SK286683B6 - Polypeptidy špecifické pre CD19xCD3 a ich použitie - Google Patents

Abstract

Opísané sú jednoreťazcové multifunkčné polypeptidy obsahujúce aspoň dve väzbové miesta špecifické pre antigény CD19 a CD3. Ďalej sú poskytnuté polypeptidy, kde už opísaný polypeptid obsahuje aspoň jednu ďalšiu doménu, výhodne s vopred danou funkciou. Okrem toho sú opísané polynukleotidy kódujúce uvedené polypeptidy, ako i vektory obsahujúce uvedené polynukleotidy a hostiteľské bunky nimi transformované, a ich použitie pri produkcii uvedených polypeptidov. Navyše sú poskytnuté prípravky, výhodne farmaceutické a diagnostické prípravky, zahrnujúce ktorýkoľvek zo skôr opísaných polypeptidov, polynukleotidov alebo vektorov a tiež použitie už uvedených polypeptidov, polynukleotidov a vektorov na prípravu farmaceutických prípravkov na imunoterapiu, výhodne pri malignitách pochádzajúcich z lymfocytov B, ako sú napríklad non-Hodgkinove lymfómy.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nových jednoreťazcových multifunkčných polypeptidov obsahujúcich aspoň dve väzbové miesta špecifické pre antigény CD19 a CD3, v uvedenom poradí. Predkladaný vynález sa ďalej týka polypeptidu, kde opísaný polypeptid obsahuje aspoň jednu ďalšiu doménu, výhodne s vopred danou funkciou. Okrem toho, predkladaný vynález sa týka polynukleotidov kódujúcich uvedené polypeptidy, ako i vektorov obsahujúcich uvedené polynukleotidy, a ďalej hostiteľských buniek nimi transformovaných a ich použitia vo výrobe uvedených polypeptidov. Navyše, predkladaný vynález sa týka prípravkov, výhodne farmaceutických a diagnostických prípravkov, obsahujúcich ktorýkoľvek z opísaných polypeptidov, polynukleotidov alebo vektorov. Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je použitie uvedených polypeptidov, polynukleotidov a vektorov na prípravu farmaceutických prípravkov na imunoterapiu, výhodne proti malignitám pochádzajúcim z B lymfocytov, ako sú napríklad non-Hodgkinove lymfómy.

Doterajší stav techniky

V celom texte tohto opisu je citovaných niekoľko dokumentov. Každý z uvedených dokumentov (vrátane všetkých opisov výrobcu, inštrukcií atď.) je teda zahrnutý do odkazov, to ale neznamená, že citovaný dokument je skutočne skorším stavom techniky predkladaného vynálezu.

Napriek zdravotnej závažnosti, výskum ochorení sprostredkovaných B lymfocytmi, ako sú napríklad non-Hodgkinove lymfómy, priniesol iba neveľký počet klinicky použiteľných dát a obvyklé prístupy na liečbu podobných ochorení zostávajú ťažké a nepríjemné a/alebo majú vysoké riziko relapsu. Napríklad, hoci chemoterapia vysokými dávkami ako primárna liečba non-Hodgkinových lymfómov vysokého stupňa malignity môže predĺžiť celkové prežitie, približne 50 % pacientov na túto chorobu stále zomiera (2-4). Okrem toho non-Hodgkinove lymfómy s nízkym stupňom malignity ako chronická lymfatická leukémia a lymfóm buniek marginálnej zóny lymfatických uzlín sú stále nevyliečiteľné. To stimulovalo výskum alternatívnych liečebných stratégií, ako je napríklad imunoterapia. Protilátky namierené proti molekulám bunkového povrchu definovaným CD antigénmi predstavujú jedinečnú možnosť vo vývoji liečiv. Expresia určitých CD antigénov je vysoko obmedzená na špecifickú líniu lymfohemopoetických buniek a v uplynulých niekoľkých rokoch boli protilátky namierené proti antigénom špecifickým pre lymfoidné tkanivo používané na vývoj liečby, ktoré boli účinné buď in vitro, alebo vo zvieracích modeloch (5-13). Z tohto hľadiska sa ukázal ako veľmi užitočný cieľ antigén CD 19. CD 19 je exprimovaný v celej línii B lymfocytov od pro-B lymfocytu do štádia zrelého B lymfocytu, jeho expresia sa nestráca, je jednotne exprimovaný na všetkých lymfómových bunkách, a na kmeňových bunkách sa nevyskytuje (8, 14). Zaujímavý postup je použitie bišpecifickej protilátky s jednou špecifičnosťou pre CD 19 a druhou pre CD3 antigény T lymfocytov. Ale bišpecifické protilátky, ktoré sú zatiaľ dostupné, majú nízku cytotoxicitu pre T lymfocyty a potrebujú súčasne stimulujúci agens, aby prejavili uspokojivú biologickú aktivitu.

Základným technickým problémom predkladaného vynálezu bolo teda poskytnú prípravky a spôsoby použiteľné na liečenie chorôb sprostredkovaných B lymfocytmi, ako sú napríklad rôzne formy non-Hodgkinových lymfómov. Riešenie uvedeného odborného problému je dosiahnuté uskutočnením vynálezu, ktorý je definovaný v patentových nárokoch.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka jednoreťazcového multifunkčného polypeptidu obsahujúceho (a) prvú doménu obsahujúcu väzbové miesto imunoglobulínového reťazca alebo protilátky špecificky rozpoznávajúce antigén CD 19, a (b) druhú doménu obsahujúcu väzbové miesto imunoglobulínového reťazca alebo protilátky špecificky rozpoznávajúce antigén CD3.

Termíny „prvá doména“ a „druhá doména“ podľa predkladaného vynálezu znamenajú, že jedno väzbové miesto je namierené proti všeobecnému markéru B lymfocytov CD19, ktorý je jednotne exprimovaný na prevažnej väčšine malígnych B lymfocytov, a druhé väzbové miesto je namierené proti CD3 antigénu ľudských T lymfocytov.

Termín „väzbové miesto“, ako je používaný podľa predkladaného vynálezu, je označením pre doménu obsahujúcu trojrozmernú štruktúru schopnú špecifickej väzby k epitopu ako natívnej protilátky, voľné scFv fragmenty alebo jeden z ich zodpovedajúcich imunoglobulínových reťazcov, výhodne reťazec VH. Teda, uvedená doména môže zahrňovať V_H a/alebo V_L doménu protilátky alebo imunoglobulínového reťazca, výhodne aspoň doménu V_H. Na druhej strane, uvedené väzbové miesta obsiahnuté v polypeptide podľa vynálezu môžu zahrňovať aspoň jednu oblasť určujúcu komplementaritu (CDR) protilátky alebo imunoglobulíno vého reťazca rozpoznávajúcu antigény CD 19 a CD3. Domény väzbových miest prítomné v polypeptide podľa vynálezu môžu byť odvodené nie len z protilátok, ale tiež z iných proteínov viažucich CD 19 alebo CD3, ako sú prirodzene sa vyskytujúce povrchové receptory alebo ligandy. Podľa vynálezu je uvedené väzbové miesto obsiahnuté v doméne.

Termín „multifunkčný polypeptid“, ako je používaný v tomto texte, je označením pre polypeptid obsahujúci aspoň dve aminokyselinové sekvencie pochádzajúce z rôznych zdrojov, t. j. z dvoch rôznych molekúl, voliteľne pochádzajúcich z rôznych živočíšnych druhov, kde aspoň dva z vedených zdrojov určujú väzbové miesta. Uvedené väzbové miesta teda určujú funkcie alebo aspoň niektoré funkcie uvedeného multifunkčného peptidu. Takéto polypeptidy zahrnujú napríklad bišpecifické jednoreťazcové (bsc) protilátky.

Termín ,jednoreťazcový“, ako je používaný podľa predkladaného vynálezu, znamená, že uvedená prvá a druhá doména polypeptidu sú kovalentne spojené, výhodne vo forme súvislej lineárnej aminokyselinovej sekvencie kódovanej molekulou nukleovej kyseliny.

CD 19 označuje antigén, ktorý je exprimovaný v rade B, ako napríklad v pre-B lymfocytoch a zrelých B lymfocytoch, nestráca expresiu, je jednotne exprimovaný na všetkých lymfómových bunkách a chýba na kmeňových bunkách (8,14).

CD3 označuje antigén, ktorý je exprimovaný na T lymfocytoch ako časť multimolekulárneho komplexu receptora T lymfocytu a ktorý sa skladá z troch rôznych reťazcov CD3e, CD35 a CD3y. Zhlukovanie CD3 na T lymfocytoch, napr. prostredníctvom imobilizovaných anti-CD3-protilátok, vedie k aktivácii T lymfocytu podobnej zapojeniu receptora T lymfocytu, ale nezávisle od špecifity typickej pre jeho kloň. V skutočnosti väčšina anti-CD3-protilátok rozpoznáva reťazec CD3s.

Protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú CD 19 alebo CD3 antigén, sú opísané v stave techniky, napr. v (24), (25) a (43), v danom poradí, a môžu byť tvorené obvyklými spôsobmi v odbore známymi.

Už bolo ukázané, že bišpecifické CD19XCD3 protilátky, ktoré nemajú jednoreťazcovú štruktúru, vykonávajú T-bunkovú cytotoxicitu na lymfómových bunkách spôsobom nezávislým od MHC, sú účinné in vitro (5, 6, 9-11, 13,43), od zvieracích modelov (7, 28), ako i v niektorých pilotných klinických skúškach (12, 29, 30). Dosiaľ tieto protilátky boli tvorené pomocou metód hybrid-hybridom, kovalentnou väzbou monoklonálnych protilátok (31) alebo technikou vzniku tzv. „diabody“ (43). Rozsiahlejšie klinické štúdie boli limitované skutočnosťou, že tieto protilátky majú nízku biologickú aktivitu, takže muselo byť použité vysoké dávkovanie, a že používame týchto protilátok samých neposkytovalo užitočný liečebný účinok. Okrem toho bola obmedzená dostupnosť materiálu klinickej úrovne.

Bez väzby na konkrétnu teóriu, má sa za to, že pri použití štruktúry bišpecifickej protilátky, ako je definovaná, takto vytvárané polypeptidy, ako napríklad bišpecifické protilátky CD19XCD3, sú zvyčajne schopné ničiť CD19-pozitívne cieľové bunky prostredníctvom doplňovania cytotoxických T lymfocytov bez potreby predbežnej stimulácie a/alebo súčasnej stimulácie T lymfocytov. To je v ostrom protiklade k všetkým známym bišpecifickým CD19XCD3 protilátkam vyrábaným podľa iných molekulových štruktúr a zvyčajne nezávisí od špecifičnosti konkrétnych CD 19 alebo CD3 protilátok použitých na konštrukciu, napr. bišpecifickej jednoreťazcovej protilátky. Nezávislosť od predbežnej stimulácie a/alebo súčasnej stimulácie T lymfocytov môže značne prispieť k výnimočne vysokej cytotoxicite sprostredkovanej polypeptidom podľa vynálezu, ako je doložené príkladom konkrétnej CD19XCD3 bišpecifickej protilátky opísanej v príkladoch.

Ďalšia výhodná vlastnosť polypeptidu podľa vynálezu je tá, že jeho malú, pomerne kompaktnú štruktúru je ľahké produkovať a purifikovať, tým sa obídu problémy nízkej výťažnosti, výskyt nejasne vymedzených vedľajších produktov, alebo ťažkopádne purifíkačné postupy (15-19) publikované pre CD19XCD3 špecifické protilátky dosiaľ vyrobené z hybridhybridomov, pomocou chemickej väzby alebo prostredníctvom renaturácie z bakteriálnych inklúznych teliesok. V nasledujúcom texte budú výhodné a neočakávané vlastnosti polypeptidu podľa vynálezu diskutované bez obmedzenia, doprevádzané pripojenými príkladmi včítane niektorých výhodných uskutočnení vynálezu, na ktoré sa odkazuje, ktoré objasnia obsiahle poňatie predkladaného vynálezu.

Podľa predkladaného vynálezu bol použitý eukaryotický expresný systém, ktorý bol vyvinutý na produkciu rekombinantných bišpecifických jednoreťazcových protilátok (1), aby vytváral rekombinantnú bišpecifickú CD19XCD3 jednoreťazcovú protilátku prostredníctvom expresie v bunkách CHO. Plne funkčná protilátka bola ľahko purifikovaná zo supematantu tkanivovej kultúry pomocou svojej histidínovej značky na C-konci na chromatografickej kolóne Ni-NTA. Špecifická väzba na CD19 a CD3 bola dokázaná prostredníctvom FACS analýzy. Výsledná molekula bscCD19xCD3 (bišpecifická jednoreťazcová CD19XCD3) podľa vynálezu preukázala niektoré neočakávané vlastnosti:

- navodila vysokú cytotoxicitu proti lymfónom namierenú na T lymfocyty in vitro a in vivo. Dokonca i pri veľmi nízkych koncentráciách 10-100 pg/ml a nízkom pomere E (efektor): T (cieľ) 5:1 a 2,5:1 bola pozorovaná významná špecifická lýza lymfómových bunkových línií. Okrem toho, 3 pg až 10 pg molekuly bscCD19xCD3 podľa vynálezu pri súcitnom podaní ukázalo zreteľné a významné zlepšenie zdravotného stavu. V porovnaní s až dosiaľ publikovanými CD19XCD3 protilátkami vyrobenými prostredníctvom metódy hybrido-hybridomu alebo pomocou prístupu s „diabody“ (ktoré tiež predstavujú rôznu štruktúru), ktoré vyka zovali cytotoxickú aktivitu v rozmedzí niekoľkých ng/ml alebo dokonca pg/ml bscCD19xCD3 protilátka podľa vynálezu sa javí oveľa účinnejšia (5-7, 27, 43), ako je doložené napr. v pripojených príkladoch 4, 5 a 7;

- dokonca i nízke koncentrácie bscCD19xCD3 podľa vynálezu boli schopné navodiť rýchlu cytotoxicitu namierenú proti lymfómu (po 4 hodinách) pri nízkom pomere E:T bez potreby akejkoľvek predbežnej stimulácie I lymfocytov. Na rozdiel od toho obvyklá CD19XCD3 bišpecifická protilátka (5-7, 27) nevykázala v týchto podmienkach (totiž žiadna predbežná stimulácia T lymfocytov, nízky pomer E:T) významnú cytotoxickú aktivitu dokonca i pri vysokých koncentráciách až 3000 ng/ml. Hoci indukcia cytotoxickej aktivity bez predbežnej stimulácie bola tiež publikovaná v prípade inej konvenčnej CD19XCD3 protilátky, bol tento účinok dosiahnutý iba pri vysokých koncentráciách a vysokom pomere E:T (100 ng/ml, 27:1) (9) v porovnaní s bscCD19xCD3 podľa vynálezu (100 pg/ml, 2,5:1). Okrem toho bol cytotoxický účinok tejto konvenčnej protilátky pozorovaný iba po 1 dni predbežnej stimulácie s bišpecifickou protilátkou samotnou, kdežto bscCD19xCD3 podľa vynálezu indukovala cytotoxicitu namierenú proti lymfómu už po 4 hodinách. Čo sa týka znalosti pôvodcov vynálezu, taká rýchla a Špecifická cytotoxická aktivita nestimulovaných T lymfocytov pri takých nízkych koncentráciách a pomeru E:T nebola opísaná pri iných bišpecifíckých protilátkach dosiaľ používaných. Hoci nedávno bolo ukázané, že anti-pl85HER2/anti-CD3 bišpecifická F(ab)2 protilátka indukovala cytotoxickú aktivitu v podobných koncentráciách ako bscCD19xCD3 podľa vynálezu, táto protilátka vyžadovala 24 hodinovú predbežnú stimuláciu s IL-2 (32). Preto, bscCD19xCD3 protilátka podľa vynálezu prejavila jedinečné cytotoxické vlastnosti, ktoré túto molekulu odlišujú od iných bišpecifíckých protilátok, ktoré boli opísané.

BscCD19xCD3 podľa vynálezu sprostredkováva cytotoxické účinky, ktoré sú špecifické pre antigén, čo je dokázané faktmi

- že táto protilátka zlyhala pri lýze plazmacytomových bunkových línií NC1 a L363, čo sú bunkové línie B radu neexprimujúce CD 19 antigén, a

- že cytotoxicita proti lymfómovým bunkám môže byť blokovaná základnou anti-CD19 protilátkou HD37. (HD37 protilátka je odvodená z HD37 hybridomu (22)).

Blokovanie metabolickej dráhy perforínu prostredníctvom deprivácie vápnika s EGTA celkom zastavilo bscCD19XCD3 sprostredkovanú cytotoxicitu, čo svedči pre to, že špecifická lýza je skôr účinok sprostredkovaný T lymfocytmi ako priamy účinok protilátky samej.

Súhrnom, bscCD19xCD3 protilátka konštruovaná podľa vynálezu vyniká nad dosiaľ opísané CD19XCD3 bišpecifické protilátky vzhľadom na značne vyššiu biologickú aktivitu, ako i možnosti rýchlej a ľahkej produkcie, čím jc poskytnuté dostačujúce množstvo klinického materiálu vysokej akosti.

Preto sa očakáva, že bscCD19xCD3 molekuly podľa vynálezu sú vhodným kandidátom pre dôkaz terapeutického prospechu bišpecifíckých protilátok v liečení chorôb sprostredkovaných B lymfocytmi, ako napríklad non-Hodgkinove lymfómy, v klinických skúškach.

Vo výhodnom uskutočnení polypeptidu podľa vynálezu sú uvedené domény spojené polypeptidovou spojkou. Uvedená spojka je umiestnená medzi uvedenou prvou a uvedenou druhou doménou, kde uvedená polypeptidová spojka výhodne zahŕňa niekoľko, hydrofilných, peptidom viazaných aminokyselín a spája N-koncovú časť uvedenej prvej domény a C-koncovú časť uvedenej druhej domény.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu uvedená prvá a/alebo druhá doména opísaného polypeptidu napodobňuje alebo zodpovedá oblastiam V_t1 a V_L prirodzenej protilátky. Protilátka poskytujúca väzbové miesto pre polypeptid podľa vynálezu môže byť napr. monoklonálna protilátka, polyklonálna protilátka, chimérická protilátka, humanizovaná protilátka, bišpecifická protilátka, syntetická protilátka, fragment protilátky, ako napríklad Fab, Fv alebo scFv fragmenty atď., alebo chemický modifikovaný derivát ktorejkoľvek z nich. Monoklonálne protilátky môžu byť pripravené napríklad metódami, ako boli pôvodne opísané v Kôhler a Milstein (Náture, 256, 495, 1975) a Galfré (Meth. Enzymol., 73, 3, 1981), ktoré zahŕňajú fúzie myších myelomových buniek s bunkami sleziny pochádzajúcich z imunizovaných cicavcov s modifikáciami vyvinutými v odbore. Okrem toho, protilátky alebo ich fragment proti skôr uvedeným antigénom môžu byť získané použitím metód, ktoré sú opísané napr. v Harlow a Lane („Antibodies, Laboratory Manuaľ, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988). Protilátky môžu pochádzať z niekoľkých druhov vrátane človeka. Keď sú deriváty uvedených protilátok získané metódou vystavovania na fágu (fágový displej), môže byť na zvýšenie účinnosti fágových protilátok, ktoré sa viažu na epitop CD 19 alebo antigén CD3 použitá povrchová plazmónová rezonancia, ako je využívaná systémom BIACORE (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7, 97-105, 1996, Malmborg, J. Immunol. Methods 183, 7-13, 1995). Produkcia chimérických protilátok je opísaná napríklad v medzinárodnej patentovej prihláške WO 89/09622. Spôsoby produkcie humanizovaných protilátok sú opísané v napr. v prihláškach EP-A1 0 239 400 a WO 90/07861. Ďalší zdroj protilátok používaných podľa predkladaného vynálezu sú takzvané xenogénne protilátky. Všeobecný princíp na produkciu xenogcnnych protilátok, ako napríklad ľudských protilátok v myšiach, je opísaný napr. v prihláškach WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 a WO 96/33735.

Protilátky použité podľa vynálezu alebo ich zodpovedajúci imunoglobulinový reťazec (reťazce) môžu byť ďalej modifikované s použitím obvyklých metód v odbore známych, napríklad s použitím delécie aminokyseliny(aminokyselín), inzercie(í), substitúcie(í), adície(í), a/alebo rekombinácie(í) a/alebo každej inej modifikácie(í) v odbore známej buď samotnej alebo v kombinácii. Metódy na zavedenie takejto modifikácie do sekvencie DNA určujúce aminokyselinovú sekvenciu imunoglobulínového reťazca sú odborníkovi známe (pozri napr. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y., 1989). Uvedené modifikácie sú výhodne uskutočňované na úrovni nukleovej kyseliny.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je aspoň jedna z uvedených domén vo opísanom polypeptide jednoreťazcový fragment variabilnej oblasti protilátky.

Ako je dobre známe, Fv, najmenší protilátkový fragment, ktorý obsahuje kompletné miesto na rozpoznávanie a väzbu antigénu, sa skladá z diméru variabilných domén jedného ťažkého a jedného ľahkého reťazca (V_H a V_L) nekovalentne spojených. V tejto konfigurácii, ktorá zodpovedá konfigurácii nájdenej v natívnych protilátkach, vzájomne interagujú tri oblasti určujúce komplementaritu (CDRs) každej variabilnej domény, čím definujú miesto viažuce antigén na povrchu diméru V_H-V_L. Súhrnne, šesť CDRs prepožičia protilátke väzbovú špecifičnosť pre antigén. Rámce (FRs) ohraničujúce CDRs majú terciámu štruktúru, ktorá je v podstate uchovaná v natívnych imunoglobulínoch živočíšnych druhov tak rôznorodých ako človek a myš. Tieto FRs slúžia na to, aby udržovali CDRs v ich príslušnej orientácii. Konštantné domény nie sú vyžadované pre väzbovú funkciu, ale môžu napomáhať pri stabilizácii interakcie V_H-V_L. Dokonca i jediná variabilná doména (alebo polovina Fv obsahujúca iba tri CDRs špecifické pre antigén) má schopnosť rozpoznať a viazať antigén, hoci zvyčajne pri nižšej afinite ako celé väzbové miesto (Painter, Biochem., 11, 1327-1337, 1972). Preto uvedená doména väzbového miesta polypeptidu podľa vynálezu môže byť dvojica domén V_H-V_L, V_H-V_H alebo V_L-V_L buď rovnakých alebo odlišných imunoglobulínov. Usporiadanie domén V_H a V_L v polypeptidovom reťazci nie je pre predkladaný vynález rozhodujúce, usporiadanie domén daných skôr môže byť obrátené zvyčajne bez straty funkcie. Ale je dôležité, že domény V_H a V_L sú usporiadané tak, že miesto viažuce antigén sa môže správne priestorovo usporiadať (folding).

Vo výhodnom uskutočnení polypeptidov podľa vynálezu uvedenej domény sú usporiadané v poradí V_LCD19-V_HCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3, kde „V_L“ a „V_H“ znamená ľahký a ťažký reťazec variabilnej domény špecifických anti-CD19 a anti-CD3 protilátok.

Ako bolo už povedané, uvedené väzbové miesta sú výhodne spojené flexibilnou spojkou, výhodne polypeptidovou spojkou umiestnenou medzi uvedenými doménami, pričom uvedená polypeptidová spojka zahŕňa niekoľké, hydrofilné, peptidom viazané aminokyseliny s dĺžkou postačujúcou na preklenutie vzdialenosti medzi C-koncovou časťou jednej z uvedených domén obsahujúcej uvedené väzbové miesto a N-koncovou časťou druhej z uvedených domén obsahujúcej uvedené väzbové miesto, keď polypeptid podľa vynálezu príjme štruktúru vhodnú na väzbu pri umiestnení vo vodnom roztoku. Výhodne sa uvedená polypeptidová spojka skladá z veľkého množstva glycínových, alanínových a/alebo serínových zvyškov. Je ďalej výhodné, že uvedená polypeptidová spojka sa skladá z veľkého množstva konsekutívnych kópií aminokyselinovej sekvencie. Zvyčajne sa polypeptidová spojka skladá z 1 až 15 aminokyselín, hoci polypeptidová spojka s viac ako 15 aminokyselinami sa môže tiež osvedčiť. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa uvedená polypeptidová spojka skladá z 1 až 5 aminokyselinových zvyškov.

V obzvlášť výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu polypeptidová spojka v polypeptide podľa vynálezu obsahuje 5 aminokyselín. Ako je ukázané v pripojených príkladoch, uvedená polypeptidová spojka sa výhodne skladá z aminokyselinovej sekvencie Gly Gly Gly Gly Ser.

V ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení uvedená prvá doména polypeptidu podľa vynálezu obsahuje aspoň jednu CDR V_H a V_L oblasti zahrnujúcej aminokyselinovú sekvenciu kódovanú DNA sekvenciou ukázanou na obrázku 8 od nukleotidu 82 do nukleotidu 414 (V_L) a nukleotidu 460 až 831 (V_H) a/alebo uvedená druhá doména obsahuje aspoň jednu CDR, výhodnejšie dve, najvýhodnejšie tri CDRs V_H a V_L oblasti obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu kódovanú DNA sekvenciou zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 847 až nukleotidu 1203 (V_H) a nukleotidu 1258 až 1575 (V_L), voliteľne v kombinácii s rámcom oblasti, ktoré sa vyskytujú zároveň s uvedenými CDRs v základných protilátkach. CDRs obsiahnuté vo variabilných oblastiach zobrazených na obrázku 8 môžu byť určené napríklad podľa autora Kabat („Sequences of Proteins of Immunological Interest“, U.S. Department of Health and Human Services, tretie vydanie, 1983, štvrté vydanie, 1987, priate vydanie, 1990). Odborník hneď ocení, že väzbové miesto alebo aspoň jedna CDR z nej vychádzajúca môžu byť použité na konštrukciu polypeptidu podľa vynálezu. Výhodne uvedený polypeptid zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú DNA sekvenciou, ako je ukázaná na obrázku 8, od nukleotidu 82 až 1575. Odborník hneď ocení, že väzbové miesto polypeptidu podľa vynálezu môže byť konštruované podľa metód v odbore známych, napr. ako bolo opísané v Európskych patentoch EP-A1 0 451 216 a EP-A1 0 549 581.

Domény väzbových miest polypeptidu podľa vynálezu výhodne majú špecifičnosť aspoň v podstate identickú s väzbovou špecifitčnosťou napr. protilátky alebo imunoglobulínového reťazca, od ktorého sú odvode

SK 286683 Β6 ne. Takéto domény väzbového miesta môžu mať väzbovú afinitu aspoň 10⁵M^_i, výhodne nie vyššiu ako 10⁷M^_i pre antigén CD3 a výhodne až 1 O^loM‘ alebo vyššiu pre antigén CD19.

Vo výhodnom uskutočnení polypeptidu podľa vynálezu (a) uvedené väzbové miesto prvej domény má afinitu aspoň približne 10’⁷M, výhodne aspoň približne 10’ ⁹M a najvýhodnejšie aspoň približne 10'^HM, a/alebo (b) uvedené väzbové miesto druhej domény má afinitu menšiu ako približne 10'⁷M, výhodne menšiu ako približne 10’⁶M a najvýhodnejšiu rádovo 10'⁵M.

V zhode s výhodnými uskutočneniami uvedenými skôr je výhodné, ak väzbové miesto rozpoznávajúce antigén CD 19 má vysokú afinitu, aby boli s vysokou účinnosťou zachytené cieľové bunky, ktoré majú byť zničené. Na druhej strane, väzbová afinita väzbového miesta rozpoznávajúceho antigén CD3 by mala byť rádovo taká, ako je afinita prirodzeného receptora CD3 alebo receptora zvyčajne nájdeného pri interakcii T-bunkového receptora so svojím ligandom, to znamená peptidovým komplexom MHC na povrchu cieľovej bunky.

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je polypeptid opísaný skôr bišpecifická jednoreťazcová protilátka.

Predkladaný vynález sa ďalej týka polypeptidu obsahujúci aspoň jednu ďalšiu doménu, uvedené domény sú spojené prostredníctvom kovalentných alebo nekovalentných väzieb.

Väzba môže byť založená na genetickej fúzii podľa metód v odbore známych a opísaných alebo môže byť uskutočnená prostredníctvom, napr. chemického zosietenia (crosslinking), ako bolo opísané napríklad v patentovej prihláške WO 94/04686. Ďalšia doména prítomná v polypeptide podľa vynálezu môže byť výhodne spojená flexibilnou spojkou, výhodne polypeptidovou spojkou k jednej z domén väzbového miesta, kde uvedená polypeptidová spojka zahŕňa niekoľko, hydrofilných, peptidom viazaných aminokyselín s dĺžkou postačujúcou na preklenutie vzdialenosti medzi C-koncovou časťou jednej z uvedených domén a N-koncovou časťou druhej z uvedených domén, keď uvedený polypeptid prijme štruktúru vhodnú na väzbu pri umiestnení vo vodnom roztoku. Výhodne uvedená polypeptidová spojka je polypeptidová spojka, ako je opísané v uskutočneniach. Polypeptid podľa vynálezu môže ďalej obsahovať štiepiteľnú spojku alebo štiepené miesto pre proteinázy, ako napríklad enterokinázy, pozri tiež pripojené príklady.

Okrem toho uvedená ďalšia doména môže mať vopred definovanú špecifičnosť alebo funkciu. Napríklad literatúra obsahuje veľké množstvo odkazov na spôsoby cielenia bioaktívnych látok, ako napríklad liekov, toxínov a enzýmov, na špecifické miesta v organizme s cieľom zničiť alebo lokalizovať malígne bunky alebo indukovať lokalizovaný liek alebo enzymatické pôsobenie. Bolo navrhnuté, ako dosiahnuť tento účinok pomocou konjugácie bioaktívnej látky k monoklonálnymi protilátkam (pozri, napr., N.Y. Oxford University Press, a Ghose, J. Natl. Cancer Inst. 61, 657-676, 1978).

V tejto súvislosti sa tiež rozumie, že polypeptidy podľa vynálezu môžu byť ďalej modifikované prostredníctvom obvyklých metód v odbore známych. To umožňuje konštrukcia chimérických proteínov obsahujúcich polypetid podľa vynálezu a ďalšie funkčné aminokyselinové sekvencie, napr. jadrové lokalizačné signály, transaktivačné domény, DNA-väzbové domény, hormóny viažuce domény, proteínové značky (GST, GFP, peptid h-myc, FLAG, peptid HA), ktoré môžu byť odvodené z heterológnych proteínov. Ako je opísané v pripojených príkladoch, polypeptid podľa vynálezu výhodne obsahuje značku FLAG dlhú približne 8 aminokyselín, pozri obrázok 8.

Polypeptidy podľa vynálezu môžu byť používané liečebne u pacientov trpiacich chorobami B lymfocytov, ako lymfóm pochádzajúci z lymfocytov B, chronická lymfatická leukémia typu B (B-CLL) a/alebo u pacientov majúcich autoimunitné choroby so vzťahom k B lymfocytom, ako napríklad myasthenia gravis, Basedowova choroba, Hashimotova thyreoiditis alebo Goodpastureov syndróm. Takáto liečba môže byť uskutočnená napríklad pomocou podávania polypeptidov podľa vynálezu. Toto podávanie môže použiť polypeptidy neoznačené i označené.

Napríklad polypeptidy podľa vynálezu môžu byť podávané značené liečebným prípravkom. Tieto prípravky môžu byť spojené buď priamo alebo nepriamo s protilátkami alebo antigénmi podľa vynálezu. Jeden príklad nepriamej väzby je použitie dištančnej skupiny (spacer). Tieto dištančné skupiny môžu byť striedavo buď nerozpustné alebo rozpustné (Diener, Science, 231, 148, 1986) a môžu byť vybrané tak, aby umožnili uvoľnenie lieku od antigénu v cieľovom mieste. Príklady terapeutických prípravkov, ktoré môžu byť spojené s polypeptidmi podľa vynálezu pre imunoterapiu, sú lieky, rádioizotopy, lektíny a toxíny. Lieky, ktoré môžu byť konjugované s polypeptidmi podľa vynálezu, zahnujú zlúčeniny, ktoré sa klasicky priraďujú k liekom, ako napríklad mitomycín C, daunorubicín a vinblastín.

Pri použití polypeptidov podľa vynálezu konjugovaných s rádioizotopmi pre napr. imunoterapiu sú určité izotopy vhodnejšie ako iné, v závislosti od takých faktorov, ako je distribúcia leukocytov, rovnako ako stabilia a emisia. Čo sa týka autoimunitnej reakcie, niektoré žiariče môžu byť vhodnejšie ako iné. Všeobecne vzaté v imunoterapii sú uprednostňované rádioizotopy emitujúce častice a a β. Výhodné sú a žiariče krátkeho dosahu a vysokej energie, ako napríklad ^2l2Bi. Príklady rádioizotopov, ktoré môžu byť viazané na polypeptidy podľa vynálezu na liečebné účely, sú ^l25I, ^l3ll'⁹⁰Y'⁶⁷Cu, ^mBi, ² ~At,²¹¹ Pb, ⁴⁷Sc, ^1<wPd a ^lfWRe.

Lektíny sú proteíny zvyčajne izolované z rastlinného materiálu, ktoré sa viažu na špecifické sacharidové skupiny. Mnoho lektínov je tiež schopné aglutinovať bunky a stimulovať lymfocyty. Ricín je toxický lektín, ktorý bol používaný imunoterapeuticky. To je uskutočňované väzbou α-peptidového reťazca ricínu, ktorý je zodpovedný za toxicitu, k polypeptidu, aby sa umožnilo miestne špecifické toxické pôsobenie.

Toxíny sú jedovaté látky produkované rastlinami, zvieratami alebo mikroorganizmami, ktoré sú v primeranej dávke Často smrteľné. Difterický toxín je látka tvorená Corynebacterium diphtheria, ktorá môže byť používaná liečebne. Tento toxín sa skladá z podjednotiek a a β, ktoré môžu byť oddelené vo vhodných podmienkach. Toxická zložka A môže byť naviazaná na polypeptid podľa vynálezu a môže byť použitá na miestne špecifické podanie k interagujúcim B a T lymfocytom, ktoré boli privedené do jej tesnej blízkosti pomocou väzby na polypeptid podľa vynálezu.

Ďalšie liečebné prípravky, ako boli opísané, ktoré môžu byť pripojované k polypeptidu podľa vynálezu, ako i zodpovedajúce ex vivo a in vivo liečebné protokoly, sú známe alebo môžu byť odborníkom ľahko zistené. Kdekoľvek je to vhodné, môže odborník použiť polynukleotid podľa vynálezu opísaný, ktorý kóduje ktorýkoľvek z opísaných polypeptidov alebo miesto samotného proteínového materiálu môžu byť použité zodpovedajúce vektory.

Odborník teda hneď ocení, že polypeptid podľa vynálezu môže byť použitý na konštrukciu ďalších polypeptidov požadovanej špecifičnosti a biologickej funkcie. Očakáva sa, že polypeptidy podľa vynálezu budú mať dôležitú liečebnú a vedeckú úlohu zvlášť v zdravotníctve, napríklad pri vývoji nových liečebných prístupov k chorobám so vzťahom k B lymfocytom, ako napríklad určité formy karcinómu a autoimunitných ochorení, alebo ako zaujímavé nástroje na analýzu a moduláciu zodpovedajúceho bunkového signálu transdukčných metabolických dráh.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje uvedená aspoň jedna ďalšia doména molekulu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z efektorových molekúl s konformáciou vhodnou pre biologickú aktivitu, aminokyselinových sekvencii schopných sekvestrovať ión a aminokyselinových sekvencii schopných selektívnej väzby na pevný podklad alebo k vopred vybranému antigénu.

Uvedená ďalšia doména obsahuje výhodne enzým, toxín, receptor, väzbové miesto, väzbové miesto na biosyntetickú protilátku, rastový faktor, bunkový diferenciačný faktor, lymfokín, cytokín, hormón, vzdialene detegovateľnú skupinu, antimetabolit, rádioaktívny atóm alebo antigén. Uvedený antigén môže byť napr. nádorový antigén, vírusový antigén, mikrobiálny antigén, alergén, autoantigén, vírus, mikroorganizmus, polypeptid, peptid alebo veľké množstvo nádorových buniek.

Okrem toho uvedená sekvencia schopná sekvestrovať ión je výhodne vybraná z kalmodulínu, metalotioneínu, ich funkčného fragmentu alebo aminokyselinové sekvencie bohaté na prinajmenšom jednu z kyselín, a to kyseliny glutámové, kyseliny asparágové, lyzínu a arginínu.

Okrem toho uvedená polypeptidová sekvencia schopná selektívnej väzby k pevnému podkladu môže byť pozitívne alebo negatívne nabitá aminokyselinová sekvencia, aminokyselinová sekvencia obsahujúca cysteín, avidín, streptavidín, funkčný fragment proteínu Staphylococcus A, GST, značka His, značka FLAG alebo Lex A. Ako je opísané v pripojených príkladoch, polypeptid podľa vynálezu vysvetlený na príklade jednoreťazcovej protilátky bol tiež exprimovaný s N-koncovou značkou FLAG a/alebo C-koncovou značkou His, ktoré umožnili ľahkú purifikáciu a detekciu. Značka FLAG používaná v príklade obsahuje 8 aminokyselín (pozri obrázok 8) a je tak výhodne použitá podľa predkladaného vynálezu. Ale sú tiež vhodné značky FLAG skladajúce sa zo skrátených verzii FLAG používaných v pripojených príkladoch, ako napríklad aminokyselinová sekvencia Asp-Tyr-Lys-Asp.

Efektorové molekuly a aminokyselinové sekvencie opísané skôr môžu byť prítomné v polotovare alebo prekurzore (proforma), ktorý samotný je buď aktívny, alebo neaktívny, a ktoré môžu byť odstránené, keď napr. vstúpia do určitého bunkového prostredia.

V najvýhodnejšom uskutočnení podľa vynálezu je uvedený receptor súčasne stimulujúca povrchová molekula dôležitá na aktiváciu T lymfocytov alebo obsahuje miesto viažuci epitop alebo miesto viažuci hormón.

V ďalšom najvýhodnejšom uskutočnení vynálezu, uvedená súčasne stimulujúca povrchová molekula je CD80 (B7-1) alebo CD86 (B7-2).

V ešte ďalšom uskutočnení sa predkladaný vynález týka polynukleotidov, ktoré pri expresii kódujú skôr opísané polypeptidy. Uvedené polynukleotidy môžu byť fúzované k vhodnej expresnej kontrolnej sekvencii v odbore známej, aby zaistili vlastnú transkripciu a transláciu polypeptidu.

Uvedený polynukleotid môže byť napr. DNA, cDNA, RNA alebo synteticky vyrobená DNA či RNA alebo rekombinantné vyrobená chimérická molekula nukleovej kyseliny zahrnujúca akýkoľvek z polynukleotidov buď samotný, alebo v kombinácii. Uvedený polynukleotid je výhodne časť vektora. Takéto vektory môžu zahŕňať ďalšie gény, ako napríklad markérové gény, ktoré umožnia selekciu uvedeného vektora vo vhodnej hostiteľskej bunke a vo vhodných podmienkach. Výhodne je polynukleotid podľa vynálezu operatívne pripojený k expresnej kontrolnej sekvencii umožňujúcej expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Expresia uvedeného polynukleotidu zahŕňa transkripciu polynukleotidu do translatovateľnej mRNA. Regulačné prvky zaisťujúce expresiu v eukaryotických bunkách, výhodne cicavčích bunkách, sú dobre odborníkovi známe. Zvyčajne zahrnujú regulačné sekvencie zaisťujúce začiatok transkripcie a voliteľne polyA signály zaisťujúce ukončenie transkripcie a stabilizácie transkriptu. Ďalšie regulačné prvky môžu zahrňovať transkripčné rovnako ako translačné zosilovače, a/alebo prirodzene pridružené alebo heterológne promótorove oblasti. Možné regulačné prvky pripúšťajúce expresiu v prokaryotických hostiteľských bunkách zahrnujú napr. promótor PL, lac, trp alebo tac v E. coli, a príklady regulačných prvkov umožňujúcich expresiu v eukaryotických hostiteľských bunkách sú promótory AOX1 alebo GALI v kvasinkách alebo promótor CMV, SV40, RSV (Rous sarcoma vírus), zosilovač CMV, zosilovač SV40 alebo globínový intrón v bunkách cicavcov a ďalších zvierat. Okrem prvkov, ktoré sú zodpovedné za počiatok transkripcie, môžu tieto regulačné prvky tiež zahrňovať transkripčné terminačné signály, ako napríklad miesto SV40-polyA alebo miesto tkpoly-A, po smere transkripcie od polynukleotidu. Okrem toho v závislosti od použitého expresného systému môžu byť ku kódujúcej sekvencií polynukleotidu podľa vynálezu pridané vedúce sekvencie schopné smerovania polypeptidu k bunkovému kompartmentu alebo sekrécie polypeptidu do média a sú v odbore dobre známe, pozri tiež napr. pripojené príklady. Vedúca sekvencia je (sú) zostavené vo vhodnej fáze s translačnými, iniciačnými a terminačnými sekvenciami a výhodne vedúcou sekvenciou schopnou riadenia sekrécie translatovaného proteínu alebo jeho časti do periplazmatického priestoru alebo extracelulámeho média. Heterológne sekvencie môžu voliteľne kódovať fúzny proteín včítane N-koncového identifikačného peptidu prepožičiavajúceho požadované vlastnosti, napr. stabilizáciu alebo zjednodušenú purifikáciu exprimovaného rekombinantného produktu, pozri skôr. V tejto súvislosti, vrátane expresné vektory sú v odbore známe, ako napríklad cDNA expresný vektor pcDVl podľa Okayamy-Berga (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-Vitrogene) alebo pSPORTl (GIBCO BRL).

Expresné kontrolné sekvencie sú výhodne eukaryotické promótorové systémy vo vektoroch schopných transformovať alebo transfekovať eukaryotické hostiteľské bunky, ale kontrolné sekvencie pre prokaryotických hostiteľov môžu byť tiež použité. Akonáhle bol vektor zavedený do vhodného hostiteľa, je hostiteľ udržovaný v podmienkach vhodných pre vysokú expresiu nukleotidovej sekvencie, a ak je žiaduci, môže nasledovať zber a purifikácia polypeptidu podľa vynálezu, pozri napr. pripojené príklady.

Ak bolo opísané, polynukleotid podľa vynálezu môže byť použitý samotný alebo ako časť vektora na expresiu polypeptidu podľa vynálezu v bunkách pre napr. génovú terapiu alebo diagnostiku chorôb so vzťahom k B lymfocytom. Polynukleotídy alebo vektory obsahujúce DNA sekvencie kódujúce akýkoľvek z opísaných polypeptidov sú zavedené do buniek, ktoré ďalej produkujú požadovaný polypeptid. Génová terapia, ktorá je založená na zavedení terapeutických génov do buniek prostredníctvom ex vivo alebo in vivo metód, je jednou z najdôležitejších aplikácii génového prenosu. Vhodné vektory, metódy alebo systémy na podávanie génov pre in vitro alebo in vivo génovou terapiou sú opísané v literatúre a sú odborníkovi známe (pozri napr. Giordano, Náture Medicíne,2, 534-539, 1996, Schaper, Circ. Res., 79, 911-919, 1996, Anderson, Science, 256, 808-813, 1992, Verma, Náture, 389, 239, 1994, Isner, Lancet, 348, 370-374, 1996, Muhlhauser, Circ. Res., 77, 1077-1086, 1995, Onodera, Blood, 91, 30-36, 1998, Verma, Gene Ther., 5, 692-699, 1998, Nabel, Anna. N.Y. Acad. Sci., 811, 289-292, 1997, Verzeletti, Hum.Gene Ther., 9, 2243-51, 1998, Wang, Náture Medicíne, 2, 714-716, 1996, WO 94/29469, WO 97/00957, US 5,580,859, US 5,589,466, alebo Schaper, Current Opinion in Biotechnology, 7, 635-640, 1996, a odkazy v nich citované). Polynukleotídy a vektory podľa vynálezu môžu byť navrhnuté na priame zavedenie alebo na zavedenie prostredníctvom lipozómy alebo vírusové vektory (napr. adenovírusové, retrovirusové) do bunky'.

Uvedená bunka je výhodne bunka zárodočnej línie, embryonálna bunka alebo vajíčko alebo bunka z nich pochádzajúca, najvýhodnejšie uvedená bunka je kmeňová bunka. Príklad embryonálnej kmeňovej bunky môže byt', inter alia, kmeňová bunka, ako je opísaná v práci autora Nagya (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428, 1993).

Podľa uvedeného sa predkladaný vynález týka vektorov, najmä plazmidov, kozmidov, vírusov a bakteriofágov zvyčajne používaných v genetickom inžinierstve, ktoré obsahujú polynukleotid kódujúci polypeptid podľa vynálezu. Uvedený vektor je výhodne expresný vektor a/alebo vektor na génový prenos alebo cieliaci (targeting) vektor. Expresné vektory odvodené z vírusov, napríklad retrovírusov, vírusu vakcínie, adenoasociovaných vírusov, herpetických vírusov alebo vírusu bovinného papilómu, môžu byť použité na dodanie polynukleotidov alebo vektora podľa vynálezu do populácií cieľových buniek. Metódy, ktoré sú odborníkovi dobre známe, môžu byť používané na konštrukciu rekombinantných vektorov, pozri napríklad metódy opísané v práci Sambrooka a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spríng Harbor Laboratory N .Y., 1989, a Ausubela a kol., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 1989). Alebo môžu byť polynukleotídy a vektory podľa vynálezu na dodanie k cieľovým bunkám rekonštituované do lipozómov. Vektory obsahujúce polynukleotídy podľa vynálezu môžu byť prenesené do hostiteľskej bunky prostredníctvom známych metód, ktoré sa menia v závislosti od typu bunkového hostiteľa. Napríklad transfekcia chloridom vápenatým je zvyčajne použitá pre prokaryotické bunky, zatiaľ čo ošetrenie fosfátom vápenatým alebo elektroporácia môžu byť použité pre iných bunkových hostiteľov, pozri Sambrook. Akonáhle sú exprimované, môžu byť polypeptidy podľa predkladaného vynálezu purifikované podľa v odbore štandardného postupu, vrátane precipitácie sulfátom amónnym, na afinitných kolo nach, stĺpcovou chromatografiou, gélovou elektroforézou apod. (pozri Scopes, „Proteín Purification“, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Na farmaceutické použitie sú výhodné v podstate čisté polypeptidy s homogenitou aspoň 90 až 95 %, najvýhodnejšie sú s homogenitou 98 až 99 % alebo viac. Akonáhle sú raz purifikované, čiastočne alebo na požadovanú homogenitu, môžu byť polypeptidy potom používané liečebne (vrátane mimotelného prístupu) alebo pri vývoji a uskutočňovaní testov.

V ešte ďalšom uskutočnení sa predkladaný vynález týka bunky obsahujúcej polynukleotid alebo vektor opísaný skôr. Keď sa uvažuje o liečebných použitiach polypeptidu, je uvedená bunka výhodne eukaryotická, najvýhodnejšia cicavčia bunka. Ale kvasinky a menej výhodné prokaryotické napr. bakteriálne bunky môžu tiež poslúžiť, najmä ak produkovaný polypeptid je používaný ako diagnostický prostriedok.

Polynukleotid alebo vektor podľa vynálezu, ktorý je prítomný v hostiteľskej bunke, môže byť buď integrovaný do genómu hostiteľskej bunky, alebo môže byť udržovaný extrachromozomálne.

Termín „prokaryotický“ je chápaný tak, že zahŕňa všetky baktérie, ktoré môžu byť transformované alebo transfekované molekulami DNA alebo RNA na expresiu polypeptidu podľa vynálezu. Prokaryotický hositelia zahrnujú Gram-negatívne, ako i Gram-pozítivne baktérie ako napríklad E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Termín „eukaryotický“ je chápaný tak, že zahŕňa kvasinky, vyššie rastliny, hmyz a výhodne cicavčie bunky. V závislostí od hostiteľa použitého v postupe rekombinantnej produkcie môžu byť polypeptidy podľa predkladaného vynálezu glykosylovany alebo môžu byť bez glykosylácie. Polypeptidy podľa vynálezu môžu tiež zahrňovať počiatočný aminokyselinový zvyšok metionín. Polynukletid kódujúci polypeptid podľa vynálezu môže byť použitý na transformáciu alebo transfekciu hostiteľa s použitím akejkoľvek z metód odborníkovi všeobecne známych. Obzvlášť výhodné je použitie plazmidu alebo vírusu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu polypeptid podľa vynálezu, ku ktorej je navyše geneticky fúzovaná N-koncová značka FLAG a/alebo C-koncová značka His. DÍžka uvedenej značky FLAG je výhodne približne 4 až 8 aminokyselín, najvýhodnejšia 8 aminokyselín. Metódy na prípravu fuzovaných, operatívne spojených génov a exprimujúcich sa v napr. cicavčích bunkách a baktériách sú v odbore známe (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Genetické konštrukty a metódy opísané tu môžu byť využité na expresiu polypeptidu podľa vynálezu v eukaryotických alebo prokarytotických hostiteľoch. Všeobecne vzaté, v spojení s hositeľom sú používané expresné vektory obsahujúce promótorove sekvencie, ktoré uľahčujú účinnú transkripciu vloženého polynukleotidu. Expresný vektor typicky obsahuje počiatok replikácie, promótor a terminátor, ako i špecifické gény, ktoré sú schopné zaistiť fenotypovú selekciu transformovaných buniek. Okrem toho na rozsiahlu produkciu polypeptidu podľa vynálezu môžu byť používané transgénne zvieratá, výhodne cicavce, obsahujúce bunky podľa vynálezu.

V ďalšom uskutočnení sa predkladaný vynález teda týka postupu na prípravu polypeptidu opísaného skôr, zahrnujúci kultiváciu buniek podľa vynálezu v podmienkach vhodných na expresiu polypeptidu a izoláciu polypeptidu z bunky alebo kultivačného média.

Transformovaní hostitelia môžu rásť vo fermentore a môžu byť pestovaní podľa metód v odbore známych tak, aby bol dosiahnutý optimálny rast buniek. Polypeptid podľa vynálezu môže potom byť izolovaný z rastového média, bunkového lyzátu alebo frakcií bunkových membrán. Izolácia a purifikácia, napr. mikrobiálne exprimovaných polypeptidov podľa vynálezu sa môže uskutočňovať akýmikoľvek obvyklými prostriedkami ako napríklad separácia preparatívnou chromatografiou a imunologická separácia zahrnujúca napríklad použitie monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok namierených napr. proti značke na polypeptide podľa vynálezu alebo ako je opísané v pripojených príkladoch.

Predkladaný vynález preto umožní rekombinantnú produkciu polypeptidov obsahujúcich väzbové miesta s afinitou a špecifičnosťou pre epitopy antigénov CE19 a CD3, podľa poradia, a voliteľne ďalšiu funkčnú doménu. Ako vysvitá z už uvedeného, vynález poskytne veľkú rodinu polypeptidov obsahujúcich tieto väzbové miesta na akékoľvek použitie v liečebných a diagnostických postupoch. Odborníkovi je zrejmé, že polypeptidy podľa vynálezu môžu byť ďalej spojené s ďalšími skupinami, ako je opísané, pre napr. cielenie lieku a použitie na zobrazovacie metódy. Táto väzba môže byť uskutočnená po expresii polypeptidov chemickým spôsobom k miestu pripojenia alebo produkt obsahujúci väzbu môže byť konštruovaný v polypeptide podľa vynálezu už na úrovni DNA. DNA je potom exprimovaná vo vhodnom hostiteľskom systéme a exprimované proteíny sú sústredené a renaturované, ak je to nevyhnutné. Ako je opísané, väzbové miesta sú výhodne odvodené z variabilnej oblasti protilátok. Po tejto stránke, technológie hybridomu umožnia produkciu bunkových línií secemujúcich protilátky proti takmer každej požadovanej látke, ktorá vyvoláva imunitnú reakciu. Z cytoplazmy hybridomu potom môže byť ziskana RNA kódujúca imunoglobulínové ľahké a ťažké reťazce. 5'koncová časť mRNA môže byť použitá na prípravu cDNA, ktorá bude použitá v spôsobe podľa predkladaného vynálezu. DNA kódujúca polypeptidy podľa vynálezu môže byť postupne exprimovaná v bunkách, výhodne cicavčích bunkách.

V závislosti od hostiteľskej bunky môžu byť na dosiahnutie správnej konformácie požadované renaturačné metódy. Ak je to nutné, môžu byť v DNA vytvorené bodové substitúcie vyhľadané na optimalizáciu väzby, s použitím obvyklej kazetovej mutagenézy alebo inej metódy proteínového inžinierstva, napríklad ako je opísaná na tomto mieste. Príprava polypeptidov podľa vynálezu môže tiež závisieť od znalosti aminokyseli novej sekvencie (alebo zodpovedajúcej sekvencie DNA či RNA) bioaktivnych proteínov, ako napríklad enzýmov, toxínov, rastových faktorov, bunkových diferenciačných faktorov, receptorov, antimetabolitov, hormónov alebo rôznych cytokínov, alebo lymfokínov. Takéto sekvencie sú publikované v literatúre a dosiahnuteľné prostredníctvom počítačových databánk. Napríklad polypeptid podľa vynálezu môže byť konštruovaný tak, že sa napr. skladá z jednoreťazcového Fv fragmentu a extracelulámej časti ľudského súčasne stimulujúceho proteínu CD80 (B7-1) prepojeného prostredníctvom spojky (Gly4Serl)l. CD80 súčasne stimulujúci protein patrí do rodiny Ig. Je to silne glykosylovaný protein s 262 aminokyselinami. Podrobnejší opis bol publikovaný v práci Freeman (J. Immunol., 143, 2714-2722, 1989). Stabilná expresia môže byť uskutočnená v napr. DHFR deficitných CHO bunkách, ako je opísané v práci Kaufmann (Methods Enzymol. 185, 537-566, 1990). Protein môže potom byť purifikovaný vďaka svojej značke His pripojenej na C-koncovej časti s použitím kolóny Ni-NTA (Mack, Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995).

Navyše predkladaný vynález poskytuje zlúčeniny obsahujúce uvedený polypeptid, polynukleotid alebo vektor podľa vynálezu.

Predkladaný vynález sa výhodne týka prípravkov, ktoré sú farmaceutické prípravky zahrnujúce uvedený polypeptid(y), polynukleotid(y) alebo vektor(y) podľa vynálezu.

Farmaceutický prípravok podľa predkladaného vynálezu môže ďalej zahŕňať farmaceutický prijateľný nosič. Príklady vhodných farmaceutických nosičov sú v odbore dobre známe a zahrnujú fyziologické roztoky pufrované fosfátmi, vodu, emulzie, ako napríklad emulzie olej/voda, rôzne druhy zmáčadiel, sterilné roztoky atď. Prípravky zahrnujúce tieto nosiče môžu byť formulované pomocou dobre známych obvyklých metód. Tieto farmaceutické prípravky môžu byť podávané pacientovi vo vhodnej dávke. Podávanie vhodných prípravkov sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi napr. prostredníctvom intravenózneho, intraperitoneálneho, subkutánneho, intramuskulámeho, lokálneho alebo intradermálneho podávania. Dávkovací režim bude určený ošetrujúcim lekárom a klinickými faktormi. Ako je v lekárskych odboroch dobre známe, dávkovanie pre každého pacienta závisí od mnohých faktorov, vrátane veľkosti pacienta, telesného povrchu, veku, konkrétnej zlúčeniny, ktorá má byť podávaná, pohlavia, času a spôsobu podávania, všeobecného zdravotného stavu a ďalších liekocv, ktoré sú podávané súčasne. Všeobecne dávkovanie pri pravidelnom podávaní farmaceutického prípravku by malo byť v rozmedzí 1 pg až 10 mg jednotiek na kilogram telesnej hmotnosti za minútu. Ale výhodnejšie dávkovanie na kontinuálnu infúziu by mohlo byť v rozmedzí 0,01 pg až 10 mg jednotiek na kilogram telesnej hmotnosti za hodinu. Obzvlášť výhodné dávkovania sú uvedené neskôr. Pokrok môže byť monitorovaný periodickým vyšetrovaním. Dávka bude kolísať, ale výhodné dávkovanie na intravenózne podávanie DNA je približne 10⁶ až 10¹² kópií molekuly DNA. Prípravky podľa vynálezu môžu byť podávané lokálne alebo systémovo. Podávanie je väčšinou parenterálne napr. intravenózne, DNA môže byť tiež podávaná namierená na cieľové miesto, napr. biolistickou metódou na vnútorné alebo vonkajšie miesto určenia alebo prostredníctvom katétru na miesto v tepne. Prípravky na parenterálne podávanie zahrnujú sterilné vodné alebo iné ako vodné roztoky, suspenzie a emulzie. Príklady rozpúšťadiel iných ako vodných sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje ako olivový olej a organické estery vhodné pre injekciu ako napríklad etylolát. Vodné nosiče zahrnujú vodu, alkoholové/vodné roztoky, emulzie alebo suspenzie, vrátane fyziologického roztoku a pufrovaných médií. Parenterálne vehikulá zahrnujú roztok chloridu sodného, Ringerovú dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, Ringerov roztok s laktátom alebo pevné oleje. Intravenózne vehikulá zahrnujú tekuté a výživné doplnky, elektrolytové doplnky (ako tie založené na Ringrovej dextróze) apod. Môžu byť tiež prítomné konzervačné prostriedky a ďalšie aditíva ako napríklad antimikrobiálne činidlá, antioxidačné činidlá, chelátotvomé činidlá a inertné plyny apod. Navyše, farmaceutický prípravok podľa predkladaného vynálezu môže zahrňovať proteínové nosiče, ako napr. sérový albumín alebo imunoglobulín, výhodne ľudského pôvodu. Okrem toho je odporučené, aby farmaceutický prípravok podľa vynálezu obsahoval ďalší biologický účinný prípravok podľa zamýšľaného použitia farmaceutického prípravku. Agens môže byť tiež liek pôsobiaci na gastrointestinálny systém, liek pôsobí ako cytostatikum, liek zabraňujúci hyperurikémii a/alebo molekuly súčasne stimulujúce T lymfocyty alebo v odbore známe cytokíny.

Predkladaný vynález predpokladá, že rôzne polynukleotidy a vektory podľa vynálezu sú podávané buď samotne alebo v akejkoľvek kombinácii s použitím štandardných vektorov a/alebo systémov na podávanie génov, a voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo excipientom. Po podaní môžu byť uvedené polynukleotidy alebo vektory trvalo integrované do genómu pacienta.

Naproti tomu môžu byť používané vírusové vektory, ktoré sú špecifické pre určité bunky alebo tkanivá a v uvedených bunkách zotrvávajú. Vhodné farmaceutické nosiče a excipienty sú v odbore dobre známe. Farmaceutické prípravky pripravené podľa vynálezu môžu byť používané na prevenciu alebo liečbu, alebo oddialenie rôznych chorôb týkajúcich sa imunodeficiencie a malignít so vzťahom k B lynifocytom.

Okrem toho je možné použiť farmaceutický prípravok podľa vynálezu, ktorý obsahuje polynukleotid alebo vektor podľa vynálezu v génovej terapii. Vhodné systémy na podávanie génov zahrnujú lipozómy, systémy na podávame sprostredkované receptormi, nechránenú DNA a vírusové vektory, ako sú napríklad herpes vírusy, retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy. Dodanie nukleových kyselín na špecifické miesto v organizme pri génovej terapii môže byť tiež uskutočnené použitím biolistického systému na prenos nuk leovej kyseliny, ako napríklad systém opísaný autorom Williamsom (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2726-2729, 1991). Ďalšie metódy na podávanie nukleových kyselín zahrnujú génový prenos sprostredkovaný časticami, ako je opísané napr. autorom Vermom (Gene Ther., 15, 692-699, 1998). Rozumie sa, že zavedené polynukleotidy a vektory exprimujú génový produkt po zavedení do uvedenej bunky a v tomto stave výhodne zostávajú počas života uvedenej bunky. Napríklad, bunkové línie, ktoré trvalo exprimujú polynukleotid pri riadení vhodnou regulačnou sekvenciou, môžu byť konštruované podľa metód odborníkom dobre známych. Skôr ako použitím expresných vektorov obsahujúcich vírusové počiatky replikácie, sú hostiteľské bunky transformované polynukleotidom podľa vynálezu a markérom na selekciu, buď v rovnakom alebo samostatnom plazmide. Po zavedení cudzorodej DNA sú skonštruované bunky pestované počas 1-2 dní v obohatených médiách, a potom sú premiestnené na selektívne média. Marker na selekciu v rekombinantnom plazmide prepožičia rezistenciu a umožni selekciu buniek s trvalo integrovaným plazmidom do svojich chromozómov, ktoré rastú a tvoria ložiská, ktoré môžu byť ďalej klonované a rozšírené do bunkových línií. Takto skonštruované bunkové línie sú tiež použiteľné najmä na skríning a detekciu zlúčenín zapojených do napr. interakcií B a T lymfocytov.

Môže byť použitý celý rad selekčných systémov vrátane napr. tymidínkinázy vírusu Herpes simplex (Wigler, Celí, 11, 223, 1977), hypoxantín-guanín fosforibosyltransferázy (Szybalska, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 48, 2026, 1962) a adenínfosforibosyltransferázy (Lowy, Celí, 22, 817, 1980) v kt-, hgprt- alebo aprtbunkách, v danom poradí bez toho, aby tento výpočet bol obmedzujúci. Tiež môže byť používaná rezistencia k antimetabolitu, ako základ selekcie s dhfr, ktorý prepožičiava rezistenciu na metotrexát (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3567, 1980, O Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527, 198), gpt, ktorý prepožičiava rezistenciu na kyselinu mykofenolovú (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072, 1981), neo, ktorý prepožičiava rezistenciu na aminoglykozid G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol., 150, 1, 1981), hygro, ktorý prepožičiava rezistenciu na hygromycín (Santerre, Gene, 30, 147, 1984), alebo puromycín (pat, puromycín N-acetyltransferáza). Boli opísané ďalšie gény na selekciu, napríklad trpB, ktorý umožňuje bunkám využívať indol namiesto tryptofánu, hisD, ktorý umožňuje bunkám zúžitkovať histinol namiesto histidínu (Hartman, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 85, 8047, 1988), a ODC (omitíndekarboxyláza), ktorá prepožičiava rezistenciu a inhibítor omitíndekarboxylázy, 2-(difluórometyl)-DL-omitín, DFMO (McCologue, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., 1987).

V ďalšom uskutočnení sa predkladaný vynález týka diagnostického prípravku obsahujúceho ktorýkoľvek z opísaných polypeptidov, polynukleotidov alebo vektorov podľa vynálezu a voliteľných vhodných prostriedkov na detekciu.

Polypeptidy podľa vynálezu sú tiež vhodné na použitie v imunotestoch, v ktorých môžu byť použité v tekutej fáze alebo naviazané na pevný nosič. Príklady imunotestov, ktoré môžu používať polypeptid podľa vynálezu, sú kompetitívne a nekompetitivne imunotesty buď priame alebo nepriame. Príklady takýchto imunotestov sú rádioimunostest (RIA), sendvičový test (imunometrický test) a testovanie pomocou westemového prenosu (westem blot).

Polypeptidy podľa vynálezu môžu byť viazané na mnohé rôzne nosiče a použité na izoláciu buniek špecificky naviazaných na uvedené polypeptidy. Príklady známych nosičov zahrnujú sklo, polystyrén, polyvinylchlorid, polypropylén, polyetylén, polykarbonát, dextrán, nylon, amylózy, prirodzenú a modifikovanú celulózu, koloidné kovy, polyakrylamidy, agarózu a magnetit. Na účely vynálezu môže byť nosič buď rozpustný alebo nerozpustný.

Odborníkovi je známych mnoho rôznych značiek a metód značenia. Príklady značiek, ktoré môžu byť použité v predkladanom vynáleze, zahrnujú enzýmy, rádioizotopy, koloidné kovy, fluorescenčné zlúčeniny, chemiluminiscenčné zlúčeniny a bioluminiscenčné zlúčeniny, pozri tiež uskutočnenie prejednané skôr.

Predkladaný vynález sa tiež týka použitia polypeptidu, polynukleotidu a vektoru podľa vynálezu opísaných na prípravu farmaceutického prípravku na liečenie malignít B lymfocytov, autoimunitných chorôb so vzťahom k B lymfocytom alebo deplecie B lymfocytov.

Nedávne klinické štúdie s presmerovanou cytotoxickou aktivitou ľudských T lymfocytov pomocou bišpecifických protilátok preukázali sľubné výsledky v liečení refraktémej Hodgkinovej choroby (33), karcinómu prsníka a vaječníkov (34-37) a malígneho gliomu (38). S danými faktmi:

-že bsc protilátky vďaka svojej nízkej molekulovej hmotnosti uľahčujú penetráciu do nádoru (ako bolo preukázané pre fragmenty Fab alebo Fv) (39), a

- že sa očakáva, že bsc protilátky znížia toxicitu závisiacu od dávky a dávku obmedzujúce, táto toxicita je spôsobená systémovým uvoľnením cytokínov sprostredkovaným Fc časťami obvyklých bišpecifických protilátok (40), a

- že dokonca intaktná monoklonálna protilátka (namierená proti CD20) viedla k regresii nádoru v pokročilých štádiách NHL (41,42), sa očakávalo - a skutočne bolo ukázané - že polypeptidy podľa vynálezu sú zaujímavé molekuly, ktoré prispievajú k ďalšiemu terapeutickému pokroku.

Vo výhodnom uskutočnení je teda farmaceutický prípravok podľa vynálezu používaný na liečenie non-Hodgkinových lymfómov.

Rozmedzie dávok pri podávaní polypeptidov, polynukleotidov a vektorov podľa vynálezu je dosť veľké, aby vyvolalo žiaduci účinok, pri ktorom sú zmiernené symptómy choroby so vzťahom k B lymfocytom. Dávkovanie by nemalo byť také veľké, aby spôsobilo podstatné nepriaznivé vedľajšie účinky, ako nežiaduce krížové reakcie, anafylaktické reakcie apod. Všeobecne, dávkovanie sa bude meniť podľa veku, stavu, pohlavia a štádia choroby pacienta a môže byť určené odborníkom. Ak nie je žiadna kontraindikácia, môže byť dávkovanie upravené jednotlivým lekárom. Predpokladá sa, že rozmedzie uvedenej dávky je stanovené napr. 0,01 pg až 10 mg polypeptidu podľa vynálezu. Obzvlášť výhodné dávkovanie je 0,1 pg až 1 mg, ešte výhodnejšie je 1 pg až 100 pg a najvýhodnejšie je dávkovanie 3 pg až 10 pg, ako je napr. ukázané v pripojenom príklade 7.

Okrem toho sa vynález týka spôsobu na rozpoznanie zlúčenín aktivujúcich alebo súčasne stimulujúcich T lymfocyt alebo na rozpoznanie inhibítorov aktivácie a stimulácie T lymfocytu, spôsob zahrnuje:

(a) pestovanie CD 19 pozitívnych buniek (výhodne B lymfocytov) a T lymfocytov v prítomnosti polypeptidu podľa vynálezu a, voliteľne, v prítomnosti zložky schopnej poskytnúť detegovateľný signál ako odpoveď na aktiváciu T lymfocytu testovanú zlúčeninou v podmienkach umožňujúcich interakciu zlúčeniny s bunkami, a (b) detekciu prítomného alebo neprítomného signálu vznikajúceho interakciou zlúčeniny s bunkami.

Toto uskutočnenie je obzvlášť užitočné na testovanie kapacity zlúčenín ako súčasne stimulujúcich molekúl. V tomto spôsobe CD 19 pozitívna bunka/B lymfocyt poskytne primárny aktivačný signál pre T lymfocyty, preto sa vyhne klonotypovému receptoru T lymfocytu. Potom môže byť podľa vynálezu určené, ktorá testovaná zlúčenina je ešte potrebná na skutočnú aktiváciu T lymfocytu. V spôsobe podľa vynálezu CD 19 pozitívna bunka/B lymfocyt pôsobí ako stimulačná bunka, ktorá spôsobuje bišpecifické molekuly, ktoré sú viazané k D3 komplexom na povrchu rovnakého T lymfocytu. Biologické spôsoby na pestovanie, detekciu a voliteľne i testovanie sú odborníkovi jasné.

Termín „zlúčenina“ v spôsobe podľa vynálezu zahŕňa jednu látku alebo veľké množstvo látok, ktoré môžu alebo nemusia byť totožné.

Uvedená zlúčenina(y) môže byť napríklad obsiahnutá vo vzorkách napr. bunkových extraktov z napr. rastlín, zvierat alebo mikroorganizmov. Okrem toho uvedené zlúčeniny môžu byť v odbore známe, ale až dosiaľ nebolo zrejmé, že sú schopné inhibovať aktiváciu T lymfocytu alebo že sú použiteľné ako súčasne stimulujúci faktor T lymfocytu. Mnoho zlúčenín môže byť napr. pridané do kultivačného média alebo vstreknuté do bunky. Ak vzorka obsahujúca zlúčeninu(y) je identifikovaná spôsobom podľa vynálezu, potom je buď možné izolovať zlúčeninu z pôvodnej vzorky, keď je určené, že obsahuje príslušnú zlúčeninu alebo pôvodnú vzorku môže byť ďalej rozdelená, napríklad ak sa skladá z veľkého množstva rôznych zlúčenín, aby sa zredukoval počet rôznych látok vo vzorke a spôsob sa ďalej opakuje s časťami pôvodnej vzorky. Pomocou metód v odbore známych ako napríklad opísaných tu a v pripojených príkladoch môže byť potom určené, či uvedená vzorka alebo zlúčenina prejavujú požadované vlastnosti. V závislosti od zložitosti vzoriek môžu byť opísané kroky uskutočnené niekoľkokrát, výhodne až dokiaľ vzorka určovaná spôsobom podľa vynálezu obsahuje iba obmedzený počet látok alebo iba jednu látku. Uvedená vzorka výhodne zahŕňa látky podobných chemických a/alebo fyzikálnych vlastností a najvýhodnejšie sú uvedené látky totožné. Spôsoby podľa predkladaného vynálezu môžu byť celkom dobre uskutočňované a navrhnuté odborníkom napríklad v zhode s inými testami založenými na bunkách, ktoré sú opísané v stave techniky alebo použitím a modifikáciou metód, ako je opísané v pripojených príkladoch. Okrem toho odborník hneď pozná, ktoré ďalšie zlúčeniny a/alebo bunky môžu byť použité na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu, napríklad interleukíny alebo enzýmy, ak to bude nevyhnutné, ktoré konvertujú určitú zlúčeninu na prekurzor, ktorý ďalej stimuluje alebo potlačuje aktiváciu T lymfocytu. Takéto adaptácie spôsobu podľa vynálezu sú v schopnostiach odborníka a môžu byť uskutočňované bez nadbytočného experimentovania.

Zlúčeniny, ktoré môžu byť použité v zhode so spôsobom podľa predkladaného vynálezu, zahrnujú peptidy, proteíny, nukleové kyseliny, protilátky, malé organické molekuly, ligandy, peptidomimetiká, PNA apod. uvedené zlúčeniny môžu tiež byť funkčnými derivátmi alebo analógmi známych aktivátorov alebo inhibítorov T lymfocytov. Spôsoby prípravy chemických derivátov a analógov sú odborníkovi dobre známe a sú opísané napríklad autorom Beilsteinom (Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA). Okrem toho uvedené deriváty a analógy môžu byť testované na svoje pôsobenie podľa spôsobov v odbore známych alebo ako je opísané napríklad v pripojených príkladoch. Mimo toho môžu byť použité peptidomimetiká a/alebo počítačom navrhnuté vhodné aktivátory alebo inhibítory aktivácie T lymfocytu napríklad podľa spôsobov opísaných neskôr. Môžu byť použité vhodné počítačové programy na identifikáciu interaktívnych miest predpokladaného inhibítora a antigénu podľa vynálezu pri vyhľadávaní komplementárnych štrukturálnych motívov prostredníctvom počítača (Fassina, Immunomethods, 5, 114-120, 1994). Ďalšie vhodné počítačové systémy na návrhy proteínov a peptidov pomocou počítača sú písané v stave techniky napríklad autormi Berry (Biochem. Soc. Trans., 22, 1033-1036, 1994), Wodak (Ann. N.Y.Acad. Sci., 501, 1-13, 1987), Pabo (Biochemistry, 25 5987-5991, 1986). Výsledky získané z opísaných počítačových analýz môžu byť použité v kombinácii so spôsobom podľa vynálezu na napr. optimalizáciu známych aktivátorov alebo inhibítorov T lymfocytov. Vhodné peptidomimetiká môžu tiež byť identifikované syntézou peptidomimetických kombinatorických súborov prostredníctvom postupnej chemickej modifikácie a testovania výsledných zlúčenín napr. podľa metódy opísanej na tomto mieste a v pripojených príkladoch. Spôsoby na tvorenie a použitie peptidomimetických kombinátorických súborov sú opísané v stave techniky napríklad autormi Ostreshom (Methods In Enzymology, 267, 220-234, 1996) a Domerom (Bioorg. Med. Chem., 4, 709-715, 1996). Okrem toho trojrozmerné a/alebo kryštalografické štruktúry inhibítorov alebo aktivátorov interakcie B lymfocyt/T lymfocyt môžu byť použité na návrh peptidomimetických inhibítorov alebo aktivátorov aktivácie T lymfocytu, ktoré sú testované spôsobom podľa vynálezu (Rose, Biochemistry, 35, 12933-12944, 1996, Rutenber, Bioorg. Med. Chem., 4,1545-1558,1996).

Stručne povedané, predkladaný vynález poskytuje spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré sú schopné modulovať imunitné reakcie sprostredkované B lymfocytom/T lymfocytom.

Zlúčeniny, v ktorých je zistené, že aktivujú reakcie sprostredkované B lymfocytom/T lymfocytom, môžu byť použité na liečenie karcinómov a príbuzných ochorení. Navyše môže byť tiež možné špecificky inhibovať vírusové choroby, a tým zabrániť vírusovej infekcii alebo šíreniu vírusu. Zlúčeniny identifikované ako supresory aktivácie alebo stimulácie T lymfocytu môžu byť použité pri orgánovej transplantácii, aby zabránili rejekcii štepu, pozri tiež skôr.

Je preto očakávané, že zlúčeniny identifikované alebo získané spôsobom podľa predkladaného vynálezu budú veľmi užitočné na diagnostiku a predovšetkým na liečebné aplikácie. Preto sa v ďalšom uskutočnení vynález týka spôsobu produkcie farmaceutického prípravku obsahujúceho formuláciu zlúčenín identifikovaných v kroku (b) opísaného spôsobu podľa vynálezu vo farmaceutický prijateľnej forme. Okrem toho sa predpokladá, že uvedená zložka môže byť modifikovaná pomocou peptidomimetiká. Spôsoby tvorenia a použitia peptidomimetických kombinátorických súborov sú opísané v stave techniky napríklad autormi Ostreshom (Methods in Enzymology, 267, 210-234, 1996), Domerom (Bioorg. Med. Chem., 4, 709-715, 1996), Beeleym (Trends Biotechnol., 12, 213-216,1994) alebo al-Obeidim (Mol. Biotech., 9, 205-223,1998).

Liečebne použiteľné zlúčeniny identifikované spôsobom podľa vynálezu môžu byť pacientovi podávané prostredníctvom akéhokoľvek vhodného spôsobu pre konkrétnu zlúčeninu napr. perorálne, intravenózne, parenterálne, trandermálne, cez sliznice alebo pomocou chirurgického zákroku alebo implantátu (napr. zlúčenina je vo forme pevnej alebo polotuhej biologicky kompatibilnej a resorbovateľnej matrix) v mieste, kde je žiaduce pôsobenie zlúčeniny alebo blízko tohto miesta. Príslušné liečebné dávky sú určené odborníkom, pozri skôr.

Okrem toho predkladaný vynález poskytuje spôsob liečenia malignít B lymfocytov, autoimunitných chorôb so vzťahom k B lymfocytom alebo deplécie B lymfocytov a/alebo spôsob odďaľujúci patologický stav, ktorý je vyvolaný poruchami B lymfocytov. Tento spôsob zahrnuje zavedenie polypeptidu, polynukleotidu alebo vektora podľa vynálezu do cicavca postihnutého uvedenou malignitou, chorobou a/alebo patologickým stavom. Okrem toho je výhodné, že uvedený cicavec je človek.

Toto a ďalšie uskutočnenia sú opísané a obsiahnuté v opise a príkladoch predkladaného vynálezu. Ďalšia literatúra týkajúca sa akejkoľvek protilátky, spôsobu, použitia a zlúčenín na použitie podľa predkladaného vynálezu, môže byť vyhľadaná vo verejných knihovniach a databázach, s použitím napríklad elektronických zariadení. Napríklad môže byť využitá verejná databáza „Medline“, ktorá je dosiahnuteľná na internete napríklad pod adresou:

http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ PubMed/medline.html.

Ďalšie databázy a adresy, ako napríklad:

http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/, http: //www.infobiogen.fr/, http: //www.fmi.ch/biology/resear_tools.html, http: //www.tigr.org/, sú odborníkom známe a môžu tiež byť získané použitím napr.

http: //www.lycos.com.

Prehľad patentových informácií v biotechnológii a prehľad dôležitých zdrojov patentových informácii použiteľných na retrospektívne hľadanie a na prehľad o súčasných znalostiach je podaný v práci autora Berksa(TIBTECH, 12, 352-364, 1994).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: SDS-PAGE: farbenie Coomassie modrou purifikovaného bscCD19xCD3 fragmentu s rôznymi množstvami proteínu. Molekulová hmotnosť (kD) štandardu je vyznačená naľavo.

Obrázok 2: FACS-analýza s bscCD19xCD3 (200 pg/ml) v rôznych CD19-pozitívnych B bunkových líniách (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), v CD19-negatívnej B bunkovej línii BL60 a s CD3-pozitívnymi bunkami Jurkat a primárnymi ľudskými PBMC. Prerušované čiary označujú negatívne kontroly.

Obrázok 3: Cytotoxicita bscCD19xCD3 v teste uvoľňovania ⁵¹Cr s nestimulovanými ľudskými PBMC a rôznymi B bunkovými líniami. Pomer efektor : cieľová bunka (pomer E : T) bol 10 : 1, doba inkubácie 4 hodiny. Smerodajná odchýlka vo všetkých troch opakovaniach bola pod 7 %.

Obrázok 4: Test cytotoxicity pomocou uvoľňovania chrómu s nestimulovanými primárnymi ľudskými PBL proti plazmacytomovým bunkovým líniám L363 a NCI a lymfómovej bunkovej línii Daudi, pomer E ; T 20 : 1, doba inkubácie 8 hodín.

Obrázok 5: Inhibícia cytotoxicity bscCD19xCD3 základná anti-CD19 protilátkou v teste uvoľňovania chrómu, doba inkubácie 8 hodín, pomer E : T 20 : 1, koncentrácia bscCD19xCD3 1 ng/ml.

Obrázok 6: Test cytotoxicity s nestimulovanými PBMC proti bunkám Daudi po pridávaní stúpajúceho množstva EGTA, pomer E : T 10 : 1, doba inkubácie 4 hodiny.

Obrázok 7: cytotoxicita bscCD19xCD3 v teste uvoľňovania ^3lCr s nestimulovanými ľudskými PBMC a bunkami Blin-1 ako cieľovými bunkami pri rôznych pomeroch E : T, doba inkubácie 4 hodiny, koncentrácia konvenčnej bišpecifickej protilátky 3 pg/ml, koncentrácia bsc 17-lAxCD3 100 ng/ml, E : T pomer, ako je uvedené.

Obrázok 8: DNA sekvencia a proteínová sekvencia bscCD19xCD3 protilátky (variant obsahujúci značku FLAG). Čísla udávajú pozície nukleotidov (nt), zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia je zobrazená pod nukleotidovou sekvenciou. DNA sekvencia kódujúca bišpecifickú protilátku začína v pozícii 1 a končí v pozícii 1593. Prvých šesť nt (pozícia -10 až -5) a posledných šesť nt (pozícii 1596 až 1601) obsahuje štiepne miesta reštrikčných enzýmov EcoRI a Sali, v tomto poradí. Nukleotidy 1 až 57 špecifikujú vedúcu sekvenciu, nukleotidy 82 až 414 a 460 až 831 kódujú V_LCD19 a VhCD19, v tomto poradí, nukleotidy 847 až 1203 a 1258 až 1575 kódujú V_HCD3 a V_LCD3, v tomto poradí, a nukleotidy 1576 až 1593 kódujú značku His.

Obrázok 9: Deplecia primárnych (malígnych) CD 19+ B lymfocytov odvádzaním autológnych primárnych T lymfocytov prostredníctvom bscCD19xCD3.

A) východiskový-bod (t = 0): n = 3 x 10⁶ PBL/jamku bolo vysiate na 24 -jamkovú tkanivovú kultivačnú misku v objeme 1 ml média RPMI 1640, doplnené 10 % FCS. Je ukázané počiatočné percento CD19⁺ B lymfocytov, ako i CD4⁺- a CD8⁺ T lymfocytov.

B-G) relatívne počty B a CD4⁺- a CD8⁺ T lymfocytov po t = 5 dňoch inkubácie v 37 °C/5 % CO₂ v neprítomnosti (B-C) alebo prítomnosti (D-G) bscCD19xCD3 (koncentrácie sú ukázané) so 60 U/ml IL-2 alebo bez neho. Negatívne kontroly obsahovali buď bišpecifickú jednoreťazcovú protilátku (17-lAxCD3) s irelevantnou špecifičnosťou pre cieľovú bunku, alebo neobsahovali žiadnu bišpecifickú protilátku (C).

Obrázok 10: Purifikačné kroky pre bscCD19xCD3.

Obrázok 11: SDS-PAGE analýza čistoty bscCD19xCD3. Je ukázaný SDS-polyakrylamidový gél s 4-12 % gradientom zafarbený koloidný Coomassie modrou. Dráhy 1 a 6, štandardy molekulovej veľkosti, dráha 2, supematant bunkovej kultúry, dráha 3, aktívna frakcia z katiónovej výmennej chromatografie, dráha 4, aktívna frakcia z afinitnej chromatografie s chelátmi kobaltu, dráha 5, aktívna frakcia z gélovej filtrácie. Bolo analyzované rovnaké množstvo proteínu (2 pg) zo supematantu bunkovej kultúry a rôzne frakcie z kolón. Veľkosť štandardov molekulovej hmotnosti v kD je ukázaná napravo. Šípka ukazuje pozície bscCD19xCD3.

Obrázok 12: Kafiónová výmenná chromatografia bscCD19xCD3. Koncentrácia proteínu bola meraná pomocou absorpcie v 280 nm (mAU, vľavo). Elučný profil proteínu je ukázaný plnou čiarou. Profil stupňovitého gradientu NaCl je vyznačený priamou plnou čiarou (% B, vpravo) a zobrané frakcie sú označené prerušovanými čiarami. bscCD19xCD3 bola detegovaná vo frakcii F6.

Obrázok 13: Afinitná chromatografia s chelátmi kobaltu bscCD19xCD3. Koncentrácia proteínu bola meraná pomocou absorpcie v 280 nm (mAU, vľavo). Elučny profil proteínu je ukázaný plnou čiarou. Imidazolový gradient je vyznačený priamou plnou čiarou (% B, vpravo) a zobrané frakcie sú označené prerušovanými čiarami. bscCD19xCD3 bola detegovaná vo frakcii F7.

Obrázok 14: Gélová filtrácia anti-CD19XANTI-CD3. Koncentrácia proteínu bola meraná pomocou absorpcie v 280 nm (mAU, vľavo). Elučný profil proteínu je ukázaný plnou čiarou. Prerušované čiary označujú zobrané frakcie. bscCD19xCD3 bola nájdená vo frakcii F7 zodpovedajúce molekulové veľkosti približne 60 kD.

Obrázok 15: Hladiny gamaglutamyltransferázy (GGT) v krvi ako reakcie na ošetrenie s bscCD19xCD3. GGT hodnoty boli určené štandardnou klinickou biochemickou metódou a sú vyjadrené v jednotkách^. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach lieku, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 16: Ultrazvukové meranie sleziny pacienta A-B.

A: Určenie veľkosti sleziny datovanej 12. apríla, 1999, pred liečbou bscCD19xCD3. Obrázok ukazuje zväčšenú slezinu (veľkosť 146 mm x 69,2 mm), čo je zavinené infiltráciou malígnymi B lymfocytmi.

B: Určenie veľkosti sleziny datovanej 16. apríla, 1999, po liečbe 3 pg 14. apríla, nasledovanými 10 pg

15.apríla. Obrázok ukazuje zmenšovanie sleziny na veľkosť 132 mm x 58,9 mm spôsobené systémovou liečbou s bscCD19xCD3. Nezrovnalosti jednotlivých meraní veľkosti ukázaných v tabuľke 1 sú vysvetlené určovaním veľkosti orgánu v rôznych priestorových rovinách na základe ultrazvukového vyšetrenia. Tieto dva rozmery sú označené (+) a (x).

Obrázok 17: Počty leukocytov v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. Počet leukocytov je uvedený v 10⁹/liter. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodnoty (h) po jednotlivých ďalších podaniach lieku, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 18: Hladiny C-reaktívneho proteínu (CRP) v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. CRP hodnoty boli určené štandardnou klinickou biochemickou metódou a sú vyjadrené v mg/dl. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach lieku, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 19: Hladiny nádorového nekrotického faktora-alfa (TNF) v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. TNF hodnoty boli určené pomocou testu ELISA a sú vyjadrené v ng/ml. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach lieku, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 20: Hladiny interleukínu-6 (IL-6) v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. IL-6 hodnoty boli určené pomocou testu ELISA a sú vyjadrené v pg/ml. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 21: Hladiny interleukínu-8 (IL-8) v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. IL-8 hodnoty boli určené pomocou testu ELISA a sú vyjadrené v pg/ml. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach, začínajúc. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Obrázok 22: hladiny alfa reťazca rozpustného receptoru interleukínu-2 (IL-2R) v krvi ako odpoveď na liečbu s bscCD19xCD3. IL-2R hodnoty boli určené pomocou testu ELISA a sú vyjadrené v jednotkách/ml. Časová os ukazuje dni (d) od začiatku prvého podania lieku a hodiny (h) po jednotlivých ďalších podaniach, začínajúc nulou. Šípky označujú časové body podávania lieku.

Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný a vysvetlený prostredníctvom nasledujúcich biologických príkladov, ktoré sú iba ilustrujúce a rozsah predkladaného vynálezu nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie variabilných (V) imunoglobulínových domén

Domény V ľahkého reťazca (VL) a V ťažkého reťazca (VH) z hybridomu HD37 (22) boli klonované podľa štandardnej PCR (polymerázová reťazová reakcia) metódy (23). cDNA syntéza bola uskutočnená s oligo-dT priméry a Taq polymerázou.

Zoznam primérov

5'L1:

GAAGCACGCGTAGATATCKTGM*TSACCCAA [sekvencia id. č. 1]

3'K:

GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [sekvencia id. č. 2]

5Ή1:

CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAG [sekvencia id. č. 3]

3'G:

ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGG [sekvencia id. č. 4]

5'VLB5RRV:

AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAG [sekvencia id. č. 5]

3'VLGS15:

GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTT [sekvencia id. č. 6]

5' VHGS15:

GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAG

SAGTCWGG[sekvencia id. č. 7]

3'VHBspEl:

AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCT [sekvencia id. č. 8]

Na amplifikáciu V domén prostredníctvom PCR boli použité priméry 5'L1 a 3'K, ohraničujúce doménu V_L, a 5 Ή1 a 3 'G pre ťažký reťazec založený na priméroch opísaných Díibel et al. (24).

CDNA anti-CD3 scFv fragmentu láskovo poskytol A. Traunecker (25).

Príklad 2

Konštrukcie bišpecifických jednoreťazcových fragmentov a eukaryotická expresia

Aby bol získaný anti-CD19 scFv-fragment, zodpovedajúce VL-a VH-oblasti klonované do samostatných plazmidových vektorov slúžili ako templáty pre VL- a VH-špecifickú PCR používajúcu páry oligonukleotidových primcrov R'VLB5RRV/3'VLGS15 a 5'VHGS15/'3'VHBspEI, v tomto poradí. Tým boli vložené prekrývajúce sa komplementárne sekvencie do PCR produktov, ktoré boli spojené za vzniku kódujúcej sekvencie 15-aminokyselinovej (Gly₄Seri)₃ spojky počas nasledujúcej fúznej PCR. Tento amplifikačný krok bol uskutočnený s párom pnmérov 5’dVLB5RRV/3'VHBspEI a výsledný fuzny produkt (alebo skôr anti-CD19 scFv-fragment) bol štiepený reštrikčnými enzýmami EcoRV a BspEI, a tak klonovaný do vektora BluescriptKS- (Stratagene) obsahujúceho buď (EcoRI/Sall-klónovanou) kódujúcu sekvenciu anti-17-lA/anti-CD3 bišpecifickej jednoreťazcovej protilátky s N-koncovou značkou FLAG [1], alebo sekvenciu modifikovanej verzie bez epitopu FLAG (21), čím bola nahradená anti-17-1 A-špecifičnosť špecifičnosťou anti-CD19 a zachovaná 5 aminokyselinová (Gly₄Ser,), spojka spájajúca C-koncový anti-CD3 scFv fragment, v danom poradí. Potom boli DNA fragmenty kódujúce obe verzie anti-CD19/anti-CD3 bišpecifických jednoreťazcových protilátok s usporiadaním domény VL_cd19-VHcdi9-VH_CD3-VL_Cd3 subklonované EcoRI/Sall do opísaného expresného vektora pEF-DHRF [1], podľa poradia. Výsledné plazmidové DNA boli transfekované do DHFR-deficitných CHO Iymfocytov pomocou elektroporácie: selekcia, génová amplifikácia a produkcia proteínu bola uskutočňovaná, ako je opísané [1], V nasledujúcich príkladoch sú vysvetlené výsledky získané s verziou bscCD19xCD3 obsahujúce FLAG.

Purifikácia bscCD19xCD3 zo supematantu transfekovaných CHO buniek poskytla 4 mg na liter tkanivového supematantu. Bsc-Ab bola purifikovaná prostredníctvom svojej C-koncovej histidinovej značky pomocou afinitnej chromatografie na kolóne Ni-NTA, ako je opísané [1], Bsc-Ab bola eluovaná z kolóny Ni-NTA ako zreteľný vrchol pri imidazole v 200 mM koncentrácii. SDS-PAGE bola uskutočňovaná podľa Laemmli (26) s 12 % gélom, a potom nasledovalo farbenie Coomassie briliantovou modrou R250 na analýzu purifikácie bsc-Ab. Výsledky analýzy SDS-PAGE (obr. 1) ukazujú predpokladanú veľkosť bsc-Ab (60 kD).

Príklad 3

Väzbové vlastnosti bsc-AbCD19xCD3

Väzbové špecifičnosti bsc-Ab pre CD3 a CD 19 boli preukázané pomocou analýzy prietokovou cytometriou na CD3-pozitívnych bunkách Jurkat, ľudských PBMC a niekoľko rôznych CD19-pozitívnych bunkových líniách lymfómov z B Iymfocytov, vrátane Blin I, SKW6.4, Daudi, BJAB a Raji. CD19-pozitívne B bunkové línie Daudi, Raji, BJAB (Burkittov lymfóm), SKW6.4 (ľudské B lymfocyty transformované EBV) a Blin-1 (línie pre -BIymfocytov) boli použité na analýzu prietokovou cytometriou a testy uvoľňovania chrómu. Jurkat je CE3-pozitívna bunková línia T Iymfocytov, BL60 a plazmocytomové bunkové línie NCI a L363 sú negatívne na obe povrchové molekuly, CD3 a CD 19. Bunkové línie boli pestované v kompetnom RPMI 1640 (Biochróm) s 10 % FCS (GIBCO).

x 10⁶ buniek bolo premytých PBS, resuspendovaných v 200 μΐ PBS s 10 % Vemimmun (Centeon, Marburg, Nemecko) a 0,1 % NaN₃ a inkubované 30 minút v 4 °C. Po centrifúgácii (100 x g, 5 minút) boli bunky inkubované v 50 μΐ bscCD19xCD3 (200 μΐ/ml v PBS s 10 % Venimmun a 0,1 % NaN₃) 30 minút v 4 °C. Bunky boli dvakrát premyté PBS. Na detekciu bsc-Ab bola použitá protilátka proti značke His (Dianova) konjugovaná s FITC. Ako negatívne kontroly slúžili irelevantná bsc-Abl7-lAxCD3, produkovaná pomocou rovnakého expresného systému ako bscCD19xCD3, alebo protilátka proti samotnej značke His. Prietoková cytometria bola uskutočňovaná na prístroji Becton Dickinson FACScan. V bunkách BL60, ktoré neexprimujú ani CD 19, ani CD3, nebola zistená žiadna väzba (obr. 2).

Príklad 4

Cytotoxická aktivita bsc-AbCD 19xCD3 proti CD19-pozitívnym lymfómovým bunkám

V teste uvoľňovania ⁵¹Cr sa ukázalo, že protilátka bscCD19xCD3 je vysoko cytotoxická pre niektoré lymfómové bunkové línie (obrázok 3). Ľudské mononukleáme bunky periférnej krvi (PBMC) ako efektorové bunky, boli izolované z čerstvo zrazených leukocytov („buffy coat“) náhodných darcov gradientovou centrifugáciou s použitím Lymphoprep™ (Nycomed) s nasledujúcou centrifugáciou 100 x g na odstránenie trombocytov. CD 19-pozitívne B lymfocyty boli odčerpané použitím Dynabeads® M-450 CD19 (Dynal). Ochudobnené bunkové populácie boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie (Becton Dickinson), ktorá ukázala 99 % depleciu CD19-pozitívnych buniek. PBMC boli inkubované cez noc v 37 °C, 5 % CO₂, ako cieľové bunky boli použité CD19-pozitívne B bunkové línie (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4).

Cytotoxicita bola meraná v štandardnom teste uvoľňovania chrómu na 96-jamkových doštičkách s guľatým dnom (Nunc) s použitím kompletného média RPMI 1640 (Biochrom) s 10 % FCS (GIBCO).

Nestimulované PBMC boli pridané v objeme 80 μΐ média do každej jamky obsahujúcej 20 μΐ bsc-Ab v rôznych koncentráciách. Potom bolo pridané 100 pl cieľových buniek (1 x 10⁴) značených ⁵¹Cr, doštičky boli stočené 3 minúty v 100 x g a inkubované 4 hodiny v 37 °C, 5 % CO₂. Po ďalšej centrifugácii bolo odstránené 50 μΐ supematantu a testované na uvoľnený ⁵¹Cr v počítači gama impulzov (TopCount, Canberra Packard).

Spontánne uvoľňovanie bolo merané pomocou inkubácie cieľových buniek bez efektorových buniek alebo protilátok a maximálne uvoľňovanie bolo určované pomocou inkubácie cieľových buniek s 10 % TritonX100. Inkubácia cieľových buniek bez efektorových buniek nemala za následok merateľnú lýzu buniek. Percento špecifickej lýzy bolo vypočítané takto: nešpecifické uvoľňovanie (%)=[(cpm, experimentálne uvoľňovanie) - (cpm, spontánne uvoľňovanie)] / [(cpm, maximálne uvoľňovanie) - (cpm, spontánne uvoľňovanie)] x 100. Všetky pokusy boli uskutočňované v troch opakovaniach (triplikátoch). SD medzi triplikátmi bola vo všetkých experimentoch pod 6 %. Ab boli priblížené podmienky in vivo použili pôvodcovia vynálezu ako efektorové bunky nestimulované PBMC od zdravých darcov. Rýchla indukcia cytotoxicity počas 4 hodín bola pozorovaná bez žiadnej predbežnej stimulácie T lymfocytov. Kontrolná bsc-protilátka s odlišnou nádorovou špecifičnosťou (bscl7-lAxCD3), ale vytváraná rovnakým systémom ako protilátka bscCD19xCD3, vykázala lyzačnú aktivitu nevýznamné vyššiu než médium ako pozadie. Okrem toho nebola pozorovaná žiadna cytotoxická aktivita pri použití plazmocytomových bunkových línií NCI a L363, ktoré neexprimujú DC19 ako cieľových buniek (obrázok 4). V kompetitívnych testoch používajúcich stúpajúce množstvo CD 19-špecifickej základnej monoklonálnej protilátky HD37 bola cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 takmer úplne blokovaná (obrázok 5). Tieto kontroly ukázali, že cytotoxický účinok sprostredkovaný bscCD19xCD3 je antigén-špecifický. Na získanie viac informácií o molekulárnom mechanizme, ktorým bscCD19xCD3 protilátka ničí CD19-pozitívne cieľové bunky, skúšali pôvodcovia vynálezu blokovať cytotoxicita sprostredkovanú bscCD19xCD3 prostredníctvom EGTA. Ako je ukázané na obrázku 6, cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 môže byť úplne zablokovaná prostredníctvom EGTA, čo ukazuje, že špecifická lýza je skôr účinok sprostredkovaný T lymfocytmi (pravdepodobne cez metabolickú dráhu perforínu) ako priame pôsobenie protilátky samej (napr. indukcia apoptózy).

Pri použití nestimulovaných T lymfocytov bol pozorovaný významný cytotoxický účinok proti bunkám Blin I dokonca pri koncentráciách protilátky pod 1 ng/ml (obrázok 7). Dokonca pri pomerne nízkom pomere E : T (5 : 1, 2,5 : 1) a pri veľmi nízkej koncentrácii protilátky 10 až 100 pg/ml, protilátka bscCD19xCD3 rýchle indukovala špecifickú cytotoxická aktivita nestimulovaných T lymfocytov (obrázok 7). Na rozdiel od toho, konvečná bišpecifická protilátka CD19XCD3 vytvorená pomocou techniky hybridu-hybridomu (5-7, 27) nevykázala v týchto podmienkach významnú cytotoxickú aktivitu ani pri koncentráciách až 3000 ng/ml (obrázok 7). Táto konvenčná bišpecifická protilátka vyžadovala ďalšiu predbežnú stimuláciu T lymfocytov a vysoké koncentrácie protilátok približne 100 ng/ml, aby indukovala cytotoxicitu špecifickú pre T lymfocyty (neukázané), čo je v súhlase s literatúrou (5-7, 27).

Príklad 5

Deplecia primárnych (malígnych) B lymfocytov prostredníctvom autológnych T lymfocytov cez cytotoxickú aktivita bscCD19xCD3

Aby sa určila cytotoxická aktivita bscCD19xCD3 na primáme malígne B lymfocyty, mononukleáme bunky periférnej krvi (PBMC) pacienta chorého na B CLL (chronická lymfatická leukémia typu B) boli izolované pomocou centrifugácie na hustotnom gradiente Ficollu. Tieto bunky boli nepretržite pestované v prítomnosti alebo neprítomnosti bscCD19xCD3 počas 5 dní v 37 °C/5 % CO₂ v médiu RPMI 1640 doplnenom 10 % FCS a, voliteľne, 60 U/ml IL-2. Analýza prietokovou cytometriou odhalila, že lymfocyty periférnej krvi (PBL) tohto konkrétneho pacienta (ktorý bol neskôr systémovo liečený s bscCD19xCD3, pozri príklad 7) s NIIL (non-Hodgkinov lymfóm) obsahovali 92,6 % CD 19-pozitívnych B lymfocytov (=cieľové bunky) a 7,4 % CD3-pozitívnych T lymfocytov (=efektorové bunky pri pomere T lymfocytov CD4/CD8 2,6 : 4,8. Prevažná väčšina týchto CE19-pozitivnych B lymfocytov sa skladala z malígnych buniek. Na 24-jamkovej tkanivovej kultivačnej doštičke bolo vysiate 3xl0⁶ PBL/ml na jamku v objeme 1 ml. Ako negatívne kontroly slúžilo kultivačné médium plus IL-2 a kultivačné médium plus IL-2 s irelevnatnou bišpecifickou jednoreťazcovou protilátkou bscl7-lAxCD3 (1) v koncentrácii 0,5 pg/ml alebo 0,05 pg/ml (buď v prítomnosti alebo neprítomnosti IL-2), boli zničené skoro všetky CD19-pozitívne B lymfocyty. Pestované bunky sa vtedy skladali prevažne z T lymfocytov s pomerom T lymfocytov CD4/CD8 asi 1 : 2 až 1 : 3. To ukázalo mimoriadnú cytotoxicitu bscCD19xCD3 pre CD 19-pozitívne B lymfocyty, pretože úplná deplecia primárnych B lymfocytov autológnymi T lymfocytmi bola indukovaná v koncentrácii iba 50 ng/ml pri veľmi nepriaznivom počiatočnom pomere efektorových a cieľových buniek (menej ako 1 : 10), dokonca bez ďalšej stimulácie T lymfocytov IL-2 alebo iným druhom stimulácie.

Príklad 6

Purifikácia bscCDl 9xCD3 na liečebné použitie bscCD19xCD3 bola produkovaná v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) trvalo transfekovaných expresným vektorom (pEF-DHFR, pozri príklad 2) kódujúcim bscCD19xCD3 a okrem toho hexahistidín a značku FLAG. Bunky boli pestované v médiu bez séra (Rencyte) v reaktore s dutými vláknami (Unisy). Päťsto ml supematantu bunkovej kultúry bolo odobrané a sterilizované filtráciou cez 0,2 pm filter (AcroCap, Pall Gelman).

bscCD19xCD3 bola detegovaná a kvantifikovaná pomocou westemového prenosu s použitím myšieho anti-FLAG IgG (Sigma) a kozieho anti-myšieho IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Sigma). Detekcia bola uskutočnená pomocou chemiluminiscencie s použitím systému BCIP/ NBT (Devitron). Koncentrácie proteínu boli určené pomocou Bradfordového testu (Biorad), s použitím bovinného IgG (Biorad) ako proteínového štandardu. Čistota frakcií z kolón bola hodnotená redukujúcou elektroforézou s dodeycylsulfátom sodným (SDS) Bis/Tris polyakrylamidovým gélom s gradientom 4-12 % (PAGE) používajúcou systém s MOPS pufrom (Novex).

Purifikácia bscCD19xCD3 do homogenity vyžaduje katiónovú výmennú chromatografiu, afinitnú chromatografiu s chelátmi kobaltu a, ako záverečný stupeň gélovú filtráciu. Tieto purifikačné kroky boli uskutočňované s použitím štandardných protokolov (pozri neskôr). Prúdová schéma purifikačného postupu je ukázaná na obrázku 10.

Katiónová výmenná chromatografia: Supematant bunkovej kultúry z CHO buniek bol zmiešaný s dvoma objemami pufra C (30 mM morfolínoetánsulfónová kyselina [MES], 20 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,3 mM benzamidínhydrochlorid, pH 5,5) a pustený cez 70 ml katiónovú výmennú kolónu SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) pri prietokovej rýchlosti 20 ml/minútu. Kolóna bola ekvilibrovaná pufrom A (20 mM MES, 20 mM NaCl, pH 5,8). Po premytí 5 objemami kolóny pufrom A bola bscCD19xCD3 eluovaná s gradientom 45 % pufra B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,8) v pufri A. Do eluátu bolo pridané 0,045 objemu IM Tris/HCL, pH 8,5, obsahujúceho 47 mM imidazolu a bol potom sterilovaný filtráciou (0,2 pm, AcroCap). Typický elučný profil katiónovej výmennej chromatografie je ukázaný na obrázku 12. bscCD19xCD3 bola obsiahnutá vo frakcii 6.

Afinitná chromatografia s chelátmi kobaltu: Eluát z katiónovej výmennej kolóny bol pustený pri prietokovej rýchlostí 2,5 ml/minútu cez 10 ml kolónu Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrovanú pufrom AO (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, pH 8,0). Kolóna bola vopred ekvilibrovaná s roztokom 0,1 M chloridu kobaltu. Po premytí s 33 objemami kolóny pufrom AO, pufrom A (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, 2mM imidazol, pH 6,4) a gradientom od 0 do 12 % pufra B (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 6,4) v pufri A, bola bscCD19xCD3 eluovaná v jednom kroku 30 ml 100 % pufra B. Eluát bol sterilizovaný filtráciou, po ktorej nasledovala približne 10 násobná koncentrácia v prístroji MacroSep (Pall Gelman, limit priepustnosti 10 kD). Typický elučný profil afinitnej chromatografie s chelátmi kobaltu je ukázaný na obrázku 13. bscCD19xCD3 bola detegovaná vo frakcii číslo 7.

Gélová filtrácia: Koncentrovaný eluát z kolóny na afinitnú chromatografiu s chelátmi kobaltu bol nanesený pri prietokovej rýchlosti 0,75 ml/minútu na 124 ml kolónu High Load Superdex 200 (Pharmacia, preparatívny stupeň) ekvilibrovanú fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátmi (Gibco). bscCD19xCD3 bola eluovaná vo frakcii s molekulovou veľkosťou zodpovedajúcou približne 55 kD (obrázok 14, frakcie číslo 7). Frakcia gélovej filtrácie obsahujúca bscCD19xCD3 bola doplnená 5 % ľudským sérový albumínom (Behring) a potom nasledovala sterilizácia filtráciou cez 0,1 pm filter (Millex, Millipore).

Veľké množstvo bscCD19xCD3 v supematante bunkovej kultúry a rôznych aktívnych frakciách z kolón, ako bolo analyzované pomocou SDS-PAGE, je ukázané na obrázku 11. bscCD19xCD3 bol hlavný proteínový pás detegovaný v supematantoch bunkových kultúr (dráha 2). Vysoko purifikovaný anti-CD19xanti-CD3, ktorý bol použitý na liečenie ľudí, nevykázal zistiteľné nečistoty (obr. 11, dráha 5).

Príklad 7

Klinické použitie bscCD19xCD3 u pacienta s lymfómom pochádzajúcim z lymfocytov B

Pri súcitnom použití bol pacient (A-B, žena, narodená 1937) trpiaci chronickou lymfatickou leukémiou typu B (B CLL) liečený bišpecifickou jednoreťazcovou protilátkou bscCD19xCD3.

Pacientova anamnéza a zdôvodnenie:

U pacienta bola diagnostikovaná B CLL v r. 1992. V dobe počiatočnej diagnózy choroba postihla rôzne oblasti lymfatických uzlín a slezinu okrem toho bola pozorovaná hemolytická anémia autoimunitného pôvodu a deficit imunoglobulínov. Pacient má struma nodosa, ktorá je dobre kontrolovaná a pacient je v eutyreoidnom stave vďaka liečeniu karbimazolom v dávke 2,5 mg/deň.

Pacient bol od r. 1992 do r. 1994 liečený mnohonásobnými chemoterapeutickými cyklami chlórambucilom a prednizónom. Po progresii choroby bola liečba zmenená na cyklofosfamid, doxorubicm, vinkristín a prednizón (CHOP, 8 cyklov) a bolo dosiahnutá remízia trvajúca dlhšie ako jeden rok. Po novom relapse pa cient dostal ďalších 6 cyklov CHOP, nasledovanými liečbou chlórambucilom a prednizónom a jednu kúru samotným chlórambucilom, ktorá nespôsobila ústup choroby. V decembri 1998 bolo uskutočnené ožiarenie sleziny, aby sa potlačila postupujúca splenomegalia pacienta. Pacient prekonal vážne zníženie aktivity kostnej drene s mnohými infekčnými komplikáciami. Pacientova anémia a trombocytopénia vyžadovala časté transfúzie červených krviniek a substitúciu doštičiek.

U tohto pacienta nebola indikovaná útočnejšia chemoterapia alebo liečba vysokými dávkami pre pokročilý stupeň choroby a zhoršenú funkciu kostnej drene. Liečenie s protilátkou anti-CD20 rituximabom nebolo vhodné, pretože účinnosť rituximabu u B CLL nebola dosiaľ jasne preukázaná.

Analýza FACS odhalila, že 95 % buniek periférnej krvi pacienta boli CD19-pozitívne bunky, zatiaľ čo 77 % buniek exprimovalo antigén CD20. Inkubácia buniek periférnej krvi pacienta s bscCD19xCD3 ukázala výraznú depléciu CD 19- pozitívnych B lymfocytov (pozri príklad 5). Preto lekári rozhodli liečiť pacienta s novou bscCD19xCD3 (súcitné použitie). Pacient bol podrobne informovaný o novosti zlúčeniny a o možnom riziku a úžitku tejto liečby. Pacient plne rozumel vysvetleniu a vyjadril písomne informovaný súhlas s týmto súcitným použitím.

Opis klinického podávania:

Pred začiatkom liečby pacient podstúpil klinické vyšetrenie a mnohé diagnostické procedúry, aby bol overený stupeň choroby a aby boli vylúčené akékoľvek ďalšie rizikové faktory. Pacient bol v dobrom klinickom stave, čo sa týka anémie, trombocytopénie a straty hmotnosti, ale bez akejkoľvek kardiovaskulárnej poruchy alebo iných komplikácii zabraňujúcich použitie bscCD19xCD3. Počas noci pred prvými dňami liečby mal pacient migrénu. Pri podávaní bscCD19xCD3 bol pacient hospitalizovaný na nemocničnom oddelení v podmienkach intenzívnej starostlivosti, aby bolo zaistené rýchle liečenie akejkoľvek náhlej príhody, ktorá by mohla nastať. Na prevenciu akútnej cytokínovej reakcie a komplikácií z lýzy nádorových buniek dostal pacient profylaktické i.v. dávky 2 mg klemastínu (Tavegil®) a 200 mg cimetidínu (Tagamet®), ako i 300 mg alopurinolu a 20 mg omeprazolu (Antra®).

V priebehu liečenia a obdobia ďalšieho sledovania bola uskutočnená alkalizácia a heparinizácia. Okrem toho pacient dostával všetku potrebnú symptomatickú liečbu.

Pred podávaním lieku a v priebehu liečenia boli odoberané vzorky krvi na sledovanie biochemických, hematologických a imunologických ukazovateľov.

Prvé podávanie bscCD19xCD3 (14. aprílal999):

Pacient dostal prvú dávku 3 pg bscCD19xCD3 ako 20 minútovú infúziu v izotonickom fosfátovom pufri obsahujúcom 5 % ľudský sérový albumín (HSA). Počas infúzie pacient nepociťoval žiadne nepriaznivé účinky. Približne 1 hodinu po infúzii mal pacient približne 5 minút trasľavky, po ktorej nasledovalo potenie, mierny pokles krvného tlaku o približne 10 mmHg a mierny vzostup telesnej teploty (+ 0,5 °C) počas niekoľkých hodín. Okrem toho sa nepatrne zhoršili bolesti hlavy. Pacient bol liečený ďalšími 2 mg Tavegilu® a 200 mg Tagametu®, 250 mg prednizolonu (Solu-Decoritn®) a 50 mg petidínu (Dolantin®). Všetky príznaky vymizli ten istý deň bez následkov.

Druhé podávanie bscCD19xCD3 (15.apríla 1999):

Druhá dávka 10 pg bscCD19xCD3 bola podaná deň neskôr za rovnakých podmienok. Približne 1 hodinu po infúzii mal pacient nápadnú trasľavku, horúčku (39,2 °C), miernu hyperventiláciu a hypotenznú reakciu. Pacient bol liečený 2 mg Tavegilu, 200 mg Tagametu a 300 mg Solu-Decortinu a 15 mg piritramidu (Dipidolor®). Na stabilizáciu kardiovaskulárnych funkcii dostal pacient infúziu dopamínu a objemovú substitúciu. Po tejto liečbe sa príznaky výrazne zmenšili. Predsa však bol pacient premiestnený cez noc na kardiologické oddelenie, aby bolo zaistené riadne sledovanie životných funkcií a v prípade nutnosti okamžitý zákrok. Druhý deň ráno bol pacient premiestnený na normálnu nemocničnú izbu bez ďalších komplikácií.

Počas ďalších 3 dní pacientovi pretrvávala subfebrilná teplota (približne 37,2 °C) a deň neskôr po druhej dávke sa objavil menší pleurálny výpotok (16. apríl 1999) a mierny edém dolných končatín (apríl 18. 1999). Kardiovaskulárna činnosť zostala stabilná a laboratórne vyšetrenie neodhalilo mimoriadné zmeny vzhľadom na bezpečné podanie lieku okrem zvýšenia y-glutamyltransferázy po druhej dávke bscCD19xCDD3 (obrázok 15).

Pretože bscCD19xCD3 bola pacientom tolerovaná a nepriaznivé účinky boli zvládnuté symptomatickou liečbou, bude u tohto pacienta pokračovať podávanie novej bscCD19xCD3.

Klinická a imunologická účinnosť bscCD19xCD3.

Klinické výsledky.

Ultrazvukové vyšetrenie sleziny a päť abdominálnych a axilámych lymfatických uzlín bolo uskutočnené jeden a štyri dni po podávaní druhej dávky bscCD19xCD3. Už jeden deň po dávke 10 pg (16. apríla 1999) vykázali lymfatické uzliny, a tiež slezina, zmenšenie približne o 20 % v porovnaní s východiskovým hodnotením. Toto pozorovanie bolo potvrdené pri druhom ultrazvukovom vyšetrení 19. apríla 1999. Hmotnosť sleziny sa zmenšila o 350 g (z 1630 g pri východiskovom hodnotení na 1280 g 19. apríla 1999) (tabuľka 1, obrázok 16).

Hematologické výsledky:

Počet bielych krviniek, ktorý zahrňoval z najväčšej časti malígne B lymfocyty, počas liečebnej kúry a v dňoch ďalšieho sledovania klesol (tabulka 2, obrázok 17). C-reaktívny proteín (CRP) je proteín akútnej fázy, ktorý odráža aktiváciu T lymfocytov a účinok prozápalových cytokínov. Po podaní 10 pg bscCD19xCD3 sa 10 jeho hodnoty nápadne zvýšili, a potom počas ďalších 3 dní pozorovania nasledoval kontinuálny pokles (tabulka 2, obrázok 18).

Imunologické výsledky:

Hladina sérových cytokínov, ktoré odráža akútnu imunologickú reakciu na podávanie zlúčeniny, bola πιει 5 raná pred podávaním novej zlúčeniny a v rôznych intervaloch po podávaní. Sérové hladiny cytokínov a rozpustného receptora IL-2 boli merané kvantitatívnym testom ELISA podľa inštrukcií výrobcu.

Nádorový nekrotický faktor TNF-α významne vzrástol spôsobom závislým od dávky počas prvej hodiny po podávaní bscCD19xCD3 (obrázok 19).

Interleukín 6 (IL-6) a interleukín 8 (IL-8) tiež vykázali významné zvýšenie závislé od dávky. Ich maxi20 málne hladiny boli pozorované 2 až 4 hodiny po podávaní bscCD19xCD3 (obrázky 20,21). Všetky cytokíny sa vrátili na východiskovú hladinu počas niekolkých hodín.

Rozpustný receptor IL-2 bol zvýšený už pri východiskovom vyšetrení, čo môže byť vysvetlené tým, že masa malígnych B lymfocytov exprimuje receptor IL-2. Po podávaní novej bscCD19xCD3 bolo pozorované zvýšenie rozpustného receptora IL-2, čo ukazuje aktiváciu efektorových buniek (obrázok 22).

Záver:

Nová bscCD19-CD3 bola podávaná bezpečne pacientovi trpiacemu refraktemou B CLL. Znášanlivosť bscCD19xCD3 v dávkach 3 pg a 10 pg bola prijateľná a môže byť dobre kontrolovaná pomocou profylaktických opatrení a symptomatickej liečby.

Nová bscCD19xCD3 spôsobila zmenšenie už predtým zväčšenej sleziny a lymfatických uzlín pacienta, ako je ukázané pri vyšetrení ultrazvukom. Pretože zväčšenie sleziny a lymfatických uzlín je spôsobené infiltráciou malígnymi B lymfocytmi, zmenšenie odráža zničenie malígnych B lymfocytov ako následok podávania bscCD19xCD3.

V ostrom protiklade ku každej inej bišpecifickej protilátke CD19XCD3 v odbore známej, bišpecifická 35 protilátka CD19XCD3 podľa vynálezu (bscCD19xCD3) sa prejavila klinicky účinná u non-Hodgkinovho lymfómu pochádzajúceho z B lymfocytov, ako je merané zmenšením lyfoidnych orgánov infiltrovaných malígnymi B lymfocytmi. Ukázalo sa, že bscCD19xCD3 je klinicky účinná výhodne v prekvapivo nízkych dávkach, ktoré sú pri systémovom podávaní dobre tolerované. Preto klinická účinnosť bscCD19xCD3 potvrdila jej výnimočnú cytotoxickú aktivitu, ako bola zistená in vitro.

Tabuľka 1

Účinok bscCD19xCD3 na veľkosť lymfatických uzlín a sleziny pacient s lytnfómom pochádzajúcim z lymfocytov B.

Ultrazvukové merania	12.4.1999	16.4.1999	19.4.1999
lymfatické uzliny	abdominálne	1	54x29x14 mm	42x30x13 mm	42x30x14 mm
		2	56x33x18 mm	43x33x18 mm	43x30x16 mm
		3	46x32x27 mm	46x31x22 mm	47x32x23 mm
	axiláme	vľavo	36x24x16 mm	34x22x15 mm	30x22x14 mm
		vpravo	37x24x13 mm	33x20x11 mm	32x23x14 mm
slezina			270x132x64 mm	265x132x64 min	265x128x63 mm
			1630 g	1340 g	1280 g

Veľkosť troch abdominálnych lymfatických uzlín, jednej ľavej a jednej pravej axilámej lymfatickej uzliny a sleziny bola určená a meraná ultrazvukovým vyšetrením s použitím prístroja Toshiba SSA100. Veľkosti sú uvedené v troch rozmeroch a v mm. Hmotnosť sleziny bola vypočítaná z rozmerov a ultrazvukovej hustoty·

Tabuľka 2

Hladiny vybraných ukazovateľov v krvi ako reakcie na liečenie s bscCD19xCD3.

		14.4. 1999	15.4. 1999	16.4. 1999	17.4. 1999	18.4. 1999	19.4. 1999
	jednotky
GGT	U/l	22	24 (ráno) - (večer)	124 (6,00) 107 (12,00)	96	89	87
LDH	U/l	618	536 (ráno) 773 (večer)	548	697	551	539
Leukocyty	Gpt/1	46,8	43.3 (ráno) 22.3 (večer)	36,9	37,0	28,3	36,6
Lymfocyty	%	85	58,8 (ráno) 82,0 (večer)	60,9	64,4	65,5	88
CRP	mg/dl	<0,4	1,0 (ráno) 0,7 (večer)	5,2	2,5	2,0	0,7

Hladiny gamaglutamyltransferázy (GGT), laktatdehydrogenázy (LDH) a C-reaktívneho proteínu (CRP) v krvi boli určované štandardnými metódami klinickej biochémie a sú vyjadrené ako jednotky/ml (U/ml) (GGT), jednotky /1 (U/ml) (LDH) a mg/dl (CRP). Počet leukocytov je vyjadrený v 10⁹/l a počet Iymfocytov je uvedený ako percento zo všetkých leukocytov. Východiskové hladiny 14. apríla 1999 pred liečbou sú udané v prvom riadku. Reakcia na 3 pg bscCD19xCD3 15. apríla (ktorá bola podaná 14. apríla) je ukázaná v druhom riadku. Reakcie na druhé podanie 10 pg zlúčeniny ten istý deň je ukázaná v treťom riadku. Hladiny vyvolených ukazovateľov štyri dni po ošetrení liekom sú uvedené v posledných štyroch riadkoch.

Zoznam literatúry

1. Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7021-5,1995.

2. Gianni, N Engl. J. Med. 336, 1290-7, 1997.

3. Urba, J. Natl. Cancer Inst. Monogr., 29-37, 1990.

4. Fisher, Cancer, 1994

5. Bohlen, Blood, 82, 1803-121,1993.

6. Bohlen, Cancer Res, 53, 18:4310-4, 1993.

7. Bohlen, Cancer Res, 57, 1704-9, 1997.

8. Haagen, Clin Exp Immunol, 90, 368-75,1992.

9. Haagen, Cancer Immunol Immunother., 39, 391-6, 1994.

10. Haagen, Blood, 84, 556-63, 1994.

11. Haagen, Blood, 85, 3208-12,1995.

12. Weiner, Leuk Lymphoma, 16, 199-207, 1995.

13. Csoka, Leukémia, 10,1765-72,1996.

14. Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8603-7, 1988.

15. Staerz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,1453-7,1986.

16. Lanzavecchia, Eur J Immunol, 17, 105-11, 1987.

17. Mallender, J Biol Chem, 269, 199-206,1994.

18. Gruber, J Immunol, 152, 5368-74, 1994.

19. Kostelny, J Immunol, 148, 1547-53, 1992.

20. Mack, J Immunol, 158, 3965-70, 1997.

21. Kufer, Cancer Immunol Immunother, 45,193-7,1997.

22. Pezzutto, J Immunol, 138, 2793-9, 1987.

23. Orlandi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833-7,1989.

24. Dubel, J Immunol Methods, 175, 89-95, 1994.

25. Traunecker, Embo J, 10, 3655-9,1991.

26. Laenmli, Náture, 227, 680-5,1970.

27. Bohlen, J Immunol Methods, 173, 55-62,1994.

28. Demanet, Int J Cancer Suppl, 7, 67-8, 1992.

29. De, J Hematother, 4, 433-7, 1995.

30. Haagen, Leuk Lymphoma, 19, 381-93, 1995.

31. Anderson, Blood, 80, 2826-34,1992.

32. Zhu, Int J Cancer, 62, 319-24, 1995.

33. Hartmann, Blod, 89, 2042-7, 1997.

34. Valone, J Clin Oncol, 13, 2281-92,1995.

35. Valone, J Hematother, 4, 471-5, 1995.

36. Bolhuis, Int J Cancer Suppl, 7, 78-81, 1992.

37. Canevari, J Natl Cancer Inst, 87,1463-9, 1995.

38. Nitta, Lancet, 335, 368-71, 1990.

39. Yokota, Cancer Res, 52, 3402-8, 1992.

40. Weiner, J Immunol, 152, 2385-92, 1994.

41. Maloney, Blood 84, 2457-66, 1994.

42. Reff, Blood 83,435-45, 1994.

43. Kipriyanov, Int. J. Cancer, 77, 763-772, 1998.

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

GAAGCACGCG TAGATATCKT GMTSACCCAA WCTCCA 36 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2: GAAGATGGAT CCAGCGGCCG CAGCATCAGC 30 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:

CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT SCAGCTGCAG SAG 33 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4: ACCAGGGGCC AGTGGATAGA CAAGCTTGG TGTCGTTTT 39

SK 286683 Β6 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:

AGGTGTAC AC TCCATATCCA GCTG ACCCAG TCTCCA 3 6 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 48 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA; jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:

GAGCCGCCG CCGCCAGAAC CACCACCTTT GATCTCGAGC TTGGTCCC 48 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 48 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7: GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGTACTGC AGAGTCGG 48 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A)OPIS /desc=“oligonuleotid“ (iii) HYPOTETICKÁ: áno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 8: AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCT TGGCCCCAG 39 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1611 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: double (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) MOLECULE TYP: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (ix) ZNAKY:

(AJMENO/OZNAČENIE: CDS (B)POZÍCIA: ÍL. 1603 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 9:

GAATTCCACC ATG	GGA TGG AGC TGT	ATC ATC CTC	TTC TTG GTA GCA ACA	49
Met	Gly	Trp	Ser	Cys	íle	íle Leu	Phe Leu	Val	Ala	Thr
1				5			10

GCT ACA

GGT GTC Glv Val

CAC His TCT Ser

TCC Ser CCA Pro 35

GAC Asp 20 GCT Ala

TAC AAA GAT GAT

GAC Asp 25 TCT Ser

GAT Asp CTA Leu

AAG Lys GGG Gly

GAT ATC

97 145

Ala CAG Gin 30

Thr 15 CTG Leu

Tyr TCT Ser

Lys Asp Asp TTG GCT GTG

Asp CAG Gin

íle AGG Arg 45

ACC Thr

CAG Gin

Leu

Ala

Val 40

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

193

Ala

Thr

íle

Ser

Cys

Lys

Ala

Se r

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

50

55

60

AGT

TAT

TTG

MC

TGG

TAC

CAA

CAG

ATT

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

241

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

íle

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

65

70

75

CTC

ATC

TAT

GAT

GCA

TCC

AAT

CTA

GTT

TCT

GGG

ATC

CCA

CCC

AC-G

TTT

289

Leu

íle

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

Íle

Pro

Pro

Arg

Phe

80

85

90

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

337

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

íle

His

Pro

Val

95

100

105

GAG

AAG

GTG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

CAC

TGT

CAG

CAA

AGT

ACT

GAG

GAT

385

Glu

Lys

Val

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

His

Cys

Gin

Gin

Ser

Thr

Glu

Asp

110

115

120

125

CCG

TGG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGG

ACC

AAG

CTC

GAG

ATC

AAA

GGT

GGT

GGT

433

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

Gly

Gly

Gly

130

135

14 0

GGT

TCT

GGC

GGC

GGC

GGC

TCC

GGT

GGT

GGT

GGT

TCT

CAG

GTG

CAG

CTG

481

C-ly

Ser

Gly

Gly

Gly

C-ly

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

145

150

155

CAG

CAG

TCT

GGG

GCT

GAG

CTG

GTG

AGG

CCT

GGG

TCC

TCA

GTG

AAG

ATT

529

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

pro

Gly

Ser

Ser

Val

Lys

íle

160

165

170

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAT

GCA

TTC

AGT

AGC

TAC

TGG

ATG

AAC

TGG

577

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Tyr

Trp

Met

Asn

Trp

175

180

185

GTG Val 190

AAG CAG AGG Lys Gin Arg

CCT GGA

CAG GGT CTT GAG TGG ATT GGA CAG

ATT íle

TGG Trp 205

625

Pro

Gly 195

Gin

Gly

Leu Glu

Trp 200

íle

Gly

Gin

CCT

GGA

GAT

GGT

GAT

ACT

AAC

TAC

AAT

GGA

AAG

TTC

AAG

GGT

AAA

GCC

673

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

C-ly

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

210

215

227

ACT

CTG

ACT

GCA

GAC

GAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTC

AGC

721

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

225

230

235

AGC

CTA

GCA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

T.AT

TTC

TGT

GCA

AC-A

CC-G

GAG

769

Ser

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

240

245

250

ACT

ACG

ACG

GTA

GC-C

CGT

TAT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAt

TGG

GGC

CAA

617

Thr

Thr

Thr

Val

Gly Arg Tyr Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

G17

Gin

255

260

265

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCC

C-GA

GGT

GGT

GGA

TCC

GAT

ATC

AAA

865

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

C-ly

Gly Gly Gly

Ser

Asp

íle

Lys

270

275

2S0

285

CTG

CAG

CAG

TCA

GGG

GCT

GAA

CTG

GCA

AC-A

CCT

GGG

C-CC

TCA

GTG

AAG

913

Leu

Glr.

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Ala

Arg

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

290

295

300

ATG

TCC

TC-C

.AAG

ACT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

ACT

AGG

TAC

ACG

ATG

CAC

961

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Arg

Tyr

Thr

Met

His

305

310

315

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

GAA

TGG

ATT

GGA

TAC

ATT

1009

Trp

Val

Lvs

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

íle

Gly

Tyr

íle

320

325

330

AAT CCT AGC CGT GGT

TAT ACT AAT TAC AAT CAG

AAG Lys 345

TTC Phe

AAG GAC

AAG Lys

1057

Asn Pro

Ser

Arg Gly

Tyr Thr 340

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Asp

335

GCC

ACA

TTG

ACT

ACA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

CAA

CTG

1105

Ala

Thr

Leu

Thr

Thr

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

350

355

360

365

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

TAT

1153

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Tyr

370

375

360

TAT

GAT

GAT

CAT

TAC

TGC

CTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

1201

Tyr Asp

Asp

His

Tyr

Cys

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

385

390

395

ACA

GTC

TCC

TCA

GTC

GAA

GGT

GGA

AGT

GGA

GGT

TCT

GGT

GGA

AGT

GGA

1249

Thr

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

400

405

410

GGT

TCA

GGT

GC-A

GTC

GAC

GAC

ATT

CAG

CTG

ACC

CAG

TCT

CCA

GC.A

ATC

1297

Gly

Ser

Gly

Gly

Val

Asp

Asp

íle

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

íle

415

420

425

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGA

GCC

AGT

1345

Met

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Aj. a

Ser

430

435

440

445

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

AAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

TCA

GGC

ACC

TCC

1393

Ser

Ser

Val

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Ser

Gly

Thr

Ser

450

455

460

CCC

AAA

AGA

TGG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAA

GTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

1441

Pro

Lys

Arg

Trp

íle

Tyr

Asp

Thr

Ser

Lys

Val

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

465

470

475

TAT Tyr

CGC TTC AGT

GGC AGT

GGG TCT

GGG ACC TCA

TAC Tyr

TCT Ser 490

CTC Leu

ACA Thr

ATC íle

1489

Arq

Phe 460

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 485

Gly

Thr

Ser

AGC

AGC

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAA

CAG

TGG

1537

Se r

Se r

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

495

500

505

AGT

AGT

AAC

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

1585

Ser

Ser

Asn

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

510

515

520

525

CAT

CAT

CAC

CAT

CAT

CAT

TAGTCGAC

1611

His

His

His

His

His

His

530 (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 531 aminokyselín (B)TYP: aminokyselina (D)TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 10:

(xii)

Met 1

Gly Trp

Ser

Cys 5

íle

I le

Leu

Phe

Leu 10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr 15

Gly

Val

HÍ5

Ser

Asp

Tyr

Lys

Asp

Asp

Asp

ASP

Lys

Asp

íle

C-ln

Leu

Thr

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

íle

35

40

45

Ser

Cys

Lys

Ala

ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

. 55 60

Asn 65

Trp

Tyr

Gin

Gin

íle 70

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro 75

Lys

Leu

Leu

íle

Tyr 80

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly

íle

Fro

Pro

A. r g

Phe

Ser

Gly

Ser

85

90

95

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

íle

His

Pro

Val

Glu

Lys

Val

100

105

110

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

His

Cys

Gin

C-ln

Ser

Thr

Glu

Asp

Pro

Trp

Thr

115

120

125

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

130 135 140

Gly 145

Gly Gly

Ser

Gly

Gly Gly Gly Ser Gin Val

Gin Leu

Gin

Gin

Ser 160

150

155

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Ser

Ser

Val

Lys

íle

Ser

Cys

Lys

165

170

175

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Tyr

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

180

185

190

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

íle

Gly

Gin

íle

Trp

Pro

Gly

Asp

195

200

205

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

210

215

220

Ala

A.sp

Glu

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Ala

225

230

235

240

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Thr

Thr

245

250

255

Val

Gly

Arg

Tyr

Tyr

Tyr; Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

260

265

270

Val	Thr	Val 275	Ser	Ser	Gly	Gly	Gly 280
Ser	Gly	Ala	C-l u	Leu	Ala	A.rg	Pro
	290					295
Lys	Thr	Ser	Gly	Tyr	Thr	Phe	Thr
305					310
Gin	Arg	Pro	Gly	Gin	Gly	Leu	Glu
				325

Gly Ser	Asp	íle	Lys 285	Leu	Gin	Gin
Gly	Ala	Ser	Val	Lys	Met	Ser	Cys
			300
Arg	Tyr	Thr	Met	His	Trp	Val	Lys
		315					320
Trp	I le	Gly	Tyr	íle	Asn	Pro	Ser
	330					335

Arg Gly Tyr Thr

Asn

Tyr

Asn Gin Lys 345

Phe

Lys

Asp

Lys

Ala 350

Thr

Leu

340

Thr

Thr

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

355

360

365

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Tyr

Tyr

Asp

Asp

370

375

380

His

Tyr

Cys

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

385

390

395

400

Ser

Val

Glu

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

405

410

415

Gly

Val

Asp

Asp

íle

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

íle

Met

Ser

Ala

42 0

425

430

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

435

440

445

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Týr

Gin

Gin

Lys

Ser

Gly

Thr

Ser

Pro

Lys

Arg

450

455

460

Trp

íle

Tyr

Asp

Thr

Ser

Lys

Val

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Tyr

Arg

Phe

465

470

475

480

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

Met

485

490

495

Glu

Ala

Glu

Asp

A.la

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ser

Asn

500

505

510

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Gl u

Leu

Lys

His

His

His

515

520

525

His His His

530

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Jednoreťazcový multifúnkčný polypeptid, ktorý obsahuje (a) prvú doménu obsahujúcu väzbové miesto imunoglobulínového reťazca alebo protilátky špecificky rozpoznávajúcej CD 19 antigén, a (b) druhú doménu obsahujúcu väzbové miesto imunoglobulínového reťazca alebo protilátky špecificky rozpoznávajúcej CD3 antigén ľudských T-lymfocytov, kde uvedené domény sú usporiadané v poradí V_LCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3.
2. 2. Polypeptid podľa nároku 1, kde dve domény sú spojené prostredníctvom polypeptidovej spojky.
3. 3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, kde prvá a/alebo druhá doména napodobňuje alebo zodpovedá V_H a V_L oblasti prirodzenej protilátky.
4. 4. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde protilátka je monoklonálna protilátka, syntetická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
5. 5. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde aspoň jedna z domén je jednoreťazcový fragment variabilnej oblasti protilátky.
6. 6. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 5, kde polypeptidová spojka obsahuje množstvo zvyškov glycínu, alaninu a/alebo serinu.
7. 7. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 6, kde polypeptidová spojka obsahuje množstvo po sebe nasledujúcich kópií aminokyselinovej sekvencie.
8. 8. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7, kde polypeptidová spojka obsahuje 1 až 5 aminokyselinových zvyškov.
9. 9. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 8, kde polypeptidová spojka obsahuje aminokyselinovú sekvenciu Gly Gly Gly Gly Ser.
10. 10. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, kde prvá doména obsahuje aspoň jednu CDR z V_H a V_L oblasti zahrnujúcej aminokyselinovú sekvenciu kódovanú DNA sekvenciou zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 82 do 414 (V_L) a nukleotidu 460 až 831 (V_H) a/alebo kde druhá doména obsahuje aspoň jednu CDR z V_H a V_L oblasti zahrnujúcej aminokyselinovú sekvenciu kódovanú DNA sekvenciou zobrazenou na obrázku 8 od nukleotidu 847 do 1203 (V_H) a nukleotidu 1258 až 1575 (V_L).
11. 11. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, kde (a) väzbové miesto prvej domény má afinitu aspoň 10'⁷M, a/alebo (b) väzbové miesto druhej domény má afinitu menšiu ako 10'⁷M.
12. 12. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, ktorý je bišpecifícká jednoreťazcová protilátka.
13. 13. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, ktorý obsahuje aspoň jednu ďalšiu doménu.
14. 14. Polypeptid podľa nároku 13, kde ďalšia doména je pripojená prostredníctvom kovalentnej alebo nekovalentnej väzby.
15. 15. Polypeptid podľa nároku 13 alebo 14, kde aspoň jedna ďalšia doména obsahuje efektorovú molekulu majúcu konformáciu vhodnú pre biologickú aktivitu, schopnú sckvcstrácic iónu alebo selektívnej väzby na pevný podklad alebo na vopred vybranú determinantu.
16. 16. Polynukleotid, ktorý pri expresii kóduje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15.
17. 17. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 16.
18. 18. Bunka transfekovaná polynukleotidom podľa nároku 16 alebo vektorom podľa nároku 17.
19. 19. Spôsob prípravy polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kultiváciu bunky podľa nároku 18 a izoláciu polypeptidu z tkanivovej kultúry.
20. 20. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, polynukleotid podľa nároku 16 alebo vektor podľa nároku 17.
21. 21. Prípravok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že predstavuje farmaceutický prípravok prípadne ďalej obsahujúci farmaceutický prijateľný nosič.
22. 22. Prípravok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že predstavuje diagnostický prípravok pripadne ďalej obsahujúci prostriedky vhodné na detekciu.
23. 23. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, polynukleotidu podľa nároku 16 alebo vektora podľa nároku 17 na výrobu farmaceutického prípravku na liečenie malignít B lymfocytov, autoimunitnýcb chorôb so vzťahom k B lymfocytom alebo deplécie B lymfocytov.
24. 24. Použitie podľa nároku 23, kde malignita B lymfocytov je lymfóm B-lymfocytov, malígny lymfóm nepatriaci k Hodgkinovmu typu, alebo od B-lymfocytov odvodená chronická lymfatická leukémia (B-CLL).
25. 25. Použitie podľa nároku 23 kde autoimunitnou chorobou so vzťahom k B-lymfocytom je myasténia gravis, Basedowova choroba, Hashimotova tyreotitída alebo Goodpasturov syndróm.
26. 26. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, polynukleotidu podľa nároku 16 alebo vektora podľa nároku 17 na výrobu farmaceutického pripavku na oddialenie patologického stavu, ktorý je spôsobený B-lymfocytovými poruchami.
27. 27. Použitie polypeptidu podľa nároku 16, alebo vektora podľa nároku 17, na výrobu prípravkov na génovú terapiu.
28. 28. Spôsob identifikácie aktivátorov alebo inhibítorov aktivácie alebo stimulácie T- lymfocytov, v y značujúci sa tým, že zahrnuje

    5 (a) kultiváciu T lymfocytov a CD 19 pozitívnych buniek, výhodne B lymfocytov, v prítomnosti polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15 a pripadne v prítomnosti zložky schopnej poskytnúť detegovateľný signál ako odpoveď na aktiváciu T lymfocytov testovanou zlúčeninou v podmienkach umožňujúcich aktiváciu T lymfocytov, a (b) detekciu prítomnosti alebo neprítomnosti signálu vzniknutého interakciou zlúčeniny s bunkami.