JP7250736B2 - Bcmaおよびcd3に対する結合分子 - Google Patents
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Description
ほとんどの移植は自家タイプ、すなわち、患者自身の細胞を使用するものである。そのような移植は、根治的でないものの、選択された患者において寿命を延ばすことが示されている。それらは、新たに診断された患者の最初の治療としてまたは再発時に行われ得る。ときには、選択された患者に対して、疾患を十分に制御するために2回以上の移植が推奨され得る。
(a)第1の結合ドメインがBCMAのエピトープクラスター3
に結合でき;かつ
(b)第2の結合ドメインがT細胞CD3受容体複合体に結合でき;
ここで、BCMAのエピトープクラスター3が、SEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、結合分子を提供する。
[本発明1001]
第1および第2の結合ドメインを含む、少なくとも二重特異性である結合分子であって、
(a)第1の結合ドメインがBCMAのエピトープクラスター3
に結合でき、かつ
(b)第2の結合ドメインがT細胞CD3受容体複合体に結合でき、
ここで、BCMAのエピトープクラスター3が、SEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、結合分子。
[本発明1002]
第1の結合ドメインが、マカクBCMAのエピトープクラスター3
にさらに結合できる、本発明1001の結合分子。
[本発明1003]
第2の結合ドメインが、CD3イプシロンに結合できる、本発明1001または1002の結合分子。
[本発明1004]
第2の結合ドメインが、ヒトCD3およびマカクCD3に結合できる、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1005]
第1および/または第2の結合ドメインが、抗体由来である、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1006]
(scFv)2、(単一ドメインmAb)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディまたはこれらのオリゴマーからなる群より選択される、本発明1005の結合分子。
[本発明1007]
第1の結合ドメインが、
(1)SEQ ID NO: 1に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 2に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 4に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 5に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 6に示されるCDR-L3;
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(32)SEQ ID NO: 661に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 662に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 663に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 664に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 665に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 666に示されるCDR-L3;
(33)SEQ ID NO: 671に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 672に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 673に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 674に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 675に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 676に示されるCDR-L3;
(34)SEQ ID NO: 681に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 682に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 683に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 684に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 685に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 686に示されるCDR-L3;
(35)SEQ ID NO: 691に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 692に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 693に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 694に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 695に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 696に示されるCDR-L3;
(36)SEQ ID NO: 701に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 702に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 703に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 704に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 705に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 706に示されるCDR-L3;
(37)SEQ ID NO: 711に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 712に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 713に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 714に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 715に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 716に示されるCDR-L3;
(38)SEQ ID NO: 721に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 722に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 723に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 724に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 725に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 726に示されるCDR-L3;
(39)SEQ ID NO: 731に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 732に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 733に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 734に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 735に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 736に示されるCDR-L3;
(40)SEQ ID NO: 741に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 742に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 743に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 744に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 745に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 746に示されるCDR-L3;
(41)SEQ ID NO: 751に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 752に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 753に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 754に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 755に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 756に示されるCDR-L3;
(42)SEQ ID NO: 761に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 762に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 763に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 764に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 765に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 766に示されるCDR-L3;
(43)SEQ ID NO: 771に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 772に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 773に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 774に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 775に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 776に示されるCDR-L3;
(44)SEQ ID NO: 781に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 782に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 783に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 784に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 785に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 786に示されるCDR-L3;
(45)SEQ ID NO: 791に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 792に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 793に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 794に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 795に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 796に示されるCDR-L3;
(46)SEQ ID NO: 801に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 802に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 803に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 804に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 805に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 806に示されるCDR-L3;
(47)SEQ ID NO: 811に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 812に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 813に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 814に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 815に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 816に示されるCDR-L3;
(48)SEQ ID NO: 821に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 822に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 823に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 824に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 825に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 826に示されるCDR-L3;
(49)SEQ ID NO: 831に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 832に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 833に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 834に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 835に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 836に示されるCDR-L3;
(50)SEQ ID NO: 961に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 962に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 963に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 964に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 965に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 966に示されるCDR-L3;
(51)SEQ ID NO: 971に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 972に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 973に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 974に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 975に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 976に示されるCDR-L3;
(52)SEQ ID NO: 981に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 982に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 983に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 984に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 985に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 986に示されるCDR-L3;ならびに
(53)SEQ ID NO: 991に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 992に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 993に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 994に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 995に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 996に示されるCDR-L3
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域ならびにCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1008]
第1の結合ドメインが、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 317、SEQ ID NO: 327、SEQ ID NO: 337、SEQ ID NO: 347、SEQ ID NO: 357、SEQ ID NO: 367、SEQ ID NO: 377、SEQ ID NO: 387、SEQ ID NO: 587、SEQ ID NO: 597、SEQ ID NO: 607、SEQ ID NO: 617、SEQ ID NO: 627、SEQ ID NO: 637、SEQ ID NO: 647、SEQ ID NO: 657、SEQ ID NO: 667、SEQ ID NO: 677、SEQ ID NO: 687、SEQ ID NO: 697、SEQ ID NO: 707、SEQ ID NO: 717、SEQ ID NO: 727、SEQ ID NO: 737、SEQ ID NO: 747、SEQ ID NO: 757、SEQ ID NO: 767、SEQ ID NO: 777、SEQ ID NO: 787、SEQ ID NO: 797、SEQ ID NO: 807、SEQ ID NO: 817、SEQ ID NO: 827、SEQ ID NO: 837、SEQ ID NO: 967、SEQ ID NO: 977、SEQ ID NO: 987およびSEQ ID NO: 997に示されるVH領域からなる群より選択されるVH領域を含む、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1009]
第1の結合ドメインが、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 328、SEQ ID NO: 338、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 358、SEQ ID NO: 368、SEQ ID NO: 378、SEQ ID NO: 388、SEQ ID NO: 588、SEQ ID NO: 598、SEQ ID NO: 608、SEQ ID NO: 618、SEQ ID NO: 628、SEQ ID NO: 638、SEQ ID NO: 648、SEQ ID NO: 658、SEQ ID NO: 668、SEQ ID NO: 678、SEQ ID NO: 688、SEQ ID NO: 698、SEQ ID NO: 708、SEQ ID NO: 718、SEQ ID NO: 728、SEQ ID NO: 738、SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 758、SEQ ID NO: 768、SEQ ID NO: 778、SEQ ID NO: 788、SEQ ID NO: 798、SEQ ID NO: 808、SEQ ID NO: 818、SEQ ID NO: 828、SEQ ID NO: 838、SEQ ID NO: 968、SEQ ID NO: 978、SEQ ID NO: 988およびSEQ ID NO: 998に示されるVL領域からなる群より選択されるVL領域を含む、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1010]
第1の結合ドメインが、
(1) SEQ ID NO: 7に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 8に示されるVL領域;
(2) SEQ ID NO: 17に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 18に示されるVL領域;
(3) SEQ ID NO: 27に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 28に示されるVL領域;
(4) SEQ ID NO: 37に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 38に示されるVL領域;
(5) SEQ ID NO: 47に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 48に示されるVL領域;
(6) SEQ ID NO: 57に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 58に示されるVL領域;
(7) SEQ ID NO: 67に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 68に示されるVL領域;
(8) SEQ ID NO: 77に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 78に示されるVL領域;
(9) SEQ ID NO: 167に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 168に示されるVL領域;
(10) SEQ ID NO: 177に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 178に示されるVL領域;
(11) SEQ ID NO: 187に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 188に示されるVL領域;
(12) SEQ ID NO: 197に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 198に示されるVL領域;
(13) SEQ ID NO: 207に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 208に示されるVL領域;
(14) SEQ ID NO: 217に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 218に示されるVL領域;
(15) SEQ ID NO: 227に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 228に示されるVL領域;
(16) SEQ ID NO: 317に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 318に示されるVL領域;
(17) SEQ ID NO: 327に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 328に示されるVL領域;
(18) SEQ ID NO: 337に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 338に示されるVL領域;
(19) SEQ ID NO: 347に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 348に示されるVL領域;
(20) SEQ ID NO: 357に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 358に示されるVL領域;
(21) SEQ ID NO: 367に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 368に示されるVL領域;
(22) SEQ ID NO: 377に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 378に示されるVL領域;
(23) SEQ ID NO: 387に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 388に示されるVL領域;
(24) SEQ ID NO: 587に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 588に示されるVL領域;
(25) SEQ ID NO: 597に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 598に示されるVL領域;
(26) SEQ ID NO: 607に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 608に示されるVL領域;
(27) SEQ ID NO: 617に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 618に示されるVL領域;
(28) SEQ ID NO: 627に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 628に示されるVL領域;
(29) SEQ ID NO: 637に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 638に示されるVL領域;
(30) SEQ ID NO: 647に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 648に示されるVL領域;
(31) SEQ ID NO: 657に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 658に示されるVL領域;
(32) SEQ ID NO: 667に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 668に示されるVL領域;
(33) SEQ ID NO: 677に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 678に示されるVL領域;
(34) SEQ ID NO: 687に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 688に示されるVL領域;
(35) SEQ ID NO: 697に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 698に示されるVL領域;
(36) SEQ ID NO: 707に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 708に示されるVL領域;
(37) SEQ ID NO: 717に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 718に示されるVL領域;
(38) SEQ ID NO: 727に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 728に示されるVL領域;
(39) SEQ ID NO: 737に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 738に示されるVL領域;
(40) SEQ ID NO: 747に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 748に示されるVL領域;
(41) SEQ ID NO: 757に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 758に示されるVL領域;
(42) SEQ ID NO: 767に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 768に示されるVL領域;
(43) SEQ ID NO: 777に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 778に示されるVL領域;
(44) SEQ ID NO: 787に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 788に示されるVL領域;
(45) SEQ ID NO: 797に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 798に示されるVL領域;
(46) SEQ ID NO: 807に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 808に示されるVL領域;
(47) SEQ ID NO: 817に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 818に示されるVL領域;
(48) SEQ ID NO: 827に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 828に示されるVL領域;
(49) SEQ ID NO: 837に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 838に示されるVL領域;
(50) SEQ ID NO: 967に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 968に示されるVL領域;
(51) SEQ ID NO: 977に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 978に示されるVL領域;
(52) SEQ ID NO: 987に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 988に示されるVL領域;ならびに
(53) SEQ ID NO: 997に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 998に示されるVL領域
からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1011]
第1の結合ドメインが、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 319、SEQ ID NO: 329、SEQ ID NO: 339、SEQ ID NO: 349、SEQ ID NO: 359、SEQ ID NO: 369、SEQ ID NO: 379、SEQ ID NO: 389、SEQ ID NO: 589、SEQ ID NO: 599、SEQ ID NO: 609、SEQ ID NO: 619、SEQ ID NO: 629、SEQ ID NO: 639、SEQ ID NO: 649、SEQ ID NO: 659、SEQ ID NO: 669、SEQ ID NO: 679、SEQ ID NO: 689、SEQ ID NO: 699、SEQ ID NO: 709、SEQ ID NO: 719、SEQ ID NO: 729、SEQ ID NO: 739、SEQ ID NO: 749、SEQ ID NO: 759、SEQ ID NO: 769、SEQ ID NO: 779、SEQ ID NO: 789、SEQ ID NO: 799、SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 819、SEQ ID NO: 829、SEQ ID NO: 839、SEQ ID NO: 969、SEQ ID NO: 979、SEQ ID NO: 989およびSEQ ID NO: 999からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1010の結合分子。
[本発明1012]
SEQ ID NO: 340またはSEQ ID NO: 980に示されるアミノ酸配列を有する、本発明1001~1006のいずれかの結合分子。
[本発明1013]
350またはそれ未満、好ましくは320またはそれ未満のEC50(pg/ml)によって特徴づけられる、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1014]
BC E5 33-B11-B8、BC 5G9 92-E10、BC 5G9 91-D2-B10、BC B12 33-A4-B2、BC 3A4 37-A11-G1、BC A7-27 C4-G7、BC C3 33-D7-B1、BC C3 33-F8-E6 B1のいずれか一つのEC50(pg/ml)と等しいEC50(pg/ml)によって特徴づけられる、前記本発明のいずれかの結合分子。
[本発明1015]
本発明1001~1014のいずれかの結合分子をコードする、核酸配列。
[本発明1016]
本発明1015の核酸配列を含む、ベクター。
[本発明1017]
本発明1015の核酸配列または本発明1016のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
[本発明1018]
本発明1001~1014のいずれかの結合分子の発現を可能にする条件下で本発明1017の宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、本発明1001~1014のいずれかの結合分子の製造プロセス。
[本発明1019]
本発明1001~1014のいずれかの結合分子または本発明1018のプロセスによって製造された結合分子を含む、薬学的組成物。
[本発明1020]
形質細胞障害、BCMA発現と相関する他のB細胞障害、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または寛解において使用するための、本発明1001~1014のいずれかの結合分子または本発明1018のプロセスによって製造された結合分子。
[本発明1021]
形質細胞障害、BCMA発現と相関する他のB細胞障害、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または寛解のための方法であって、それを必要とする対象に本発明1001~1014のいずれかの結合分子または本発明1018のプロセスによって製造された結合分子を投与する工程を含む、方法。
[本発明1022]
形質細胞障害が、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性γグロブリン血症、およびくすぶり型多発性骨髄腫からなる群より選択される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、本発明1021の方法。
[本発明1024]
本発明1001~1014のいずれかの結合分子、本発明1015の核酸分子、本発明1016のベクター、および/または本発明1017の宿主細胞を含む、キット。
[本発明1025]
BCMAに結合できる結合分子の、好ましくは抗体の生成のためのBCMAのエピトープクラスター3の使用であって、BCMAのエピトープクラスター3がSEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、使用。
[本発明1026]
BCMAに結合できる抗体を、好ましくは二重特異性結合分子を生成する方法であって、
(a)BCMAのエピトープクラスター3を含むポリペプチドで動物を免疫する工程であって、BCMAのエピトープクラスター3がSEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、工程、
(b)該抗体を得る工程、ならびに
(c)任意で、該抗体を、ヒトBCMAおよび好ましくはT細胞CD3受容体複合体に結合できる二重特異性結合分子に変換する工程
を含む、方法。
結合分子は、1つまたは複数の結合ドメインが標的分子BCMAおよびCD3と結合/相互作用できるよう、言わば、それらの結合ドメインのスキャホールドを提供する。例えば、そのようなスキャホールドは、プロテインA、特にそのZドメイン(アフィボディ)、ImmE7(免疫タンパク質)、BPTI/APPI(Kunitzドメイン)、Ras結合タンパク質AF-6(PDZドメイン)、カリブドトキシン(サソリ毒)、CTLA-4、Min-23(ノッチン)、リポカリン(アンチカリン)、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメインまたはチオレドキシンによって提供され得る(Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997))。好ましい結合分子は、抗体である。
結合分子は、既存の(モノクローナル)抗体由来のCDR配列の,スキャホールド、例えば本明細書に開示されるスキャホールドへの移植による以外にも、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング法によって製造される(またはそれらによって入手可能である)ことが想定されている。
結合ドメインは、結合ドメインドナー、例えば、抗体、プロテインA、ImmE7(免疫タンパク質)、BPTI/APPI(Kunitzドメイン)、Ras結合タンパク質AF-6(PDZドメイン)、カリブドトキシン(サソリ毒)、CTLA-4、Min-23(ノッチン)、リポカリン(アンチカリン)、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメインまたはチオレドキシンから得ることができる(Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997))。好ましい結合ドメインは、抗体から得られる。本発明の結合ドメインは、標的分子BCMAおよびCD3上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位への結合/相互作用に必要となる上記の結合ドメインのいずれかの少なくとも一部分を含むことが想定されている。
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の3次元折り畳みによって近接することになる非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の1次配列が認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。直線状エピトープは、典型的に、特有の配列内に、少なくとも3つまたは少なくとも4つ、およびより一般には少なくとも5つまたは少なくとも6つまたは少なくとも7つ、例えば約8~約10のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、直線状エピトープに対して、エピトープを含むアミノ酸の1次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ(例えば、アミノ酸の1次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ)である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメント、の3次元構造を認識する(本発明においては、結合ドメインの1つに対する抗原がBCMAタンパク質内に含まれている)。例えば、タンパク質分子が折り畳まれ3次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸および/またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法は、x線結晶解析、2次元核磁気共鳴(2D-NMR)分光分析および部位特異的スピンラベルおよび電子常磁性共鳴(EPR)分光分析を含むがこれらに限定されない。さらに、提供される実施例には、所定の結合ドメインが所定のタンパク質、特にBCMA、の1つまたは複数のエピトープクラスターに結合するかどうかを試験するためのさらなる方法が記載されている。
この、非ヒト(例えば、マウス)BCMA抗原の各エピトープクラスターとの交換に起因する結合の喪失を試験する方法は、本明細書の実施例、特に実施例1~3に記載されている。所定の結合分子または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析したい各残基を例えば部位特異的変異誘発を通じてアラニンで置き換えるアラニンスキャニング(例えば、Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5(3): 302-7を参照のこと)である。アラニンが使用される理由は、かさ高くなく、化学的に不活性であり、にもかかわらず多くの他のアミノ酸が有している参照2次構造を模倣するメチル官能基を有しているため、である。ときどき、変異させる残基のサイズを保存することが望まれる例では、かさ高いアミノ酸、例えばバリンまたはロイシンが使用され得る。アラニンスキャニングは、長きにわたり使用されている成熟した技術である。
本明細書で使用される場合、「エピトープクラスター」という用語は、所定の連続する抗原ストレッチの中に存在するエピトープの全体を示す。エピトープクラスターは、1つ、2つまたはそれ以上のエピトープを含み得る。本発明との関係でBCMAの細胞外ドメインにおいて定義されたエピトープクラスターが上記されており、かつ図1に示されている。
「本質的に結合しない」または「結合できない」という用語は、本発明の結合ドメインが、BCMAまたはCD3以外の別のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、BCMAまたはCD3のそれぞれに対する結合を100%として、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に対して30%超、好ましくは20%超、より好ましくは10%超、特に好ましくは9%、8%、7%、6%または5%超の反応性を示さないことを意味する。
本発明の別の局面において、第2の結合ドメインは、CD3イプシロンに結合できる。本発明のさらに別の局面において、第2の結合ドメインは、ヒトCD3およびマカクCD3、好ましくはヒトCD3イプシロンおよびマカクCD3イプシロンに結合できる。付加的にまたは代替的に、第2の結合ドメインは、コモンマーモセット、ワタボウシタマリンおよび/またはコモンリスザルのCD3イプシロンに結合できる。これらの態様にしたがい、本発明の結合分子の一方または両方の結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーに対して種間特異的(cross-species specific)である。種間特異的CD3結合ドメインは、例えば、WO 2008/119567に記載されている。
(a)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 27に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 28に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 29に示されるCDR-L3;
(b)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 117に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 118に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 119に示されるCDR-L3;ならびに
(c)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 153に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 154に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 155に示されるCDR-L3
から選択されるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む本発明の結合分子が、特に好ましい。
(a)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 12に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 13に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 14に示されるCDR-H3;
(b)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 30に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 31に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 32に示されるCDR-H3;
(c)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 48に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 49に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 50に示されるCDR-H3;
(d)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 66に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 67に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 68に示されるCDR-H3;
(e)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 84に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 85に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 86に示されるCDR-H3;
(f)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 102に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 103に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 104に示されるCDR-H3;
(g)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 120に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 121に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 122に示されるCDR-H3;
(h)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 138に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 139に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 140に示されるCDR-H3;
(i)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 156に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 157に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 158に示されるCDR-H3;ならびに
(j)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 174に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 175に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 176に示されるCDR-H3
から選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域を含む。
(a)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 17または21に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 15または19に示されるVH領域;
(b)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 35または39に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 33または37に示されるVH領域;
(c)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 53または57に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 51または55に示されるVH領域;
(d)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 71または75に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 69または73に示されるVH領域;
(e)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 89または93に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 87または91に示されるVH領域;
(f)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 107または111に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 105または109に示されるVH領域;
(g)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 125または129に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 123または127に示されるVH領域;
(h)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 143または147に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 141または145に示されるVH領域;
(i)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 161または165に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 159または163に示されるVH領域;ならびに
(j)WO 2008/119567のSEQ ID NO: 179または183に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 177または181に示されるVH領域;
からなる群より選択されるVL領域およびVH領域を含むT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインによって特徴づけられる。
特に好ましい態様において、本発明のBCMA/CD3 二重特異性結合分子は、≦350 pg/mlまたはそれ未満、より好ましくは≦320 pg/mlまたはそれ未満のEC50によって特徴づけられる。その態様において、標的細胞はL363細胞であり、エフェクター細胞は未刺激のヒトPBMCである。当業者は、EC50値を測定する方法を知っており、さらなる労力を要しない。さらに、本明細書は、EC50値を測定する方法に関する具体的指示を教示している;例えば、以下の実施例8.3を参照のこと。適当なプロトコルは以下のようなものである:
a) 濃縮リンパ球調製物(軟膜)からFicoll密度勾配遠心分離によりヒト末梢血単核細胞(PBMC)を調製する
b) 必要に応じてDulbecco PBS(Gibco)で洗浄する
c) 赤血球溶解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)とのインキュベートを通じて残存する赤血球をPBMCから除去する
c)100 x gでのPBMCの遠心分離により上清を通じて血小板を除去する
d) CD14+細胞およびNK細胞を枯渇させる
e) 例えばLSカラム(Miltenyi Biotec、#130-042-401)を用いてCD14/CD56陰性細胞を単離する
f) 必要になるまで、インキュベーターにおいて37℃で、例えばRPMI完全培地、すなわち10% FBS(Biochrom AG、#S0115)、1x非必須アミノ酸(Biochrom AG、#K0293)、10mM Hepes緩衝液(Biochrom AG、#L1613)、1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG、#L0473)および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(Biochrom AG、#A2213)を補充したRPMI1640(Biochrom AG、#FG1215)中で、CD14+/CD56+細胞を含まないPBMCを培養する
g) 標的細胞を標識する
h) 好ましくは等容積の、エフェクターおよび標的細胞を、E:T細胞比が10:1になるよう混合する
i) 好ましくは連続希釈された、結合分子を添加する。
j) 7% CO2加湿インキュベーター内で48時間進行させる
k) 例えばフローサイトメトリーによって、例えば終濃度1μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)を添加することにより、標的細胞の膜完全性をモニタリングする
l) EC50を、例えば次式:
にしたがって計算する。
GraphPad Prism 5ソフトウェア(Graph Pad Software, San Diego)を用いて、細胞毒性の百分率を、対応する二重特異性抗体の濃度に対してプロットした。用量応答曲線は、一定のヒル勾配(hill slope)のシグモイド用量応答曲線の評価のための4パラメータロジスティック回帰モデルを用いて分析することができ、EC50値を計算した。
上記のアッセイにおいて「参照」結合分子の役割をするBCMA/CD3 二重特異性結合分子BCMA-83 x CD3、BCMA-62 x CD3、BCMA-5 x CD3、BCMA-98 x CD3、BCMA-71 x CD3、BCMA-34 x CD3、BCMA-74 x CD3、BCMA-20 x CD3は、好ましくはCHO細胞において産生される。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、対象抗原は、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ハムスターまたはラットを免疫するために使用され得る。1つの態様において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部分を含む。例えば、マウス抗体産生能を欠失しているマウス系統をヒトIg遺伝子座の大フラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体が産生および選択され得る。例えば、XENOMOUSE(商標)、Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21、US 2003-0070185、WO96/34096およびWO96/33735を参照のこと。
抗体またはそのフラグメントはまた、ヒトT細胞エピトープの特異的欠失またはWO 98/52976およびWO 00/34317に開示される方法による「非免疫化」によって修飾され得る。簡潔に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインが、MHCクラスIIに結合するペプチドについて分析され得;これらのペプチドが、(WO 98/52976およびWO 00/34317で定義されるように)潜在的T細胞エピトープである。WO 98/52976およびWO 00/34317に記載されるように、潜在的T細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング(peptide threading)」と呼ばれるコンピューターモデリングアプローチが適用され得、加えて、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースが、VHおよびVL配列に存在するモチーフについて検索され得る。これらのモチーフは、18個の主要MHCクラスII DRアロタイプのいずれかに結合し、したがって、潜在的T細胞エピトープを構成する。検出された潜在的T細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによってまたは好ましくは単一アミノ酸置換によって除去され得る。典型的に、保存的置換が行われる。すべてではないが多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列における位置に一般的なアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖系列配列は、例えば、Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16(5): 237-242;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638に開示されている。V BASEディレクトリは、(Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UKによってコンパイルされた)ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびCDRのための、ヒト配列の供給源として、使用することができる。例えば米国特許第6,300,064号に記載されるような、コンセンサスヒトフレームワーク領域もまた使用することができる。
「可変」という用語は、それらの配列における可変性(variability)を示し、個々の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、免疫グロブリンドメインの一部分(すなわち、「可変ドメイン」)を表す。可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく;それは重鎖および軽鎖の各々の可変領域の部分ドメインに集中している。これらの部分ドメインは、「超可変」領域または「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる。可変ドメインのより保存された(非超可変)部分は、「フレームワーク」領域(FRM)と呼ばれる。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβシート配置をとっている4つのFRM領域を含んでおり、これらが、ループ接続を形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によって接続されている。各鎖の超可変領域は、FRMによって近接状態になってまとめられて保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat et al., loc. cit.を参照のこと)。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的細胞媒介細胞毒性および補体活性化、を示す。
(1)SEQ ID NO: 1に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 2に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 3に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 4に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 5に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 6に示されるCDR-L3;
(2)SEQ ID NO: 11に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 12に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 13に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 14に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 15に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 16に示されるCDR-L3;
(3)SEQ ID NO: 21に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 22に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 23に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 24に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 25に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 26に示されるCDR-L3;
(4)SEQ ID NO: 31に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 32に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 33に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 34に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 35に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 36に示されるCDR-L3;
(5)SEQ ID NO: 41に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 42に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 43に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 44に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 45に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 46に示されるCDR-L3;
(6)SEQ ID NO: 51に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 52に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 53に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 54に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 55に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 56に示されるCDR-L3;
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(8)SEQ ID NO: 71に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 72に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 73に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 74に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 75に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 76に示されるCDR-L3;
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(31)SEQ ID NO: 651に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 652に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 653に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 654に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 655に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 656に示されるCDR-L3;
(32)SEQ ID NO: 661に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 662に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 663に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 664に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 665に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 666に示されるCDR-L3;
(33)SEQ ID NO: 671に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 672に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 673に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 674に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 675に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 676に示されるCDR-L3;
(34)SEQ ID NO: 681に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 682に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 683に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 684に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 685に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 686に示されるCDR-L3;
(35)SEQ ID NO: 691に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 692に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 693に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 694に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 695に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 696に示されるCDR-L3;
(36)SEQ ID NO: 701に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 702に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 703に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 704に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 705に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 706に示されるCDR-L3;
(37)SEQ ID NO: 711に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 712に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 713に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 714に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 715に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 716に示されるCDR-L3;
(38)SEQ ID NO: 721に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 722に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 723に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 724に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 725に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 726に示されるCDR-L3;
(39)SEQ ID NO: 731に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 732に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 733に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 734に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 735に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 736に示されるCDR-L3;
(40)SEQ ID NO: 741に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 742に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 743に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 744に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 745に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 746に示されるCDR-L3;
(41)SEQ ID NO: 751に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 752に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 753に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 754に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 755に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 756に示されるCDR-L3;
(42)SEQ ID NO: 761に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 762に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 763に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 764に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 765に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 766に示されるCDR-L3;
(43)SEQ ID NO: 771に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 772に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 773に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 774に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 775に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 776に示されるCDR-L3;
(44)SEQ ID NO: 781に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 782に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 783に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 784に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 785に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 786に示されるCDR-L3;
(45)SEQ ID NO: 791に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 792に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 793に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 794に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 795に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 796に示されるCDR-L3;
(46)SEQ ID NO: 801に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 802に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 803に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 804に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 805に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 806に示されるCDR-L3;
(47)SEQ ID NO: 811に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 812に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 813に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 814に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 815に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 816に示されるCDR-L3;
(48)SEQ ID NO: 821に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 822に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 823に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 824に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 825に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 826に示されるCDR-L3;
(49)SEQ ID NO: 831に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 832に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 833に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 834に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 835に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 836に示されるCDR-L3;
(50)SEQ ID NO: 961に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 962に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 963に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 964に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 965に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 966に示されるCDR-L3;
(51)SEQ ID NO: 971に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 972に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 973に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 974に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 975に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 976に示されるCDR-L3;
(52)SEQ ID NO: 981に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 982に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 983に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 984に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 985に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 986に示されるCDR-L3;ならびに
(53)SEQ ID NO: 991に示されるCDR-H1、SEQ ID NO: 992に示されるCDR-H2、SEQ ID NO: 993に示されるCDR-H3、SEQ ID NO: 994に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 995に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO: 996に示されるCDR-L3
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域ならびにCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む。
(1) SEQ ID NO: 7に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 8に示されるVL領域;
(2) SEQ ID NO: 17に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 18に示されるVL領域;
(3) SEQ ID NO: 27に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 28に示されるVL領域;
(4) SEQ ID NO: 37に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 38に示されるVL領域;
(5) SEQ ID NO: 47に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 48に示されるVL領域;
(6) SEQ ID NO: 57に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 58に示されるVL領域;
(7) SEQ ID NO: 67に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 68に示されるVL領域;
(8) SEQ ID NO: 77に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 78に示されるVL領域;
(9) SEQ ID NO: 167に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 168に示されるVL領域;
(10) SEQ ID NO: 177に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 178に示されるVL領域;
(11) SEQ ID NO: 187に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 188に示されるVL領域;
(12) SEQ ID NO: 197に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 198に示されるVL領域;
(13) SEQ ID NO: 207に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 208に示されるVL領域;
(14) SEQ ID NO: 217に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 218に示されるVL領域;
(15) SEQ ID NO: 227に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 228に示されるVL領域;
(16) SEQ ID NO: 317に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 318に示されるVL領域;
(17) SEQ ID NO: 327に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 328に示されるVL領域;
(18) SEQ ID NO: 337に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 338に示されるVL領域;
(19) SEQ ID NO: 347に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 348に示されるVL領域;
(20) SEQ ID NO: 357に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 358に示されるVL領域;
(21) SEQ ID NO: 367に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 368に示されるVL領域;
(22) SEQ ID NO: 377に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 378に示されるVL領域;
(23) SEQ ID NO: 387に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 388に示されるVL領域;
(24) SEQ ID NO: 587に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 588に示されるVL領域;
(25) SEQ ID NO: 597に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 598に示されるVL領域;
(26) SEQ ID NO: 607に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 608に示されるVL領域;
(27) SEQ ID NO: 617に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 618に示されるVL領域;
(28) SEQ ID NO: 627に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 628に示されるVL領域;
(29) SEQ ID NO: 637に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 638に示されるVL領域;
(30) SEQ ID NO: 647に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 648に示されるVL領域;
(31) SEQ ID NO: 657に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 658に示されるVL領域;
(32) SEQ ID NO: 667に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 668に示されるVL領域;
(33) SEQ ID NO: 677に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 678に示されるVL領域;
(34) SEQ ID NO: 687に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 688に示されるVL領域;
(35) SEQ ID NO: 697に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 698に示されるVL領域;
(36) SEQ ID NO: 707に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 708に示されるVL領域;
(37) SEQ ID NO: 717に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 718に示されるVL領域;
(38) SEQ ID NO: 727に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 728に示されるVL領域;
(39) SEQ ID NO: 737に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 738に示されるVL領域;
(40) SEQ ID NO: 747に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 748に示されるVL領域;
(41) SEQ ID NO: 757に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 758に示されるVL領域;
(42) SEQ ID NO: 767に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 768に示されるVL領域;
(43) SEQ ID NO: 777に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 778に示されるVL領域;
(44) SEQ ID NO: 787に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 788に示されるVL領域;
(45) SEQ ID NO: 797に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 798に示されるVL領域;
(46) SEQ ID NO: 807に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 808に示されるVL領域;
(47) SEQ ID NO: 817に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 818に示されるVL領域;
(48) SEQ ID NO: 827に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 828に示されるVL領域;
(49) SEQ ID NO: 837に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 838に示されるVL領域;
(50) SEQ ID NO: 967に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 968に示されるVL領域;
(51) SEQ ID NO: 977に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 978に示されるVL領域;
(52) SEQ ID NO: 987に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 988に示されるVL領域;ならびに
(53) SEQ ID NO: 997に示されるVH領域およびSEQ ID NO: 998に示されるVL領域
からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む。
非経口投与用の調製物は、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性/水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含む。静脈内用ビヒクルは、流体および栄養補給物、電解質補給物(例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの)等を含む。保存剤および他の添加物、例えば抗菌物質、抗酸化物質、キレート化剤、不活性ガス等もまた存在し得る。加えて、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性の担体を含み得る。本発明の組成物は、その組成物の意図されている用途に依存して、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えてさらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定されている。そのような薬剤は、胃腸管系に作用する薬物、細胞静止剤として作用する薬物、高尿酸血症(hyperurikemia)を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物(例えば、コルチコステロイド)、炎症応答を調整する薬物、循環器系に作用する薬物および/または当技術分野で公知の薬剤、例えばサイトカイン、であり得る。本発明の結合分子は、共同療法で、すなわち、別の抗癌医薬と併用して適用されることも想定されている。
形質細胞障害では、形質細胞の1つのクローンが無制限に増殖する。結果として、このクローンは、膨大な量の、Mタンパク質として公知の単一(モノクローナル)抗体を産生する。いくつかの例において、例えば、単クローン性免疫グロブリン血症の例において、産生される抗体は不完全であり、軽鎖のみまたは重鎖のみからなる。これらの異常な形質細胞およびそれらが産生する抗体は、通常、1つのタイプに限定される。好ましくは、形質細胞障害は、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性γグロブリン血症、およびくすぶり型多発性骨髄腫からなる群より選択される。
(a)BCMA、好ましくはヒトBCMAのエピトープクラスター3を含むポリペプチドで動物を免疫する工程であって、BCMAのエピトープクラスター3がSEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、工程、
(b)該抗体を得る工程、ならびに
(c)任意で、該抗体を、ヒトBCMAおよび好ましくはT細胞CD3受容体複合体に結合できる二重特異性結合分子に変換する工程
を含む方法を提供する。
好ましくは、工程(b)は、得られた抗体を以下のようにして試験することを含む:ヒトBCMAタンパク質の各エピトープクラスターがマウスBCMA抗原の各エピトープクラスターと交換されている(それによって、ヒトエピトープクラスター3がマウスエピトープクラスター3で置き換えられたヒトBCMAを含むコンストラクトが生成される;SEQ ID NO: 1011を参照のこと)場合、抗体結合の減少が起こり得る。その減少は、ヒトBCMAタンパク質の各エピトープクラスターに対する結合を100%として、ヒトBCMAタンパク質の各エピトープクラスターとの比較で、好ましくは少なくとも10%、20%、30%、40%、50%であり;より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%、95%でありまたは100%でさえある。上記のヒトBCMA/マウスBCMAキメラをCHO細胞において発現させることが想定されている。ヒトBCMA/マウスBCMAキメラを異なる膜結合タンパク質、例えばEpCAMの膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメインと融合させることも想定されている;実施例2aを参照のこと。
この、非ヒト(例えば、マウス)BCMA抗原の各エピトープクラスターとの交換に起因する結合の喪失を試験する方法は、以下の実施例、特に実施例1~3に記載されている。
この方法はさらに、抗体がヒトBCMAのエピトープクラスター3に結合し、さらにマカクBCMA、例えばマカカ・ムラタ(SEQ ID NO: 1017)またはマカカ・ファシキュラリス(SEQ ID NO: 1017)由来のBCMA、のエピトープクラスター3に結合できるかどうかを試験することを含み得る。
好ましくは、結合分子は、Xが1~100である「BCMA-(X)」で表される結合分子(付記された配列一覧表の第2列を参照のこと)由来の3つのVH CDR配列(「VH CDR1」、「VH CDR2」、「VH CDR3」と名付けられている、付記された配列一覧表の第4列を参照のこと)および/またはXが1~100であるBCMA-Xで表される結合分子(付記された配列一覧表の第2列を参照のこと)由来の3つのVL CDR配列(「VL CDR1」、「VH CDR2」、「VH CDR3」と名付けられている、付記された配列一覧表の第4列を参照のこと)を含む。
好ましくは、結合分子は、付記された配列一覧表に示されるVHおよび/またはVL配列(付記された配列一覧表の第4列を参照のこと;「VH」および「VL」)を含む。
好ましくは、結合分子は、付記された配列一覧表に示されるscFv配列(付記された配列一覧表の第4列を参照のこと;「scFv」)を含む。
好ましくは、結合分子は、付記された配列一覧表に示される二重特異性分子配列(付記された配列一覧表の第4列を参照のこと;「2特性分子」)を含む。
項目2 第1の結合ドメインがBCMAの細胞外ドメインに結合し、第2の結合ドメインがCD3のε鎖に結合する、項目1の二重特異性結合剤。
項目3 全長抗体または抗体フラグメントの形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目4 第1のBCMA結合ドメインがマウス由来であり、第2のCD3結合ドメインがラット由来である、全長抗体の形式の項目3の二重特異性結合剤。
項目5 2つのドメインが対を形成しないように同一ポリペプチド上の軽鎖可変ドメインに接続された重鎖可変ドメインを含む、ダイアボディ形態の抗体フラグメントの形式である、項目3の二重特異性結合剤。
項目6 リンカーペプチドを通じてまたはヒト血清アルブミン分子によって接続された2つのscFv分子からなる二重特異性単鎖抗体の形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目7 重鎖領域(VH)および対応する可変軽鎖領域(VL)が、N末端からC末端に向かって、
VH(BCMA)-VL(BCMA)-VH(CD3)-VL(CD3)、
VH(CD3)-VL(CD3)-VH(BCMA)-VL(BCMA)または
VH CD3)-VL(CD3)-VL(BCMA)-VH(BCMA)
の順に配列されている、項目6の二重特異性結合剤。
項目8 VHHおよびVHから選択される単一ドメイン免疫グロブリンドメインの形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目9 少なくとも1つの結合ドメインがヒトBCMAに特異的であり、少なくとも1つの結合ドメインがヒトCD3に特異的である、少なくとも2つの結合ドメインを有する4つの抗体可変ドメインを有するFv分子の形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目10 BCMAに特異的な第1の結合ドメイン、第1の結合ドメインのC末端側に配置された定常小領域、定常小領域のC末端側に配置されたサソリリンカー、および定常小領域のC末端側に配置されたCD3に特異的な第2の結合ドメイン、からなる単鎖結合分子の形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目11 抗体または抗体フラグメントの2つの重鎖/軽鎖Fvを通じてBCMAに結合しかつ該抗体または抗体フラグメントの重鎖または軽鎖の非CDRループに組み込まれる加工がなされた結合ドメインを通じてCD3に結合する抗体様分子の形式である、項目1または2の二重特異性結合剤。
項目12 二重特異性アンキリン反復分子の形式である、項目1の二重特異性結合剤。
項目13 第1の結合ドメインが項目3~12のいずれかで定義された形式から選択される形式を有し、第2の結合ドメインが項目3~12のいずれかで定義された形式から選択される異なる形式を有する、項目1の二重特異性結合剤。
項目14 2環式ペプチドである、項目1の二重特異性結合剤。
項目15 少なくとも1つの項目1~14のいずれかの二重特異性結合剤を含む、薬学的組成物。
項目16 形質細胞障害またはBCMA発現と相関する他のB細胞障害の処置のためおよび自己免疫疾患の処置のための、項目1~14のいずれかの二重特異性結合剤および項目14の薬学的組成物。
項目17 形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性γグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫から選択される形質細胞障害の処置のための、項目1~14のいずれかの二重特異性結合剤および項目15の薬学的組成物。
上記項目のバリエーションはEP 10 191 418.2から導き出すことができ、それらも本発明に含まれる。
本明細書の文書を通じて引用されているすべての刊行物および特許(すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、説明書等を含む)は、上記のものも以下のものも、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなる事項も、本発明が先行発明であることを理由としてそのような開示よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認とみなされるべきではない。参照により組み入れられる書類が本明細書と相反または矛盾する程度まで、本明細書は任意のそのような書類よりも優先される。
キメラBCMAを発現するCHO細胞の生成
キメラエピトープマッピング分子の構築のために、ヒトBCMAの各エピトープドメインのアミノ酸配列または単一のアミノ酸残基をマウス配列に変換した。以下の分子を構築した:
キメラ細胞外BCMAドメイン:エピトープクラスター1(SEQ ID NO: 1002または1007のアミノ酸残基1~7)が各々のマウスクラスター(SEQ ID NO: 1004または1008のアミノ酸残基1~4)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるアミノ酸残基1~3の欠失およびG6Qの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:エピトープクラスター2(SEQ ID NO: 1002または1007のアミノ酸残基8~21)が各々のマウスクラスター(SEQ ID NO: 1004または1008のアミノ酸残基5~18)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるS9F、Q10HおよびN11Sの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:エピトープクラスター3(SEQ ID NO: 1002または1007のアミノ酸残基24~41)が各々のマウスクラスター(SEQ ID NO: 1004または1008のアミノ酸残基21~36)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるアミノ酸残基31および32の欠失ならびにQ25H、S30N、L35AおよびR39Pの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:エピトープクラスター4(SEQ ID NO: 1002または1007のアミノ酸残基42~54)が各々のマウスクラスター(SEQ ID NO: 1004または1008のアミノ酸残基37~49)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるN42D、A43P、N47S、N53YおよびA54Tの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:SEQ ID NO: 1002または1007の22位のアミノ酸残基(イソロイシン)がSEQ ID NO: 1004または1008の各々のマウスアミノ酸残基(リジン、19位)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるI22Kの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:SEQ ID NO: 1002または1007の25位のアミノ酸残基(グルタミン)がSEQ ID NO: 1004または1008の各々のマウスアミノ酸残基(ヒスチジン、22位)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるQ25Hの変異
キメラ細胞外BCMAドメイン:SEQ ID NO: 1002または1007の39位のアミノ酸残基(アルギニン)がSEQ ID NO: 1004または1008の各々のマウスアミノ酸残基(プロリン、34位)で置き換えられたヒト細胞外BCMAドメイン
→SEQ ID NO: 1002または1007におけるR39Pの変異。
2.1 HEK293細胞における一過的発現
配列検証済みのヌクレオチド配列を有する発現プラスミドのクローンを、製造元のプロトコルにしたがうFreeStyle 293発現システム(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)におけるトランスフェクションおよびタンパク質発現のために、使用した。発現されたタンパク質を含む上清を取得し、細胞を遠心分離により除去し、そして上清を-20℃で保存した。
配列検証済みのヌクレオチド配列を有する発現プラスミドのクローンを、該コンストラクトの真核生物発現のために、DHFR欠損CHO細胞にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞における真核生物タンパク質発現は、Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566に記載されているようにして行った。コンストラクトの遺伝子増幅を、メトトレキサート(MTX)の濃度を20 nM MTXの最終濃度になるまで増加させることによって誘導した。静置培養で2回継代した後、細胞を、収集前の7日間、ヌクレオシドフリーHyQ PF CHO液体ダイズ培地(4.0 mM L-グルタミンを含み、0.1% Pluronic F-68を含む; HyClone)を含むローラーボトル中で成長させた。細胞を遠心分離によって除去し、発現されたタンパク質を含む上清を-20℃で保存した。
可溶性のBCMAタンパク質の精製は、以下のようにして行った。Akta(登録商標) エクスプローラシステム(GE Healthcare)およびUnicorn(登録商標)ソフトウェアをクロマトグラフィーに使用した。ZnCl2を充填したFractogel EMDキレート(登録商標)(Merck)を製造元の提供するプロトコルにしたがい用いて、固定化金属親和性クロマトグラフィー(「IMAC」)を行った。カラムを緩衝液A(20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、0.1M NaCl)で平衡化し、ろ過した(0.2μmの)細胞培養上清を3ml/分の流速でカラム(10ml)に適用した。未結合の試料を除去するため、カラムを緩衝液Aで洗浄した。結合したタンパク質を、以下の手順にしたがい、2段勾配の緩衝液B(20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、0.1M NaCl、0.5Mイミダゾール)を用いて溶出させた:
第1段階:6カラム容積の10%緩衝液B
第2段階:6カラム容積の100%緩衝液B。
第2段階により溶出したタンパク質画分をさらなる精製のために集めた。すべての化合物は研究グレードのものであり、Sigma(Deisenhofen)またはMerck(Darmstadt)から購入した。
ゲルろ過クロマトグラフィーは、Equi緩衝液(HEK細胞で発現させたタンパク質については10mMクエン酸塩、25mMリジン・HCl、pH7.2、CHO細胞で発現させたタンパク質についてはPBS pH7.4)で平衡化させたHiLoad 16/60 Superdex 200分取グレードカラム(GE/Amersham)において行った。溶出したタンパク質試料(流速1ml/分)を、検出のために標準的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロットに供した。タンパク質濃度は、OD280nmを用いて決定した。
HEK293細胞における一過的発現を通じて得られたタンパク質を、免疫処置に使用した。CHO細胞における安定的発現を通じて得られたタンパク質を、結合体の選択および結合の測定に使用した。
マウスscFvフラグメントのエピトープクラスタリング
ヒトもしくはマウスBCMAまたはキメラBCMA分子でトランスフェクトされた細胞を、ヒト/マカクBCMAに結合するscFvを含む粗精製未希釈ペリプラズム抽出物で染色した。結合したscFvを、1μg/mlの抗FLAG抗体(Sigma F1804)およびR-PE標識抗マウスFcγ特異的抗体(1:100; Dianova #115-116-071)で検出した。すべての抗体を、2% FCSを含むPBSで希釈した。陰性対照として、細胞を、ペリプラズム抽出物の代わりにPBS/2% FCSと共にインキュベートした。試料を、FACSCanto II機器(Becton Dickinson)におけるフローサイトメトリーによって測定し、FlowJoソフトウェア(バージョン7.6)によって分析した;図3を参照のこと。
可溶性ヒトおよびマカクBCMAの異なる組み換え形態の入手
A)ヒトおよびアカゲザルBCMAのコード配列(GenBankにおいて公開、アクセッション番号NM_001192[ヒト]、XM_001106892[アカゲザル])、ヒトアルブミン、ヒトFcγ1およびマウスアルブミンのコード配列を、ヒトおよびマカクBCMAのそれぞれならびにヒトアルブミン、ヒトIgG1 Fcおよびマウスアルブミンのそれぞれの可溶性融合タンパク質ならびにBCMAの細胞外ドメインのみを含む可溶性タンパク質をコードする人工cDNA配列の構築に使用した。可溶性ヒトおよびマカクBCMAタンパク質の発現のためのコンストラクトを生成するために、cDNAフラグメントを、標準的プロトコルにしたがう上記の全長BCMA cDNAのPCR変異誘発および分子クローニングによって取得した。
ヒトアルブミンとの融合体については、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位、その後にヒトおよびアカゲザルBCMAの細胞外ドメインに対応するそれぞれアミノ酸1~54および1~53を含む、それぞれヒトおよびアカゲザル(またはマカカ・ムラタ)BCMAタンパク質のコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly4-Ser1リンカーのコード配列、その後にインフレームでヒト血清アルブミンのコード配列、その後にインフレームでFlagタグのコード配列、その後にインフレームで修飾ヒスチジンタグ
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
マウスIgG1との融合体については、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位、その後にヒトおよびアカゲザルBCMAの細胞外ドメインに対応するそれぞれアミノ酸1~54および1~53を含む、それぞれヒトおよびマカクBCMAタンパク質のコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly4-Ser1リンカーのコード配列、その後にインフレームでヒトIgG1のヒンジおよびFcγ部分のコード配列、その後にインフレームでヘキサヒスチジンタグのコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
可溶性細胞外ドメインコンストラクトについては、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位、その後にヒトおよびアカゲザルBCMAの細胞外ドメインに対応するそれぞれアミノ酸1~54および1~53を含む、それぞれヒトおよびマカクBCMAタンパク質のコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly1リンカーのコード配列、その後にインフレームでFlagタグのコード配列、その後にインフレームで修飾ヒスチジンタグ
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
cDNAフラグメントをまた、フラグメントの最初および最後に制限部位を導入するよう設計した。導入された制限部位である5'末端のEcoRIおよび3'末端のSalIを、以下のクローニング手順で使用した。cDNAフラグメントを、EcoRIおよびSalIを通じてpEF-DHFRと呼ばれるプラスミドにクローニングした(pEF-DHFRは、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150に記載されている)。上記の手順はすべて、標準的なプロトコル(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))にしたがい行った。
アルブミンとの融合体については、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位および19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、その後にインフレームでそれぞれのBCMAタンパク質の細胞外ドメインのコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly4-Ser1リンカーのコード配列、その後にインフレームでそれぞれの血清アルブミンのコード配列、その後にインフレームでFlagタグのコード配列、その後にインフレームで修飾ヒスチジンタグ
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
IgG Fcとの融合体については、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位および19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、その後にインフレームでそれぞれのBCMAタンパク質の細胞外ドメインのコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly4-Ser1リンカーのコード配列、ただしヒトIgG1 Fcの場合は人工Ser1-Gly1リンカーを使用、その後にインフレームでそれぞれのIgGのヒンジおよびFcγ部分のコード配列、その後にインフレームでFlagタグのコード配列、その後にインフレームで修飾ヒスチジンタグ
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
可溶性細胞外ドメインコンストラクトについては、最初にコンストラクトの真核生物発現のためのKozak部位および19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、その後にインフレームでそれぞれのBCMAタンパク質の細胞外ドメインのコード配列、その後にインフレームで人工Ser1-Gly1リンカーのコード配列、その後にインフレームでFlagタグのコード配列、その後にインフレームで修飾ヒスチジンタグ
のコード配列および停止コドンを含むよう、修飾cDNAフラグメントを設計した。
コンストラクトのクローニングのために、適当な制限部位を導入した。cDNAフラグメントはすべて、pEF-DHFRと呼ばれるプラスミドにクローニングした(pEF-DHFRは、Raum et al. 2001に記載されている)。上記の手順はすべて、標準的なプロトコル(Sambrook, 2001)にしたがい行った。
以下のコンストラクトは、別々のエピトープに対して向けられたパンニングが可能なように設計した。マウス・ヒトBCMAキメラのおよびマウス・マカクBCMAキメラのコード配列(マウス、ヒトおよびマカクBCMAの配列は上記の通り)ならびにマウスアルブミンおよびマウスFcγ1のコード配列を、マウス・ヒトおよびマウス・マカクBCMAキメラのそれぞれならびにマウスIgG1 Fcおよびマウスアルブミンのそれぞれの可溶性融合タンパク質をコードする人工cDNA配列の構築に使用した。可溶性マウス・ヒトおよびマウス・マカクBCMAキメラの発現のためのコンストラクトを生成するため、そのヒトおよびマカク配列のそれぞれに対して変異が加えられたそれぞれのエピトープドメインを含むマウスBCMA(アミノ酸1~49)のcDNAフラグメントを、標準的なプロトコルにしたがう遺伝子合成によって得た。コンストラクトのクローニングを上記のようにしておよび標準的なプロトコル(Sambrook, 2001)にしたがい行った。
以下の分子を構築した:
・アミノ酸1~4ヒト、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸1~4ヒト、マウスアルブミン
・アミノ酸1~4アカゲザル、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸1~4アカゲザル、マウスアルブミン
・アミノ酸5~18ヒト、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸5~18ヒト、マウスアルブミン
・アミノ酸5~18アカゲザル、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸5~18アカゲザル、マウスアルブミン
・アミノ酸37~49ヒト、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸37~49ヒト、マウスアルブミン
・アミノ酸37~49アカゲザル、マウスIgG1 Fc
・アミノ酸37~49アカゲザル、マウスアルブミン
5.1 ヒトおよびマカクBCMAおよびCD3に対する二重特異性抗体の親和性のBiacoreベースの決定
BCMAに対する標的結合を決定するため、ヒト血清アルブミン(ALB)を含む組み換えBCMA融合タンパク質を用いてBiacore分析実験を行った。CD3に対する親和性の測定のために、ヒト抗体Fc部分に融合されたCD3イプシロン(CD3e)のN末端27アミノ酸を有する組み換え融合タンパク質を使用した。この組み換えタンパク質は、ヒトCD3e 1-27版およびカニクイザルCD3e版があり、どちらも二重特異性抗体のCD3結合部分のエピトープを保有している。
詳細を述べると、CM5センサーチップ(GE Healthcare)に、製造元のマニュアルにしたがい酢酸緩衝液pH4.5を用いておよそ100~150RUの各組み換え抗原を固定化した。二重特異性抗体試料を、HBS-EP泳動緩衝液(GE Healthcare)で希釈した5つの濃度:50nM、25nM、12.5nM、6.25nMおよび3.13nMで充填した。流速は、30~35μl/分で3分間であり、その後にHBS-EP泳動緩衝液を、再度30~35μl/mlの流速で8分間適用した。チップの再生は、10mMグリシン 0.5M NaCl pH2.45を用いて行った。データセットを、BiaEvalソフトウェアを用いて分析した(図4を参照のこと)。通常、2回の独立した実験を行った。
ヒトおよびマカクBCMAに対するBCMA/CD3 二重特異性抗体の結合親和性を、マウスアルブミン(ALB)を含む組み換えBCMA融合タンパク質を用いたBiacore分析によって決定した。
CM5チップ上の組み換え可溶性BCMAに対するBCMA/CD3 二重特異性抗体の親和性のBiacore測定を、より長い解離期間(以前の実験で使用した10分間に代えて60分間)を使用してKDおよび特にオフレートを再確認するために繰り返した。試験したBCMA/CD3 二重特異性抗体のすべてについて、各々5つの異なる濃度を用いる2回の独立した親和性測定を行った。
二重特異性結合および種間交差反応性
ヒトおよびマカクBCMAおよびCD3への結合を確認するため、二重特異性抗体を、ヒトおよびマカクBCMAのそれぞれでトランスフェクトしたCHO細胞、ネイティブのヒトBCMAを発現するヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929、CD3発現ヒトT細胞白血病細胞株HPB-ALL(DSMZ, Braunschweig, ACC483)およびCD3発現マカクT細胞株4119LnPx(Knappe A, et al., Blood, 2000, 95, 3256-3261)を用いたフローサイトメトリーによって試験した。さらに、未トランスフェクトCHO細胞を陰性対照として使用した。
ヒトおよびマカクBCMAに対する二重特異性抗体の親和性のScatchardベースの決定
Scatchard分析では、各々の細胞株に対する二重特異性抗体の1価結合を正確に決定するため、Micrometが開発した1価検出システム(抗His Fab/Alexa 488)を用いて飽和結合実験を行う。
それぞれの細胞株(ヒトBCMAを組換え発現するCHO細胞株、マカクBCMAを組換え発現するCHO細胞株)2 x 104細胞を、100nMから始まるそれぞれのBCMA 二重特異性抗体の3連の希釈シリーズ(1:2の8段階希釈)各50μlと共にインキュベートし、その後に撹拌しながら4℃で16時間インキュベートし、1回の残留物の洗浄工程を行う。次に、細胞を30μlの抗His Fab/Alexa488溶液(Micromet;30μg/ml)と共にさらに30分間インキュベートする。1回の洗浄工程の後、細胞を、3.5%ホルムアルデヒドを含む150μlのFACS緩衝液に再懸濁し、さらに15分間インキュベートし、遠心分離し、FACS緩衝液に再懸濁し、そしてFACS CantoII機およびFACS Divaソフトウェアを用いて分析する。データは、2回の独立した実験セットから得る。値を、双曲線の結合曲線としてプロットする。それぞれのScatchard分析から最大結合(Bmax)を推定する計算を行う。それぞれのKDを反映する最大半量結合(half-maximal binding)時の二重特異性抗体の濃度を決定する。3連の測定の値を双曲線としてプロットする。最大結合を、Scatchard評価を用いて決定し、それぞれのKDを計算する。
細胞毒性活性
8.1 刺激されたヒトT細胞を用いたクロム放出アッセイ
CD8+T細胞について濃縮され刺激されたT細胞を、以下のようにして得た。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(OKT3、Orthoclone)を用いて、37℃で1時間コーティングした。未結合のタンパク質を、PBSを用いた1回の洗浄工程により除去した。安定化型グルタミン/10% FCS/IL-2 20 U/ml(Proleukin(登録商標)、Chiron)を含む120mlのRPMI 1640中3~5 x 107個のヒトPBMCを、プレコートしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に、細胞を回収し、RPMI 1640で1回洗浄した。IL-2を最終濃度20 U/mlとなるよう添加し、そして細胞を再度、上記と同じ細胞培養培地中で1日培養した。
CD8+細胞毒性Tリンパ球(CTL)を、Dynal-Beadsを製造元のプロトコルにしたがい用いてCD4+T細胞およびCD56+NK細胞を枯渇させることにより、濃縮した。
マカクまたはヒトBCMAトランスフェクトCHO標的細胞をPBSで2回洗浄し、そして50% FCSを含む最終容積100μlのRPMI中11.1 MBqの51Crを用いて37℃で60分間標識した。その後、標識された標的細胞を5ml RPMIで3回洗浄し、その後これを細胞毒性アッセイに使用した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、総容積200μlの補充されたRPMI中、10:1のE:T比で行った。出発濃度0.01~1μg/mlの精製された二重特異性抗体およびその3倍希釈物を使用した。アッセイにおけるインキュベート時間は、18時間であった。細胞毒性は、最大溶解(Triton-Xの添加)と自然溶解(エフェクター細胞なし)の差に対する上清中に放出されたクロムの相対値として決定した。すべての測定を4連で行った。上清中のクロム活性の測定は、Wizard 3''γカウンター(Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany)において行った。結果の分析は、Windows版Prism 5(バージョン5.0、GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA)を用いて行った。分析プログラムによってシグモイド用量応答曲線から計算されたEC50値を、細胞毒性活性の比較に使用した(図5を参照のこと)。
BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞としてヒトBCMAでトランスフェクトされたCHO細胞を、エフェクター細胞として刺激され濃縮されたヒトCD8 T細胞を用いた、51クロム(51Cr)放出細胞毒性アッセイにおいて分析した。この実験は、実施例8.1に記載されるようにして行った。
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、血液バンクが輸血のために回収した血液の副産物である濃縮リンパ球調製物(軟膜)からFicoll密度勾配遠心分離によって調製した。軟膜は、国内の血液バンクによって提供され、PBMCを、血液回収と同日に調製した。Ficoll密度遠心分離およびDulbecco PBS(Gibco)による十分な洗浄の後、残った赤血球を、赤血球溶解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)とのインキュベーションを通じてPBMCから除去した。血小板は、PBMCの100 x gでの遠心分離により上清を通じて除去した。残ったリンパ球は、主としてBおよびTリンパ球、NK細胞および単球を含んでいる。PBMCを、10% FCS(Gibco)を含むRPMI培地(Gibco)中、37℃/5% CO2下の培養により維持した。
CD14+細胞を枯渇させるために、ヒトCD14マイクロビーズ(Milteny Biotec、MACS、#130-050-201)を使用し、NK細胞を枯渇させるために、ヒトCD56マイクロビーズ(MACS、#130-050-401)を使用した。PBMCをカウントし、室温で10分間、300 x gで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをMACS単離緩衝液[80μL/107細胞;PBS(Invitrogen、#20012-043)、0.5% (v/v) FBS(Gibco、#10270-106)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich、#E-6511)]に再懸濁した。CD14マイクロビーズおよびCD56マイクロビーズ(20μL/107細胞)を添加し、4~8℃で15分間インキュベートした。細胞をMACS単離緩衝液(1~2mL/107細胞)で洗浄した。遠心分離後(上記を参照のこと)、上清を廃棄し、細胞をMACS単離緩衝液(500μL/108細胞)に再懸濁した。次に、CD14/CD56陰性細胞を、LSカラム(Miltenyi Biotec、#130-042-401)を用いて単離した。CD14+/CD56+細胞を含まないPBMCを、必要となるまで、37℃のインキュベーターにおいて、RPMI完全培地、すなわち10% FBS(Biochrom AG、#S0115)、1 x 非必須アミノ酸(Biochrom AG、#K0293)、10mM Hepes緩衝液(Biochrom AG、#L1613)、1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG、#L0473)および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン(Biochrom AG、#A2213)を補充したRPMI1640(Biochrom AG、#FG1215)中で培養した。
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素DiOC18(DiO)(Molecular Probes、#V22886)を使用して、標的細胞としてのヒトBCMAまたはマカクBCMAトランスフェクトCHO細胞を標識し、それらをエフェクター細胞から区別できるようにした。簡潔に説明すると、細胞を収集し、PBSで1回洗浄し、そして2% (v/v) FBSおよび膜色素DiO(5μL/106細胞)を含むPBSで106細胞/mLに調節した。37℃で3分間のインキュベートの後、細胞を完全RPMI培地で2回洗浄し、そして細胞数を1.25 x 105細胞/mLに調節した。細胞の生存性を、0.5% (v/v)等張性EosinG溶液(Roth、#45380)を用いて決定した。
このアッセイは、BCMA 二重特異性抗体の連続希釈物の存在下でのマカクまたはヒトBCMAトランスフェクトCHO細胞の溶解を定量するよう設計した。
等量のDiO標識標的細胞およびエフェクター細胞(すなわち、CD14+細胞を含まないPBMC)を混合し、E:T細胞比を10:1にした。この懸濁物160μLを96ウェルプレートの各ウェルに移した。40μLの、BCMA 二重特異性抗体の連続希釈物および陰性対照二重特異性(無関係の標的抗原を認識するCD3ベースの二重特異性抗体)または追加の陰性対照としてのRPMI完全培地を添加した。二重特異性抗体媒介細胞毒性反応は、7% CO2加湿インキュベーター内で48時間進行させた。次いで、細胞を新しい96ウェルプレートに移し、標的細胞の膜完全性の喪失を、最終濃度1μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)の添加によってモニタリングした。PIは、通常生きた細胞から排除される膜不透過性の色素であるが、死滅した細胞はそれを取り込み、蛍光放射によって同定可能になる。
標的細胞を、DiO陽性細胞として同定した。PI陰性標的細胞を、生きている標的細胞に分類した。細胞毒性の百分率は、次式:
にしたがって計算した。
BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞としてヒトBCMAでトランスフェクトされたCHO細胞を、エフェクター細胞として未刺激のヒトPBMCを用いた、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて分析した。このアッセイを上記のようにして行った(実施例8.3)。
9.1 BAFF受容体との交差反応の排除
フローサイトメトリーのために、それぞれの細胞株200,000細胞を5μg/mlの濃度の精製された二重特異性抗体50μlと共に氷上で30分間インキュベートした。細胞を、2% FCSを含むPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合をマウスPentaHis抗体(Qiagen;2% FCSを含む50μlのPBSで1:20希釈)で検出した。洗浄後、結合したPentaHis抗体を、2% FCSを含むPBSで1:100希釈された、フィコエリトリンにコンジュゲートされたFcγ特異的抗体(Dianova)で検出した。試料をFACSCanto II機器におけるフローサイトメトリーによって測定し、FACSDivaソフトウェアによって分析した(両方ともBecton Dickinson製)。二重特異性結合体は、BAFF受容体と交差反応性でないことを示した。
ヒトBAFF-RおよびTACIへの結合の排除のために、BCMA/CD3 二重特異性抗体を、ヒトBAFF-RおよびTACIのそれぞれでトランスフェクトされたCHO細胞を用いたフローサイトメトリーによって試験した。さらに、L363多発性骨髄腫細胞を、ヒトBCMAへの結合の陽性対照として使用した。CHO細胞におけるBAFF-RおよびTACI抗原の発現を、2つの陽性対照抗体によって確認した。フローサイトメトリーは、上記実施例に記載されたようにして行った。
細胞毒性活性
エフェクターT細胞をBCMA発現標的細胞に対してリダイレクトするヒト様BCMA 二重特異性抗体の効力を、5つの追加のインビトロ細胞毒性アッセイにおいて分析する:
1. 刺激されたヒトエフェクターT細胞をBCMA陽性(ヒト)腫瘍細胞株に対してリダイレクトするBCMA 二重特異性抗体の効力を、51クロム放出アッセイにおいて測定する。
2. 未刺激のヒトPBMC中のT細胞をヒトBCMAトランスフェクトCHO細胞に対してリダイレクトするBCMA 二重特異性抗体の効力を、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて測定する。
3. 未刺激のヒトPBMC中のT細胞をBCMA陽性(ヒト)腫瘍細胞株に対してリダイレクトするBCMA 二重特異性抗体の効力を、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて測定する。
4. 交差反応性のBCMA 二重特異性抗体がマカクT細胞をマカクBCMAトランスフェクトCHO細胞に対してリダイレクトできることを確認するため、エフェクターT細胞としてマカクT細胞株を用いてFACSベースの細胞毒性アッセイを行う。
5. 単量体形態および2量体形態のBCMA 二重特異性抗体の間の効力ギャップを、標的細胞としてヒトBCMAトランスフェクトCHO細胞を、エフェクター細胞として刺激されたヒトT細胞を用いる、51クロム放出アッセイにおいて決定する。
BCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株L363に対する刺激されたヒトT細胞
BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞源としてBCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株L363(DSMZ No.ACC49)を、エフェクター細胞として刺激され濃縮されたヒトCD8 T細胞を用いた、51クロム(51Cr)放出細胞毒性アッセイにおいて分析した。アッセイは、実施例8.1に記載されるようにして行った。
BCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株L363に対する未刺激のヒトPBMC
BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞源として、すべての試験した標的T細胞株の中で最も弱いネイティブBCMAの表面発現を示した、BCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株L363(DSMZ、ACC49)を、エフェクター細胞として未刺激のヒトPBMCを用いた、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいてさらに分析した。アッセイは、上記(実施例8.3)のようにして行った。
BCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929に対する未刺激のヒトPBMC
BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞源としてBCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929(ATCC CRL-9068)を、エフェクター細胞として未刺激のヒトPBMCを用いた、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて分析した。アッセイは、上記(実施例8.3)のようにして行った。
マカクBCMA発現標的細胞に対するマカクT細胞
最後に、BCMA/CD3 二重特異性抗体の細胞毒性活性を、標的細胞としてマカクBCMAでトランスフェクトされたCHO細胞を、エフェクター細胞源としてマカクT細胞株を用いた、FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて分析した。
BCMA/CD3 二重特異性抗体の単量体と2量体の間の効力ギャップ
個々のBCMA/CD3 二重特異性抗体の単量体と2量体のアイソフォーム間の細胞毒性活性の差(これを効力ギャップと称する)を決定するために、上記(実施例8.1)のような51クロム放出細胞毒性アッセイを、精製されたBCMA/CD3 二重特異性抗体の単量体および2量体を用いて行った。効力ギャップは、二重特異性抗体の単量体と2量体のEC50値の間の比として計算した。試験したエピトープクラスターE3のBCMA/CD3 二重特異性抗体の効力ギャップは、0.03~1.2の間であった。したがって2量体がそのそれぞれの単量体と比較して有意に高い活性であるということはない。
3回の凍結/解凍サイクル後の単量体から2量体への変換
二重特異性BCMA/CD3抗体の単量体を3回の凍結/解凍サイクルに供し、その後に高速SECを行って、抗体の2量体に変換された当初単量体であった抗体の百分率を決定した。
熱安定性
BCMA/CD3 二重特異性抗体に固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するため、融解温度曲線を示差走査熱量測定(DSC)により決定した。これらの実験は、MicroCal LLC(Northampton, MA, U.S.A)VP-DSCデバイスを用いて行った。BCMA/CD3 二重特異性抗体を含む試料のエネルギー取り込みを、抗体の処方緩衝液のみを含む試料との比較で、20℃から90℃まで記録した。
フローサイトメトリーによる血漿の干渉の排除
BCMA/CD3 二重特異性抗体とヒト血漿タンパク質の潜在的な相互作用を決定するため、血漿干渉試験を構築した。この目的で、10μg/mlのそれぞれのBCMA/CD3 二重特異性抗体を、37℃で1時間、90%ヒト血漿中でインキュベートした。その後に、ヒトBCMA発現CHO細胞に対する結合をフローサイトメトリーによって決定した。
(PBS試料のシグナル/検出試薬なしのシグナル)/(血漿試料のシグナル/検出試薬なしのシグナル)。
ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるBCMA/CD3 二重特異性抗体の治療効能
研究第1日目に、5 x 106細胞のヒト癌細胞株NCI-H929を、メスNOD/SCIDマウスの右背側面に皮下注射した。
標的陰性細胞の溶解の排除
インビトロ溶解アッセイを、エフェクター 対 標的細胞比5:1のBCMA陽性ヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929および精製されたT細胞を用いて、24時間のインキュベート時間で行った。エピトープクラスターE3のBCMA/CD3 二重特異性抗体(BCMA-34およびBCMA-98)は、NCI-H929の溶解に関して高い効力および効能を示した。しかし、BCMA陰性細胞株HL60(AML/骨髄芽球形態)、MES-SA(子宮肉腫、線維芽細胞形態)およびSNU-16(胃癌、上皮形態)では、最大500nMのそれぞれの抗体で溶解が検出されなかった。
異なるPBMCサブセットのT細胞活性化の誘導
FACSベースの細胞毒性アッセイ(48h; E:T = 10:1)を、標的細胞としてヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929、L-363およびOPM-2を、エフェクター細胞としてヒトPBMCの異なるサブセット(CD4+/CD8+/CD25+/CD69+)を用いて行った。結果(表13を参照のこと)は、EC50値によって測定された活性化の程度が、分析された異なるPBMCサブセットで本質的に同じ範囲内であることを示している。
サイトカイン放出の誘導
FACSベースの細胞毒性アッセイ(48h; E:T = 10:1)を、標的細胞としてヒト多発性骨髄腫細胞株NCI-H929、L-363およびOPM-2を、エフェクター細胞としてヒトPBMCを用いて行った。サイトカイン放出のレベル[pg/ml]を、漸増濃度のエピトープクラスターE3のBCMA/CD3 二重特異性抗体の下で決定した。以下のサイトカインを分析した:Il-2、IL-6、IL-10、TNFおよびIFN-γ。結果が表14および図17に示されている。
Claims (23)
- 第2の結合ドメインが、CD3イプシロンに結合できる、請求項1または2記載の結合分子。
- 第2の結合ドメインが、ヒトCD3およびマカクCD3に結合できる、請求項1~3のいずれか一項記載の結合分子。
- (scFv)2、(単一ドメインmAb)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディまたはこれらのオリゴマーからなる群より選択される、請求項1に記載の結合分子。
- ポリペプチドである、請求項1~5のいずれか一項に記載の結合分子。
- 抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される1以上を含む、請求項1に記載の結合分子。
- 抗体が、Fabフラグメント、F(ab')2、Fv、scFvフラグメントまたは単一ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディ(diabodies)、Dual-Affinity Re-Targeting(DART)抗体、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ、ミニボディ、Fc DART抗体、IgG DART抗体、およびマルチボディからなる群から選択される1以上を含む、請求項1または7に記載の結合分子。
- 親和性成熟抗体である、請求項1、7、および8のいずれか一項に記載の結合分子。
- BCMAのエピトープクラスター3への結合が、非ヒトBCMAの対応するエピトープクラスターへの交換またはアラニンスキャンにより試験される、請求項1~9のいずれか一項に記載の結合分子。
- 350またはそれ未満、好ましくは320またはそれ未満のEC50(pg/ml)によって特徴づけられ、ここでEC50は、BCMAを発現する標的細胞およびエフェクター細胞として抹消血単核細胞(PBMC)を用いた細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定されるものである、請求項1~10のいずれか一項に記載の結合分子。
- BCMAを発現する標的細胞およびエフェクター細胞として抹消血単核細胞(PBMC)を用いた細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて、配列番号830、配列番号620、配列番号50、配列番号980、配列番号710、配列番号340、配列番号740または配列番号200で表されるBCMA/CD3二重特異性結合分子のいずれか一つのEC50(pg/ml)と等しいEC50(pg/ml)によって特徴づけられる、請求項1~11のいずれか一項に記載の結合分子。
- 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子をコードする、核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項13に記載の核酸分子または請求項14に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
- 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子の発現を可能にする条件下で請求項15に記載の宿主細胞を培養する工程、および、産生された結合分子を培養物から回収する工程を含む、請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子の製造プロセス。
- 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子または請求項16に記載のプロセスによって製造された結合分子を含む、薬学的組成物。
- 形質細胞障害、BCMA発現と相関する他のB細胞障害、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防、処置または寛解において使用するための薬学組成物であって、請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子または請求項16に記載のプロセスによって製造された結合分子を含む、薬学組成物。
- 形質細胞障害、BCMA発現と相関する他のB細胞障害、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の処置または寛解のための、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 形質細胞障害が、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性γグロブリン血症、およびくすぶり型多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項19に記載の薬学的組成物。
- 自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項19に記載の薬学的組成物。
- 請求項1~12のいずれか一項記載の結合分子、請求項13に記載の核酸分子、請求項14に記載のベクター、および/または請求項15に記載の宿主細胞を含む、キット。
- 請求項1に記載の結合分子の生成のためのBCMAのエピトープクラスター3の使用であって、結合分子がBCMAに結合でき、BCMAのエピトープクラスター3がSEQ ID NO: 1002に示される配列のアミノ酸残基24~41に対応する、使用。
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