BG65066B1 - CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USE THEREOF - Google Patents
CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USE THEREOF Download PDFInfo
- Publication number
- BG65066B1 BG65066B1 BG104868A BG10486800A BG65066B1 BG 65066 B1 BG65066 B1 BG 65066B1 BG 104868 A BG104868 A BG 104868A BG 10486800 A BG10486800 A BG 10486800A BG 65066 B1 BG65066 B1 BG 65066B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- cell
- cells
- polypeptide
- antibody
- polypeptide according
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Област на техникатаTechnical field
Настоящото изобретение се отнася до нови едноверижни мултифункционални полипептиди, включващи поне два сайта на свързване, специфични за CD 19 и CD3 антигена, съответно. Предоставят се освен това и полипептиди, като долуописаният полипептид включва поне един допълнителен домен, за предпочитане с предетерминирани функции. Освен това, изобретението се отнася, също така до полинуклеотидите, кодиращи тези полипептиди, както и вектори, които включват посочените полинукпеотиди и клетки гостоприемници, трансформирани с посочените полинуклеотиди, както и тяхното използване при производството на посочените полипептиди. В допълнение се предоставят също и състави, за предпочитане фармацевтични и диагностични състави, включващи кой да е от горе описаните полипептиди, полинуклеотиди и вектори за изготвянето на фармацевтични състави за имунотерапия, за предпочитане срещу В-клетъчни злокачествени образувания, като неHodgkin лимфома.The present invention relates to novel single-stranded multifunctional polypeptides comprising at least two binding sites specific for the CD19 and CD3 antigens, respectively. Polypeptides are also provided, the polypeptide described below comprising at least one additional domain, preferably with predetermined functions. In addition, the invention also relates to polynucleotides encoding these polypeptides, as well as vectors that include said polynucleotides and host cells transformed with said polynucleotides, and their use in the production of said polypeptides. In addition, compositions, preferably pharmaceutical and diagnostic compositions including any of the polypeptides, polynucleotides and vectors described above, are also provided for the preparation of pharmaceutical compositions for immunotherapy, preferably against B-cell malignancies such as non-Hodgkin lymphoma.
В текста на настоящото изобретение са цитирани известен брой документи. Всеки от тук цитираните документи (включително и описания от производителя, инструкции, и др.) са включени в настоящото за справка; въпреки това не се приема който и да е от цитираните документи като действително ниво на настоящото изобретение.A number of documents are cited in the text of the present invention. Each of the documents cited herein (including manufacturer's descriptions, instructions, etc.) are incorporated herein by reference; nevertheless, none of the documents cited is considered to be the true level of the present invention.
Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION
Въпреки важността за медицината, изследванията върху медиираните от В-клетки заболявания, като не-Hodgkin лимфома, са довели само до малък брой данни, използваеми в клиниката, и конвенционалните подходи за лечение на такива заболявания остават досадни и неприятни и/или съществува голям риск от повтаряне на болестта. Например, въпреки че високата доза химиотерапия като първично лечение за тежка степен не-Hodgkin лимфома не може да подобри преживяемостга, приблизително 50% от пациентите все още умират от това заболяване [2-4]. Освен това, лека степен на не-Hodgkin лимфома - подобна хронична лимфатична левкемия и клетъчна лимфома все още са нелечими. Това стимулира търсенето на алтернативни стратегии, като имунотерапията. Антитела насочени срещу молекулите от клетъчната повърхност, дефинирани от CD антиген представляват единствена възможност за развитието на терапевтични средства.Despite the importance of medicine, studies on B-cell-mediated diseases, such as non-Hodgkin's lymphoma, have resulted in only a small amount of data used in the clinic, and conventional approaches to treat such diseases remain annoying and unpleasant, and / or there is a high risk from the recurrence of the disease. For example, although high-dose chemotherapy as a primary treatment for severe non-Hodgkin lymphoma may not improve survival, approximately 50% of patients still die from the disease [2 - 4]. In addition, mild non-Hodgkin's lymphoma - similar chronic lymphatic leukemia and cell lymphoma are still incurable. This stimulates the search for alternative strategies such as immunotherapy. Antibodies directed against cell surface molecules defined by a CD antigen represent the only opportunity for the development of therapeutic agents.
Експресията на някои CD антигени силно се ограничава до специфични линии лимфохематопоетични клетки и през изминалите няколко години, антителата насочени срещу лимфоидспецифични антигени са били използвани за да се развиват лечения, които да бъдат ефективни било то in vitro или при животински модели [513]. С оглед на това, CD19 е доказал, че е изключително полезна мишена. CD 19 се експресира в цялата В линия от про В клетката до зрялата В клетка, не се изменя, еднакво се експресира във всички лимфомни клетки и отсъства от стволовите клетки [8,14]. Интересна модификация е прилагането на биспецифично антитяло с една специфичност на CD 19, а другата за CD3 антигена върху Т-клетките. Въпреки това, биспецифичните антитела предоставени по този начин страдат от ниска Т-клетьчна цитотоксичност и липса на костимулиращи средства, с цел да се представи задоволителна биологична активност.Expression of some CD antigens is highly restricted to specific lympho-hematopoietic cell lines and over the past few years, antibodies directed against lymphoid-specific antigens have been used to develop treatments that are effective either in vitro or in animal models [513]. In this regard, CD19 has proven to be an extremely useful target. CD 19 is expressed throughout the B line from pro B cell to mature B cell, does not change, is uniformly expressed in all lymphoma cells and is absent from stem cells [8,14]. An interesting modification is the administration of a bispecific antibody with one specificity for CD19 and the other for the CD3 antigen on T cells. However, the bispecific antibodies provided in this way suffer from low T-cell cytotoxicity and lack of costimulatory agents in order to present satisfactory biological activity.
Следователно, техническият проблем подчертаващ настоящото изобретение е да се предоставят средства и методи, полезни при третирането на В-клетьчно медиирани заболявания като различни форми на не-Hodgkin лимфома. Решението на такъв технически проблем се постига чрез предоставяне на вариантите за изпълнение, охарактеризирани в патентните претенции.Therefore, a technical problem emphasizing the present invention is to provide tools and methods useful in treating B-cell-mediated diseases as various forms of non-Hodgkin lymphoma. The solution to such a technical problem is achieved by providing the embodiments described in the claims.
В съответствие, настоящото изобретение се отнася до едноверижен мултифункционален полипептид включващ:Accordingly, the present invention relates to a single-stranded multifunctional polypeptide comprising:
(а) един първи домен включващ сайт на свързване от имуноглобулинова верига или едно антитяло специфично разпознаващо CD19 антигена; и (б) един втори домен включващ сайт на свързване от имуноглобулинова верига или едно антитяло специфично разпознаващо CD3 антигена.(a) one first domain comprising an immunoglobulin chain binding site or an antibody specifically recognizing the CD19 antigen; and (b) a second domain comprising an immunoglobulin chain binding site or an antibody specifically recognizing the CD3 antigen.
Терминът “първи домен” и “втори домен”, в съответствие с настоящото изобретение озна чават, че един сайт на свързване е насочен срещу рап В клетъчния маркер CD 19, който еднакво се експресира при по-голямата част от злокачествените В клетки, а другият сайт на свързване е насочен срещу CD3 антигена на човешки Т клетки.The terms "first domain" and "second domain", in accordance with the present invention, mean that one binding site is directed against rap B cell marker CD 19, which is uniformly expressed in the majority of malignant B cells and the other the binding site is directed against the CD3 antigen of human T cells.
Терминът “сайт на свързване”, както се употребява в съответствие с настоящото изобретение посочва домен, който включва триизмерна структура, способна специфично да се свързва към епитоп като нативните антитела, без scFv фрагменти или една от съответните им имуноглобулинови вериги, за предпочитане VH веригата. По този начин посоченият домен може да включва VH и/или VL домен на антитяло или имуноглобулинова верига, за предпочитане поне VH домена. От друга страна, посочените сайтове на свързване, съдържащи се в полипептида на изобретението, могат да включват поне една комплементарна детерминантна област (CDR) на антитяло или имуноглобулинова верига, разпознаваща съответно CD19 и CD3 антигените. С оглед на това, трябва да се отбележи, че домените на сайтовете на свързване, присъстващи в полипептида на изобретението могат да произлизат не единствено само от антитела, но също така и от други CD 19 или CD3 свързващи протеини, като естествено срещаните в природата повърхностни рецептори или лиганди. Съгласно изобретението, посоченият сайт на свързване е включен в домен.The term "binding site" as used in accordance with the present invention refers to a domain that includes a three-dimensional structure capable of specifically binding to an epitope such as native antibodies without scFv fragments or one of their respective immunoglobulin chains, preferably the V H chain . Thus, said domain may include the V H and / or V L domain of an antibody or immunoglobulin chain, preferably at least the V H domain. On the other hand, said binding sites contained in the polypeptide of the invention may include at least one complementary determinant region (CDR) of an antibody or immunoglobulin chain recognizing CD19 and CD3 antigens respectively. In view of this, it should be noted that the domains of the binding sites present in the polypeptide of the invention may originate not only from antibodies but also from other CD 19 or CD3 binding proteins, such as naturally occurring surface proteins. receptors or ligands. According to the invention, said binding site is included in a domain.
Терминът “мултифункционален полипептид”, както се използва тук, посочва полипептид, включващ поне две аминокиселинни последователности произлизащи от различни източници, т. е. от две различни молекули, по желание произлизащи от различни видове, при което поне два от тези източника охарактеризират сайта на свързване. В съответствие, посочените сайтове на свързване охарактеризират функциите или поне някои функции на посочения мултифункционален пептид. Такива полипептиди включват, например, биспецифични (bsc) едноверижни антитела.The term "multifunctional polypeptide" as used herein refers to a polypeptide comprising at least two amino acid sequences originating from different sources, i.e. from two different molecules, optionally originating from different species, wherein at least two of these sources characterize the site of the connection. Accordingly, said binding sites characterize the functions or at least some functions of said multifunctional peptide. Such polypeptides include, for example, bispecific (bsc) single-chain antibodies.
Терминът “едноверижен”, както се използва в съответствие с настоящото изобретение означава, че посочените първи и втори домени на полипептида са ковалентно свързани, за предпочитане под формата на ко-линейна аминокиселинна последователност кодирана от молеку ла на нуклеинова киселина. CD 19 бележи антиген, който се експресира в В линия, както в pro В клетки и в зрели В клетки, не се изменя, еднакво се експресира във всички лимфомни клетки и отсъства от стволовите клетки [8,14].The term "single-stranded" as used in accordance with the present invention means that said first and second domains of the polypeptide are covalently linked, preferably in the form of a collinear amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule. CD 19 marks an antigen that is expressed in the B lineage, both in pro B cells and in mature B cells, does not change, is uniformly expressed in all lymphoma cells and is absent from stem cells [8,14].
CD3 посочва антиген, който се експресира върху Т клетки като част от мултимолекулярния Т-клетьчен рецепторен комплекс и който се състои от три различни вериги СОепсилон, СОделта и CDraMa. Натрупването на CD3 върху Т клетки, например чрез имобилизирани антиCD3-антитела води до Т-клетьчно активиране подобно на свързването на Т-клетьчния рецептор, но независимо от неговата характерна за клона специфичност. Всъщност, повечето анти-СОЗантитела разпознават СОепсилон-вериги.CD3 indicates an antigen that is expressed on T cells as part of the multimolecular T-cell receptor complex and which consists of three different chains of Coepsilon, CoDelta and CDraMa. The accumulation of CD3 on T cells, for example through immobilized antiCD3 antibodies, results in T-cell activation similar to T cell receptor binding but regardless of its clone-specificity. In fact, most anti-CD3 antibodies recognize COepsilon chains.
Антитела, които специфично разпознават CD 19 или CD3 антигена са описани в състоянието на техниката, например [24,25 и 43], съответно и могат да се регенират чрез конвенционални методи, известни от състоянието на техниката.Antibodies that specifically recognize the CD19 or CD3 antigen have been described in the prior art, for example [24,25 and 43], respectively, and can be regenerated by conventional methods known in the art.
Биспецифични CD19 х CD3 антитела, които не са от едноверижен формат, насочващи повторно Т-клетьчната цитотоксичност към лимфомни клетки по МНС-независим начин вече са били посочени като ефективни in vitro [5, 6, 9-11, 13,43] при животински модели [7,28], така както и при някои пилотни клинични изпитания [12,29, 30]. Досега тези антитела са били конструирани чрез хибрид-хибридомни техники, чрез ковалентно свързване на моноклоналните антитела [31] или чрез diabody подход [43]. Проведени са позадълбочени клинични изследвания благодарение на факта, че тези антитела притежават ниска биологична активност, така че е необходимо да се прилагат по-високи дози и това прилагане единствено на антитела не предоставя благоприятен терапевтичен ефект. Освен това е ограничен достъпът до клиничен материал.Non-single-stranded non-single-stranded CD19 x CD3 antibodies that re-direct T-cell cytotoxicity to lymphoma cells in an MHC-independent manner have already been shown to be effective in vitro [5, 6, 9-11, 13,43] in animals models [7,28], as in some pilot clinical trials [12,29, 30]. So far, these antibodies have been constructed by hybrid-hybridoma techniques, by covalent binding of monoclonal antibodies [31] or by a diabody approach [43]. In-depth clinical studies have been conducted due to the fact that these antibodies have low biological activity, so higher doses need to be administered and this administration of antibodies alone does not have a beneficial therapeutic effect. Furthermore, access to clinical material is restricted.
Без да се свързва към някоя определена теория се вярва, че чрез използването на биспецифичен антитяло-подобен формат, както е дефинирано по-горе, така генерираните полипептиди като биспецифични CD 19 х CD3 антитела обикновено са способни да разрушат CD19-noзитивните клетки мишени чрез събиране на цитотоксичните Т-лимфоцити без никаква необходимост от Т-клетъчно пре- и/или ко-стимулиране. Това е в рязък контраст с всички известни биспецифични CD 19 х CD3 антитела продуцирани съгласно други молекулярни формати и обикновено не зависи от конкретните особености на CD 19- или CD3-антитяло, които се използват при конструирането, например на биспецифичното едноверижно антитяло. Независимостта от Т-клетьчно пре- и/или ко-стимулиране може значително да допринесе за изключително високата цитотоксичност, медиираначрез полипептида от изобретението, както се обяснява чрез специфичното биспецифично CD 19 xCD3 антитяло, описано в примерите за конкретно изпълнение.Without being bound by any particular theory, it is believed that by using a bispecific antibody-like format, as defined above, the polypeptides thus generated, such as bispecific CD 19 x CD3 antibodies, are typically capable of destroying CD19-positive target cells by collection of cytotoxic T lymphocytes without any need for T cell pre- and / or co-stimulation. This is in sharp contrast to all known bispecific CD19 x CD3 antibodies produced according to other molecular formats and is generally independent of the specific features of the CD19 or CD3 antibody used in the construction, for example of the bispecific single chain antibody. Independence from T-cell pre- and / or co-stimulation can significantly contribute to the extremely high cytotoxicity mediated by the polypeptide of the invention, as explained by the specific bispecific CD 19 xCD3 antibody described in the embodiments.
Друго полезно свойство на полипептида от изобретението е това, че поради неговата малка, сравнително компактна структура е лесно да се продуцира и да се пречисти, като по този начин се преодоляват проблемите с нисък добив, възникването на заболяване, дефинирано чрез продукти, или трудоемките процеси на пречистване [15-19] докладвани за CD 19 х CD3 специфични антитела продуцирани от хибрид-хибридома, чрез химическо свързване или чрез ренатуриране (възстановяване) от бактериални телца на включване. При следващото, полезността и неочакваните ефекти на полипептида от изобретението ще се разглеждат по неограничаващ начин в светлината на прилежащите претенции, включващи някои от предпочитаните варианти за изпълнение на изобретението, посочени по-долу, което илюстрира широкия обхват на настоящото изобретение.Another advantageous feature of the polypeptide of the invention is that, because of its small, relatively compact structure, it is easy to produce and purify, thus overcoming problems of low yield, the occurrence of a product-defined disease, or labor-intensive processes of purification [15-19] reported for CD19 x CD3 specific antibodies produced by hybrid-hybridoma, by chemical coupling or by renaturation (bacterial inclusion bodies). In the following, the utility and unexpected effects of the polypeptide of the invention will be contemplated in a non-limiting manner in light of the appended claims, including some of the preferred embodiments of the invention set forth below, illustrating the broad scope of the present invention.
В съответствие с настоящото изобретение се използва еукариотна експресионна система, която се развива за производството за рекомбинантни биспецифични едноверижни антитела [1] с цел да се генерира рекомбинантно биспецифично CD 19 х CD3 антитяло чрез експресията на СНО клетки. Напълно функционалното антитяло се пречиства по същество от културалната супернатанта чрез неговия С-краен хистидин tag върху Ni-NTA хроматографска колона. Специфичното свързване към CD 19 и CD3 се демонстрира чрез FACS анализ. Получената bscCD19 X CD3 (биспецифични едноверижни CD 19 х CD3) молекула на изобретението показва някои неочаквани свойства:In accordance with the present invention, a eukaryotic expression system is being developed that is developed for the production of recombinant bispecific single-chain antibodies [1] in order to generate recombinantly bispecific CD 19 x CD3 antibody through the expression of CHO cells. The fully functional antibody is substantially purified from the culture supernatant by its C-terminal histidine tag on a Ni-NTA chromatographic column. The specific binding to CD19 and CD3 is demonstrated by FACS analysis. The resulting bscCD19 X CD3 (bispecific single-stranded CD 19 x CD3) molecule of the invention exhibits some unexpected properties:
- индуцира висока лимфомна насочена Тклетъчна цитотоксичност in vitro и in vivo. Даже при много ниски концентрации от 10-100 pg/ml и ниски стойности на съотношението Е (ефектор):Т (мишена) от 5:1 и 2,5:1 се наблюдава значителен специфичен лизис на лимфомна клетъчна линия. Освен това, 3 micro g до 10 micro g bscCD 19 X CD3 молекулата от изобретението при доброволно използване показват ясно и значително подобряване на медицинския статус. В сравнение с публикуваните досега CD 19 X CD3 антитела, продуцирани чрез хибрид-хибридомни техники или по diabody подход (които също представляват различен формат), които проявяват цитотоксична активност в рамките на няколко нанограма/ml или даже micro g/ml, bscCD19 X CD3 антитялото от изобретението изглеждала е много по-ефикасно [5-7, 27, 43] както например е документирано в прилежащите примери за изпълнение на изобретението 4, 5 и 7.- induces high lymphoma targeting Cellular cytotoxicity in vitro and in vivo. Even at very low concentrations of 10-100 pg / ml and low values of E (effector): T (target) ratio of 5: 1 and 2.5: 1, significant specific lymphoma cell line lysis is observed. In addition, 3 micro g to 10 micro g bscCD 19 X CD3 molecules of the invention on voluntary use show a clear and significant improvement in medical status. Compared to the previously published CD 19 X CD3 antibodies produced by hybrid hybrid techniques or by diabody approach (which also represent a different format) that exhibit cytotoxic activity within a few nanograms / ml or even micro g / ml, bscCD19 X CD3 the antibody of the invention appeared to be much more effective [5-7, 27, 43] as documented, for example, in the accompanying embodiments 4, 5 and 7.
- Даже и ниските концентрации на bscCD 19 X CD3 от изобретението са способни да индуцират бърза цитотоксичност насочена срещу лимфома (след 4 h) при ниски съотношения на Е:Т без необходимост от каквото и да било предварително Т-клетъчно стимулиране. В контраст, конвенционално CD 19 X CD3 биспецифично антитяло [5-7,27] не проявява цитотоксична активност при тези условия (а именно без предварително Т-клетъчно стимулиране, ниско съотношение на Е:Т) даже и при високи концентрации до 3 000 ng/ml. Въпреки че се докладва също индуциране на цитотоксичната активност без предварително стимулиране, при случай на друго конвенционално CD 19 X CD3 антитяло, този ефект се постига единствено при високи концентрации и високо съотношение на Е:Т (100 ng/ml, 27:1) [9] в сравнение с bscCD 19 X CD3 на изобретението (100 pg/ml, 2,7:1). Цитотоксичният ефект от това антитяло се наблюдава, освен това, само след един ден предварително стимулиране със самото специфично антитяло, при което bscCD 19 X CD3 на изобретението, индуцира лимфома-насочена цитотоксичност вече след четири h. До колкото е известно на изобретателите на изобретението такава бърза и специфична цитотоксична активност на Т клетки, при такива ниски концентрации и съотношение на Е:Т, не са били наблюдавани за други биспецифични антитела, които са били използвани досега. Въпреки това, за анти-р185НЕ1<2/анти-СОЗ биспецифично F(ab)2 антитяло бе показано, че индуцира цитотоксична активност при подобни кон центрации, както bscCD19 X CD3 от изобретението, като това антитяло се нуждае от 24 h предварително стимулиране с IL-2 [32]. Следователно, bscCDl 9 X CD3 антитялото на изобретението проявява уникални цитотоксични свойства, които отличават тази молекула от други биспецифични антитела, които вече са били описани.- Even low concentrations of bscCD 19 X CD3 of the invention are capable of inducing rapid cytotoxicity directed against lymphoma (after 4 h) at low E: T ratios without the need for any prior T-cell stimulation. In contrast, conventionally CD 19 X CD3 bispecific antibody [5-7,27] does not exhibit cytotoxic activity under these conditions (namely, without pre-T cell stimulation, low E: T ratio) even at high concentrations up to 3,000 ng / ml. Although induction of cytotoxic activity without prior stimulation has also been reported, in the case of another conventional CD 19 X CD3 antibody, this effect is only achieved at high concentrations and high E: T ratio (100 ng / ml, 27: 1) [ 9] compared to the bscCD 19 X CD3 of the invention (100 pg / ml, 2.7: 1). The cytotoxic effect of this antibody is also observed only after one day of pre-stimulation with the specific antibody itself, wherein the bscCD 19 X CD3 of the invention induces lymphoma-directed cytotoxicity after four hours. To the best of the inventors of the invention, such rapid and specific cytotoxic activity of T cells, at such low concentrations and E: T ratios, have not been observed for other bispecific antibodies that have been used so far. However, anti-p185HE1 <2 / anti-CD3 bispecific F (ab) 2 antibody has been shown to induce cytotoxic activity at similar concentrations as bscCD19 X CD3 of the invention, which requires 24 h pre-stimulation with IL-2 [32]. Therefore, the bscCD1 9 X CD3 antibody of the invention exhibits unique cytotoxic properties that distinguish this molecule from other bispecific antibodies that have already been described.
bscCD19 X CD3 от изобретението медиира цитоксични ефекти, които са антиген специфични, което се демонстрира от следните факти:bscCD19 X CD3 of the invention mediates cytotoxic effects that are antigen specific, as demonstrated by the following facts:
- това антитяло не проявява възможност да лизира плазмоцитомни клетъчни линии NC1 и L363, които са клетъчни линии от В линиите, които не експресират CD 19 антигена; и- this antibody is unable to lyse plasmacytoma cell lines NC1 and L363, which are cell lines from B lines that do not express the CD19 antigen; and
- цитотоксичностга срещу лимфомни клетки би могла да бъде блокирана от родителското анти-CD 19 антитяло HD37 (HD37 антитялото се получава от HD37 хибридома [22]).- cytotoxicity against lymphoma cells could be blocked by the parent anti-CD19 antibody HD37 (HD37 antibody is derived from HD37 hybridoma [22]).
Блокирането на синтетичния път на перфорина, чрез лишаване от калций чрез EGTA, напълно блокира медиираната от bscCD 19 X CD3 цитотоксичност, което подсказва, че специфичният лизис е по-скоро Т-клетъчно медииран ефект, отколкото директен ефект от самото антитяло.Blocking the perforin synthetic pathway by calcium deprivation via EGTA completely blocks the cytotoxicity mediated by bscCD 19 X CD3, suggesting that specific lysis is more a T-cell-mediated effect than a direct effect of the antibody itself.
Като се вземе предвид всичко това, bscCD 19XCD3 антитялото, конструирано съгласно общите изводи на изобретението, надвишава досега описаните CD19XCD3 биспецифични антитела, като се има предвид неговата значително по-висока биологична активност, така както и възможността за неговото бързо и лесно производство, като по този начин се добиват достатъчни количества висококачествени клинични продукти.Taking all this into consideration, the bscCD 19XCD3 antibody constructed according to the general findings of the invention exceeds the CD19XCD3 bispecific antibodies described so far, given its significantly higher biological activity as well as its rapid and easy production, in this way, sufficient quantities of high quality clinical products are obtained.
Поради това се очаква bscCD 19XCD3 молекулите на изобретението да са подходящи кандидати за да докажат терапевтичното предимство от биспецифичните антитела при лечението на Вклетъчно медиирани заболявания, като неHodgkin лимфома при клинични изпитания.Therefore, the bscCD 19XCD3 molecules of the invention are expected to be suitable candidates to demonstrate the therapeutic advantage of bispecific antibodies in the treatment of Cell-mediated diseases such as non-Hodgkin lymphoma in clinical trials.
При един предпочитан вариант за изпълнение на полипептида от изобретението, посочените домени са свързани чрез полипептиден линкер. Посоченият линкер се разполага между посочения първи и посочения втори домен, при което посоченият полипептиден линкер за предпочитане включва множество хидрофилни аминокиселини с пептидни връзки, и свързва N-терминалния край на посочения първи домен и С терминалния край на посочения втори домен.In a preferred embodiment of the polypeptide of the invention, said domains are linked via a polypeptide linker. Said linker is located between said first and said second domain, wherein said polypeptide linker preferably comprises multiple hydrophilic amino acids with peptide bonds, and binds the N-terminal end of said first domain and the C terminal end of said second domain.
При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението посоченият първи и/или втори домен от гореописания полипептид наподобява или съответства на VH и VL областта на естествено съществуващо в природата антитяло. Антитялото, което предоставя сайта за свързване за полипептида на изобретението може да е, например, моноклонално антитяло, поликлонално антитяло, химерно антитяло, хуманизирано антитяло, биспецифично антитяло, синтетично антитяло, фрагмент на антитяло като Fab, Fv или scFv фрагменти и др. или химически модифицирани производни на което и да е от тези вещества. Моноклоналните антитела могат да се изготвят, например, чрез техниките както първоначално са описани от Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, и Galfreq Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, които включват сливането на миши миеломни клетки към клетки от далака на бозайници, имунизирани с модификации, развити в състоянието на техниката. Освен това, антитела или техни фрагменти за горе посочените антигени могат да се получат при използване на методи, които са описани в, например, Harlow and Lane “Antibodies, A Labiratory Manual”, CHS Press, Cold Sping Harbor, 1988. Антитела могат да се получат от различни видове, включително от човек. Когато се получат производни на посочените антитела чрез phage display техниката, повърхностен plasmon резонанс, както се използва в BIAcore системата може да се използва за увеличаване ефикасността на фаговите антитела, които се свързват към един епитоп на CD 19 или CD3 антигена (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13), Продуцирането на химерни антитела се описва, например, в WO 1989/009622. Методи за продуциране на хуманизирани антитела са описани например, в ЕР-А1 0 239 400 и WO 1990/007861. Друг източник на антитела за използване съгласно настоящото изобретение са така наречените ксеногенни антитела. Общият принцип за продуциране на ксеногенни антитела, като човешки антитела в мишки се описва в например, WO 1991/ 010741, WO 1994/002602, WO 1996/034096 и WO 1996/033735.In another preferred embodiment of the invention, said first and / or second domain of the polypeptide described above resembles or corresponds to the V H and V L region of a naturally occurring antibody. The antibody that provides the binding site for the polypeptide of the invention may be, for example, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a bispecific antibody, a synthetic antibody, an antibody fragment such as Fab, Fv or scFv fragments, and the like. or chemically modified derivatives of any of these substances. Monoclonal antibodies can be prepared, for example, by techniques as originally described by Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfreq Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, which include the fusion of murine myeloma cells to mammalian spleen cells immunized with modifications developed in the prior art. In addition, antibodies or fragments thereof for the abovementioned antigens may be obtained using methods described in, for example, Harlow and Lane "Antibodies, A Labiratory Manual", CHS Press, Cold Sping Harbor, 1988. Antibodies may be are obtained from different species, including humans. When derivatives of said antibodies are obtained by the phage display technique, surface plasmon resonance, as used in the BIAcore system, can be used to increase the efficiency of phage antibodies that bind to an epitope of a CD 19 or CD3 antigen (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13), The production of chimeric antibodies is described, for example, in WO 1989/009622. Methods for producing humanized antibodies are described, for example, in EP-A1 0 239 400 and WO 1990/007861. Another source of antibodies for use according to the present invention are the so-called xenogeneic antibodies. The general principle for the production of xenogenic antibodies, such as human antibodies in mice, is described in, for example, WO 1991/010741, WO 1994/002602, WO 1996/034096 and WO 1996/033735.
Антитела за използване, съгласно настоящото изобретение или техните съответстващи имуноглобулинови вериги могат да бъдат допълнително модифицирани при използване на конвенционални техники добре известни от състоянието на техниката, например, чрез използване на аминокиселинни делеции, инсерции, замествания, прибавяния и/или рекомбинации и/или каквито и да било други модификации, известни от състоянието на техниката, било то единично, било то в комбинация. Методи за въвеждане на такива модификации в ДНК последователността подчертаващи аминокиселинната последователност на една имуноглуболинова верига са добре известни на специалистите в областта; виж например Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) Ν. Y. Посочените модификации за предпочитане се осъществяват на нуклеотидно ниво.Antibodies for use according to the present invention or their corresponding immunoglobulin chains can be further modified using conventional techniques well known in the art, for example, using amino acid deletions, insertions, substitutions, additions and / or recombinations and / or whatever and any other modifications known in the art, whether single or combined. Methods for introducing such modifications into the DNA sequence emphasizing the amino acid sequence of an immunoglobulin chain are well known in the art; see, for example, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) Ν. Y. These modifications are preferably carried out at the nucleotide level.
При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението поне един от посочените домени в горе описаните полипептиди е едноверижен фрагмент на вариабилната област на антитялото.In another preferred embodiment of the invention, at least one of the domains mentioned in the polypeptides described above is a single-stranded fragment of the variable region of the antibody.
Както е добре известно, Fv, минималният фрагмент на антитялото, който съдържа пълен сайт за разпознаване и свързване на антигена, се състои от димер на една тежка и една лека верига на вариабилен домен (VH и VL) в не-ковалентна асоциация. В тази конфигурация това съответства на откритите в нативните три комплементарни детерминантни области (CDRs) на всеки вариабилен домен взаимодейства за да дефинира един сайт за свързване на антиген на повърх-ността на VH-VL димера Колективно шестте CDRs придават антиген-свързваща специфичност към антитялото. Рамката (FRs) ограничаваща CDRs има терциерна структура, която по същество се запазва в нативните имуноглобулини от видове, така различни, като човешките и мишите. Тези FRs служат да задържат CDRs в тяхната подходяща ориентация. Константните домени не са необходими за функциите на свързване, но могат да помогнат при стабилизирането на VHVL взаимодействието. Даже единичен вариабилен домен (или половината от Fv включващ единствено три CDRs специфични за един антиген) имат способността да разпознават и да свързват антигена, въпреки че обикновено при по-нисък афинитет, отколкото един цял сайт на свързване (Painter, Bochem. 11 (1972), 1327-1337). Следо вателно, посоченият домен на сайта на свързване на полипептида от изобретението може да е двойка от VH-VL, VH-VH или VL-VL домени, било то от един или от различни имуноглобулини. Редът на VH и VL домените в полипептидната верига не е решителен за настоящото изобретение, редът на посочените по-горе домени може да се обърне, обикновено без да се загуби никаква функция. Въпреки това е важно, че VH и VL домените са подредени така, че сайтът за свързване на антигена да може правилно да се нагъне.As is well known, Fv, the minimal antibody fragment that contains the complete antigen recognition and binding site, consists of a heavy and one light chain variable domain dimer (V H and V L ) in a non-covalent association. In this configuration, this corresponds to the CDRs detected in the native three complementary determinant regions (CDRs) of each variable domain to define a single antigen binding site of the surface of the V H -V L dimer Collectively, the six CDRs confer antigen-binding specificity on the antibody. The framework (FRs) limiting CDRs has a tertiary structure that is essentially conserved in native immunoglobulins of species as diverse as human and mouse. These FRs serve to keep CDRs in their proper orientation. Constant domains are not required for binding functions, but may help stabilize the V H V L interaction. Even a single variable domain (or half of Fv comprising only three CDRs specific to one antigen) has the ability to recognize and bind the antigen, although usually at a lower affinity than one whole binding site (Painter, Bochem. 11 (1972 ), 1327-1337). Therefore, said domain of the polypeptide binding site of the invention may be a pair of V H -V L , V H -V H or V L -V L domains, whether from one or different immunoglobulins. The order of the V H and V L domains in the polypeptide chain is not decisive for the present invention, the order of the above domains can be reversed, usually without losing any function. However, it is important that the V H and V L domains are arranged so that the antigen binding site can be folded properly.
При един предпочитан вариант за получаване на полипептида на изобретението, посочените домени се подреждат в реда VLCD19VHCD19- VHCD3-VLCD3, при което “VL” и “VH” означават леката и тежката верига на вариабилния домен на специфичните анти-CD 19 и антиCD3 антитела.In one preferred embodiment of the polypeptide of the invention, said domains are arranged in the order V L CD19V H CD19- V H CD3-V L CD3, wherein "V L " and "V H " denote the light and heavy chains of the variable domain of specific anti-CD 19 and antiCD3 antibodies.
Както се дискутира по-горе, посочените сайтове за свързване за предпочитане се свързват чрез гъвкав линкер, за предпочитане чрез полипептиден линкер, разположен между посочените домени, като посоченият полипептиден линкер включва множествени, хидрофилни, пептид-свързани аминокиселини с дължина достатъчна да заеме разстоянието между С-терминалния край и един от посочените домени, включващ сайтове за свързване и N-терминалния край на другия от посочените домени, включващ посочените сайтове за свързване когато полипептидът от изобретението претърпява конформация подходяща за свързване, когато се намира във воден разтвор. За предпочитане посоченият полипептиден линкер включва множество глицинови, аланинови и/или серинови остатъци. Предпочита се освен това, посоченият полипептиден линкер да включва множество последователни копия на аминокиселинна последователност. Обикновено полипептидният линкер включва 10 до 15 аминокиселини, въпреки че полипептидни линкери над 15 аминокиселини могат да работят също така добре. В предпочитания вариант за изпълнение на изобретението посоченият полипептиден линкер включва 1 до 5 аминокиселинни остатъци.As discussed above, said binding sites are preferably linked via a flexible linker, preferably via a polypeptide linker located between said domains, said polypeptide linker comprising multiple, hydrophilic, peptide-linked amino acids of sufficient length to span The C-terminal end and one of said domains comprising the binding sites and the N-terminal end of the other of said domains including said binding sites when the polypeptide of the invention it undergoes a conformation suitable for bonding when in aqueous solution. Preferably said polypeptide linker comprises a plurality of glycine, alanine and / or serine residues. Preferably, said polypeptide linker includes multiple sequences of amino acid sequence. Typically, the polypeptide linker includes 10 to 15 amino acids, although polypeptide linkers over 15 amino acids may also work well. In a preferred embodiment of the invention, said polypeptide linker comprises 1 to 5 amino acid residues.
При един изключително предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение посоченият полилинкер в полипептида от изобретението включва 5 аминокиселини. Както се вижда от прилежащите примери за изпълнение на изобретението, посоченият полепептиден линкер има предимството да включва аминокиселинната последователност Gly Gly Gly Gly Ser.In a highly preferred embodiment of the present invention, said polylinker in the polypeptide of the invention comprises 5 amino acids. As can be seen from the accompanying embodiments, said polypeptide linker has the advantage of including the Gly Gly Gly Gly Gly Ser amino acid sequence.
При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посоченият първи домен на полипептида от изобретението включва поне един CDR от VH и VL областта включваща аминокиселинната последователност кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 82 до 414 (VL) и от нуклеотиди 460 до 831 (VH) и/или посоченият втори домен включва поне един CDR, за предпочитане два, по-предпочитано 3 CDR от VH и VL областта включваща аминокиселинната последователност кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 847 до 1203 (VH) и от нуклеотиди 1258 до 1575 (VL), евентуално в комбинация с рамкова област, която се появява заедно с посочените CDR в родителските антитела. CDR съдържащи се във вариабилните области, посочени на фигура 8 могат да бъдат определени например по Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (U. S. Department of Helth and Human Services, third edition, 1983; fourth edition, 1987; fifth edition, 1990). Специалистът в областта ще оцени, че сайтът на свързване или поне един CDR, получен от него може да се използва при конструирането на полипептида от изобретението. За предпочитане, посоченият полипептид включва аминокиселинната последователност, кодирана от ДНК последователността посочена на фигура 8 от нуклеотиди 82 до 1575. Специалистът в областта ще оцени, че сайтовете на свързване на полипептида от изобретението може да бъде конструиран съгласно методи, известни от състоянието на техниката, например както се описва в ЕР-А1 0 451 216 и ЕР-А1 0549581.In another preferred embodiment of the invention, said first domain of the polypeptide of the invention comprises at least one CDR of the V H and V L regions comprising the amino acid sequence encoded by the DNA sequence shown in Fig. 8 from nucleotides 82 to 414 (V L ) and from nucleotides 460 to 831 (V H ) and / or said second domain includes at least one CDR, preferably two, more preferably 3 CDRs from the V H and V L regions comprising the amino acid sequence encoded by the DNA sequence shown in Figure 8 from nucleotides 847 to 12 03 (V H ) and from nucleotides 1258 to 1575 (V L ), optionally in combination with a framework region that appears together with the indicated CDRs in the parent antibodies. The CDRs contained in the variable regions shown in Figure 8 can be determined, for example, by Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (US Department of Helth and Human Services, third edition, 1983; fourth edition, 1987; fifth edition, 1990 ). One of skill in the art will appreciate that the binding site or at least one CDR derived therefrom can be used in constructing the polypeptide of the invention. Preferably, said polypeptide comprises the amino acid sequence encoded by the DNA sequence shown in Figure 8 from nucleotides 82 to 1575. One skilled in the art will appreciate that the binding sites of the polypeptide of the invention can be constructed according to methods known in the art. for example, as described in EP-A1 0 451 216 and EP-A1 0549581.
Домените на сайтовете за свързване на полипептида от изобретението за предпочитане имат специфичност поне идентична по същество на свързващата специфичност на, например антитяло или имуноглоболинова верига, от които произлизат. Такива домени на сайтове за свързване могат да имат афинитет на свързване от 105 М1, за предпочитане не по-висок от 107 М1, за CD3 антигена и предимно до 1010 М-1 или повече за CD 19 антигена.The domains of the polypeptide binding sites of the invention preferably have a specificity at least substantially identical to the binding specificity of, for example, an antibody or immunoglobulin chain from which they originate. Such domain binding sites may have a binding affinity of 10 5 M 1 , preferably not higher than 10 7 M 1 , for the CD3 antigen and preferably up to 10 10 M-1 or more for the CD 19 antigen.
При един предпочитан вариант на изпълнение на полипептида от изобретението (а) посоченият сайт за свързване на първия домен има афинитет от поне приблизително ΙΟ 7 М, за предпочитане поне приблизително ΙΟ 9 М и още по-предпочитано 10 М;In a preferred embodiment of the polypeptide of the invention (a) said first domain binding site has an affinity of at least about 7 M, preferably at least about 9 M, and more preferably 10 M;
и/или (б) посоченият сайт за свързване на втория домен има афинитет от поне приблизително ΙΟ’7 М, за предпочитане по-малко от приблизително 10-6 М и още по-предпочитано от порядъка на ΙΟ'5 М.and / or (b) said second domain binding site has an affinity of at least approximately ΙΟ 7 M, preferably less than approximately 10 -6 M and even more preferably in the order of ΙΟ ′ 5 M.
Съгласно предпочитаните варианти за изпълнение, посочени по-горе е полезно, ако сайтът за свързване разпознаващ CD 19 антигена има висок афинитет с цел да залавя клетките мишени, които трябва да бъдат разрушени с висока ефикасност. От друга страна, афинитетът на свързване на сайта на свързване, разпознаващ CD3 антигена, трябва да е от порядъка на тези на естествените CD3 рецептори или на този, който обикновено се открива при взаимодействието на Т клетъчния рецептор с неговия лиганд, който е МНС-пептиден комплекс върху повърхността на клетката мишена. При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, описаният погоре пептид е биспецифично едноверижно антитяло.According to preferred embodiments mentioned above, it is advantageous if the CD19 antigen recognition site has high affinity in order to capture target cells that need to be destroyed with high efficiency. On the other hand, the binding affinity of the binding site recognizing the CD3 antigen must be in the order of those of the natural CD3 receptors or that which is usually detected by the interaction of the T cell receptor with its ligand, which is the MHC peptide complex on the surface of the target cell. In another preferred embodiment of the invention, the peptide described above is a bispecific single-chain antibody.
Настоящото изобретение се отнася освен това и до полипептид включващ поне още един домен, като посочените домени са свързани чрез ковалентни или нековалентни връзки.The present invention also relates to a polypeptide comprising at least one further domain, said domains being linked by covalent or non-covalent bonds.
Свързването може да се основава на генетично сливане, съгласно методите, известни от състоянието на техниката и описани по-горе или може да се осъществи чрез, например, химическо омрежване, както е описано в WO 1994/ 004686. Допълнителният домен присъстващ в полипептида на изобретението може за предпочитане да е свързан чрез гъвкав линкер, по-полезно полипептиден линкер за един от домените на сайта на свързване, като посоченият полипептиден линкер включва множествени, хидрофилни, пептид-свързани аминокиселини с дължина достатъчна да заемат разстоянието между С-терминалния край на един от посочените домени, и Nтерминалния край на другия от посочените домени, когато посоченият полипептид претърпява конформация подходяща за свързване, когато се намира във воден разтвор. За предпочитане посоченият полепептиден линкер е полипептиден линкер, както е посочено в гореописаните ва рианти за изпълнение. Полипептидьт на изобретението може освен това да включва разцепващ се линкер или сайт за разцепване за протеинази, като ентерокиназа; виж приложените примери.The binding may be based on genetic fusion according to methods known in the art and described above, or may be accomplished by, for example, chemical crosslinking as described in WO 1994 / 004686. The additional domain present in the polypeptide of the invention may preferably be linked via a flexible linker, more useful polypeptide linker for one of the domains of the binding site, said polypeptide linker comprising multiple, hydrophilic, peptide-linked amino acids of sufficient length to occupy oyanieto between the C-terminal end of one of said domains and Nterminalniya end of the other of said domains when said polypeptide undergoes a conformation suitable for binding when it is in aqueous solution. Preferably said polypeptide linker is a polypeptide linker as indicated in the above described embodiments. The polypeptide of the invention may further include a cleavage linker or cleavage site for proteinases such as enterokinase; see attached examples.
Освен това, посоченият допълнителен домен може да е с предварително дефинирана специфичност или функция. Например, в литературата се посочва гостоприемник според концепцията за насочване на биоакгивните вещества като лекарствени средства, токсини и ензими, към специфична точка на тялото, за да се унищожат или локализират злокачествените клетки или за да се индуцира локализиран ефект на лекарственото средство или ензима. Предлагано е този ефект да се постигне чрез конюгиране на биоактивното вещество към моноклонални антитела (виж например Ν. Y. Oxford University Press; and Ghose, J. Natl. Cancer Inst. 61 (1978), 657-676).In addition, said additional domain may have a predefined specificity or function. For example, the literature refers to a host according to the concept of targeting bioactive substances such as drugs, toxins and enzymes, to a specific point in the body to destroy or localize the malignant cells or to induce a localized effect of the drug or enzyme. This effect has been suggested to be achieved by conjugating the bioactive substance to monoclonal antibodies (see, e.g., Y. Oxford University Press; and Ghose, J. Natl. Cancer Inst. 61 (1978), 657-676).
В този контекст се разбира също, че полипептидите, съгласно изобретението могат да бъдат допълнително модифицирани чрез конвенционални методи, известни от състоянието на техниката. Това позволява конструирането на химерни протеини, включващи полипептида от изобретението и други функционални аминокиселинни последователности, например сигнали за ядрена локализация, трансактивиращи домени, ДНК-свързващи домени, хормон-свързващи домени, tag протеини (GST, GFP, h-myc пептид, FLAG, НА пептид) които могат да произлизат от хетероложни протеини. Както се описва в прилежащите примери за изпълнение, полипептидьт от изобретението за предпочитане включва FLAG-tag с дължина приблизително осем аминокиселини; виж фигура 8.It is also understood in this context that the polypeptides of the invention can be further modified by conventional methods known in the art. This allows the construction of chimeric proteins comprising the polypeptide of the invention and other functional amino acid sequences, e.g., nuclear localization signals, transactivating domains, DNA-binding domains, hormone-binding domains, tag proteins (GST, GFP, h-myc peptide, FLA Of the peptide) that may be derived from heterologous proteins. As described in the accompanying embodiments, the polypeptide of the invention preferably includes a FLAG tag of approximately eight amino acids in length; see Figure 8.
Полипептидите от изобретението могат да се използват терапевтично при пациенти, страдащи от В-клетьчни нарушения, като В-клетъчна лимфома, В-клетъчно производна хронична лимфатична левкемия (B-CLL) и/или имащи Вклетъчно свързано автоимунно заболяване, като myasthenia gravis, Morbus Bazedow, Hashimoto thyreoiditis, или Goodpasture syndrome. Такава терапия може да се проведе чрез, например, прилагането на полипептиди от изобретението. Такова прилагане може да използва небелязани, както и белязани полипептиди.The polypeptides of the invention can be used therapeutically in patients suffering from B-cell disorders such as B-cell lymphoma, B-cell-derived chronic lymphatic leukemia (B-CLL) and / or having a cell-related autoimmune disease, such as myasthenia gravis, Morbus Bazedow, Hashimoto thyreoiditis, or Goodpasture syndrome. Such therapy can be carried out by, for example, administering the polypeptides of the invention. Such administration may utilize unlabeled as well as labeled polypeptides.
Полипептидите от изобретението, например, могат да бъдат приложени белязани с терапевтично средство. Тези средства могат да бъ дат свързани или директно, или индиректно към антителата или антигените на изобретението. Пример за индиректно свързване е чрез използване на спейсърна част. Тези спейсърни части на свой ред могат да бъдат неразтворими или разтворими (Diener, Science 231 (1986), 148) и могат да се подберат така, че да направят възможно освобождаването на лекарственото средство от антигена на определеното място. Примери за терапевтични средства, които могат да се свържат към полипептидите на изобретението за имунотерапия са лекарствени средства, радиоизотопи, пектини и токсини. Лекарствените средства, които могат да бъдат конюгирани към полипептидите на изобретението, включват съединения, които класически се отнасят като лекарствени средства, като митомицин С, даунорубицин и винбластин.The polypeptides of the invention, for example, can be administered labeled with a therapeutic agent. These agents may be linked either directly or indirectly to the antibodies or antigens of the invention. An example of indirect coupling is by using a spacer part. These spacer portions, in turn, may be insoluble or soluble (Diener, Science 231 (1986), 148) and may be selected to allow the release of the drug from the antigen at the designated site. Examples of therapeutic agents that can bind to the immunotherapy polypeptides of the invention are drugs, radioisotopes, pectins and toxins. Drugs that can be conjugated to the polypeptides of the invention include compounds that are classically referred to as drugs, such as mitomycin C, daunorubicin, and vinblastine.
При използване на радиоизотопно конюгирани полипептиди на изобретението, например, при имунотерапия, някои изотопи могат да бъдат по-предпочитани от други, според такива фактори, като разпределение на левкоцити, както и стабилност и емисия. Според автоимунният отговор някои емитери могат да са по-предпочетени от други. Най-общо радиоизотопи, излъчващи алфа и бета частици се предпочитат в имунотерапията. Предпочитат се високоенергийни алфа емитери с малък обхват, като 212Bi. Примери за радиоизотопи, които могат да се свържат към полипептидите на изобретението за терапевтични цели са 1251,131l,90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd и 188Re.When using radioisotope conjugated polypeptides of the invention, for example, in immunotherapy, some isotopes may be more preferred than others according to such factors as leukocyte distribution as well as stability and emission. According to the autoimmune response, some emitters may be more preferred than others. In general, radioisotopes emitting alpha and beta particles are preferred in immunotherapy. Low energy high alpha emitters such as 212 Bi are preferred. Examples of radioisotopes that can bind to the polypeptides of the invention for therapeutic purposes are 125 I, 131 I, 90 Y, 67 Cu, 212 Bi, 212 At, 211 Pb, 47 Sc, 109 Pd and 188 Re.
Пектините са протеини, обикновено изолирани от растителен материал, които се свързват към специфични захарни части. Много лектини са способни, също така да аглутинират клетки и да стимулират линфоцити. Въпреки това рицинът е токсичен лектин, който се използва в имунотерапията. Това се осъществява чрез свързване на алфа-пептидната верига на рицина, който е отговорен за токсичността, към полипептида за да се позволи сайт-специфичната доставка на токсичния ефект.Pectins are proteins, usually isolated from plant material, that bind to specific sugar moieties. Many lectins are also capable of agglutinating cells and stimulating lymphocytes. However, ricin is a toxic lectin used in immunotherapy. This is accomplished by binding the alpha-peptide chain of the ricin responsible for toxicity to the polypeptide to allow site-specific delivery of the toxic effect.
Токсините са отровни вещества, продуцирани от растения, животни или микроорганизми, които в достатъчна доза често са летални. Дифтерийният токсин е вещество, продуцирано от Corynebacterium diphtheria, който може да се използва терапевтично. Този токсин се състои от алфа и бета субединици, които при подходящи условия могат да бъдат разделени. Токсичният А компонент може да се свърже към полипептида от изобретението и може да се използва за сайт-специфична доставка на взаимодействащите В-клетки и Т-клетки, които са доведени в близост чрез свързване към полипептида от изобретението.Toxins are poisonous substances produced by plants, animals, or microorganisms that are often lethal in sufficient dosage. Diphtheria toxin is a substance produced by Corynebacterium diphtheria that can be used therapeutically. This toxin is composed of alpha and beta subunits that can be separated under appropriate conditions. The toxic A component can bind to the polypeptide of the invention and can be used for site-specific delivery of interacting B cells and T cells that are brought close by binding to the polypeptide of the invention.
Други терапевтични средства, като описаните по-горе, могат да се свържат към полипептида от изобретението, както и съответни ех vivo и in vivo терапевтични протоколи, са известни или могат лесно да бъдат установени от специалистите в областта. Когато е подходящо специалистът в областта може да използва полипептида от изобретението, описан по-горе, кодиращ който и да е от горе описаните полипептиди или съответните вектори, вместо самия протеинов материал.Other therapeutic agents, such as those described above, can bind to the polypeptide of the invention, as well as the corresponding ex vivo and in vivo therapeutic protocols are known or can be readily established by those skilled in the art. Where appropriate, one skilled in the art may use the polypeptide of the invention described above encoding any of the polypeptides or vectors described above instead of the protein material itself.
Следователно специалистът в областта ще оцени това, че полипептидът от изобретението може да се използва за конструиране на други полипептиди с желана специфичност и биологична функция. Очаква се полипептидите от изобретението да играят важна терапевтична и научноизследователска роля, по-точно в областта на медицината, например при разработка на нови подходи за лечение за В-клетъчно свързаните нарушения, като някои форми на рак или автоимунни заболявания или като интересно средство за анализиране и модулиране на съответния биологичен път на трансдукция на клетъчния сигнал.It will therefore be appreciated by those skilled in the art that the polypeptide of the invention can be used to construct other polypeptides of desired specificity and biological function. The polypeptides of the invention are expected to play an important therapeutic and research role, particularly in the field of medicine, for example in the development of new approaches to the treatment of B-cell disorders, such as some cancers or autoimmune diseases, or as an interesting tool for analysis and modulating the corresponding cellular signal transduction pathway.
При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, този поне един друг домен включва молекула, избрана от група, състояща се от ефекторни молекули, притежаващи конфолмация подходяща за биологична активност, аминокиселинни последователности, способни да отделят един йон, и аминокиселинни последователности, способни на селективно свързване към твърда подложка или към предварително избран антиген.In another preferred embodiment of the invention, this at least one other domain comprises a molecule selected from the group consisting of effector molecules having conflation suitable for biological activity, amino acid sequences capable of secreting a single ion, and amino acid sequences capable of selective binding to a solid support or to a pre-selected antigen.
За предпочитане този друг домен включва ензим, токсин, рецептор, сайт за свързване, сайт за свързване на биосинтетично антитяло, растежен фактор, фактор за клетъчна диференциация, лимфокин, цитокин, хормон, лесно установима частица, антиметаболит, радиоактивен атом или антиген. Посоченият антиген може да бъде, например туморен антиген, вирусен анти ген, микробиален антиген, алерген, автоантиген, вирус, микроорганизъм, полипептид, пептид или множество туморни клетки.Preferably this other domain includes an enzyme, toxin, receptor, binding site, biosynthetic antibody binding site, growth factor, cell differentiation factor, lymphokine, cytokine, hormone, easily detectable particle, antimetabolite, radioactive atom or antigen. Said antigen may be, for example, a tumor antigen, a viral antigen, a microbial antigen, an allergen, an autoantigen, a virus, a microorganism, a polypeptide, a peptide, or multiple tumor cells.
Освен това, посочената последователност, способна да отдели един йон, се избира за предпочитане измежду калмодулин, металотионеин, техни функционални фрагменти, или аминокиселинна последователност богата поне на една от глутаминова киселина, аспартат, лизин и аргинин.In addition, said ion-capable sequence is preferably selected from calmodulin, metallothionein, their functional fragments, or an amino acid sequence rich in at least one glutamic acid, aspartate, lysine and arginine.
Освен това посочената полипептидна последователност, способна селективно да се свързва към твърда подложка, може да е положително или отрицателно заредена аминокиселинна последователност, цистен-съдържаща аминокиселинна последователност, авидин, стрептавидин, функционален фрагмент от протеин А на Staphylococcus, GST, His-tag, FLAG-tag или Lex А. Както се описва в прилежащите примери за изпълнение, полипептидът от изобретението, обяснен с едноверижно антитяло, се експресира с N-терминален FLAG-tag и/или С-терминален His-tag, което позволява по-лесното пречистване и откриване. FLAG-tag, който се използва в примера включва 8 аминокиселини (виж фигура 8) и така се използва за предпочитане, съгласно настоящото изобретение. Въпреки това, FLAG-tag включващи съкратени версии на FLAG се използват в прилежащите примери за изпълнение, като аминокиселинната последователност Asp-Tyr-Lys-Asp също е подходяща.In addition, said polypeptide sequence capable of selectively binding to a solid support may be a positive or negatively charged amino acid sequence, cystine-containing amino acid sequence, avidin, streptavidin, functional fragment of Staphylococcus protein A, GST, His-tag, His-tag -tag or Lex A. As described in the accompanying embodiments, the polypeptide of the invention, explained by a single-stranded antibody, is expressed by an N-terminal FLAG tag and / or a C-terminal His-tag, which allows for easier purification and detection. The FLAG tag used in the example includes 8 amino acids (see Figure 8) and thus is preferably used according to the present invention. However, FLAG-tag including abbreviated versions of FLAG are used in the accompanying embodiments, with the Asp-Tyr-Lys-Asp amino acid sequence also being appropriate.
Ефекторните молекули и аминокиселините последователности, описани по-горе могат да присъстват в проформа, която от своя страна е или активна или не, и които могат да се отстранят, когато например, навлязат в известно клетъчно обкръжение.The effector molecules and amino acid sequences described above may be present in a proforma, which is either active or not, and which can be removed when, for example, they enter a known cellular environment.
При един особено предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посоченият рецептор е костимулираща повърхностна молекула, важна за Т-клетьчното активиране или включваща сайт за свързване на епитоп или сайт за свързване на хормон.In a particularly preferred embodiment of the invention, said receptor is a costimulatory surface molecule important for T-cell activation or including an epitope binding site or hormone binding site.
При друг особено предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, посочената костимулираща повърхностна молекула е CD80 (В71) или CD86 (В7-2).In another particularly preferred embodiment of the invention, said costimulatory surface molecule is CD80 (B71) or CD86 (B7-2).
При друг предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение се отнася до полинуклеогиди, които след експресия кодират го9 ре описаните полипептиди. Посочените полинуклеотиди могат да са слети към подходящи последователности за контрол на експресията, известни от нивото на техниката, че осигуряват правилна транскрипция и транслация на полипептидите.In another preferred embodiment, the present invention relates to polynucleotides which, upon expression, encode the polypeptides described above. Said polynucleotides may be fused to suitable expression control sequences known in the art to provide proper transcription and translation of polypeptides.
Посочените полинуклеотиди могат да бъдат например, ДНК, сДНК, РНК, или синтетично продуцирана ДНК или РНК или рекомбинантно продуцирана химерна молекула на нуклеинова киселина, включваща който и да е от тези полинуклеотиди, било то самостоятелно или в комбинация. За предпочитане, посоченият полинуклеотид е част от вектор. Такива вектори могат да включват други гени, като маркерни гени, които позволяват селекционирането на този вектор в подходяща клетка гостоприемник и при подходящи условия. За предпочитане полинуклеотидът от изобретението е свързан към последователност контролираща експресията, позволяваща експресия в прокариотни или еукариотни клетки. Експресията на посочения полинуклеотид включва транскрипция на полинукпеотида в способна да бъде транслирана иРНК. Регулаторните елементи осигуряващи експресията в еукариотни клетки, за предпочитане клетки от бозайници, са известни на специалистите в областта. Те обикновено включват регулаторни последователности осигуряващи иницииране на транскрипцията и при желание poly-A сигнали, осигуряващи крох на транскрипцията и стабилизиране натранскрипта. Допълнителни регулаторни елементи могат да включват енхансери на транскрипцията, както и енхансери на транслацията, и/или естествено асоциирана или хетероложна промоторна област. Възможните регулаторни елементи позволяващи експресия в прокариотни клетки гостоприемници включват например, PL, lac, trp или tac промотор от Е. coli, а примери за регулаторни елементи позволяващи експресията в еукариотни клетки са АОХ1 или GAL1 промотор в дрожди или CMV-, SV40-, RSV-промотор (Rous sarcoma virus), CMV-енхансер, SV-40енхансер или глобулинов интрон в клетки от бозайници или от други организми. Освен елементите, отговорни за инициирането на транскрипцията, такива регулаторни елементи могат също така да включват сигнали за край на транскрипцията, като SV40-poly-A сайт или tk-poly-Асайт, в посока downstream от полинуклеотида. Освен това, според използваната експресионна система могат да се прибавят към кодиращата последователност на полинуклеотида от изобретението лидерни последователности насочващи полипептида към клетъчното пространство или секретиращи го в средата, добре известни от състоянието на техниката; виж също така например, примерите за изпълнение на изобретението. Лидерната последователност(и) се сглобява в подходяща фаза с транслационните, иницииращите и последователностите затерминация, и за предпочитане лидерна последователност, способна да насочва транслацията на секретирания протеин, или негова част, към периплазматичното пространство или извънклетъчната среда. По желание, хетероложната последователност може да кодира слят протеин, включващ N-терминален идентификационен пептид, придаващ желаните характеристики, например стабилизиране или опростено пречистване на експресирания рекомбинантен продукт; виж по-горе. В този контекст, подходящи експресионни вектори са добре известни от състоянието на техниката, OkayamaBerg cDNA expression vector pcDV 1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogene), or pSPORTl (GIBCO BRL).Said polynucleotides may be, for example, DNA, cDNA, RNA, or synthetically produced DNA or RNA, or a recombinantly produced chimeric nucleic acid molecule comprising any of these polynucleotides, either alone or in combination. Preferably, said polynucleotide is part of a vector. Such vectors may include other genes, such as marker genes, that allow selection of this vector in a suitable host cell and under suitable conditions. Preferably, the polynucleotide of the invention is linked to an expression-controlling sequence allowing expression in prokaryotic or eukaryotic cells. The expression of said polynucleotide involves transcription of the polynucleotide into capable of translating mRNA. The regulatory elements providing expression in eukaryotic cells, preferably mammalian cells, are known to those skilled in the art. These typically include regulatory sequences providing for transcription initiation and, if desired, poly-A signals, providing transcription breakdown and transcript stabilization. Additional regulatory elements may include transcription enhancers as well as translation enhancers and / or a naturally associated or heterologous promoter region. Possible regulatory elements allowing expression in host prokaryotic cells include, for example, PL, lac, trp or tac promoter from E. coli, and examples of regulatory elements allowing expression in eukaryotic cells are the AOX1 or GAL1 promoter in yeast or CMV-, SV40-, RSV promoter (Rous sarcoma virus), CMV enhancer, SV-40 enhancer, or globulin intron in mammalian cells or other organisms. In addition to the elements responsible for initiating transcription, such regulatory elements may also include transcriptional termination signals, such as the SV40-poly-A site or tk-poly-Asite, downstream of the polynucleotide. Furthermore, according to the expression system used, leader sequences targeting the polypeptide to the cell space or secreting it into the environment well known in the art can be added to the coding sequence of the polynucleotide of the invention; see also, for example, embodiments of the invention. The leader sequence (s) are assembled in an appropriate phase with translation, initiation, and fading sequences, and preferably a leader sequence capable of directing the translation of the secreted protein, or a portion thereof, to the periplasmic space or extracellular environment. Optionally, the heterologous sequence may encode a fusion protein comprising an N-terminal identification peptide conferring the desired characteristics, for example, stabilization or simplified purification of the expressed recombinant product; look above. In this context, suitable expression vectors are well known in the art, OkayamaBerg cDNA expression vector pcDV 1 (Pharmacia), pCDM8, pRc / CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), or pSPORT1 (GIBCO BRL).
За предпочитане, последователностите контролиращи експресията са еукариотни промоторни системи във вектори способни да трансформират или да трансфектират еукариотни клетки гостоприемници, но могат да се използват също така контролни последователности за прокариотни клетки. След като векторът е вече инкорпориран в подходящия гостоприемник, гостоприемникът се поддържа при условия, подходящи за високо ниво на експресия на нуклеотидните последователности, и при желание може да следва събиране и пречистване на полипептида от изобретението; виж например прилежащите примери за изпълнение.Preferably, the expression control sequences are eukaryotic promoter systems in vectors capable of transforming or transfecting eukaryotic host cells, but control sequences for prokaryotic cells may also be used. Once the vector has already been incorporated into the appropriate host, the host is maintained under conditions suitable for a high level of expression of the nucleotide sequences, and may optionally be followed by collection and purification of the polypeptide of the invention; see, for example, the accompanying embodiments.
Както се описва по-горе, полипептидът от изобретението може да се използва самостоятелно или като част от вектор за експресия на полипептида от изобретението в клетки, например при генна терапия или диагностициране на заболявания свързани с В-клетъчни нарушения. Полинуклеотидите или векторите съдържащи ДНК последователност(и), кодираща който и да е от горе описаните полипептиди, се въвежда в клетката, която на свой ред продуцира полипеп тида представляващ интерес. Генната терапия, която се основава върху въвеждането на терапевтични гени в клетки чрез ex vivo или in vivo техники е едно от най-важните приложения на трансфера на гени. Подходящи вектори, методи или системи за доставка на гени за ex vivo или in vivo генна терапия са описани в литературата и са добре известни на специалистите в областта; виж например Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann.As described above, the polypeptide of the invention can be used alone or as part of a vector for expression of the polypeptide of the invention in cells, for example in gene therapy or diagnosis of diseases associated with B-cell disorders. Polynucleotides or vectors containing the DNA sequence (s) encoding any of the polypeptides described above are introduced into the cell, which in turn produces the polypeptide of interest. Gene therapy based on the introduction of therapeutic genes into cells by ex vivo or in vivo techniques is one of the most important applications of gene transfer. Suitable vectors, methods or systems for delivering genes for ex vivo or in vivo gene therapy have been described in the literature and are well known to those skilled in the art; see, for example, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Really. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Really. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann.
N. Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 1994/029469; WO 1997/000957, US 5,580,859; US 5,589,466; or Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; цитираната литературна справка. Полинуклеотидите и векторите от изобретението могат да се проектират за директно въвеждане в клетката чрез липозоми, или чрез вирусни вектори (например, аденовирусен, ретроверусен). За предпочитане, посочената клетка е клетка от микробиална клетъчна линия, ембрионална клетка, или яйчна клетка, или техни производни, за предпочитане посочената клетка е стволова клетка. Пример за ембрионална стволова клетка може да бъде стволова клетка, както се описва в Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.N. Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 1994/029469; WO 1997/000957, US 5,580,859; US 5,589,466; or Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; cited literature reference. The polynucleotides and vectors of the invention can be designed for direct introduction into the cell by liposomes or by viral vectors (e.g., adenovirus, retroverus). Preferably, said cell is a microbial cell line, embryonic cell, or egg cell, or derivatives thereof, preferably said cell is a stem cell. An example of an embryonic stem cell may be a stem cell as described in Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.
Съгласно горе описаното, настоящото изобретение се отнася до вектори, определени плазмиди, козмиди, вируси и бактериофаги, използвани конвенционално в генното инженерство, които включват полинуклеотид кодиращ полипептида съгласно изобретението. За предпочитане посоченият вектор е експресионен вектор и/или вектор за трансфер на гени или вектор за насочване. Експресонните вектори, произлизащи от вируси, като ретровирусите, ваксиния вирусите, адено-асоциираните вируси, херпес вирус или говежди папилома вирус, могат да се използват за доставка на полинуклеотидите или векторите на изобретението в популации от клетки мишени. Могат да се използват методи, добре известни на специалиста в областта, за конструиране на рекомбинантни вектори; виж например, техниките описани в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989). Алтернативно, полинуклеотидите и векторите съгласно изобретението могат да се реконституират в липозоми за доставка в клетките мишени. Векторите съдържащи полинекпеотидите на изобретението могат да се прехвърлят в клетка гостоприемник чрез добре известни методи, които варират според клетъчния вид на гостоприемника. Например, трансфекция с калциев хлорид широко се използва за прокариотни клетки, докато обработка с калциев фосфат или електропорация могат да се използват за други клетки госториемници; виж например Sambrook погоре. След като се експресират, полипептидите от изобретението могат да се пречистят, съгласно стандартни процедури от състоянието на техниката, включително утаяване с амониев сулфат, афинитетна колонна хроматография, гел-електрофореза и други; виж Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N. Y. (1982). Съществено чисти полипептиди c приблизително 90 до 95% хомогенност са предпочитани, а 98 до 99% или повече хомогенност са най-предпочитаните за фармацевтично използване. След като са пречистени частично или до желаната хомогенност, полипептидте могат да се използват терапевтично (включително екстракорпорално) или за развитието и усъвършенстването на изследванията.As described above, the present invention relates to vectors, certain plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages conventionally used in genetic engineering, which include a polynucleotide encoding the polypeptide of the invention. Preferably said vector is an expression vector and / or a gene transfer vector or a target vector. Expression vectors derived from viruses, such as retroviruses, vaccine viruses, adeno-associated viruses, herpes virus or bovine papilloma virus, can be used to deliver polynucleotides or vectors of the invention in target cell populations. Methods well known to one of skill in the art may be used to construct recombinant vectors; see, for example, the techniques described in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989). Alternatively, the polynucleotides and vectors of the invention can be reconstituted into liposomes for delivery into target cells. The vectors containing the polynucleotides of the invention can be transferred to a host cell by well-known methods that vary according to the cell type of the host. For example, calcium chloride transfection is widely used for prokaryotic cells, while treatment with calcium phosphate or electroporation can be used for other host cells; see for example Sambrook above. Once expressed, the polypeptides of the invention can be purified according to standard state-of-the-art procedures, including ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, gel electrophoresis, and the like; see Scopes, “Protein Purification,” Springer-Verlag, N. Y. (1982). Substantially pure polypeptides with approximately 90 to 95% homogeneity are preferred, and 98 to 99% or more homogeneity are most preferred for pharmaceutical use. Once purified partially or to the desired homogeneity, the polypeptides can be used therapeutically (including extracorporeally) or for the development and refinement of studies.
При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до клетка, съдържаща описания по-горе полипептид или вектор. За предпочитане посочената клетка е екариотна, попредпочитано клетка от бозайник, ако се предвижда терапевтично използване на полипептида. Дрождите, както и по-малко предпочитаните прокариотни клетки, например бактериални клетки, също могат да служат, по-специално ако продуцираният полипептид се използва като диагностично средство.In another embodiment, the invention relates to a cell comprising the polypeptide or vector described above. Preferably, said cell is an eukaryotic, preferably mammalian cell, if therapeutic use of the polypeptide is contemplated. Yeast, as well as less preferred prokaryotic cells, such as bacterial cells, may also serve, in particular, if the polypeptide produced is used as a diagnostic agent.
Полинуклеотидът или векторът, съгласно изобретението, който присъства в клетката гостоприемник може или да е интегриран в генома на клетката гостоприемник или може да се поддържа извънхромозомно.The polynucleotide or vector of the invention that is present in the host cell may either be integrated into the genome of the host cell or may be maintained extrachromosomally.
Терминът “прокариотен” се счита, че включва всички бактерии, които могат да бъдат трансформирани с ДНК или РНК молекули за експресиране полипептида от изобретението. Прокариотните клетки гостоприемници могат да включват Грам негативни, както и Грам позитивни бактерии, като например, Е. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Терминът “еукариотен” се счита, че включва клетки от дрожди, от висши растения, от насекоми и за предпочитане от бозайници. Според използваният гостоприемник в процедурата за рекомбинантно продуциране, полипептидите от настоящото изобретение могат да са гликозилирани или да не са гликозилирани. Полипептидите от изобретението могат също така да включват един първоначален метионинов аминокиселинен остатък. Полинуклеотид, кодиращ за полипептида от изобретението може да се използва за трансформиране или трансфектиране на гостоприемника, при използване на техники, добре известни на специалистите в областта. Особено предпочитано е използването на плазмид или вирус, съдържащ кодиращата последователност на полипептида от изобретението и генетично слят към него N-терминален FLAG-tag и/или С-терминален His-tag. За предпочитане дължината на този FLAG-tag е приблизително 4 до 8 аминокиселини, по-предпочитано 8 аминокиселини. Методи за приготвяне на слети, оперативно свързани гени и за тяхната експресия в, например клетки на бозайници и бактериални клетки са добре известни от състоянието на техниката (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y, 1989). Описаните там генетични структури и методи могат да се използват за експресиране на полипептида от изобретението в еукариотни или прокариотни гостоприемници. Най-общо, експресионните вектори, съдържащи промоторни последователности, които улесняват ефикасността на транскрипцията на инсерирания полинуклеотид, се използват според гостоприемника. Характерно, експресионният вектор съдържа едно начало на репликация, промотор и терминатор, както и специфични гени, които са способни да предоставят фенотипна селекция на трансформираните клетки. Освен това, трансгенни животни, за предпочитане бозайници, съдържащи клетки от изобретението могат да се използват при широкомащаб ното производство на полипептида от изобретението.The term "prokaryotic" is intended to include all bacteria that can be transformed with DNA or RNA molecules to express the polypeptide of the invention. Host prokaryotic cells may include Gram negative as well as Gram positive bacteria such as E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens and Bacillus subtilis. The term "eukaryotic" is understood to include cells from yeast, higher plants, insects and preferably mammals. According to the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides of the present invention may be glycosylated or not glycosylated. The polypeptides of the invention may also include an initial methionine amino acid residue. A polynucleotide encoding a polypeptide of the invention can be used to transform or transfect the host using techniques well known to those skilled in the art. Particularly preferred is the use of a plasmid or virus comprising the coding sequence of the polypeptide of the invention and a genetically fused N-terminal FLAG-tag and / or C-terminal His-tag. Preferably, the length of this FLAG tag is approximately 4 to 8 amino acids, more preferably 8 amino acids. Methods for the preparation of fusion, operatively linked genes and their expression in, for example, mammalian and bacterial cells are well known in the art (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y, 1989). The genetic structures and methods described therein can be used to express the polypeptide of the invention in eukaryotic or prokaryotic hosts. In general, expression vectors containing promoter sequences that facilitate transcription efficiency of the inserted polynucleotide are used according to the host. Typically, the expression vector contains a single origin of replication, a promoter and a terminator, as well as specific genes that are capable of conferring phenotypic selection on the transformed cells. In addition, transgenic animals, preferably mammals containing cells of the invention can be used in the large-scale production of the polypeptide of the invention.
При друг вариант за изпълнение, настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на описания по-горе, включващ култивиране на клетки от изобретението при условия, подходящи за ексресията на полипептида и изолиране на полипептида от клетките или от културалната среда.In another embodiment, the present invention relates to a method for the preparation of the above, comprising culturing cells of the invention under conditions suitable for the expression of the polypeptide and isolating the polypeptide from the cells or from the culture medium.
Трансформираният гостоприемник може да се отглежда във ферментатор и да се култивира, съгласно техниките известни от състоянието на техниката, за да се постигне оптимален клетъчен растеж. Полипептидът от изобретението може след това да се изолира от културалната среда, клетъчен лизат или фракции на клетъчни мембрани. Изолирането и пречистването на например, микробиално експресирани полипептиди на изобретението може да е чрез което и да е конвенционално средство, като разделяне чрез препаративна хроматография и имунологично разделяне, като тези изискващи използването на моноклонални или поликлонални антитела насочени срещу, например, tag на полипептида на изобретението или както е описано в примерите за изпълнение на изобретението.The transformed host can be grown in a fermenter and cultured according to techniques known in the art to achieve optimal cell growth. The polypeptide of the invention can then be isolated from the culture medium, cell lysate, or cell membrane fractions. Isolation and purification of, for example, microbially expressed polypeptides of the invention may be by any conventional means, such as separation by preparative chromatography and immunological separation, such as those requiring the use of monoclonal or polyclonal antibodies directed against, for example, a tag of the polypeptide of the invention or as described in the embodiments of the invention.
Следователно, настоящото изобретение дава възможност за рекомбинантно продуциране на полипептиди, включващи сайт на свързване, притежаващ афинитет и специфичност за епитоп за CD 19 и CD3 антигена, и по желание друг функционален домен. Както става ясно от горното, изобретението предоставя голяма фамилия полипептиди, съдържащи такива сайтове за свързване за използване при каквито и да са терапевтични или диагностични подходи. За специалиста в областта е ясно, че полипептидите от изобретението могат, освен това, да бъдат свързани към други частици, както е описано по-горе, например, лекарствени средства, насочващи и изобразяващи приложенията. Такова свързване може да се проведе химически след експресия на полипептидите към сайта за прикрепване или продуктът на свързване може да се конструира в полипептида на изобретението на ДНК ниво. След това ДНК-ите се експресират в подходяща гостоприемнкова система и експресираните протеини се събират и се ренатурират (възстановяват) при необходимост. Както е описано погоре, сайтовете на свързване за предпочитане произлизат от вариабилната област на антителата. В това отношение хибридомната технология дава възможност да се продуцират клетъчни линии, секретиращи антитяло за практически което и да е желано вещество, което дава имунен отговор. След това може да се получи от цитоплазмата на хибридомата РНК кодираща леките и тежките вериги на имуноглобулина. Участъкът от 5' края на иРНК може да се използва за получаване на сДНК, която да се използва при метода от настоящото изобретение. ДНК кодираща полипептидите на изобретението може след това да се експресира в клетки, за предпочитане клетки от бозайници.Accordingly, the present invention enables the recombinant production of polypeptides comprising a binding site having affinity and epitope specificity for the CD19 and CD3 antigen, and optionally another functional domain. As is apparent from the above, the invention provides a large family of polypeptides containing such binding sites for use in any therapeutic or diagnostic approach. It will be understood by one of ordinary skill in the art that the polypeptides of the invention may further be coupled to other particles as described above, for example, drugs targeting and depicting applications. Such binding can be carried out chemically after expression of the polypeptides at the attachment site or the binding product can be constructed in the polypeptide of the invention at the DNA level. The DNAs are then expressed in a suitable host system, and the expressed proteins are harvested and renatured as needed. As described above, binding sites preferably originate from the variable region of antibodies. In this regard, hybridoma technology enables the production of antibody-secreting cell lines for virtually any desired substance that produces an immune response. It can then be obtained from the cytoplasm of the hybridoma RNA encoding the light and heavy chains of the immunoglobulin. The 5 'end region of the mRNA can be used to produce cDNA to be used in the method of the present invention. The DNA encoding the polypeptides of the invention can then be expressed in cells, preferably mammalian cells.
Според клетката гостоприемник може да са необходими техники за ренатурация, за да се постигне правилна конформация. При необходимост в ДНК може да се направи точково заместващо търсене за оптимизиране на свързването, при използване на конвенционален касетен мутагенез или други методологии за конструиране на протеини, като описаната в настоящото. Изготвянето на полипептидите на изобретението може също да зависи от известността на аминокиселинната последователност (или съответната ДНК или РНК последователност) на биоактивни протеини, като ензими, токсини, растежни фактори, фактори за клетъчна диференциация, рецептори, антиметаболити, хормони или различни цитокини или линфокини. Такива последователности са известни от литературата и са на разположение посредством компютъризирани бази данни. Например, полипептидът на изобретението може да се конструира, така че да се състои от едноверижен Fv фрагмент и извънклетъчната част на човешкия ко-стимулиращ протеин CD80 (В7-1) свързан чрез (Gly4Ser 1) 1 линкер. Ко-стимулиращият протеин CD80 принадлежи на Ig суперфамилията. Той представлява силно гликозилиран протеин от 262 аминокиселини. Поподробно описание е публикувано от Freeman, J. Immunol. 143 (1989), 2714-2722. Стабилна експресия може да се осъществи в, например DHFR дефицитни СНО-клетки, както е описано от Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537566. След това протеинът може да се пречисти чрез неговия His-tag, прикрепен към С-края при използване HaNi-NTA-column (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995), 7021-7025).According to the host cell, renaturation techniques may be needed to achieve the correct conformation. If necessary, spot replacement search can be performed in DNA to optimize binding using conventional cassette mutagenesis or other protein design methodologies, as described herein. The preparation of the polypeptides of the invention may also depend on the known amino acid sequence (or corresponding DNA or RNA sequence) of bioactive proteins, such as enzymes, toxins, growth factors, cell differentiation factors, receptors, antimetabolites, hormones or various cytokines or lymphocytes. Such sequences are known in the literature and are available through computerized databases. For example, the polypeptide of the invention may be designed to consist of a single-stranded Fv fragment and the extracellular portion of the human co-stimulatory protein CD80 (B7-1) linked via a (Gly4Ser 1) 1 linker. The CD80 co-stimulating protein belongs to the Ig superfamily. It is a highly glycosylated protein of 262 amino acids. A more detailed description is published by Freeman, J. Immunol. 143 (1989), 2714-2722. Stable expression can be effected in, for example, DHFR deficient CHO cells, as described by Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537566. The protein can then be purified by its His-tag attached to the C-terminus using a HaNi-NTA-column (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021 -7025).
Освен това настоящото изобретение пре доставя състави, включващи горепосочения полипептид, полинуклеотид или вектор от настоящото изобретение.Furthermore, the present invention provides compositions comprising the aforementioned polypeptide, polynucleotide or vector of the present invention.
За предпочитане, настоящото изобретение се отнася до състави, които са фармацевтични състави, включващи горепосочения полипептид^), полинуклеотид(и) или вектор(и) от настоящото изобретение.Preferably, the present invention relates to compositions that are pharmaceutical compositions comprising the aforementioned polypeptide, polynucleotide (s) or vector (s) of the present invention.
Фармацевтичният състав, съгласно настоящото изобретение, може освен това да включва фармацевтично приемлив носител. Примери за подходящи фармацевтични носители са добре известни от състоянието на техниката и включват буферирани с фосфат физиологични разтвори, вода, емулсии, като маслено-водни емулсии, различни видове омокрящи средства, стерилни разтвори, и др. Състави, включващи такива носители могат да се приведат във фармацевтична форма чрез добре известни конвенционални методи. Тези фармацевтични състави могат да се прилагат на субекта в подходяща доза. Прилагането на подходящи състави може да се осъществи по различни пътища, например интравенозно, интраперитонеално, подкожно, интрамускулно, локално или интрадермално. Режимът на дозата ще се определи от лекуващия лекар и клиничните фактори. Както е добре известно от медицинската литература, дозите за всеки един пациент, зависят от много фактори, включително ръста на пациента, площта на телесната повърхност, възрастта, определеното съединение, което ще бъде приложено, пола, времето и начина за прилагане, общото здравословно състояние и другите лекарствени средства, които се прилагат конкурентно. Най-общо, режимът за редовно прилагане на фармацевтичния състав трябва да е в границите от 1 micro g до 10 mg единици дневно. Ако режимът е непрекъснато вливане, трябва да бъде в границите от 1 micro g до 10 mg единици на килограм телесно тегло за минута, съответно. Въпреки това, по-предпочитана доза за непрекъснато вливане, трябва да бъде в границите от 0,01 micro g до 10 mg единици на килограм телесно тегло за час. Изключително предпочитани дози са посочените по-долу. Може да се следи прогресирането чрез периодично оценяване. Дозата ще варира, но предпочитаната доза за интравенозно прилагане на ДНК е от приблизително 106 до 1012 копия на ДНК молекулата. Съставът от изобретението може да се приложи локално или систематично. Обикновено, прилагането е парентерално, например интравенозно; ДНК също може да се приложи директно в мястото мишена, например чрез биолистична доставка към вътрешен или външен сайт мишена или чрез катетър към сайт в артерия. Приготвянето за парентерално приложение включва стерилни водни или не-водни разтвори, суспензии и емулсии. Примери за неводни разтворители са пропилен гликол, полиетилен гликол, растителни масла, като маслинено масло, и инжектируеми органични естери, като етил олеат. Водните носители включват вода, алкохол/водни разтвори, емулсии или суспенсии, включително физиологичен разтвор и буферирани среди. Парентералните вехикулуми включват разтвор на натриев хлорид, Ringer’s декстроза, декстроза и натриев хлорид, лактиран Ringer или фиксирани масла. Интравенозните вехикулуми включват течност и хранителни добавки, електролитни добавки (като тези основаващи се на Ringer’s декстрозата), и др. подобни. Могат да присъстват също и консерванти и други допълнения като например, антимикробиални средства, антиоксиданти, хелатни средства и инертни газове и др. подобни. Освен това, фармацевтичният състав на настоящото изобретение може да включва протеинови носители като например, серумен албумин или имуноглобулин, за предпочитане с човешки произход. Освен това се предвижда фармацевтичният състав от изобретението да може да включва биологичноактивно средство, според желаното използване на фармацевтичния състав. Такива средства могат да бъдат лекарствени средства, действащи върху гастро-интестиналната система, лекарствени средства, действащи като цитостатици, лекарствени средства, предотвратяващи увеличената пикочна киселина в кръвта, и/или средства като Т-клетьчни ко-стимулиращи молекули или цитокини, известни от състоянието на техниката.The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of suitable pharmaceutical carriers are well known in the art and include phosphate buffered saline, water, emulsions, such as oil-water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions, and the like. Compositions comprising such carriers can be formulated into pharmaceutical form by well-known conventional methods. These pharmaceutical compositions may be administered to the subject in an appropriate dose. The administration of suitable compositions can be accomplished by a variety of routes, for example intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, topically or intradermally. The dosage regimen will be determined by your doctor and clinical factors. As is well known in the medical literature, dosages for each patient depend on many factors, including patient height, body surface area, age, particular compound to be administered, sex, time and route of administration, general health status and other medicines that are competitively administered. In general, the regimen for regular administration of the pharmaceutical composition should be in the range of 1 micro g to 10 mg units per day. If the regimen is continuous infusion, it should be in the range of 1 micro g to 10 mg units per kilogram body weight per minute, respectively. However, a more preferred dose for continuous infusion should be in the range of 0.01 micro g to 10 mg units per kilogram body weight per hour. Particularly preferred doses are as indicated below. Progression through periodic evaluation can be monitored. The dose will vary, but the preferred dose for intravenous administration of DNA is from about 10 6 to 10 12 copies of the DNA molecule. The composition of the invention may be administered topically or systematically. Typically, administration is parenteral, e.g., intravenously; DNA can also be applied directly to the target site, for example, by biological delivery to an internal or external target site or by a catheter to a site in an artery. Preparation for parenteral administration involves sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcohol / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer or fixed oils. Intravenous vehicles include fluid and nutritional supplements, electrolyte supplements (such as those based on Ringer's dextrose), and more. similar. Preservatives and other additives such as antimicrobials, antioxidants, chelating agents and inert gases, etc., may also be present. similar. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may include protein carriers such as serum albumin or immunoglobulin, preferably of human origin. It is further contemplated that the pharmaceutical composition of the invention may include a biologically active agent, according to the desired use of the pharmaceutical composition. Such agents may be drugs acting on the gastrointestinal system, drugs acting as cytostatics, drugs preventing increased uric acid in the blood, and / or agents such as T-cell co-stimulating molecules or cytokines known in the art of the technique.
Настоящото изобретение предвижда, че различните полинуклеотиди и вектори от настоящото изобретение се прилагат било то самостоятелно или в каквато и да е комбинация, при използване на стандартни вектори и/или системи за доставка на гени, и при желание заедно с фармацевтично приемлив носител или пълнител. След прилагането посочените полинуклеотиди и вектори могат да бъдат стабилно интегрирани в генома на субекта.The present invention provides that the various polynucleotides and vectors of the present invention are administered either alone or in any combination, using standard vectors and / or gene delivery systems, and optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. After administration, said polynucleotides and vectors can be stably integrated into the genome of the subject.
От друга страна могат да се използват вирусни вектори, които са специфични за някои клетки или тъкани и продължават да съществуват в посочените клетки. Подходящи фармацевтично приемливи носители или пълнители са известни от състоянието на техниката. Фармацевтичните състави, приготвени съгласно настоящото изобретение, могат да се използват за предотвратяване или лечение или отлагане във времето на различни видове заболявания, които са свързани с В-клетъчно свързаните имунонедостатьчности и злокачествени прояви.On the other hand, viral vectors that are specific to some cells or tissues and continue to exist in said cells may be used. Suitable pharmaceutically acceptable carriers or excipients are known in the art. The pharmaceutical compositions prepared according to the present invention can be used to prevent or treat or delay over time various types of diseases that are associated with B-cell-associated immunodeficiency and malignancies.
Възможно е да се използва, освен това, фармацевтичният състав, съгласно изобретението, който включва полинуклеотид или вектор от изобретението за генна терапия. Подходящи системи за доставка на гени могат да включват липозоми, рецептор-медиирана система за доставка, гола ДНК и вирусни вектори като херпес вирус, ретровируси, адено-асоциирани вируси, измежду другите. Доставянето на нуклеинови киселини в специфично място в тялото за генна терапия може също да се постигне при използване на система за биолистична доставка, като описаната от Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Други методи за доставка на нуклеинови киселини включват генен трансфер медииран от частици, като например, описания във Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692699. Трябва да се разбира, че въведените полинуклеотиди или вектори експресират генния продукт след въвеждане в посочената клетка и за предпочитане остават с този статус по време на полуживота на посочената клетка. Например, може да се проектира, съгласно методи, добре известни на специалистите в областта, клетъчна линия, която стабилно да експресира полинуклеотида под контрола на подходящи регулаторни последователности. Вместо да се използват вектори, които съдържат вирусно начало на репликация, клетките гостопиремници могат да се трансформират с полинуклеотида от изобретението и селекционен маркер, или от едни и същи или от различни плазмиди. След въвеждането на горе посочената ДНК, проектираните клетки могат да се оставят да прорастват 1 -2 дни в обогатена среда, след което се включва селективна среда. Селекционният маркер в рекомбинантния плазмид придава устойчивост към се лекцията и позволява подбора на клетки, притежаващи стабилно интегриран плазмид в техните хромозоми и прорастват под формата на огнище, което на свой ред може да бъде клонирано и да се развие в клетъчна линия. Такива проектирани клетъчни линии също са изключително полезни при методите за скриниране за откриване на съединения включени, например във взаимодействията В-клетки/Т-клетки.It is also possible to use the pharmaceutical composition according to the invention which includes a polynucleotide or vector of the invention for gene therapy. Suitable gene delivery systems may include liposomes, receptor-mediated delivery systems, naked DNA, and viral vectors such as herpes virus, retroviruses, adeno-associated viruses, among others. Delivery of nucleic acids to a specific site in the body for gene therapy can also be achieved using a biological delivery system, such as that described by Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Other methods of nucleic acid delivery include particle-mediated gene transfer, such as those described in Verma, Gene Ther. 15 (1998), 692699. It should be understood that introduced polynucleotides or vectors express the gene product after introduction into said cell and preferably remain with this status during the half-life of said cell. For example, a cell line can be designed, according to methods well known to those skilled in the art, to stably express the polynucleotide under the control of appropriate regulatory sequences. Instead of using vectors that contain the viral origin of replication, the host cells can be transformed with the polynucleotide of the invention and a selection marker, or from the same or different plasmids. After the introduction of the above DNA, the engineered cells can be allowed to sprout for 1 -2 days in enriched medium, after which selective medium is included. The selection marker in the recombinant plasmid confers resistance to the selection and allows the selection of cells that have a stably integrated plasmid in their chromosomes and sprout in the form of an outbreak, which in turn can be cloned and develop into a cell line. Such engineered cell lines are also extremely useful in screening methods for detecting compounds involved, for example in B-cell / T-cell interactions.
Могат да се използват голям брой селекционни системи, включително, но без да се ограничават до, тимидин киназа на херпес симплекс вирус (Wigler, Cell 11 (1977), 223), хипоксантин-гуанин фосфорибозил трансфераза (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), и аденин фосфорибозил трансфераза (Lowy, Cell 22 (1980), 817) в tk‘, hgprt или aprt клетки, съответно. Също, може да се използва устойчивост на антиметаболити, като основа за селекция на dhfr, който придава устойчивост на метотрексат (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O’Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, който придава устойчивост на микофенолна киселина (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, който придава устойчивост на аминогликозида G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); hygro, който придава устойчивост на хигромицин (Santerre, Gene 30 (1984), 147); или пуромицин (pat, пуромицин N-ацетил трансфераза). Описани са допълнителни селекционни гени, например trpB, който дава възможност на клетките да използват индол вместо триптофан, hisD, който дава възможност на клетките да използват хистинол вместо хистидин (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); и ODC (орнитин декарбоксилаза) който придава устойчивост на орнитин декарбоксилазен инхибитор, 2-(дифлуорометил)-ОЬорнитин, DFMO (McCologue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).A large number of breeding systems may be used, including but not limited to the herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler, Cell 11 (1977), 223), hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026), and adenine phosphoribosyl transferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) in tk ', hgprt or aprt cells, respectively. Also, resistance to antimetabolites may be used as a basis for the selection of dhfr that confers resistance to methotrexate (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, which confers resistance to the aminoglycoside G-418 (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1); hygro that confers hygromycin resistance (Santerre, Gene 30 (1984), 147); or puromycin (pat, puromycin N-acetyl transferase). Additional selection genes have been described, for example, trpB, which enables cells to use indole instead of tryptophan, hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047 ); and ODC (ornithine decarboxylase), which confers resistance to ornithine decarboxylase inhibitor, 2- (difluoromethyl) -Ornithine, DFMO (McCologue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
При друг вариант за изпълнение настоящото изобретение се отнася до диагностични състави, включващи който и да е от гореописаните пептиди, полинуклеотиди или вектори от изобретението и по желание подходящи средства за определяне.In another embodiment, the present invention relates to diagnostic compositions comprising any of the peptides, polynucleotides or vectors of the invention described above and, if desired, suitable determination agents.
Полипептидите от изобретението също са подходящи за използване при имуноизследвания, при които те могат да бъдат използвани в течна фаза или да бъдат свързани към твърдофазов носител. Примери за имуноизследвания, които могат да използват полипептиди от настоящото изобретение са компетитивни и некомпетитивни имуноизследвания в директен или индиректен формат. Примери за такива имуноизследвания са радиоимуноизследването (RIA), сандвич (имунометрично изследване) и Western blot изследването. Полипептидите от настоящото изобретение могат да бъдат свързани към много различни носители и да се използват, за да се изолират клетки специфично свързани към посочените полипептиди. Примери за добре известни носители включват стъкло, полистирен поливинил хлорид, полипропилен полиетилен поликарбонат, декстран, найлон, амилози, естествени и модифицирани целулози, колоидални метали, полиакриламиди, агарози и магнетит. Същността на носителя може да е или разтворим или неразтворим за целите на изобретението.The polypeptides of the invention are also suitable for use in immunoassays in which they can be used in the liquid phase or coupled to a solid phase carrier. Examples of immunoassays that can use the polypeptides of the present invention are competitive and incompetent direct or indirect immunoassays. Examples of such immunoassays are radioimmunoassay (RIA), sandwich (immunometric assay) and Western blot assay. The polypeptides of the present invention can be linked to many different carriers and used to isolate cells specifically linked to said polypeptides. Examples of well known carriers include glass, polystyrene polyvinyl chloride, polypropylene polyethylene polycarbonate, dextran, nylon, amylose, natural and modified celluloses, colloidal metals, polyacrylamides, agarose and magnetite. The nature of the carrier may be either soluble or insoluble for the purposes of the invention.
Съществуват много различни маркери и методи за белязане, известни на специалистите в областта. Примери за такъв тип маркери, които могат да бъдат използвани в настоящото изобретение, включват ензими, радиоизотопи, колоидални метали, флуоресцентни съединения, хемилуминесцентни съединения и биолуменисцентни съединения; виж също вариантите за изпълнение, дискутирани по-горе.There are many different markers and marking methods known to those skilled in the art. Examples of such type of markers that can be used in the present invention include enzymes, radioisotopes, colloidal metals, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds; see also the embodiments discussed above.
Настоящото изобретение се отнася също така до използване на полипептидите, полинуклеотидите и векторите от настоящото изобретение, описани по-горе за получаване на фармацевтичен състав за лечение на В-клетъчни злокачествени образувания, В-клетъчно медиирани автоимунни заболявания или изтощаване на Вклетки.The present invention also relates to the use of the polypeptides, polynucleotides and vectors of the present invention described above for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of B-cell malignancies, B-cell-mediated autoimmune diseases or depletion of Cells.
Наскоро проведени клинични изследвания за пренасочване на цитотоксичната активност на човешки Т клетки чрез биспецифични антитела са показали обещаващи резултати при лечението на рефракторна болест на Hodgkin [33], рак на гърдата и яйчниците [34-37] и злокачествена глиома [38]. Като се вземат предвид фактитеRecent clinical studies to redirect the cytotoxic activity of human T cells through bispecific antibodies have shown promising results in the treatment of refractory Hodgkin's disease [33], breast and ovarian cancer [34-37], and malignant glioma [38]. Considering the facts
- че bsc антитела, поради тяхната ниска молекулна маса улесняват навлизането в тумори (както бе показано за Fab или Fv фрагменти) [39]; и- that bsc antibodies, due to their low molecular weight, facilitate tumor entry (as shown for Fab or Fv fragments) [39]; and
- допуска се, че bsc антитела намаляват зависимата от дозата и ограничаваща дозата ток сичност, причинена от системното освобождаване на цитокини медиирано от Fc части на конвенционално биспецифично антитяло; и- bsc antibodies are believed to reduce the dose-dependent and dose-limiting toxicity caused by the systemic release of cytokines mediated by Fc portions of a conventional bispecific antibody; and
- това, че интактно моноклонално антитяло (насочено срещу CD20) води до туморна репресия при напредналите стадии HaNHL [41,42], се очаква и действително е било показано, че полипептидите от изобретението са интересни молекули, които допринасят за допълнително терапевтично подобрение.- that an intact monoclonal antibody (directed against CD20) leads to tumor repression in advanced stages of HaNHL [41,42], it is expected and has actually been shown that the polypeptides of the invention are interesting molecules that contribute to further therapeutic improvement.
Следователно при един предпочитан вариант, фармацевтичният състав на изобретението, се използва за лечение на не-Hodgkin лимфома.Therefore, in a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is used to treat non-Hodgkin lymphoma.
Границите на дозата за прилагане на полипептидите, полинуклеотидите и векторите от изобретението са достатъчно широки за да доведат до желания ефект, при който симптомите на В-клетьчно медиираните заболявания се подобряват. Дозата не трябва да е толкова голяма, че да причини основни обратни странични ефекти, като нежелани кръстосани реакции, анафилактични реакции и други подобни. Обикновено дозата варира според възрастта, състоянието, пола и разпространението на болестта в пациента и може да бъде определена от специалиста в областта. Дозата може да се определи от индивидуалния лекар по време на каквито и да са контраиндикации. Предвижда се границата на посочената доза да е при 0,01 micro g до 10 mg от полипептида на изобретението. Изключително предпочитана доза е 0,1 micro g до 1 mg, попредпочитана е 1 до 100 micro g и още по-предпочитана е доза от 3 до 10 micro g (претенция 7).The dose limits for administering the polypeptides, polynucleotides, and vectors of the invention are wide enough to produce the desired effect in which the symptoms of B-cell-mediated disease are improved. The dose should not be so large as to cause major adverse effects, such as adverse reactions, anaphylactic reactions and the like. Typically, the dosage will vary according to the age, condition, sex and spread of the disease in the patient and can be determined by one of ordinary skill in the art. The dose may be determined by the individual physician during any contraindications. It is envisaged that the dose range will be at 0.01 micro g to 10 mg of the polypeptide of the invention. An extremely preferred dose is 0.1 microg to 1 mg, a preferred dose is 1 to 100 microg and an even more preferred dose is 3 to 10 microg (claim 7).
Изобретението се отнася също така и до метод за идентифициране на съединения за активиране или ко-стимулиране на Т-клетки или за идентифициране на инхибитори на активирането и стимулирането на Т клетки, включващThe invention also relates to a method for identifying compounds for activating or co-stimulating T cells or for identifying inhibitors of T cell activation and stimulation, including
а) култивиране на CD 19 позитивни клетки (за предпочитане В клетки) и Т клетки в присъствието на полипептида от изобретението и при желание в присъствието на съставка, способна да предостави сигнал, който може да бъде отчетен в отговор на Т клетъчното активиране със съединение, което ще бъде скринирано при условия, позволяващи взаимодействие на съединението с клетките; иa) culturing CD19 positive cells (preferably B cells) and T cells in the presence of the polypeptide of the invention and, if desired, in the presence of a component capable of providing a signal that can be readily responded to by T cell activation with a compound, which will be screened under conditions allowing the compound to interact with the cells; and
б) определяне присъствието или отсъствието на сигнал генериран от взаимодействието на съединението с клетките.b) determining the presence or absence of a signal generated by the interaction of the compound with the cells.
Този вариант за изпълнение е изключително полезен за тестване на способността на съединенията като ко-стимулиращи молекули. При този метод CD 19 позитивни клетки/В клетки предоставят първичен сигнал за активиране на Т клетки, като по този начин се избягва клонотипичния Т клетъчен рецептор. След това може да се определи съгласно изобретението, кое от съединенията за тестване е все още необходимо действително да активира Т клетките. При този метод от изобретението CD 19 позитивни клетки/В клетки функционират, като стимулиране на клетки, свързващи биспецифични молекули, които се свързват към CD3 комплекси на повърхността на същите Т клетки. Биологичните методи за провеждане на култивирането, определяне и по желание тестване са ясни за специалиста в областта.This embodiment is extremely useful for testing the ability of compounds as co-stimulating molecules. In this method CD 19 positive cells / B cells provide a primary signal for T cell activation, thus avoiding the clonotypic T cell receptor. It can then be determined according to the invention which of the test compounds still needs to actually activate the T cells. In this method of the invention, CD 19 positive cells / B cells function as stimulating cells binding bispecific molecules that bind to CD3 complexes on the surface of the same T cells. The biological methods for conducting the cultivation, determination and, if desired, testing are clear to the person skilled in the art.
Терминът “съединение” в метода от изобретението включва сигнално вещество или множество вещества, които могат да бъдат или не идентични. Посоченото съединение(я) може да е включено, например в проби, например, клетъчни екстракти от, например растения, животни или микроорганизми. Освен това посочените съединения могат да са известни от състоянието на техниката, но досега да не са били известни със способността си да инхибират Т-клетьчното активиране или да не са били известни с полезността си като Т-клетъчен ко-стимулиращ фактор. Множество съединения може например, да се добави към културалната среда или да се инжектира в клетката. Ако при метода на изобретението, се идентифицира проба съдържаща съединението, тогава е възможно или да се изолира съединението от първоначалната проба, идентифицирана като съдържаща въпросното съединение или впоследствие първоначалната проба може да се раздели, например, ако се състои от множество различни съединения, така че да се намали броят различни съединения за проба и да се повтори методът с подразделенията на първоначалната проба. След това може да се определи дали посочената проба или съединение проявява необходимите качества, чрез методи, известни от състоянието на техниката, като описаните в настоящото и в прилежащите претенции. В зависимост от сложността на пробите, гореописаните етапи могат да се проведат няколко пъти, за предпочитане докато пробата, идентифицирана съгласно метода на изобретението, включва единствено ограничен брой от или само едно вещество. За предпочитане посочената проба включва вещества с подобни химични и/ или физични свойства, а по-предпочитано е посочените вещества да са идентични. Методите на изобретението могат лесно да се проведат и да се проектират от специалист в областта, например, съгласно други опити, извършени на базата на клетки, описани в състоянието на техниката или при използване и модифициране на методи, както са описани в прилежащите примери за изпълнение. Освен това специалистът в областта лесно ще разпознае кои други съединения и/или клетки могат да се използват за осъществяване на методите на изобретението, например, интерлевкини или ензими, които при необходимост конвертират някое съединение в предшественика, който на свой ред стимулира или потиска Т клетъчното активиране. Такова адаптиране на метода на изобретението е в способностите на специалиста в областта и може да се осъществи без ненужно експериментиране.The term "compound" in the method of the invention includes a signal substance or a plurality of substances that may or may not be identical. Said compound (s) may be included, for example, in samples, for example, cell extracts of, for example, plants, animals or microorganisms. In addition, said compounds may be known in the art, but have not yet been known for their ability to inhibit T-cell activation or have not been known for their utility as a T-cell co-stimulating factor. Multiple compounds may, for example, be added to the culture medium or injected into the cell. If a sample containing the compound is identified by the method of the invention, then it is possible to either isolate the compound from the original sample identified as containing the compound in question, or subsequently the original sample can be separated, for example, if it consists of many different compounds, such that reduce the number of different compounds for the sample and repeat the method with the subdivisions of the original sample. It can then be determined whether said sample or compound exhibits the necessary properties by methods known in the art, such as those described herein and in the appended claims. Depending on the complexity of the samples, the steps described above can be performed several times, preferably while the sample identified according to the method of the invention includes only a limited number of or only one substance. Preferably said sample includes substances having similar chemical and / or physical properties, and more preferably said substances are identical. The methods of the invention can be readily conducted and designed by one of ordinary skill in the art, for example, according to other cell-based experiments described in the prior art or using and modifying methods as described in the accompanying embodiments . In addition, one of skill in the art will readily recognize which other compounds and / or cells can be used to carry out the methods of the invention, for example, interleukins or enzymes that, if necessary, convert any compound into a precursor, which in turn stimulates or suppresses T cell activation. Such adaptation of the method of the invention is within the ability of one of ordinary skill in the art and can be accomplished without undue experimentation.
Съединения, които могат да се използват съгласно метода на настоящото изобретение, включват пептиди, протеини, нуклеинови киселини, антитела, малки органични съединения, лиганди, пептидомиметици, PNAs и други подобни. Посочените съединения могат да бъдат също така функционални производни или аналози на известни Т-клетъчни активатори или инхибитори. Методи за получаване на химични производни и аналози са добре известни на специалистите в областта и са описани, например, в Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, Ν. Y. 10010 U. S. A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Освен това посочените производни и аналози могат да се тестват за техния ефект, съгласно методи известни от състоянието на техниката или както е описано, например, в прилежащите примери за изпълнение. Освен това могат да се използват пептидомиметици и/или проектирани с помощта на компютър активатори или инхибитори на Т-клетьчно активиране например, съгласно долуописаните методи. Приспособени компютърни програми могат да се използват за идентифициране на сайтовете на взаимодействие на предполагаем инхибитор и на антигена от изобретението чрез компютърно търсене за комплементарни сктруктурни мотиви (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Други приспособени компютърни програми за компютьрно-подпомогнато проектиране на протеин и пептиди, се описва в предшестващото състояние на техниката, например в Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Получените резултати от горе описаните компютърни анализи могат да се използват в комбинация с метода на изобретението, например за оптимизиране на известните Т-клетьчни активатори или инхибитори. Подходящи пептидомиметици също могат да се идентифицират чрез синтеза на пептидомиметични комбинирани библиотеки чрез последователни химични модификации и тестване на получените съединения, например, съгласно описания в настоящото метод и прилежащите примери за изпълнение. Методи за генериране и използване на пептидомиметични комбинирани библиотеки са описани в предшестващото състояние на техниката, например, в Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Освен това триизмерните и/или кристалографски структури на инхибиторите или активаторите на В-клетъчни/Т-клетъчни взаимодействия могат да се използват за проектиране на пептидомиметични инхибитори или активатори на Т-клетъчно активиране, което ще бъде тествано при метода от изобретението (Rose, Biochemistry 35 (1996), 1293312944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).Compounds that can be used according to the method of the present invention include peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic compounds, ligands, peptidomimetics, PNAs and the like. These compounds may also be functional derivatives or analogues of known T-cell activators or inhibitors. Methods for the preparation of chemical derivatives and analogues are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, Ν. Y. 10010 U. S. A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. In addition, said derivatives and analogs can be tested for their effect according to methods known in the art or as described, for example, in the accompanying embodiments. In addition, peptidomimetics and / or computer-aided or T-cell activation inhibitors may be used, for example, according to the methods described below. Custom computer programs can be used to identify the interaction sites of a putative inhibitor and the antigen of the invention by computer searching for complementary structural motifs (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Other adapted computer programs for computer-aided design of proteins and peptides are described in the prior art, for example, in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. The results obtained from the above-described computer analyzes can be used in combination with the method of the invention, for example to optimize known T-cell activators or inhibitors. Suitable peptidomimetics can also be identified by the synthesis of peptidomimetic combination libraries by successive chemical modifications and testing of the compounds obtained, for example, according to the method described herein and related embodiments. Methods for generating and using peptidomimetic combination libraries have been described in the prior art, for example, in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. In addition, three-dimensional and / or crystallographic structures of B cell / T cell interaction inhibitors or activators can be used to design peptidomimetic T cell activation inhibitors or activators to be tested in the method of the invention (Rose, Biochemistry 35 (1996), 1293312944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Най-общо, изобретението предоставя методи за идентифициране на съединения, които са способни да модулират В-клетьчен/Т-клетъчен имунен отговор.In general, the invention provides methods for identifying compounds that are capable of modulating the B-cell / T-cell immune response.
Съединения, за които е открито, че активират В-клетъчно/Т-клетьчно медииран отговор, могат да се използват за лечение на рак и сродните заболявания. Освен това може да е възможно специфично да се инхибират вирусни заболявания, като по този начин се предотвратява вирусна инфекция и нейното разпространение. Съединенията, които са идентифицирани като супресори на Т-клетъчното активиране или стимулиране, могат да се използват при трансплантирането на органи, за да се избегне отхвърлянето на трансплантата; виж по-горе.Compounds found to activate the B cell / T cell mediated response can be used to treat cancer and related diseases. In addition, it may be possible to specifically inhibit viral diseases, thereby preventing viral infection and its spread. Compounds identified as suppressors of T-cell activation or stimulation may be used in organ transplantation to avoid transplant rejection; look above.
Съединенията идентифицирани или получени съгласно метода на настоящото изобретение се очаква да са много полезни при диагностиката, и по-специално за терапевтично приложение. След като при един друг вариант за изпълнение изобретението се отнася до метод за продуциране на фармацевтичен състав, включващ привеждане на идентифицираното съединение от етап (б) във фармацевтична форма, на горе описаните методи на изобретението, във фармацевтично приемлива форма. Освен това се има предвид, че посоченият компонент може да бъде модифициран от пептидомиметици. Методи за генериране и използване на пептидомиметични комбинаторни библиотеки са известни от състоянието на техниката, например, Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210-234, Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213-216, or al-Obeidi, Mol. Biotech. 9 (1998), 205-223.Compounds identified or prepared according to the method of the present invention are expected to be very useful in diagnosis, and in particular for therapeutic use. In yet another embodiment, the invention relates to a method of producing a pharmaceutical composition comprising converting the identified compound of step (b) into pharmaceutical form to the methods of the invention described above in a pharmaceutically acceptable form. It is further appreciated that said component can be modified by peptidomimetics. Methods for generating and using peptidomimetic combinatorial libraries are known in the art, for example, Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 210-234, Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213-216, or al-Obeidi, Mol. Biotech. 9 (1998), 205-223.
Терапевтично полезните съединения, идентифицирани съгласно метода на изобретението могат да се прилагат на пациент по който и да е подходящ метод за конкретното съединение, например, орално, интравенозно, парантерално, трансдермално, трансмукозно или хирургично или чрез имплантиране (например, като съединението е под формата на твърд или полутвърд биологично съвместим и резорбционен матрикс) в или близо до мястото, където се желае ефектът на съединението. Терапевтичните дози е подходящо да се определят от специалиста в областта, виж по-горе.The therapeutically useful compounds identified according to the method of the invention may be administered to a patient by any suitable method for the particular compound, e.g., orally, intravenously, parenterally, transdermally, transmucosally or surgically or by implantation (e.g., as the compound is in the form solid or semi-solid biocompatible and resorptive matrix) at or near the point where the effect of the compound is desired. The therapeutic doses are suitably determined by one of ordinary skill in the art, see above.
Допълнително, настоящото изобретение предоставя метод за лечение на В-клетични злокачествени заболявания, В-клетьчно медиирани автоимунни заболявания или изтощаване на Вклетките и/или метод за отлагане на патологично състояние, причинено от B-клетъчни нарушения, включващ въвеждане на полипептида, полинуклеотида или вектора на изобретението в клетка на бозайник, засегната от посочените злокачествени заболявания и/или патологично състояние. Предпочита се освен това, посоченият бозайник да е човек.Additionally, the present invention provides a method of treating B-cell malignancies, B-cell-mediated autoimmune diseases or depletion of the Cells and / or a method for delaying a pathological condition caused by B-cell disorders, comprising administering a polypeptide, polynucleotide or vector of the invention in a mammalian cell affected by said malignancies and / or pathological condition. It is also preferred that said mammal be a human.
Тези и други варианти за изпълнение на изобретението са описани и включени в описанието и примерите за изпълнение на настоящото изобретение. Друга литература, отнасяща се до което и да е от антителата, методите, използването и съединенията, използвани съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат открити в обществените библиотеки и бази данни, при използване например, на електронни устройства. Например може да се използва обществената база данни “Medline”, която е на разположение чрез интернет с адрес http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PubMed/medline.html. Други бази данни и адреси като http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. http:// www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/ research tools.html. http://www.tigr.org/, са известни на специалистите в областта и също могат да се получат при използване, например, на http://www.lycos.com. Преглед на патентната информация в биотехнологиите и оценка на релевантните източници, полезни за ретроспективно търсене и за текущо осведомяване са предоставени от Berks, TIBTECH 12(1994), 352-364.These and other embodiments are described and included in the description and embodiments of the present invention. Other literature relating to any of the antibodies, methods, uses and compounds used according to the present invention can be found in public libraries and databases, using, for example, electronic devices. For example, the public Medline database, available online at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PubMed / medline.html, may be used. Other databases and addresses such as http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. http: // www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/ research tools.html. http://www.tigr.org/ are known to those of skill in the art and can also be obtained by using, for example, http://www.lycos.com. A review of patent information in biotechnology and an evaluation of relevant sources useful for retrospective search and up-to-date information are provided by Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Описание на приложените фигуриDescription of the attached figures
Фигура 1. SDS-PAGE: Coomassie оцветяване на пречистения bscCD19xCD3 фрагмент с различни количества протеин. Молекулярната маса (kDa) на маркера е посочена от лявата страна;Figure 1. SDS-PAGE: Coomassie staining of the purified bscCD19xCD3 fragment with different amounts of protein. The molecular weight (kDa) of the marker is indicated on the left;
Фигура 2. FACS-анализ с bscCD19xCD3 (200 micro g/ml) върху различни CD19-no3Hтивни В-клетьчни линии (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), върху СО19-негативни В-клетъчна линия BL60 и върху СОЗ-позитивни Jurkat клетки и първични човешки PBMCs. Разрушените линии са индикация за негативни контроли;Figure 2. FACS analysis with bscCD19xCD3 (200 micro g / ml) on various CD19-No3Hive B-cell lines (BJAB, SKW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), on CD19-negative B-cell line BL60 and on CD3-positive Jurkat cells and primary human PBMCs. Dashed lines are an indication of negative controls;
Фигура 3. Цитотоксичност на bscCD 19xCD3 при изследване за освобождаването на 51Сг с нестимулирани човешки PBMCs и различни В-клетъчни линии. Ефектор: Съотношение на клетки мишени 10:1; време за инкубиране 4 h. Стандартно отклонение при всички проведени в три повторения опити 7%;Figure 3. Cytotoxicity of bscCD 19xCD3 in a 51 Cr release assay with unstimulated human PBMCs and various B cell lines. Effector: Target cell ratio 10: 1; incubation time 4 h. Standard deviation for all 7% attempts at 3 replicates;
Фигура 4. Изследване за цитотоксичност при освобождаването на хром с нестимулирани на първични човешки PBLs срещу плазмацитомни клетъчни линии L363 и NC1 и лимфонна клетъчна линия Daudi Е:Т съотношение 20:1; време за инкубиране 8 h;Figure 4. Cytotoxicity assay for chromium release with unstimulated primary human PBLs against plasmacytoma cell lines L363 and NC1 and Daudi E: T ratio 20: 1 ratio; incubation time 8 h;
Фигура 5. Инхибиране на цитотоксичността на bscCD 19xCD3 чрез родителското антиCD 19 антитяло HD37 изследване за освобожда ването на хром; време за инкубиране 8 h; Е:Т съотношение 20:1; концентрация на bscCD19xCD3 1 ng/ml;Figure 5. Inhibition of cytotoxicity of bscCD 19xCD3 by parental antiCD 19 antibody HD37 assay for chromium release; incubation time 8 h; E: T ratio 20: 1; concentration of bscCD19xCD3 1 ng / ml;
Фигура 6. Изследване за цитотоксичност с нестимулирани PBMCs срещу Daudi клетки, след прибавяне на нарастващи количества EGTA, Е:Т съотношение 10:1, време за инкубиране 4 h;Figure 6. Cytotoxicity assay with unstimulated PBMCs against Daudi cells after addition of increasing amounts of EGTA, E: T ratio 10: 1, incubation time 4 h;
Фигура 7. Цитотоксичност на bscCD19xCD3 при изследване за освобождаването на 51Сг с нестимулирани човешки PBMCs и Blin-Ι като клетки мишени при различни Е:Т съотношения; време за инкубиране 4 h; концентрация на конвенционално биспецифично антитяло 3 micro g/ml; концентрация Habsc 17-lAxCD3 100 ng/ml; E:T съотношения както са посочени;Figure 7. Cytotoxicity of bscCD19xCD3 in a 51 Cr release assay with unstimulated human PBMCs and Blin-Ι as target cells at different E: T ratios; incubation time 4 h; concentration of conventional bispecific antibody 3 micro g / ml; Habsc 17-lAxCD3 concentration 100 ng / ml; E: T ratios as indicated;
Фигура 8. ДНК- и протеинова последователност на bscCD19xCD3 антитяло (вариант съдържащ FLAG-tag). Цифрите сочат нуклеотидните (nt) позиции, съответните аминокиселини са посочени след нуклеотидната последователност. Кодиращата ДНК последователност за биспецифичното антитяло започва в позиция 1 и завършва в позиция 1593. Първите шест nt (позиции -10 до -5) и последните шест nt (позиции 1596 до 1601) съдържат сайтовете за разцепване на рестрикционните ензими EcoRI и Sail, съответно. Нуклеотиди от 1 до 57 уточняват лидерната последователност; нуклеотиди 82 до 414 и 460 до 831 кодират VLCD19 и VHCD19, съответно; нуклеотиди 847 до 1203 и 1258 до 1575 кодират VHCD3 и VLCD3, съответно; и нуклеотиди 1576 до 1593 кодират His-tag.Figure 8. DNA and protein sequence of a bscCD19xCD3 antibody (variant containing FLAG tag). The numbers indicate the nucleotide (nt) positions, the corresponding amino acids are indicated after the nucleotide sequence. The DNA encoding sequence for the bispecific antibody begins at position 1 and ends at position 1593. The first six nt (positions -10 to -5) and the last six nt (positions 1596 to 1601) contain the EcoRI and Sail restriction enzyme cleavage sites, respectively. Nucleotides 1 to 57 specify the leader sequence; nucleotides 82 to 414 and 460 to 831 encode V L CD19 and V H CD19, respectively; nucleotides 847 to 1203 and 1258 to 1575 encode V H CD3 and V L CD3, respectively; and nucleotides 1576 to 1593 encode His-tag.
Фигура 9. Изтощаване на първичните (злокачествени) CD19+ В-клетки чрез събиране на автоложни първични Т-лимфоцити посредством bscCD 19xCD3.Figure 9. Depletion of primary (malignant) CD19 + B cells by collection of autologous primary T lymphocytes by bscCD 19xCD3.
А) Начало (t = 0): η = 3 χ 106 PBL/ямка се посяват в 24-ямкови блюда за тькънно култивиране в обем от 1 ml RPMI 1640 среда всяка, с добавяне на 10% FCS към всяка. Първоначалното процентно съдържание на CD19+ В-клетки, както и това на CD4+- и CD8+ Т-клетки е посочено.A) Start (t = 0): η = 3 χ 10 6 PBL / well were seeded in 24 well tissue culture dishes in a volume of 1 ml RPMI 1640 medium each, with 10% FCS added to each. The initial percentage of CD19 + B cells as well as that of CD4 + - and CD8 + T cells is indicated.
В-G) Относително преброяване на В- и CD4+- и CD8+ Т-клетки след t ~ 5 дни инкубиране при 37°С/5% СО2 в отсъствие на (В-С) или в присъствие (D-G) на bscCD 19xCD3 (концентрации както са посочени) с или без 60 U/ml IL-2. Негативни контроли, съдържащи или биспецифично едноверижно антитяло (17-1 AxCD3) с не ясна клетъчна специфичност на мишената, или без биспецифично антитяло въобще (С).B-G) Relative counting of B- and CD4 + - and CD8 + T-cells after t ~ 5 days incubation at 37 ° C / 5% CO 2 in the absence of (B-C) or in the presence (DG) of bscCD 19xCD3 (concentrations as indicated) with or without 60 U / ml IL-2. Negative controls containing either a bispecific single-stranded antibody (17-1 AxCD3) with no clear cell specificity for the target or no bispecific antibody at all (C).
Фигура 10. Етапи на пречистване за bscCD 19xCD3;Figure 10. Purification steps for bscCD 19xCD3;
Фигура 11. Показан е SDS-PAGE анализ за чистотата на bscCD 19xCD3. Оцветен с колоидален Coomassie-blue SDS 4-12% градиент на полиакриламиден гел. Ивици 1 и 6, маркери за размер на молекулата; ивица 2, супернатанта от клетъчна култура; ивица 3, активна фракция от катионообменна хроматография; ивица 4; активни фракции на афинитетна хроматография с кобалтов хелат; ивица 5, активна фракция от гел филтрация. Равни количества протеин (2 micro g) от супернатантата на клетъчната култура и различните колонни фракции се анализират. Размерът в kDa на стандартите за молекулно тегло е посочен от дясната страна. Стрелката показва позицията на bscCD 19xCD3;Figure 11. SDS-PAGE analysis for the purity of bscCD 19xCD3 is shown. Colored Coomassie-blue SDS 4-12% polyacrylamide gel gradient. Lanes 1 and 6, molecule size markers; lane 2, cell culture supernatant; lane 3, active fraction of cation exchange chromatography; lane 4; active fractions of cobalt chelate affinity chromatography; lane 5, active gel filtration fraction. Equal amounts of protein (2 micro g) of cell culture supernatant and different column fractions were analyzed. The size in kDa of molecular weight standards is indicated on the right. The arrow indicates the position of bscCD 19xCD3;
Фигура 12. Катионнообменна хроматография на bscCDl 9xCD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Профилът на етапа на градиент на NaCl е показан чрез непрекъсната права линия (%В, дясно) и събраните фракции са посочени чрез начупени линии. BscCD 19xCD3 се определят във фракция F6;Figure 12. Cation exchange chromatography on bscCD1 9xCD3. Protein concentration was measured by absorption at 280 nm (mAU, left). The protein elution profile is shown in a continuous line. The NaCl gradient step profile is shown by a continuous straight line (% B, right) and the fractions collected are indicated by broken lines. BscCD 19xCD3 were determined in fraction F6;
Фигура 13. Афинитетна хроматография с кобалтов хелат на bscCD 19xCD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Имидазоловия градиент е показан чрез непрекъсната права линия (%В, дясно) и събраните фракции са посочени чрез начупена непрекъсната линия. BscCD19xCD3 се открива във фракция F7;Figure 13. Affinity chromatography with bscCD 19xCD3 cobalt chelate. Protein concentration was measured by absorption at 280 nm (mAU, left). The protein elution profile is shown in a continuous line. The imidazole gradient is indicated by a continuous straight line (% B, right) and the collected fractions are indicated by a broken continuous line. BscCD19xCD3 was detected in fraction F7;
Фигура 14. Гел филтрация на антиCD19xaHTH-CD3. Концентрацията на протеин се измерва чрез абсорбция на 280 nm (mAU, ляво). Профилът на елюиране на протеина е показан с непрекъсната линия. Начупените линии сочат събраните фракции. BscCDl9xCD3 се открива във фракции F7 съответстваща на молекулярен размер от приблизително 60 kDa;Figure 14. Gel filtration of antiCD19xaHTH-CD3. Protein concentration was measured by absorption at 280 nm (mAU, left). The protein elution profile is shown in a continuous line. The broken lines indicate the fractions collected. BscCDl9xCD3 is detected in F7 fractions corresponding to a molecular size of approximately 60 kDa;
Фигура 15. Кръвни нива на гама-глутамил трансфераза (GGT) в отговор на лечение с bscCD 19xCD3. GGT нива се определят чрез стандартен клиничен биохимичен метод и се изразяват като единица/I. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство.Figure 15. Blood levels of gamma-glutamyl transferase (GGT) in response to treatment with bscCD 19xCD3. GGT levels are determined by a standard clinical biochemical method and expressed as unit / I. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. The arrows indicate the time at which the drug is administered.
Фигура 16. Ултразвукови измервания от далак на пациент А-В.Figure 16. Ultrasound measurements from the spleen of patient AB.
А: Определяне на размера на далака на 12 април 1999, преди терапия cbscCD19xCD3. Фигурата показва уголемен далак (размер 146 mm х 69,2 mm), което се дължи на инфилтрация на злокачествени В клетки.A: Determination of spleen size on April 12, 1999, prior to cbscCD19xCD3 therapy. The figure shows an enlarged spleen (size 146 mm x 69.2 mm) due to infiltration of malignant B cells.
В: Определяне на размера на далака на 16 април, 1999 след третиране с 3 micro g на 14 април, следвано от 10 micro g на 15 април. Снимката показва свиване на далака до размер 132 mm х 58,9 mm, причинено от системно третиране с bscCD 19xCD3. Несъответствията на единичните измерения на стойностите на размера, посочени в Таблица 1 се обясняват чрез различните пространствени планове при определянето на размера на органа чрез ултразвук. Двете измерения са белязани с (+) и (х);C: Determination of spleen size on April 16, 1999 after treatment with 3 micro g on April 14, followed by 10 micro g on April 15. The photograph shows a shrinkage of the spleen to a size of 132 mm x 58.9 mm caused by systemic treatment with bscCD 19xCD3. The discrepancies between the unit dimensions of the size values given in Table 1 are explained by the different spatial plans in determining the size of the organ by ultrasound. Both dimensions are marked with (+) and (x);
Фигура 17. Преброяване на броя на левкоцитите в кръвта в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Броят на левкоцитите е даден в гига части/литьр. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;Figure 17. Enumeration of leukocytes in the blood in response to treatment with bscCD 19xCD3. The leukocyte count is given in gigas / liter. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. Arrows indicate the time at which the drug is administered;
Фигура 18. Кръвни нива на С-реактивен протеин (CRP) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на CRP се определят чрез стандартен клиничен биохимичен метод и се изразяват като mg/dl. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;Figure 18. Blood levels of C-reactive protein (CRP) in response to treatment with bscCD 19xCD3. CRP levels were determined by a standard clinical biochemical method and expressed as mg / dl. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. Arrows indicate the time at which the drug is administered;
Фигура 19. Кръвни нива на тумор некрозис фактор-алфа (TNF) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на TNF се определят чрез ELISA и се изразяват с ng/ml. Оста за вре мето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;Figure 19. Blood levels of tumor necrosis factor-alpha (TNF) in response to treatment with bscCD 19xCD3. TNF levels were determined by ELISA and expressed in ng / ml. The time axis shows days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following individual drug addition. Arrows indicate the time at which the drug is administered;
Фигура 20. Кръвни нива на интерлевкин6 (IL-6) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-6 се определят чрез ELISA и се изразяват с pg/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;Figure 20. Blood levels of interleukin6 (IL-6) in response to treatment with bscCD 19xCD3. IL-6 levels were determined by ELISA and expressed in pg / ml. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. Arrows indicate the time at which the drug is administered;
Фигура 21. Кръвни нива на интерлевкин8 (IL-8) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-8 се определят чрез ELISA и се изразяват с pg/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство;Figure 21. Blood levels of interleukin8 (IL-8) in response to treatment with bscCD 19xCD3. IL-8 levels were determined by ELISA and expressed in pg / ml. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. Arrows indicate the time at which the drug is administered;
Фигура 22. Кръвни нива на разтворим интерлевкин-2 рецептор алфа верига (IL-2R) в отговор на третиране с bscCD 19xCD3. Нивата на IL-2R се определят чрез ELISA и се изразяват в единици/ml. Оста за времето показва дни (d) след започването на първото приложение на лекарственото средство като започва от нула, часове (h) следващи индивидуално добавяне на лекарствено средство. Стрелките сочат времето, в което се прилага лекарственото средство.Figure 22. Blood levels of soluble interleukin-2 receptor alpha chain (IL-2R) in response to treatment with bscCD 19xCD3. IL-2R levels were determined by ELISA and expressed in units / ml. The time axis shows the days (d) after the first administration of the drug begins, starting from zero, hours (h) following the individual drug addition. The arrows indicate the time at which the drug is administered.
Изобретението е описано с помощта на следните биологични примери, които са илюстративни и не ограничават обхвата му.The invention is described using the following biological examples, which are illustrative and do not limit its scope.
Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention
Пример 1. Клониране на вариабилни (V) имуноглоболинови домениExample 1. Cloning of variable (V) immunoglobulin domains
Домени на V лека верига (VL) и V тежка верига (VH) от HD37 хибридома [22] се клонират съгласно стандартни PCR методи [23]. Синтез на сДНК се осъществява с олиго dT праймери и Taq полимераза.Domains of V light chain (VL) and V heavy chain (VH) of HD37 hybridomas [22] are cloned according to standard PCR methods [23]. CDNA synthesis was carried out with oligo dT primers and Taq polymerase.
Списък на праймеритеList of primers
5’Ll:5'Ll:
GAAGCACGCGTAGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA [SEQ ID NO: 1 ]GAAGCACGCGTAGATATCKTGMTSACCCAAWCTCCA [SEQ ID NO: 1]
3’K:3'K:
GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [SEQ ID N0:2]GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC [SEQ ID NO: 2]
5Ή1:5Ή1:
CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAGSAG [SEQ ID NO: 3]CAGCCGGCCATGGCGCAGGTSCAGCTGCAGSAG [SEQ ID NO: 3]
3’G:3'G:
ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT [SEQ ID NO: 4] 5’VLB5RRV:ACCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT [SEQ ID NO: 4] 5'VLB5RRV:
AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA [SEQ ID NO: 5]AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA [SEQ ID NO: 5]
3’VLGS15:3'VLGS15:
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC [SEQ ID NO: 6] 5’VHGS15:GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC [SEQ ID NO: 6] 5′VHGS15:
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG [SEQ ID N0:7]GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG [SEQ ID NO: 7]
3’VHBspEl:3'VHBspEl:
AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTIGGCCCCAG[SEQ ID NO: 8]AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTIGGCCCCAG [SEQ ID NO: 8]
За амплифицирането на V домените чрез PCR се използват праймери 5’Ll и 3’К, ограничаващи VL домена, и5’Н1 иЗ’Оза тежката верига основаваща се на праймери, описани от Dubel et al. [24].For the amplification of V domains by PCR, primers 5'L1 and 3'K limiting the V L domain, and 5'H1 and 3'O for the heavy chain based on primers described by Dubel et al. [24].
сДНК на анти-СОЗ scFv фрагмент любезно бе предоставена от A. Traunecker [25].The cDNA of the anti-POP scFv fragment was kindly provided by A. Traunecker [25].
Пример 2. Конструиране на биспецифични едноверижни фрагменти и експресия в еукариотиExample 2. Construction of bispecific single-stranded fragments and expression in eukaryotes
За получаване на анти-СО19 scFv-фрагмент, съответните VL- и VH-области, клонирани в отделни плазмидни вектори служат като матрици за VL- и VH-специфичен PCR, при използване на двойки олигонуклеотидни праймери 5’VLB5RRV/3’VLGS15 и 5’VHGS15/3’VHBspEI, съответно. По този начин припокриващите се комплементарни последователности се въвеждат в PCR-продуктите, които се комбинират, за да образуват кодиращата последователност от 15 аминокиселини (Gly4Serj)3-BHHKep по време на последващото сливане-PCR. Този етап на амплифициране се осъществява с праймерната двойка 5’VLB5RRV/3’VHBspEI и полученият слят продукт (или по-точно анти-СО19 scFv-фрагмент) се разцепва с рестрикционни ензими EcoRV и BspEI, като по този начин се клонира в KS-вектор (Stratagene) съдържащ или (EcoRI/Sall-кло ниран) кодираща последователност на анти-171 А/анти-СИЗ биспецифично едноверижно антитяло с N-терминален FLAG-tag [1] или този на модифицираната версия без FLAG/епитоп (21), като по този начин замества анти-17-1 А- с антиС019-специфичност и предпазване на 5-аминокиселинен (О^БегД-линкер свързващ С-терминалния анти-СОЗ scFv-фрагмент, съответно. След това, ДНК фрагментът; кодиращ двете версии на анти-CDl 9/анти-СОЗ биспецифичното едноверижно антитяло с подредбата на домени VLcDis-VHcDis-VHcoj-VLcDaсе субклонира EcoRI/ Sall в описания експресионен вектор pEF-DHRF [1], съответно. Получените плазмидни ДНК се трансфектират в СНО-клетки с дефицит на DHFRклетки чрез електропорация: Селекцията, генната амплификация и продуцирането на протеин се осъществяват както е описано [1]. В следващите примери са илюстрирани получените резултати с FLAG-съдьржащата версия на bscCD19xCD3.For the preparation of the anti-CD19 scFv fragment, the respective VL- and VH-regions cloned into individual plasmid vectors serve as matrices for VL- and VH-specific PCR using pairs of oligonucleotide primers 5'VLB5RRV / 3'VLGS15 and 5 'VHGS15 / 3'VHBspEI, respectively. In this way, overlapping complementary sequences are introduced into the PCR products, which combine to form the coding sequence of 15 amino acids (Gly 4 Serj) 3- BHHKep during subsequent fusion-PCR. This amplification step is carried out with the primer pair 5'VLB5RRV / 3'VHBspEI and the resulting fusion product (or more specifically the anti-CD19 scFv fragment) is cleaved by EcoRV and BspEI restriction enzymes, thereby cloning into KS- a vector (Stratagene) containing either an (EcoRI / Sall-cloned) coding sequence of an anti-171 A / anti-CIZ bispecific single-stranded antibody with an N-terminal FLAG tag [1] or that of the modified version without FLAG / epitope (21) , thereby replacing anti-17-1 A- with antiC019 specificity and protecting the 5-amino acid (O ^ BegD-linker linking the C-terminal α I-SSZ scFv-fragment, respectively. Then, a DNA fragment, encoding both versions of the anti-CDl 9 / anti-SSZ bispecific single chain antibody with the arrangement of the domains VLcDis-VHcDis-VHcoj-VLcDa subcloned EcoRI / Sall into the described expression vector pEF-DHRF [1], respectively, The resulting plasmid DNAs were transfected into CHF-deficient DHFR cells by electroporation: Selection, gene amplification and protein production were performed as described [1]. The following examples illustrate the results obtained with the FLAG-containing version of bscCD19xCD3.
Пречистване на bscCD19xCD3 от супернатантата на трансфектирани СНО клетки дава добив 4 mg/Ι културална супернатанта. bsc-Ab се пречиства чрез неговата С-терминална хистидинова опашка чрез афинитетна хроматография върху Ni-NTA-колона както е описано [1]. bsc-Ab се елюира от Ni-NTA колоната като отделен пик при концентрация от 200 тМ имидазол.Purification of bscCD19xCD3 from the supernatant of transfected CHO cells yields 4 mg / Ι culture supernatant. bsc-Ab was purified by its C-terminal histidine tail by affinity chromatography on a Ni-NTA column as described [1]. bsc-Ab was eluted from the Ni-NTA column as a separate peak at a concentration of 200 mM imidazole.
SDS-Page се провежда съгласно Laemmli [26] с 12% гел следвано от оцветяване с Coomassie brilliant blue R250 за анализиране на пречистването на bsc-Ab. Резултатите от SDS-PAGE анализа (Фиг. 1) показват очаквания размер на bscAb (60 kDa).SDS-Page was performed according to Laemmli [26] with a 12% gel followed by Coomassie brilliant blue R250 staining to analyze the purification of bsc-Ab. The results of the SDS-PAGE analysis (Fig. 1) show the expected size of bscAb (60 kDa).
Пример 3. Свързващи свойства на bscAbCD19xCD3Example 3. Binding properties of bscAbCD19xCD3
Свързващите свойства на bsc-Ab към CD3 и CD 19 са показани чрез поточен цитометричен анализ върху CD3-позитивни Jurkat клетки, човешки PBMCs и известен брой различни клетъчни линии наСО19-позитивни В клетъчна лимфома, включително Blin I, SKW6.4,Daudi, В JAB and Raji. С019-позитивни В клетъчни линии Daudi, Raji, В JAB (лимфома на Burkitt), SKW6.4 (човешки EBV трансформирани В клетки) и Blin1 (pre В клетъчна линия) се използват при поточен цитометричен анализ и изследване за освобождаване на хром. Jurkat е СОЗ-позитивна Т клетъчна линия; BL60 и плазмоцитомни клетъчни линии NC1 и L363 са негативни за двете повърхностни молекули, CD3 и CD 19. Клетъчните линии се култивират в пълна RPMI 1640 (Biochrom) среда с 10% FCS (GIBCO).The binding properties of bsc-Ab to CD3 and CD 19 are shown by flow cytometric analysis of CD3-positive Jurkat cells, human PBMCs and a number of different cell lines of CD19-positive B cell lymphoma, including Blin I, SKW6.4, Daudi, B JAB and Raji. C019-positive B cells of Daudi, Raji, B JAB (Burkitt lymphoma), SKW6.4 (human EBV transformed B cells) and Blin1 (pre B cell line) were used in flow cytometric analysis and chromium release assay. Jurkat is a CD3-positive T cell line; BL60 and plasmacytoma cell lines NC1 and L363 are negative for both surface molecules, CD3 and CD 19. The cell lines are cultured in complete RPMI 1640 (Biochrom) medium with 10% FCS (GIBCO).
χ 106 клетки се промиват с PBS, ресуспендират се в 200 micro 1 PBS с 10 % Vemimmun (Centeon, Marburg, Germany) и 0,1 % NaN3 и се инкубират 30 min при 4°С. След етапа на центрофугиране (100 х g, 5 min) клетките се инкубират в 50 micro 1 bscCD19xCD3 (200 micro g/ ml в PBS c 10 % Venimmun и 0,1 % NaN3) за 30 min при 4°C. Клетките се промиват двукратно с PBS. За откриването на bsc-Ab се използва FITC-конюгирано антитяло срещу His-tag (Dianova). Ирелевантните bsc-Ab 17-lAxCD3, получени от същата експресионна система като bscCD19xCD3, или His-tag антитялото самостоятелно, служат като негативни контроли. Поточната цитометрия се провежда с Becton Dickinson FACScan. Не се установява свързване върху BL60, които не експресират нито CD 19 нито CD3 (Фиг. 2).χ 10 6 cells were washed with PBS, resuspended in 200 micro 1 PBS with 10% Vemimmun (Centeon, Marburg, Germany) and 0.1% NaN 3 and incubated for 30 min at 4 ° C. After the centrifugation step (100 x g, 5 min), the cells were incubated in 50 micro 1 bscCD19xCD3 (200 micro g / ml in PBS with 10% Venimmun and 0.1% NaN 3 ) for 30 min at 4 ° C. The cells were washed twice with PBS. A FITC-conjugated His-tag antibody (Dianova) was used to detect bsc-Ab. Irrelevant bsc-Ab 17-lAxCD3, obtained from the same expression system as bscCD19xCD3, or the His-tag antibody alone, serve as negative controls. Flow cytometry was performed with a Becton Dickinson FACScan. No binding was found on BL60s that did not express either CD 19 or CD3 (Fig. 2).
Пример 4. Цитотоксична активност на bscAbCD19xCD3 срещу С019-позитивни лимфомни клеткиExample 4. Cytotoxic activity of bscAbCD19xCD3 against C019-positive lymphoma cells
За bscCD19xCD3 антитялото е доказано, че е силно цитотоксично за няколко лимфомни клетъчни линии при изследване за освобождаване на 51Сг (Фигура 3). От прясна коричка на рана се изолират мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв (PBMCs) като ефекторни клетки от произволни донори при използване на Lymphoprep™ (Nycomed) градиентно центрофугиране при 100 х g етапи на центрофугиране за отстраняване натромбоцитите. С019-позитивни В клетки се изтощават при използване на Dynabeads® М-450 CD19 (Dynal). Изтощените клетъчни популации се анализират чрез поточна цитометрия (Becton Dickinson), която показва 99% изтощаване на СО19-позитивни клетки. PBMCs се инкубират през цялата нощ при 37°С, 5% СО2 С019-позитивни В клетъчни линии (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4) се използват като клетки мишени.The bscCD19xCD3 antibody was shown to be highly cytotoxic to several lymphoma cell lines in a 51 Cr release assay (Figure 3). Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from fresh wound skin as effector cells from arbitrary donors using Lymphoprep ™ (Nycomed) gradient centrifugation at 100 x g centrifugation steps to remove platelets. C019-positive B cells were depleted using Dynabeads® M-450 CD19 (Dynal). Depleted cell populations were analyzed by flow cytometry (Becton Dickinson) showing 99% depletion of CD19-positive cells. PBMCs were incubated overnight at 37 ° C, 5% CO 2 CO-positive B cell lines (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, SKW6.4) were used as target cells.
Цитотоксичността се измерва при стандартно изследване за освобождаване на хром в облодънни 96-ямкови блюда (Nunc) при използване на RPMI 1640 пълна среда (Biochrom) с 10% FCS (GIBCO).Cytotoxicity was measured in a standard chromium release assay in fertilized 96-well plates (Nunc) using RPMI 1640 complete medium (Biochrom) with 10% FCS (GIBCO).
Нестимулирани PBMCs се прибавят в количества от 80 microl среда към всяка ямка, съдържаща 20 micro 1 bsc-Ab в различни концентрации. След това се прибавят 100 micro 1 от 51Сгбелязани клетки мишени (1 χ 104), блюдата се центрофугират 3 min при 100 х g и се инкубират 4 h при 37°С, 5 % СО2. След допълнителен етап на центрофугиране се отстраняват 50 micro 1 супернатанта и се изследват за освобождаване на 51Сг в гама брояч (TopCount, Canberra Packard).Unstimulated PBMCs were added in amounts of 80 microl medium to each well containing 20 micro 1 bsc-Ab at various concentrations. Then, 100 micro 1 of 51 Target cells (1 × 10 4 ) were added, the plates were centrifuged for 3 min at 100 x g and incubated for 4 h at 37 ° C, 5% CO 2 . After an additional spin step, 50 micro 1 supernatants were removed and examined for the release of 51 Cr in a gamma counter (TopCount, Canberra Packard).
Спонтанното освобождаване се измерва при инкубиране на клетките мишени без ефекторни клетки или антитела, като максимално освобождаване се определя при инкубиране на клетките мишени с 10 % TritonX-100. Инкубирането на клетките мишени с bscAb без ефекторни клетки не води до лизис, който може да се измери. Процентът специфичен лизис се изчислява с неспецифичното освобождаване в (%)=[(срт, експериментално освобождаване) (срт, спонтанно освобождаване)] / [(срт, максимално освобождаване) - (срт, спонтанно освобождаване)] х 100. Всички тестове се провеждат в трикратно повторение. SD при трикратните повторения за всички експерименти е под 6%. За наподобяване на in vivo условията, се използват нестимулирани PBMCs от здрави донори като ефекторни клетки. Може да се наблюдава бързото индуциране на цитотоксичността до 4 h без какъвто и да е протокол за предварително сти мулиране на Т-клетките. Като контрола bsc-антитяло е различна туморна специфичност (bsc 171AxCD3), но генерирано чрез същата система, като bscCD19xCD3 антитялото, показва лизисна активност незначително над средния фон. Освен това, не може да се наблюдава цитотоксична активност при използване на плазмоцитомна клетъчна линия NC1 и L363, които не експресират CD19 като клетки мишени (Фигура 4). При компетитивни изследвания с нарастващи количества С019-специфично родителско моноклонално антитяло HD37, цитотоксичната активност на bscCD19xCD3 може почти напълно да се блокира (Фигура 5). Тези контроли показват, че bscCD 19хСОЗ-медиираните цитотоксични ефекти са антиген специфични. За да се получи повече информация за молекулярните механизми, как bscCD19xCD3 антитялото убива CD 19позитивните клетки мишени, бе проведен опит да се блокира bscCD 19хСОЗ-медиираната цитотоксичност чрез EGTA. Както е показано на Фигура 6, цитотоксичната активност на bscCD 19xCD3 може напълно да се блокира с EGTA, което означава, че специфичният лизис е по-скоро Т-клетъчно медииран ефект (най-вероятно чрез перфориновия синтетичен път), отколкото директен ефект (например, индуциращ апоптозис) на самото антитяло.Spontaneous release was measured by incubation of target cells without effector cells or antibodies, with maximum release determined by incubation of target cells with 10% TritonX-100. Incubation of target cells with bscAb without effector cells does not result in measurable lysis. The percentage specific lysis was calculated by nonspecific release in (%) = [(cpm, experimental release) (cpm, spontaneous release)] / [(cpm, maximal release) - (cpm, spontaneous release)] x 100. All tests were performed in triplicate. The SD at triplicate for all experiments was below 6%. To mimic in vivo conditions, unstimulated PBMCs from healthy donors are used as effector cells. Rapid induction of cytotoxicity can be observed for up to 4 h without any protocol for pre-stimulation of T cells. As a control, the bsc-antibody has different tumor specificity (bsc 171AxCD3), but generated through the same system as the bscCD19xCD3 antibody exhibits lysis activity slightly above the mean background. Furthermore, no cytotoxic activity could be observed using plasmacytoma cell line NC1 and L363, which did not express CD19 as target cells (Figure 4). In competitive studies with increasing amounts of C019-specific parent monoclonal antibody HD37, the cytotoxic activity of bscCD19xCD3 could be almost completely blocked (Figure 5). These controls indicate that the bscCD 19xCO3-mediated cytotoxic effects are antigen specific. To obtain more information about the molecular mechanisms of how the bscCD19xCD3 antibody kills CD19positive target cells, an attempt was made to block bscCD 19xCO3-mediated cytotoxicity by EGTA. As shown in Figure 6, the cytotoxic activity of bscCD 19xCD3 can be completely blocked by EGTA, which means that specific lysis is more of a T-cell mediated effect (most likely via the perforin synthetic pathway) rather than a direct effect (e.g. apoptosis inducing antibody) of the antibody itself.
При използване на нестимулирани Т-клетки, даже при концентрации на антитялото под 1 ng/ml може да се наблюдава значителен цитотоксичен ефект срещу Blin-Ι клетки (Фигура 7). Даже при относително ниски Е:Т съотношения [5:1;2.5:1]ипри много високи концентрации на антитялото от 10-100 pg/ml, bscCD 19xCD3 антитялото може бързо да индуцира специфична цитотоксична активност на нестимулирани Т-клетки (Фигура 7). В противовес, конвенционално CD19xCD3 антитяло, генерирано по хибрид-хибридомна техника [5-7, 27] не показва значителна цитотоксична активност при тези условия, даже при концентрации до 3000 ng/ml (Фигура 7). Конвенционалното биспецифично антитяло се нуждае от допълнително Т-клетъчно престимулиране и от високи концентрации на антитяло от приблизително 100 ng/ml, за индуциране на специфична Т-клетьчна цитотоксичност (не е показано), което е в съгласие с литературата [5-7,27].When unstimulated T cells are used, even at antibody concentrations below 1 ng / ml, a significant cytotoxic effect against Blin-Ι cells can be observed (Figure 7). Even at relatively low E: T ratios [5: 1; 2.5: 1] and at very high antibody concentrations of 10-100 pg / ml, the bscCD 19xCD3 antibody can rapidly induce specific cytotoxic activity of unstimulated T cells (Figure 7) . In contrast, a conventional CD19xCD3 antibody generated by a hybrid hybridoma technique [5-7, 27] showed no significant cytotoxic activity under these conditions, even at concentrations up to 3000 ng / ml (Figure 7). The conventional bispecific antibody needs additional T-cell prestimulation and high antibody concentrations of approximately 100 ng / ml to induce specific T-cell cytotoxicity (not shown), which is in accordance with the literature [5-7,27 ].
Пример 5. Изтощаване на първични (злокачествени) В-клетки с автоложни Т-клетки чрез цитотоксична активност на bscCD 19xCD3Example 5. Exhaustion of primary (malignant) B cells with autologous T cells by cytotoxic activity of bscCD 19xCD3
С цел да се определи цитотоксичната активност на bscCD 19xCD3 върху първични злокачествени В-клетки, мононуклеарни клетки от периферна кръв (РВМС) на пациент, страдащ от B-CLL (В-клетъчна производна хронична лимфатична левкемия) се изолират чрез Ficoll плътностно градиентно центрофугиране. Тези клетки се култивират последователно в присъствие или отсъствие на bscCD 19xCD3 за 5 дни при 37°С/ 5% СО2 в RPMI 1640 среда допълнена с 10% FCS и, по желание, с 60 U/ml IL-2. Поточният цитометричен анализ показва, че лимфоцитите от периферната кръв (PBL) на този определен NHL (Non-Hodgkin лимфома)-пациент (който след това систематично се лекува с bscCD 19xCD3; виж пример 7) съдържат 92,6% С019-позитивни В-клетки (= клетки мишени) и 7,4% CD3-noзитивни Т-лимфоцити (= ефекторни клетки) при съотношение CD4/CD8 на Т-клетките от 2,6:4,8. По-голямата част от тези СО19-позитивни Вклетки се състои от злокачествени клетки. 3x106 PBL/ml на ямка се посяват в обем от 1 ml за всяка в 24-ямкови блюда за тъкънни култури. За негативни контроли се използва културална среда с прибавяне на IL-2 и културална среда с прибавен IL-2 с ирелевантно биспецифично едноверижно антитяло bscl7-lAxCD3 (1) при концентрация от 0,5 micro g/ml. Както е показано на Фигура 9, не се открива изтощаване на CD19-noзитивните клетки при тези условия след 5 дни инкубиране. Въпреки това, когато се добави bscCD 19xCD3 в концентрации от 0,5 micro g/ml или 0,05 micro g/ml (било то в присъствие или в отсъствие на IL-2) почти всички С019-позитивни В-клетки се убиват. Културалните клетки в този момент се състоят предимно от Т-лимфоцити с CD4/CD8 Т-клетъчно съотношение от приблизително 1:2 до 1:3. Това показва изключителната цитотоксичност на bscCD 19xCD3 към CD 19позитивни В-клетки, при положение, че тоталното изтощаване на първичните В-клетки от автоложните Т-клетки може да се индуцира от концентрации от само 50 ng/ml при крайно неблагоприятно първоначално съотношение на ефекторни клетки мишени под 1:10, даже без IL2 или друг вид допълнително Т-клетъчно стимулиране.In order to determine the cytotoxic activity of bscCD 19xCD3 on primary malignant B cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of a patient suffering from B-CLL (B cell derivative of chronic lymphatic leukemia) were isolated by Ficoll density gradient. These cells were sequentially cultured in the presence or absence of bscCD 19xCD3 for 5 days at 37 ° C / 5% CO 2 in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS and, optionally, 60 U / ml IL-2. Current cytometric analysis showed that peripheral blood (PBL) lymphocytes of this particular NHL (Non-Hodgkin lymphoma) -patient (who was then systematically treated with bscCD 19xCD3; see Example 7) contained 92.6% C019-positive B- cells (= target cells) and 7.4% CD3-positive T lymphocytes (= effector cells) at a CD4 / CD8 T-cell ratio of 2.6: 4.8. Most of these CD19-positive cells are composed of malignant cells. 3x10 6 PBL / ml per well were sown in a volume of 1 ml for each in 24-well tissue culture dishes. For negative controls, culture medium supplemented with IL-2 and culture medium supplemented with IL-2 with the irrelevant bispecific single-stranded antibody bscl7-lAxCD3 (1) at a concentration of 0.5 micro g / ml. As shown in Figure 9, no depletion of CD19-bearing cells was detected under these conditions after 5 days of incubation. However, when bscCD 19xCD3 was added at concentrations of 0.5 micro g / ml or 0.05 micro g / ml (whether in the presence or absence of IL-2) almost all C019-positive B cells were killed. The culture cells at this time consist mainly of T lymphocytes with a CD4 / CD8 T cell ratio of approximately 1: 2 to 1: 3. This demonstrates the exceptional cytotoxicity of bscCD 19xCD3 to CD 19positive B cells, provided that the total depletion of primary B cells by autologous T cells can be induced by concentrations of only 50 ng / ml at an extremely unfavorable initial effector cell ratio targets below 1:10, even without IL2 or other supplemental T-cell stimulation.
Пример 6. Пречистване на bscCD 19xCD3 за терапевтично използванеExample 6. Purification of bscCD 19xCD3 for therapeutic use
BscCD19xCD3 се получава от клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО) стабилно трансфектирани с експресионен вектор (pEFDHFR; виж пример 2) кодиращ bscCD19xCD3 и, допълнително хексахистидин и FLAG tag. Клетките се развиват в безсерумна среда (Rencyte) в кух реактор от фибростъкло (Unisyn). Пет хиляди милилитра супернатанта от клетъчната култура се събират и стерилно се филтрират презBscCD19xCD3 was obtained from Chinese hamster ovary (CHO) cells stably transfected with an expression vector (pEFDHFR; see Example 2) encoding bscCD19xCD3 and, further, hexahistidine and the FLAG tag. Cells were grown in serum-free medium (Rencyte) in a hollow fiberglass reactor (Unisyn). Five thousand milliliters of cell culture supernatants were collected and sterile filtered through
0.2 micro m филтър (AcroCap; Pall Gelman).0.2 micro m filter (AcroCap; Pall Gelman).
BscCD19xCD3 се открива и количествено се определя чрез Western blotting при използване на миши анти-FLAG IgG (Sigma) и козианти-миши IgG свързан към алкална фосфатаза (Sigma). Откриването се провежда чрез хемилуминисценция при използване на BCIP/NBT система (Devitron). Концентрациите на протеин се определят чрез изследване на Bradford (Biorad), при използване на говежди IgG (Biorad) като стандарт за протеина. Чистотата на колонните фракции се изследва чрез редуциране на натриев додецилсулфат (SDS) Bis/Tris 4-12% градиентна полиакриламидна гел електрофореза (PAGE) при използване на MOPS буферна система (Novex).BscCD19xCD3 was detected and quantified by Western blotting using murine anti-FLAG IgG (Sigma) and alkaline phosphatase (Sigma) conjugated murine IgG. Detection was performed by chemiluminescence using a BCIP / NBT system (Devitron). Protein concentrations were determined by Bradford assay (Biorad) using bovine IgG (Biorad) as a protein standard. The purity of the column fractions was examined by reducing sodium dodecyl sulfate (SDS) Bis / Tris 4-12% gradient polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using a MOPS buffer system (Novex).
Пречистването на bscCD 19xCD3 до хомогенност изисква катионообменна хроматография, афинитетна хроматография с кобалтов хелат и като последен етап гел филтрация. Тези етапи на пречистване се провеждат при използване на стандартни протоколи (виж по-горе). Поточна схема на метода на пречистване е показана на фигура 10.Purification of bscCD 19xCD3 to homogeneity requires cation exchange chromatography, cobalt chelate affinity chromatography and, as a last step, gel filtration. These purification steps are carried out using standard protocols (see above). A flow chart of the purification method is shown in Figure 10.
Катионообменна хроматография: Супернатантата на клетъчната култура на СНО клетки се смесва с два обема буфер С (30 mM морфолиноетан сулфонова киселина [MES], 20 mM NaCB, 3 mM EDTA, 0.3 тМ бензамидин хидрохлорид, pH 5.5) и се пропуска през 70 ml-SP Sepharose Fast Flow катионообменна колона (Pharmacia) при скорост на потока 20 ml/min. Колоната се уравновесява с буфер А (20 mM MES, 20 тМ NaCe, pH 5.8). След промиване с 5 обема на колоната с буфер A, bscCD 19xCD3 се елюира със стъпаловиден градиент 45% буфер В (20 тМ MES, 1 М NaCB, pH 5.8) в буфер А. Елюатът получава 0.045 обема 1 М Tris/НСв, pH 8.5, съдържащ 47 тМ имидазол, след което се подлага на стерилно филтриране (0.2 microm; AcroCap). Типичен профил на елюиране на катионообмен ната хроматография е показан на Фигура 12. BscCD 19xCD3 се съдържа във фракция 6.Cation exchange chromatography: Cell culture supernatant of CHO cells was mixed with two volumes of C buffer (30 mM morpholinoethane sulfonic acid [MES], 20 mM NaCB, 3 mM EDTA, 0.3 mM benzamidine hydrochloride, pH 5.5) and passed through 70 ml- SP Sepharose Fast Flow cation exchange column (Pharmacia) at a flow rate of 20 ml / min. The column was equilibrated with buffer A (20 mM MES, 20 mM NaCe, pH 5.8). After washing with 5 volumes of column A with buffer A, bscCD 19xCD3 was eluted with a step gradient of 45% buffer B (20 mM MES, 1 M NaCB, pH 5.8) in buffer A. The eluate received 0.045 volumes 1 M Tris / HCl, pH 8.5 containing 47 mM imidazole then subjected to sterile filtration (0.2 µm; AcroCap). A typical elution profile of cation exchange chromatography is shown in Figure 12. BscCD 19xCD3 is contained in fraction 6.
Афинитетно пречистване с кобалтов хелат: Елюатът от катионообменната колона се пропуска при скорост на потока 2.5 ml/min през 10 mlChelating Sepharose Fast Flow колона (Pharmacia) уравновесена в буфер AO (50 mM Na2HPO4, 400 mM NaCl, pH 8.0). Колоната е предварително уравновесена c разтвор на 0.1 M кобалтов хлорид. След промиване с 33 обема на колоната с буфер АО, буфер А (50 mM Na2HPO4, 400 тМ NaCl, 2 тМ имидазол, pH 6.4) и градиент от ΟΙ 2% буфер В (50 mM NajHPO,, 400 тМ NaCl, 500 тМ имидазол, pH 6.4) в буфер А, bscCD 19xCD3 се елюира в един етап с 30 ml 100% буфер В. Елюатът се филтрира стерилно, следвано от приблизително 10-кратно концентриране в MacroSep устройство (Pall Gelman; 10 kD cut-off). Типичен профил за елюиране на афинитетната хроматография с кобалтов хелат е показан на Фигура 13. BscCD19xCD3 се открива във фракция No. 7.Cobalt chelate affinity purification: The eluate from the cation exchange column was passed at a flow rate of 2.5 ml / min through 10 mlChelating Sepharose Fast Flow column (Pharmacia) equilibrated in AO buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , 400 mM NaCl, pH 8.0). The column was pre-equilibrated with a solution of 0.1 M cobalt chloride. After washing with 33 volumes of column with buffer AO, buffer A (50 mM Na 2 HPO 4 , 400 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 6.4) and a gradient of ΟΙ 2% buffer B (50 mM NaHPO, 400 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 6.4) in buffer A, bscCD 19xCD3 was eluted in one step with 30 ml of 100% buffer B. The eluate was sterile filtered, followed by approximately 10-fold concentration in a MacroSep device (Pall Gelman; 10 kD cut-off ). A typical elution profile for cobalt chelate affinity chromatography is shown in Figure 13. BscCD19xCD3 is found in fraction No. 7.
Гел филтрация: Концентрираният елюат от афинитетната колона с кобалтов хелат се пропуска при скорост на потока 0.75 ml/min през 124 ml-High Load Superdex 200 колона (Pharmacia; prep grade) уравновесена c фосфатно буфериран физиологичен разтвор (Gibco). bscCD19xCD3 се елюира във фракция с размер на молекулите, съответстващ на приблизително 55 kDa (Фигура 14, фракция No. 7). Към фракцията от гел филтрацията съдържаща bscCD 19xCD3 се прибавя 5% човешки серумен албумин (Behring), следван от стерилно филтриране през 0.1 microm филтър (Millex; Millipore).Gel filtration: The concentrated eluate from the affinity column with cobalt chelate was passed at a flow rate of 0.75 ml / min through a 124 ml-High Load Superdex 200 column (Pharmacia; prep grade) equilibrated with phosphate buffered saline (Gibco). bscCD19xCD3 was eluted in a fraction with a molecule size corresponding to approximately 55 kDa (Figure 14, fraction No. 7). To the gel filtration fraction containing bscCD 19xCD3 was added 5% human serum albumin (Behring), followed by sterile filtration through a 0.1 micrometer filter (Millex; Millipore).
Изобилието на bscCD 19xCD3 в супернатантата от клетъчната култура и различните активни фракции от колоната, както са анализирани чрез SDS-PAGE, са показани на Фигура 11. bscCD 19xCD3 е главния открит протеин в супернатантата от клетъчната култура (ивица 2). Анти-CD 19ханти-СОЗ с висока степен на пречистване, който се използва при терапия на хора не показва откриваеми онечиствания (Фигура 11, ивица 5).The abundance of bscCD 19xCD3 in cell culture supernatant and the various active fractions of the column, as analyzed by SDS-PAGE, are shown in Figure 11. bscCD 19xCD3 is the major open protein in cell culture supernatant (lane 2). High-purity anti-CD 19hanth-POPs used in human therapy did not show detectable impurities (Figure 11, lane 5).
Пример 7. Клинично използване на bscCD 19xCD3 при пациент с В-клетъчна лимфомаExample 7. Clinical use of bscCD 19xCD3 in a patient with B-cell lymphoma
При доброволно използване, пациент (АВ, жена, родена 1937), страдаща от В-клетьчно производна хронична лимфатична левкемия (ВCLL) се третира с биспецифично едноверижно антитяло bscCD 19xCD3.In voluntary use, a patient (AB, woman, born 1937) suffering from B-cell-derived chronic lymphatic leukemia (BCLL) is treated with a bispecific single-stranded bscCD 19xCD3 antibody.
История на пациента и разпределяне:Patient history and distribution:
Пациентът е диагностициран с B-CLL през 1992. По време на първоначалното диагностициране болестта е била засегнала области на различни лимфни възли и далака; освен това, е била наблюдавана хемолитична анемия с автоимунен произход, както и имуноглобулинов дефицит. Пациентката е със struma nodosa, което добре се контролира, и нормално състояние на щитовидната жлеза, чрез лечение с карбимазол 2.5 mg/d.The patient was diagnosed with B-CLL in 1992. During the initial diagnosis, the disease had affected areas of different lymph nodes and spleen; moreover, hemolytic anemia of autoimmune origin was observed as well as immunoglobulin deficiency. The patient has well-controlled struma nodosa and a normal thyroid condition by treatment with carbimazole 2.5 mg / d.
Пациентката е получила многократни цикли хемотерапия с хлорамбуцил и преднизон от 1992 до 1994. Следвайки прогресирането на болестта лечението е променено на циклофосфамид, дексорубицин, винкристин и преднизон (CHOP, 8 цикъла) и е постигната ремисия за повече от една година. При следващия рецидив пациентката получава нови 6 цикъла със CHOP, следвани от хлорамбуцил и преднизон и единична доза хлорамбуцил самостоятелно, което не довежда до никакво подобряване на болестта. През декември 1998, се провежда облъчване на далака, за да се контролира прогресирането на спленумегалия у пациентката Пациентката претърпява силно намаляване на костния мозък с многобройни инфекциозни усложнения. Нейната анемия и тромбоцитопения изискват чести трансфузии на червени кръвни клетки и заместител на тромбоцити.The patient received multiple cycles of chemotherapy with chlorambucil and prednisone from 1992 to 1994. Following the progression of the disease, treatment was changed to cyclophosphamide, dexorubicin, vincristine and prednisone (CHOP, 8 cycles) and remission was achieved for more than one year. At the next relapse, the patient received a further 6 cycles of CHOP, followed by chlorambucil and prednisone and a single dose of chlorambucil alone, which did not lead to any improvement in the disease. In December 1998, a spleen irradiation was performed to control the progression of splenomegaly in the patient. The patient undergoes severe bone marrow reduction with numerous infectious complications. Its anemia and thrombocytopenia require frequent red blood cell transfusions and platelet replacement.
Поради напредналия стадий на заболяването и засегнатата функция на костния мозък, по-агресивни и по-високи дози хемотерапия не се препоръчват на пациентката. Лечение с антиCD20 антитяло ретуксимаб не се препоръчва, тъй като ефикасността на ретуксимаб във B-CLL не е добре изяснена до сега.Due to the advanced stage of the disease and the affected bone marrow function, more aggressive and higher doses of chemotherapy are not recommended for the patient. Treatment with antiCD20 antibody retuximab is not recommended because the efficacy of retuximab in B-CLL is not well understood so far.
FACS анализ показва, че 95 % от клетките на периферната кръв на пациентката са CD 19 позитивни клетки, докато 77 % от клетките експресира CD20 антигена. Инкубиране на клетки от периферна кръв на пациентката с bscCDl 9xCD3 показват подчертано изтощаване на CD 19-позитивни В-клетки (виж пример 5). Поради тази причина лекуващите лекари са решили да лекуват пациентката с новия bscCD 19xCD3 при доброволно използване. Пациентката бе информирана подробно за новостта на съединението и за по тенциалните рискове и ползи от такова лечение. Тя напълно разбра обясненията и даде писмено съгласие за доброволно използване.FACS analysis showed that 95% of the patient's peripheral blood cells were CD19 positive cells, while 77% of the cells expressed the CD20 antigen. Incubation of peripheral blood cells of a patient with bscCD1 9xCD3 showed marked depletion of CD 19-positive B cells (see Example 5). For this reason, treating physicians have decided to treat the patient with the new bscCD 19xCD3 voluntarily. The patient was informed in detail of the novelty of the compound and of the potential risks and benefits of such treatment. She fully understood the explanations and gave written consent for voluntary use.
Описание на клиничното прилагане:Description of clinical application:
Преди началото на лечението пациентката премина клиничен преглед и разширени диагностични процедури, за да се провери степента на заболяването и да се изключат всякакви други рискови фактори. Пациентката е в добро клинично състояние с анемия, с тромбоцитопения и загуба на тегло, но без каквото и да е засягане на сърдечно съдовата система или каквито и да са усложнения възпрепятстващи използването на bscCD 19xCD3. През нощта преди първия ден на лечение пациентката се оплаква от мигренозно главоболие. За прилагането HabscCD19xCD3 пациентката е настанена в болнично заведение при засилено наблюдение, за да се подсигури бързо лечение при какъвто и да е спешен случай, който би могъл да възникне. За да се предотвратят каквито и да са остри реакции на цитокините и усложнения от туморен лизис, пациентката приема профилактично IV дози от 2 mg клемастин (Tavegil®) и 200 mg циметидин (Tagamet®), както и 300 mg алопуринол и 20 mg от омерпазол (Antra®).Prior to initiation of treatment, the patient underwent a clinical examination and advanced diagnostic procedures to check the severity of the disease and to exclude any other risk factors. The patient is in good clinical condition with anemia, with thrombocytopenia and weight loss, but without any involvement of the cardiovascular system or any complications preventing the use of bscCD 19xCD3. The patient complains of a migraine headache the night before the first day of treatment. For the administration of HabscCD19xCD3, the patient is admitted to a hospital under enhanced surveillance to ensure prompt treatment for any emergencies that may arise. To prevent any acute cytokine reactions and complications of tumor lysis, the patient is prophylactically administered IV doses of 2 mg clemastine (Tavegil®) and 200 mg cimetidine (Tagamet®), as well as 300 mg allopurinol and 20 mg of omeprazole (Antra®).
Провежда се алкализиране и хепаринизиране по време на лечението и последващия период. Освен това пациентката получи всяко необходимо симптоматично лечение.Alkalisation and heparinization are performed during the treatment and the subsequent period. In addition, the patient received any necessary symptomatic treatment.
Кръвни проби бяха взети преди и по време на прилагането на лекарственото средство, за да се следят биохимичните, хематологичните и имунологичните параметри.Blood samples were taken before and during drug administration to monitor biochemical, hematologic and immunological parameters.
1ВО прилагане на bscCD 19xCD3 (14 април. 1999):1 applying bscCD 19xCD3 (April 14th. 1999):
Пациентката получава първа доза от 3 micro g bscCD 19xCD3 като 20-минутна инфузия в изотоничен фосфатен буфер, съдържащ 5 % човешки серумен албумин (HSA). По време на инфузията пациентката няма странични ефекти. Приблизително 1 h след инфузията пациентката изпитва студ за около пет min, следвано от изпотяване, леко спадане на кръвното налягане с около 10 mm Hg и леко повишаване на телесната температура (+ 0.5°С) за около няколко h. Освен това нейното главоболие леко се засилва. Пациентката се третира с други 2 mg Tavegil® и 200 mg Tagamet®, 250 mg преднизолон (SoluDecortin®) и 50 mg петидин (Dolantin®). Всич ки симптоми изчезват без да оставят последствия за следващия ден.The patient received a first dose of 3 micro g bscCD 19xCD3 as a 20-minute infusion in isotonic phosphate buffer containing 5% human serum albumin (HSA). The patient has no side effects during the infusion. Approximately 1 hour after the infusion, the patient experiences cold for about five minutes, followed by sweating, a slight drop in blood pressure of about 10 mm Hg, and a slight increase in body temperature (+ 0.5 ° C) for about a few hours. In addition, her headache is slightly exacerbated. The patient is treated with another 2 mg Tavegil® and 200 mg Tagamet®, 250 mg prednisolone (SoluDecortin®) and 50 mg pethidine (Dolantin®). All symptoms disappear without leaving any consequences for the next day.
2ро прилагане на bscCD19xCD3 (15 април 1999) 2nd implementation of bscCD19xCD3 (15 April 1999)
Втора доза от 10 microg bscCD 19xCD3 се дава един ден по-късно при същите условия. Около един час след инфузията пациентката изпитва силен студ, треска (39.2 °C), слабо усилване на дишането и падане на кръвното. Пациентката се третира с 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet и 300 mg Solu-Decortin и 15 mg пиритрамид (Dipidolor®). За стабилизиране на нейната сърдечносъдова функция пациентката получава инфузия на допамин. След това лечение симптомите значително намаляват. Въпреки това, пациентката се прехвърля в кардиологично отделение за през нощта, за да се осигури постоянно наблюдение на жизнените признаци и незабавна намеса в случай на необходимост. Пациентката се привежда в обикновена болнична стая на следващата сутрин без никакви други усложнения.A second dose of 10 µg bscCD 19xCD3 was given one day later under the same conditions. About one hour after the infusion, the patient experienced severe cold, fever (39.2 ° C), slight increase in breathing and a fall in blood. The patient was treated with 2 mg Tavegil, 200 mg Tagamet and 300 mg Solu-Decortin and 15 mg pyritramide (Dipidolor®). To stabilize her cardiovascular function, the patient receives a dopamine infusion. After this treatment, the symptoms decrease significantly. However, the patient is transferred to the cardiology ward overnight to ensure constant monitoring of vital signs and prompt intervention if necessary. The patient is brought to a regular hospital room the next morning without any other complications.
По време на следващите три дни пациентката продължава да има субфебрилна температура (около 37.2°С) и развива нищожно плеврално изтичане един ден след втората доза (16 април 1999) и лек оток на долните крайници (18 април 1999). Сърдечносъдовата функция остава стабилна и лабораторните изследвания не показват значителни промени по отношение на сигурността, с изключение на повишаване на гамаглутамил-трансферазата след втората доза bscCD 19xCD3 (Фигура 15).Over the next three days, the patient continued to have a subfebrile temperature (about 37.2 ° C) and developed a minor pleural effusion one day after the second dose (April 16, 1999) and a slight swelling of the lower extremities (April 18, 1999). Cardiovascular function remains stable and laboratory studies show no significant changes in safety, except for an increase in gamaglutamyl transferase after the second dose of bscCD 19xCD3 (Figure 15).
Тъй като bscCD19xCD3 се понася от пациентката и страничните ефекти могат да бъдат контролирани със симптоматично лечение, прилагането на новия bscCD 19xCD3 ще продължи при тази пациентка.Because bscCD19xCD3 is tolerated by the patient and side effects can be controlled by symptomatic treatment, administration of the new bscCD 19xCD3 will continue in that patient.
Клинична и имунологична ефикасност на bscCD 19xCD3:Clinical and immunological efficacy of bscCD 19xCD3:
Клинични резултати:Clinical results:
Провежда се ултразвуков преглед на далака и на пет абдоминални аксиларни лимфни възли един ден преди и четири дни след прилагането на втората доза bscCD 19xCD3. Вече един ден след 10 micro g-овата доза (16 април 1999), лимфните възли, както и далака показват свиване от около 20 % в сравнение с базовите стойности. Това наблюдение се потвърждава при втори ултразвуков преглед на 19 април 1999. Тег лото на далака намалява до 350 g (от 1630 g базова стойност до 1280 g на 19 април 1999) (Таблица 1; Фигура 16).Ultrasound examination of the spleen and five abdominal axillary lymph nodes was performed one day before and four days after the second dose of bscCD 19xCD3. Already one day after the 10 micro g dose (April 16, 1999), the lymph nodes as well as the spleen show a contraction of about 20% compared to baseline values. This observation was confirmed at the second ultrasound examination on 19 April 1999. The spleen weight decreased to 350 g (from 1630 g baseline to 1280 g on 19 April 1999) (Table 1; Figure 16).
Хематологични резултати:Hematological results:
Броят бели кръвни клетки, който включва повечето злокачествени В-клетки, намалява по време на курса на лечение и последващите дни (таблица 2; Фигура 17). С-реактивният протеин (CRP) е реакционен протеин на акутната фаза, който отразява активирането и ефекта на провъзпалителните процеси. Той забележимо намалява след прилагането на 10 micro g bscCD 19xCD3, следвано от непрекъснато намаляване по време на следващите три дни от наблюдението (таблица 2; Фигура 18).The white blood cell count, which includes most malignant B cells, decreased during the course of treatment and subsequent days (Table 2; Figure 17). C-reactive protein (CRP) is an acute-phase reaction protein that reflects the activation and effect of inflammatory processes. It decreased markedly after administration of 10 micro g bscCD 19xCD3, followed by a continuous decrease over the next three days of observation (Table 2; Figure 18).
Имунологични резултатиImmunological results
Нивото на серумни цитокини, което отразява острия имунологичен отговор на прилагането на съединението, се измерва преди и на различни интервали след прилагането на новото съединение. Серумните нива на цитокините и на разтворимия IL-2 рецептор се измерват чрез количествено ELISA изследване, съгласно инструкциите на производителя.Serum cytokine levels, reflecting the acute immunological response to administration of the compound, are measured before and at different intervals after administration of the new compound. Serum cytokine and soluble IL-2 receptor levels were measured by quantitative ELISA according to the manufacturer's instructions.
Тумор некрозис фактор TNF-алфа нараства значително по начин зависим от дозата, през първия час след прилагането на bscCD 19xCD3 (Фигура 19).Tumor necrosis factor TNF-alpha increased significantly in a dose-dependent manner during the first hour after administration of bscCD 19xCD3 (Figure 19).
Интерлевкин 6 (IL-6) и интерлевкин 8 (IL8) също показват значително нарастване по начин зависим от дозата. Техните максимални нива се наблюдават 2 до 4 h след прилагането на bscCD19xCD3 (фигури 20, 21). Всички цитокини се връщат до базовите нива за няколко h.Interleukin 6 (IL-6) and interleukin 8 (IL8) also show significant increases in a dose-dependent manner. Their maximum levels are observed 2 to 4 hours after administration of bscCD19xCD3 (Figures 20, 21). All cytokines returned to baseline within a few hours.
Разтворимият IL-2 рецептор е повишен вече до базовата стойност, което може да се обясни с масата на злокачествените В-клетки, експресиращи IL-2 рецептора. След прилагане на новия bscCD 19xCD3, се наблюдава нарастване на разтворимия IL-2 рецептор, което сочи активиране на ефекторните клетки (Фигура 22).The soluble IL-2 receptor has already been raised to a baseline, which can be explained by the mass of malignant B cells expressing the IL-2 receptor. Following administration of the new bscCD 19xCD3, an increase in soluble IL-2 receptor was observed, indicating activation of effector cells (Figure 22).
Изводи:Conclusions:
Новият bscCD 19-CD3 се прилага надеждно на пациент страдащ от рефракторен B-CLL. Поносимостта на bscCD 19xCD3 при доза от 3 micro g и 10 micro g е приемлива и добре може да се контролира чрез измервания на пролиферацията и симптоматично лечение.The new bscCD 19-CD3 is reliably administered to a patient suffering from refractory B-CLL. The tolerance of bscCD 19xCD3 at a dose of 3 microg and 10 microg is acceptable and can be well controlled through proliferation measurements and symptomatic treatment.
Новият bscCD 19xCD3 причинява свиване на преди това уголемения далак и лимфните възли на пациента, както е показано на снимката от ултразвуковият преглед. Тъй като уголемяването на далака и на лимфните възли на пациента се причинява от инфилтриране със злокачествени В-клетки, свиването отразява разрушаването 5 на злокачествените В-клетки като резултат от прилагането на bscCD19xCD3.The new bscCD 19xCD3 causes the previously enlarged spleen and lymph nodes of the patient to contract, as shown in the ultrasound image. Because enlargement of the spleen and lymph nodes of the patient is caused by infiltration of malignant B cells, the contraction reflects the destruction of 5 malignant B cells as a result of administration of bscCD19xCD3.
В ярък контраст на което и да е друго биспецифично CD19xCD3 антитяло, известно от състоянието на техниката, биспецифичното CD19xCD3 антитяло от изобретението (bscCD19xCD3) показва клинично действие при В-клетьчно производна не-Hodgkin лимфома, както е измерено чрез свиването на лимфоидните органи, инфил трирани от злокачествени В-клетки. Преимуществено, bscCD19xCD3 доказа, че е клинично ефективен при изненадващо ниски дози, които добре се понасят след системно прилагане. Следователно, клиничното действие на bscCDl 9xCD3 потвърждава неговата изключителна цитотоксична активност, както е определено in vitro.In stark contrast to any other bispecific CD19xCD3 antibody known in the art, the bispecific CD19xCD3 antibody of the invention (bscCD19xCD3) exhibits clinical activity in B-cell non-Hodgkin lymphoma as measured by lymphoid contraction, treated with malignant B cells. Advantageously, bscCD19xCD3 has been shown to be clinically effective at surprisingly low doses well tolerated after systemic administration. Therefore, the clinical action of bscCD1 9xCD3 confirms its exceptional cytotoxic activity as determined in vitro.
Размерът натри абдоминални лимфни възли, един от ляво и един от дясно аксиларен лимфен възел и на далака се определят и се измерват ултразвуково при използване на Toshiba SSA100 устройство. Размерите са дадени в три измерения и в mm. Теглото на далака се изчислява от размера му и от ултразвуковата плътност.The size of the sodium abdominal lymph nodes, one on the left and one on the right axillary lymph node and the spleen are determined and measured ultrasonically using a Toshiba SSA100 device. The dimensions are given in three dimensions and in mm. The weight of the spleen is calculated by its size and by the ultrasonic density.
ТАБЛИЦА 1:TABLE 1:
Ефект на bscCD19xCD3 върху размера на лимфните възли и далака при пациент, страдащ от В-клетъчна лимфома сп cn σ>Effect of bscCD19xCD3 on lymph node size and spleen in a patient with B-cell lymphoma cn σ>
co cnco cn
cn cn σ>cn cn σ>
ΕζΕζ
X CL 1= <6X CL 1 = <6
CMCM
ТАБЛИЦА 2: Кръвни нива на селекционни маркери в отговор на лечение с bscCD19xCD3.TABLE 2: Blood levels of selection markers in response to treatment with bscCD19xCD3.
Кръвните нива на гама-глутамил трансферазата (GGT), лактата дехидрогеназата (LDH) и на С-реактивния протеин (CRP) се определят чрез стандартни клинични биохимични методи и се изразяват в единици/ml (GGT), единици/1 5 (LDH) и mg/dl (CRP). Броят на левкоцитите се изразява като Giga точки/1, а броят на лимфоцитите се представя като процент от общите левкоцити. Базовите стойности на 14 април 1999, пре ди лечението се дават в първата колона. Отговорът на 3 micro g bscCD 19xCD3 на 15 април 1999 (което е приложено на 14 април) е показано във втората колона. Отговорът на второто третиране с 10 micro g от съединението през същия ден е показан в третата колона. Кръвните нива на селекционните маркери през четвъртия ден следващи третирането с лекарственото средство са дадени в последните колони.Blood levels of gamma-glutamyl transferase (GGT), lactate dehydrogenase (LDH) and C-reactive protein (CRP) are determined by standard clinical biochemical methods and expressed in units / ml (GGT), units / 1 5 (LDH) and mg / dl (CRP). The leukocyte count is expressed as Giga points / l and the lymphocyte count is represented as a percentage of total leukocytes. Baseline values on 14 April 1999, prior to treatment, are given in the first column. The response of 3 micro g bscCD 19xCD3 on 15 April 1999 (which was annexed on 14 April) is shown in the second column. The response of the second treatment with 10 micro g of the compound on the same day is shown in the third column. Blood levels of selection markers in the fourth day following drug treatment are given in the last columns.
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:LIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION:
(i) ЗАЯВИТЕЛ:(i) APPLICANT:
(A) ИМЕ: DOERKEN, Bernd (B) УЛИЦА: Lyckallee 47 (C) ГРАД: Berlin (D) ЩАТ: попе (E) ДЪРЖАВА: Germany (F) ПОЩЕНСИ КОД (ZIP): 14055 (A) ИМЕ: RIETHMUELLER, Bernd (B) УЛИЦА: Finauer Str. 12 (C) ГРАД: Munich (D) ЩАТ: попе (E) ДЪРЖАВА: Germany (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): 80805 (ii) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО:(A) NAME: DOERKEN, Bernd (B) STREET: Lyckallee 47 (C) CITY: Berlin (D) STATE: POPE (E) COUNTRY: Germany (F) POSTAL CODE (ZIP): 14055 (A) NAME: RIETHMUELLER, Bernd (B) STREET: Finauer Str. 12 (C) CITY: Munich (D) STATE: POPE (E) COUNTRY: Germany (F) ZIP CODE (ZIP): 80805 (ii) TITLE OF THE INVENTION:
CD 19 X CD3 СПЕЦИФИЧНИ ПОЛИПЕПТИДИ И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗВАНЕ (iii) БРОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 10 (iv) КОМПЮТЪРЕН ФОРМАТ:CD 19 X CD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND THEIR USE (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 10 (iv) COMPUTER FORMAT:
(A) СРЕДА: флопи (B) КОМПЮТЪР: IBM PC съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) СОФТУЕР: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (ЕРО) (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 1:(A) ENVIRONMENT: Flops (B) COMPUTER: IBM PC Compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) SEQ ID Information NO: 1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 36 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 1:(A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
GAAGCACGCG TAGATATCKT GMTSACCCAA WCTCCA 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2:GAAGCACGCG TAGATATCKT GMTSACCCAA WCTCCA 36 (2) SEQ ID NO: 2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 30 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 2(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2
GAAGATGGAT CCAGCGGCCG CAGCATCAGC 30 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:GAAGATGGAT CCAGCGGCCG CAGCATCAGC 30 (2) SEQ ID NO: 3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 3:(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT SCAGCTGCAG SAG 33 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT SCAGCTGCAG SAG 33 (2) SEQ ID NO: 4:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 39 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 4:(A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
ACCAGGGGCC AGTGGATAGA CAAGCTTGGG TGTCGTTTT 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 5:ACCAGGGGCC AGTGGATAGA CAAGCTTGGG TGTCGTTTT 39 (2) SEQ ID NO: 5:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 36 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 5:(A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
AGGTGTACAC ТССАТАТСС A GCTG ACCCAG TCTCCA 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 6:AGGTGTACAC CCATATSS A GCTG ACCCAG TCTCCA 36 (2) SEQ ID NO: 6:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 48 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ IDNO: 6:(A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) ERPITY: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ IDNO: 6:
GGAGCCGCCGCCGCCAGAAC CACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC 48 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 7:GGAGCCGCCGCCGCCAGAAC CACCACCTTTGATCTCGAGCTTGGTCCC 48 (2) SEQ ID NO: 7:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 48 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеотид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: Ί:(A) LENGTH: 48 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) ERPITY: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULES TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleotide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: Ί:
GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGTACTGC AGAGTCGG 48 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 8:GGCGGCGGCG GCTCCGGTGG TGGTGGTTCT CAGGTACTGC AGAGTCGG 48 (2) SEQ ID NO: 8:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 39 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: единична (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = “олигонуклеогид” (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: ДА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ ID NO: 8:(A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "oligonucleogide" HYPOTHETICAL: YES (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCTTGGCCCCAG 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 9:AATCCGGAGG AGACGGTGAC CGTGGTCCCTTGGCCCCAG 39 (2) SEQ ID NO: 9:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) ДЪЛЖИНА: 1611 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) ТИП МОЛЕКУЛА: сДНК (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: НЕ (ix) СВОЙСТВА:(A) LENGTH: 1611 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: double (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICS: NO (ix) PROPERTIES
(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) РАЗПОЛОЖЕНИЕ: 11..1603 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТА: SEQ IDNO: 9:(A) NAME / KEY: CDS (B) LOCATION: 11..1603 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID: 9:
Claims (28)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE98107269 | 1998-04-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG104868A BG104868A (en) | 2001-09-28 |
BG65066B1 true BG65066B1 (en) | 2007-01-31 |
Family
ID=38057577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG104868A BG65066B1 (en) | 1998-04-21 | 2000-10-17 | CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USE THEREOF |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
BG (1) | BG65066B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107184977A (en) * | 2008-11-07 | 2017-09-22 | 安进研发(慕尼黑)股份有限公司 | The treatment method of ALL |
-
2000
- 2000-10-17 BG BG104868A patent/BG65066B1/en unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107184977A (en) * | 2008-11-07 | 2017-09-22 | 安进研发(慕尼黑)股份有限公司 | The treatment method of ALL |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BG104868A (en) | 2001-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4169478B2 (en) | CD19xCD3-specific polypeptide and uses thereof | |
JP7250736B2 (en) | Binding molecules for BCMA and CD3 | |
JP2022505921A (en) | Antibodies targeting CLL1 and their applications | |
US9399679B2 (en) | Therapeutic anti-TIRC7 antibodies for use in immune related and other diseases | |
EP1673398A1 (en) | Multispecific deimmunized cd3-binders | |
JP4263391B2 (en) | Use of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine | |
US20050163770A1 (en) | Immunological reagent specifically interacting with the extracellular domain of the human zeta chain | |
BG65066B1 (en) | CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USE THEREOF | |
MXPA00010245A (en) | CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF | |
AU2002360073A1 (en) | Mono-and dual chemokine/cytokine constructs |