BG65066B1 - CD19 x CD3 СПЕЦИФИЧНИ ПОЛИПЕПТИДИ И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗВАНЕ - Google Patents

Abstract

Едноверижните мултифункционални полипептиди включват поне два сайта на свързване, съответно специфични за CD19 и CD3 антигена, и поне един допълнителен домен, за предпочитане с предетерминирани функции. Изобретението се отнася и до полинуклеотидите, кодиращи тези полипептиди, до вектори, които включват посочените полинуклеотиди, и клетки гостоприемници, трансформирани с посочените полинуклеотиди, и до тяхното използване при производството на посочените полипептиди. Създадени са също фармацевтични и диагностични състави, включващи който и да еот посочените полипептиди, полинуклеотиди и вектори, за изготвянето на фармацевтични състави за имунотерапия, по-специално срещу В-клетъчни злокачествени образувания, например не-Hodgkin лимфома.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до нови едноверижни мултифункционални полипептиди, включващи поне два сайта на свързване, специфични за CD 19 и CD3 антигена, съответно. Предоставят се освен това и полипептиди, като долуописаният полипептид включва поне един допълнителен домен, за предпочитане с предетерминирани функции. Освен това, изобретението се отнася, също така до полинуклеотидите, кодиращи тези полипептиди, както и вектори, които включват посочените полинукпеотиди и клетки гостоприемници, трансформирани с посочените полинуклеотиди, както и тяхното използване при производството на посочените полипептиди. В допълнение се предоставят също и състави, за предпочитане фармацевтични и диагностични състави, включващи кой да е от горе описаните полипептиди, полинуклеотиди и вектори за изготвянето на фармацевтични състави за имунотерапия, за предпочитане срещу В-клетъчни злокачествени образувания, като неHodgkin лимфома.

В текста на настоящото изобретение са цитирани известен брой документи. Всеки от тук цитираните документи (включително и описания от производителя, инструкции, и др.) са включени в настоящото за справка; въпреки това не се приема който и да е от цитираните документи като действително ниво на настоящото изобретение.

Предшестващо състояние на техниката

Въпреки важността за медицината, изследванията върху медиираните от В-клетки заболявания, като не-Hodgkin лимфома, са довели само до малък брой данни, използваеми в клиниката, и конвенционалните подходи за лечение на такива заболявания остават досадни и неприятни и/или съществува голям риск от повтаряне на болестта. Например, въпреки че високата доза химиотерапия като първично лечение за тежка степен не-Hodgkin лимфома не може да подобри преживяемостга, приблизително 50% от пациентите все още умират от това заболяване [2-4]. Освен това, лека степен на не-Hodgkin лимфома - подобна хронична лимфатична левкемия и клетъчна лимфома все още са нелечими. Това стимулира търсенето на алтернативни стратегии, като имунотерапията. Антитела насочени срещу молекулите от клетъчната повърхност, дефинирани от CD антиген представляват единствена възможност за развитието на терапевтични средства.

Експресията на някои CD антигени силно се ограничава до специфични линии лимфохематопоетични клетки и през изминалите няколко години, антителата насочени срещу лимфоидспецифични антигени са били използвани за да се развиват лечения, които да бъдат ефективни било то in vitro или при животински модели [513]. С оглед на това, CD19 е доказал, че е изключително полезна мишена. CD 19 се експресира в цялата В линия от про В клетката до зрялата В клетка, не се изменя, еднакво се експресира във всички лимфомни клетки и отсъства от стволовите клетки [8,14]. Интересна модификация е прилагането на биспецифично антитяло с една специфичност на CD 19, а другата за CD3 антигена върху Т-клетките. Въпреки това, биспецифичните антитела предоставени по този начин страдат от ниска Т-клетьчна цитотоксичност и липса на костимулиращи средства, с цел да се представи задоволителна биологична активност.

Следователно, техническият проблем подчертаващ настоящото изобретение е да се предоставят средства и методи, полезни при третирането на В-клетьчно медиирани заболявания като различни форми на не-Hodgkin лимфома. Решението на такъв технически проблем се постига чрез предоставяне на вариантите за изпълнение, охарактеризирани в патентните претенции.

В съответствие, настоящото изобретение се отнася до едноверижен мултифункционален полипептид включващ:

(а) един първи домен включващ сайт на свързване от имуноглобулинова верига или едно антитяло специфично разпознаващо CD19 антигена; и (б) един втори домен включващ сайт на свързване от имуноглобулинова верига или едно антитяло специфично разпознаващо CD3 антигена.

Терминът “първи домен” и “втори домен”, в съответствие с настоящото изобретение озна чават, че един сайт на свързване е насочен срещу рап В клетъчния маркер CD 19, който еднакво се експресира при по-голямата част от злокачествените В клетки, а другият сайт на свързване е насочен срещу CD3 антигена на човешки Т клетки.

Терминът “сайт на свързване”, както се употребява в съответствие с настоящото изобретение посочва домен, който включва триизмерна структура, способна специфично да се свързва към епитоп като нативните антитела, без scFv фрагменти или една от съответните им имуноглобулинови вериги, за предпочитане V_H веригата. По този начин посоченият домен може да включва V_H и/или V_L домен на антитяло или имуноглобулинова верига, за предпочитане поне V_H домена. От друга страна, посочените сайтове на свързване, съдържащи се в полипептида на изобретението, могат да включват поне една комплементарна детерминантна област (CDR) на антитяло или имуноглобулинова верига, разпознаваща съответно CD19 и CD3 антигените. С оглед на това, трябва да се отбележи, че домените на сайтовете на свързване, присъстващи в полипептида на изобретението могат да произлизат не единствено само от антитела, но също така и от други CD 19 или CD3 свързващи протеини, като естествено срещаните в природата повърхностни рецептори или лиганди. Съгласно изобретението, посоченият сайт на свързване е включен в домен.

Терминът “мултифункционален полипептид”, както се използва тук, посочва полипептид, включващ поне две аминокиселинни последователности произлизащи от различни източници, т. е. от две различни молекули, по желание произлизащи от различни видове, при което поне два от тези източника охарактеризират сайта на свързване. В съответствие, посочените сайтове на свързване охарактеризират функциите или поне някои функции на посочения мултифункционален пептид. Такива полипептиди включват, например, биспецифични (bsc) едноверижни антитела.

Терминът “едноверижен”, както се използва в съответствие с настоящото изобретение означава, че посочените първи и втори домени на полипептида са ковалентно свързани, за предпочитане под формата на ко-линейна аминокиселинна последователност кодирана от молеку ла на нуклеинова киселина. CD 19 бележи антиген, който се експресира в В линия, както в pro В клетки и в зрели В клетки, не се изменя, еднакво се експресира във всички лимфомни клетки и отсъства от стволовите клетки [8,14].

CD3 посочва антиген, който се експресира върху Т клетки като част от мултимолекулярния Т-клетьчен рецепторен комплекс и който се състои от три различни вериги СОепсилон, СОделта и CDraMa. Натрупването на CD3 върху Т клетки, например чрез имобилизирани антиCD3-антитела води до Т-клетьчно активиране подобно на свързването на Т-клетьчния рецептор, но независимо от неговата характерна за клона специфичност. Всъщност, повечето анти-СОЗантитела разпознават СОепсилон-вериги.

Антитела, които специфично разпознават CD 19 или CD3 антигена са описани в състоянието на техниката, например [24,25 и 43], съответно и могат да се регенират чрез конвенционални методи, известни от състоянието на техниката.

Биспецифични CD19 х CD3 антитела, които не са от едноверижен формат, насочващи повторно Т-клетьчната цитотоксичност към лимфомни клетки по МНС-независим начин вече са били посочени като ефективни in vitro [5, 6, 9-11, 13,43] при животински модели [7,28], така както и при някои пилотни клинични изпитания [12,29, 30]. Досега тези антитела са били конструирани чрез хибрид-хибридомни техники, чрез ковалентно свързване на моноклоналните антитела [31] или чрез diabody подход [43]. Проведени са позадълбочени клинични изследвания благодарение на факта, че тези антитела притежават ниска биологична активност, така че е необходимо да се прилагат по-високи дози и това прилагане единствено на антитела не предоставя благоприятен терапевтичен ефект. Освен това е ограничен достъпът до клиничен материал.

Без да се свързва към някоя определена теория се вярва, че чрез използването на биспецифичен антитяло-подобен формат, както е дефинирано по-горе, така генерираните полипептиди като биспецифични CD 19 х CD3 антитела обикновено са способни да разрушат CD19-noзитивните клетки мишени чрез събиране на цитотоксичните Т-лимфоцити без никаква необходимост от Т-клетъчно пре- и/или ко-стимулиране. Това е в рязък контраст с всички известни биспецифични CD 19 х CD3 антитела продуцирани съгласно други молекулярни формати и обикновено не зависи от конкретните особености на CD 19- или CD3-антитяло, които се използват при конструирането, например на биспецифичното едноверижно антитяло. Независимостта от Т-клетьчно пре- и/или ко-стимулиране може значително да допринесе за изключително високата цитотоксичност, медиираначрез полипептида от изобретението, както се обяснява чрез специфичното биспецифично CD 19 xCD3 антитяло, описано в примерите за конкретно изпълнение.

Друго полезно свойство на полипептида от изобретението е това, че поради неговата малка, сравнително компактна структура е лесно да се продуцира и да се пречисти, като по този начин се преодоляват проблемите с нисък добив, възникването на заболяване, дефинирано чрез продукти, или трудоемките процеси на пречистване [15-19] докладвани за CD 19 х CD3 специфични антитела продуцирани от хибрид-хибридома, чрез химическо свързване или чрез ренатуриране (възстановяване) от бактериални телца на включване. При следващото, полезността и неочакваните ефекти на полипептида от изобретението ще се разглеждат по неограничаващ начин в светлината на прилежащите претенции, включващи някои от предпочитаните варианти за изпълнение на изобретението, посочени по-долу, което илюстрира широкия обхват на настоящото изобретение.

В съответствие с настоящото изобретение се използва еукариотна експресионна система, която се развива за производството за рекомбинантни биспецифични едноверижни антитела [1] с цел да се генерира рекомбинантно биспецифично CD 19 х CD3 антитяло чрез експресията на СНО клетки. Напълно функционалното антитяло се пречиства по същество от културалната супернатанта чрез неговия С-краен хистидин tag върху Ni-NTA хроматографска колона. Специфичното свързване към CD 19 и CD3 се демонстрира чрез FACS анализ. Получената bscCD19 X CD3 (биспецифични едноверижни CD 19 х CD3) молекула на изобретението показва някои неочаквани свойства:

- индуцира висока лимфомна насочена Тклетъчна цитотоксичност in vitro и in vivo. Даже при много ниски концентрации от 10-100 pg/ml и ниски стойности на съотношението Е (ефектор):Т (мишена) от 5:1 и 2,5:1 се наблюдава значителен специфичен лизис на лимфомна клетъчна линия. Освен това, 3 micro g до 10 micro g bscCD 19 X CD3 молекулата от изобретението при доброволно използване показват ясно и значително подобряване на медицинския статус. В сравнение с публикуваните досега CD 19 X CD3 антитела, продуцирани чрез хибрид-хибридомни техники или по diabody подход (които също представляват различен формат), които проявяват цитотоксична активност в рамките на няколко нанограма/ml или даже micro g/ml, bscCD19 X CD3 антитялото от изобретението изглеждала е много по-ефикасно [5-7, 27, 43] както например е документирано в прилежащите примери за изпълнение на изобретението 4, 5 и 7.

- Даже и ниските концентрации на bscCD 19 X CD3 от изобретението са способни да индуцират бърза цитотоксичност насочена срещу лимфома (след 4 h) при ниски съотношения на Е:Т без необходимост от каквото и да било предварително Т-клетъчно стимулиране. В контраст, конвенционално CD 19 X CD3 биспецифично антитяло [5-7,27] не проявява цитотоксична активност при тези условия (а именно без предварително Т-клетъчно стимулиране, ниско съотношение на Е:Т) даже и при високи концентрации до 3 000 ng/ml. Въпреки че се докладва също индуциране на цитотоксичната активност без предварително стимулиране, при случай на друго конвенционално CD 19 X CD3 антитяло, този ефект се постига единствено при високи концентрации и високо съотношение на Е:Т (100 ng/ml, 27:1) [9] в сравнение с bscCD 19 X CD3 на изобретението (100 pg/ml, 2,7:1). Цитотоксичният ефект от това антитяло се наблюдава, освен това, само след един ден предварително стимулиране със самото специфично антитяло, при което bscCD 19 X CD3 на изобретението, индуцира лимфома-насочена цитотоксичност вече след четири h. До колкото е известно на изобретателите на изобретението такава бърза и специфична цитотоксична активност на Т клетки, при такива ниски концентрации и съотношение на Е:Т, не са били наблюдавани за други биспецифични антитела, които са били използвани досега. Въпреки това, за анти-р185НЕ1<2/анти-СОЗ биспецифично F(ab)₂ антитяло бе показано, че индуцира цитотоксична активност при подобни кон центрации, както bscCD19 X CD3 от изобретението, като това антитяло се нуждае от 24 h предварително стимулиране с IL-2 [32]. Следователно, bscCDl 9 X CD3 антитялото на изобретението проявява уникални цитотоксични свойства, които отличават тази молекула от други биспецифични антитела, които вече са били описани.

bscCD19 X CD3 от изобретението медиира цитоксични ефекти, които са антиген специфични, което се демонстрира от следните факти:

- това антитяло не проявява възможност да лизира плазмоцитомни клетъчни линии NC1 и L363, които са клетъчни линии от В линиите, които не експресират CD 19 антигена; и

- цитотоксичностга срещу лимфомни клетки би могла да бъде блокирана от родителското анти-CD 19 антитяло HD37 (HD37 антитялото се получава от HD37 хибридома [22]).

Блокирането на синтетичния път на перфорина, чрез лишаване от калций чрез EGTA, напълно блокира медиираната от bscCD 19 X CD3 цитотоксичност, което подсказва, че специфичният лизис е по-скоро Т-клетъчно медииран ефект, отколкото директен ефект от самото антитяло.

Като се вземе предвид всичко това, bscCD 19XCD3 антитялото, конструирано съгласно общите изводи на изобретението, надвишава досега описаните CD19XCD3 биспецифични антитела, като се има предвид неговата значително по-висока биологична активност, така както и възможността за неговото бързо и лесно производство, като по този начин се добиват достатъчни количества висококачествени клинични продукти.

Поради това се очаква bscCD 19XCD3 молекулите на изобретението да са подходящи кандидати за да докажат терапевтичното предимство от биспецифичните антитела при лечението на Вклетъчно медиирани заболявания, като неHodgkin лимфома при клинични изпитания.

При един предпочитан вариант за изпълнение на полипептида от изобретението, посочените домени са свързани чрез полипептиден линкер. Посоченият линкер се разполага между посочения първи и посочения втори домен, при което посоченият полипептиден линкер за предпочитане включва множество хидрофилни аминокиселини с пептидни връзки, и свързва N-терминалния край на посочения първи домен и С терминалния край на посочения втори домен.

При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението посоченият първи и/или втори домен от гореописания полипептид наподобява или съответства на V_H и V_L областта на естествено съществуващо в природата антитяло. Антитялото, което предоставя сайта за свързване за полипептида на изобретението може да е, например, моноклонално антитяло, поликлонално антитяло, химерно антитяло, хуманизирано антитяло, биспецифично антитяло, синтетично антитяло, фрагмент на антитяло като Fab, Fv или scFv фрагменти и др. или химически модифицирани производни на което и да е от тези вещества. Моноклоналните антитела могат да се изготвят, например, чрез техниките както първоначално са описани от Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, и Galfreq Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, които включват сливането на миши миеломни клетки към клетки от далака на бозайници, имунизирани с модификации, развити в състоянието на техниката. Освен това, антитела или техни фрагменти за горе посочените антигени могат да се получат при използване на методи, които са описани в, например, Harlow and Lane “Antibodies, A Labiratory Manual”, CHS Press, Cold Sping Harbor, 1988. Антитела могат да се получат от различни видове, включително от човек. Когато се получат производни на посочените антитела чрез phage display техниката, повърхностен plasmon резонанс, както се използва в BIAcore системата може да се използва за увеличаване ефикасността на фаговите антитела, които се свързват към един епитоп на CD 19 или CD3 антигена (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13), Продуцирането на химерни антитела се описва, например, в WO 1989/009622. Методи за продуциране на хуманизирани антитела са описани например, в ЕР-А1 0 239 400 и WO 1990/007861. Друг източник на антитела за използване съгласно настоящото изобретение са така наречените ксеногенни антитела. Общият принцип за продуциране на ксеногенни антитела, като човешки антитела в мишки се описва в например, WO 1991/ 010741, WO 1994/002602, WO 1996/034096 и WO 1996/033735.

Антитела за използване, съгласно настоящото изобретение или техните съответстващи имуноглобулинови вериги могат да бъдат допълнително модифицирани при използване на конвенционални техники добре известни от състоянието на техниката, например, чрез използване на аминокиселинни делеции, инсерции, замествания, прибавяния и/или рекомбинации и/или каквито и да било други модификации, известни от състоянието на техниката, било то единично, било то в комбинация. Методи за въвеждане на такива модификации в ДНК последователността подчертаващи аминокиселинната последователност на една имуноглуболинова верига са добре известни на специалистите в областта; виж например Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) Ν. Y. Посочените модификации за предпочитане се осъществяват на нуклеотидно ниво.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението поне един от посочените домени в горе описаните полипептиди е едноверижен фрагмент на вариабилната област на антитялото.

Както е добре известно, Fv, минималният фрагмент на антитялото, който съдържа пълен сайт за разпознаване и свързване на антигена, се състои от димер на една тежка и една лека верига на вариабилен домен (V_H и V_L) в не-ковалентна асоциация. В тази конфигурация това съответства на откритите в нативните три комплементарни детерминантни области (CDRs) на всеки вариабилен домен взаимодейства за да дефинира един сайт за свързване на антиген на повърх-ността на V_H-V_L димера Колективно шестте CDRs придават антиген-свързваща специфичност към антитялото. Рамката (FRs) ограничаваща CDRs има терциерна структура, която по същество се запазва в нативните имуноглобулини от видове, така различни, като човешките и мишите. Тези FRs служат да задържат CDRs в тяхната подходяща ориентация. Константните домени не са необходими за функциите на свързване, но могат да помогнат при стабилизирането на V_HV_L взаимодействието. Даже единичен вариабилен домен (или половината от Fv включващ единствено три CDRs специфични за един антиген) имат способността да разпознават и да свързват антигена, въпреки че обикновено при по-нисък афинитет, отколкото един цял сайт на свързване (Painter, Bochem. 11 (1972), 1327-1337). Следо вателно, посоченият домен на сайта на свързване на полипептида от изобретението може да е двойка от V_H-V_L, V_H-V_H или V_L-V_L домени, било то от един или от различни имуноглобулини. Редът на V_H и V_L домените в полипептидната верига не е решителен за настоящото изобретение, редът на посочените по-горе домени може да се обърне, обикновено без да се загуби никаква функция. Въпреки това е важно, че V_H и V_L домените са подредени така, че сайтът за свързване на антигена да може правилно да се нагъне.

При един предпочитан вариант за получаване на полипептида на изобретението, посочените домени се подреждат в реда V_LCD19V_HCD19- V_HCD3-V_LCD3, при което “V_L” и “V_H” означават леката и тежката верига на вариабилния домен на специфичните анти-CD 19 и антиCD3 антитела.

Както се дискутира по-горе, посочените сайтове за свързване за предпочитане се свързват чрез гъвкав линкер, за предпочитане чрез полипептиден линкер, разположен между посочените домени, като посоченият полипептиден линкер включва множествени, хидрофилни, пептид-свързани аминокиселини с дължина достатъчна да заеме разстоянието между С-терминалния край и един от посочените домени, включващ сайтове за свързване и N-терминалния край на другия от посочените домени, включващ посочените сайтове за свързване когато полипептидът от изобретението претърпява конформация подходяща за свързване, когато се намира във воден разтвор. За предпочитане посоченият полипептиден линкер включва множество глицинови, аланинови и/или серинови остатъци. Предпочита се освен това, посоченият полипептиден линкер да включва множество последователни копия на аминокиселинна последователност. Обикновено полипептидният линкер включва 10 до 15 аминокиселини, въпреки че полипептидни линкери над 15 аминокиселини могат да работят също така добре. В предпочитания вариант за изпълнение на изобретението посоченият полипептиден линкер включва 1 до 5 аминокиселинни остатъци.

При един изключително предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение посоченият полилинкер в полипептида от изобретението включва 5 аминокиселини. Както се вижда от прилежащите примери за изпълнение на изобретението, посоченият полепептиден линкер има предимството да включва аминокиселинната последователност Gly Gly Gly Gly Ser.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посоченият първи домен на полипептида от изобретението включва поне един CDR от V_H и V_L областта включваща аминокиселинната последователност кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 82 до 414 (V_L) и от нуклеотиди 460 до 831 (V_H) и/или посоченият втори домен включва поне един CDR, за предпочитане два, по-предпочитано 3 CDR от V_H и V_L областта включваща аминокиселинната последователност кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 847 до 1203 (V_H) и от нуклеотиди 1258 до 1575 (V_L), евентуално в комбинация с рамкова област, която се появява заедно с посочените CDR в родителските антитела. CDR съдържащи се във вариабилните области, посочени на фигура 8 могат да бъдат определени например по Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (U. S. Department of Helth and Human Services, third edition, 1983; fourth edition, 1987; fifth edition, 1990). Специалистът в областта ще оцени, че сайтът на свързване или поне един CDR, получен от него може да се използва при конструирането на полипептида от изобретението. За предпочитане, посоченият полипептид включва аминокиселинната последователност, кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 82 до 1575. Специалистът в областта ще оцени, че сайтовете на свързване на полипептида от изобретението може да бъде конструиран съгласно методи, известни от състоянието на техниката, например както се описва в ЕР-А1 0 451 216 и ЕР-А1 0549581.

Домените на сайтовете за свързване на полипептида от изобретението за предпочитане имат специфичност поне идентична по същество на свързващата специфичност на, например антитяло или имуноглоболинова верига, от които произлизат. Такива домени на сайтове за свързване могат да имат афинитет на свързване от 10⁵ М¹, за предпочитане не по-висок от 10⁷ М¹, за CD3 антигена и предимно до 10¹⁰ М-1 или повече за CD 19 антигена.

При един предпочитан вариант на изпълнение на полипептида от изобретението (а) посоченият сайт за свързване на първия домен има афинитет от поне приблизително ΙΟ ⁷ М, за предпочитане поне приблизително ΙΟ ⁹ М и още по-предпочитано 10 М;

и/или (б) посоченият сайт за свързване на втория домен има афинитет от поне приблизително ΙΟ’⁷ М, за предпочитане по-малко от приблизително 10^-6 М и още по-предпочитано от порядъка на ΙΟ'⁵ М.

Съгласно предпочитаните варианти за изпълнение, посочени по-горе е полезно, ако сайтът за свързване разпознаващ CD 19 антигена има висок афинитет с цел да залавя клетките мишени, които трябва да бъдат разрушени с висока ефикасност. От друга страна, афинитетът на свързване на сайта на свързване, разпознаващ CD3 антигена, трябва да е от порядъка на тези на естествените CD3 рецептори или на този, който обикновено се открива при взаимодействието на Т клетъчния рецептор с неговия лиганд, който е МНС-пептиден комплекс върху повърхността на клетката мишена. При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, описаният погоре пептид е биспецифично едноверижно антитяло.

Настоящото изобретение се отнася освен това и до полипептид включващ поне още един домен, като посочените домени са свързани чрез ковалентни или нековалентни връзки.

Свързването може да се основава на генетично сливане, съгласно методите, известни от състоянието на техниката и описани по-горе или може да се осъществи чрез, например, химическо омрежване, както е описано в WO 1994/ 004686. Допълнителният домен присъстващ в полипептида на изобретението може за предпочитане да е свързан чрез гъвкав линкер, по-полезно полипептиден линкер за един от домените на сайта на свързване, като посоченият полипептиден линкер включва множествени, хидрофилни, пептид-свързани аминокиселини с дължина достатъчна да заемат разстоянието между С-терминалния край на един от посочените домени, и Nтерминалния край на другия от посочените домени, когато посоченият полипептид претърпява конформация подходяща за свързване, когато се намира във воден разтвор. За предпочитане посоченият полепептиден линкер е полипептиден линкер, както е посочено в гореописаните ва рианти за изпълнение. Полипептидьт на изобретението може освен това да включва разцепващ се линкер или сайт за разцепване за протеинази, като ентерокиназа; виж приложените примери.

Освен това, посоченият допълнителен домен може да е с предварително дефинирана специфичност или функция. Например, в литературата се посочва гостоприемник според концепцията за насочване на биоакгивните вещества като лекарствени средства, токсини и ензими, към специфична точка на тялото, за да се унищожат или локализират злокачествените клетки или за да се индуцира локализиран ефект на лекарственото средство или ензима. Предлагано е този ефект да се постигне чрез конюгиране на биоактивното вещество към моноклонални антитела (виж например Ν. Y. Oxford University Press; and Ghose, J. Natl. Cancer Inst. 61 (1978), 657-676).

В този контекст се разбира също, че полипептидите, съгласно изобретението могат да бъдат допълнително модифицирани чрез конвенционални методи, известни от състоянието на техниката. Това позволява конструирането на химерни протеини, включващи полипептида от изобретението и други функционални аминокиселинни последователности, например сигнали за ядрена локализация, трансактивиращи домени, ДНК-свързващи домени, хормон-свързващи домени, tag протеини (GST, GFP, h-myc пептид, FLAG, НА пептид) които могат да произлизат от хетероложни протеини. Както се описва в прилежащите примери за изпълнение, полипептидьт от изобретението за предпочитане включва FLAG-tag с дължина приблизително осем аминокиселини; виж фигура 8.

Полипептидите от изобретението могат да се използват терапевтично при пациенти, страдащи от В-клетьчни нарушения, като В-клетъчна лимфома, В-клетъчно производна хронична лимфатична левкемия (B-CLL) и/или имащи Вклетъчно свързано автоимунно заболяване, като myasthenia gravis, Morbus Bazedow, Hashimoto thyreoiditis, или Goodpasture syndrome. Такава терапия може да се проведе чрез, например, прилагането на полипептиди от изобретението. Такова прилагане може да използва небелязани, както и белязани полипептиди.

Полипептидите от изобретението, например, могат да бъдат приложени белязани с терапевтично средство. Тези средства могат да бъ дат свързани или директно, или индиректно към антителата или антигените на изобретението. Пример за индиректно свързване е чрез използване на спейсърна част. Тези спейсърни части на свой ред могат да бъдат неразтворими или разтворими (Diener, Science 231 (1986), 148) и могат да се подберат така, че да направят възможно освобождаването на лекарственото средство от антигена на определеното място. Примери за терапевтични средства, които могат да се свържат към полипептидите на изобретението за имунотерапия са лекарствени средства, радиоизотопи, пектини и токсини. Лекарствените средства, които могат да бъдат конюгирани към полипептидите на изобретението, включват съединения, които класически се отнасят като лекарствени средства, като митомицин С, даунорубицин и винбластин.

При използване на радиоизотопно конюгирани полипептиди на изобретението, например, при имунотерапия, някои изотопи могат да бъдат по-предпочитани от други, според такива фактори, като разпределение на левкоцити, както и стабилност и емисия. Според автоимунният отговор някои емитери могат да са по-предпочетени от други. Най-общо радиоизотопи, излъчващи алфа и бета частици се предпочитат в имунотерапията. Предпочитат се високоенергийни алфа емитери с малък обхват, като ²¹²Bi. Примери за радиоизотопи, които могат да се свържат към полипептидите на изобретението за терапевтични цели са ¹²⁵1,¹³¹l,⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и ¹⁸⁸Re.

Пектините са протеини, обикновено изолирани от растителен материал, които се свързват към специфични захарни части. Много лектини са способни, също така да аглутинират клетки и да стимулират линфоцити. Въпреки това рицинът е токсичен лектин, който се използва в имунотерапията. Това се осъществява чрез свързване на алфа-пептидната верига на рицина, който е отговорен за токсичността, към полипептида за да се позволи сайт-специфичната доставка на токсичния ефект.

Токсините са отровни вещества, продуцирани от растения, животни или микроорганизми, които в достатъчна доза често са летални. Дифтерийният токсин е вещество, продуцирано от Corynebacterium diphtheria, който може да се използва терапевтично. Този токсин се състои от алфа и бета субединици, които при подходящи условия могат да бъдат разделени. Токсичният А компонент може да се свърже към полипептида от изобретението и може да се използва за сайт-специфична доставка на взаимодействащите В-клетки и Т-клетки, които са доведени в близост чрез свързване към полипептида от изобретението.

Други терапевтични средства, като описаните по-горе, могат да се свържат към полипептида от изобретението, както и съответни ех vivo и in vivo терапевтични протоколи, са известни или могат лесно да бъдат установени от специалистите в областта. Когато е подходящо специалистът в областта може да използва полипептида от изобретението, описан по-горе, кодиращ който и да е от горе описаните полипептиди или съответните вектори, вместо самия протеинов материал.

Следователно специалистът в областта ще оцени това, че полипептидът от изобретението може да се използва за конструиране на други полипептиди с желана специфичност и биологична функция. Очаква се полипептидите от изобретението да играят важна терапевтична и научноизследователска роля, по-точно в областта на медицината, например при разработка на нови подходи за лечение за В-клетъчно свързаните нарушения, като някои форми на рак или автоимунни заболявания или като интересно средство за анализиране и модулиране на съответния биологичен път на трансдукция на клетъчния сигнал.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, този поне един друг домен включва молекула, избрана от група, състояща се от ефекторни молекули, притежаващи конфолмация подходяща за биологична активност, аминокиселинни последователности, способни да отделят един йон, и аминокиселинни последователности, способни на селективно свързване към твърда подложка или към предварително избран антиген.

За предпочитане този друг домен включва ензим, токсин, рецептор, сайт за свързване, сайт за свързване на биосинтетично антитяло, растежен фактор, фактор за клетъчна диференциация, лимфокин, цитокин, хормон, лесно установима частица, антиметаболит, радиоактивен атом или антиген. Посоченият антиген може да бъде, например туморен антиген, вирусен анти ген, микробиален антиген, алерген, автоантиген, вирус, микроорганизъм, полипептид, пептид или множество туморни клетки.

Освен това, посочената последователност, способна да отдели един йон, се избира за предпочитане измежду калмодулин, металотионеин, техни функционални фрагменти, или аминокиселинна последователност богата поне на една от глутаминова киселина, аспартат, лизин и аргинин.

Освен това посочената полипептидна последователност, способна селективно да се свързва към твърда подложка, може да е положително или отрицателно заредена аминокиселинна последователност, цистен-съдържаща аминокиселинна последователност, авидин, стрептавидин, функционален фрагмент от протеин А на Staphylococcus, GST, His-tag, FLAG-tag или Lex А. Както се описва в прилежащите примери за изпълнение, полипептидът от изобретението, обяснен с едноверижно антитяло, се експресира с N-терминален FLAG-tag и/или С-терминален His-tag, което позволява по-лесното пречистване и откриване. FLAG-tag, който се използва в примера включва 8 аминокиселини (виж фигура 8) и така се използва за предпочитане, съгласно настоящото изобретение. Въпреки това, FLAG-tag включващи съкратени версии на FLAG се използват в прилежащите примери за изпълнение, като аминокиселинната последователност Asp-Tyr-Lys-Asp също е подходяща.

Ефекторните молекули и аминокиселините последователности, описани по-горе могат да присъстват в проформа, която от своя страна е или активна или не, и които могат да се отстранят, когато например, навлязат в известно клетъчно обкръжение.

При един особено предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посоченият рецептор е костимулираща повърхностна молекула, важна за Т-клетьчното активиране или включваща сайт за свързване на епитоп или сайт за свързване на хормон.

При друг особено предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посочената костимулираща повърхностна молекула е CD80 (В71) или CD86 (В7-2).

При друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение се отнася до полинуклеогиди, които след експресия кодират го9 ре описаните полипептиди. Посочените полинуклеотиди могат да са слети към подходящи последователности за контрол на експресията, известни от нивото на техниката, че осигуряват правилна транскрипция и транслация на полипептидите.

Посочените полинуклеотиди могат да бъдат например, ДНК, сДНК, РНК, или синтетично продуцирана ДНК или РНК или рекомбинантно продуцирана химерна молекула на нуклеинова киселина, включваща който и да е от тези полинуклеотиди, било то самостоятелно или в комбинация. За предпочитане, посоченият полинуклеотид е част от вектор. Такива вектори могат да включват други гени, като маркерни гени, които позволяват селекционирането на този вектор в подходяща клетка гостоприемник и при подходящи условия. За предпочитане полинуклеотидът от изобретението е свързан към последователност контролираща експресията, позволяваща експресия в прокариотни или еукариотни клетки. Експресията на посочения полинуклеотид включва транскрипция на полинукпеотида в способна да бъде транслирана иРНК. Регулаторните елементи осигуряващи експресията в еукариотни клетки, за предпочитане клетки от бозайници, са известни на специалистите в областта. Те обикновено включват регулаторни последователности осигуряващи иницииране на транскрипцията и при желание poly-A сигнали, осигуряващи крох на транскрипцията и стабилизиране натранскрипта. Допълнителни регулаторни елементи могат да включват енхансери на транскрипцията, както и енхансери на транслацията, и/или естествено асоциирана или хетероложна промоторна област. Възможните регулаторни елементи позволяващи експресия в прокариотни клетки гостоприемници включват например, PL, lac, trp или tac промотор от Е. coli, а примери за регулаторни елементи позволяващи експресията в еукариотни клетки са АОХ1 или GAL1 промотор в дрожди или CMV-, SV40-, RSV-промотор (Rous sarcoma virus), CMV-енхансер, SV-40енхансер или глобулинов интрон в клетки от бозайници или от други организми. Освен елементите, отговорни за инициирането на транскрипцията, такива регулаторни елементи могат също така да включват сигнали за край на транскрипцията, като SV40-poly-A сайт или tk-poly-Асайт, в посока downstream от полинуклеотида. Освен това, според използваната експресионна система могат да се прибавят към кодиращата последователност на полинуклеотида от изобретението лидерни последователности насочващи полипептида към клетъчното пространство или секретиращи го в средата, добре известни от състоянието на техниката; виж също така например, примерите за изпълнение на изобретението. Лидерната последователност(и) се сглобява в подходяща фаза с транслационните, иницииращите и последователностите затерминация, и за предпочитане лидерна последователност, способна да насочва транслацията на секретирания протеин, или негова част, към периплазматичното пространство или извънклетъчната среда. По желание, хетероложната последователност може да кодира слят протеин, включващ N-терминален идентификационен пептид, придаващ желаните характеристики, например стабилизиране или опростено пречистване на експресирания рекомбинантен продукт; виж по-горе. В този контекст, подходящи експресионни вектори са добре известни от състоянието на техниката, OkayamaBerg cDNA expression vector pcDV 1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogene), or pSPORTl (GIBCO BRL).

За предпочитане, последователностите контролиращи експресията са еукариотни промоторни системи във вектори способни да трансформират или да трансфектират еукариотни клетки гостоприемници, но могат да се използват също така контролни последователности за прокариотни клетки. След като векторът е вече инкорпориран в подходящия гостоприемник, гостоприемникът се поддържа при условия, подходящи за високо ниво на експресия на нуклеотидните последователности, и при желание може да следва събиране и пречистване на полипептида от изобретението; виж например прилежащите примери за изпълнение.

Както се описва по-горе, полипептидът от изобретението може да се използва самостоятелно или като част от вектор за експресия на полипептида от изобретението в клетки, например при генна терапия или диагностициране на заболявания свързани с В-клетъчни нарушения. Полинуклеотидите или векторите съдържащи ДНК последователност(и), кодираща който и да е от горе описаните полипептиди, се въвежда в клетката, която на свой ред продуцира полипеп тида представляващ интерес. Генната терапия, която се основава върху въвеждането на терапевтични гени в клетки чрез ex vivo или in vivo техники е едно от най-важните приложения на трансфера на гени. Подходящи вектори, методи или системи за доставка на гени за ex vivo или in vivo генна терапия са описани в литературата и са добре известни на специалистите в областта; виж например Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann.

N. Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 1994/029469; WO 1997/000957, US 5,580,859; US 5,589,466; or Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; цитираната литературна справка. Полинуклеотидите и векторите от изобретението могат да се проектират за директно въвеждане в клетката чрез липозоми, или чрез вирусни вектори (например, аденовирусен, ретроверусен). За предпочитане, посочената клетка е клетка от микробиална клетъчна линия, ембрионална клетка, или яйчна клетка, или техни производни, за предпочитане посочената клетка е стволова клетка. Пример за ембрионална стволова клетка може да бъде стволова клетка, както се описва в Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

Съгласно горе описаното, настоящото изобретение се отнася до вектори, определени плазмиди, козмиди, вируси и бактериофаги, използвани конвенционално в генното инженерство, които включват полинуклеотид кодиращ полипептида съгласно изобретението. За предпочитане посоченият вектор е експресионен вектор и/или вектор за трансфер на гени или вектор за насочване. Експресонните вектори, произлизащи от вируси, като ретровирусите, ваксиния вирусите, адено-асоциираните вируси, херпес вирус или говежди папилома вирус, могат да се използват за доставка на полинуклеотидите или векторите на изобретението в популации от клетки мишени. Могат да се използват методи, добре известни на специалиста в областта, за конструиране на рекомбинантни вектори; виж например, техниките описани в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989). Алтернативно, полинуклеотидите и векторите съгласно изобретението могат да се реконституират в липозоми за доставка в клетките мишени. Векторите съдържащи полинекпеотидите на изобретението могат да се прехвърлят в клетка гостоприемник чрез добре известни методи, които варират според клетъчния вид на гостоприемника. Например, трансфекция с калциев хлорид широко се използва за прокариотни клетки, докато обработка с калциев фосфат или електропорация могат да се използват за други клетки госториемници; виж например Sambrook погоре. След като се експресират, полипептидите от изобретението могат да се пречистят, съгласно стандартни процедури от състоянието на техниката, включително утаяване с амониев сулфат, афинитетна колонна хроматография, гел-електрофореза и други; виж Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N. Y. (1982). Съществено чисти полипептиди c приблизително 90 до 95% хомогенност са предпочитани, а 98 до 99% или повече хомогенност са най-предпочитаните за фармацевтично използване. След като са пречистени частично или до желаната хомогенност, полипептидте могат да се използват терапевтично (включително екстракорпорално) или за развитието и усъвършенстването на изследванията.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до клетка, съдържаща описания по-горе полипептид или вектор. За предпочитане посочената клетка е екариотна, попредпочитано клетка от бозайник, ако се предвижда терапевтично използване на полипептида. Дрождите, както и по-малко предпочитаните прокариотни клетки, например бактериални клетки, също могат да служат, по-специално ако продуцираният полипептид се използва като диагностично средство.

Полинуклеотидът или векторът, съгласно изобретението, който присъства в клетката гостоприемник може или да е интегриран в генома на клетката гостоприемник или може да се поддържа извънхромозомно.

Терминът “прокариотен” се счита, че включва всички бактерии, които могат да бъдат трансформирани с ДНК или РНК молекули за експресиране полипептида от изобретението. Прокариотните клетки гостоприемници могат да включват Грам негативни, както и Грам позитивни бактерии, като например, Е. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Терминът “еукариотен” се счита, че включва клетки от дрожди, от висши растения, от насекоми и за предпочитане от бозайници. Според използваният гостоприемник в процедурата за рекомбинантно продуциране, полипептидите от настоящото изобретение могат да са гликозилирани или да не са гликозилирани. Полипептидите от изобретението могат също така да включват един първоначален метионинов аминокиселинен остатък. Полинуклеотид, кодиращ за полипептида от изобретението може да се използва за трансформиране или трансфектиране на гостоприемника, при използване на техники, добре известни на специалистите в областта. Особено предпочитано е използването на плазмид или вирус, съдържащ кодиращата последователност на полипептида от изобретението и генетично слят към него N-терминален FLAG-tag и/или С-терминален His-tag. За предпочитане дължината на този FLAG-tag е приблизително 4 до 8 аминокиселини, по-предпочитано 8 аминокиселини. Методи за приготвяне на слети, оперативно свързани гени и за тяхната експресия в, например клетки на бозайници и бактериални клетки са добре известни от състоянието на техниката (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y, 1989). Описаните там генетични структури и методи могат да се използват за експресиране на полипептида от изобретението в еукариотни или прокариотни гостоприемници. Най-общо, експресионните вектори, съдържащи промоторни последователности, които улесняват ефикасността на транскрипцията на инсерирания полинуклеотид, се използват според гостоприемника. Характерно, експресионният вектор съдържа едно начало на репликация, промотор и терминатор, както и специфични гени, които са способни да предоставят фенотипна селекция на трансформираните клетки. Освен това, трансгенни животни, за предпочитане бозайници, съдържащи клетки от изобретението могат да се използват при широкомащаб ното производство на полипептида от изобретението.

При друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на описания по-горе, включващ култивиране на клетки от изобретението при условия, подходящи за ексресията на полипептида и изолиране на полипептида от клетките или от културалната среда.

Трансформираният гостоприемник може да се отглежда във ферментатор и да се култивира, съгласно техниките известни от състоянието на техниката, за да се постигне оптимален клетъчен растеж. Полипептидът от изобретението може след това да се изолира от културалната среда, клетъчен лизат или фракции на клетъчни мембрани. Изолирането и пречистването на например, микробиално експресирани полипептиди на изобретението може да е чрез което и да е конвенционално средство, като разделяне чрез препаративна хроматография и имунологично разделяне, като тези изискващи използването на моноклонални или поликлонални антитела насочени срещу, например, tag на полипептида на изобретението или както е описано в примерите за изпълнение на изобретението.

Следователно, настоящото изобретение дава възможност за рекомбинантно продуциране на полипептиди, включващи сайт на свързване, притежаващ афинитет и специфичност за епитоп за CD 19 и CD3 антигена, и по желание друг функционален домен. Както става ясно от горното, изобретението предоставя голяма фамилия полипептиди, съдържащи такива сайтове за свързване за използване при каквито и да са терапевтични или диагностични подходи. За специалиста в областта е ясно, че полипептидите от изобретението могат, освен това, да бъдат свързани към други частици, както е описано по-горе, например, лекарствени средства, насочващи и изобразяващи приложенията. Такова свързване може да се проведе химически след експресия на полипептидите към сайта за прикрепване или продуктът на свързване може да се конструира в полипептида на изобретението на ДНК ниво. След това ДНК-ите се експресират в подходяща гостоприемнкова система и експресираните протеини се събират и се ренатурират (възстановяват) при необходимост. Както е описано погоре, сайтовете на свързване за предпочитане произлизат от вариабилната област на антителата. В това отношение хибридомната технология дава възможност да се продуцират клетъчни линии, секретиращи антитяло за практически което и да е желано вещество, което дава имунен отговор. След това може да се получи от цитоплазмата на хибридомата РНК кодираща леките и тежките вериги на имуноглобулина. Участъкът от 5' края на иРНК може да се използва за получаване на сДНК, която да се използва при метода от настоящото изобретение. ДНК кодираща полипептидите на изобретението може след това да се експресира в клетки, за предпочитане клетки от бозайници.

Според клетката гостоприемник може да са необходими техники за ренатурация, за да се постигне правилна конформация. При необходимост в ДНК може да се направи точково заместващо търсене за оптимизиране на свързването, при използване на конвенционален касетен мутагенез или други методологии за конструиране на протеини, като описаната в настоящото. Изготвянето на полипептидите на изобретението може също да зависи от известността на аминокиселинната последователност (или съответната ДНК или РНК последователност) на биоактивни протеини, като ензими, токсини, растежни фактори, фактори за клетъчна диференциация, рецептори, антиметаболити, хормони или различни цитокини или линфокини. Такива последователности са известни от литературата и са на разположение посредством компютъризирани бази данни. Например, полипептидът на изобретението може да се конструира, така че да се състои от едноверижен Fv фрагмент и извънклетъчната част на човешкия ко-стимулиращ протеин CD80 (В7-1) свързан чрез (Gly4Ser 1) 1 линкер. Ко-стимулиращият протеин CD80 принадлежи на Ig суперфамилията. Той представлява силно гликозилиран протеин от 262 аминокиселини. Поподробно описание е публикувано от Freeman, J. Immunol. 143 (1989), 2714-2722. Стабилна експресия може да се осъществи в, например DHFR дефицитни СНО-клетки, както е описано от Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537566. След това протеинът може да се пречисти чрез неговия His-tag, прикрепен към С-края при използване HaNi-NTA-column (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995), 7021-7025).

Освен това настоящото изобретение пре доставя състави, включващи горепосочения полипептид, полинуклеотид или вектор от настоящото изобретение.

За предпочитане, настоящото изобретение се отнася до състави, които са фармацевтични състави, включващи горепосочения полипептид^), полинуклеотид(и) или вектор(и) от настоящото изобретение.

Фармацевтичният състав, съгласно настоящото изобретение, може освен това да включва фармацевтично приемлив носител. Примери за подходящи фармацевтични носители са добре известни от състоянието на техниката и включват буферирани с фосфат физиологични разтвори, вода, емулсии, като маслено-водни емулсии, различни видове омокрящи средства, стерилни разтвори, и др. Състави, включващи такива носители могат да се приведат във фармацевтична форма чрез добре известни конвенционални методи. Тези фармацевтични състави могат да се прилагат на субекта в подходяща доза. Прилагането на подходящи състави може да се осъществи по различни пътища, например интравенозно, интраперитонеално, подкожно, интрамускулно, локално или интрадермално. Режимът на дозата ще се определи от лекуващия лекар и клиничните фактори. Както е добре известно от медицинската литература, дозите за всеки един пациент, зависят от много фактори, включително ръста на пациента, площта на телесната повърхност, възрастта, определеното съединение, което ще бъде приложено, пола, времето и начина за прилагане, общото здравословно състояние и другите лекарствени средства, които се прилагат конкурентно. Най-общо, режимът за редовно прилагане на фармацевтичния състав трябва да е в границите от 1 micro g до 10 mg единици дневно. Ако режимът е непрекъснато вливане, трябва да бъде в границите от 1 micro g до 10 mg единици на килограм телесно тегло за минута, съответно. Въпреки това, по-предпочитана доза за непрекъснато вливане, трябва да бъде в границите от 0,01 micro g до 10 mg единици на килограм телесно тегло за час. Изключително предпочитани дози са посочените по-долу. Може да се следи прогресирането чрез периодично оценяване. Дозата ще варира, но предпочитаната доза за интравенозно прилагане на ДНК е от приблизително 10⁶ до 10¹² копия на ДНК молекулата. Съставът от изобретението може да се приложи локално или систематично. Обикновено, прилагането е парентерално, например интравенозно; ДНК също може да се приложи директно в мястото мишена, например чрез биолистична доставка към вътрешен или външен сайт мишена или чрез катетър към сайт в артерия. Приготвянето за парентерално приложение включва стерилни водни или не-водни разтвори, суспензии и емулсии. Примери за неводни разтворители са пропилен гликол, полиетилен гликол, растителни масла, като маслинено масло, и инжектируеми органични естери, като етил олеат. Водните носители включват вода, алкохол/водни разтвори, емулсии или суспенсии, включително физиологичен разтвор и буферирани среди. Парентералните вехикулуми включват разтвор на натриев хлорид, Ringer’s декстроза, декстроза и натриев хлорид, лактиран Ringer или фиксирани масла. Интравенозните вехикулуми включват течност и хранителни добавки, електролитни добавки (като тези основаващи се на Ringer’s декстрозата), и др. подобни. Могат да присъстват също и консерванти и други допълнения като например, антимикробиални средства, антиоксиданти, хелатни средства и инертни газове и др. подобни. Освен това, фармацевтичният състав на настоящото изобретение може да включва протеинови носители като например, серумен албумин или имуноглобулин, за предпочитане с човешки произход. Освен това се предвижда фармацевтичният състав от изобретението да може да включва биологичноактивно средство, според желаното използване на фармацевтичния състав. Такива средства могат да бъдат лекарствени средства, действащи върху гастро-интестиналната система, лекарствени средства, действащи като цитостатици, лекарствени средства, предотвратяващи увеличената пикочна киселина в кръвта, и/или средства като Т-клетьчни ко-стимулиращи молекули или цитокини, известни от състоянието на техниката.

Настоящото изобретение предвижда, че различните полинуклеотиди и вектори от настоящото изобретение се прилагат било то самостоятелно или в каквато и да е комбинация, при използване на стандартни вектори и/или системи за доставка на гени, и при желание заедно с фармацевтично приемлив носител или пълнител. След прилагането посочените полинуклеотиди и вектори могат да бъдат стабилно интегрирани в генома на субекта.

От друга страна могат да се използват вирусни вектори, които са специфични за някои клетки или тъкани и продължават да съществуват в посочените клетки. Подходящи фармацевтично приемливи носители или пълнители са известни от състоянието на техниката. Фармацевтичните състави, приготвени съгласно настоящото изобретение, могат да се използват за предотвратяване или лечение или отлагане във времето на различни видове заболявания, които са свързани с В-клетъчно свързаните имунонедостатьчности и злокачествени прояви.

Възможно е да се използва, освен това, фармацевтичният състав, съгласно изобретението, който включва полинуклеотид или вектор от изобретението за генна терапия. Подходящи системи за доставка на гени могат да включват липозоми, рецептор-медиирана система за доставка, гола ДНК и вирусни вектори като херпес вирус, ретровируси, адено-асоциирани вируси, измежду другите. Доставянето на нуклеинови киселини в специфично място в тялото за генна терапия може също да се постигне при използване на система за биолистична доставка, като описаната от Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Други методи за доставка на нуклеинови киселини включват генен трансфер медииран от частици, като например, описания във Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692699. Трябва да се разбира, че въведените полинуклеотиди или вектори експресират генния продукт след въвеждане в посочената клетка и за предпочитане остават с този статус по време на полуживота на посочената клетка. Например, може да се проектира, съгласно методи, добре известни на специалистите в областта, клетъчна линия, която стабилно да експресира полинуклеотида под контрола на подходящи регулаторни последователности. Вместо да се използват вектори, които съдържат вирусно начало на репликация, клетките гостопиремници могат да се трансформират с полинуклеотида от изобретението и селекционен маркер, или от едни и същи или от различни плазмиди. След въвеждането на горе посочената ДНК, проектираните клетки могат да се оставят да прорастват 1 -2 дни в обогатена среда, след което се включва селективна среда. Селекционният маркер в рекомбинантния плазмид придава устойчивост към се лекцията и позволява подбора на клетки, притежаващи стабилно интегриран плазмид в техните хромозоми и прорастват под формата на огнище, което на свой ред може да бъде клонирано и да се развие в клетъчна линия. Такива проектирани клетъчни линии също са изключително полезни при методите за скриниране за откриване на съединения включени, например във взаимодействията В-клетки/Т-клетки.

Могат да се използват голям брой селекционни системи, включително, но без да се ограничават до, тимидин киназа на херпес симплекс вирус (Wigler, Cell 11 (1977), 223), хипоксантин-гуанин фосфорибозил трансфераза (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), и аденин фосфорибозил трансфераза (Lowy, Cell 22 (1980), 817) в tk‘, hgprt или aprt клетки, съответно. Също, може да се използва устойчивост на антиметаболити, като основа за селекция на dhfr, който придава устойчивост на метотрексат (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O’Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, който придава устойчивост на микофенолна киселина (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, който придава устойчивост на аминогликозида G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); hygro, който придава устойчивост на хигромицин (Santerre, Gene 30 (1984), 147); или пуромицин (pat, пуромицин N-ацетил трансфераза). Описани са допълнителни селекционни гени, например trpB, който дава възможност на клетките да използват индол вместо триптофан, hisD, който дава възможност на клетките да използват хистинол вместо хистидин (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); и ODC (орнитин декарбоксилаза) който придава устойчивост на орнитин декарбоксилазен инхибитор, 2-(дифлуорометил)-ОЬорнитин, DFMO (McCologue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).

При друг вариант за изпълнение настоящото изобретение се отнася до диагностични състави, включващи който и да е от гореописаните пептиди, полинуклеотиди или вектори от изобретението и по желание подходящи средства за определяне.

Полипептидите от изобретението също са подходящи за използване при имуноизследвания, при които те могат да бъдат използвани в течна фаза или да бъдат свързани към твърдофазов носител. Примери за имуноизследвания, които могат да използват полипептиди от настоящото изобретение са компетитивни и некомпетитивни имуноизследвания в директен или индиректен формат. Примери за такива имуноизследвания са радиоимуноизследването (RIA), сандвич (имунометрично изследване) и Western blot изследването. Полипептидите от настоящото изобретение могат да бъдат свързани към много различни носители и да се използват, за да се изолират клетки специфично свързани към посочените полипептиди. Примери за добре известни носители включват стъкло, полистирен поливинил хлорид, полипропилен полиетилен поликарбонат, декстран, найлон, амилози, естествени и модифицирани целулози, колоидални метали, полиакриламиди, агарози и магнетит. Същността на носителя може да е или разтворим или неразтворим за целите на изобретението.

Съществуват много различни маркери и методи за белязане, известни на специалистите в областта. Примери за такъв тип маркери, които могат да бъдат използвани в настоящото изобретение, включват ензими, радиоизотопи, колоидални метали, флуоресцентни съединения, хемилуминесцентни съединения и биолуменисцентни съединения; виж също вариантите за изпълнение, дискутирани по-горе.

Настоящото изобретение се отнася също така до използване на полипептидите, полинуклеотидите и векторите от настоящото изобретение, описани по-горе за получаване на фармацевтичен състав за лечение на В-клетъчни злокачествени образувания, В-клетъчно медиирани автоимунни заболявания или изтощаване на Вклетки.

Наскоро проведени клинични изследвания за пренасочване на цитотоксичната активност на човешки Т клетки чрез биспецифични антитела са показали обещаващи резултати при лечението на рефракторна болест на Hodgkin [33], рак на гърдата и яйчниците [34-37] и злокачествена глиома [38]. Като се вземат предвид фактите

- че bsc антитела, поради тяхната ниска молекулна маса улесняват навлизането в тумори (както бе показано за Fab или Fv фрагменти) [39]; и

- допуска се, че bsc антитела намаляват зависимата от дозата и ограничаваща дозата ток сичност, причинена от системното освобождаване на цитокини медиирано от Fc части на конвенционално биспецифично антитяло; и

- това, че интактно моноклонално антитяло (насочено срещу CD20) води до туморна репресия при напредналите стадии HaNHL [41,42], се очаква и действително е било показано, че полипептидите от изобретението са интересни молекули, които допринасят за допълнително терапевтично подобрение.

Следователно при един предпочитан вариант, фармацевтичният състав на изобретението, се използва за лечение на не-Hodgkin лимфома.

Границите на дозата за прилагане на полипептидите, полинуклеотидите и векторите от изобретението са достатъчно широки за да доведат до желания ефект, при който симптомите на В-клетьчно медиираните заболявания се подобряват. Дозата не трябва да е толкова голяма, че да причини основни обратни странични ефекти, като нежелани кръстосани реакции, анафилактични реакции и други подобни. Обикновено дозата варира според възрастта, състоянието, пола и разпространението на болестта в пациента и може да бъде определена от специалиста в областта. Дозата може да се определи от индивидуалния лекар по време на каквито и да са контраиндикации. Предвижда се границата на посочената доза да е при 0,01 micro g до 10 mg от полипептида на изобретението. Изключително предпочитана доза е 0,1 micro g до 1 mg, попредпочитана е 1 до 100 micro g и още по-предпочитана е доза от 3 до 10 micro g (претенция 7).

Изобретението се отнася също така и до метод за идентифициране на съединения за активиране или ко-стимулиране на Т-клетки или за идентифициране на инхибитори на активирането и стимулирането на Т клетки, включващ

а) култивиране на CD 19 позитивни клетки (за предпочитане В клетки) и Т клетки в присъствието на полипептида от изобретението и при желание в присъствието на съставка, способна да предостави сигнал, който може да бъде отчетен в отговор на Т клетъчното активиране със съединение, което ще бъде скринирано при условия, позволяващи взаимодействие на съединението с клетките; и

б) определяне присъствието или отсъствието на сигнал генериран от взаимодействието на съединението с клетките.

Този вариант за изпълнение е изключително полезен за тестване на способността на съединенията като ко-стимулиращи молекули. При този метод CD 19 позитивни клетки/В клетки предоставят първичен сигнал за активиране на Т клетки, като по този начин се избягва клонотипичния Т клетъчен рецептор. След това може да се определи съгласно изобретението, кое от съединенията за тестване е все още необходимо действително да активира Т клетките. При този метод от изобретението CD 19 позитивни клетки/В клетки функционират, като стимулиране на клетки, свързващи биспецифични молекули, които се свързват към CD3 комплекси на повърхността на същите Т клетки. Биологичните методи за провеждане на култивирането, определяне и по желание тестване са ясни за специалиста в областта.

Терминът “съединение” в метода от изобретението включва сигнално вещество или множество вещества, които могат да бъдат или не идентични. Посоченото съединение(я) може да е включено, например в проби, например, клетъчни екстракти от, например растения, животни или микроорганизми. Освен това посочените съединения могат да са известни от състоянието на техниката, но досега да не са били известни със способността си да инхибират Т-клетьчното активиране или да не са били известни с полезността си като Т-клетъчен ко-стимулиращ фактор. Множество съединения може например, да се добави към културалната среда или да се инжектира в клетката. Ако при метода на изобретението, се идентифицира проба съдържаща съединението, тогава е възможно или да се изолира съединението от първоначалната проба, идентифицирана като съдържаща въпросното съединение или впоследствие първоначалната проба може да се раздели, например, ако се състои от множество различни съединения, така че да се намали броят различни съединения за проба и да се повтори методът с подразделенията на първоначалната проба. След това може да се определи дали посочената проба или съединение проявява необходимите качества, чрез методи, известни от състоянието на техниката, като описаните в настоящото и в прилежащите претенции. В зависимост от сложността на пробите, гореописаните етапи могат да се проведат няколко пъти, за предпочитане докато пробата, идентифицирана съгласно метода на изобретението, включва единствено ограничен брой от или само едно вещество. За предпочитане посочената проба включва вещества с подобни химични и/ или физични свойства, а по-предпочитано е посочените вещества да са идентични. Методите на изобретението могат лесно да се проведат и да се проектират от специалист в областта, например, съгласно други опити, извършени на базата на клетки, описани в състоянието на техниката или при използване и модифициране на методи, както са описани в прилежащите примери за изпълнение. Освен това специалистът в областта лесно ще разпознае кои други съединения и/или клетки могат да се използват за осъществяване на методите на изобретението, например, интерлевкини или ензими, които при необходимост конвертират някое съединение в предшественика, който на свой ред стимулира или потиска Т клетъчното активиране. Такова адаптиране на метода на изобретението е в способностите на специалиста в областта и може да се осъществи без ненужно експериментиране.

Съединения, които могат да се използват съгласно метода на настоящото изобретение, включват пептиди, протеини, нуклеинови киселини, антитела, малки органични съединения, лиганди, пептидомиметици, PNAs и други подобни. Посочените съединения могат да бъдат също така функционални производни или аналози на известни Т-клетъчни активатори или инхибитори. Методи за получаване на химични производни и аналози са добре известни на специалистите в областта и са описани, например, в Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, Ν. Y. 10010 U. S. A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Освен това посочените производни и аналози могат да се тестват за техния ефект, съгласно методи известни от състоянието на техниката или както е описано, например, в прилежащите примери за изпълнение. Освен това могат да се използват пептидомиметици и/или проектирани с помощта на компютър активатори или инхибитори на Т-клетьчно активиране например, съгласно долуописаните методи. Приспособени компютърни програми могат да се използват за идентифициране на сайтовете на взаимодействие на предполагаем инхибитор и на антигена от изобретението чрез компютърно търсене за комплементарни сктруктурни мотиви (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Други приспособени компютърни програми за компютьрно-подпомогнато проектиране на протеин и пептиди, се описва в предшестващото състояние на техниката, например в Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Получените резултати от горе описаните компютърни анализи могат да се използват в комбинация с метода на изобретението, например за оптимизиране на известните Т-клетьчни активатори или инхибитори. Подходящи пептидомиметици също могат да се идентифицират чрез синтеза на пептидомиметични комбинирани библиотеки чрез последователни химични модификации и тестване на получените съединения, например, съгласно описания в настоящото метод и прилежащите примери за изпълнение. Методи за генериране и използване на пептидомиметични комбинирани библиотеки са описани в предшестващото състояние на техниката, например, в Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Освен това триизмерните и/или кристалографски структури на инхибиторите или активаторите на В-клетъчни/Т-клетъчни взаимодействия могат да се използват за проектиране на пептидомиметични инхибитори или активатори на Т-клетъчно активиране, което ще бъде тествано при метода от изобретението (Rose, Biochemistry 35 (1996), 1293312944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Най-общо, изобретението предоставя методи за идентифициране на съединения, които са способни да модулират В-клетьчен/Т-клетъчен имунен отговор.

Съединения, за които е открито, че активират В-клетъчно/Т-клетьчно медииран отговор, могат да се използват за лечение на рак и сродните заболявания. Освен това може да е възможно специфично да се инхибират вирусни заболявания, като по този начин се предотвратява вирусна инфекция и нейното разпространение. Съединенията, които са идентифицирани като супресори на Т-клетъчното активиране или стимулиране, могат да се използват при трансплантирането на органи, за да се избегне отхвърлянето на трансплантата; виж по-горе.

Съединенията идентифицирани или получени съгласно метода на настоящото изобретение се очаква да са много полезни при диагностиката, и по-специално за терапевтично приложение. След като при един друг вариант за изпълнение изобретението се отнася до метод за продуциране на фармацевтичен състав, включващ привеждане на идентифицираното съединение от етап (б) във фармацевтична форма, на горе описаните методи на изобретението, във фармацевтично приемлива форма. Освен това се има предвид, че посоченият компонент може да бъде модифициран от пептидомиметици. Методи за генериране и използване на пептидомиметични комбинаторни библиотеки са известни от състоянието на техниката, например, Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210-234, Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213-216, or al-Obeidi, Mol. Biotech. 9 (1998), 205-223.

Терапевтично полезните съединения, идентифицирани съгласно метода на изобретението могат да се прилагат на пациент по който и да е подходящ метод за конкретното съединение, например, орално, интравенозно, парантерално, трансдермално, трансмукозно или хирургично или чрез имплантиране (например, като съединението е под формата на твърд или полутвърд биологично съвместим и резорбционен матрикс) в или близо до мястото, където се желае ефектът на съединението. Терапевтичните дози е подходящо да се определят от специалиста в областта, виж по-горе.

Допълнително, настоящото изобретение предоставя метод за лечение на В-клетични злокачествени заболявания, В-клетьчно медиирани автоимунни заболявания или изтощаване на Вклетките и/или метод за отлагане на патологично състояние, причинено от B-клетъчни нарушения, включващ въвеждане на полипептида, полинуклеотида или вектора на изобретението в клетка на бозайник, засегната от посочените злокачествени заболявания и/или патологично състояние. Предпочита се освен това, посоченият бозайник да е човек.

Тези и други варианти за изпълнение на изобретението са описани и включени в описанието и примерите за изпълнение на настоящото изобретение. Друга литература, отнасяща се до което и да е от антителата, методите, използването и съединенията, използвани съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат открити в обществените библиотеки и бази данни, при използване например, на електронни устройства. Например може да се използва обществената база данни “Medline”, която е на разположение чрез интернет с адрес http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PubMed/medline.html. Други бази данни и адреси като http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. http:// www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/ research tools.html. http://www.tigr.org/, са известни на специалистите в областта и също могат да се получат при използване, например, на http://www.lycos.com. Преглед на патентната информация в биотехнологиите и оценка на релевантните източници, полезни за ретроспективно търсене и за текущо осведомяване са предоставени от Berks, TIBTECH 12(1994), 352-364.

Описание на приложените фигури

Фигура 1. SDS-PAGE: Coomassie оцветяване на пречистения bscCD19xCD3 фрагмент с различни количества протеин. Молекулярната маса (kDa) на маркера е посочена от лявата страна;

Фигура 2. FACS-анализ с bscCD19xCD3 (200 micro g/ml) върху различни CD19-no3Hтивни В-клетьчни линии (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), върху СО19-негативни В-клетъчна линия BL60 и върху СОЗ-позитивни Jurkat клетки и първични човешки PBMCs. Разрушените линии са индикация за негативни контроли;

Фигура 3. Цитотоксичност на bscCD 19xCD3 при изследване за освобождаването на ⁵¹Сг с нестимулирани човешки PBMCs и различни В-клетъчни линии. Ефектор: Съотношение на клетки мишени 10:1; време за инкубиране 4 h. Стандартно отклонение при всички проведени в три повторения опити 7%;

Фигура 4. Изследване за цитотоксичност при освобождаването на хром с нестимулирани на първични човешки PBLs срещу плазмацитомни клетъчни линии L363 и NC1 и лимфонна клетъчна линия Daudi Е:Т съотношение 20:1; време за инкубиране 8 h;

Фигура 5. Инхибиране на цитотоксичността на bscCD 19xCD3 чрез родителското антиCD 19 антитяло HD37 изследване за освобожда ването на хром; време за инкубиране 8 h; Е:Т съотношение 20:1; концентрация на bscCD19xCD3 1 ng/ml;

Фигура 6. Изследване за цитотоксичност с нестимулирани PBMCs срещу Daudi клетки, след прибавяне на нарастващи количества EGTA, Е:Т съотношение 10:1, време за инкубиране 4 h;

Фигура 7. Цитотоксичност на bscCD19xCD3 при изследване за освобождаването на ⁵¹Сг с нестимулирани човешки PBMCs и Blin-Ι като клетки мишени при различни Е:Т съотношения; време за инкубиране 4 h; концентрация на конвенционално биспецифично антитяло 3 micro g/ml; концентрация Habsc 17-lAxCD3 100 ng/ml; E:T съотношения както са посочени;

Фигура 8. ДНК- и протеинова последователност на bscCD19xCD3 антитяло (вариант съдържащ FLAG-tag). Цифрите сочат нуклеотидните (nt) позиции, съответните аминокиселини са посочени след нуклеотидната последователност. Кодиращата ДНК последователност за биспецифичното антитяло започва в позиция 1 и завършва в позиция 1593. Първите шест nt (позиции -10 до -5) и последните шест nt (позиции 1596 до 1601) съдържат сайтовете за разцепване на рестрикционните ензими EcoRI и Sail, съответно. Нуклеотиди от 1 до 57 уточняват лидерната последователност; нуклеотиди 82 до 414 и 460 до 831 кодират V_LCD19 и V_HCD19, съответно; нуклеотиди 847 до 1203 и 1258 до 1575 кодират V_HCD3 и V_LCD3, съответно; и нуклеотиди 1576 до 1593 кодират His-tag.

Фигура 9. Изтощаване на първичните (злокачествени) CD19⁺ В-клетки чрез събиране на автоложни първични Т-лимфоцити посредством bscCD 19xCD3.

А) Начало (t = 0): η = 3 χ 10⁶ PBL/ямка се посяват в 24-ямкови блюда за тькънно култивиране в обем от 1 ml RPMI 1640 среда всяка, с добавяне на 10% FCS към всяка. Първоначалното процентно съдържание на CD19⁺ В-клетки, както и това на CD4⁺- и CD8⁺ Т-клетки е посочено.

В-G) Относително преброяване на В- и CD4⁺- и CD8⁺ Т-клетки след t ~ 5 дни инкубиране при 37°С/5% СО₂ в отсъствие на (В-С) или в присъствие (D-G) на bscCD 19xCD3 (концентрации както са посочени) с или без 60 U/ml IL-2. Негативни контроли, съдържащи или биспецифично едноверижно антитяло (17-1 AxCD3) с не ясна клетъчна специфичност на мишената, или без биспецифично антитяло въобще (С).

Фигура 10. Етапи на пречистване за bscCD 19xCD3;

Фигура 11. Показан е SDS-PAGE анализ за чистотата на bscCD 19xCD3. Оцветен с колоидален Coomassie-blue SDS 4-12% градиент на полиакриламиден гел. Ивици 1 и 6, маркери за размер на молекулата; ивица 2, супернатанта от клетъчна култура; ивица 3, активна фракция от катионообменна хроматография; ивица 4; активни фракции на афинитетна хроматография с кобалтов хелат; ивица 5, активна фракция от гел филтрация. Равни количества протеин (2 micro g) от супернатантата на клетъчната култура и различните колонни фракции се анализират. Размерът в kDa на стандартите за молекулно тегло е посочен от дясната страна. Стрелката показва позицията на bscCD 19xCD3;

Фигура 12. Катионнообменна хроматография на bscCDl 9xCD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Профилът на етапа на градиент на NaCl е показан чрез непрекъсната права линия (%В, дясно) и събраните фракции са посочени чрез начупени линии. BscCD 19xCD3 се определят във фракция F6;

Фигура 13. Афинитетна хроматография с кобалтов хелат на bscCD 19xCD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Имидазоловия градиент е показан чрез непрекъсната права линия (%В, дясно) и събраните фракции са посочени чрез начупена непрекъсната линия. BscCD19xCD3 се открива във фракция F7;

Фигура 14. Гел филтрация на антиCD19xaHTH-CD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Начупените линии сочат събраните фракции. BscCDl9xCD3 се открива във фракции F7 съответстваща на молекулярен размер от приблизително 60 kDa;

Фигура 15. Кръвни нива на гама-глутамил трансфераза (GGT) в отговор на лечение с bscCD 19xCD3. GGT нива се определят чрез стандартен клиничен биохимичен метод и се изразяват като единица/I. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство.

Фигура 16. Ултразвукови измервания от далак на пациент А-В.

А: Определяне на размера на далака на 12 април 1999, преди терапия cbscCD19xCD3. Фигурата показва уголемен далак (размер 146 mm х 69,2 mm), което се дължи на инфилтрация на злокачествени В клетки.

В: Определяне на размера на далака на 16 април, 1999 след третиране с 3 micro g на 14 април, следвано от 10 micro g на 15 април. Снимката показва свиване на далака до размер 132 mm х 58,9 mm, причинено от системно третиране с bscCD 19xCD3. Несъответствията на единичните измерения на стойностите на размера, посочени в Таблица 1 се обясняват чрез различните пространствени планове при определянето на размера на органа чрез ултразвук. Двете измерения са белязани с (+) и (х);

Фигура 17. Преброяване на броя на левкоцитите в кръвта в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Броят на левкоцитите е даден в гига части/литьр. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;

Фигура 18. Кръвни нива на С-реактивен протеин (CRP) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на CRP се определят чрез стандартен клиничен биохимичен метод и се изразяват като mg/dl. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;

Фигура 19. Кръвни нива на тумор некрозис фактор-алфа (TNF) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на TNF се определят чрез ELISA и се изразяват с ng/ml. Оста за вре мето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;

Фигура 20. Кръвни нива на интерлевкин6 (IL-6) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-6 се определят чрез ELISA и се изразяват с pg/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;

Фигура 21. Кръвни нива на интерлевкин8 (IL-8) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-8 се определят чрез ELISA и се изразяват с pg/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;

Фигура 22. Кръвни нива на разтворим интерлевкин-2 рецептор алфа верига (IL-2R) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-2R се определят чрез ELISA и се изразяват в единици/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство.

Изобретението е описано с помощта на следните биологични примери, които са илюстративни и не ограничават обхвата му.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Клониране на вариабилни (V) имуноглоболинови домени

Домени на V лека верига (VL) и V тежка верига (VH) от HD37 хибридома [22] се клонират съгласно стандартни PCR методи [23]. Синтез на сДНК се осъществява с олиго dT праймери и Taq полимераза.

Списък на праймерите

5’Ll:

GAAGCACGCGTAGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA [SEQ ID NO: 1 ]

3’K:

GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [SEQ ID N0:2]

5Ή1:

CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAGSAG [SEQ ID NO: 3]

3’G:

ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT [SEQ ID NO: 4] 5’VLB5RRV:

AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA [SEQ ID NO: 5]

3’VLGS15:

GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC [SEQ ID NO: 6] 5’VHGS15:

GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG [SEQ ID N0:7]

3’VHBspEl:

AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTIGGCCCCAG[SEQ ID NO: 8]

За амплифицирането на V домените чрез PCR се използват праймери 5’Ll и 3’К, ограничаващи V_L домена, и5’Н1 иЗ’Оза тежката верига основаваща се на праймери, описани от Dubel et al. [24].

сДНК на анти-СОЗ scFv фрагмент любезно бе предоставена от A. Traunecker [25].

Пример 2. Конструиране на биспецифични едноверижни фрагменти и експресия в еукариоти

За получаване на анти-СО19 scFv-фрагмент, съответните VL- и VH-области, клонирани в отделни плазмидни вектори служат като матрици за VL- и VH-специфичен PCR, при използване на двойки олигонуклеотидни праймери 5’VLB5RRV/3’VLGS15 и 5’VHGS15/3’VHBspEI, съответно. По този начин припокриващите се комплементарни последователности се въвеждат в PCR-продуктите, които се комбинират, за да образуват кодиращата последователност от 15 аминокиселини (Gly₄Serj)₃-BHHKep по време на последващото сливане-PCR. Този етап на амплифициране се осъществява с праймерната двойка 5’VLB5RRV/3’VHBspEI и полученият слят продукт (или по-точно анти-СО19 scFv-фрагмент) се разцепва с рестрикционни ензими EcoRV и BspEI, като по този начин се клонира в KS-вектор (Stratagene) съдържащ или (EcoRI/Sall-кло ниран) кодираща последователност на анти-171 А/анти-СИЗ биспецифично едноверижно антитяло с N-терминален FLAG-tag [1] или този на модифицираната версия без FLAG/епитоп (21), като по този начин замества анти-17-1 А- с антиС019-специфичност и предпазване на 5-аминокиселинен (О^БегД-линкер свързващ С-терминалния анти-СОЗ scFv-фрагмент, съответно. След това, ДНК фрагментът; кодиращ двете версии на анти-CDl 9/анти-СОЗ биспецифичното едноверижно антитяло с подредбата на домени VLcDis-VHcDis-VHcoj-VLcDa^се субклонира EcoRI/ Sall в описания експресионен вектор pEF-DHRF [1], съответно. Получените плазмидни ДНК се трансфектират в СНО-клетки с дефицит на DHFRклетки чрез електропорация: Селекцията, генната амплификация и продуцирането на протеин се осъществяват както е описано [1]. В следващите примери са илюстрирани получените резултати с FLAG-съдьржащата версия на bscCD19xCD3.

Пречистване на bscCD19xCD3 от супернатантата на трансфектирани СНО клетки дава добив 4 mg/Ι културална супернатанта. bsc-Ab се пречиства чрез неговата С-терминална хистидинова опашка чрез афинитетна хроматография върху Ni-NTA-колона както е описано [1]. bsc-Ab се елюира от Ni-NTA колоната като отделен пик при концентрация от 200 тМ имидазол.

SDS-Page се провежда съгласно Laemmli [26] с 12% гел следвано от оцветяване с Coomassie brilliant blue R250 за анализиране на пречистването на bsc-Ab. Резултатите от SDS-PAGE анализа (Фиг. 1) показват очаквания размер на bscAb (60 kDa).

Пример 3. Свързващи свойства на bscAbCD19xCD3

Свързващите свойства на bsc-Ab към CD3 и CD 19 са показани чрез поточен цитометричен анализ върху CD3-позитивни Jurkat клетки, човешки PBMCs и известен брой различни клетъчни линии наСО19-позитивни В клетъчна лимфома, включително Blin I, SKW6.4,Daudi, В JAB and Raji. С019-позитивни В клетъчни линии Daudi, Raji, В JAB (лимфома на Burkitt), SKW6.4 (човешки EBV трансформирани В клетки) и Blin1 (pre В клетъчна линия) се използват при поточен цитометричен анализ и изследване за освобождаване на хром. Jurkat е СОЗ-позитивна Т клетъчна линия; BL60 и плазмоцитомни клетъчни линии NC1 и L363 са негативни за двете повърхностни молекули, CD3 и CD 19. Клетъчните линии се култивират в пълна RPMI 1640 (Biochrom) среда с 10% FCS (GIBCO).

χ 10⁶ клетки се промиват с PBS, ресуспендират се в 200 micro 1 PBS с 10 % Vemimmun (Centeon, Marburg, Germany) и 0,1 % NaN₃ и се инкубират 30 min при 4°С. След етапа на центрофугиране (100 х g, 5 min) клетките се инкубират в 50 micro 1 bscCD19xCD3 (200 micro g/ ml в PBS c 10 % Venimmun и 0,1 % NaN₃) за 30 min при 4°C. Клетките се промиват двукратно с PBS. За откриването на bsc-Ab се използва FITC-конюгирано антитяло срещу His-tag (Dianova). Ирелевантните bsc-Ab 17-lAxCD3, получени от същата експресионна система като bscCD19xCD3, или His-tag антитялото самостоятелно, служат като негативни контроли. Поточната цитометрия се провежда с Becton Dickinson FACScan. Не се установява свързване върху BL60, които не експресират нито CD 19 нито CD3 (Фиг. 2).

Пример 4. Цитотоксична активност на bscAbCD19xCD3 срещу С019-позитивни лимфомни клетки

За bscCD19xCD3 антитялото е доказано, че е силно цитотоксично за няколко лимфомни клетъчни линии при изследване за освобождаване на ⁵¹Сг (Фигура 3). От прясна коричка на рана се изолират мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв (PBMCs) като ефекторни клетки от произволни донори при използване на Lymphoprep™ (Nycomed) градиентно центрофугиране при 100 х g етапи на центрофугиране за отстраняване натромбоцитите. С019-позитивни В клетки се изтощават при използване на Dynabeads® М-450 CD19 (Dynal). Изтощените клетъчни популации се анализират чрез поточна цитометрия (Becton Dickinson), която показва 99% изтощаване на СО19-позитивни клетки. PBMCs се инкубират през цялата нощ при 37°С, 5% СО₂ С019-позитивни В клетъчни линии (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4) се използват като клетки мишени.

Цитотоксичността се измерва при стандартно изследване за освобождаване на хром в облодънни 96-ямкови блюда (Nunc) при използване на RPMI 1640 пълна среда (Biochrom) с 10% FCS (GIBCO).

Нестимулирани PBMCs се прибавят в количества от 80 microl среда към всяка ямка, съдържаща 20 micro 1 bsc-Ab в различни концентрации. След това се прибавят 100 micro 1 от ⁵¹Сгбелязани клетки мишени (1 χ 10⁴), блюдата се центрофугират 3 min при 100 х g и се инкубират 4 h при 37°С, 5 % СО₂. След допълнителен етап на центрофугиране се отстраняват 50 micro 1 супернатанта и се изследват за освобождаване на ⁵¹Сг в гама брояч (TopCount, Canberra Packard).

Спонтанното освобождаване се измерва при инкубиране на клетките мишени без ефекторни клетки или антитела, като максимално освобождаване се определя при инкубиране на клетките мишени с 10 % TritonX-100. Инкубирането на клетките мишени с bscAb без ефекторни клетки не води до лизис, който може да се измери. Процентът специфичен лизис се изчислява с неспецифичното освобождаване в (%)=[(срт, експериментално освобождаване) (срт, спонтанно освобождаване)] / [(срт, максимално освобождаване) - (срт, спонтанно освобождаване)] х 100. Всички тестове се провеждат в трикратно повторение. SD при трикратните повторения за всички експерименти е под 6%. За наподобяване на in vivo условията, се използват нестимулирани PBMCs от здрави донори като ефекторни клетки. Може да се наблюдава бързото индуциране на цитотоксичността до 4 h без какъвто и да е протокол за предварително сти мулиране на Т-клетките. Като контрола bsc-антитяло е различна туморна специфичност (bsc 171AxCD3), но генерирано чрез същата система, като bscCD19xCD3 антитялото, показва лизисна активност незначително над средния фон. Освен това, не може да се наблюдава цитотоксична активност при използване на плазмоцитомна клетъчна линия NC1 и L363, които не експресират CD19 като клетки мишени (Фигура 4). При компетитивни изследвания с нарастващи количества С019-специфично родителско моноклонално антитяло HD37, цитотоксичната активност на bscCD19xCD3 може почти напълно да се блокира (Фигура 5). Тези контроли показват, че bscCD 19хСОЗ-медиираните цитотоксични ефекти са антиген специфични. За да се получи повече информация за молекулярните механизми, как bscCD19xCD3 антитялото убива CD 19позитивните клетки мишени, бе проведен опит да се блокира bscCD 19хСОЗ-медиираната цитотоксичност чрез EGTA. Както е показано на Фигура 6, цитотоксичната активност на bscCD 19xCD3 може напълно да се блокира с EGTA, което означава, че специфичният лизис е по-скоро Т-клетъчно медииран ефект (най-вероятно чрез перфориновия синтетичен път), отколкото директен ефект (например, индуциращ апоптозис) на самото антитяло.

При използване на нестимулирани Т-клетки, даже при концентрации на антитялото под 1 ng/ml може да се наблюдава значителен цитотоксичен ефект срещу Blin-Ι клетки (Фигура 7). Даже при относително ниски Е:Т съотношения [5:1;2.5:1]ипри много високи концентрации на антитялото от 10-100 pg/ml, bscCD 19xCD3 антитялото може бързо да индуцира специфична цитотоксична активност на нестимулирани Т-клетки (Фигура 7). В противовес, конвенционално CD19xCD3 антитяло, генерирано по хибрид-хибридомна техника [5-7, 27] не показва значителна цитотоксична активност при тези условия, даже при концентрации до 3000 ng/ml (Фигура 7). Конвенционалното биспецифично антитяло се нуждае от допълнително Т-клетъчно престимулиране и от високи концентрации на антитяло от приблизително 100 ng/ml, за индуциране на специфична Т-клетьчна цитотоксичност (не е показано), което е в съгласие с литературата [5-7,27].

Пример 5. Изтощаване на първични (злокачествени) В-клетки с автоложни Т-клетки чрез цитотоксична активност на bscCD 19xCD3

С цел да се определи цитотоксичната активност на bscCD 19xCD3 върху първични злокачествени В-клетки, мононуклеарни клетки от периферна кръв (РВМС) на пациент, страдащ от B-CLL (В-клетъчна производна хронична лимфатична левкемия) се изолират чрез Ficoll плътностно градиентно центрофугиране. Тези клетки се култивират последователно в присъствие или отсъствие на bscCD 19xCD3 за 5 дни при 37°С/ 5% СО₂ в RPMI 1640 среда допълнена с 10% FCS и, по желание, с 60 U/ml IL-2. Поточният цитометричен анализ показва, че лимфоцитите от периферната кръв (PBL) на този определен NHL (Non-Hodgkin лимфома)-пациент (който след това систематично се лекува с bscCD 19xCD3; виж пример 7) съдържат 92,6% С019-позитивни В-клетки (= клетки мишени) и 7,4% CD3-noзитивни Т-лимфоцити (= ефекторни клетки) при съотношение CD4/CD8 на Т-клетките от 2,6:4,8. По-голямата част от тези СО19-позитивни Вклетки се състои от злокачествени клетки. 3x10⁶ PBL/ml на ямка се посяват в обем от 1 ml за всяка в 24-ямкови блюда за тъкънни култури. За негативни контроли се използва културална среда с прибавяне на IL-2 и културална среда с прибавен IL-2 с ирелевантно биспецифично едноверижно антитяло bscl7-lAxCD3 (1) при концентрация от 0,5 micro g/ml. Както е показано на Фигура 9, не се открива изтощаване на CD19-noзитивните клетки при тези условия след 5 дни инкубиране. Въпреки това, когато се добави bscCD 19xCD3 в концентрации от 0,5 micro g/ml или 0,05 micro g/ml (било то в присъствие или в отсъствие на IL-2) почти всички С019-позитивни В-клетки се убиват. Културалните клетки в този момент се състоят предимно от Т-лимфоцити с CD4/CD8 Т-клетъчно съотношение от приблизително 1:2 до 1:3. Това показва изключителната цитотоксичност на bscCD 19xCD3 към CD 19позитивни В-клетки, при положение, че тоталното изтощаване на първичните В-клетки от автоложните Т-клетки може да се индуцира от концентрации от само 50 ng/ml при крайно неблагоприятно първоначално съотношение на ефекторни клетки мишени под 1:10, даже без IL2 или друг вид допълнително Т-клетъчно стимулиране.

Пример 6. Пречистване на bscCD 19xCD3 за терапевтично използване

BscCD19xCD3 се получава от клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО) стабилно трансфектирани с експресионен вектор (pEFDHFR; виж пример 2) кодиращ bscCD19xCD3 и, допълнително хексахистидин и FLAG tag. Клетките се развиват в безсерумна среда (Rencyte) в кух реактор от фибростъкло (Unisyn). Пет хиляди милилитра супернатанта от клетъчната култура се събират и стерилно се филтрират през

0.2 micro m филтър (AcroCap; Pall Gelman).

BscCD19xCD3 се открива и количествено се определя чрез Western blotting при използване на миши анти-FLAG IgG (Sigma) и козианти-миши IgG свързан към алкална фосфатаза (Sigma). Откриването се провежда чрез хемилуминисценция при използване на BCIP/NBT система (Devitron). Концентрациите на протеин се определят чрез изследване на Bradford (Biorad), при използване на говежди IgG (Biorad) като стандарт за протеина. Чистотата на колонните фракции се изследва чрез редуциране на натриев додецилсулфат (SDS) Bis/Tris 4-12% градиентна полиакриламидна гел електрофореза (PAGE) при използване на MOPS буферна система (Novex).

Пречистването на bscCD 19xCD3 до хомогенност изисква катионообменна хроматография, афинитетна хроматография с кобалтов хелат и като последен етап гел филтрация. Тези етапи на пречистване се провеждат при използване на стандартни протоколи (виж по-горе). Поточна схема на метода на пречистване е показана на фигура 10.

Катионообменна хроматография: Супернатантата на клетъчната култура на СНО клетки се смесва с два обема буфер С (30 mM морфолиноетан сулфонова киселина [MES], 20 mM NaCB, 3 mM EDTA, 0.3 тМ бензамидин хидрохлорид, pH 5.5) и се пропуска през 70 ml-SP Sepharose Fast Flow катионообменна колона (Pharmacia) при скорост на потока 20 ml/min. Колоната се уравновесява с буфер А (20 mM MES, 20 тМ NaCe, pH 5.8). След промиване с 5 обема на колоната с буфер A, bscCD 19xCD3 се елюира със стъпаловиден градиент 45% буфер В (20 тМ MES, 1 М NaCB, pH 5.8) в буфер А. Елюатът получава 0.045 обема 1 М Tris/НСв, pH 8.5, съдържащ 47 тМ имидазол, след което се подлага на стерилно филтриране (0.2 microm; AcroCap). Типичен профил на елюиране на катионообмен ната хроматография е показан на Фигура 12. BscCD 19xCD3 се съдържа във фракция 6.

Афинитетно пречистване с кобалтов хелат: Елюатът от катионообменната колона се пропуска при скорост на потока 2.5 ml/min през 10 mlChelating Sepharose Fast Flow колона (Pharmacia) уравновесена в буфер AO (50 mM Na₂HPO₄, 400 mM NaCl, pH 8.0). Колоната е предварително уравновесена c разтвор на 0.1 M кобалтов хлорид. След промиване с 33 обема на колоната с буфер АО, буфер А (50 mM Na₂HPO₄, 400 тМ NaCl, 2 тМ имидазол, pH 6.4) и градиент от ΟΙ 2% буфер В (50 mM NajHPO,, 400 тМ NaCl, 500 тМ имидазол, pH 6.4) в буфер А, bscCD 19xCD3 се елюира в един етап с 30 ml 100% буфер В. Елюатът се филтрира стерилно, следвано от приблизително 10-кратно концентриране в MacroSep устройство (Pall Gelman; 10 kD cut-off). Типичен профил за елюиране на афинитетната хроматография с кобалтов хелат е показан на Фигура 13. BscCD19xCD3 се открива във фракция No. 7.

Гел филтрация: Концентрираният елюат от афинитетната колона с кобалтов хелат се пропуска при скорост на потока 0.75 ml/min през 124 ml-High Load Superdex 200 колона (Pharmacia; prep grade) уравновесена c фосфатно буфериран физиологичен разтвор (Gibco). bscCD19xCD3 се елюира във фракция с размер на молекулите, съответстващ на приблизително 55 kDa (Фигура 14, фракция No. 7). Към фракцията от гел филтрацията съдържаща bscCD 19xCD3 се прибавя 5% човешки серумен албумин (Behring), следван от стерилно филтриране през 0.1 microm филтър (Millex; Millipore).

Изобилието на bscCD 19xCD3 в супернатантата от клетъчната култура и различните активни фракции от колоната, както са анализирани чрез SDS-PAGE, са показани на Фигура 11. bscCD 19xCD3 е главния открит протеин в супернатантата от клетъчната култура (ивица 2). Анти-CD 19ханти-СОЗ с висока степен на пречистване, който се използва при терапия на хора не показва откриваеми онечиствания (Фигура 11, ивица 5).

Пример 7. Клинично използване на bscCD 19xCD3 при пациент с В-клетъчна лимфома

При доброволно използване, пациент (АВ, жена, родена 1937), страдаща от В-клетьчно производна хронична лимфатична левкемия (ВCLL) се третира с биспецифично едноверижно антитяло bscCD 19xCD3.

История на пациента и разпределяне:

Пациентът е диагностициран с B-CLL през 1992. По време на първоначалното диагностициране болестта е била засегнала области на различни лимфни възли и далака; освен това, е била наблюдавана хемолитична анемия с автоимунен произход, както и имуноглобулинов дефицит. Пациентката е със struma nodosa, което добре се контролира, и нормално състояние на щитовидната жлеза, чрез лечение с карбимазол 2.5 mg/d.

Пациентката е получила многократни цикли хемотерапия с хлорамбуцил и преднизон от 1992 до 1994. Следвайки прогресирането на болестта лечението е променено на циклофосфамид, дексорубицин, винкристин и преднизон (CHOP, 8 цикъла) и е постигната ремисия за повече от една година. При следващия рецидив пациентката получава нови 6 цикъла със CHOP, следвани от хлорамбуцил и преднизон и единична доза хлорамбуцил самостоятелно, което не довежда до никакво подобряване на болестта. През декември 1998, се провежда облъчване на далака, за да се контролира прогресирането на спленумегалия у пациентката Пациентката претърпява силно намаляване на костния мозък с многобройни инфекциозни усложнения. Нейната анемия и тромбоцитопения изискват чести трансфузии на червени кръвни клетки и заместител на тромбоцити.

Поради напредналия стадий на заболяването и засегнатата функция на костния мозък, по-агресивни и по-високи дози хемотерапия не се препоръчват на пациентката. Лечение с антиCD20 антитяло ретуксимаб не се препоръчва, тъй като ефикасността на ретуксимаб във B-CLL не е добре изяснена до сега.

FACS анализ показва, че 95 % от клетките на периферната кръв на пациентката са CD 19 позитивни клетки, докато 77 % от клетките експресира CD20 антигена. Инкубиране на клетки от периферна кръв на пациентката с bscCDl 9xCD3 показват подчертано изтощаване на CD 19-позитивни В-клетки (виж пример 5). Поради тази причина лекуващите лекари са решили да лекуват пациентката с новия bscCD 19xCD3 при доброволно използване. Пациентката бе информирана подробно за новостта на съединението и за по тенциалните рискове и ползи от такова лечение. Тя напълно разбра обясненията и даде писмено съгласие за доброволно използване.

Описание на клиничното прилагане:

Преди началото на лечението пациентката премина клиничен преглед и разширени диагностични процедури, за да се провери степента на заболяването и да се изключат всякакви други рискови фактори. Пациентката е в добро клинично състояние с анемия, с тромбоцитопения и загуба на тегло, но без каквото и да е засягане на сърдечно съдовата система или каквито и да са усложнения възпрепятстващи използването на bscCD 19xCD3. През нощта преди първия ден на лечение пациентката се оплаква от мигренозно главоболие. За прилагането HabscCD19xCD3 пациентката е настанена в болнично заведение при засилено наблюдение, за да се подсигури бързо лечение при какъвто и да е спешен случай, който би могъл да възникне. За да се предотвратят каквито и да са остри реакции на цитокините и усложнения от туморен лизис, пациентката приема профилактично IV дози от 2 mg клемастин (Tavegil®) и 200 mg циметидин (Tagamet®), както и 300 mg алопуринол и 20 mg от омерпазол (Antra®).

Провежда се алкализиране и хепаринизиране по време на лечението и последващия период. Освен това пациентката получи всяко необходимо симптоматично лечение.

Кръвни проби бяха взети преди и по време на прилагането на лекарственото средство, за да се следят биохимичните, хематологичните и имунологичните параметри.

1^ВО прилагане на bscCD 19xCD3 (14 април. 1999):

Пациентката получава първа доза от 3 micro g bscCD 19xCD3 като 20-минутна инфузия в изотоничен фосфатен буфер, съдържащ 5 % човешки серумен албумин (HSA). По време на инфузията пациентката няма странични ефекти. Приблизително 1 h след инфузията пациентката изпитва студ за около пет min, следвано от изпотяване, леко спадане на кръвното налягане с около 10 mm Hg и леко повишаване на телесната температура (+ 0.5°С) за около няколко h. Освен това нейното главоболие леко се засилва. Пациентката се третира с други 2 mg Tavegil® и 200 mg Tagamet®, 250 mg преднизолон (SoluDecortin®) и 50 mg петидин (Dolantin®). Всич ки симптоми изчезват без да оставят последствия за следващия ден.

2^ро прилагане на bscCD19xCD3 (15 април 1999)

Втора доза от 10 microg bscCD 19xCD3 се дава един ден по-късно при същите условия. Около един час след инфузията пациентката изпитва силен студ, треска (39.2 °C), слабо усилване на дишането и падане на кръвното. Пациентката се третира с 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet и 300 mg Solu-Decortin и 15 mg пиритрамид (Dipidolor®). За стабилизиране на нейната сърдечносъдова функция пациентката получава инфузия на допамин. След това лечение симптомите значително намаляват. Въпреки това, пациентката се прехвърля в кардиологично отделение за през нощта, за да се осигури постоянно наблюдение на жизнените признаци и незабавна намеса в случай на необходимост. Пациентката се привежда в обикновена болнична стая на следващата сутрин без никакви други усложнения.

По време на следващите три дни пациентката продължава да има субфебрилна температура (около 37.2°С) и развива нищожно плеврално изтичане един ден след втората доза (16 април 1999) и лек оток на долните крайници (18 април 1999). Сърдечносъдовата функция остава стабилна и лабораторните изследвания не показват значителни промени по отношение на сигурността, с изключение на повишаване на гамаглутамил-трансферазата след втората доза bscCD 19xCD3 (Фигура 15).

Тъй като bscCD19xCD3 се понася от пациентката и страничните ефекти могат да бъдат контролирани със симптоматично лечение, прилагането на новия bscCD 19xCD3 ще продължи при тази пациентка.

Клинична и имунологична ефикасност на bscCD 19xCD3:

Клинични резултати:

Провежда се ултразвуков преглед на далака и на пет абдоминални аксиларни лимфни възли един ден преди и четири дни след прилагането на втората доза bscCD 19xCD3. Вече един ден след 10 micro g-овата доза (16 април 1999), лимфните възли, както и далака показват свиване от около 20 % в сравнение с базовите стойности. Това наблюдение се потвърждава при втори ултразвуков преглед на 19 април 1999. Тег лото на далака намалява до 350 g (от 1630 g базова стойност до 1280 g на 19 април 1999) (Таблица 1; Фигура 16).

Хематологични резултати:

Броят бели кръвни клетки, който включва повечето злокачествени В-клетки, намалява по време на курса на лечение и последващите дни (таблица 2; Фигура 17). С-реактивният протеин (CRP) е реакционен протеин на акутната фаза, който отразява активирането и ефекта на провъзпалителните процеси. Той забележимо намалява след прилагането на 10 micro g bscCD 19xCD3, следвано от непрекъснато намаляване по време на следващите три дни от наблюдението (таблица 2; Фигура 18).

Имунологични резултати

Нивото на серумни цитокини, което отразява острия имунологичен отговор на прилагането на съединението, се измерва преди и на различни интервали след прилагането на новото съединение. Серумните нива на цитокините и на разтворимия IL-2 рецептор се измерват чрез количествено ELISA изследване, съгласно инструкциите на производителя.

Тумор некрозис фактор TNF-алфа нараства значително по начин зависим от дозата, през първия час след прилагането на bscCD 19xCD3 (Фигура 19).

Интерлевкин 6 (IL-6) и интерлевкин 8 (IL8) също показват значително нарастване по начин зависим от дозата. Техните максимални нива се наблюдават 2 до 4 h след прилагането на bscCD19xCD3 (фигури 20, 21). Всички цитокини се връщат до базовите нива за няколко h.

Разтворимият IL-2 рецептор е повишен вече до базовата стойност, което може да се обясни с масата на злокачествените В-клетки, експресиращи IL-2 рецептора. След прилагане на новия bscCD 19xCD3, се наблюдава нарастване на разтворимия IL-2 рецептор, което сочи активиране на ефекторните клетки (Фигура 22).

Изводи:

Новият bscCD 19-CD3 се прилага надеждно на пациент страдащ от рефракторен B-CLL. Поносимостта на bscCD 19xCD3 при доза от 3 micro g и 10 micro g е приемлива и добре може да се контролира чрез измервания на пролиферацията и симптоматично лечение.

Новият bscCD 19xCD3 причинява свиване на преди това уголемения далак и лимфните възли на пациента, както е показано на снимката от ултразвуковият преглед. Тъй като уголемяването на далака и на лимфните възли на пациента се причинява от инфилтриране със злокачествени В-клетки, свиването отразява разрушаването 5 на злокачествените В-клетки като резултат от прилагането на bscCD19xCD3.

В ярък контраст на което и да е друго биспецифично CD19xCD3 антитяло, известно от състоянието на техниката, биспецифичното CD19xCD3 антитяло от изобретението (bscCD19xCD3) показва клинично действие при В-клетьчно производна не-Hodgkin лимфома, както е измерено чрез свиването на лимфоидните органи, инфил трирани от злокачествени В-клетки. Преимуществено, bscCD19xCD3 доказа, че е клинично ефективен при изненадващо ниски дози, които добре се понасят след системно прилагане. Следователно, клиничното действие на bscCDl 9xCD3 потвърждава неговата изключителна цитотоксична активност, както е определено in vitro.

Размерът натри абдоминални лимфни възли, един от ляво и един от дясно аксиларен лимфен възел и на далака се определят и се измерват ултразвуково при използване на Toshiba SSA100 устройство. Размерите са дадени в три измерения и в mm. Теглото на далака се изчислява от размера му и от ултразвуковата плътност.

ТАБЛИЦА 1:

Ефект на bscCD19xCD3 върху размера на лимфните възли и далака при пациент, страдащ от В-клетъчна лимфома сп cn σ>

co cn

Ε	ε	Е	Е	Е	Е Е
Ε	Е	Е	Е	Е	00 CD
ХГ	co	co	χφ	•м-	X
Т“	т-	см	X—	№
X	X	X	X	X	00 CXI
ο	ο	см	см	co	V“	ΓΊΠ
co	co	co	см	см	X
X	X	X	X	X	ID	O CO
см	co	Г'-	о	см	CD	CXI
xt	XT	хф	co	co	CXI

cn	E	E	E
cn сг>	E	E	E
	co	co	CM
—	4—	№	CM
е;	X	X	X
s ο	o	co	X—
c	co	co	co
03	X	X	X
CD	CM	co	co
X“	хф	хф	xf

E	E	E
E Ю	E	XT co
V“		X
X CM CM X	X o CM	CM co X	cd o
		in	ΧΦ
χφ	co	co	co
co	co	CM	№

cn cn σ>

Εζ

X CL 1= <6

CM

E	E	E	E
E	E	E	E
xT	00	l·-	co
	4-	CM	r—
X	X	X	X
cn CM	co	CM	хф
co	co	CM
X	X	X	X
χφ	co	co	co
Ю	Ю	xr	CO

E	E
E	cn co
co	X
X	co ΧΦ
хф CM X	X o	CD o co
K		co
co	CM

tK
x
X			X
(0			X
m			c;
ex			co
d>			X
s			X
co			2
X			o
s
m			ID
p			<
X
m	X
CO	X
co cx 1—	a s	X c; co
5;	X	fi
	«=;	m

ТАБЛИЦА 2: Кръвни нива на селекционни маркери в отговор на лечение с bscCD19xCD3.

		14, април 1999	15, април 1999	16, април 1999	17, април 1999	18, април 1999	19, април 1999
	Единици
GGT	U/I	22	24 (сутрин) (вечер)	124 (6.00 h) 107 (12.00 h)	96	89	87
LDH	ил	618	536 (сутрин) 773 (вечер)	548	697	551	539
Левкоцити	Gpt/I	46,8	43.3 (сутрин) 22.3 (вечер)	36,9	37,0	28,3	36,6
Лимфоцити	%	85	58,8 (сутрин) 82,0 (вечер)	60,9	64,4	65,5	88
CRP	mg/dl	<0,4	1,0 (сутрин) 0,7 (вечер)	5,2	2,5	2,0	0,7

Кръвните нива на гама-глутамил трансферазата (GGT), лактата дехидрогеназата (LDH) и на С-реактивния протеин (CRP) се определят чрез стандартни клинични биохимични методи и се изразяват в единици/ml (GGT), единици/1 5 (LDH) и mg/dl (CRP). Броят на левкоцитите се изразява като Giga точки/1, а броят на лимфоцитите се представя като процент от общите левкоцити. Базовите стойности на 14 април 1999, пре ди лечението се дават в първата колона. Отговорът на 3 micro g bscCD 19xCD3 на 15 април 1999 (което е приложено на 14 април) е показано във втората колона. Отговорът на второто третиране с 10 micro g от съединението през същия ден е показан в третата колона. Кръвните нива на селекционните маркери през четвъртия ден следващи третирането с лекарственото средство са дадени в последните колони.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛ:

(A) ИМЕ: DOERKEN, Bernd (B) УЛИЦА: Lyckallee 47 (C) ГРАД: Berlin (D) ЩАТ: попе (E) ДЪРЖАВА: Germany (F) ПОЩЕНСИ КОД (ZIP): 14055 (A) ИМЕ: RIETHMUELLER, Bernd (B) УЛИЦА: Finauer Str. 12 (C) ГРАД: Munich (D) ЩАТ: попе (E) ДЪРЖАВА: Germany (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): 80805 (ii) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО:

CD 19 X CD3 СПЕЦИФИЧНИ ПОЛИПЕПТИДИ И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗВАНЕ (iii) БРОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 10 (iv) КОМПЮТЪРЕН ФОРМАТ:

(A) СРЕДА: флопи (B) КОМПЮТЪР: IBM PC съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) СОФТУЕР: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (ЕРО) (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 1:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 36 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 1:

GAAGCACGCG TAGATATCKT GMTSACCCAA WCTCCA 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 30 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 2

GAAGATGGAT CCAGCGGCCG CAGCATCAGC 30 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 3:

CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT SCAGCTGCAG SAG 33 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 39 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 4:

ACCAGGGGCC AGTGGATAGA CAAGCTTGGG TGTCGTTTT 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 5:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 36 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 5:

AGGTGTACAC ТССАТАТСС A GCTG ACCCAG TCTCCA 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 6:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 48 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ IDNO: 6:

GGAGCCGCCGCCGCCAGAAC CACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC 48 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 7:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 48 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: Ί:

GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGTACTGC AGAGTCGG 48 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 8:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 39 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеогид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 8:

AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCTTGGCCCCAG 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 9:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1611 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: НЕ (ix) СВОЙСТВА:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) РАЗПОЛОЖЕНИЕ: 11..1603 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ IDNO: 9:

Claims (28)

1. Патентни претенции

   1. Едноверижен мултифункционален полипептид, включващ (а) първи домен, съдържащ сайт за свързване на имуноглобулинова верига или антитяло, специфично разпознаващо CD 19 антигена; и (б) втори домен, съдържащ сайт за свързване на имуноглобулинова верига или антитяло, специфично разпознаващо CD3 антиген в човешки Т клетки, характеризиращ се с това, че посочените домени са подредени в следния ред V_LCD19V_HCD1 9-V_hCD3-V_lCD3 .
2. 2. Полипептид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посочените два домена са свързани чрез полипептиден линкер.
3. 3. Полипептид, съгласно претенция 1или 2, характеризиращ се с това, че първият и/или вторият домен наподобяват или съответстват на V_H и V_L областите на естествено съществуващо в природата антитяло.
4. 4. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че посоченото антитяло е моноклонално антитяло, синтетично антитяло или хуманизирано антитяло.
5. 5. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че поне един от посочените домени е едноверижен фрагмент на вариабилната област на антитялото.
6. 6. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 2 до 5, характеризиращ се с това, че посоченият полипептиден линкер съдържа множество глицинови, аланинови и/или серинови остатъци.
7. 7. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 2 до 6, характеризиращ се с това, че посоченият полипептиден линкер съдържа множество последователни копия на аминокиселинна последователност.
8. 8. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 2 до 7, характеризиращ се с това, че посоченият полипептиден линкер съдържа от 1 до 5 аминокиселинни остатъка.
9. 9. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 2 до 8, характеризиращ се с това, че посоченият полипептиден линкер съдържа аминокиселините последователности:

   Gly Gly Gly Gly Ser.
10. 10. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 9, характеризиращ се с това, че посоченият първи домен съдържа поне един CDR от V_H и V_L областта, включващ аминокиселинната последователност кодирана от ДНК последователността, посочена на Фигура 8, от нуклеотиди 82 до 414 (V_L) и нуклеотид 460 до 831 (V_H) и/или когато посоченият домен съдържа поне един CDR от V_H и V_L областта, включващ аминокиселинната последователност, кодирана от ДНК последователността, посочена на Фигура 8, от нуклеотиди 847 до 1203 (V_H) и нуклеотиди 1258 до 1575 (VJ.
11. 11. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 10, характеризиращ се с това, че (a) посоченият сайт за свързване на първия домен е с афинитет поне от приблизително ΙΟ^-7 М; и/или (b) посоченият сайт за свързване на втория домен е с афинитет поне от приблизително

    10-⁷ М.
12. 12. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 11, характеризиращ се с това, че е биспецифично едноверижно антитяло.
13. 13. Полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 12, характеризиращ се с това, че съдържа поне още един друг домен.
14. 14. Полипептид, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че посоченият друг домен е свързан чрез ковалентни или нековалентни връзки.
15. 15. Полипептид, съгласно претенция 13 или 14, характеризиращ се с това, че поне един друг домен включва ефекторна молекула с комформация подходяща за биологична активност, способна да отделя един йон или избирателно да се свързва към твърд носител или към предварително избрана детерминанта.
16. 16. Полинуклеотид, който при експресия кодира полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 15.
17. 17. Вектор, включващ полинуклеотид, съгласно претенция 16.
18. 18. Клетка, трансфектирана с полинуклеотида от претенция 16 или вектора от претенция 17.
19. 19. Метод за получаване на полинуклеотид съгласно коя да е претенция от 1 до 15, характеризиращ се с това, че се култивират клетки съгласно претенция 18 и се изолира посоче43 ният полипептид от културата.
20. 20. Състав, характеризиращ се с това, че включва полипептид, съгласно коя да е претенция от 1 до 15, полинуклеотид от претенция 16 или вектор от претенция 17.
21. 21. Съставът, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че е фармацевтичен състав, по желание включващ освен това фармацевтично приемлив носител.
22. 22. Съставът, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че е състав за диагностика, по желание включващ освен това подходящи средства за определяне.
23. 23. Използване на полипептида, съгласно коя да е претенция от 1 до 15, полинуклеотида от претенция 16 или вектора от претенция 17 за получаване на фармацевтичен състав за лечение на В-клетьчни злокачествени заболявания, Вклетъчно медиирани автоимунни заболявания или изтощаване на В-клетките.
24. 24. Използване, съгласно претенция 23, характеризиращо се с това, че посоченото В-клетъчно злокачествено заболяване е В-клетъчна лимфома, не-Hodgkin лимфома, или В-клетьчна хронична лимфатична левкемия (B-CLL).
25. 25. Използване, съгласно претенция 23, характеризиращо се с това, че посочените В-клетьчни медиирани автоимунни заболявания са Миастения Гравис, Морбус Базедов, Хашимото тиреоидитис или Гудпастур синдром.
26. 26. Използване на полинуклеотид съгласно претенции от 1 до 15, полинуклеотид съгласно претенция 16, или на вектор от претенция 17 за получаване на фармацевтичен състав за забавяне на патологични състояния, причинени от Вклетьчни нарушения.
27. 27. Използване на полинуклеотид съгласно претенция 16, или на вектор от претенция 17 за получаване на състави за генна терапия.
28. 28. Метод за идентифициране на активатори или инхибитори на Т-клетъчното активиране или стимулиране, който включва:

    (а) култивиране на Т-клетки и CD19 позитивни клетки, за предпочитане В-клетки, в присъствие на полипептид съгласно коя да е претенция от 1 до 15 и, по желание, в присъствие на съставка, способна да предостави сигнал, който може да бъде открит, в отговор на Т-клетъчно активиране със съединение, което трябва да се скринира, при условия, при които да се поз воли активиране на Т-клетките, и (Ь) откриване присъствието или отсъствието на сигнал, генериран от взаимодействието на съединението с клетките.