JPH09503672A

JPH09503672A - Ｆａｓ拮抗剤とその利用

Info

Publication number: JPH09503672A
Application number: JP7512047A
Authority: JP
Inventors: リンチ，デヴィッド・エイチ; アルダーソン，マーク
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1997-04-15
Also published as: EP0723556A4; EP0723556A1; NZ275711A; US5620889A; KR960704938A; CA2174132A1; WO1995010540A1; AU705114B2; AU7978494A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトFas抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体及び結合タンパク質のパネルを提供する。抗体及び結合タンパク質のあるものは、Ｔ細胞の増殖刺激及び、抗Fas CH-11モノクローナル抗体の、Fas抗原発現細胞への結合阻害及び、抗Fas CH-11モノクローナル抗体を介した細胞溶解阻害、ならびにFasリガンドを介した細胞溶解阻害が可能である。本発明はまた、このモノクローナル抗体を含む治療用組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Fas拮抗剤とその利用発明の分野本発明は分子生物学、生化学及び免疫学の分野に関するものである。本明細書中に記載されているのは、過剰あるいは不必要にプログラムされた、または活性化誘導した細胞死に関連した疾病の治療のための、予防あるいは治療への応用を含む組成物である。より具体的にはFasとFas-リガンド（Fas-L）の相互作用に影響を与え、かつFas受容体を介してシグナルを伝達する事が出来る物質が提供される。発明の背景Ｔ細胞の発達と免疫応答調節の間、負の調節機構によって、自己反応性あるいは機能不全のＴ細胞の排除、および末梢Ｔ細胞の過剰な増殖の防止が保証されている。未成熟の胸腺細胞と成熟した末梢Ｔ細胞の排除は、影響を受けた細胞の細胞質が凝集し、細胞膜が包旋状化し、核が凝縮し、DNAの断片化が生ずるプログラム細胞死、アポトーシスの誘導を介して起こる。先行技術データは、Ｔ細胞のアポトーシスが誘導されるかも知れない２つの経路を示唆している。１つの経路は、CD3Ｔ細胞受容体（TCR）複合体の活性化を含むかも知れない。もう一つの経路には細胞表面のFas抗原が関与するかも知れない。Fasは神経増殖因子／腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である。ワタナベ-フクナガら(J．Immun ol．148: 1274-79(1992))及びイトウら(Cell 66: 233-43(1991))は、それぞれネズミとヒトのFas抗原をコードするcDNAのクローニングを報告している。リンパ球増殖(lpr)突然変異として知られる常染色体劣性突然変異をホモにもつマウスはFas抗原遺伝子を欠損しており、アポトーシスシグナルを伝達することが出来る正常の機能を有するFasタンパク質を発現していない（ワタナベ-フクナガら、Nature 356: 314-17(1992)）。これらのマウスは、リンパ節及び脾臓に CD4^-CD8^- T細胞を蓄積することで特徴付けられる異常、ガンマグロブリン過剰症、自己抗体産生、リューマチ因子、関節炎および糸球体症を進行させる。同上文献。広範なリンパ球増殖病(gld)として知られる変異遺伝子をホモに持つ他のマウスは、lprマウスで見られるものと、臨床的に区別不能な症候を示す（J．B．ロス(Roths)ら、J．Exp．Med.，159: 1-20(1984)）。gld遺伝子はマウスの第１番染色体にマップされ、一方lpr遺伝子はマウスの第１９番染色体にマップされている。gld遺伝子産物は単離されていないが、アレン(Allen)ら（J．Exp．Med.， 172:1367-75(1990)）は、lprとgld遺伝子が、異なる細胞で発現している、相互作用するリガンド-受容体分子対をコードすることを示唆している。 Fas抗原は本来２つのモノクローナル抗体であるCH-11と抗APO-1によって定められた。CH-11はIgMクラスの免疫グロブリンに属している。抗APO-1はIgG3クラスの免疫グロブリンに属している。CH-11と抗APO-1モノクローナル抗体はどちらもヒトFasを発現する細胞に結合し、拮抗剤として機能し、Fasを発現するリンパ細胞系列にアポトーシスを誘導する。CH-11と抗APO-1抗体は、いずれも特定のin vitroで培養された細胞系列に対する細胞溶解活性に基づいて選択された。 Fas抗原を発現する細胞に対するCH-11の結合を妨げるか、あるいはCH-11を介する、またはFas-L-を介するリンパ細胞系列の溶解を妨害するモノクローナル抗体は未だ開示されていない。そのような妨害性抗体は、たとえば正常な免疫応答に加え、一般的な自己免疫疾患おけるその役割に関する見識を与えるための研究応用に有用であろう。また、妨害性抗体はFasまたはFas Lが介する生物学的活性を阻害する必要のある治療応用においても有用であろう。本発明は、この様な抗体および関連するその他の利点を提供するものである。発明の概要本発明はヒトFasの細胞外ドメインに特異的に結合し、またFasを発現する細胞への、抗Fasモノクローナル抗体CH-11の結合を、約４％から約６３％まで、約１０倍モル過剰に阻害する新規なIgG1モノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体はネズミおよびヒト由来のモノクローナル抗体からなるグループから選択される。ブロッキング実験は、これらのモノクローナル抗体の多くが、CH -11モノクローナル抗体を介するFas発現細胞の溶解を、約１：１から約１０：１のモル比（IgG1モノクローナル抗体とCH-11のモル比）で、１０％の範囲内から９０％を越えるまで阻害することを示している。これらのIgG1 Fasモノクローナル抗体のいくつかはFas抗原を発現する細胞系列の、有意な溶解を起こすことができたが、溶解はこの抗体が最初に固層支持体に結合しているときにのみ観察された。このモノクローナル抗体が溶液状態でFas抗原を発現する細胞系列の培養中に加えられると、３０％以下の細胞溶解がどの抗体に対しても観察された。それに加え、Fasモノクローナル抗体のあるものは、固層に結合されている場合に、インターロイキン２とは独立にT細胞の増殖を刺激する。本発明に関連する解釈の範囲内では、上述のFasに対するIgG1モノクローナル抗体と、生理学的に許容できる担体あるいは希釈剤からなる治療用組成物が提供される。また、本発明はヒトFasの細胞外ドメインに特異的に結合し、インターロイキン２とは独立にＴ細胞の増殖を刺激し、Fasを発現する細胞のFasリガンドを介した溶解を、少なくとも１０％まで阻害する。本発明に関連する解釈の範囲内では、上述のFasに対するIgG1モノクローナル抗体と、生理学的に許容できる担体あるいは希釈剤からなる治療用組成物が提供される。本発明は更に、ヒトFas抗原の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体、あるいはその一部をコードするＤＮＡ配列によってコードされる、Fas結合ドメインを含むヒトFas抗原に特異的に結合する結合タンパク質を提供する。また、その結合タンパク質はインターロイキン２とは独立にＴ細胞の増殖を剌激することが出来る。本発明に関連する解釈の範囲内では、ヒトFas抗原に特異的に結合する結合蛋白質と、生理学的に許容できる担体あるいは希釈剤からなる治療用組成物が提供される。また更に、可溶性の融合タンパク質と、生理学的に許容できる担体あるいは希釈剤からなる治療用組成物が提供される。可溶性の融合タンパク質は、huFas/FC と呼ばれ、Fasを発現するリンパ球細胞の、実質的に全てのFasリガンドを介した溶解を阻害する。図面の簡単な説明第１図Ａと第１図Ｂは、huFas M38モノクローナル抗体による、CD3モノクローナル抗体（黒丸）存在下と、CD3モノクローナル抗体非存在下（白抜き丸）、ならびにhuFas M33とCD3モノクローナル抗体（黒四角）によるＴ細胞増殖の共同刺激能を示している。第１図Ａは末梢血Ｔ細胞を、固定化したCD3モノクローナル抗体存在下または非存在下で、固定化したhuFas M33とM38モノクローナル抗体とともに、３日間培養し、最後の６時間³H-TdRでパルスラベルした、６回の実験結果を代表するものである。第１図Ｂは胸腺細胞を、固定化したCD3モノクローナル抗体存在下または非存在下で、固定化したhuFas M33とM38モノクローナル抗体とともに、３日間培養し、最後の６時間³H-TdRでパルスラベルした、３回の実験結果を代表するものである。第１図Ａと第１図Ｂのデータは、３連培養の平均± 標準偏差を示している。第２図Ａから第２図Ｄは、huFas M38による共同刺激作用が、CD4⁺及びCD8⁺Ｔ細胞による、CD25とCD69の発現を促進することを示している。第２図Ａで、末梢血由来のＴ細胞は、固定化されたCD3モノクローナル抗体単独か、あるいは固定化したCD3モノクローナル抗体と固定化したhuFas M38いずれかで４８時間刺激され、CD4-PEとCD25-FITCを用いた２色フローサイトメトリーによって解析された。第２図Ｂでは、Ｔ細胞は、固定化されたCD3モノクローナル抗体単独か、あるいは固定化したCD3モノクローナル抗体と固定化したhuFas M38いずれかで４８時間刺激され、CD4-PEとCD69-FITCを用いた２色フローサイトメトリーによって解析された。第２図Ｃでは、Ｔ細胞は、固定化されたCD3モノクローナル抗体単独か、あるいは固定化したCD3モノクローナル抗体と固定化したhuFas M38いずれかで４８時間刺激され、CD8-PEとCD25-FITCを用いた２色フローサイトメトリーによって解析された。第２図Ｄでは、Ｔ細胞は、固定化されたCD3モノクローナル抗体単独か、あるいは固定化したCD3モノクローナル抗体と固定化したhuFas M38 いずれかで４８時間刺激され、CD8-PEとCD69-FITCを用いた２色フローサイトメトリーによって解析された。第３図Ａと第３図Ｂは、huFasモノクローナル抗体M38によるＴ細胞の増殖共同刺激作用が、大部分IL-2非依存的であることを示す。第３図Ａでは、末梢血Ｔ細胞が、固定化したCD3モノクローナル抗体とIL-2とともに７２時間培養された。第３図Ｂでは、末梢血Ｔ細胞が、固定化したCD3モノクローナル抗体とhuFas M38 モノクローナル抗体とともに７２時間培養された。第３図Ａと第３図Ｂいずれにおいても、細胞は1:500希釈のIL-2中和血清の存在下（黒丸）あるいは非存在下（白抜き丸）で培養された。それぞれの図のデータは、４回実施された実験の代表である。第４図は、増殖しているＴ細胞前駆体の頻度に対するhuFas M38の効果を示している。順番に数を増した精製Ｔ細胞を、CD3モノクローナル抗体のみ（黒四角）、あるいはCD3モノクローナル抗体とhuFas M38モノクローナル抗体（黒丸）でプレコートしたウエルに、10ng/mlのIL-2を含む培地中で15μl量培養した。５日後、増殖しているＴ細胞クローンについて、ウエルを顕微鏡下でスコアした。第５図は、Fas-Lを介するジャーカット細胞の殺傷における、huFas M3とhuFas M31の効果を示している。白抜きの四角は対照、白抜きの丸は10ug/mlのhuFas M 31を示し、白抜きの菱形は10ug/mlのhuFas M3を示している。第６図は、Fas-Lを介するジャーカット細胞の殺傷における、さまざまな可溶性融合タンパク質の効果を示している。huIL4R/Fc（黒四角）、huCD30/Fc（黒菱形）、huTNFR/Fc（白抜き丸）あるいはhuFas/Fc（白抜き三角）は、対照（白抜き四角）とともに解析された可溶性融合タンパク質である。第７図Ａ、第７図Ｂ及び第７図Ｃは、Fas拮抗剤が、ヒトCD4⁺Ｔ細胞クローン（TCC）の長期培養における、活性化誘導アポトーシスを阻害することを示している。第７図Ａは、Fas M3モノクローナル抗体が、ヒトCD4⁺Ｔ細胞クローンの２つの異なる長期培養において、PMAとイノマイシンによって誘導されるアポトーシスを実質的に阻害することを示している。抗体を含まない対照培地中で培養されたTCCは、網かけの棒で示されており；Fas M3抗体のみを含む培地中で培養されたものは斜線の入った棒で；PMAとイノマイシンを含む培地で培養されたものは黒ぬりの捧で示され；そしてPMA、イノマイシンおよびFAS M3抗体を含む培地で培養されたものは波線の入った捧で示されている。第７図Ｂは、可溶性のhuFA S M3モノクローナル抗体（それぞれの棒グラフで斜線を入れた中央の棒）が、TC R/CD3複合体とOKT3モノクローナル抗体を組み合せること、またはTCCをPHAまたはPMAとイノマイシンとともに培養することによって誘導される、TCCにおけるアポトーシスを実質的に阻害することを示している。抗体を含まない対照は網かけの捧で示されており、IgG1モノクローナル抗体対照はそれぞれの棒グラフの右側の黒ぬりの棒で示されている。第７図Ｃは、Fas/Fc融合タンパク質がhuFas M3モノクローナル抗体と同様に活性化誘導されたTCCにおけるアポトーシスを阻害するが、一方対照のIgG1免疫グロブリンは何の効果も持たないことを示している。対照は左端の網かけの棒で示されており；IgG1免疫グロブリンの結果は左から２番目の（斜線を入れた）棒で示され、Fas M3の結果は左から３番目（黒塗）の棒で示され、huFas/Fc融合タンパク質の結果はそれぞれのグラフの左から４番目（波線）の棒で示されている。発明の詳細な説明抗原Fas（APO-1とも呼ばれる）は神経成長因子／腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である。過去に、Fasの機能に関する結論は、特定の細胞系列に対する細胞溶解活性に基づいて選択した、２種類の最初のモノクローナル抗体（クローンCH-11と抗APO-1）によって出されたin vitroのデータに基づいて導かれた。本発明に付随するデータは、Fasによって仲介される複雑な一連の相互作用の存在と、あるガン化した細胞系列におけるアポトーシスの誘導と、正常なＴ細胞の活性化と増殖において、Fasがある役割を担っていることを示している。本発明に従って、本発明者らはhuFasに単純に結合する能力に基づいてFasモノクローナル抗体のパネルを開発し、そのため、さまざまな生物学的特性を持つモノクローナル抗体を作製した。huFasに対して作られたモノクローナル抗体のパネルは（１）Fasを発現する細胞へのCH-11の結合を阻害する能力；（２）溶液に加えたとき、あるいは培養プレートに結合している場合に、Fasを発現する細胞系列を殺す能力；および（３）Fasを発現するリンパ細胞におけるCH-11もしくは Fasリガンド（Fas-L）によって誘導されたアポトーシスを阻害する能力に関して、その性質が調べられた。それに加え、Fasの発現を誘導できる、新鮮な単離されたヒトＴリンパ球に対する、これらのhuFas特異的抗体の効果も調べられた。 huFas cDNAはクローニングされ、そのＤＮＡ配列とそれにコードされるアミノ酸配列がイトウら（Cell 66: 233-43(1991)）によって報告された。精製された Fas抗原は、モノクローナル抗体ならびに、組換えＤＮＡ法を用いて特異的に構築され得る他の結合タンパク質の調製に用いることが出来る。これらの結合タンパク質は、モノクローナル抗体の特異的結合を担う可変領域を取り入れることも出来る。通常の技術を有する当業者には明らかなように、抗体はFas抗原全体に対しても、あるいはFas抗原の一部に対しても作製することが出来る。特に好ましいのは、可溶性型のヒトFas抗原に対して作製された抗体である。それに加え、本発明の関係においては、結合タンパク質及び抗体は、通常の技術を有する当業者によって容易に調製可能な抗原結合断片、例えばF(ab')₂やFab断片を含む。モノクローナル抗体（Mabs）もまた、慣用技術（米国特許番号RE32,011，4,90 2,614，4,543,439および4,411,993参照、なお、これらは本明細書に引用文献として取り込まれる；また、Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimensi on inBiological Analyses，ケネット(Kennett)ら編、Plenum Press(1980)；およびAntibodies: A Laboratory Manual、ハーロウとレーン(Harlow and Lane)編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)を参照のこと、なお、これらも本明細書に引用文献として取り込まれる）。組換え技術によって抗体の産性を可能とする他の技術（例えば、Stratacyte，La Jolla，Californiaから得られる市販のシステムを含む、ウィリアム D．ヒューズ(William D．Huse)ら、Science， 246: 1275-1281(1989)；L．サストゥリー(L．Sastry)ら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，86: 5728-5732(1989)；およびミッチェルアルティング-メース(Michell e Alting-Mees)ら、Strategies in Molecular Biology，3: 1-9(1990)）によって記載されている技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用してもよい。同様に、特異的な結合をする抗体の可変域をコードする遺伝子の一部を取り入れるために、組換えＤＮＡ技術を利用して結合タンパク質を構築することも出来る。これらのタンパク質の構築は、本明細書で提供される開示があれば、通常の技術を有する当業者によって容易に行なえる（ジェイムズ W．ラリック(James W ．Larrick)ら、Biotechnology，7: 934-938(1989)、リーヒマン(Riechmann)ら、 Nature（England）332: 323-327(1988)；ロバーツ(Roberts)ら、Nature（Engla nd）328: 731-734(1987)；ベルヘーエン(Verhoeyen)ら、Science 239: 1534-153 6(1988)；チャウダリー(Chaudhary)ら、Nature（England）339: 394-397(1989) ）。簡単に述べると、特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合部位もしくはFas抗原結合ドメインをコードするＤＮＡが増幅され、ヒト抗体を産生する細胞のゲノムに直接挿入される（ベルヘーエンら、前出；リーヒマンら、前出を参照）。この技術は、特異的に結合するネズミ（マウスまたはラット）のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインがヒトの抗体に転移するのを可能とする。このような抗体は、ラットもしくはマウスの抗体のように抗原性を持たないため、ヒトでの治療への利用に好ましい。または、抗原結合部位（可変領域）をもう一つの完全に異なるタンパク質に連結もしくは挿入することにより（チャウダリーら、前出参照）、その結果として、抗体の抗原結合部位とともに全く異なるタンパク質の機能活性を持つ新たなタンパク質を得ることができる。通常の技術を有する当業者が理解するであろうように、その抗体の抗原結合部位あるいはFas抗原結合ドメインは、抗体の可変領域に見いだされるかも知れない。さらに、哺乳類のFas抗原に特異的に結合する抗体のより狭い領域もしくは可変領域をコードするＤＮＡ配列もまた、本発明の中で用いることが出来る。これらの部位は、例えばELISA、ABCまたはドットブロットアッセイを含むアッセイを用いて、Fas抗原に対する結合特異性について容易に検査することが出来る。したがって、本発明は表１に挙げたネズミモノクローナル抗体由来のヒトで作られたモノクローナル抗体を提供する。本発明の他の態様は、表１に挙げたモノクローナル抗体の抗原結合部位を含む、組み換え型結合タンパク質に向けられており、ここではその結合タンパク質は（表１のMAbの本来の配列と比較して）改変されたアミノ酸配列から構成されるか、あるいは、その結合タンパク質が、表１のMAbと別のタンパク質に由来する追加されたポリペプチド配列を含む。ヒト型の抗体は、抗原結合部位が由来するところのネズミの抗体のそれとイソタイプが等価であるヒトの抗体の定常領域を含むことが好ましい。表１のネズミモノクローナル抗体は、サブクラスIgG1のものである。ヒト免疫グロブリンサブクラスIgG4は、ネズミの免疫グロブリンサブクラスIgG1に相当する（ゴルブ(Gol ub)、エドワード(Edward)、Immunology: A Synthesis，Sinauer Assocs.，Inc. ，サンダーランド、マサチューセッツ州、1987、５８ページ）。非免疫グロブリン由来のポリペプチドに融合されたモノクローナル抗体の抗原結合部位を含む結合タンパク質について、ひとつの例はアッセイで検出可能で、該抗原結合部位に融合された酵素である。例えば、このような融合タンパク質は、Fas抗原を発現する細胞のアッセイへの利用を見いだす。もう一つの例では、非免疫グロブリン由来のポリペプチドがタンパク性毒素であり、そのためその融合タンパク質がFasを有する細胞に対し、細胞毒性効果を持つものである。その他の結合タンパク質は、表１の抗体に由来する、既知の技術によって作出された抗体を含む（例えば、ロバーツら、前出、及びリーヒマンら、前出、を参照のこと）。それに加えて、本明細書で開示されるモノクローナル抗体に由来するポリペプチドのアミノ酸配列は、部位特異的突然変異導入法などの技術によって改変することができ、またその突然変異型ポリペプチドからなる抗体は求める生物学的特性についてスクリーニングしてもよい。上述のヒト型MAbと結合タンパク質は、表１のMAbの可変領域全体もしくは、抗原結合部位を含む該可変領域の断片からなっていてもよい。その可変領域もしくはその断片をコードするｃＤＮＡは本発明のハイブリドーマ細胞系列から単離されたｍＲＮＡから調製することができる。そのｃＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡ、もしくは非免疫グロブリン型のポリペプチドをコードするＤＮＡに融合してもよい。その融合遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された適当な宿主細胞は、それがコードする組み換え型タンパク質を生産するために培養される。ラリックら、前出は、免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離する一般法を述べている。この方法は、リーダー配列に相当する上流プライマーと、定常領域に保存された配列に基づく下流プライマーの混合物を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応を含む。もし必要であれば、単離されたＤＮＡは特定の定常領域ポリペプチド、例えばヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡに融合することが出来る。本発明では、huFasの細胞外領域（リガンド結合ドメイン）をコードするｃＤＮＡ断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて得られ、ヒトIgG1抗体の定常領域と併せることにより、可溶性のhuFas/Fc融合タンパク質が形成される。以下の実施例１で、より詳細に述べるように、huFasの細胞外ドメインをコードするＤＮＡは、ヒトＴ細胞ハイブリドーマから単離したＲＮＡから合成されたＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって増幅された。このＰＣＲで用いたプライマーは、前出のイトウらによって発表されたhuFas配列に基づいたものである。インフレームとなるように、ヒトIgG1のFc領域のＤＮＡ配列の５’末端に融合されたhuFasの細胞外ドメインＤＮＡを含む発現ベクターが構築され、哺乳動物細胞に形質導入された。発現されたタンパク質は、融合タンパク質のFc領域をアフィニティーカラムのプロテインＧに結合することを含む方法によって精製された。可溶性のhuFas/Fc融合タンパク質は、（１）以下の実施例に述べる抗ヒトhuFa sモノクローナル抗体精製のため、また（２）Fas-Lを発現する細胞によって仲介される、Fasを発現する標的細胞の溶解を阻害する融合タンパク質の能力を評価し、（３）Fasを発現するリンパ球細胞系列における、活性誘導アポトーシス（A IA）を妨げる、融合タンパク質の能力を評価するために用いられた。抗huFasモノクローナル抗体を作製するために、実施例２に述べるようにhuFas /Fc融合タンパク質をフロイントアジュバントとともにBALB/cJマウスに免疫した。そのマウスの脾臓細胞をネズミのミエローマと融合し、ハイブリドーマを得た。huFas/Fcへの結合はするが、ヒトIgG1には結合しないモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマがクローン化された。そのクローン化されたハイブリドーマ由来の全てのモノクローナル抗体についてそのIgG1イソタイプを調べ、プロテインＡアフィニティーカラムで精製した。上述の方法にしたがって作製され、hu Fas M38モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマクローンhuFas M38は、１９９３年１０月１９日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ame rican Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ）、12301 パークローンドライブ、ロックヴィル、メリーランド州 20852、米国（寄託番号 HB 11465）に寄託された。huFas M3モノクローナル抗体を生産するhuFas M3ハイブリドーマ細胞系列は、１９９４年１０月１１日にＡＴＣＣに寄託され、割り当てられた寄託番号はである。いずれの寄託も、ブダペスト条約の条件の下で行なわれた。本発明は、寄託されたハイブリドーマ細胞系列によって生産されるモノクローナル抗体M38 およびM3と同様に、M38またはM3の生物学的な特徴を持つモノクローナル抗体を提供する。M38およびM3の特定の特徴的な生物学的な性質は、表１に示されている。ひとたび適当な抗体もしくは結合タンパク質が得られれば、それらは、通常の技術を持つ当業者によく知られる多くの技術によって単離もしくは精製することが出来る。例えば、Antibodies: A Laboratory Manual，ハーロウとレーン編、C old Spring Harbor Laboratory Press(1988)を参照のこと。適当な技術とは、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、HPLCまたはRP-HPLC、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムによる精製、またはこれらの全ての組み合せを含む。 Fasモノクローナル抗体のIgG1イソタイプを調べる際に、それがもつMP-1細胞へのCH-11Fasモノクローナル抗体の結合阻害能を評価するために、フローサイトメトリーが用いられた。実施例３で述べられるように、Fasをもつ標的細胞はブロッキング溶液とともにインキュベーションされ、次に試験用IgG1Fasモノクローナル抗体とインキュベーションされた。次にCH-11モノクローナル抗体が加えられ、インキュベーションされた。その細胞はFACS緩衝液で２回洗浄され、結合したCH-11抗体を検出するために、マウスのIgG1とは交叉反応性を持たない抗マウスIgM-FITC（Tago）とともにインキュベーションされた。次に、FACScan（Bec ton-Dickinson社）を用いてフローサイトメトリーが行なわれ、データが収集された。このモノクローナル抗体は、５％以下から、最高で約６３％までのCH-11 結合阻害能をばらつきを示した（表１）。 CH-11結合に関する実施例３のデータは、IgG1Fasモノクローナル抗体の多くが、CH-11と同様なFasエピトープに結合することを示唆することから、ジャーカット細胞もしくはMP-1細胞の溶解促進能について試験がなされた。ジャーカット細胞及びMP-1細胞はCH-11モノクローナル抗体によって溶解された。Fas特異的モノクローナル抗体であるAPO-1のFcドメインは、有意にそのアポトーシス効果に影響を与えることが示されている（デイン(Dhein)ら、J．Immunol.，149; 3166-73 (1992)）。これに関して、APO-1のIgG1イソタイプの変種は、クロスリンクされない限り比較的弱いアポトーシス誘導しか示さなかった。表１のhuFas特異的なモノクローナル抗体の全てが、IgG1イソタイプであるとして、溶液に加えられた場合とクロスリンクされた場合、即ち、組織培養プレートのプラスチックに結合された場合とで、それらの持つジャーカット細胞もしくはMP-1細胞に対するアポトーシス誘導活性が調べられた。実施例４で述べるように、huFasモノクローナル抗体によって誘導される細胞溶解を測定するために、オーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイ法が用いられた。Fasをもつ標的細胞におけるアポトーシス誘導能は、溶液に加えられた場合とクロスリンクされた場合、即ち、組織培養プレートのプラスチックに結合された場合とで、IgG1イソタイプのFasモノクローナル抗体に関して測定された。採取されたデータは表１に要約されている。IgG1イソタイプのFasモノクローナル抗体のいくつか（M23、M31、M33およびM35）は、溶液中でも、固定されても、細胞溶解能を持たない。その他のもの（M1、M3、M24およびM 38）は、溶液中では細胞溶解能を示さなかったが、固定化された場合に、少なくともわずかな細胞溶解能を示した。唯一M2抗体だけが、溶液中（２０％以下の溶解）と固定化された場合とで、わずかな細胞溶解性を示した。この細胞溶解性に関する研究は、固定化されたときにアポトーシスを誘導する IgG1イソタイプFasモノクローナル抗体のいくつかが、溶液に加えられた場合にはCH-11によって誘導される細胞溶解過程を阻害するかどうかを調べるために、更に進められた。実施例５に述べるブロッキングアッセイを用い、⁵¹Crラベルしたジャーカット細胞と、ジャーカット細胞を溶解することが知られている一定濃度のCH-11とともに、段階的に希釈したIgG1Fas抗体を一夜インキュベーションし、オーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイによって、溶解した細胞からの⁵¹Crの遊離をアッセイした。この細胞溶解性に関する結果は、表１に示されている。この結果は、Fasを発現する細胞に対するCH-11の結合を部分的に阻害する性質と一致して、いくつかのモノクローナル抗体がCH-11を介する細胞溶解を阻害することを示している。他方、huFas M38モノクローナル抗体はCH-11の結合阻害は示さないが、CH-11によって誘導される標的細胞の溶解は効果的に阻害した。従って、huFas M38は、CH-11抗体によって認識されないエピトープに結合することによって、C H-11を介した標的細胞の溶解を阻害すると考えられる。細胞溶解性実験は、またM31とM33モノクローナル抗体は細胞表面Fasに結合するが、アポトーシスを誘導、阻害いずれもしないことを示している。したがって、それらはおそらく情報伝達経路に関わらないエピトープを認識しているのだろう。さらにM23とM33抗体は、細胞表面Fasに対するCH-11の結合の実質的な阻害を仲介しているが、溶液中及び固層においては、Fasを発現している標的の溶解を仲介していない。また、それらはCH-11によって仲介される標的の溶解も阻害しない。したがって、CH-11によって認識されるものと類似のエピトープへ結合することは、ある抗体がアポトーシスを直接仲介するか、あるいはCH-11が介するアポトーシスを阻害するかを予想する助けにはならない。モノクローナル抗体huFas M3は固定化された場合、強い溶解性を持つが、可溶性の状態では細胞を溶解せず、またCH-11モノクローナル抗体によって誘導される細胞溶解を阻害した。これは、huFas M3がプラスチックに結合している場合は CH-11作動薬（agonist）として機能するが、可溶化した状態で加えられると拮抗薬（antagonist）として働くことを示している。溶液中で拮抗的な性質を示す抗体は、正常な免疫応答におけるFasの機能を決定する上で極めて有用である。実施例６で述べるフローサイトメトリーと２色染色法は、Fasモノクローナル抗体の、Ｔリンパ球への結合能を評価するために用いられた。好中球、単球、SA C活性化Ｂ細胞及びPHA誘導Ｔ芽細胞への特異的な結合が検出されたが、実施例２で述べるオーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイにおいて、可溶性もしくは固定化されたhuFasモノクローナル抗体と培養した場合、これらの細胞タイプのいずれも細胞溶解を起こさなかった。これらの結果は、PHA芽細胞がFasを高発現しているが、huFasモノクローナル抗体に実際にさらされても細胞に何等の悪影響を及ぼさないことを示した、最近発表されたデータを支持するものである。T.ミヤワキら、J．Immunol.，149; 3753-58(1992)。もうひとつのNGFR/TNFR族のメンバーであるCD27に対するモノクローナル抗体が、Ｔ細胞の増殖を共同刺激することが示されているとして（R.A.W.ヴァン・リアーら、J．Immunol.，139: 1589-96(1987)）、固定化されたIgG1イソタイプhuF asモノクローナル抗体が、固層のCD3モノクローナル抗体とともにＴ細胞を共同刺激するか調べるために、Ｔ細胞共同刺激アッセイが用いられた。これを行なうために、実施例６で述べるＴ細胞共同刺激アッセイが用いられた。huFasモノクローナル抗体の完全なパネルを用いて得られた結果が、表１に要約されている。全てではないが、いくつかのIgG1イソタイプhuFasモノクローナル抗体が、IL-2 と同等もしくはそれ以上に強いＴ細胞共同刺激能を示すことが見つかった。例えば、huFas M38は100ng/mlの低濃度でＴ細胞の増殖を共同刺激した（第１図）。C H-11を含むhuFasモノクローナル抗体は、固定化された場合のみＴ細胞を共同刺激するが、溶液として培養に加えられると共同刺激しなかった。IgG1イソタイプ Fasモノクローナル抗体の大部分について、Fasを発現する細胞系列の溶解誘導能は、Ｔ細胞の共同刺激活性と相関があった。しかし、huFas M35とM38はＴ細胞増殖の強力な共同剌激薬であるが、細胞溶解アッセイではほとんど、あるいは全く活性を持たなかった。それと対照的に、CH-11モノクローナル抗体は、溶液に添加された際にはジャーカットおよびMP-1標的細胞を溶解するが、培養ウェルに固定化されると、CD3モノクローナル抗体とともにＴ細胞を共同刺激するのみであった。胸腺細胞がFasを発現するとして、末梢血Ｔ細胞について上で簡単に説明した方法を用いて、胸腺細胞の共同刺激能を調べた。E.ルヴィエら、J．Exp．Me d，177: 195-200(1993)の結果が、Fasが４時間の⁵¹Cr遊離アッセイにおいて正常のネズミ胸腺細胞の溶解を仲介することができると示唆しているが、本明細書では、CD3モノクローナル抗体存在下で、固定化したhuFas M38モノクローナル抗体によって、ヒト胸腺細胞が増殖に関して共同剌激を受けた（第１図Ｂ）。従って、胸腺細胞のサブセットがFasによって仲介されるシグナルに対して、異なった応答をする可能性がある。 Fasモノクローナル抗体のヒトＴ細胞に対する効果を更に詳細に分析するために、huFasモノクローナル抗体による末梢血Ｔ細胞の共同刺激がＴ細胞活性化分子の発現を促進することを伴うのかを調べるために、本明細書に記載されたフローサイトメトリーとＴ細胞共同刺激アッセイが用いられた。初期活性化抗原CD69 およびIL-2受容体CD25の低親和性鎖であるp55などの２種類の分子が、CD3モノクローナル抗体のみを用いた場合に比べ、huFas M38とCD3モノクローナル抗体で刺激した末梢血Ｔ細胞について、強い促進効果を示した（第２図Ａから第２図Ｄ）。実施例７に記載されている培養したＴ細胞の２色染色法とフローサイトメトリー法は、huFas M38がCD25の発現を促進し、CD69がCD4⁺とCD8⁺Ｔ細胞で検出されることを示した。CD3モノクローナル抗体存在下で固定化したhuFas M38によるFas の連結もまた、接着性分子であるCD11a(LFA-1)、CD18及びCD54(ICAM-1)の発現の適度な増加を誘導した。実施例７に記載されたサイトカイニン・アッセイ法が行なわれた。CD3モノクローナル抗体と組み合せると、huFasモノクローナル抗体のいくつかはＴ細胞を共同刺激することができ（表１）、それはIL-2非依存的である。上述及び実施例６と実施例７に記載されたＴ細胞共同刺激ならびにサイトカイニン・アッセイは、Fasが特定の形質転換した細胞系列でアポトーシスを誘導するばかりでなく、新鮮な単離Ｔ細胞の共同刺激にも関与していることを示している。大部分のIgG1 イソタイプのFasモノクローナル抗体について、Fasを発現する細胞系列の溶解誘導能は、Ｔ細胞に対する共同刺激活性と相関を示した。しかし、huFas M35とM38 は強力なＴ細胞共同刺激因子であるが、細胞溶解アッセイにおいては殆ど、あるいは全くの活性を持たなかった。データは、CH-11モノクローナル抗体は溶液に添加された際にはジャーカット及びMP-1標的細胞を溶解できるが、培養ウェルに固定化された場合には、CD3モノクローナル抗体とともにＴ細胞を共同刺激するだけであることを示した。総合すると、これらのデータはFasによって仲介される活性化及びアポトーシス経路を調節するシグナルが極めて異なるか、あるいはシグナルへの異なる感受性を含むかもしれないことを示唆している。実施例７で報告されているM38の結果は、Ｔ細胞の増殖を共同剌激できる他の抗体にも、同様に適用できると信じられている。したがって、モノクローナル抗体M1、M2、M3、M23、M24、M35及びM38は、IL-2と独立に、固定化したCD3モノクローナル抗体共存下でＴ細胞の増殖を共同刺激すると信じられている。Ｔ細胞の活性化においてＴ細胞がFasモノクローナル抗体の直接の標的であるか、あるいは付随細胞との相互作用が必要であるかを知るために、実施例８に記載される限界希釈分析が用いられた。加えた細胞数と、陰性を示したウエルの割合の対数が直線関係にあることから（第４図）、Ｔ細胞前駆体がＴ細胞培養における制限的要素であることが示唆される。huFas M38モノクローナル抗体は、固定化されたCD3モノクローナル抗体によって増殖刺激されるＴ細胞の頻度を、有意に向上させた（表３）。このデータは、Fas M38モノクローナル抗体が付随細胞あるいは他の細胞タイプの関与を必要としないＴ細胞に、直接的な共同刺激効果を持つことを示している。これに加え、このデータは高濃度培養において観察される、huFas M38モノクローナル抗体の効果が、応答するＴ細胞の頻度と、Ｔ細胞クローンのサイズを増加する事を示している。実施例９に記載される高感度な３段階フローサイトメトリー法を用い、本明細書の実施例１にしたがって調製されたFas/Fc融合タンパク質が、PMAとイノマイシンによる刺激に続いて、抗腫瘍CTL系列（B10抗B10.5）の表面に特異的に結合することが見いだされた。この結合アッセイを用いて検出された決定因子がFas- Lであるという支援的な証拠は、活性化された細胞がFas細胞表面受容体を発現する標的細胞の溶解を仲介し、この溶解が中和性huFasモノクローナル抗体によって完全に阻害されるという事実によって提供される（表１及び実施例１０）。例えば、huFas特異的M3モノクローナル抗体は、前駆型CH-11モノクローナル抗体による標的細胞のFasを介した溶解を止めるのみならず、PMAとイノマイシンによって刺激されたB10抗B10.5細胞によるジャーカット標的細胞の溶解も完全に阻害した。また、アポトーシス過程に伴う、特徴的なＤＮＡ梯子状パターンは活性化されたB10抗B10.5細胞によって誘導され、これもまたバイオアッセイにhuFas M3モノクローナル抗体を添加することによって完全に阻害された。huFas M3モノクローナル抗体はFasを発現する標的細胞に結合するが、Fas-Lを発現する作用細胞には結合しないため、このモノクローナル抗体が非Fas受容体経路を介して機能するB10抗B10.5細胞の細胞毒活性の発現を非特異的に阻害している可能性は除外できる。標的細胞によって発現される他の抗原に対するモノクローナル抗体は、活性化されたCTLによって仲介されるジャーカット標的細胞のアポトーシスには何等の効果も示さなかった。さらに（huFas M31などの）CH-11抗体による標的細胞の溶解を阻害しない抗hu Fasモノクローナル抗体もまた、活性化されたB10抗B10.5細胞による溶解を阻害しなかったことは、これらのモノクローナル抗体の阻害効果がエピトープ特異性を有することを示すものである。最後に、他の細胞表面受容体の融合タンパク質はそうではないが、huFas/Fc融合タンパク質もまた、おそらく、もしそうでなければ細胞表面のFasと相互作用し標的細胞のアポトーシスを仲介するところの、F as-Lの活性化部位への競合的な結合により、活性化されたB10抗B10.5細胞によるジャーカット標的細胞の溶解を阻害した。ジャーカット標的細胞およびMP-1標的細胞は100ng/mlという高濃度でもTNFによる細胞殺傷作用に対して完全に抵抗性であることが見いだされているため、これらの標的細胞の溶解が細胞表面あるいは可溶性のTNFいずれかによって起こされた可能性は支持されない。Fas-Lは、抗原特異的なＴ細胞系列の刺激に続いて誘導及び合成されるが、細胞表面にほんの一時的に発現されるだけのようである。活性化誘導されたアポトーシスとFasをクロスリンクすることによって誘導されたアポトーシスに因果関係があるかを調べるために、フォルボールエステル（ PMA）とカルシウムイオノフォア（イノマイシン）とともに、長期培養されたヒトCD4⁺Ｔ細胞クローン（TCC）を刺激することにより誘導されたアポトーシスを阻害する目的で、Fasの拮抗薬が用いられた。細胞の生存率は実施例１１に記載されているトリパン・ブルー色素排除法で調べられた。培地のみ、あるいはFas M8モノクローナル抗体を含む培地で培養されたTCCに比べると、PMAとイノマイシンを含む培地で培養されたTCCでは、細胞の生存率に顕著な低下が観察された。この効果は、PMAとイノマイシンを含む培地で培養されたTCCに、Fas M3モノクローナル抗体を添加することにより完全に阻害された（第７図Ａ）。後の実験において、アポトーシスはTCR/CD3複合体によって、またはTCCをPHA あるいはPMAとイノマイシンとともに培養することによって誘導された。実施例１１記載のMTT比色アッセイ法は培地のみ、Fas M3抗体を含む培地、及びIgG1免疫グロブリンを含む培地で培養したTCCにおけるMTT転換の違いを検出するために用いられた。可溶性のFas M3モノクローナル抗体は試験された３つの刺激のいずれかによって誘導されたTCCのアポトーシスを実質的に阻害するが、対照であるI gG1免疫グロブリンの添加は何の影響も与えなかった（第７図Ｂ）。最後に、TCCの自殺の阻害がFasとそのリガンドの相互作用による干渉作用によるのか、あるいはFas M3モノクローナル抗体がＴ細胞に直接シグナルを与えるのかを調べるために、huFas/Fc融合タンパク質が用いられた。huFas/Fc融合タンパク質は、Fas M3モノクローナル抗体と同様に、活性化誘導アポトーシスを阻害したが、対照として用いたIgG1免疫グロブリンは何の影響も与えなかった（第７図Ｃ）。したがって、このデータは活性化誘導されたTCCにおけるアポトーシスが、少なくとも部分的にはFasとそのリガンドとの相互作用にって仲介されるという解釈と一致する。本発明は、上で記載された及び表１に挙げられたモノクローナル抗体ならびに、これらの抗体を提供する。実施例１０に記載されるように、モノクローナル抗体M3とM38のF(ab)'₂断片は、Fas抗原を有する細胞のFas-Lを介した溶解阻害アッセイにおいて、それと対応する抗体全体と同じ性質を示した。抗体断片は、抗体全体の酵素処理を含む方法、あるいは組み換えＤＮＡ技術を含む既知の方法によって生産することができる。本発明のIgG1イソタイプFasモノクローナル抗体、結合タンパク質及び精製されたhuFas/Fc融合タンパク質は、多数の利用法を持つ。例えば、IgG1イソタイプ Fasモノクローナル抗体は、細胞培養中及びFas抗原を精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて、Fasの存在を検出するために用いることができる。抗体はまた、Fas抗原をもつ細胞をソーティングするために、あるいはFas 抗原をもつ細胞を組織化学的に染色するために、フローサイトメトリーで利用することも出来る。簡単に述べると、細胞上のFas抗原を検出するためにその細胞を、Fasに特異的に結合する標識されたモノクローナル抗体とともにインキュベーションし、続いて結合した抗体の存在が検出する。また、これらのステップは、結合しなかった抗体を除くための洗浄などの、追加ステップを用いて完了してもよい。本発明において用いるのに適したラベルは、他のものを含む、フルオレッセイン・イソチオシアネート(FITC)、フィコエリスリン(PE)、ホース・ラディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP)、放射性ヌクレオチドならびにコロイド状の金を含む、当該分野においてよく知られたものである。また、ビオチンとそれに続くFITC、あるいはより好ましくはPEまたはHRPを結合したストレプトアビジンによる第２段階処理も用いてもよい。フローサイトメトリーで用いるのに特に好ましいのは、ケルトカンプ(Keltkamp)、Immunology，18: 865-873(1970)の方法による、精製抗体に結合することができるFITCである。また、ケルトカンプ、Immu nology，18: 875-881(1970)とゴーディング(Goding)、Immunol．Methods，13215 -226(1970)を参照のこと。組織化学的染色にはHRPが好ましく、ナカネ(Nakane) とカワオイ(Kawaoi)、J．Histochem．Cytochem.，22: 1084-1091(1974)、の方法により精製抗体に結合することが出来る。ティジュセン(Tijssen)とカースターク(Kursta k)、Anal．Biochem.，136: 451-457(1984)も参照のこと。さらにこの抗体には、それに結合した細胞毒性物質をFas⁺細胞に輸送するための担体としての利用法もある。表１に挙げたモノクローナル抗体並びに該抗体に連結された診断または治療薬からなる凝集物が、本明細書で提供される。 IgG1イソタイプFasモノクローナル抗体と結合タンパク質は、Fasの生物学的活性の阻害効果を調べまた免疫系の異常の病因を調べるための研究手法として用いることもできる。こうした異常は、以下に限定するものではないが、全身性エリテマトーデス(SLE)、リューマチ、関節症状によって特徴つけられる他の病気（例えばライム病）、特発性CD4⁺Ｔ細胞リンパ球減少症およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)の感染を含む。上述のように、lpr変異をホモに持つマウスはFas抗原遺伝子に欠損を持ち、アポトーシスシグナルを伝達できる正常な機能的Fasタンパク質を発現しない（ワタナベ-フクナガら、Nature 356: 314-17，1992）。これらのマウスはリンパ節および脾臓におけるCD4^- CD8^-Ｔ細胞の蓄積、免疫グロブリン過多症、自己抗体生産、リューマチ因子、関節炎および糸球体腎炎によって特徴つけられる異常を進行させる。前出引用文献参照のこと。本発明の抗体は、 lpr変異に関係した異常の研究における使用法もある。精製されたIgG1イソタイプFasモノクローナル抗体と結合タンパク質は、また、in vivoでのFas-LのFas抗原への結合を阻害するかあるいは、in vivoでFas抗原を持つ細胞の不活性化または共同刺激化に治療目的で使用することもできる。好ましい態様において、抗体は、例えば上で述べたように特異的なネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位をヒトモノクローナル抗体に転移させることによって、免疫学的な検出を逃れるように修飾される。特に好ましいのは、ヒトFas抗原に対する抗体もしくは結合タンパク質、および生理学的に受容可能な担体または希釈剤を含む薬剤組成物の利用である。他のもののうち、適した担体または希釈剤は、中性の緩衝生理食塩水または非特異的なアルブミンを含む生理食塩水である。ざらに、治療用組成物には緩衝液剤、例えばブドウ糖、ショ糖若しくはデキストロースを含む炭水化物、EDTAなどのキレート剤またはさまざまな保存剤などの、賦形剤または安定化剤も更に含んでもよい。投薬の量と回数は処置に対する反応の性質と程度、求められる反応の度合および患者の状態などの因子に依存するが、適切な投与量は、臨床実験によって決定されるであろう。また抗体は、患者に投与された可溶性のFas抗原が循環しているかをモニタするため、あるいは患者のin vivoのFasレベルを測定するために用いてもよい。好ましい態様において、２因子法あるいはサンドイッチアッセイがFas抗原を検出するために用いられる。簡単には、可溶性のFas抗原を含むと思われる血清を、上述のようにモノクローナル抗体をもつ固層とともにインキュベーションし、結合が起きるために充分な条件と時間だけ保持する。他のものの中で、ELISAプレート（Linbro，McLean，Va.）、ニトロセルロース（Millipore Corp．Bedford， Mass.）、ビーズ（Polysciences，Warrington，Penn.）及び磁気ビーズ（Robbin Scientific，Mountain View，Calif.）を含む、多くの固層が当該分野では知られている。それに加え、このモノクローナル抗体は、当業者によく知られる技術によって、容易に固層に固定されるだろう（Antibodies: A Laboratory Manual ，ハーロウとレーン編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)を参照のこと）。次に、この固層を結合が充分に起きるような条件と時間だけ、ヒトFas 抗原に特異的な標識された２次モノクローナル抗体とともにインキュベーションし、その後、結合した標識された抗体の存在が検出することができる。特に好ましい態様において、モノクローナル抗体は９６ウェルプレートのような固定支持体にコートされる。続いて、このプレートは牛血清アルブミンまたは脱脂粉乳などのタンパク質で約３０分間ブロックされる。患者から採取した血液はリン酸緩衝生理食塩水で希釈され、結合が起きるのに充分な条件と時間--一般に約３０分間ウエル内でインキュベーションされる。それに続いて、そのプレートは洗浄し、異なるFas抗原エピトープに特異的な標識された２次モノクローナル抗体をウエルに添加し、上述のようにインキュベーションする。異なるFas抗原エピトープに体する抗体は、交叉阻害アッセイの利用によって決定できる。次に、そのウェルを２次標識抗体の存在について調べる。２次標識抗体の存在は、患者の血清中にFas抗原が存在することを示す。通常の知識を有する当業者に理解されるように、上述のアッセイで用いられるモノクローナル抗体は、ヒトFas 抗原に特異的なポリクローナル抗体あるいは結合タンパク質を代りにしてもよい。本発明の特定のモノクローナル抗体は、Fas-Lを介したFas抗原を有する細胞のアポトーシスを阻害することが求められる場合に有用である。mAbは内因性Fas-L が細胞のFas抗原に結合するのをブロックできる。Fas-Lを介する細胞殺傷に拮抗的な性質を示すmAbsのうち、M3とM38 mAbsは最も強力のようであり、したがって、この場合の使用に好ましい。表１に示されるように、M3とM38は、最も高いレベルのFas⁺細胞のFas-Lを介した溶解阻害を示した。活性化されたヒトＴ細胞は、CD3/Ｔ細胞受容体複合体を通して引き起こされた場合、つまり活性化誘導細胞死（AICD）と呼ばれる過程ではプログラムされた細胞死（アポトーシス）を行なうために誘導される。AICDは、HIVに感染者から単離した新鮮なＴ細胞で観察されているが、非感染者からは観察されていない（グロー(Groux)ら、J．Exp．Med.，175; 331，1992；メイヤード(Meyaard)ら、Scie nce，257; 217，1992）。したがって、アポトーシスはHIV感染者におけるCD4⁺Ｔ細胞の消失とAIDSの進行にある役割を担っているかも知れない。 Fas-LがHIV感染におけるＴ細胞の消失に役割を果たすには、２つの基準が満たされねばならない。第一に、Fas-Lが発現されなければならない、従って、Ｔ細胞が抗原にさらされることによって活性化されなければならない。第二に、Ｔ細胞はFasを介したアポトーシスに感受性となるために”発火(primed)”されねばならない。HIV⁺患者においては、そうしたＴ細胞の刺激は、GP-120/抗GP-120複合体によるCD4のクロスリンクに由来するかも知れない。このような複合体はin vitroでAICDを起こすために、正常なCD4⁺Ｔ細胞を刺激し、また、Ｔ細胞にヒトC D4トランス遺伝子を発現するマウスにおけるアポトーシスを起こさせることが示されている（ワン(Wang)ら、Eur．J．Immunol.，24: 1533，1994）。加えて、CD 4⁺Ｔ細胞はCD4に対する抗体で処理されたマウスにおいてアポトーシス様細胞死を起こすが、この現象はFasを欠損したLPRマウスでは起きない（ワンら、Eur．J ．Immunol.，24: 1549，1994）。活性化された正常なヒトＴ細胞（PL-1細胞など）で見られるAICDとHIV+個体から単離された新鮮なＴ細胞におけるAICDは、その性質において同一である。したがって、可溶性の（つまり固定化されていない） Fa s M3あるいは可溶性のFas M38などのFas拮抗剤を用いた、HIV感染者に対する治療的干渉が可能かも知れない。（可溶性のFas M3および可溶性のFas M38などの）拮抗的Fas抗体のもうひとつの利用法は、養子的免疫療法のためのＴ細胞のex vivo拡大培養におけるものである。腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）と細胞溶解性Ｔ細胞（CTL）の拡大培養における制限的な段階のひとつは、これらの細胞がin vitroではほんの僅かな時間しか増殖できず、これはおそらくAICDのためであろう。したがって、拮抗的Fas抗体は、これらのＴ細胞をin vitroでより長い期間培養し、養子縁組的移植のためのより多くの細胞を得るために用いられる。Ｔ細胞は、ex vivo拡大培養の段階でFasモノクローナル抗体と接触させられる。このＴ細胞は抗体単独と、あるいはサイトカイニンまたはＴ細胞の増殖あるいは他の生物学的効果を促進する因子とともに抗体と接触できる。本発明の一つの態様において、Ｔ細胞は、ex vivo拡大培養段階の間、Fas抗体及びIL-2の存在下で培養される。養子縁組的な免疫療法は記載されている。例えば、ローゼンバーガー，S．A.、”Adoptive Immunotherapy for Cancer”、Scientific American ，pp．62-69，May，1990；及び、本明細書で引用文献として取り入れれている米国特許第5,229,115号を参照のこと。治療的な利用には、本発明の精製されたhuFas/Fc融合タンパク質、あるいはIg G1イソタイプFasモノクローナル抗体が、患者、好ましくはヒトに、指示に合った方法で処置するために投与される。従って、例えば薬学的な組成物は、静脈、巨丸剤の注入、連続的な点滴、移植片からの持続的な放出あるいは他に適した技術によって投薬することが出来る。本発明のFas特異的mAbsを用いた治療処置が有効かもしれない病気は、以下に限定しないが、SLE、リューマチ性関節炎、ライム病、突発性CD4⁺Ｔリンパ球減少症およびヒト免疫不全症ウイルス（HIV）感染の影響などを含む。本発明の一つの態様は、治療的に有効量のモノクローナル抗体M3あるいはM38と希釈剤または担体を含む組成物を、そうした病気に悩む患者に対して投与することからなる、そのような病気の治療法に向けられている。こうした組成物は、Fas-Lが介するアポトーシスの抑制が求められる他の異常における利用法もある。 Fas/Fc融合タンパク質と適当な希釈剤あるいは担体からなる組成物もまた、本明細書で提供される。そのような組成物は、Fas-Lを介したFas抗原を発現する細胞の溶解阻害に用いられる。薬学的組成物において用いられるFas/Fc融合タンパク質は精製されるべきであり、その中でFas/Fc融合タンパク質は天然あるいは内在性由来の他のタンパク質を実質的には含まず、また、製造過程でのタンパク質残留物の重量の約１％以下である。しかし、こうした組成物は安定化剤、担体、賦形剤あるいは共治療薬として添加された他のタンパク質を含むことが出来る。 Fas/Fc融合タンパク質は、好ましくは実質的に均一となるまで、すなわち、銀染色によるポリアクリルアミドゲルの単一のタンパク質バンドとして検出されるまで精製される。以下の実施例は、特定の態様を説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１可溶性huFas/Fc融合タンパク質の調製可溶性huFas/Fc融合タンパク質は、huFasタンパク質の細胞外ドメインをヒトI gG1のFc領域に連結することによって、pDC406哺乳類発現ベクターに構築された。プラスミドpDC406（C．J．マクマハン(McMahan)ら、EMBO J.，10(10): 2821-3 2(1991)）は、哺乳動物細胞と大腸菌内で複製する発現ベクターである。前出のイトウらによって発表されたhuFas配列に基づいて、huFasの細胞外領域をコードするcDNA断片がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて増幅された。PCR反応で増幅された求めるDNA断片は、huFasのシグナル配列全体と細胞外ドメインをコードする配列の上流にあるAsp718部位とBglII部位を含む。PCRで鋳型として用いられたcDNAは、II-23（C.F.ウェア(Ware)ら、Lymphokine Res.，5: 3 13-24(1986)）と呼ばれるヒトＴ細胞ハイブリドーマから単離されたRNAで合成されたcDNAであった。 PCR反応で用いられた５’プライマー（SEQ ID NO1）は、次の配列の一本鎖オリゴヌクレオチドであった：この５’プライマーは、イトウらに示された翻訳開始コドンATG（二重下線）の８ヌクレオチド上流から始まる、huFasヌクレオチド配列の２３ヌクレオチドからなる配列の上流にある制限酵素Asp718（下線）に対する認識部位を含む。 PCR反応で用いられた３’プライマー（SEQ ID NO2）は、次の配列の一本鎖オリゴヌクレオチドであった：この３’プライマーは、huFasの細胞外ドメインの最後の７アミノ酸と、huFasの細胞膜貫通ドメインの最初のアミノ酸をコードする、イトウらに示された配列に相補的な２４ヌクレオチトの配列である。この３’プライマーは、Fcをコードする遺伝子をコードするDNA配列を連結するために用いる制限酵素BglIIのための認識部位（下線）を含む。当業者は、サルキ（Sarki）ら、Science 239: 487-491(1988)；ウー（Wu）ら編、Recombinant DNA Methodology，pp．189-196，Academic Press Inc.，San D iego(1989)；およびイニス（Innis）ら編、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc．(1990)に記載されたものを含む、多くのPCR反応法が、適当な方法であることを認識するであろうが；しかし、次のP CR法が、単なる例として提供される。10ulの10X PCR緩衝液（500mM KCl，100mM Tris-HCl，25℃でpH8.3，25mM MgCl₂と1mg/mlゼラチン）（Perkins-Elmer Cetus ，Norwalk，CN）、8ulのそれぞれのdNTP（2mM dATP，2mM dCTP，2mM dGTP，2mM dTTP）を含む2.5mM溶液、2.5ユニット（標準的な5000ユニット／ml溶液を0.5ul ）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkins-Elmer Cetus）、1ngの鋳型DNA、100pmolのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー、および水を加えて100ulにし、これを0.5mlのエッペンドルフ微量遠心管にPCR試薬として添加した。次に、この最終的な混合物に100ulのパラフィンオイルを重層する。PCRはDNAサーマルサイクラー（Ericomp，San Diego，CA）を用いて行なう。好ましい方法において、鋳型は９４℃で４分間変性され、続いて９４℃で１分間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長反応）の条件で５サイクル行なわれ；続いて９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間、３０サイクル行なわれ；最後のサイクルに続いて７２℃で５分間最終伸長反応が行なわれた。PCR産物は、Asp718とBglIIで切断され、必要な断片がゲル電気泳動で精製された。ヒトIgG1抗体Fc断片をコードするDNA配列は、可溶性のFas/Fc融合タンパク質を作るために、以下のようにして調製され、huFasをコードするDNA断片に融合された。ヒトIgG1抗体のFc領域由来の一本鎖ポリペプチドをコードするDNAは、pBL UESCRIPT SK（登録商標）ベクター（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，C alifornia）のSpeI部位にクローニングされた。このプラスミドベクターは、大腸菌で複製可能で、２１の単一の制限酵素部位からなるポリリンカー断片を含む。クローン化されたFc cDNAコード配列のDNA配列は、配列番号３に示されている。単一のBglII部位は、挿入されたFcをコードする配列の５'端、即ち配列番号３のヌクレオチド１から６まで（AGATCT）に導入された。 DNAによってコードされるFcポリペプチドは、Ｎ端ヒンジ領域から本来のＣ端、つまり全長の抗体Fc領域にわたっている。Fc配列を含む組換え型ベクターは、 BglII（これは配列番号３の核酸１から６の、単一のBglII部位のみで切断する）と、NotI（これはFc cDNA挿入断片の下流のマルチクローニングサイトでベクターを切断する）で切断される。Fcをコードする断片（約７００塩基対）は、LMT アガロースゲル電気泳動を用いる従来の方法で単離された。上述のようにして調製された、Asp718/BglII huFasをコードするDNA断片とBgl II/NotI FcをコードするDNA断片は、最初にpDC302発現ベクターに連結された。ベクターとFc及びhuFas DNA断片を連結する３断片ライゲーションが、従来の方法で行なわれ、大腸菌細胞がこのライゲーション混合液で形質転換された。求める方向（つまりhuFas配列は、配列番号４に示されたように、下流のFc配列と同じ読み枠となるように融合された）の挿入断片を含む、組換え型プラスミドが単離された。配列番号４は、huFasの翻訳開始コドンATGのすぐ上流の８ヌクレオチド、並びにhuFasの細胞外ドメインをコードする全てのヌクレオチド（最後の３ヌクレオチドを除く）を含む。配列番号４はまた、配列番号３の全てのヌクレオチド（最初の６ヌクレオチドを除く）を含む。その後、Asp718/NotI DNA挿入断片がpDC302/huFas/Fc構築物から単離され、その末端はクレノーで平滑化され、そのDNA挿入断片はCV-1/EBNA細胞への大規模なトランスフェクションが可能なように、pDC406にクローニングされた。Fas/Fc融合分子は、一般にあまりに巨大でかつ複雑であり、原核細胞の発現系では合成できないため、組換え型哺乳類細胞培養において合成されることが好ましい。受容体／Fc融合タンパク質の発現に適した哺乳動物細胞の例は、CV-1細胞（ATCC CCL 70）とCOS-7細胞（ATCC CRL 1651）を含む。CV-1とCOS-7細胞はどちらも、サルの腎臓由来である。 DNA構築物pDC406/huFas/Fcは、サル腎臓細胞系列CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478) に形質転換された。CV-1/EBNA細胞系列は、C.J．マクマハンら、EMBO J.，10(1 0): 2821-32(1991)によって記載されたように、エプスタイン-バール(Epstein-B arr)ウイルス核抗原-1(EBNA-1)をコードする遺伝子で形質転換されたCV-1細胞系列（ATCCC CL 70）に由来し、ヒトCMV中期-初期エンハンサー／プロモーターによってEBNA-1を恒常的に発現する。EBNA-1遺伝子は、EBV複製開始点を含むpDC40 6のような発現ベクターの、染色体外での複製を可能にする。CV-1/EBNAのような哺乳類宿主細胞では、huFas/Fc融合タンパク質は、HIVトランス活性化領域（TAR ）プロモーターから発現される。 pDC406/huFas/Fcベクターで形質転換されたCV-1/EBNA細胞は、融合タンパク質の一時的な発現を可能にするために、回転瓶内で培養され、その融合タンパク質はFasシグナルペプチドを介して培地に分泌される。huFas/Fc融合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーで精製された：huFas/Fc融合タンパク質を含む１リットルの培養液上清は、上清を（例えば、0.45umフィルターで）漉過し、この漉過物を製造元の指示に従ってプロテインＧアフィニティーカラム（Schlei cher and Schuell，Keene，NH）にかけることによって精製された。融合タンパク質のFc領域はカラム中のプロテインＧによって結合された。結合した融合タンパク質をカラムから溶出し、その精製を銀染色したSDSゲルで確認した。実施例２ huFasモノクローナル抗体の作製 BALB/cJマウス（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）は、フロイントアジュバント中のhuFas/Fcで免疫された。マウスは６回免疫され、その脾臓細胞は、PBS中に50% PEG/ 10% DMSO存在下で、ネズミ・ミエローマ8.653に融合され、続いてDMEM/HATとDMEM/HT選択培地で培養された。陽性のウエルから得た上清を、ELISA法においてビオチン化したhuFas/Fcへの結合能を調べ、かつウエスタンブロットとドットブロットにおいてhuFas/Fcに対する反応性を調べた。huFas/ Fcに結合性を有すが、ヒトIgG1には結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、限界希釈を３回行なうことによってクローン化された。全てのモノクローナル抗体（表１）は1gG1イソタイプであることが調べられ、またプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製された。このモノクローナル抗体は、Ｔリンパ腫ジャーカット細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville，MD（本明細書では以降「ATCC」））とEBV Ｂ細胞系列であるMP-1によって発現された細胞表面のFasとの反応性もまた、フローサイトメトリーで調べられた。MP-1は、当研究室で作製され、偶発的にEBVで形質転換されたＢ細胞系列である。細胞系列は、10% FCS、5x10^-5M 2- ME、1mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、50 U/mlのペニシリンおよび50ug/mlのストレプトマイシンを補ったRPMI培養液中を、恒常的に通過させることにより維持された。非特異的なマウスIgの結合を防ぐために、Fasの発現に関して分析される細胞をまず、2%の正常なウサギ血清と2%の正常ヤギ血清を含むPBSのブロッキング溶液中４℃でインキュベーションした。細胞をFACS緩衝液（PBS/ 1% FCS/ 0.02%アジ化ナトリウム）中で洗浄し、４℃、３０分間、適当なモノクローナル抗体（5 μg/ml）とともに全量50ulでインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、４ ℃で３０分間、50ulの1:40希釈したヤギ抗マウスIgG-PE（Tago，Burlingame，CA ）中でインキュベーションした。培養されたＴ細胞の２色染色法のために、CD4- PEまたはCD8-PEを、CD25-FITCまたはCD69-FITCモノクローナル抗体とともに用いた。PE-もしくはFITC-と結合したイソタイプの一致する対照抗体とともにインキュベーションした細胞の分析のために、四分円（quadrant）がセットされた。FA CScan（Becton-Dickinson）を用いてフローサイトメトリーが行なわれ、10⁴個の生細胞に関してデータが集められた。実施例３ CH-11結合の阻害表１に挙げたFasモノクローナル抗体が、CH-11 Fasモノクローナル抗体のジャーカット細胞あるいはMP-1細胞への結合を阻害する能力は、フローサイトメトリーでアッセイされた。ジャーカット細胞またはMP-1細胞は、実施例２において上述のようにブロックされ、試験用の50ug/mlのIgG1 Fasモノクローナル抗体とともに３０分間、４℃でインキュベーションされた。次に、CH-11モノクローナル抗体（Medical and Biological Laboratories，Magoya，Japan）が5ug/mlの濃度で添加され、３０分間、４℃でインキュベーションされた。細胞は、FACS緩衝液で２回洗浄され、マウスIgG1と全く交叉反応性を持たない抗マウスIgM-FITC（Ta go）とともにインキュベーションされた。フローサイトメトリーは、FACScan（B ecton-Dickinson）を用いて行なわれ、データが集められた。 IgG1 Fasモノクローナル抗体は、CH-11結合を阻害する能力に関して、huFas M 31とM38モノクローナル抗体について、5%以下の阻害から、最高でhuFas M35モノクローナル抗体では62.4%阻害までの多様性を示した。実施例４ Fasを発現する細胞の溶解オーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイは、huFasモノクローナル抗体によって誘導される細胞溶解を測定するために用いられた。オーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイには、ジャーカットまたはMP-1細胞が、150uCiの⁵¹Crとともに１時間、３７℃でラベルされた。溶液中でモノクローナル抗体を調べるために、９６ウエルの丸底プレート（Corning Glass Works，Corning NY）中で、100ulの培地で連続的な希釈系列が作製された。抗体の固層への結合には、希釈はPBS中で行なわれ、培養プレート中で、室温で４時間インキュベーションし、続いてPBSで４回洗浄し、最後の洗浄の後、100ulの培地が添加された。次に１００μl培地中に10,000の⁵¹ Cr標識した標的が加えられた。３７℃で一夜培養した後、プレートを（150gで５分間）遠心し、上清をスカトロンSCSハーベスティングシステム（Skatron SCS h arvesting system）（Skatron，Sterling VA）を用いて採取した。上清の⁵¹Cr含有量は、マイクロメディックMEプラス・ガンマカウンター（Micromedic ME Plus gamma counter）（Micromedics，Huntsville，TN）で測定された。特異的な⁵¹C r遊離率が、次の式によって計算された： 100 X［(実験で得られたcpm)−(自然cpm)］／［(最大cpm)−(自然cpm)］［式中、自然cpmとは培地のみに遊離したcpmであり、最大cpmとは1N塩酸存在下で遊離するcpmである。］表１に要約された細胞溶解性のデータは、上述のオーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイを用いて得られた。IgG1イソタイプFasモノクローナル抗体のいくつか（M23 ，M31，M33及びM35）は、溶液中でも固定化されても細胞溶解能を持たない。溶液で培地に添加した際に、ジャーカット細胞及びMP-1細胞の検出可能な溶解を起こす唯一のモノクローナル抗体は、huFas M2であった。表１に示されるように、溶液中のM2はFasを発現する細胞の溶解を10%以上30%以下起こし、試験された他の抗体は10%以下起こした。しかし、溶液中のhuFas M2が100ng/mlの低濃度で標的細胞の溶解を誘導するが、1ug/mlで最大⁵¹Cr遊離量が17%であるのに対し、同様な実験で、CH-11（これもまた1ug/ml）で78%であった。その他のIgG1イソタイプFasモノクローナル抗体（M1，M3，M24とM38）は溶液中では細胞溶解性ではないが、固定化された場合少なくとも僅かに細胞溶解性である。これらのうち、M1とM3は培養プレートに固定化された場合強い細胞溶解性を示した。例えば、固層のhuFas M3の活性はその抗体が最適な濃度で用いられた場合に、可溶性のCH-11と同等、あるいはそれ以上であった。表１で示されるように、本発明のモノクローナル抗体は、固定化された場合、Fas発現細胞の10%以下の溶解を起こすもの30%以下の溶解を起こすもの、50%以下の溶解を起こすもの、あるいは50%以上の溶解を起こすものとして特徴付けられた。実施例５ CH-11を介した細胞溶解の阻害可溶性のIgG1 huFas特異的モノクローナル抗体が、CH-11モノクローナル抗体によって誘導されたジャーカット細胞またはMP-1細胞の溶解を阻害する能力がアッセイされた。用いられたブロッキングアッセイは、IgG1 huFas抗体の連続的希釈系列を作り、⁵¹Cr標識したジャーカット細胞またはMP-1細胞、並びにジャーカット細胞とMP-1細胞を溶解することが知られる一定濃度（例えば100ng/ml）のCH -1 1を添加し、一夜インキュベーションし、上の実施例４で記載したオーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイ法を用いて、溶解した細胞から遊離した⁵¹Crについてアッセイすることからなるものであった。その結果は、表１に示されている。表１に示されるように、本発明は、約10:1のモル比で抗FasCH-11モノクローナル抗体によって仲介される細胞溶解を10%以上阻害するモノクローナル抗体を提供する。本発明の特定のモノクローナル抗体は該細胞溶解を50%以上阻害し、またその他のものも該細胞溶解を90%以上阻害した。Fasを発現する細胞へのCH-11 の結合を部分的に阻害する能力と一致して、いくつかのモノクローナル抗体はCH -11を介した細胞溶解を阻害した（表１）。他方で、huFas M38モノクローナル抗体はCH-11の結合を阻害しなかったが、CH-11によって誘導される標的細胞の溶解は効果的に阻害した。M23，M31及びM33モノクローナル抗体は、細胞表面のFasに結合しないし、アポトーシスを誘導も阻害もしないことが分かった。モノクローナル抗体Fas M3は、固定化されると強い細胞溶解性を示したが、溶液に加えると細胞を溶解せず、CH-11モノクローナル抗体によって誘導された細胞溶解を阻害した。これは、huFas M3がプラスチックに結合している場合はCH-1 1作動薬として働くが、溶液状で加えられると、拮抗薬として働くことを示している。固定化されたhuFas M3によって誘導された細胞溶解は、可溶性のCH-11によって誘導されるのと類似のDNAラダー化が、MP-1及びジャーカット細胞で観察されるというアポトーシスに特徴的なものである。更に、CH-11モノクローナル抗体によって誘導されたDNAラダー化は、可溶性のhuFas M3を添加することによって完全に阻害された。他方で、huFas M38モノクローナル抗体はCH-11の結合は阻害しないが、CH-11によって誘導される標的細胞の溶解を効果的に阻害した。従って、huFas M38モノクローナル抗体は、CH-11抗体によって認識されないエピトープに結合することによって、標的細胞のCH-11によるアポトーシスを阻害するようである。実施例６Ｔリンパ球活性化の共同刺激作用我々のhuFas特異的なモノクローナル抗体が、新鮮に単離された正常なヒトの白血球もしくは体細胞分裂刺激物質とともに培養された白血球に結合するかを調べるために、フローサイトメトリーが用いられた。フローサイトメトリーのためにはFasの発現について調べる細胞をまず、非特異的なマウスIgの結合を避けるために、2%の正常なウサギ血清と2%の正常な山羊血清を含むPBSのブロッキング溶液中で、４℃でインキュベーションした。細胞をFACS緩衝液（PBS/ 1% FCS/ 0 .02%アジ化ナトリウム）で洗浄し、適当なモノクローナル抗体（5ug/ml）とともに、50ulの総容量中において４℃で３０分間インキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、1:40希釈のヤギ抗マウスIgG-PE（Tago，Burlingame，CA）50ul中で、４℃、３０分間インキュベーションした。好中球、単球、SAC活性化Ｂ細胞及びPHA活性化Ｔ芽細胞への、huFasモノクローナル抗体の特異的な結合が検出された。加えて、これらのどの細胞タイプも、上の実施例２に記載されたオーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイ法において、可溶性のまたは固定化されたhuFasモノクローナル抗体とともに培養しても、細胞溶解を起こすように誘導されなかった。Ｔ細胞共同刺激アッセイは、固定化されたIgG1イソタイプhuFasモノクローナル抗体が、固層のCD3モノクローナル抗体とともにＴ細胞を共同剌激するかを調べるために用いられた。Ｔ細胞は、2-アミノエチル・イソチオウロニム・ブロミド・ハイドロブロミド処理したSRBCでロゼット処理することにより、PBMCから濃縮された。単球は３７℃で１時間、プラスチックへの吸着を行なうことによって除かれ、それによって得られた細胞集団はフローサイトメトリーによると９５％以上がCD3⁺であった。末梢血Ｔ細胞を上述のモノクローナル抗体であらかじめコートした、９６ウエルの平底プレート中で、ウエル当り1x10⁵細胞で培養した。末梢血Ｔ細胞は、CD3モノクローナル抗体存在下あるいは非存在下で、固定化されたhuFasモノクローナル抗体とともに培養され、３日間５％二酸化炭素の、湿度を保った環境中で、３７℃でインキュベーションされ、luCiの³H-TdRを用いて最後の６時間パルスラベルされた。次に、ウエルから採取され、取り込まれた放射能がマトリックス９６ベータカウンター（Packard，Meriden，CT）で測定された。 huFasモノクローナル抗体の完全なパネルを用いて得られたデータが表１に要約されている。全てではないが、IgG1イソタイプhuFasモノクローナル抗体のうちのいくつかで、IL-2と同等、あるいはそれ以上の強いＴ細胞増殖の共同刺激作用が見られた。例えば、huFas M38モノクローナル抗体は100ng/mlの低濃度でＴ細胞を共同刺激した（第１図Ａ）。CH-11を含むhuFasモノクローナル抗体は、固定化された場合のみＴ細胞を共同刺激し、溶液で培地に添加されると共同刺激しなかった。IgG1イソタイプFasモノクローナル抗体の大部分について、Fasを発現する細胞系列の溶解を誘導する能力は、Ｔ細胞の共同刺激能に対応した。しかし、huFas M35及びM38は、Ｔ細胞の強力な共同刺激因子だが、細胞溶解アッセイにおいて殆どもしくは全く活性を持たなかった。それとは対照的に、溶液中に添加された場合、CH-11モノクローナル抗体はジャーカット及びMP-1標的を溶解するが、培養ウエルに固定化された場合は、CD3モノクローナル抗体とともにＴ細胞を共同刺激のみすることが出来る。矯正心臓手術を行なっている赤ん坊から得られ、フィコール密度遠心によって単離された胸腺細胞もまた、それらがIgG1 huFasモノクローナル抗体によって活性化されるか調べるために評価された。胸腺細胞は、上述のモノクローナル抗体であらかじめコートした、９６ウエルの平底プレート中で、ウエル当り1x10⁵細胞で培養された。胸腺細胞は、CD3モノクローナル抗体存在下あるいは非存在下で、固定化されたhuFasモノクローナル抗体とともに培養され、３日間５％二酸化炭素の湿度を保った環境中で３７℃でインキュベーションされ、luCiの³H-TdR を用いて最後の６時間パルスラベルされた。次に、ウエルから採取され、取り込まれた放射能がマトリックス９６ベータカウンター（Packard，Meriden，CT）で測定された。ヒト胸腺細胞は、固定化されたCD3モノクローナル抗体存在下で固定化されたhuFas M38モノクローナル抗体によって増殖共同刺激された（第１図Ｂ）。ヒトＴ細胞に対するFasモノクローナル抗体の効果を更に詳細に分析するために、上述のフローサイトメトリーとＴ細胞共同刺激アッセイが、huFasモノクローナル抗体による末梢血Ｔ細胞の共同刺激が、Ｔ細胞活性化因子の発現促進によってなされるのかを調べるために用いられた。２つのこうした分子、即ち初期活性化抗原CD69とIL-2受容体CD25のp55低親和性鎖は、huFas M38モノクローナル抗体と固定化されたCD3モノクローナル抗体によって刺激されたCD4⁺及びCD8⁺Ｔ細胞において、固定化されたCD3モノクローナル抗体のみの場合と比較して強い促進を示した（第２図Ａから第２図Ｄ）。培養されたＴ細胞の２色染色法のために、 CD4-PEもしくはCD8-PEが、CD25-FITCまたはCD69-FITCモノクローナル抗体とともに用いられた。PE-及びFITC-結合したイソタイプの一致する対照抗体とインキュベーションした細胞の分析によって、四分円（quadrant）がセットされた。FACS can（Becton-Dickinson）を用いてフローサイトメトリーが行なわれ、10⁴の生細胞についてデータが採取された。CD25とCD69の発現促進が、CD4⁺及びCD8⁺Ｔ細胞の両方で検出された。固定化されたCD3モノクローナル抗体共存下での固定化されたhuFas M38によるFasの結合はまた、接着性分子であるCD11a(LFA-1)、CD18及びCD54(ICAM-1)の発現の適当な上昇を誘導した。実施例７サイトカインアッセイ Fasモノクローナル抗体によるヒトＴ細胞の活性化が、可溶性のサイトカイン産生に依存するかを調べるために、２つの方法が用いられた。第一に、Fasモノクローナル抗体で共同刺激されたＴ細胞が、サイトカイン産生を上昇させるかという評価がなされた。第二に、Ｔ細胞は中和性IL-2抗血清の存在、あるいは非存在下でFasモノクローナル抗体によって共同刺激された。サイトカインアッセイには、IL-2産生の測定を行なうための培養は、Ｔ細胞によって生産されたIL-2の利用を避けるために、IL-2R p55モノクローナル抗体存在下で行なわれた。IL-2 レベルは、組換え型ヒトIL-2を標準試料として用い、CTLLバイオアッセイ法（S. ギリス(Gillis)ら、J．Immunol.，120: 2027-32(1978)）で測定された。IFN-γ とTNF-αレベルは、M.R.アルダーソン(Alderson)ら、J．Exp．Med．173: 923-30 (1991)によって記載されたように、ELISA法によって測定された。 huFas M38とCD3モノクローナル抗体で刺激されたＴ細胞は、CD3モノクローナル抗体のみで刺激した細胞に比べ、約１０倍多いIL-2、IFN-γ及びTNF-αを生産することが分かった（表２）。第２番目の実験では、細胞は中和性IL-2抗血清共存下、あるいは非共存下で、huFas M38モノクローナル抗体によって共同刺激された。この抗血清は、広い範囲のIL-2濃度に渡ってＴ細胞の増殖に対する外因性のIL-2の効果を完全に中和するが（第３図Ａ）、それはFasモノクローナル抗体の共同刺激には最小の効果しか持たなかった（第３図Ｂ）。実施例８限界希釈分析Ｔ細胞の活性化において、Ｔ細胞がFasモノクローナル抗体が作用する直接的な標的であるか、あるいは付随細胞との相互作用が必要であるかという疑問に答えるために、我々はテラサキ微量培養における限界希釈分析を用い、Fasモノクローナル抗体に応答性のＴ細胞の程度を分析した。限界希釈分析では、増殖しているヒトＴ細胞前駆体の頻度が、ネズミのＴ細胞について、E．マラスコフスキー(Maraskovsky)ら、Int．Immunol．3(3): 255-64(1991)；E．マラスコフスキーら、Int．Immunol．4(4): 475-85(1992)によって記載されたように、微量培養中でアッセイされた。この限界希釈分析を用いて、Ｔ細胞はhuFas M38モノクローナル抗体（10ug/ml）共存下あるいは非共存下で、OKT3(10ug/ml)でプレコートされた６０ウエルのテラサキ・トレイ中で一晩４℃で培養された。細胞は、総容量 15ulの中IL-2（10ng/ml）存在下で、１ウエル当り１から２０細胞の濃度で培養された。５日間培養後ウエルは倒立対照顕微鏡を用いて、増殖しているＴ細胞が存在するか否か視覚的に調べられた。もし少なくとも３つの芽細胞からなる一つあるいはそれ以上の細胞集団が観察されるか、あるいはもし加えた芽細胞の数よりもその時点での芽細胞の数が多ければ、そのウエルは陽性とスコアされた。増殖している前駆体細胞の割合の概算は、C.タスウェル(Taswell)、J．Immunol．1 26: 1614-19(1981)によって記載された最小χ²法を用いて、はじめに加えた細胞数と陰性のウエルの割合の間のポアソン分布相関関係から決定された。クローンの数の概算は、ウエル当りの細胞数を数え、続いてポアソン分布に基づいてクローンの重複について補正して行なわれた。はじめに加えた細胞数と陰性ウエルの割合の対数が、直線関係にあることから（第４図）、前駆体Ｔ細胞がこの培養中で制限因子であることが示唆される。応答が異なるＴ細胞供与体によって変るが、Fas M38は増殖しているＴ細胞クローンの割合を一貫して少なくとも３倍促進し、平均クローンサイズを約２倍増加させた（表３）。実施例９ B10抗-B10.5細胞系列の開発 Fasに対するリガンドを検出するために、高感度の３段階フローサイトメトリーアッセイが用いられた。このアッセイではFas-Lの発現について評価されるべき細胞を、まず総容量20ulとなるように、1%の正常なマウスの血清、50ug/mlの精製されたラット抗マウスFcR_γII(2.4G2)、0.01%のアジ化ナトリウムを含むFAC S緩衝液中、（９６ウエルのミクロタイタープレートのウエル当り5x10⁵細胞）４ ℃でインキュベーションすることによってブロックされた。次に、細胞を表示された融合タンパク質(huCD69/Fc，huIL4R/Fc，HSA/Fc，huFas/Fc又はhuTNFR/Fc) 、続いてビオチン化されたマウス抗huIgG₁（Fc特異的；Jackson Laboratories， West Grove，PA）、及びストレプトアビジン-フィコエリスリン（Tago，Burling ame，CA）とともに順次インキュベーションした。最終的な洗浄の後、細胞は10n g/mlのプロピジウム・アイオダイドを含む0.3mlのFACS緩衝液に再懸濁された。フローサイトメトリーは、FACScan（Becton-Dickinson）を用いて行なわれ、1x1 0⁴個の生細胞に関してデータが集められ、LYSYS IIソフトウェアを用いて分析された。このアッセイを用いて、PMAとイノマイシンで２時間Ｔ細胞を刺激した後、huF as/Fcの長期CD8⁺ネズミ抗腫瘍Ｔ細胞系列（B10抗-B10.5）への、低レベルの結合が検出された。このB10抗-B10.5細胞系列は、共通遺伝型の線維肉腫（B10.5）（ D.H.リンチ(Lynch)とR.E.ミラー(Miller)、Eur．J．Immunol.，21: 1403-10(199 1)と、D.H.リンチら、Eur．J．Immunol.，21: 2977-85(1991)）に反応性の、C57 B1/10SnJ(B10)起源のリンパ腫細胞から、次のようにして開発された：マウスは後ろ足の平に、2-4x10⁶の生きた共通遺伝型の線維肉腫細胞を注入された。８から１２日後、ドレイニングリンパ節(DLN)が無菌的に摘出され、単細胞懸濁液となるように溶解された。細胞培養は５％の二酸化炭素を含む湿度を保った３７℃の空気中で、10%のFBS、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 非必須アミノ酸、5x10^-5M 2-メルカプトエタノール、50ug/mlストレプトマイシン及び50U/mlのペニシリンを補ったRPMI 1640培地中で、1ml当り1.5x10⁶生細胞（フラスコ当り20ml）となるように縦型の25cm²組織培養フラスコ中で（腫瘍刺激細胞を添加せずに）確立された。培養４日後得られたCTLを、1ml当り5x10⁵細胞（１ウエル当り2ml）の濃度となるように、IL-2とIL7（それぞれ2ng/mlと10ng /ml）の混合液を補った培地中で、放射線照射（10,000R）した腫瘍活性化細胞とともに２４ウエルの組織培養プレートで小培養した。次にこの小培養を腫瘍細胞刺激を加えずに、IL-2とIL-7を含む培地を毎週与えることによって維持した。 B10抗-B10.5細胞もまた、PMAとイノマイシンによる刺激の後、TNFR/Fcに結合するが、huIL-4R/Fc、huCD69/Fc、あるいはHSA/Fcには結合しないことがわかった。これらの細胞はまた、CD27/Fc、4-IBB/Fc、CD40/FcあるいはmuOX40/Fcには結合しなかった。さらに追加された研究により、Fas-Lは種々の異なるタイプのネズミおよびヒトＴ細胞において誘導され得ることが示された（表４）。しかし、それは調べられた全てのＴ細胞系列で誘導される訳ではないようであった。またFas-Lは、マウスＢ細胞系、ヒトＢ細胞系のいずれでも検出されなかった。我々はヒト末梢血好中球及びヒト骨髄球、単球細胞系列U937ならびにTHP-1ではFas-Lは検出できなかった。実施例１０アポトーシスによるFas-Lの評価オーバーナイト⁵¹Cr遊離アッセイ法（実施例４参照）及びアポトーシス過程に特徴的な標的細胞DNAの「ラダー」状分解パターンの両者が、（１）PMAとイノマイシンで２時間刺激された後、B10抗-B10.5細胞で検出される細胞表面決定因子が、ジャーカット細胞あるいはMP-1標的細胞のアポトーシスを仲介する事が出来るか、また、（２）アポトーシス過程がhuFasモノクローナル抗体によって阻害されるかを調べるために用いられた。活性化されたB10抗-B10.5細胞で検出される細胞表面決定因子によって誘導される細胞溶解を測定するために、B10抗-B10.5細胞はホルボールエステルとカルシウム・イオノフォアを含む培地中で２時間インキュベーションすることにより活性化され、続いて軽く固定（１分間の0.6%ホルムアルデヒド処理）された。固定した活性型B10抗-B10.5細胞の数を滴定し、活性化因子（effector）と標的細胞との比が10:1、3:1、1:1、および0.3:1となるように、⁵¹Cr標識したジャーカット細胞とともに共培養した。この細胞混合液を一晩インキュベーションし、上の実施例４で記載されたように、溶解した細胞からの⁵¹Crの遊離についてアッセイした。一晩のインキュベーションの後の⁵¹Crの内発的な遊離は20.3%であった。阻害アッセイにおいてB10抗-B10.5細胞は上述のようにして活性化され、軽く固定された。固定した活性型B10抗-B10.5細胞の数を滴定し、活性化因子と標的細胞との比が10:1、3:1、1:1、および0.3:1となるように、培地のみ、あるいはh uFas M3若しくはM31抗体（10ug/ml）を含む培地中で、⁵¹Cr標識したジャーカット細胞とともに共培養した。この細胞混合液を一晩インキュベーションし、上の実施例４で記載されたように、溶解した細胞からの⁵¹Crの遊離についてアッセイした。第５図は、培地のみ（白抜きの四角）、10ug/mlのhuFas M3（白抜きの菱形）あるいは10ug/mlのhuFas M31（白抜きの丸）モノクローナル抗体と一晩培養した細胞混合液からの特異的な51Crの遊離を示している。これと平行して行なった培養から得られたDNAについて、ゲル電気泳動によってDNA断片化が評価された。DNA断片化は有意な⁵¹Crの遊離が検出された細胞混合液においてのみ観察された。それぞれの抗体についての結果は、表１に要約されている。表１のデータは、２つの抗体（M3とM38）が10ug/mlの濃度でFasを発現している細胞のFasリガンドを介した細胞溶解を９０％以上阻害できることを示している。M3とM38のF(ab) '₂断片は、Fasリガンドを介したジャーカット細胞の溶解を、対応するM3抗体及びM38抗体全体と同等のレベルで阻害した。 PMAとイノマイシンによる活性化の直後に、B10抗-B10.5細胞によって発現される分子がFas-Lであることを確定するために、上述の阻害アッセイで用いた活性型B10抗-B10.5細胞の溶解活性もまた、培地のみ、あるいは25ug/mlのhuIL4R/Fc 、 huCD30/Fc、huTNFR/Fc、あるいはhuFas/Fc存在下で評価された。標的細胞の溶解は、huFas/Fc融合タンパク質によって阻害されたか、huIL-4R/Fc、huTNFR/Fc、またはCD30/Fcでは阻害されなかった（第６図）。 DNAは上述のグループと平行して行なった培養（活性化因子：標的比＝2.5:1）から、８時間培養した後に得られ、ゲル電気泳動によってDNA断片化が評価された。DNA断片化は、有意な⁵¹Crの遊離が検出された細胞混合液においてのみ観察された。実施例１１Ｔ細胞クローンにおけるアポトーシスの阻害活性化誘導されたアポトーシス及びFasのクロスリンクによって誘導されたアポトーシスが、因果関係を持つかも知れないかということを決めるために、ホルボール・エステル（PMA）とカルシウム・イオノフォア（イノマイシン）による、長期培養されたヒトCD4⁺Ｔ細胞クローン（TCC）の刺激によって誘導されたアポトーシスを阻害する目的で、Fasの拮抗剤が用いられた。はじめの実験では、２つの異なるTCC（PL-1とPL-2）が培地のみ、または可溶性Fas M3モノクローナル抗体（10ug/ml）を含む培地、またはPMAとイノマイシン（それぞれ5ng/mlと50 0ng/ml）を含む培地、あるいはFas M3モノクローナル抗体（10ug/ml）と、PMA及びイノマイシン（それぞれ5ng/mlと500ng/ml）を含む培地で培養された。５％の二酸化炭素を含む湿度を保った３７℃の空気中で４８時間培養した後、トリパンブルー排除法によって細胞の生存率が決定された。培地のみあるいはFas M3モノクローナル抗体を含む培地中で培養したTCCに比べ、PMAとイノマイシンを含む培地中で培養されたTCCにおいて、細胞の生存率の有意な減少が観察された（第７図）。この効果は、PMAとイノマイシンを含む培地中で培養されたTCCに、Fas M3 モノクローナル抗体を添加することによって完全に阻害された。続く実験において、Fas M3モノクローナル抗体はTCR/CD3複合体(OKT3)を用いるか、あるいは、TCCをPHAまたはPMAとイノマイシンとともに培養することによって誘導されるアポトーシスを阻害するために用いられた。これを行なうために、活性なミトコンドリアがテトラゾリウム塩［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（MTTとして知られる）を青色のフォルマザン産物に転換する比色アッセイ法が用いられた。９６ウェルプレートに、最終的に容量が100ulとなるように、クローン化されたヒトＴ細胞（ウエル当り１0⁴細胞）が加えられた。細胞は、上で記載されたようなさまざまな条件で刺激される。いくつかの培養に対しては、対照のネズミIgG1抗体もしくはhuFas M3 抗体が添加された（最終濃度10ug/ml）。５％の二酸化炭素を含む湿度を保った３７℃の空気中で２４時間から４８時間培養した後、10ulの5mg/ml MTT溶液がウエルに添加された。このプレートは、生存しており代謝的に活発な細胞によるMT Tの転換を行なわせるために更に４時間培養される。このインキュベーションに続き、イソプロパノール中、0.05M塩酸100ulがウエルに添加される。この結果得られる混合液は、MTTの開裂によって形成される結晶を溶解するために、激しくピペットで撹拌される。転換の度合は２波長設定（550nm-650nm）を用い、（ELI SA法のためのもののような）ミクロタイタープレート読み取り器において、プレートを読み取ることによって決定される。高いＯＤ値(562-620)によって示されるように、高いレベルのMTT転換は、細胞の生存率と代謝活性の増加を示すものである。可溶性のFas M3モノクローナル抗体は、可溶性のhuFas M3モノクローナル抗体を含む培養において、MTT転換レベルの増加（OD562-620の増加）によって示されるように、これらのTCR/CD3複合体(OKT3)のいずれかを用いるか、あるいは、長期培養されたヒトCD4+Ｔ細胞クローン（TCC）をPHA、またはPMAとイノマイシンとともに培養するかによって誘導されるTCCにおけるアポトーシスを実質的に阻害した（第７図Ｂ）。もう一つの実験においては、TCCの自殺の阻害がFasとそのリガンドとの相互作用への干渉によるのか、あるいはＴ細胞に直接信号を送ることによって活性化されるhuFas M3モノクローナル抗体によるのかを調べるために、Fas/Fc融合タンパク質をhuFas M3モノクローナル抗体及び対照のIgG1免疫グロブリンならびに培地と比較した。培養は、開始してから２４時間及び４８時間でアッセイされた。クローン化されたヒトＴ細胞（ウエル当り10⁴細胞）は培地のみ、あるいは対照であるネズミIgG1抗体を含む培地、huFas M3モノクローナル抗体を含む培地、huIL -4/Fc融合タンパク質を含む培地もしくはhuFas/Fc融合タンパク質を含む培地中で、PHAで刺激された。５％の二酸化炭素を含む湿度を保った３７℃の空気中で４８時間培養した後、MTT転換アッセイが上述のようにして行なわれた。このデータは、Fas/Fc融合タンパク質は活性化誘導されたアポトーシスを、huFas M3モノクローナル抗体が阻害するのと全く同様に阻害するが、一方IgG1は何の効果も持たないことを示す（第７図Ｃ）。限界希釈微量培養は、１０ng/mlのＩＬ−２とともにウェル当たり約１０個のＴ細胞を用いて確立され、また頻度の概算は単一衝突速度論を仮定してポアソン分布に由来する。クローンサイズの概算は陽性のウェル当たりの芽細胞数を数え、クローン重複を補正することによって行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトFas抗原の細胞外ドメインに特異的に結合し、１０倍モル過剰量において、Fas抗原を発現する細胞に対する抗Fas CH-11モノクローナル抗体の結合を約４％から約６２％の範囲で阻害する、IgG1モノクローナル抗体。２．該モノクローナル抗体がネズミモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。３．約１０：１のモル比で抗Fas CH-11モノクローナル抗体を介した細胞溶解を１０％以上阻害する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。４．約１０：１のモル比で抗Fas CH-11モノクローナル抗体を介した細胞溶解を９０％以上阻害する、請求項３に記載のモノクローナル抗体。５．固定化されたCD3モノクローナル抗体とともに、インターロイキン２とは独立にＴ細胞の増殖を共同刺激し、また溶液中で３０％以下のFas発現細胞を溶解する、請求項３に記載のモノクローナル抗体。６．固定化によってクロスリンクされた場合に５０％以下のFas発現細胞を溶解する、請求項５に記載のモノクローナル抗体。７．固定化によってクロスリンクされた場合に１０％以下のFas発現細胞を溶解し、また固定化されたCD3モノクローナル抗体とともに、インターロイキン２と同等、あるいはそれ以上にＴ細胞の増殖を共同刺激する、請求項６に記載のモノクローナル抗体。８．約１０：１のモル比で抗Fas CH-11モノクローナル抗体を介した細胞溶解を９０％以上阻害し、また固定化されたCD3モノクローナル抗体とともに、インターロイキン２と同等あるいはそれ以上にＴ細胞の増殖を共同刺激する、請求項６に記載のモノクローナル抗体。９．以下の条件：ａ）ヒトFas抗原の細胞外ドメインに特異的に結合し、ｂ）固定化されたCD3モノクローナル抗体とともに、インターロイキン２と独立にＴ細胞の増殖を共同刺激し、また、ｃ）Fasリガンドを介したFas発現細胞の溶解を、少なくとも１０％まで阻害するを満たすIgG₁モノクローナル抗体。１０．該モノクローナル抗体がネズミモノクローナル抗体である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。１１．固定化されたCD3モノクローナル抗体とともに、インターロイキン２と同等あるいはそれ以上にＴ細胞の増殖を共同刺激する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。１２．溶液中でFas発現細胞の１０％以下を溶解する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。１３．固定化によってクロスリンクされた場合Fas発現細胞の３０％以下を溶解する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。１４．約10ug/mlの濃度で、Fasリガンドを介したFas発現細胞の溶解を９０％以上阻害する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。１５．ハイブリドーマATCC HB 11465によって生産されるモノクローナル抗体M38 及び、M38の生物学的特徴を持つモノクローナル抗体を含むグループから選択されるモノクローナル抗体。１６．ヒトFas抗原の細胞外ドメインに特異的に結合し、Fasリガンドを介したFa S発現細胞の溶解を９０％以上阻害することができる、IgG1モノクローナル抗体。１７．該モノクローナル抗体が、抗Fasモノクローナル抗体CH-11を介したFas発現細胞の溶解を９０％以上阻害することができる、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。１８．請求項１に記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片。１９．請求項１に記載のモノクローナル抗体の抗原結合部位及び、IgG4サブクラスのヒトモノクローナル抗体の定常領域からなる、ヒト型モノクローナル抗体。２０．M3、M38、M3の抗原結合断片、M38の抗原結合断片、M3由来のヒト型mAbs及び、M38由来のヒト型mAbsからなるグループより選択されるモノクローナル抗体（mAb）。２１．該mAbが、M38、M38の抗原結合断片、及びM38由来のヒト型mAbsからなるグループより選択される、請求項２０に記載のモノクローナル抗体。２２．請求項２０に記載のmAb及び、生理学的に受容できる希釈剤または担体からなる組成物。２３．Fasリガンドを介したアポトーシスを抑制するために用いる、請求項２２に記載の組成物。２４．Fas/Fc融合タンパク質及び、生理学的に受容できる希釈剤または担体からなる、Fasリガンドを介したアポトーシスを抑制するために用いる治療用組成物。