、前記のように接着配列または抗体に対するエピトープ）または細胞受容体結合配列（例えば、インテグリンと結合するための配列）を、ファイバーノブ中に含むようになされる。望ましくは、短シャフトキメラファイバー蛋白中の（上で定義されたような）二重特異的または多重特異的蛋白結合配列は、ファイバーノブ中に、約１〜約２５０アミノ酸、より好ましくは約１〜約１００アミノ酸、最も好ましくは約１〜約５０アミノ酸のアミノ酸配列の、野生型蛋白質への付加または該蛋白質中における置換を構成する。あるいは、アデノウイルスペントンベースが、上で定義されたような、対応の天然に存在する、すなわち野生型アデノウイルスペントンベース蛋白が結合しない特定の分子との結合をもたらす二重特異的または多重特異的蛋白質結合配列を含む。あるいは、キメラアデノウイルスペントンベースまたはファイバーノブは、好ましくは、天然に存在する、すなわち野生型ペントンベースまたはファイバーノブとは結合しない、細胞受容体のような分子に結合する非天然アミノ酸配列をそれぞれ含む。したがって、本発明の蛋白質（およびペプチド）は、数多くの慣用的技術のいずれによっても調製することができる。例えば、組換えペプチドの場合、所望のペプチドをコードするＤＮＡ断片を周知の分子・遺伝学的技術を用いて適当なベクターにサブクローニングすることができる（例えば、Maniatisら，「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory，1989)を参照）。該断片はインビトロで転写させ、続けてペプチドに翻訳させることができる。市販のキット（例えば、Clontech,Palo Alto ，CA；Amersham Life Sciences，Inc.，Arlington Heights，IL；InVitrogen，S an Diego，CAなどにより製造されるような）を用いることもできる。最適には、ポリメラーゼ連鎖反応を核酸の操作に使用することができる。変異ペプチドを製造するための天然アミノ酸配列の変化は、当業者に知られている種々の手段によって行うことができる。変異ペプチドは、別の指示されたペプチドと実質的に相同であるが、そのペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドである。相同性の程度（すなわち、同一性のパーセント）は、例えば、そのような比較のために最適化されたコンピュータープログラムを用いて（例えば、Devereuxら(Nucleic Acids Res.，12，387（1984）に記載され、theUnivers ity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)より自由に入手することができるＧＡＰコンピュータープログラム，バージョン６．０またはより高度なバージョンを用いて)配列情報を比較することによって測定することができる。変異蛋白質および／またはペプチドの活性は、例えば、短シャフトファイバー蛋白との組み合わせで、キメラペントンベースまたはキメラノブにより付与される形質導入能力または細胞結合能力を試験することにより、あるいは当業者に公知の他の方法を用いて調べることができる。変異蛋白質（ペプチド）と対照蛋白質（ペプチド）の間で同一でないアミノ酸残基に関して、好ましくは変異蛋白質（ペプチド）は、保存性のアミノ酸置換、すなわち、所定のアミノ酸が、大きさ、電荷密度、疎水性／親水性および／または立体配置が類似した別のアミノ酸（例えば、Pheに対してVal）により置換されるようなアミノ酸置換を含む。変異部位特異的な変異は、改変部位を含む合成オリゴヌクレオチドを発現ベクターに連結することにより導入することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドにより指示される部位特異的変異誘発は、Walder ら，Gene，42，133(1986)；Bauerら，Gene，37，73(1985)；Craik，Biotechniqu es ，12-19(January 1995)；および米国特許第4,518,584号および第4,737,462号に開示されるもののように使用することができる。いかなる適当な発現ベクター（例えば、Pouwelsら，「クローニングベクター：ア・ラボラトリー・マニュアル」(Elsevior，NY:1985)に記載）およびいかなる対応の適切な宿主も、組換えペプチドの製造に使用することができる。発現宿主としては、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、サルモネラ属に属する細菌種、バキュロウイルス系を含む咄乳動物または昆虫宿主細胞系（例えば、Luckowら，Bio/Technology，６，47(1988)に記載）および樹立細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ細胞株）などが挙げられるが、それらに限定されない。本発明のキメラ蛋白質（ペプチド）調製用の特に好適な発現系はバキュロウイルス発現系（例えば、Wickhamら(1995)，上述，に記載）であり、ここでは、トリコプルシア・ニイ（Trichoplusiani）、Ｔｎ５Ｂ１−４昆虫細胞または他の適当な昆虫細胞が、高レベルの組換え蛋白質を製造するのに使用される。もちろん、当業者は、発現宿主の選択が産生されるペプチドの種類に派生した効果を有することを承知している。例えば、酵母または咄乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）において産生されるペプチドのグリコシル化は、大腸菌のような細菌細胞において産生されるペプチドのそれとは相違する。あるいは、（変異ペプチドを含めて）本発明のペプチドは、当業者に周知の標準的なペプチド合成技術（例えば、Bodanszky，「ペプチド合成の原理」，(Spri nger-Verlag，Heidelberg:1984)に要約される）を用いて合成することができる。特に、該ペプチドは固相合成法（例えば、Merrifield，J ．Am．Chem.Soc.，85 ，2149-54(1963)；Baranyら，Int ．J．Peptide Protein Res.，30，705-739(198 7)；および米国特許第5,424,398号を参照）を用いて合成することができる。所望であれば、これは自動化ペプチド合成機を用いて行うことができる。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸保護基の除去および樹脂からのペプチドの分離は、例えば、低下した温度で酸処理することによって達成することができる。ペプチド含有混合物は、次いで、例えばジメチルエーテルで抽出して非ペプチド性有機化合物を除去し、合成されたペプチドを（例えば、約２５％ｗ／ｖ酢酸で）樹脂粉末から抽出することができる。ペプチド合成に続いて、任意で、不完全なペプチドあるいは遊離アミノ酸のいずれも排除するために、（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて）さらに精製を行うことができる。合成されたペプチドについてアミノ酸分析および／またはＨＰＬＣ分析を行い、ペプチドの同一性を確認することができる。所望であれば、（変異ペプチドまたは蛋白質を含めて）本発明のペプチドまたは蛋白質は、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化によって、あるいは本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステルおよびＮ−アシル誘導体の創製によって修飾することができる。また、該ペプチドを修飾し、他の部分と共有結合または非共有結合による複合体を形成させてペプチド誘導体を創ることもできる。共有結合した複合体は、ペプチドを含むアミノ酸側鎖上、またはＮもしくはＣ末端の官能基に化学的部分を結合することによって調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体に接着する細胞表面受容体に対するリガンドを有する二重特異的分子を構築するのに特に有用であり得る。さらなる修飾が当業者には明らかであろう。目的の短シャフトファイバー蛋白の種々の特性パラメーターを調べることができる。受容体または他の蛋白質／短シャフトファイバー相互作用の特異性および親和性は、Wickhamら(1993)，上述，により先に示されるように、野生型ペントンベース蛋白に対するスキャッチャード分析により調べることができる。受容体特異性は、慣用の方法により、抗体または標的受容体に特異的なペプチドを用いて短シャフトファイバーと細胞との結合をブロックすることによってさらに調べることができる。短シャフトファイバーのペントンベースとの結合は、短シャフトファイバー蛋白に対する抗体を介してプロテインＡでコーティングしたビーズとカップリングさせたときに、それが放射性標識したペントンベース蛋白を沈澱させる能力により調べることができる。ウイルスの接着、侵入および遺伝子発現は、まず、短シャフトファイバー蛋白とβ−ガラクトシダーゼのようなマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを生じさせる目的のインサートを含むアデノウイルスベクターを用いて評価することができる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＬａｃＺ）に感染した細胞でのβ−ガラクトシダーゼの発現は、細胞にＡｄ−Ｇｌｕｃを添加後２時間程度の早さで検出することができる。この手法は、組換えウイルスの細胞侵入および遺伝子発現の迅速且つ効率的な分析を提供するものであり、当業者は慣用の技術を用いて容易にこれを実施する。アデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングする方法本発明はまた、細胞侵入のためのアデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングする方法を提供する。この方法は、アデノウイルスの細胞内への侵入が達成されるべく、該細胞に上記の組換えアデノウイルスを接触させることを含む。「ターゲッティング」とは、別の細胞よりも特定の細胞へ優先的に導入することを意味する。本発明において、細胞はいかなる細胞であってもよいが、好ましくは真核細胞である。真核細胞は、好ましくは多細胞種（例えば、単細胞の酵母細胞とは反対であるような）のものであり、いっそう好ましくは咄乳動物、例えば、ヒト細胞である。望ましくは、そのような真核細胞は、アデノウイルスが該細胞内に侵入した後、その中にある一定の時間（すなわち、通常、少しの時間から約２ヶ月まで、可能性としては約２ヶ月後でも）存在し得るものである。最も好ましくは、初期ＲＮＡは、本明細書にさらに記載するように、アデノウイルスによって細胞に運ばれるアデノウイルスゲノム（好ましくは非天然遺伝子を含む）から転写される。細胞は単一で存在しても、より大きな細胞集団の部分であってもよい。そのような「より大きな細胞集団」には、例えば、細胞培養（混合または純粋）、組織（例えば、上皮または他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、眼および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、神経系、外皮系または他の器官系）または生物（例えば、鳥類、哺乳類等）が包含される。好ましくは、ターゲッティングされる器官／組織／細胞は、循環器系（例えば、心臓、血管および血液を含むがそれらに限定されない）、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺等）、消化器系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢他を含む）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道等）、神経系（例えば、脳および脊髄、および眼のような特殊な感覚器官を含むが、それらに限定されない）および外皮系（例えば、皮膚）のものである。いつそう好ましくは、ターゲッティングされる細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱および眼細胞からなる群より選択される。特に、組換えアデノウイルスがターゲッティングされる細胞は、該ターゲッティングされる細胞が特定の細胞表面結合部位を含むという点で、ターゲッティングされない別の細胞と異なる。「特定の細胞表面結合部位」とは、アデノウイルスが相互作用して細胞に接着し、それによって細胞への侵入を促進することができる、該細胞の表面上に存在するいかなる部位（すなわち、分子または分子の組み合わせ）をも意味する。したがって、特定の細胞表面結合部位は細胞表面受容体を包含し、好ましくは、蛋白質（改変蛋白質を含む）、炭水化物、糖蛋白、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子またはムコ蛋白等である。可能性のある細胞表面結合部位の例としては、グリコサミノグリカン上に見られるヘパリンおよびコンドロイチン硫酸部分；ムチン、糖蛋白およびガングリオシド上に見られるシアル酸部分；主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）糖蛋白；マンノース、Ｎ−アセチルーガラクトサミン、Ｎ−アセチルーグルコサミン、フコースおよびガラクトースを含む、膜糖蛋白中に見られる共通の炭水化物分子；ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンおよびインテグリン分子のような糖蛋白；および、例えばＭＵＣ−１腫瘍特異的エピトープのような、癌細胞上に存在する腫瘍特異的抗原が挙げられるが、それらに限定されない。しかしながら、細胞にアデノウイルスをターゲッティングする本法は、細胞相互作用（すなわち、所定の細胞表面結合部位との相互作用）のいかなる特定のメカニズムにも限定されず、またそのように解釈されるべきではない。上記組換えアデノウイルスの１つの接着をターゲッティングする方法が、二重特異的または多重特異的結合剤の使用を含むとき、該方法は、(a)(i)アデノウイルス中の二重特異的または多重特異的蛋白結合配列（例えば、抗体結合部位）とそれぞれ選択的に結合する第一成分と、(ii)細胞上の細胞表面結合部位と選択的に結合する第二成分とを含む二重特異的または多重特異的結合剤を、アデノウイルスに接触させて、アデノウイルスと二重特異的または多重特異的結合剤（例えば抗体）との複合体を形成させ、(b)細胞内へのアデノウイルスの侵入が達成されるように、(a)の複合体を細胞に接触させることを含む。本発明の方法によってアデノウイルスが細胞に侵入する能力を至適化するために、好ましくは、該方法は、細胞内に導入された特定のアデノウイルスに指向される中和抗体の非存在下で行われる。そのような抗体の非存在下では、アデノウイルスが該抗体に結合する可能性はなく、したがって、細胞との結合および／または細胞への侵入を妨げられる可能性がない。そのような中和抗体の存在を試験することは当業者であれば十分できることである。そのような中和抗体の存在がアデノウイルスの細胞内送達にとって障害となる場合には、別のアデノウイルスベクター、例えば、別の血清型のアデノウイルスベクター（Cromptonら，J.Gen ．Virol. ，75，133-139(1994)）または該抗体が指向されるエピトープを欠く別のアデノウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との「複合体」はいかなる相互作用であってもよく、例えば、アデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との間の共有結合または非共有結合による相互作用であり、好ましくは、非共有結合による相互作用である。そのような「接触」は、当業者に知られ且つ本明細書に記載され、アデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との、または細胞とアデノウイルス・二重特異的（多重特異的）分子複合体との見かけ上の接触または相互の接触状態がそれによって達成され得るいかなる手段によってなされてもよい。例えば、アデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との接触は、これらの要素を少量の同じ溶液中で混合することにより行うことができる。任意で、それらの要素を、例えば、当業者に公知の化学的手段または他の手段によってさらに共有結合させることができ、あるいは、好ましくは、非共有結合的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ファン・デル・ワールスカおよび／または非極性相互作用）によって結合させることができる。これに比べて、細胞と該複合体は、例えば、該複合体が宿主（例えば、ヒト）に投与され、それが選択的に結合し侵入する細胞に血流により運ばれる場合がそうであるように、必ずしも少量で接触に至る必要はない。アデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との接触は、好ましくは、細胞がアデノウイルスと二重特異的（多重特異的）分子との複合体に接触する前に行われる。「前」とは、アデノウイルスと二重特異的分子との複合体が該複合体の細胞との接触に先立って形成されるのを確実にするに十分な、細胞との接触に先立ついかなる量の時間をも意味し、例えば、約５分〜約５年（すなわち、アデノウイルスと二重特異的分子との複合体が使用可能な形態で、例えば、凍結乾燥状態または凍結保護剤の存在下−８０℃で、安定に維持され得る最長時間とおよそ同じぐらい）の範囲の期間である。本発明の方法には複数の好適な実施態様がある。例えば、本明細書に記載するように、アデノウイルスが非天然遺伝子を含むものである方法が好ましく実施される。また、特定の細胞表面結合部位を含む細胞が、対応の野生型アデノウイルスが通常結合（すなわち、形質導入または感染）しないか、あるいは見かけ上低い効率でしか結合しないものである方法も好ましく実施される。しかしながら、本法はいかなる細胞にも、野生型アデノウイルスが比較的高い効率で結合し侵入する細胞（例えば、上皮細胞）にさえ、アデノウイルスを導入するために実施することができる。本法は、二重特異的分子が、(a)ファイバーノブまたはペントンベース中の二重特異的蛋白結合配列と選択的に結合する第一抗体と、(b)アデノウイルスが接触するに至り、そうして該アデノウイルスの細胞侵入が達成される細胞の表面上に存在する細胞表面結合部位と選択的に結合する第二抗体とを含む二重特異的抗体であるようにして、行うことができる。本明細書にさらに記載するように、この方法は、任意で、野生型またはキメラアデノウイルスペントンベースのいずれかを含むアデノウイルスを用いて行うことができる。キメラアデノウイルスペントンベースは、好ましくは、野生型アデノウイルスペントンベースが結合しない特定の分子との結合をもたらす結合ドメインである非天然アミノ酸配列を含む。キメラアデノウイルスペントンベースの結合ドメインは、好ましくは、（野生型アデノウイルスペントンベースの結合ドメインと同様）第一抗体に対するエピトープを含む。好ましくは、キメラアデノウイルスペントンベース蛋白のエピトープは、配列番号８（すなわち、DYKDDDDK，つまり、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、配列番号９（すなわち、TSEAAAHAIRGDTYADYKDDDDKGSS，つまり、Thr Ser Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Asp Tyr Ly s Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser）、配列番号１０（すなわち、TSEAAAHAIRG DTYPYDVPDYAGSS，つまり、Thr Ser Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Arg Gly Asp Thr Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Ser）および配列番号１１（すなわち、YPYDVPDYA，つまり、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）からなる群より選択される配列、またはＭ２もしくは１２ＣＡ５モノクローナル抗体かＦＬＡＧもしくは赤血球凝集素ペプチドに指向される他の抗体（米国特許出願第08/634,060号）のいずれかにより認識されるこれらの配列の派生物（すなわち、欠失および／または変異を含む）を含む。接着のためにターゲッティングされるアデノウイルスのファイバーと細胞との結合を排除する（すなわち、妨げる）ことをさらに含む本発明の方法もまた、好ましく実施される。特に、アデノウイルスが細胞侵入を果たし得るいかなる細胞表面結合部位へのアデノウイルスファイバーの結合も排除することが好ましい。この好適な態様において、ファイバーとその細胞表面受容体との相互作用は実質的に排除され、従って、これらの相互作用のどれも、特定の細胞表面受容体に対する細胞結合／細胞侵入をターゲッティングするペントンベースの能力を妨害することから排除される。標的細胞のアデノウイルス受容体に親和性を有するファイバーノブの部分は、アデノウイルスファイバー蛋白のシャフトを短縮することによってその受容体と相互作用できなくなる。しかしながら、該ファイバー蛋白は三量体化能力のようなウイルスの生存性に決定的な機能を保持する。したがって、本発明の短シャフトファイバー蛋白は、好ましくは三量体化することができ、もし特にアデノウイルス受容体との結合を妨げるようにさらに改変されなければ、他の点では同一の、アデノウイルス受容体との結合のための完全長シャフトのファイバー蛋白を含む野生型ウイルスと競合し得る。いかなるアデノウイルスの細胞との結合も推計学的プロセスである。それ故、短シャフトファイバーは、小さい割合で標的細胞との結合を仲介することができる。しかしながら、アデノウイルスにおいて、短シャフトファイバーの標的細胞との結合は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、実質的に減衰するだろう。本発明の多くの実施態様において、細胞結合／細胞侵入を命令するのは、望ましくはアデノウイルスペントンベースである。上記のように、また以下にさらに記載するように、アデノウイルスがキメラまたは野生型ペントンベースのいずれかを含むこの方法が、好ましく実施される。例えば、結合は、望ましくは野生型アデノウイルスファイバーのエピトープと選択的に結合する抗体を該アデノウイルスに接触させることによって排除される。好ましくは、この抗体（または他の結合剤）は、アデノウイルスファイバーとその受容体との相互作用を妨げるようなやり方で結合する。いっそう好ましくは、該抗体は機能ブロッキング抗体である。あるいは、該方法に使用される（キメラまたは野生型ペントンベースを含む）アデノウイルスは、好ましくはキメラアデノウイルスファイバーをさらに含む。任意で、キメラアデノウイルスファイバーのエピトープと選択的に結合する抗体または他の結合剤をアデノウイルスに接触させることにより、キメラアデノウイルスファイバーの結合は実質的に排除される。望ましくは、この抗体（または他の結合剤）は、アデノウイルスファイバーとその受容体との相互作用を妨げるようなやり方で結合する。短シャフトアデノウイルスはまた、対応の野生型アデノウイルスファイバーノブが結合し得る細胞に、自然には結合できないことを特徴とするキメラアデノウイルスファイバーノブを含むこともできる。例えば、アデノウイルスファイバーノブは、異なる細胞受容体に対する結合ドメインである非天然アミノ酸配列を含んでもよく、および／または該ファイバーノブはシャフトの血清型とは異なる血清型のものであってもよい。この方法に用いる長さのより短いキメラファイバー蛋白が、好ましくは、ペントンベースと複合体形成した二重特異的抗体が該キメラファイバー（例えば、Ａｄ９ファイバー）とアデノウイルスファイバー受容体との相互作用を立体的に阻害するのを可能にするという点で、短シャフトアデノウイルスを形成するためにファイバー蛋白を交換することはさらに有利である。本発明のさらに他の好適な態様において、特定の細胞表面結合部位を含む細胞へのアデノウイルスの導入方法は、好ましくは、本明細書に記載されるような本発明の組換えアデノウイルスベクターを用いて行われる。使用例本発明のベクターはインビトロで利用性がある。そのようなベクターは、アデノウイルスの細胞接着および細胞感染の研究における研究道具として、また、結合部位−リガンド相互作用のアッセイ法に使用することができる。同様に、アデノウイルスベクター、特に短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、インビボでも使用することができる。特に、本発明の組換えアデノウイルスは、例えば矯正ＤＮＡ、すなわち欠損するか損なわれた機能をコードするＤＮＡ、または、例えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡのような慎重な殺傷剤、またはリボザイムやアンチャンス分子をコードするＤＮＡを標的細胞に送達することによって、多くの疾患のいずれかを治療するのに使用することができる。したがって、（例えば、「治療遺伝子」をコードするような）「非天然アデノウイルス遺伝子」という語の使用は、これらの、並びに当業者に知られているように遺伝子治療としてより一般的に言われている他の態様を包含することを意図する。このような治療の対象となり得る疾患としては、例えば、癌（例えば、黒色腫または膠腫）、嚢胞性線維症、遺伝病およびＨＩＶ感染を含む病原性の感染が挙げられる。例えば、α_Vβ₃受容体により認識される短シャフトファイバーを有する組換えアデノウイルスを黒色腫または膠腫の治療に使用することができ、また、α₃β₁ 受容体により認識され嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を発現する組換えアデノウイルスは、肺上皮細胞に送達することにより嚢胞性線維症の治療に使用することができる。さらに、α_mβ₂受容体により認識され好中球およびマクロファージにターゲッティングされる組換えアデノウイルス、α₄β₁受容体により認識されリンパ球にターゲッティングされる組換えアデノウイルス、α_II _B β₃受容体により認識され血小板および巨核球にターゲッティングされる組換えアデノウイルスおよびα_Vβ₃インテグリンにより認識され血管新生中の内皮細胞にターゲッティングされる組換えアデノウイルスを用いて、種々の血液関連疾患を治療することができる。 α_Vインテグリンはターゲッティングされた遺伝子治療に有用な組織特異的受容体である。α_Vインテグリンの発現は大多数の黒色腫（Albeldaら，Cancer Res . ，50，6757-6764(1990)）および神経膠細胞芽腫（Gladsonら，J ．Clin．Invest .，88，1924(1991)）において活性化される。これらの細胞上のα_Vインテグリンに治療的アデノウイルスをターゲッティングすることにより、例えば毒性遺伝子を送達することが可能となるが、健常な周辺の組織への遺伝子送達を回避することができる。さらに、インテグリンα_Vβ₃は増殖中の内皮細胞上で発現する（Br ooksら，Science，264，569-571（1994）；Brooksら，Cell，79，1157-1165(199 4)）。これらの細胞上のα_Vβ₃受容体にターゲッティングすることは、それらの増殖を防ぐのに、例えば、腫瘍増殖の減衰または網膜疾患の治療に有用であろうし、あるいは虚血組織の血管再形成のようなさらなる血管形成を促進するのに有用であろう。さらに、アデノウイルスが通常感染しない細胞のような他の細胞に、本発明の方法を用いて、例えば、それらの細胞上の細胞受容体へのアデノウイルスの接着をターゲッティングすることにより、あるいはこれらの細胞内への侵入効率（すなわち、特異性）を増大させることにより、ターゲッティングを行うことができる。これは種々の手段、好ましくは、抗体のような、特定の細胞受容体にアデノウイルスを接着させる二重特異的または多重特異的結合剤を用いることにより、達成することができる。本発明の方法および構成要素の他の適用が当業者には明らかであろう。投与手段本発明のベクターは、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に接触させて使用することができる。本発明において、「接触」は、ベクターの細胞侵入をもたらすいかなる手段をも包含する。その方法はいかなる特定の導入手段にも依存せず、またそのように解釈されるべきではない。導入手段は当業者によく知られており、また、本明細書に例示される。したがって、導入は、例えば、エレクトロポーレーション、形質転換、形質導入、接合または三親交配、（共）トランスフェクション、（共）感染、カチオン性脂質による膜融合、ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルにより高速射撃、リン酸カルシウムとのインキュベーション−ＤＮＡ沈殿、単細胞への直接マイクロインジェクション等によって、インビトロ（例えば、遺伝子治療の生体外（ex vivo）タイプ法や組織培養研究において）またはインビボで達成され得る。同様に、ベクターはカチオン性脂質、例えばリポソームによって導入することができる。そのようなリポソームは市販されている（例えば、リポフ Gaithersburg，MDより供給される）。さらに、導入効率が増大した、および／またはインビボでの毒性が減少したリポソーム（例えば、ＰＣＴ国際特許出願WO 9 5/21259号を参照）を使用することができる。他の方法も利用することができ、当業者に知られている。当業者には、本発明のベクター（特にアデノウイルスベクター）を遺伝子治療 (例えば、Rosenfeldら，Science，252，431-434（1991）;Jaffeら，Clin ．Res. ，39(2)，302A(1991)；Rosenfeldら，Clin ．Res.，39(2),311A(1991)；Berkner ，BioTechniques，6，616-629（1988）を参照)、化学療法およびワクチン接種の目的で動物に投与するのに適当な方法を用いることができ、２つ以上の経路が投与に使用することができるが、ある特定の経路が、他の経路よりもより迅速でより効果的な反応を提供し得ることがわかるであろう。医薬上許容され得る賦形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択はベクターの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定されるであろう。したがって、本発明における使用には、非常に多様な好適な製剤がある。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって何ら限定するものではない。経口投与に好適な製剤は、(a)液剤、例えば、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解された有効量の化合物、(b)それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、(c)適当な液体中の懸濁液剤、および(d)適当な乳液剤からなり得る。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学上適合性の賦形剤の内の１つまたは２つ以上を含み得る。トローチ剤型は、有効成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリンのような不活性な基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤などは有効成分に加えて、当技術分野において知られているような賦形剤を含有する。本発明のベクターは単独で、あるいは他の適当な有効成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される推進ガス中におくことができる。それらはまた、ネブライザー噴霧器やアトマイザー噴霧器中のような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、贈粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位投与量または複数回投与量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記述した種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。さらに、本発明のベクターは、乳化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより坐薬としてもよい。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。本発明によれば、動物、特にヒトに投与される用量は、目的の遺伝子、使用される組成物、投与方法および治療される特定部位および生物によって変化する。しかしながら、好ましくは、ベクター（例えば、本発明のアデノウイルスベクター）の有効量に相当する用量が使用される。「有効量」は、宿主内で所望の効果を生むのに十分な量であり、当業者に知られているいくつかのエンドポイント法を用いてモニターすることができる。例えば、所望の効果の１つは宿主細胞への核酸導入である。そのような導入は、治療効果（例えば、治療すべき疾患、病態、障害または症候群に付随するある症状の緩和）を含むがそれに限定されない種々の手段により、あるいはさらに、導入された遺伝子もしくはコード配列または宿主内でのその発現を実証することによって（例えば、宿主細胞内の核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンまたはサザンハイブリダイゼーション、または転写アッセイ、あるいは導入された核酸によってコードされる蛋白質またはポリペプチドを検出するためのイムノブロット分析、抗体を介した検出、または特殊化されたアッセイ、あるいはそのような導入に起因するレベルまたは機能における強い影響を用いて）モニターすることができる。記載されたこれらの方法がすべての例示では決してなく、特定の適用に合ったさらなる方法が当業者には明らかだろう。一般に、本発明のベクターの効果的な導入を確実にするには、所定の投与経路を考慮した上で接触させるおおよその細胞数に基づけば、接触させる細胞あたり約１〜約５，０００コピーの本発明のアデノウイルスベクターを用いることが好ましく、各細胞に約３〜約３００ｐｆｕ入ることがいっそう好ましい。しかしながら、これは単なる一般的な目安にすぎず、特定の適用において許可されるように、インビトロまたはインビボのいずれでも、より高いまたはより低い量の成分の使用を決して妨げるものではない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、あるいは薬物動態、薬物性向および代謝における個体間差によって変動し得る。同様に、インビトロでの適用においては、ターゲッティングされる特定の細胞腫やベクターを導入する手段によって、量は変動し得る。当業者は、必要に応じて、特別な状況のいかなる必要な調整も容易に行うことができる。実施例以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。以下の実施例に関して：全てのＤＮＡ操作は標準的なプロトコール（Ausubelら，「分子生物学の最新プロトコール」，Greene Publishing Assocs./Wiley-Interscience，New York(1 989)）に従って行った。 SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによる蛋白分析も発表されたプロトコール（Ausubelら，上述；およびLaemmli，Nature，227，680-685(1970)）に従って行った。 Ad2、Ad3、Ad5およびAd9は、ATCC（Rockville，MD）から保存株として入手し、5%ウシ胎児血清（FCS）添加ダルベッコの最少必須培地（DMEM;Gibco BRL，Gai thersburg，MD）中のA549またはHeLa細胞で継代した。 HepG2、Hs 700T、A172、Ul18およびTera２細胞株はATCCから入手し、5% FCS添加DMEM中で維持した。 RamosおよびY79細胞株もATCCから入手し、5% FCS添加RPMI（Gibco BRL）中で維持した。ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMS)はCell Systems Corp．（Kirklans，WA）から購入し、5% FCSを含むMCDB(Gibco BRL)中で維持した。ヒト黒色腫ACA19細胞はJohn Hilkens氏（Netherlands Cancer Institute，Ams terdam）からの提供で、5% FCSを含むDMEM中で維持した。ハムスター黒色腫CS-1細胞はCaroline Damsky氏（Schools of Dentistry and Medicine，UCSF，San Francisco，CA）から提供された。 β5インテグリンサブユニット遺伝子はSarah Bodary氏（Genentech Inc.，Sou th San Francisco，CA）から入手した。 CS-1細胞およびその誘導細胞は5% FCSを含むDMEM中で維持した。 ³H-メチルチミジン標識アデノウイルスは、A549単層（約1,200万細胞／フラスコ）を感染多重度（moi）５で感染させることによって得た。感染後（pi）24時間で、0.5mCiの³H-メチルチミジンを10mlの容量で加えた。この低容量で一晩インキュベーションした後、15mlの培地を加え、感染55-96時間後に細胞を採取した。次いで、細胞をペレットにし、２回洗浄し、10mMトリス（pH=8.0）を含むDMEM中に再懸濁させた。３回の凍結／融解サイクルによってウイルスを細胞から放出させ、細胞の破片を遠心分離により除去した。上清をCsCl勾配上に重層して、22,500rpmで５時間遠心分離した。ウイルスのバンドを集め、10mMトリス(pH=8.0)、150mM NaCl、10mM MgCl₂および10% グリセロールに対して一晩透析した。透析物を等体積に分けて、さらに使用するまで−80℃で保存した。実施例１本実施例ではアデノウイルス蛋白の合成および精製について説明する。 Ad3(GenBank受諾番号M12411；Signaesら(1985)，上述)、Ad5(GenBank受諾番号 M18369;Chroboczekら(1992),上述;およびChroboczekら，Virol.，161,549-554(1 987))、およびAd9（GenBank受諾番号X74659）のファイバー配列を、アデノウイルスのゲノムDNAからファイバーノブを増幅するためのプライマーの設計に使用した。適当な制限酵素で消化した後のPCR産物のクローニングを容易にするために、センスプライマーにBam HIサイト、アンチセンスプライマーにKpn Ｉサイトを含むようにプライマーを設計した。センスプライマーは、増幅の際に、各標的ファイバー遺伝子のシャフトの末端反復配列である保存されたシャフトーノブジャンクション TWT（Stoutenら，J ．Molec．Biol.，226，1073-1084（1992）；配列番号４）および受容体認識ノブ(Henryら(1994)，上述；Louisら，J.Virol.，6 8 ，4104-4106(1994)およびStevensonら，J ．Virol.，69，2850-2857(1995))を産物が含むようにハイブリダイズすべく設計した。PCR反応は、UltmaDNAポリメラーゼ（Perkin Elmer，Foster City，CA）を用いて、標準的なPCRプロトコールで行った。次いで、産物を細菌発現ベクターpQE32(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA) 中にBam HI/Kpn Ｉフラグメントとしてクローニングした。ファイバーノブのDNA 配列は自動化373 DNAシーケンサー（Applied Biosystems，Foster City，CA）を用いて決定され、Genbankデータベースに報告されている元の配列と比較して配列に差異は見られなかった。次いで、pQE32ベクターを制限酵素Eco RIおよびKpn Ｉで切断して完全なインサートを遊離させ、そしてこれをバキュロウイルス導入ベクターpAcSG2（Pharmi ngen，San Diego，CA）中にクローニングした。Ad3、Ad5またはAd9ファイバーノブ構築物を含む組換えバキュロウイルスを、標準的なプロトコール（O'Reillyら，「バキュロウイルス発現ベクター:ア・ラボラトリー・マニュアル」，W．H．F reeman & Co.，Salt Lake City，Utah(1992)）に従って分離し、増幅した。組換えAd2、Ad3、Ad5およびAd9ファイバーを、以前に記述されたようにして（Wickha mら(1993)，上述）合成し、精製した。Ad3、Ad5およびAd9ノブ蛋白（それぞれ、 F3K、F5KおよびF9K）は、Tn5B1-4昆虫細胞（Invitrogen，San Diego，CA）内で高収率で産生され、Ni²⁺NTAアガロースカラムを製造元（Qiagen）が記載するように用いて容易に均質にまで精製された。蛋白ゲル分析により、F3Kは24.1kDa、 F5Kは23.5kDa、およびF9Kは24.3kDaと、予測されたサイズで移動するバンドが明らかとなった。ウェスタンブロット分析により、F5KとF9Kはどちらもファイバー 2蛋白に対して生じたウサギポリクローナル抗体と交叉反応するのに対し、F3Kは交叉反応しないことがわかった。³⁵S標識Ad3、Ad5およびAd9ファイバーノブを以前に記述されたようにして（Wickhamら(1993)，上述）製造した。実施例２本実施例では、A549細胞上にある同じ細胞ファイバー受容体へのAd2、Ad5およびAd9の交叉競合について説明する。 3mM MgCl₂および１mM CaCl₂を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩水（PBS;Gibco BRL）(PBS⁺⁺)250μｌ中の約1×10⁶個のA549細胞を、5% ウシ胎児血清アルブミン（BSA）PBS⁺⁺溶液でプレコートされたエッペンドルフチューブ中で、ウイルス粒子の数を増やしながら4℃で1時間予備インキュベーションした。細胞懸濁液に組換えファイバーノブを最終濃度が10μｇ/mlとなるように加え、次いで該懸濁液を37℃で１時間インキュベーションした後、4℃で15分間冷蔵した。それから、標識したウイルスまたは標識したファイバー蛋白（1-3×10⁴cpm）を細胞懸濁液に加え、該懸濁液を4℃でさらに１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をペレット化し、接種物を除去し、該ペレットを冷PBS⁺⁺で２回洗浄した。ペレットを100μｌのPBS⁺⁺に再懸濁させ、シンチレーション液に加えて、Beckmanシンチレーションカウンターで直接カウントした。完全長の組換えファイバー2およびファイバー5の量を増加させると、図１Ａおよび１Ｂにそれぞれ示されるように、Ad2およびAd5の結合はどちらも同等に阻害された。図１Ａおよび１Ｂはそれぞれ、競合する非標識ファイバー2（■）および非標識ファイバー5（●）存在下での、ファイバー濃度（μｇ/ml）に対する標識Ad2および標識Ad5の結合（コントロールに対する％）のグラフである。どちらの場合でも、受容体部位の飽和は、95％の標識ウイルス結合の最大阻害とともに、最終濃度0.1と0.3μｇ/mlの間で起こった。したがって、ファイバーを介した同型（同じ血清型）のおよび異型（同じ亜群）の交叉競合が血清型Ad2とAd5の間で起こった。このことは、Ad2およびAd5ファイバーが同一の受容体を認識することを示唆した。このことはまた、該ファイバーがAd2およびAd5ウイルスの結合研究において相互交換的に競合物として使用可能であることを示唆した。完全なファイバー蛋白の代わりに受容体を認識する組換えファイバーノブを競合物として用いて、異なる亜群、つまり、Ad2(Ｃ亜群)、Ad3（Ｂ亜群）およびAd 9（Ｄ亜群）の血清型間の交叉競合を調べた。Hisタグを有するF3K、F5KおよびF9 Kを実施例１に記載されるようにして製造した。 F3K、F5KまたはF9Kの量を増やしながらA549細胞を予備インキュベーションした結果、図２Ａ（該図は、競合する非標識F3K(■)、F5K（●）およびF9K（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ/ml）に対する標識Ad2の結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、標識Ad2の結合は F5KおよびF9Kによって用量依存的に阻害されたが、F3Kによっては阻害されなかった。１μｇ/mlの濃度で、Ad2結合の90%以上が阻害された。これらの実験から、F9K蛋白はF5K蛋白が競合するのと同じ受容体部位で競合することが示唆された。本結合実験においてコントロールとして用いられたF3K蛋白は、Ad2の結合に全く影響を及ぼさなかった。 F3K、F5KまたはF9Kの量を増やしながらA549細胞を予備インキュベーションした後標識Ad3とインキュベーションしたところ、図２Ｂ（該図は、競合する非標識F3K(■)、F5K（●）およびF9K（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ/ml）に対する標識Ad3の結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、相同なファイバーノブだけが、試験された最高濃度で、Ad 3の結合に対して85％の最大阻害効果を有することが分かった。F3Kと、ペントンベース蛋白または、α_Vインテグリンに指向されるモノクローナル抗体L230（Wei nackerら，J ．Biol．Chem.，269，6940-6948(1994)）とを組み合わせて細胞をさらに予備インキュベーションすることにより、Ad3の結合は完全に阻害された。F 5KとF9KはどちらもAd3の結合に全く影響を及ぼさなかった。これらの結果から、 Ad3はAd2/Ad5受容体以外の受容体を認識することが確認され、また、Ad3はそのペントンベースを用いてα_Vインテグリンと直接相互作用し得ることが分かった。 F3K、F5KまたはF9Kの量を増やしながらA549細胞を予備インキュベーションした後標識Ad9とインキュベーションしたところ、図２Ｃ（該図は、競合する非標識F3K(■)、F5K（●）およびF9K（◆）の存在下における、ファイバーノブ濃度（μｇ/ml）に対する標識Ad9の結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、後者２つのノブは、用いられた最高濃度で、ウイルスの結合に対して20%の最大阻害効果を有することが分かった。実際、２つの上皮細胞株A549およびHs 700Tを用いた競合実験において、最終濃度を25μｇ/mlにまで上げて使用しても、それ以上の阻害は観察されなかった。これらの結果は、Ad9 がファイバー非依存的なメカニズムによってA549およびHs 700T細胞に接着し得ることを示唆するものである。 Ad2の結合阻害がAd2/Ad5ファイバー受容体への競合によるものか否かを決定するために、A549細胞上のファイバー受容体についての直接的な蛋白質−蛋白質競合実験を、³⁵S標識F5Kおよび非標識F5KまたはF9K、並びにその逆を用いて組み立てた。図３Ａ（該図は、競合する非標識F3K(■)、F5K（●）およびF9K（◆）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ/ml）に対する標識F5Kの結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、どちらの競合物とも、標識F5Kの結合部位について同一の親和性で競合した。300ng/mlと１μｇ/mlの間の濃度で非標識F5KまたはF9Kと細胞を予備インキュベーションすると、標識F5Kの結合は完全に競合された。該非標識競合物は、図３Ｂ（該図は、競合する非標識 F3K(■)、F5K（●）およびF9K（◆）の存在下における、ファイバー濃度（μｇ/ ml）に対する標識F9Kの結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、標識F9Kとも同様の様式で競合した。また、ウイルス/ウイルス競合実験において、細胞あたりの非標識Ad9ビリオンの数を増やしながらA549細胞を予備インキュベーションした結果、標識Ad2ビリオンの結合は用量依存的に減少した。ウイルス/ウイルス、ファイバー/ウイルスおよびファイバー/ファイバー交叉競合のデータはすべて、F5KとF9Kが同じまたは類似の受容体を認識することを強く示唆している。実施例３本実施例では、Ad2およびAd9がペントンベース蛋白を介してα_Vインテグリンと直接結合することを説明する。 Hs700T細胞を、Ad2またはAd9ファイバーの結合をそれぞれ阻害するF5KまたはF 9K(最終濃度２μｇ/mlで)、直接的なペントン／α_Vインテグリン相互作用を機能的にブロックするmAb L230(最終濃度50μｇ/mlで)、Ad2ペントンベースまたは関連のファイバーノブを伴うAd2ペントンベースと予備インキュベーションした。次に、1-3×10⁴cpmの標識Ad2またはAd9を加え、混合物を4℃で１時間インキュベーションした。細胞をペレット化して冷PBS⁺⁺で２回洗浄した。それから、細胞と結びついたcpmをシンチレーションカウンター中で測定した(結合パーセント＝細胞に結合した投入量のカウント／投入量の正確なcpm)。結合したウイルスを測定すると、図４Ａ（該図は、CTRL、F5K、L230、PBおよびPB＋F5Kに対する標識Ad2の結合(コントロールに対する％)の棒グラフ（平均値の標準偏害されることが分かった。細胞を、飽和量のL230またはAd2ペントンベースとともに予備インキュベーションしても、Ad2の結合に影響はなかった。ペントンベースとF5Kを組み合わせてもAd2の結合をさらに阻害する効果はなく、表Ｉに示されるように、ファイバーのみが、Hs 700T細胞およびA549のような他の上皮細胞株への最初のAd2の結合を仲介することが確認された。表Ｉ：ファイバー受容体およびα_Vインテグリンを種々のレベルで発現する細胞株へのAd2およびAd9の結合 *インテグリン：ビトロネクチン受容体α_Vβ₃およびα_Vβ₅ ND：測定せず^** 細胞株および誘導株は：A549，ヒト肺癌；HepG2，肝癌；Hs 700T，腸または膵癌の転移；A172およびU-118-MG，神経膠芽細胞腫；ACAl9，ヒト黒色腫細胞株；H ASMC，ヒト大動脈平滑筋細胞；Ramos，ヒトリンパ腫；Y79,網膜芽細胞腫；およびTera 2，胚奇形癌である。 Ad9の結合は、図４Ｂ（該図は、CTRL、F9K、L230、PBおよびPB＋F9Kに対する標識Ad9の結合（コントロールに対する％）の棒グラフである）に示されるように、F9Kによって20-25%、L230によって46%、Ad2ペントンベースによって57%およびAd2ペントンベースとF9Kの組み合わせによって77%ブロックされた。これらの結果から、Ad9はファイバー−受容体相互作用に依存せずに、ペントンベースの αVインテグリンとの直接的な相互作用（上記表Ｉに示されるように、Hs 700T細胞および他の上皮細胞株（例えば、A549株）へのAd9の接着および結合において支配的な役割を果たすことがここで分かった）のようなメカニズムを用いて、細胞に結合し得ることが確かめられた。しかしながら、これらの結果は、ファイバーおよびペントンベース以外の蛋白質がウイルスの細胞表面への接着および結合にマイナーな役割を果たす可能性を排除するものではない。実施例４本実施例では、可溶性ファイバー蛋白がAd9による細胞感染をブロックしないことについて説明する。ウェル当たり約10⁶個のHs 700T細胞を播種し、静置して付着させた。培地（10 %FCS添加DMEM）を除去し、PBS⁺⁺で細胞を２回洗浄した。次いで、ファイバー5およびファイバー9ノブ並びにAd2ペントンベースを、FCSを含まないDMEM中それぞれ最終濃度10、10および50μｇ/mlとなるように該ウェルに加え、細胞を4℃で２時間インキュベーションした。統計学的に信頼できる数のフォーカスを生じるように予め決められた希釈度でウイルスを加え、細胞を冷所でさらに1.5時間インキュベーションした。接種物を除去し、FCSを含まない冷DMEMでウェルを２回洗浄した。10%FCSを含むDMEMを２ml加え、細胞を24-48時間インキュベーションした。アデノウイルスの感染を、Wickhamら(1993)，上述，に記載されるようにして、且つ以下の改変を加えて定量した。簡単にいうと、細胞単層2%パラホルムアルデヒドPBS溶液で20分間固定した後PBSで２回洗浄し、0.2%トライトンX-10 0とともに５分間インキュベーションした。0.5%魚ゼラチン（Sigma，St．Louis ，MO）PBS溶液で細胞を２回洗浄し、次いで同溶液で１時間ブロッキングした。アデノウイルスDNA結合蛋白およびヘキソン蛋白に対する一次抗体（どちらもDou glas Brough氏，GenVec，Inc.により提供された）またはペントンベース蛋白に対する一次抗体(Glen Nemerow氏，The Scripps Instituteにより提供された）を、0.5%魚ゼラチンPBS溶液中1:100から1:250の希釈度で使用し、１時間インキュベーションした。細胞を３回洗浄し、0.5%魚ゼラチンを含むPBS溶液中l:100希釈のFITC結合ヤギ抗ウサギ抗体（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）と一晩インキュベーションした。３回洗浄した後、1mlのPBSを染色した細胞にかけ、フォーカスをNikon Diaphot 200蛍光顕微鏡を用いて計数した。非標識Ad2およびAd9によるHs 700T細胞の感染に及ぼす競合物の効果を、アデノウイルス感染サイクルの初期（α-DNA結合蛋白）および後期（α-ヘキソンおよびα-ペントンベース）の両方に特異的な蛋白を検出する抗体を用いて分析した。図５Ａに示されるように(該図は、CTRL、F5K、F9K、PBおよびPB＋F5Kに対するAd2感染能（FFU/10⁶細胞）の棒グラフであり、１つの実験について抗PB抗体を用いて２回行った)、上記３つの抗体を用いたAd2感染の分析から、どちらのファイバーノブとともに細胞を予備インキュベーションしても、感染は完全に阻止されることがわかった。飽和量のAd2ペントンベース蛋白とともに予備インキュベーションしても効果は観察されなかった。上記３つの抗体を用いたAd9感染の分析では、F5Kには有意な阻害効果が見られなかった。同様に、F9Kと細胞を予備インキュベーションした結果、図５Ｂ（該図は、CTRL、F5K、F9K、PBおよびPB＋F5Kに対するAd9の感染能（FFU/10⁶細胞）の棒グラフであり、１つの実験について抗PB抗体を用いて２回行った）に示されているように、僅かに感染能を阻害したが、それは統計学的には有意ではなかった。しかしながら、飽和量のAd2ペントンベースと予備インキュベーションすると、結果として形成するフォーカス数は45%減少した。これらの結果は、Ad9の感染がペントンベースとα_Vインテグリンとの直接的な相互作用を伴うことを示している。ペントンベースとファイバーを組み合わて競合させてもさらに感染能が低下することはないという事実は、Ad9ペントンが他の細胞受容体と相互作用するかもしれないことを示唆する。実施例５本実施例では、Ad9がα_Vインテグリンに直接結合し得ることを説明する。様々なレベルのファイバー受容体提示し且つα_Vインテグリンを発現または欠如するヒト細胞株の調査対象群（表Ｉ参照）を用いて、Ad2およびAd9の結合をさらに分析した。２つの細胞株、肝癌誘導株HepG2およびHs 700Tは、使用された標識Ad2ウイルスの投入量の５から10%の間のレベルでAd2と結合した。これらのレベルは、飽和量のF5Kと細胞を予備インキュベーションした場合、90%を超えて低下したことから、Ad2結合はファイバー依存的且つ特異的であることがわかった。L230では全く影響が見られなかったことから、Ad2の結合にペントンベースは識別されるほどの役割を果たさないことがわかった。HepG2へのAd9の結合はF9K によって阻害されなかったが、L230によって25%阻害された。Hs 700TへのAd9の結合はF9Kによって25%阻害された。Hs 700TへのAd9の結合の約45%がα_Vインテグリンとの相互作用と関連した。どれも低レベルのAd2ファイバー受容体を提示するA172、U118MG、ACA19およびHASMCへのAd2の結合は低かった。これらの細胞株に対するAd9の結合はF9K蛋白との予備インキュベーションによって有意に減少しなかったので、該Ad9の結合は、mAb L230と細胞を予備インキュベーションした際の結合パーセントの降下により確かめられるように、主として直接的なペントン/α_Vインテグリン相互作用と関連していた。Ad9は、どちらも α_Vインテグリンをほとんどまたは全く発現していないRamosおよびY79に、低いレベルで結合した。F9K蛋白との予備インキュベーション時に得られた結合パーセントによって証明されるように、結合したウイルスの約60-80%はこれらの細胞にファイバーを介して結合しているようだった。RamosおよびY79はどちらもL230 との予備インキュベーションにより結合に何の効果も示さなかった。Tera２はα_V インテグリンを有し、（Ad2への結合データで証明されたように）非常に高いレベルのファイバー受容体を発現しているが、そのTera２にもAd9は結合した。α_V インテグリンが存在するにも関わらず主にファイバーを介して結合したことは、細胞のファイバー受容体密度を反映しているのかもしれない。Tera２細胞のL230 との予備インキュベーションは、Ad9の結合に何の効果も示さなかった。HepG2、 Ramos、Y79およびTera２に対するAd9のファイバーを介した結合は、Ad2の場合より約6-9倍低かった。これらの結果から、短縮されたファイバーシャフトを有するアデノウイルスベクターは、ファイバー受容体を介した結合のレベルを減らすことによって、より高いターゲッティング特異性を有するだろうと示唆される。機能的なα_Vインテグリンを欠くハムスター黒色腫細胞株CS-1へのAd2およびAd 9の結合についても分析した。100万個の細胞を、２μｇ/mlの適当なファイバーノブ、50μｇ/mlのAd2ペントンベース、または両者の組み合わせと予備インキュベーションし、4℃で１時間インキュベーションした。準飽和量の標識したウイルスを加え、１時間インキュベーションを続けた。次いで、細胞をペレットにし、冷PBS⁺⁺で２回洗浄し、シンチレーションカウンターで計数した。図６Ａおよび６Ｂ（該図は、それぞれCS-1およびCS-1-α_Vβ5での、CTRL、F5K、PBおよびF5 K＋PBに対する標識Ad2の結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、Ad2はCS-1に予想通り結合した。Ad2はCS-1とよく結合し、F5K との予備インキュベーションにより90%の競合を結果として生じた。ペントンベースは結合に関与しなかった。CS-1細胞へのα_Vβ5インテグリンのトランスフェクションは、Ad2の結合に何ら影響を及ぼさなかった。図６Ｃおよび６Ｄ（該図は、それぞれCS-1およびCS-1-α_Vβ5での、CTRL、F9K 、PBおよびF9K＋PBに対する標識Ad9の結合（コントロールに対する％）のグラフである）に示されるように、Ad9はCS-1に結合した。Ad9はAd2より約５倍低いレベルでCS-1に結合し、F9Kとの予備インキュベーションにより65%の競合を結果として生じた。ペントンベースとの予備インキュベーションでは有意な効果は観察されなかった。しかし、Ad2とは異なり、α_Vβ5インテグリンでCS-1細胞をトランスフェクトすると、Ad9の結合特性は劇的に変化した。Ad9の全結合は２つの因子の１つによって増加したが、F9Kとの予備インキュベーションでは競合が25%まで低下し、ペントンベースとの予備インキュベーションでは40%阻害の結果を示した。F9Kおよびペントンベースとの予備インキュベーションは、65%にまで阻害を増加させた。α_Vβ3インテグリンでCS-1細胞をトランスフェクトすると同様の効果がみられたが、それほど顕著ではなかった。 F9Kが多くの細胞株へのAd9の結合をブロックできないのは、Ad9が、Ad2とは異なり、ファイバーに依存せずα_Vインテグリンを介して細胞に結合し得ることと相関がある。したがって、α_VインテグリンはAd9ウイルスに対する第二の接着部位として作用することができる。このことは、可溶性ファイバーがなぜ多くの細胞株へのAd9の接着をブロックしないかを説明している。飽和量のペントンベースおよびF9KとのHs 700T細胞の予備インキュベーションにより、Ad9の結合が77% ブロックされるということは、ファイバー−受容体およびペントン−インテグリン以外のウイルス−細胞相互作用が役割を果たしているかもしれず、実際、図５Ｂに示されるHs 700T細胞でのAd9感染のFFU分析で見られたように、少なくとも部分的には、これらの相互作用と置き換わり得ることを示している。α_Vインテグリン以外の細胞インテグリンとペントンベースとの相互作用およびヘキソンと細胞表面蛋白との相互作用は、何故Ad9が、ファイバーおよびα_Vインテグリン非依存的なメカニズムを用いて、みかけ上細胞に結合し侵入し得るかを説明するかもしれない。 Ad9（12-13nm）のように短いファイバー（10-11nm）を有するにも関わらず、標識Ad3の結合は、飽和量の機能中和モノクローナル抗体L230およびF3KとA549細胞を予備インキュベーションすると、Ad9とは異なつて完全に排除された。したがって、観察された標識Ad3の結合の15%までが、ウイルスのα_Vインテグリンとの方向づけ相互作用からもたらされた。したがって、Ad3はAd9のファイバーに相当するファイバーの長さを有するにも関わらず、主としてそのファイバー受容体と相互作用し、該受容体はAd2/5/9ファイバーによって認識されるファイバー受容体よりも容易に使用可能であるに違いない。実施例６本実施例では、短シャフトウイルスベクターAdSEAP.F5F9Kshortの構築について述べる。導入プラスミドp193NS83-100を、プラスミドpNEB193（New England Biolabs， Beverly，MA）にAd5ゲノムの83-100マップ単位領域にわたるAd5 NdeＩ−SalＩフラグメントをクローニングすることにより構築した。クローニングを容易にするために、（5’NdeＩサイトと3’MunＩサイトで両側を挟まれた）Bam HIサイトを含む合成オリゴヌクレオチドでNdeＩ-MunＩフラグメントを置換した。二本鎖合成オリゴヌクレオチドフラグメントは、オーバーラップする合成一本鎖センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドTATGGAGGAT CCAATAAAGA ATCGTTTGTG TTATG TTTCA ACGTGTTTAT TTTTC（配列番号１２）およびAATTGAAAAA TAAACACGTT GAAACA TAAC ACAAACGATT CTTTATTGGA TCCTCCA（配列番号１３）から作製した。オーバーラップするオリゴマーの末端をNdeＩおよびMunＩサイトへ直接クローニングできるような突出部を持つように作製した。得られたベクター p193NS(ΔF)は、ファイバー蛋白の全コード配列を欠失していたが、アデノウイルスE4コード配列全体を含んでいた。該プラスミドは、合成Nde I/Mun Iオリゴヌクレオチド中に含まれるポリアデニル化シグナル（配列番号１４および１５中で太字で示される）を保持し、且つ新しいBam HI制限部位（配列番号１４および１５中で下線で示される）も取り込んでいた。最後のファイバー蛋白のコドンとファイバー蛋白の終止コドンとの間にBam HI サイトを有する変異ファイバー遺伝子を含む導入プラスミドp193(F5*)を、p193N S(ΔF)から構築した。ファイバー遺伝子の最終コドンの後に改変Bam HIサイトを組み込んで変異ファイバー遺伝子を創る一方で、ボリメラーゼ連鎖反応により該ファイバー遺伝子を増幅すべく合成のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、該変異ファイバー遺伝子をファイバーを欠くp193NS( ΔF)プラスミドに組み込んだ。このBam HIサイトはアミノ酸グリシンおよびセリンをコードするものとしても機能した。Ad5のゲノムDNA由来のファイバー遺伝子のNdeＩサイトからＣ末端コード領域までを増幅するために用いたプライマーは、アンチセンスプライマーTCCCCCCGGG TCTAGATTAG GATCCTTCTT GGGCAATGTA TGA （太字は停止部位；Bam HIサイトは下線部；配列番号１４）およびセンスプライマーCGTGTATCCA TATGACACAG A（NdeＩサイトは下線部；配列番号１５）だった。次いで、PCR産物をNdeＩおよびBam HIで切断し、p193NS(ΔF)のNde I/Bam HIサイトにクローニングした。プラスミドp193F5F9K-shortをp193F5*から構築した。オリゴヌクレオチドプライマーGGACTAGTAG CATTTAATAAA AAAGAAGAT AAGCGC（配列番号１６）およびCCGGA TCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG（配列番号１７）を用いて、最後のシャフトリピートおよびノブをコードするAd9配列を該ファイバー遺伝子から増幅した。次いで、PCR産物を標準的な技術を用いて精製した後、制限酵素NheＩおよびBam HIで消化して、PCR産物をP193(F5*)導入プラスミドのNhe I/Bam HI領域にクローニングできるようにした。アデノウイルスの必須E4領域を含む導入プラスミドp193 F5F9KshortをSalＩで切断し、１時間前にアデノウイルスベクターAdSE.E4Gus（E4領域を欠いており、 E4遺伝子がなければ293細胞内で複製することができない）で感染させておいた2 93細胞にトランスフェクトした。AdSE.E4Gus DNAがp193 F5F9K shortプラスミド DNAと組換えを行い、E4遺伝子を獲得する場合にのみ、該ベクターは293細胞内で複製が可能である。この組換えの間に、新しく形成されたベクターはプラスミドにコードされたファイバーの変異も取り込む。F5F9Kshortファイバーキメラを含む生存可能な組換えE4+アデノウイルスを、トランスフェクション後５日目にトランスフェクトされた細胞の細胞溶解物をプラーキングすることによって分離した。得られたベクターAdSE.F5F9Kshortは、293細胞上で２回の連続したプラーキングを用いて、標準的なウイルス学的技術により単離精製した。ウイルスDNAのP CRおよび制限分析によって、該ベクターが正しい挿入を含むことを確認した。ファイバー遺伝子のいずれらかの側でプライミングするオリゴヌクレオチドプライマーは、PCR産物が短縮されたキメラファイバー遺伝子として正しい大きさのものであることを示した。ベクターDNAの制限分析は、新しいベクターがAd9ファイバーノブにユニークな正しい制限部位を含んでいることを示した。したがって、 p193 F5F9K-shortプラスミド（その地図を図７に示す）は、Ad5ファイバー由来の最初の８つのβリピート、つまり1-8、およびAd9ファイバー由来の最後のβリピートの、合計９シャフトリピート単位からなる短いシャフトを有するキメラファイバー蛋白をコードする。言い換えれば、Ad5ファイバー遺伝子は、Ad5ファイバーのNheＩ制限部位からAd5ファイバーコード配列の末端までを欠失し、その欠失配列は、ノブおよび最後のシャフトリピートをコードするAd9ファイバー配列で置換された。実施例７本実施例ではAdSE.F5F9Kshortによる293細胞へのアルカリホスファターゼ遺伝子の送達の特異性について説明する。 293細胞を、３μｇ/ml Ad9ファイバー、50μｇ/mlペントンベース、またはファイバーとペントンベースの組み合わせを含む、あるいは競合物を含まなDMEM(0 .3ml）の懸濁液中で37℃で45分間インキュベーションした。次いで、同量のAdSE .F5F9Kshortを各サンプルに加え、該サンプルを37℃で60分間インキュベーションした。それから細胞を３回洗浄し、37℃で１日間培養した。次いで、アルカリホスファターゼキットを製造元の指示に従って用い、培地の分泌アルカリホスファターゼ活性をアッセイした。結果を図８に示す（該図は、コントロール、ファイバー、PBおよびファイバー＋PBに対するアルカリホスファターゼ発現（RLU）の棒グラフである)。組換えファイバー蛋白は、それが長シャフトファイバー蛋白を含むアデノウイルスベクターによる遺伝子送達の95-99%をブロックする濃度で、かろうじてAdSE.F5F9Kshortによる遺伝子送達に対して効果を示すにすぎなかった。しかしながら、ペントンベースは長シャフトのAd5ベクターによる遺伝子送達に対してはかろうじて効果を示すだけだが、AdSE.F5F9Kshortによる送達を95％を超えて減少させた。これらの結果より、ペントンベースはAdSe.F5F9Ksh ortによる細胞への遺伝子送達を命令するのに対し、ファイバー蛋白は長シャフトのAd2およびAd5ベクターによる細胞への遺伝子送達を命令することが実証された。実施例８本実施例では、AdSE（長シャフト）およびAdSE.F5F9Kshort（短シャフト）による平滑筋細胞への遺伝子送達を比較する。 Ad2、Ad5またはAd9に対する機能的なファイバー受容体を、全くでないにしてもほとんど発現しないヒト腸管平滑筋細胞を、実験の１日前に２４穴プレートにプレーティングした。次に、50μｇ/mlのペントン蛋白の存在下または非存在下で、細胞を37℃で１時間DMEM 0.3ml中でインキュベーションした。次いで、AdSE またはAdSE.F5F9Kshortを細胞に加え、室温で１時間振動させた。それから細胞を３回洗浄し、37℃で１日培養した。アルカリホスファターゼキットを製造元の指示に従って用い、培地の分泌アルカリホスファターゼ活性をアッセイした。結果を図９に示す（該図は、コントロールおよび競合ペントンおよびmockに対する AdSe.F5F9Kshort（■）およびAdSe（□）のアルカリホスファターゼ発現（RLU）の棒グラフである。これらの結果は、AdSE.F5F9Kshortが、ある特定の細胞種への遺伝子送達においてAdSEよりも効率的であることを示している。さらに、ペントンベースが細胞の形質導入をブロックしたことから考えて、これらの結果はAd SE.F5F9Kshortのペントンベースが結合および形質導入を仲介することを示している。本明細書中で引用した全ての文献は、引用により、各文献が個々に且つ詳細に明らかにされたと同程度に、そっくりそのまま組み入れられるものである。本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることが当業者には自明であろう。本発明はここで詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図している。したがって、本発明は添付の請求の範囲の精神と範囲に包含されるすべての改変を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月２１日（１９９８．８．２１）【補正内容】請求の範囲１．テール、シャフトおよびノブを含む短シャフトアデノウイルスファイバー。２．該シャフトが約１２個以下のβリピートを含む、請求の範囲１の短シャフトアデノウイルスファイバー。３．該シャフトがＣ血清群またはＤ血清群の血清型のものであり、該ノブがＣ血清群またはＤ血清群の血清型のものである、請求の範囲１または２の短シャフトアデノウイルスファイバー。４．該シャフトおよびノブが同じ血清型のものである、請求の範囲１〜３のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。５．該シャフトが天然に存在するアデノウイルス中のテールに隣接するシャフトの部分を含む、請求の範囲１〜４のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。６．該短シャフトファイバーが非天然のアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜５のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。７．該非天然のアミノ酸配列が、細胞受容体結合配列または二重特異的もしくは多重特異的蛋白結合配列である、請求の範囲６の短シャフトアデノウイルスファイバー。８．該非天然のアミノ酸配列が、該ノブの露出したループの天然アミノ酸配列の

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コウベスディ、イムリアメリカ合衆国、メリーランド州 20852、ロックヴィル、ウォーブラーレイン 7713

Claims

【特許請求の範囲】１．テール、シャフトおよびノブを含む短シャフトアデノウイルスファイバー。２．該シャフト状物が約１２個以下のβリピートを含む、請求の範囲１の短シャフトアデノウイルスファイバー。３．該シャフトがＣ血清群またはＤ血清群の血清型のものであり、該ノブがＣ血清群またはＤ血清群の血清型のものである、請求の範囲１または２の短シャフトアデノウイルスファイバー。４．該シャフトおよびノブが同じ血清型のものである、請求の範囲１〜３のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。５．該シャフトが天然に存在するアデノウイルス中のテールに隣接するシャフトの部分を含む、請求の範囲１〜４のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。６．該短シャフトファイバーが非天然のアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜５のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。７．該非天然のアミノ酸配列が、細胞受容体結合配列または二重特異的もしくは多重特異的蛋白結合配列である、請求の範囲６の短シャフトアデノウイルスファイバー。８．該非天然のアミノ酸配列が、該ノブの露出したループの天然アミノ酸配列の中にまたはそれに代えて挿入されるか、あるいは該ノブのＣ末端の延長である、請求の範囲６または７の短シャフトアデノウイルスファイバー。９．該非天然のアミノ酸配列が、該短シャフトアデノウイルスファイバーを含むアデノウイルスのアッセンブリを妨げない、請求の範囲６〜８のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー。１０．該短シャフトアデノウイルス蛋白が、いかなるウイルスからも離れているときは同種のアデノウイルス受容体に結合するが、血清型５のアデノウイルスに組み込まれたときは同種のアデノウイルス受容体に実質的に結合しない、請求の範囲１〜９のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバー(但し、該血清型５アデノウイルスは該短シャフトファイバーが組み込まれている以外は野生型ウイルスである)。１１．請求の範囲１〜１０のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバーをコードするＤＮＡを含む導入ベクター。１２．請求の範囲１〜１０のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバーをコードする短シャフトアデノウイルスファイバー遺伝子を含むバキュロウイルス。１３．非天然の遺伝子および請求の範囲１〜１０のいずれかの短シャフトアデノウイルスファイバーを含むアデノウイルス。１４．該アデノウイルスが組換えペントンベース蛋白をさらに含み、且つ該組換えペントンベース蛋白が非天然のアミノ酸配列を含む、請求の範囲１３のアデノウイルス。１５．該組換えペントンベース蛋白の該非天然のアミノ酸配列が、細胞受容体結合配列、二重特異的または多重特異的蛋白結合配列である、請求の範囲１４のアデノウイルス。１６．該アデノウイルスが、細胞結合を命令するペントンベース蛋白を含む、請求の範囲１３〜１５のいずれかのアデノウイルス。１７．該アデノウイルスが細胞に結合し、該アデノウイルスと該細胞との該結合が、いかなるアデノウイルスにも結合されず且つ該アデノウイルスの該短シャフトファイバー蛋白と同一である短シャフトファイバーの存在下で、実質的に減少しない、請求の範囲１３〜１６のいずれかのアデノウイルス。１８.該アデノウイルスが細胞に結合し、該アデノウイルスと細胞との該結合が、いかなるアデノウイルスにも結合されず且つ該アデノウイルスの該短シャフトファイバー蛋白と同一である短シャフトファイバーの存在下で、５％以下しか減少しない、請求の範囲１３〜１６のいずれかのアデノウイルス。１９．該アデノウイルスが細胞に結合し、該アデノウイルスと該細胞との該結合が、いかなるアデノウイルスにも結合されず且つ該アデノウイルスの該短シャフトファイバー蛋白と同一である、１０００倍モル過剰（遊離蛋白：ウイルス結合蛋白）の短シャフトファイバーの存在下で、１０％以下しか減少しない、請求の範囲１３〜１６のいずれかのアデノウイルス。２０．該細胞が、該短シャフトファイバーがウイルスから離れているときには該ファイバーが結合する細胞表面受容体を含まないものである、請求の範囲１８〜２０のアデノウイルス。２１．該アデノウイルスが、非Ｃ群アデノウイルスを中和するがＣ群アデノウイルスを中和しない抗体によっては中和されないものである、請求の範囲１３〜２０のいずれかのアデノウイルス。２２．該アデノウイルスがＣ血清群のものである請求の範囲１３〜２０のいずれかのアデノウイルス。２３．アデノウイルスの細胞への接着をターゲッティングしてアデノウイルスの細胞侵入をもたらす方法であって、該細胞に請求の範囲１３〜２２のいずれかのアデノウイルスを接触させることを含む方法。２４．請求の範囲１３〜２２のいずれかのアデノウイルスの接着をターゲッティングする方法であって、 (a) 該アデノウイルスに二重特異的または多重特異的結合剤(該結合剤は、(i )該アデノウイルスの非天然アミノ酸配列と選択的に結合する第一成分および(ii )該細胞上の細胞表面結合部位と選択的に結合する第二成分を含む)を接触させて、該アデノウイルスと該結合剤の複合体を形成させ、 (b) 該細胞への該アデノウイルスの侵入をもたらすように、該細胞に(a)の該複合体を接触させることを含む方法。