ES2751996T3 - Moléculas de unión para BCMA y CD3 - Google Patents

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Barbara Hebeis
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Abstract

Una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en donde (a) el primer dominio de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC); y (b) el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y en donde el grupo de epítopos 3 del BCMA corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 1002, y en donde dicha molécula de unión es un polipéptido.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión para BCMA y CD3
La presente invención se refiere a una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en donde el primer dominio de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 de BCMA, y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3. Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de unión, un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico y una célula hospedante transformada o transfectada con dicho vector. Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de la molécula de unión de la invención, un uso médico de dicha molécula de unión y un kit que comprende dicha molécula de unión.
El BCMA (antígeno de maduración de células B, TNFRSF17, CD269) es una proteína transmembrana que pertenece a la superfamilia de receptores de TNF. El BCMA se describió originalmente como una proteína de membrana integral en el aparato de Golgi de linfocitos B maduros humanos, es decir, como una proteína intracelular (Gras et al., (1995) International Immunol 7 (7): 1093-1105) que muestra que parece que el BCMA tienen una función importante durante el desarrollo de células B y la homeostasia. El hallazgo de Gras et al. podría estar asociado con el hecho de que la proteína BCMA que se describió en Gras et al. debido a una translocación cromosómica es una proteína de fusión entre BCMA e IL-2. Sin embargo, por el momento el BCMA se establece como un marcador de células B que es esencial para el desarrollo de células B y la homeostasia (Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111 -2114) debido a su supuesta interacción esencial con sus ligandos BAFF (factor activador de células B), denominado también TALL-1 o TNFSF13B, y APRIL (ligando inductor de proliferación A).
La expresión de BCMA está restringida al linaje de células B y está presente principalmente en células plasmáticas y plasmablastos y, en cierta medida, en células B de memoria, pero prácticamente ausente en células B periféricas e indiferenciadas. El BCMA también se expresa en células de mieloma múltiple (MM). Junto con los miembros de su familia, el activador de transmembrana y el interaccionador de ligando de ciclofilina (TACI) y el factor de activación de células B del receptor de la familia de TNF (BAFF-R), el BCMA regula diferentes aspectos de la inmunidad humoral, desarrollo de células B y homeostasia. La expresión de BCMA aparece bastante tarde en la diferenciación de células B y contribuye a la supervivencia a largo plazo de los plasmablastos y células plasmáticas en la médula ósea. La eliminación dirigida del gen de BCMA en ratones no afecta a la generación de células B maduras, la calidad y magnitud de las respuestas inmunitarias humorales, formación del centro germinal y generación de células plasmáticas de vida corta. Sin embargo, dichos ratones tienen un número significativamente reducido de células plasmáticas de larga vida en la médula ósea, lo que indica la importancia del BCMA para su supervivencia (O'Connor et al., 2004).
En línea con este descubrimiento, el BCMA también mantiene el crecimiento y la supervivencia de las células de mieloma múltiple (MM). Novak et al. encontraron que las líneas celulares de MM y las células de MM recién aisladas expresan las proteínas BCMA y TACI en sus superficies celulares y tienen una expresión variable de la proteína bAf F-R en su superficie celular (Novak et al., (2004) Blood 103 (2): 689-694).
El mieloma múltiple (MM) es la segunda neoplasia hematológica más común y constituye el 2% de todas las muertes por cáncer. El MM es una enfermedad heterogénea y causada principalmente por translocaciones cromosómicas, entre otras t(11 ;14),t(4;14),t(8;14),del(13),del(17) (Drach et al., (1998) Blood 92(3):802-809; Gertz et al., (2005) Blood 106(8):2837-2840; Facon et al., (2001) Blood 97(6):1566-1571). Los pacientes afectados por MM pueden experimentar una variedad de síntomas relacionados con la enfermedad debido a la infiltración de médula ósea, destrucción ósea, insuficiencia renal, inmunodeficiencia y la carga psicosocial de un diagnóstico de cáncer. Desde 2006, la tasa de supervivencia relativa a 5 años para el MM era aproximadamente 34%, lo que destaca que el MM es una enfermedad difícil de tratar donde actualmente no hay opciones curativas.
Nuevas y apasionantes terapias como la quimioterapia y los enfoques de trasplante de citoblastos están disponibles y tienen mejores tasas de supervivencia, pero a menudo llevan efectos secundarios no deseados, y por lo tanto, el MM sigue siendo incurable (Lee et al., (2004) J Natl Compr Canc Netw 8 (4): 379-383). Hasta la fecha, las dos opciones de tratamiento usadas con más frecuencia para pacientes con mieloma múltiple son combinaciones de esteroides, talidomida, lenalidomida, bortezomib o varios agentes citotóxicos, y para pacientes más jóvenes, conceptos de quimioterapia de dosis altas con trasplante autólogo de células madre.
La mayoría de los trasplantes son del tipo autólogo, es decir, que usan las propias células del paciente. Dichos trasplantes, aunque no son curativos, han mostrado prolongar la vida en pacientes seleccionados. Se pueden realizar como terapia inicial en pacientes recién diagnosticados o en el momento de la recaída. A veces, en pacientes seleccionados, se puede recomendar más de un trasplante para controlar adecuadamente la enfermedad.
Los agentes quimioterapéuticos usados para tratar la enfermedad son ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y melfalán, terapias de combinación con agentes inmunomoduladores tales como talidomida (Thalomid®), lenalidomida (Revlimid®), bortezomib (Velcade®) y corticosteroides (p. ej., dexametasona) han surgido como opciones importantes para el tratamiento del mieloma, tanto en pacientes recién diagnosticados como en pacientes con enfermedad avanzada en los que la quimioterapia o el trasplante han fallado.
Las terap ias actualm ente usadas norm alm ente no son curativas. El trasplante de citob lastos puede no ser una opción para m uchos pacientes debido a la edad avanzada, la presencia de otra enferm edad grave u otras lim itaciones físicas. La qu im io terap ia solo contro la parcia lm ente el m ielom a m últiple, rara vez conduce a una rem isión com pleta. P o r lo tanto, existe una necesidad urgente de tratam ientos nuevos e innovadores.
Bellucci et al. (Blood, 2005; 105 (10) identificaron anticuerpos específicos de BCMA en pacientes con m ielom a m últiple después de haber recibido infusiones de linfocitos de donantes (DLI). El suero de estos pacientes era capaz de m ediar la lisis ce lu la r específica de BCMA por ADCC y CDC y se detectó únicam ente en pacientes con respuestas antitum ora les (4/9), pero no en pacientes que no respondían (0/6). Los autores especulan que la inducción de anticuerpos específicos de BCMA contribuye a la e lim inación de células de m ielom a y a la rem isión a largo plazo de los pacientes.
Ryan et al. (Mol. Cáncer Ther. 2007; 6 (11) describ ieron la generación de un anticuerpo específico de BCMA antagonista que previene la activación de NF-kB que está asociado con una potente ruta de señalización pro­ supervivencia en células B norm ales y m alignas. Adem ás, el anticuerpo confería una potente citotoxicidad celu lar dependiente de anticuerpos (ADCC) a m últip les líneas celu lares de m ielom a in vitro, lo cual era s ignificativam ente m ejorado por la m odificación genética de Fc.
La publicación internacional W O 2009/132058 proporciona un ensayo de diagnóstico para m edir los niveles de BCMA en la superfic ie de células B. Tam bién describe los anticuerpos biespecíficos d irig idos contra m arcadores de células B y m oléculas receptoras de células T.
O tros enfoques en la lucha contra tum ores transm itidos por la sangre o trastornos autoinm unitarios se centran en la interacción entre BAFF y APRIL, es decir, ligandos de la superfam ilia de ligandos TNF, y sus receptores TACI, BAFF-R y BCMA que son activados por BAFF y/o APRIL. Por ejem plo, al fus ionar el dom inio Fc de la inm unoglobulina hum ana con TACI, Zym ogenetics, Inc. ha generado A tacicept (TACI-Ig) para neutra lizar ambos ligandos y preven ir la activación del receptor. A tacicept se encuentra actualm ente en ensayos clín icos para el tratam iento del lupus eritem atoso sistém ico (LES, fase III), esclerosis múltiple (EM, fase II) y artritis reum atoide (AR, fase II), así com o en ensayos clínicos de fase I para el tratam iento de neoplasias malignas de células B leucem ia linfocítica crón ica (CLL), linfom a no Hodgkin (NHL) y MM. En estudios preclínicos, atacicept reduce el crecim iento y la supervivencia de las células de MM prim arias y líneas celulares de MM in vitro (M oreaux et al., Blood, 2004, 103) e in vivo (Yaccoby et al., Leukemia, 2008, 22, 406-13), lo que dem uestra la relevancia de los ligandos de TACI para las células de m M. Puesto que la m ayoría de las células de MM y las líneas celu lares derivadas expresan BCMA y TACI, am bos receptores pueden contribu ir al crecim iento y la supervivencia m ediados por ligandos. Estos datos sugieren que antagonizar BCMA y TACI podría ser beneficioso en el tratam iento de los trastornos de células plasm áticas.
Adem ás, se han descrito anticuerpos específicos de BCMA que tienen reacción cruzada con TACI (docum ento W O 02/066516).
Human G enom a Sciences y G laxoSm ithK line han desarro llado un anticuerpo que se dirige a BAFF que se llama Belim um ab. Belim um ab bloquea la unión de BAFF soluble a sus receptores BAFF-R, BCMA y TACI en las células B. Belim um ab no se une a las células B directam ente, pero al unirse a BAFF, belim um ab inhibe la supervivencia de las células B, incluyendo las células B autorreactivas, y reduce la diferenciación de las células B en células plasm áticas productoras de inm unoglobulinas.
Sin em bargo, a pesar del hecho de que BCMA; BAFF-R y TACI, es decir, receptores de células B que pertenecen a la superfam ilia de receptores de TNF, y sus ligandos BAFF y APRIL están sujetos a terap ias para luchar contra el cáncer y/o trastornos autoinm unitarios, todavía existe la necesidad de tener d isponib les otras opciones para el tratam iento de dichas afecciones médicas.
Por consiguiente, se proporcionan a continuación m edios y m étodos para la solución de este problem a en form a de una m olécula de unión que es al menos biespecífica con un dom inio de unión a células citotóxicas, es decir, células T citotóxicas, y con un segundo dom in io de unión a BCMA.
Por lo tanto, en un prim er aspecto, la presente invención proporciona una m olécula de unión que es al menos biespecífica, que com prende un prim er y un segundo dom inio de unión, en donde
(a) el prim er dom in io de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 de BCMA (CQ LRCSSNTPPLTCQ RYC) (SEQ ID NO: 1016); y
(b) el segundo dom inio de unión es capaz de unirse a CD3; y
en donde el grupo de epítopos 3 de BCMA corresponde a los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia com o se representa en la S e Q ID NO: 1002.
Debe indicarse que, com o se usa en la presente m emoria, las form as singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias en plural a m enos que el contexto indique claram ente lo contrario. Así, por ejem plo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que se podrían modificar o sustituir por los métodos descritos en la presente memoria.
A menos que se indique lo contrario, la expresión "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando solo experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por la presente invención. El término "y/o" siempre que se usa en la presente memoria incluye el significado de "y", "o" y "todas o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".
El término "aproximadamente" o "aproximado" como se usa en el presente documento significa dentro de ±20%, preferiblemente dentro de ±15%, más preferiblemente dentro de ±10%, y lo más preferiblemente dentro de ±5% de un valor o intervalo dado.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en la presente memoria, el término "que comprende" se puede sustituir por el término "que contiene" o "que incluye" o, a veces, cuando se usa en la presente memoria por el término "que tiene".
Cuando se usa en la presente memoria "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en la presente memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y nuevas de la reivindicación.
En cada caso en la presente memoria, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se puede sustituir por cualquiera de los otros dos términos.
A continuación se describen diversos aspectos y realizaciones de la invención.
La presente invención se refiere a una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en donde
(a) el primer dominio de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 de BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC); y (b) el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y
en donde el grupo de epítopos 3 de BCMA corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 1002, y en donde dicha molécula de unión es un polipéptido.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión anterior, en donde el primer dominio de unión es además capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA de macaco (CQLRCSSTPPLTCQRYC).
La presente invención también se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en donde el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada antes, en donde el primer y/o el segundo dominio de unión comprenden las CDR de un anticuerpo.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada antes, en donde el primer y el segundo dominio forman una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpo u oligómeros de los mismos.
La presente invención se refiere adicionalmente a las moléculas de unión mencionadas antes, en donde el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:
(1) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 1, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 2, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 3, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 4, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 6;
(2) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 11, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 13, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 14, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 15 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 16;
(3) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 21, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 22, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 23, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 24, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 25 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 26;
(4) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 31, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 32, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 33, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 34, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 36;
(5) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 41, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 42, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 43, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 44, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 46;
(6) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 51, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 52, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 53, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 54, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 56;
(7) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 61, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 62, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 63, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 64, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 66;
(8) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 71, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 72, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 73, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 74, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 76;
(9) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 161, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 162, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 163, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 166;
(10) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 171, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 172, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 173, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 176;
(11) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 181, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 182, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 183, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 186;
(12) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 191, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 192, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 193, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 196;
(13) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 201, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 202, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 203, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 206;
(14) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 211, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 212, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 213, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO:214, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 215 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 216;
(15) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 221, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 222, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 223, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 226;
(16) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 311, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 312, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 313, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 314, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 315 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 316;
(17) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 321, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 322, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 323, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 324, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 325 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 326;
(18) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 331, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 332, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 333, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 334, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 335 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 336;
(19) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 341, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 342, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 343, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 344, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 345 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 346;
(20) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 351, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 352, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 353, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 354, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 355 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 356;
(21) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 361, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 362, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 363, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 364, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 365 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 366;
(22) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 371, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 372, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 373, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 374, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 375 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 376;
(23) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 381, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 382, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 383, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 384, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 385 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 386;
(24) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 581, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 582, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 583, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 584, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 585 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 586;
(25) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 591, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 592, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 593, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 594, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 595 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 596;
(26) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 601, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 602, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 603, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 604, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 605 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 606;
(27) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 611, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 612, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 613, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 614, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO :615 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 616;
(28) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 621, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 622, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 623, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 624, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 625 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 626;
(29) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 631, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 632, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 633, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 634, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 635 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 636;
(30) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 641, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 642, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 643, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 644, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 645 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 646;
(31) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 651, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 652, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 653, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 654, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 655 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 656;
(32) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 661, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 662, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 663, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 664, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 665 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 666;
(33) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 671, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 672, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 673, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 674, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 675 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 676;
(34) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 681, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 682, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 683, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 684, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 685 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 686;
(35) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 691, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 692, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 693, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 694, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 695 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 696;
(36) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 701, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 702, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 703, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 704, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 705 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 706;
(37) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 711, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 712, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 713, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 714, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 715 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 716;
(38) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 721, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 722, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 723, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 724, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 725 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 726;
(39) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 731, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 732, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 733, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 734, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 735 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 736;
(40) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 741, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 742, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 743, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 744, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 745 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 746;
(41) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 751, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 752, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 753, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 754, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 755 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 756;
(42) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 761, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 762, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 763, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 764, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 765 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 766;
(43) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 771, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 772, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 773, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 774, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 775 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 776;
(44) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 781, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 782, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 783, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 784, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 785 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 786;
(45) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 791, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 792, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 793, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 794, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 795 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 796;
(46) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 801, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 802, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 803, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 804, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 805 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 806;
(47) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 811, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 812, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 813, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 814, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 815 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 816;
(48) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 821, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 822, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 823, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 824, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 825 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 826;
(49) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 831, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 832, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 833, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 834, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 835 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 836;
(50) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 961, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 962, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 963, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 964, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 965 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 966;
(51) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 971, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 972, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 973, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 974, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 975 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 976;
(52) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 981, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 982, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 983, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 984, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 985 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 986; and
(53) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 991, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 992, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 993, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 994, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 995 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 996.
La presente invención tam bién se refiere a la m olécula de unión m encionada antes, en donde el prim er dom inio de unión com prende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las regiones VH com o se representan en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987 y SEQ ID NO: 997.
Adem ás, la presente invención tam bién se refiere a la m olécula de unión m encionada antes, en donde el prim er dom in io de unión com prende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL com o se representan en las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988 y SEQ ID NO: 998.
Adicionalm ente, la presente invención tam bién se refiere a la m olécula de unión m encionada antes, en donde el prim er dom inio de unión com prende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en:
(1) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 7, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 8;
(2) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 17, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 18;
(3) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 27, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 28
(4) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 37, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 38
(5) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 47, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 48
(6) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 57, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 58
(7) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 67, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 68
(8) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 77, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 78
(9) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 167, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 168;
(10) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 177, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 178
(11) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 187, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 188
(12) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 197, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 198
(13) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 207, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 208;
(14) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 217, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 218
(15) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 227, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 228;
(16) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 317, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 318;
(17) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 327, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 328;
(18) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 337, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 338;
(19) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 347, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 348;
(20) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 357, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 358;
(21) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 367, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 368;
(22) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 377, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 378;
(23) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 387, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 388;
(24) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 587, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 588;
(25) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 597, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 598;
(26) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 607, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 608;
(27) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 617, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 618;
(28) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 627, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 628;
(29) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 637, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 638;
(30) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 647, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 648;
(31) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 657, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 658;
(32) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 667, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 668;
(33) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 677, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 678;
(34) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 687, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 688;
(35) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 697, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 698;
(36) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 707, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 708;
(37) una región VH com o se representa en a SEQ ID NO: 717, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 718;
(38) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 727, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 728
(39) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 737, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 738
(40) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 747, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 748
(41) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 757, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 758
(42) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 767, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 768
(43) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 777, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 778
(44) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 787, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 788
(45) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 797, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 798
(46) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 807, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 808
(47) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 817, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 818
(48) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 827, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 828
(49) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 837, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 838
(50) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 967, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 968
(51) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 977, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 978
(52) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 987, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 988 y
(53) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 997, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 998
Adem ás la presente invención tam bién se refiere a la m olécula de unión m encionada antes que tiene la secuencia de am inoácidos m ostrada en la SEQ ID NO: 340 o SEQ ID NO: 980.
La presente invención tam bién se refiere a la m olécula de unión m encionada antes caracterizada por una CE50 (pg/m l) de 350 o menos, preferib lem ente 320 o menos.
La presente invención se refiere adem ás a la m olécula de unión m encionada antes caracterizada por una CE50 (pg/m l) que iguala a la CE50 (pg/m l) de cualquiera de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas com o se expone en SEQ ID NO:829xCD3, SEQ ID NO:619xCD3 SEQ ID NO:49xCD3, SEQ ID NO:979xCD3, SEQ ID NO:709xCD3, SEQ ID NO:339xCD3, SEQ ID NO :739xCD3 o SEQ ID NO:199xCD3.
La presente invención tam bién se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una m olécula de unión com o se ha definido antes.
Adem ás, la presente invención tam bién se refiere a un vecto r que com prende una secuencia de ácido nucleico com o se ha definido antes.
Adem ás, la presente invención tam bién se refiere a una célu la hospedante transform ada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico com o se ha definido antes o con el vecto r com o se ha definido antes.
La presente invención tam bién se refiere a un procedim iento para la producción de una m olécula de unión com o se ha definido antes, com prendiendo dicho procedim iento cu ltivar una célu la hospedante com o se define en la presente memoria en condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión como se define en la presente memoria y recuperar la molécula de unión producida del cultivo.
Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión como se define en la presente memoria, o producida de acuerdo con el procedimiento definido antes.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada antes, o producida de acuerdo con el procedimiento definido, para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que se correlacionan con la expresión de BCMA y las enfermedades autoinmunitarias.
La presente invención se refiere además a un kit que comprende una molécula de unión como se ha definido antes, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente memoria, un vector como se ha definido antes y/o una célula hospedante como se ha definido antes también.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dicho segundo dominio de unión es capaz de unirse al CD3 humano y al CD3 de macaco.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dichos dominios de unión derivan de un anticuerpo, lipocalina o anticalina.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde el primer y/o el segundo dominio de unión es un anticuerpo.
La presente invención se refiere además a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dicho anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, quiméricos, monocatenarios, humanizados y humanos.
La presente invención se refiere además a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dicho anticuerpo incluye fragmentos Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos scFv, anticuerpos de dominio único, nanocuerpos, diacuerpos, anticuerpos DART, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem, minicuerpos, anticuerpos Fc DART, anticuerpos IgG DART y multicuerpos.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de afinidad madurada.
Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se ha mencionado antes, en donde dicha unión al grupo de epítopos 3 de BCMA se ensaya por intercambio con el grupo de epítopos respectivo de un antígeno BCMA no humano o por barrido de alanina.
El grupo de epítopos 3 está compuesto por el dominio extracelular de BCMA. El "dominio extracelular de BCMA" o "ECD de BCMA" se refiere a una forma de BCMA que carece esencialmente de dominios transmembrana y citoplasmáticos del BCMA. El experto en la técnica entenderá que el dominio transmembrana identificado para el polipéptido BCMA de la presente invención se identifica según los criterios empleados habitualmente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero lo más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio mencionado específicamente en la presente memoria. Un ECD de BCMA preferido se muestra en la SEQ ID NO: 1007.
El CD3 es un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas distintas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD35 y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de células T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T. La lisis redirigida de células diana a través del reclutamiento de células T por moléculas biespecíficas implica la formación de sinapsis citolítica y el suministro de perforina y granzimas. Las células T implicadas son capaces de lisis de células diana en serie, y no son afectadas por mecanismos de escape inmunitario que interfieren con el procesamiento y presentación del antígeno peptídico, o la diferenciación de células T clonales; véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 2007/042261.
La expresión "molécula de unión" en el sentido de la presente descripción indica cualquier molécula capaz de unirse (específicamente), interaccionar o reconocer las moléculas diana de BCMA y CD3. Según la presente invención, las moléculas de unión son específicamente polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (p. ej., conectores químicos o agentes de reticulación químicos tales como glutaraldehído).
Una molécula de unión, por así decirlo, proporciona el armazón para dichos uno o más dominios de unión de modo que dichos dominios de unión se pueden unir/interaccionar con las moléculas diana BCMA y CD3. Por ejemplo, dicho armazón se podría proporcionar mediante la proteína A, en particular, su dominio Z (affibodies), ImmE7 (proteínas de inmunidad), BPTI/APPI (dominios de Kunitz), proteína de unión a Ras AF-6 (dominios PDZ), caribdotoxina (toxina de escorpión), CTLA-4, Min-23 (knottinas), lipocalinas (anticalinas), neocarzinostatina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición de consenso de anquirina o tiorredoxina (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295- 304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren y Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol 7, 463-469 (1997)). Una m olécula de unión preferida es un anticuerpo.
Está previsto que la m olécula de unión se produzca por (o se pueda obtener por) m étodos de presentación en fagos o de cribado de bibliotecas en lugar de in jertar secuencias de CDR de un anticuerpo preexistente (m onoclonal) en un arm azón, por ejem plo, un arm azón com o se describe en la presente memoria.
El térm ino "b iespecífico", com o se usa en la presente m emoria, se refiere a una m olécula de unión que com prende al menos un prim er y un segundo dom inio de unión, en donde el prim er dom inio de unión es capaz de unirse a un antígeno o diana, y el segundo dom in io de unión es capaz de unirse a otro antígeno o diana. La "m olécula de unión" de la invención tam bién com prende m oléculas de unión m ultiespecíficas tales como, p. ej., m oléculas de unión triespecíficas, incluyendo estas últim as tres dom in ios de unión.
Tam bién está previsto que la m olécula de unión de la invención tenga, adem ás de su función de unirse a las m oléculas d iana BCMA y CD3, una función adicional. En este form ato, la m olécula de unión es una m olécula de unión trifuncional o m ultifuncional que se dirige a células plasm áticas a través de la unión a BCMA, media la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión a CD3 y proporciona una función adicional tal com o un dom in io constante Fc com pletam ente funcional que media la c itotoxicidad ce lu la r dependiente de anticuerpos a través del reclutam iento de células efectoras com o células NK, un m arcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico como, p. ej., una toxina o radionucleido, y/o medios para m ejorar la sem ivida en el suero, etc.
La expresión "dom inio de unión" caracteriza, en relación con la presente invención, un dom in io que es capaz de unirse específicam ente a/in teraccionar con un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las m oléculas diana BCMA y CD3.
Los dom inios de unión pueden deriva r de un donador de dom inio de unión tal como, por ejem plo, un anticuerpo, proteína A, ImmE7 (inm unoproteínas), BPTI/APPI (dom inios Kunitz), proteína de unión a Ras AF-6 (dom inios PDZ), caribdotoxina (toxina de escorpión), CTLA-4, Min-23 (knottinas), lipocalinas (anticalinas), neocarzinostatina, un dom in io de fibronectina, un dom in io de repetición de consenso de anquirina o tiorredoxina (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren y Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463- 469 (1997)). Un dom inio de unión preferido deriva de un anticuerpo. Está previsto que un dom in io de unión de la presente invención com prende al m enos dicha parte de cualqu iera de los dom inios de unión m encionados antes que se requiere para la unión a/interacción con un epítopo diana dado o un sitio d iana dado en las m oléculas d iana BCMA y CD3.
Está previsto que el dom inio de unión de los donadores de dom in io de unión m encionados antes se caracterice por la parte de estos donadores que es responsable de la unión a la d iana respectiva, es decir, cuando esa parte se retira del donador de dom inio de unión, dicho donador pierde su capacidad de unión. "P ierde" significa una reducción de al m enos el 50% de la capacidad de unión en com paración con el donador de unión. Los m étodos para cartografia r estos sitios de unión son bien conocidos en la técn ica; por lo tanto, está dentro del conocim iento estándar de la persona experta localizar/cartografiar el sitio de unión de un donador de dom in io de unión y, por lo tanto, "derivar" dicho dom inio de unión de los respectivos donadores de dom in io unión.
El térm ino "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicam ente un dom in io de unión, tal como un anticuerpo o inm unoglobulina o derivado o fragm ento de un anticuerpo o de una inm unoglobulina. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, el térm ino epítopo a veces tam bién se denom ina en la presente m em oria "estructura antigénica" o "determ inante antigénico". Por lo tanto, el dom inio de unión es un "sitio de interacción de antígeno". Dicha un ión/interacción tam bién se entiende que define un "reconocim iento específico". En un ejem plo, dicho dom in io de unión que (específicam ente) se une/in teracciona con un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las m oléculas d iana BCMA y CD3 es un anticuerpo o inm unoglobulina, y dicho dom in io de unión es una región VH y/o VL de un anticuerpo o de una inm unoglobulina.
Los "epítopos" pueden estar form ados tanto por am inoácidos contiguos com o por am inoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegam iento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo donde una secuencia prim aria de am inoácidos com prende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típ icam ente incluye al m enos 3 o al menos 4, y más habitualm ente, al m enos 5 o al m enos 6 o al m enos 7, por ejem plo, de aproxim adam ente 8 a aproxim adam ente 10 am inoácidos en una secuencia única.
Un "epítopo conform acional", en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en donde la secuencia prim aria de los am inoácidos que com prenden el epítopo no es el único com ponente defin itorio del epítopo reconocido (p. ej., un epítopo en donde la secuencia prim aria de am inoácidos no es necesariam ente reconocida por el dom in io de unión). Típ icam ente, un epítopo conform acional com prende un m ayor número de am inoácidos respecto a un epítopo lineal. Con respecto al reconocim iento de epítopos conform acionales, el dom in io de unión reconoce una estructura trid im ensional del antígeno, preferib lem ente un péptido o proteína o fragm ento del m ismo (en el contexto de la presente invención, el antígeno para uno de los dom inios de unión está com prendido dentro de la proteína BCMA). Por ejem plo, cuando una m olécula de proteína se pliega para fo rm ar una estructura trid im ensional, ciertos am inoácidos y/o la cadena principal del polipéptido que form a el epítopo conform acional se yuxtaponen perm itiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Los métodos para determinar la conformación de los epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN 2D) y marcaje de sonda de espín dirigido al sitio y espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR). Además, los ejemplos proporcionados describen un método adicional para ensayar si un dominio de unión dado se une a uno o más grupos de epítopos de una proteína dada, en particular BCMA.
En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente invención es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA humano, preferiblemente el ECD del BCMA humano. Por consiguiente, cuando el grupo de epítopos respectivo en la proteína BCMA humana se intercambia con el grupo de epítopos respectivo de un antígeno de BCMA murino (dando como resultado una construcción que comprende BCMA humano, en donde el grupo de epítopos 3 humano se reemplaza por el grupo de epítopos 3 murino; véase la SEQ ID NO: 1011), se producirá una disminución en la unión del dominio de unión. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en comparación con el respectivo grupo de epítopos en la proteína BCMA humana, de modo que la unión al respectivo grupo de epítopos en la proteína BCMA humana se establece que es 100% Está previsto que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino mencionadas antes se expresen en células CHO. También está previsto que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino se fusionen con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM; véase la Figura 2a.
En los ejemplos adjuntos, en particular en los ejemplos 1-3, se describe un método para ensayar esta pérdida de unión debido al intercambio con el respectivo grupo de epítopos de un antígeno BCMA no humano (p. ej., murino). Un método adicional para determinar la contribución de un resto específico de un antígeno diana al reconocimiento por una molécula de unión o dominio de unión dado es el barrido de alanina (véase, p. ej., Morrison KL y Weiss GA. C ur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5 (3): 302-7), donde cada resto que se va a analizar se reemplaza por alanina, p. ej., por mutagénesis dirigida al sitio. La alanina se usa debido a su grupo funcional metilo no voluminoso, químicamente inerte que, sin embargo, imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, los aminoácidos voluminosos como la valina o la leucina se pueden usar en casos en donde se desea conservar el tamaño de los restos mutados. El barrido de alanina es una tecnología madura que se ha usado durante un largo período de tiempo.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "grupo de epítopos" denota la totalidad de los epítopos que se encuentran en un tramo contiguo definido de un antígeno. Un grupo de epítopos puede comprender uno, dos o más epítopos. Los grupos de epítopos que se han definido, en el contexto de la presente invención, en el dominio extracelular de BCMA se han descrito antes y se representan en la Figura 1.
Las expresiones "(capaz de) unirse a", "reconoce específicamente", "dirigido a" y "reacciona con" significan de acuerdo con esta invención que un dominio de unión es capaz de interaccionar específicamente con uno o más, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres y lo más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un epítopo.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "que interacciona específicamente", "que se une específicamente" o "se une(n) específicamente" significan que un dominio de unión presenta una afinidad apreciable por una proteína o antígeno particular y, en general, no presenta reactividad significativa con proteínas o antígenos que no sean BCMA o CD3. La "afinidad apreciable" incluye la unión con una afinidad de aproximadamente 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-12 a 10-8 M, de 10-12 a 10-9 M, de 10-12 a 10-10 M, de 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de aproximadamente 10-11 a 10-9 M. Si un dominio de unión reacciona específicamente o se une a una diana se puede ensayar fácilmente, entre otros, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencialmente o no es capaz de unirse a proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas del BCMA y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).
La expresión "no se une esencialmente" o "no es capaz de unirse" significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a otra proteína o antígeno distinto de BCMA o CD3, es decir, no muestra reactividad de más de 30%, preferiblemente no más de 20%, más preferiblemente no más de 10%, en particular preferiblemente no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3, de modo que la unión a BCMA o CD3, respectivamente, se establece que es 100%.
Se cree que la unión específica se efectúa por motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por lo tanto, la unión se logra como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como el resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción para el antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado una unión simple de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción para el antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado, alternativa o adicionalmente, el inicio de una señal, p. ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.
En un aspecto, el prim er dom in io de unión de la presente invención se une al grupo de epítopos 3 del BCMA hum ano y adem ás es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA de m acaco tal com o BCMA de M acaca m ulatta (SEQ ID NO: 1017) o M acaca fascicu laris (SEQ ID NO: 1017). Está previsto que el prim er dom inio de unión se una o no se una al BCMA murino.
Por consiguiente, en una realización, un dom in io de unión que se une al BCMA hum ano, específicam ente al grupo de epítopos 3 del dom in io de proteína extrace lu lar del BCMA form ado por los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia hum ana com o se representa en la SEQ ID NO: 1002, tam bién se une al BCMA de m acaco, en particular al grupo de epítopos 3 del dom inio de proteína extrace lu lar del BCMA form ado por los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia de BCMA de m acaco com o se representa en la SEQ ID NO: 1006.
En una realización, un prim er dom in io de unión de una m olécula de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA, en el que el grupo de epítopos 3 del BCMA corresponde a los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia com o se representa en la SEQ ID NO: 1002 (polipéptido BCMA de longitud com pleta hum ano) o SEQ ID NO: 1007 (dom inio extrace lu lar de BCMA hum ano: am inoácidos 1 -54 de SEQ ID NO: 1002).
En un aspecto de la presente invención, el prim er dom in io de unión de la m olécula de unión es adicional o alternativam ente capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y/o Saimirí sciureus.
Las proteínas (incluidos sus fragm entos, preferib lem ente fragm entos biológicam ente activos y péptidos, que norm alm ente tienen menos de 30 am inoácidos) com prenden uno o más am inoácidos acoplados entre sí m ediante un enlace peptídico covalente (que da com o resultado una cadena de am inoácidos). El térm ino "polipéptido" com o se usa en la presente m em oria describe un grupo de m oléculas, que consisten en más de 30 am inoácidos. Los polipéptidos pueden form ar adem ás m ultím eros tales com o dím eros, trím eros y o ligóm eros superiores, es decir, que consisten en más de una m olécula de polipéptido. Las m oléculas de polipéptidos que form an dichos dímeros, trím eros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de dichos m ultím eros se denom inan, en consecuencia, homo- o heterodím eros, hom o- o heterotrím eros, etc. Un ejem plo para un heterom ultím ero es una m olécula de anticuerpo, que, en su form a natural, consta de dos cadenas de polipéptidos ligeras idénticas y dos cadenas de po lipéptidos pesadas idénticas. Los térm inos "polipéptido" y "proteína" tam bién se refieren a po lipéptidos/proteínas m odificados naturalm ente en donde la m odificación se realiza, p. ej., m ediante m odificaciones postraduccionales com o glicosilación, acetilación, fosforilación y sim ilares. Un "polipéptido" cuando se hace referencia en la presente m em oria tam bién se puede m odificar quím icam ente tal com o pegilado. Dichas m odificaciones son bien conocidas en la técnica.
En otro aspecto de la invención, el segundo dom inio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon. En otro aspecto más de la invención, el segundo dom inio de unión es capaz de unirse al CD3 humano y al CD3 de macaco, preferib lem ente al CD3 épsilon hum ano y al CD3 épsilon de macaco. Adicional o a lternativam ente, el segundo dom in io de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y/o Saimiri sciureus. De acuerdo con estas realizaciones, uno o am bos dom in ios de unión de la m olécula de unión de la invención son preferib lem ente de especies cruzadas específicas para m iem bros del orden de los prim ates de mam íferos. Los dom in ios de unión a CD3 específicos de especies cruzadas se describen, por ejem plo, en la publicación internacional W O 2008/119567.
Se prefiere particularm ente para la m olécula de unión de la presente invención que el segundo dom inio de unión capaz de unirse a CD3 com prenda una región VL que com prende C D R -L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionados entre: (a) CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 27 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 28 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 29 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(b) CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 117 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 118 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 119 de la publicación internacional W O 2008/119567; and
(c) CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 153 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 154 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 155 de la publicación internacional W O 2008/119567.
En una realización alternativam ente preferida de la m olécula de unión de la presente invención, el segundo dom inio de unión capaz de unirse a CD3 com prende una región VH que com prende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:
(a) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 12 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 13 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 14 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(b) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 30 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 31 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 32 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(c) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 48 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 49 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 50 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(d) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 66 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 67 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 68 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(e) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 84 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 85 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 86 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(f) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 102 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 103 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 104 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(g) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 120 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 121 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 122 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(h) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 138 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 139 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 140 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(i) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 156 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 157 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 158 de la publicación internacional W O 2008/119567; y
(j) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 174 de la publicación internacional W O 2008/119567, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 175 de la publicación internacional W O 2008/119567 y CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 176 de la publicación internacional W O 2008/119567.
Se prefiere adem ás para la m olécula de unión de la presente invención que el segundo dom in io de unión capaz de unirse a CD3 com prenda una región V L seleccionada del grupo que consiste en una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165 de la publicación internacional W O 2008/119567.
Se prefiere a lternativam ente que el segundo dom inio de unión capaz de unirse a CD3 com prenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51 ,55 , 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 de la publicación internacional W O 2008/119567. Más preferib lem ente, la m olécula de unión de la presente invención se caracteriza por el segundo dom inio de unión capaz de unirse a CD3 que com prende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 17 o 21 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 15 o 19 de la publicación internacional W O 2008/119567; (b) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 35 o 39 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 33 o 37 de la publicación internacional W O 2008/119567; (c) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 53 o 57 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 51 o 55 de la publicación internacional W O 2008/119567; (d) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 71 o 75 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 69 o 73 de la publicación internacional W O 2008/119567; (e) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 89 o 93 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 87 o 91 de la publicación internacional W O 2008/119567; (f) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 107 o 111 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 105 o 109 de la publicación internacional W O 2008/119567; (g) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 125 o 129 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 123 o 127 de la publicación internacional W O 2008/119567; (h) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 143 o 147 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 141 o 145 de la publicación internacional W O 2008/119567;
(i) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 161 o 165 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 159 o 163 de la publicación internacional W O 2008/119567; y
(j) una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 179 o 183 de la publicación internacional W O 2008/119567 y una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 177 o 181 de la publicación internacional W O 2008/119567.
De acuerdo con una realización pre ferida de la m olécula de unión de la presente invención, en particu lar el segundo dom in io de unión capaz de unirse a CD3, las parejas de regiones VH y regiones VL están en el form ato de un anticuerpo m onocatenario (scFv). Las regiones VH y VL están dispuestas en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH esté situada N-term inal respecto a la secuencia conectora. La región VL está situada C-term inal de la secuencia conectora.
U na realización preferida de la m olécula de unión de la presente invención descrita antes se caracteriza por el segundo dom inio de unión capaz de unirse a CD3 que com prende una secuencia de am inoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41 ,43 , 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 de la publicación internacional W o 2008/119567.
La afinidad del prim er dom in io de unión para el BCMA hum ano es preferib lem ente <15 nM, más preferib lem ente <10 nM, incluso más preferib lem ente <5 nM, incluso más preferib lem ente <1 nM, incluso más preferib lem ente <0,5 nM, incluso más preferib lem ente <0,1 nM, y lo más preferib lem ente <0,05 nM. La afinidad del prim er dom in io de unión para el BCMA de m acaco es preferib lem ente <15 nM, más preferib lem ente <10 nM, incluso más preferib lem ente <5 nM, incluso más preferib lem ente <1 nM, incluso más preferib lem ente <0,5 nM, incluso más preferib lem ente <0,1 nM, y lo más preferib lem ente <0,05 nM o incluso <0,01 nM. La afinidad se puede m edir por ejem plo en un ensayo de Biacore o en un ensayo de Scatchard, p. ej., com o se describe en los ejem plos. La diferencia de afinidad para el BCMA de m acaco frente al BCMA hum ano es preferib lem ente [1 :10-1:5] o [5:1-10:1], más preferib lem ente [1 :5-5:1], y lo más preferib lem ente [1:2-3:1] o incluso [1 :1 -3:1]. O tros m étodos de determ inación de la afinidad son bien conocidos para el experto en la técnica.
La citotoxicidad m ediada por las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas se puede m edir de varias maneras. Las células efectoras pueden ser, por ejem plo, células T CD8 positivas (hum anas) enriquecidas estim uladas o células m ononucleares de sangre periférica (PBMC) (hum anas) no estim uladas. Si las células d iana proceden de m acaco o expresan o se transfectan con BCMA de m acaco, las células efectoras tam bién deben proceder de m acaco, tal com o una línea de células T de macaco, p. ej., 4119LnPx. Las células d iana deben expresar (al menos el dom inio extrace lu lar de) BCMA, p. ej., BCMA hum ano o de m acaco. Las células d iana pueden ser una línea ce lu la r (tal com o CHO) que se transfecta de m anera estable o transitoria con BCMA, p. ej., BCMA hum ano o de m acaco. A lternativam ente, las células diana pueden ser una línea ce lu la r expresadora natural positiva para BCMA, tal com o la línea ce lu lar de m ielom a m últiple hum ano L363 o NCI-H929. Norm alm ente, se espera que los valores de CE50 sean más bajos con líneas celu lares d iana que expresan niveles más altos de BCMA en la superfic ie celular. La relación de célu la e fectora a diana (E:T) norm alm ente es de aproxim adam ente 10:1, pero tam bién puede variar. La actividad citotóxica de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas se puede m edir en un ensayo de liberación de 51-crom o (tiempo de incubación de aproxim adam ente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiem po de incubación de aproxim adam ente 48 horas). Tam bién son posib les m odificaciones del tiem po de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Los expertos en la m ateria conocen bien otros m étodos para m edir la c itotoxicidad y com prenden ensayos de MTT o MTS, ensayos basados en ATP que incluyen ensayos biolum iniscentes, el ensayo de sulforodam ina B (SRB), el ensayo de W ST, el ensayo c lonogénico y la tecnología ECIS.
La actividad c itotóxica m ediada por las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas de la presente invención se m ide preferib lem ente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. Está representada por el va lor de CE50, que corresponde a la mitad de la concentración eficaz m áxim a (concentración de la m olécula de unión que induce una respuesta c itotóxica a medio cam ino entre la línea base y el máxima). Preferiblem ente, el va lo r de CE50 de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas es <20.000 pg/ml, más preferib lem ente <5.000 pg/ml, incluso más preferib lem ente <1.000 pg/ml, incluso más preferib lem ente <500 pg/ml, incluso más preferib lem ente <350 pg/ml, incluso más preferib lem ente <320 pg/ml, incluso más preferib lem ente <250 pg/ml, incluso más preferib lem ente <100 pg/ml, incluso más preferib lem ente <50 pg/ml, incluso más preferib lem ente <10 pg/ml, y lo más preferib lem ente <5 pg/ml.
Se puede com binar cualquiera de los valores de CE50 dados antes con cualquiera de los escenarios indicados de un ensayo de citotoxicidad basado en células. Por ejem plo, cuando se usan células T CD8 positivas (hum anas) o una línea de células T de m acaco com o células efectoras, el va lo r de CE50 de la m olécula de unión a BCM A/CD3 b iespecífica es preferib lem ente <1000 pg/ml, más preferib lem ente <500 pg/ml, incluso más preferib lem ente <250 pg/ml, incluso más preferib lem ente <1000 pg/ml, más preferib lem ente <500 pg/ml, incluso más preferib lem ente <250 pg/ml, incluso más preferib lem ente <100 pg/ml, incluso más preferib lem ente <50 pg/ml, incluso más preferib lem ente <10 pg/ml, y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si en este ensayo las células diana son células transfectadas con BCMA (humanas o de macaco) tales como células CHO, el valor de CE50 de la molécula de unión a BCMA/CD3 biespecífica es preferiblemente <150 pg/ml, más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <30 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml, y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si las células diana son una línea celular expresadora natural positiva para BCMA, entonces el valor de CE50 es preferiblemente <350 pg/ml, más preferiblemente <320 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <200 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <150 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o inferior.
Cuando se usan PBMC humanas como células efectoras, el valor de CE50 de la molécula de unión a BCMA/CD3 biespecífica es preferiblemente <1000 pg/ml, más preferiblemente <750 pg/ml, más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <350 pg/ml, incluso más preferiblemente <320 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o inferior.
En una realización particularmente preferida, las moléculas de unión a BCMA/CD3 biespecíficas de la presente invención se caracterizan por una CE50 <350 pg/ml o menos, más preferiblemente <320 pg/ml o menos. En esa realización, las células diana son células L363 y las células efectoras son PBMC humanas no estimuladas. El experto en la materia sabe cómo medir el valor de CE50 sin más preámbulos. Además, la memoria descriptiva enseña una instrucción específica sobre cómo medir el valor de CE50; véase, por ejemplo, el Ejemplo 8.3, más abajo. Un protocolo adecuado es el siguiente:
a) Preparar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocitarias)
b) Lavar opcionalmente con PBS de Dulbecco (Gibco)
c) Separar los eritrocitos restantes de las PBMC por incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 pM)
c) Separar las plaquetas por el líquido sobrenadante tras centrifugación de las PBMC a 100 x g
d) Agotar las células CD14+ y células NK
e) Aislar las células CD14/CD56 negativas usando, p. ej., columnas LS (Miltenyi Biotec, n° 130-042-401) f) Cultivar las PBMC sin células CD14+/CD56+, p. ej., en medio RPMI completo, es decir, RPMI1640 (Biochrom AG, n° FG1215) complementado con FBS al 10% (Biochrom AG, n° S0115), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, n° K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, n° L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, n° L0473) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, n° A2213) a 37°C en una incubadora hasta que sea necesario. g) Marcar las células diana
h) Mezclar las células efectoras y diana, preferiblemente en volúmenes iguales, para tener así una relación de células E:T de 10:1
i) Añadir la molécula de unión, preferiblemente en una dilución seriada
j) Proceder durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%
k) Vigilar la integridad de la membrana de las células diana, p. ej., mediante la adición de yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/ml, p. ej., por citometría de flujo
l) Calcular la CE50, p. ej., de acuerdo con la siguiente fórmula:
r -, . Citotox ■ ic • id j ad j r |% n / J l = n - c--é-lu-l-a-s-- d-ia--n-a- m-- u--e-r-ta-s- X 100
^células diana
n = número de sucesos
Usando el software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), se representó gráficamente el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de anticuerpos biespecíficos correspondientes. Las curvas de respuesta a la dosis se pueden analizar con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para evaluar las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea con pendiente fija y se calcularon los valores de CE50.
En vista de lo anterior, se prefiere que la molécula de unión de la presente invención se caracterice por una CE50 (pg/ml) de 350 o menos, preferiblemente 320 o menos.
La presente invención tam bién se refiere a m oléculas de unión descritas en la presente m em oria que se caracterizan por una CE50 (pg/m l) que equivale a la CE50 (pg/m l) de cualquiera de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas BCM A-83 x CD3, BCM A-62 x CD3, BCM A-5 x CD3, BCM A-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCM A-34 x CD3, BCMA-74 x CD3, BCM A-20 x CD3. Con el fin de determ inar si la CE50 de una m olécula de unión com o se describe en la presente m em oria equivale a la CE50 de cualqu iera de BCM A-83 x CD3, BCM A-62 x CD3, BCM A-5 x CD3, BCM A-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCM A-34 x CD3, BCM A-74 x CD3, BCM A-20 x CD3, está previsto que para la determ inación del va lo r de CE50 se aplique el m ism o ensayo. El térm ino "equivale a" incluye de ese modo una desviación de /- 10%, preferib lem ente /- 7,5%, más preferib lem ente /- 5%, incluso más preferib lem ente /-2,5% del va lor de CE50 respectivo.
Las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas BCM A-83 x CD3, BCM A-62 x CD3, BCMA-5 x CD3, BCM A-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCM A-34 x CD3, BCM A-74 x CD3, BCM A-20 x CD3 que sirven com o m oléculas de unión de "referencia" en el ensayo descrito antes se producen preferib lem ente en células CHO.
La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoform a m onom érica y la d im érica de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas individuales (tales com o anticuerpos) se denom ina "d iferencia de potencia". Esta d iferencia de potencia se puede calcular, p. ej., com o la relación entre los valores de CE50 de la form a m onom érica y dim érica de la molécula. Las diferencias de potencia de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas de la presente invención son preferib lem ente <5, más preferib lem ente <4, incluso más preferib lem ente <3, incluso más preferib lem ente <2 y lo más preferib lem ente <1.
Preferiblem ente, las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas de la presente invención no se unen, interaccionan, reconocen o reaccionan de form a cruzada con BAFF-R humano y/o TACI humano. Los m étodos para detectar la reactividad cruzada con BAFF-R hum ano y/o TACI hum ano se describen en el Ejemplo 9.
Tam bién se prefiere que las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas de la presente invención presenten una conversión de dím ero muy baja después de un núm ero de ciclos de conge lación/descongelación. Preferiblem ente, los porcentajes de dím ero son <5%, más preferib lem ente <4%, incluso más preferib lem ente <3%, incluso más preferib lem ente <2,5%, incluso más preferib lem ente <2%, incluso más preferib lem ente <1,5%, y lo más preferib lem ente <1%, por ejem plo después de tres ciclos de congelación/descongelación. Un ciclo de congelacióndescongelación y la determ inación del porcenta je de dím ero se pueden llevar a cabo de acuerdo con el Ejemplo 16. Las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas (tales com o anticuerpos) de la presente invención preferib lem ente m uestran una term oestabilidad favorable con tem peraturas de fusión superiores a 60°C.
Para determ inar la potencial interacción de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas (tales com o anticuerpos) con proteínas plasm áticas humanas, se puede llevar a cabo un ensayo de in terferencia p lasm ática (véase, p. ej., el E jemplo 18). En una realización preferida, no hay una reducción significativa de la unión a la diana de las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas m ediada por proteínas plasm áticas. El va lo r de interferencia p lasm ática relativo es preferib lem ente <2.
Adem ás, está previsto que las m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas de la presente invención sean capaces de presentar e ficacia terapéutica o actividad antitum oral. Esto se puede evaluar, p. ej., en un estudio com o se describe en el Ejemplo 19 (m odelo de xenoinjerto de tum or hum ano en estadio avanzado). El experto en la m ateria sabe cóm o m odificar o adaptar ciertos parám etros de este estudio, tales com o el núm ero de células tum ora les inyectadas, el sitio de inyección, el núm ero de células T hum anas trasplantadas, la cantidad de m oléculas de unión a BCM A/CD3 biespecíficas que se va a adm inistrar, y los desarro llos cronológicos, m ientras todavía se llega a un resultado significativo y reproducib le. Preferiblem ente, la inhibición del crecim iento tum ora l T/C [%] es 70 o 60 o menos, más preferib lem ente 50 o 40 o menos, incluso más preferib lem ente al m enos 30 o 20 o m enos y lo más preferib lem ente 10 o menos, 5 o m enos o incluso 2,5 o menos.
Preferiblem ente, las m oléculas de unión a BCM A/CD3 b iespecíficas de la presente invención no inducen/m edian la lisis o no inducen/m edian esencia lm ente la lisis de células negativas para BCMA ta les com o HL60, M ES-SA y SNU-16. La expresión "no induce la lisis", "no induce esencia lm ente la lisis", "no media la lisis" o "no m edia esencialm ente la lisis" significa que una m olécula de unión de la presente invención no induce ni media la lisis de más de 30%, preferib lem ente no más de 20%, más preferib lem ente no más de 10%, en particular preferib lem ente no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% de células negativas para BCMA, por lo que la lisis de una línea ce lu lar positiva para BCMA tal com o NCI-H929, L-363 u OPM-2 se establece en 100%. Esto se aplica para concentraciones de la m olécula de unión de al menos hasta 500 nM. El experto sabe cóm o m edir la lisis ce lu la r sin más preám bulos. Adem ás, la m em oria descrip tiva enseña una instrucción específica sobre cóm o m edir la lisis celular; véase, por ejem plo, el Ejemplo 20 a continuación.
En una realización, el prim er o el segundo dom inio de unión son o deriva de un anticuerpo. En otra realización, am bos dom inios de unión son o derivan de un anticuerpo.
La definición del térm ino "anticuerpo" incluye realizaciones ta les com o anticuerpos m onoclonales, quim éricos, m onocatenarios, hum anizados y hum anos. Adem ás de los anticuerpos de longitud com pleta, la definición tam bién incluye derivados de anticuerpos y fragm entos de anticuerpos, como, entre otros, fragm entos Fab. Los fragm entos o derivados de anticuerpos com prenden adem ás fragm entos F(ab')2, Fv, scFv o anticuerpos de dom in io único tales com o anticuerpos o nanocuerpos de dom inio, anticuerpos de dom in io variab le único o dom in io variab le único de inm unoglobulina que com prende sim plem ente un dom in io variable, que puede ser VHH, V H o VL, que se une específicam ente a un antígeno o epítopo independientem ente de otras regiones o dom inios V ; véanse, por ejem plo, Harlow y Lane (1988) y (1999), en el lugar citado; Konterm ann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recom binant Antibodies fo r Im m unotherapy, Cam bridge University Press 2009. Dicho térm ino tam bién incluye diacuerpos o anticuerpos de red ireccionam iento de doble afinidad (DART). Están previstos adem ás los d iacuerpos m onocatenarios (biespecíficos), d iacuerpos en tándem (Tandab's), "m inicuerpos" ilustrados por una estructura que es com o sigue: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 o (scFv-CH3-scFv)2, anticuerpos "Fc DART" y anticuerpos "IgG DART", y m ulticuerpos ta les com o triacuerpos. Los dom inios variab les únicos de inm unoglobulina abarcan no solo un polipéptido de dom inio variab le único de anticuerpo aislado, sino tam bién polipéptidos más grandes que com prenden uno o más m onóm eros de una secuencia de po lipéptido de dom in io variab le único de anticuerpo.
Se conocen varios procedim ientos en la técn ica y se pueden usar para la producción de dichos anticuerpos y/o fragm entos. Por lo tanto, los derivados (anticuerpos) se pueden producir m ediante peptidom im éticos. Adem ás, las técn icas descritas para la producción de anticuerpos m onocatenarios (véase, entre otros, la patente de EE.UU.
4.946.778, Konterm ann y Dübel (2010), en el lugar citado, y Little (2009), en el lugar citado) se pueden adaptar para producir anticuerpos m onocatenarios específicos para po lipéptido(s) elegido(s). Adem ás, se pueden usar anim ales transgén icos para expresar anticuerpos hum anizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos m onoclonales, se puede usar cua lqu ier técn ica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejem plos de dichas técn icas incluyen la técn ica del h ibridom a (Kohler y M ilstein Nature 256 (1975), 495-497), la técn ica del triom a, la técn ica del hibridom a de células B hum anas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técn ica del h ibridom a de EBV para producir anticuerpos m onoclonales hum anos (Cole et al., M onoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). La resonancia de plasm ón superfic ial com o se usa en el sistem a BIAcore se puede usar para aum entar la eficacia de los anticuerpos en fagos que se unen a un epítopo de un po lipéptido diana, tal com o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malm borg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Tam bién está previsto en el contexto de esta invención que el térm ino "anticuerpo" com prende construcciones de anticuerpos, que se pueden expresar en un hospedante com o se describe a continuación en la presente m emoria, p. ej., construcciones de anticuerpos que se pueden transfecta r y/o transducir, entre otros, m ediante v irus o vectores plasm ídicos.
Adem ás, el térm ino "anticuerpo" tal com o se usa en la presente m em oria tam bién se refiere a derivados o variantes de los anticuerpos descritos en la presente m em oria que presentan la m ism a especific idad que los anticuerpos descritos. Los ejem plos de "variantes de anticuerpos" incluyen variantes hum anizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos de "afinidad m adurada" (véase, p. ej., Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y m utantes de anticuerpos con función(es) efectora(s) alterada(s) (véase, p. ej., la patente de EE.UU. 5.648.260, Konterm ann y Dübel (2010), en el lugar citado, y Little (2009), en el lugar citado).
Las expresiones "dom inio de unión al antígeno", "fragm ento de unión al antígeno" y "región de unión del anticuerpo" cuando se usan en la presente m em oria se refieren a una parte de una m olécula de anticuerpo que com prende am inoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que es específicam ente reconocida y es unida por el anticuerpo se denom ina "epítopo" com o se ha descrito antes en la presente m emoria. Com o se ha m encionado antes, un dom in io de unión al antígeno puede com prender típ icam ente una región variab le de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variab le de cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin em bargo, no tiene que com prender ambos. Los fragm entos Fd, por ejem plo, tienen dos regiones VH y a m enudo retienen alguna función de unión al antígeno del dom in io de unión al antígeno intacto. Los ejem plos de fragm entos de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragm ento Fab, un fragm ento m onovalente que tiene los dom inios VL, VH, CL y C H 1 ; (2) un fragm ento F(ab')2, un fragm ento bivalente que tiene dos fragm entos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragm ento Fd que tiene los dos dom in ios VH y CH1; (4) un fragm ento Fv que tiene los dom in ios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragm ento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que tiene un dom inio VH; (6) una región determ inante de com plem entariedad aislada (CDR), y (7) un Fv m onocatenario (scFv), siendo preferido este últim o (por ejem plo, derivado de una bib lioteca de scFV). Aunque los dos dom in ios del fragm ento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, se pueden unir, usando m étodos recom binantes, por un conector sintético que les perm ite hacerse com o una cadena de proteína única en la que las regiones VL y VH se em pare jan para fo rm ar m oléculas m onovalentes (conocidas com o Fv m onocatenario (scFv); véase, por ejem plo, Huston et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Estos fragm entos de anticuerpos se obtienen usando técn icas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y se evalúa la función de los fragm entos de la m ism a m anera que los anticuerpos intactos.
La expresión "anticuerpo m onoclonal" com o se usa en la presente m em oria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancia lm ente hom ogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que com prenden la población son idénticos, excepto por posib les m utaciones naturales y/o m odificaciones postraduccionales (p. ej., isom erizaciones, am idaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores.
Los anticuerpos m onoclonales son muy específicos, están dirig idos contra un único sitio antigénico. Adem ás, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típ icam ente incluyen diferentes anticuerpos dirig idos contra diferentes determ inantes (epítopos), cada anticuerpo m onoclonal se dirige contra un único determ inante en el antígeno. Adem ás de su especific idad, los anticuerpos m onoclonales son ventajosos porque son sin te tizados por el cultivo de hibridom a, no contam inados por otras inm unoglobulinas. El m odificador "m onoclonal" indica el carácte r del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancia lm ente hom ogénea, y no debe interpretarse com o que requiere la producción del anticuerpo por ningún m étodo particular. P o r ejem plo, los anticuerpos m onoclonales para usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por el m étodo del hibridom a descrito por prim era vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden hacer por m étodos de ADN recom binante (véase, por ejem plo, patente de EE.UU. N° 4.816.567). Los "anticuerpos m onoclonales" tam bién se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técn icas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejem plo.
Los anticuerpos m onoclonales de la presente invención incluyen específicam ente anticuerpos "quim éricos" (inm unoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u hom óloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a un clase o subclase particu lar de anticuerpos, m ientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas u hom ólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así com o a fragm entos de dichos anticuerpos, siem pre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. N° 4.816, 567; M orrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos qu im éricos de interés en la presente m em oria incluyen anticuerpos "prim atizados" que com prenden secuencias de unión al antígeno del dom inio variab le derivadas de un prim ate no hum ano (p. ej., cercopitécidos, mono etc.) y secuencias de la región constante humanas.
Las form as "hum anizadas" de anticuerpos no hum anos (p. ej., m urinos) son inm unoglobulinas quim éricas, cadenas de inm unoglobulinas o fragm entos de las m ismas (tales com o Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) de secuencias m ayoritariam ente hum anas, que contienen una secuencia m ínima derivada de inm unoglobulina no humana. En su m ayor parte, los anticuerpos hum anizados son inm unoglobulinas hum anas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reem plazan por restos de una región hipervariable de una especie no hum ana (anticuerpo donador) ta l com o ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afin idad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región arm azón de Fv (FR) de la inm unoglobulina hum ana se reem plazan por los restos no hum anos correspondientes. Adem ás, "anticuerpos hum anizados" com o se usa en la presente m em oria tam bién puede com prender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas m odificaciones se realizan para refinar y optim izar aún más el rendim iento del anticuerpo. El anticuerpo hum anizado de m anera óptim a tam bién com prenderá al menos una parte de una región constante de inm unoglobulina (Fc), típ icam ente la de una inm unoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichm ann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
La expresión "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variab les y constantes que corresponden sustancia lm ente a secuencias de inm unoglobulina de línea germ inal hum ana conocidas en la técnica, que incluyen, por ejem plo, las descritas por Kabat et al. (Véase Kabat et al. (1991) en el lugar citado). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de am inoácidos no codificados por secuencias de inm unoglobulina de la línea germ inal hum ana (p. ej., m utaciones introducidas por m utagénesis a leatoria o específica del sitio in vitro o por m utación som ática in vivo), por ejem plo en las CDR, y en particular, CDR3. El anticuerpo hum ano puede tener al m enos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustitu idas por un resto de am inoácido que no está codificado por la secuencia de inm unoglobulina de la línea germ inal humana.
Com o se usa en la presente m em oria, "anticuerpo generado in vitro" se refiere a un anticuerpo donde toda o parte de la región variab le (p. ej., al m enos una CDR) se genera en una selección de células no inm unitarias (p. ej., una presentación en fagos in vitro, chip de proteína o cua lqu ier otro m étodo en el que se pueda ensayar la capacidad de las secuencias candidatas para unirse a un antígeno). Por lo tanto, este térm ino excluye preferib lem ente secuencias generadas por reordenam iento genóm ico en una cé lu la inmunitaria.
Un anticuerpo o inm unoglobulina "biespecífico" o "b ifuncional" es un anticuerpo o inm unoglobulina híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por una variedad de m étodos que incluyen la fusión de hibridom as o la unión de fragm entos Fab'. Véase, p. ej., Songsivila i y Lachm ann, Clin. Exp. Immunol79: 315-321 (1990). Num erosos m étodos conocidos por los expertos en la técn ica están disponib les para obtener anticuerpos o fragm entos de unión al antígeno de los m ismos. Por ejem plo, los anticuerpos se pueden producir usando m étodos de ADN recom binante (patente de EE.UU. N° 4.816.567). Los anticuerpos m onoclonales tam bién se pueden producir m ediante la generación de hibridom as (véase, p. ej., Kohler y M ilstein (1975) Nature, 256: 495-499) de acuerdo con m étodos conocidos. Los hibridom as form ados de esta m anera después se seleccionan usando m étodos estándar, tales com o el ensayo de inm unoabsorción ligado a enzim as (ELISA) y el análisis de resonancia de plasm ones de superficie (BIACORE™ ), para identificar uno o más hibridom as que producen un anticuerpo que se une específicam ente con un antígeno específico. Se puede usar cua lqu ier form a del antígeno especificado com o inm unógeno, p. ej., antígeno recom binante, form as naturales, cua lqu ier variante o fragm ento del mismo, así com o su péptido antigénico".
Un m étodo ilustrativo para hacer de anticuerpos incluye el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas, p. ej., b ibliotecas de presentación en fagos o ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejem plo, en Ladner et al., patente de EE.UU. N25.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; C lackson et al. (1991) Nature, 352: 624­ 628.
Adem ás del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno especificado se puede usar para inm unizar un animal no humano, p. ej., un roedor, p. ej., un ratón, hám ster o rata. En una realización, el animal no hum ano incluye al menos una parte de un gen de inm unoglobulina humana. Por ejem plo, se pueden m odificar genéticam ente cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragm entos grandes de locus de Ig humana. Usando la tecnología del hibridom a, se pueden producir y se leccionar anticuerpos m onoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especific idad deseada. Véase, p. ej., XENO M O USE™ , Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, docum entos US 2003-0070185, W O 96/34096 y W O96/33735.
Se puede obtener un anticuerpo m onoclonal de un animal no humano, y después m odificarlo, p. ej., hum anizado, desinm unizado, quim érico, usando técn icas de ADN recom binante conocidas en la técnica. Se han descrito una variedad de enfoques para hacer anticuerpos quim éricos. Véase, p. ej., M orrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314: 452, 1985, Cabilly et al., patente de EE.u U. n° 4.816.567; Boss et al., patente de EE.UU. N° 4.816.397; Tanaguchi et al., docum entos EP 0171496; EP 0173494, GB 2177096. Los anticuerpos hum anizados tam bién se pueden producir, por ejem plo, usando ratones transgén icos que expresan genes de cadena pesada y ligera hum anos, pero son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inm unoglobulina endógena de ratón. W in ter describe un m étodo de injerto de CDR de ejem plo que se puede usar para preparar los anticuerpos hum anizados descritos en la presente m em oria (patente de EE.UU. N° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo hum ano particular se pueden reem plazar por al m enos una porción de una CDR no hum ana, o solo algunas de las CDR se pueden reem plazar por CDR no hum anas. Solo es necesario reem plazar el núm ero de CDR requeridas para la unión del anticuerpo hum anizado a un antígeno predeterm inado.
Los anticuerpos hum anizados o fragm entos de los m ism os se pueden generar reem plazando secuencias del dom in io variab le Fv que no están directam ente im plicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de dom in ios variab les Fv humanos. Proporcionan m étodos de ejem plo para generar anticuerpos hum anizados o fragm entos de los m ismos M orrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; y los docum entos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos m étodos incluyen aislar, m anipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todos o parte de los dom in ios variables Fv de inm unoglobulina de al m enos uno de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucle icos se pueden obtener a partir de un hibridom a que produce un anticuerpo contra un objetivo predeterm inado, com o se ha descrito antes com o de otras fuentes. El ADN recom binante que codifica la m olécula de anticuerpo hum anizado después se puede c lonar en un vecto r de expresión adecuado.
Un anticuerpo hum anizado se puede optim izar m ediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de línea germ inal y/o retrom utaciones. Dichas m oléculas de inm unoglobulina a lteradas se pueden preparar mediante cualquiera de varias técn icas conocidas en la técn ica (p. ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; O lsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), y se pueden hacer de acuerdo con las enseñanzas del docum ento EP 239400.
Un anticuerpo o fragm ento del m ismo tam bién se puede m odificar por e lim inación específica de epítopos de células T hum anas o "desinm unización" m ediante los m étodos descritos en los docum entos W O 98/52976 y W O 00/34317. Brevem ente, se pueden analizar en los dom inios variab les de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo los péptidos que se unan al MHC de clase II; estos péptidos representan potenciales epítopos de células T (com o se define en los docum entos W O 98/52976 y W O 00/34317). Para la detección de potenciales epítopos de células T, se puede aplicar un procedim iento de m odelización por ordenador denom inado "enhebrado de péptidos", y adem ás se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II hum anos los motivos presentes en las secuencias VH y VL, com o se describe en los docum entos W O 98/52976 y W O 00/34317. Estos m otivos se unen a cualqu iera de los 18 alotipos principales de DR de MHC de clase II y, por lo tanto, constituyen potenciales epítopos de células T. Los potenciales epítopos de células T detectados se pueden e lim inar sustituyendo núm eros pequeños de restos de am inoácidos en los dom in ios variables, o preferib lem ente, por sustituciones de am inoácidos individuales. T íp icam ente, se realizan sustituciones conservadoras. A m enudo, pero no exclusivam ente, se puede usar un am inoácido com ún a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germ inal humana. Las secuencias de la línea germ inal humana, p. ej., se describen en Tom linson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, GP et al. (1995) Immunol. Today vol. 16 (5): 237-242; y Tom linson et al. (1995) Em BO J. 14: 14: 4628-4638. El d irectorio V BASE proporciona un directorio com pleto de secuencias de región variab le de inm unoglobulina hum ana (com pilado por Tom linson, LA. et al. MRC C enter fo r Protein Engineering, Cam bridge, Reino Unido). Estas secuencias se pueden usar com o fuente de secuencia humana, p. ej., para regiones arm azón y CDR. Tam bién se pueden usar las regiones arm azón hum anas consenso, p. ej., com o se describe en la patente de EE.UU. N° 6.300.064.
El em pare jam iento entre sí de un VH y VL form a un único sitio de unión al antígeno. El dom inio CH más próxim o a VH se designa com o CH1. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, m ientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del ¡sotipo de la cadena H. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas llamadas regiones armazón (FR1, FR2, FR3 y FR4), que forman una estructura soporte para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayoría de los restos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR se denominan CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, los constituyentes de la CDR en la cadena pesada se denominan H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes de la CDR en la cadena ligera se denominan L1, L2 y L3.
El término "variable" se refiere a las partes de los dominios de inmunoglobulina que presentan variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el(los) "dominio(s) variable(s)"). La variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos subdominios se denominan regiones "hipervariables" o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR). Las partes más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "armazón" (FRM). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras que se encuentran de forma natural comprenden cuatro regiones FRM, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectados por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., en el lugar citado). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión al antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y activación del complemento.
También se prefiere para la molécula de unión de la invención que el primer y segundo dominio formen una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, mAb de dominio único scFv, diacuerpo u oligómeros de los mismos.
Los términos "CDR" y su plural "las CDR" se refieren a una región determinante de complementariedad (CDR), tres de las cuales constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDR contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y están separadas por secuencias de aminoácidos que comprenden regiones de estructura soporte o armazón. Los límites y longitudes de las CDR definitorios exactos están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, se pueden mencionar por las definiciones de límites de Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra, incluyendo el sistema de numeración descrito en la presente memoria. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene cierto grado de solapamiento en lo que constituyen las llamadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Por lo tanto, las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas límite con respecto a la región armazón adyacente. Véanse, por ejemplo, Kabat, Chothia y/o MacCallum (Kabat et al., en el lugar citado; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; y MacCallum et al., J. Mol. Biol., 1996, 262: 732). Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el llamado sistema Kabat.
El término "aminoácido" o "resto de aminoácido" se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque se pueden usar aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. En general, los aminoácidos se pueden agrupar según tengan una cadena lateral no polar (p. ej., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral con carga negativa (p. ej., Asp, Glu); una cadena lateral con carga positiva (p. ej., Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar sin carga (p. ej., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).
La expresión "región hipervariable" (también conocida como "regiones determinantes de complementariedad" o CDR) cuando se usa en la presente memoria se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que están (normalmente tres o cuatro regiones cortas de variabilidad de secuencia extrema) dentro del dominio de la región V de una inmunoglobulina que forma el sitio de unión al antígeno y son los principales determinantes de la especificidad del antígeno. Hay al menos dos métodos para identificar los restos de las CDR: (1) Un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat et al., en el lugar citado); y (2) Un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Sin embargo, en la medida en que dos técnicas de identificación de restos definen regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. Sin embargo, en general, los restos de las CDR se identifican preferiblemente de acuerdo con el denominado sistema (numeración) de Kabat.
La expresión "región armazón" se refiere a las partes reconocidas en la técnica de una región variable de anticuerpo que existen entre las CDR más divergentes (es decir, hipervariables). Dichas regiones armazón se denominan típicamente armazones 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4) y proporcionan una estructura soporte para la presentación de las seis CDR (tres de la cadena pesada y tres de la cadena ligera) en el espacio tridimensional, para formar una superficie de unión al antígeno.
Típicamente, las CDR forman una estructura de bucle que se puede clasificar como una estructura canónica. La expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación de la cadena principal que es adoptada por los bucles de unión al antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha encontrado que cinco de los seis bucles de unión al antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica se puede caracterizar por los ángulos de torsión de la cadena principal de polipéptido. Los bucles correspondientes entre anticuerpos pueden, por lo tanto, tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del bucle y los restos de aminoácidos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro del armazón conservado (es decir, fuera del bucle). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular se puede hacer basándose en la presencia de estos restos de aminoácidos clave. La expresión "estructura canónica" también puede incluir consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según lo catalogado por Kabat (Kabat et al., en el lugar citado). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un estándar ampliamente adoptado para numerar los restos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte de la presente memoria. También se pueden usar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, esas diferencias no reflejadas completamente por la numeración de Kabat se pueden describir por el sistema de numeración de Chothia et al., y/o poner de manifiesto por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelización computacional bidimensional o tridimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpos dada se puede poner en una clase canónica que permita, entre otras cosas, identificar secuencias de bastidor adecuadas (p. ej., basado en un deseo de incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y consideraciones estructurales como describen Chothia et al., en el lugar citado, y sus implicaciones para la construcción de aspectos canónicos de la estructura de anticuerpos, se describen en la bibliografía.
La CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión de anticuerpos. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos restos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura de los anticuerpos, vea "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura subunidad, p. ej., una estructura CH, VH, CL, VL, CDR, FR, comprende fragmentos activos, p. ej., la parte de la subunidad VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión al antígeno, o, p. ej., la parte de la subunidad CH que se une y/o activa, p. ej., un receptor y/o complemento Fc. Las CDR típicamente se refieren a las CDR de Kabat, como se describe en "Sequences of Proteins of immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. (1991), eds. Kabat et al. Otro estándar para caracterizar el sitio de unión al antígeno es referirse a los bucles hipervariables descritos por Chothia. Véase, p. ej., Chothia, et al. (1987; J. Mol. Biol. 227: 799­ 817); y Tomlinson et al. (1995) EM BO J. 14: 4628-4638. Otro estándar más es la definición de AbM usada por el software de modelización de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, p. ej., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains". En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Las realizaciones descritas con respecto a las CDR de Kabat se pueden implementar alternativamente usando relaciones similares descritas con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos por AbM.
La secuencia de los genes de anticuerpos después del ensamblaje y mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., Eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). En consecuencia, el sistema inmunitario proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La o las secuencias se pueden generar por reordenación in vivo de los segmentos V, D y J de cadenas pesadas, y los segmentos V y J de cadenas ligeras. Alternativamente, la o las secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce la reordenación, p. ej., estimulación in vitro. Alternativamente, parte o toda la o las secuencias se pueden obtener por corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase, p. ej. patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo las de una colección genéticamente diversa.
En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la invención comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:
(1) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 1, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 2, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 3, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 4, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 6;
(2) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 11, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 13, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 14, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 15 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 16;
(3) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 21, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 22, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 23, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 24, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 25 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 26;
(4) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 31, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 32, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 33, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 34, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 36;
(5) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 41, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 42, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 43, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 44, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 46;
(6) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 51, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 52, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 53, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 54, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 56;
(7) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 61, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 62, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 63, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 64, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 66;
(8) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 71, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 72, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 73, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 74, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 76;
(9) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 161, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 162, CDR-h 3 com o se representa en la SEQ ID NO: 163, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 166;
(10) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 171, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 172, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 173, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 176;
(11) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 181, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 182, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 183, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 186;
(12) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 191, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 192, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 193, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 196;
(13) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 201, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 202, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 203, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 206;
(14) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 211, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 212, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 213, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 214, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 215 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 216;
(15) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 221, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 222, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 223, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 226;
(16) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 311, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 312, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 313, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 314, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 315 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 316;
(17) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 321, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 322, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 323, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 324, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 325 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 326;
(18) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 331, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 332, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 333, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 334, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 335 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 336;
(19) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 341, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 342, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 343, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 344, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 345 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 346;
(20) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 351, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 352, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 353, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 354, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 355 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 356;
(21) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 361, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 362, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 363, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 364, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 365 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 366;
(22) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 371, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 372, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 373, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 374, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 375 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 376;
(23) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 381, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 382, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 383, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 384, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 385 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 386;
(24) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 581, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 582, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 583, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 584, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 585 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 586;
(25) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 591, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 592, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 593, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 594, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 595 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 596;
(26) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 601, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 602, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 603, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 604, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 605 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 606;
(27) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 611, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 612, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 613, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 614, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 615 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 616;
(28) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 621, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 622, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 623, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 624, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 625 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 626;
(29) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 631, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 632, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 633, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 634, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 635 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 636;
(30) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 641, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 642, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 643, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 644, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 645 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 646;
(31) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 651, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 652, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 653, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 654, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 655 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 656;
(32) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 661, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 662, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 663, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 664, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 665 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 666;
(33) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 671, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 672, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 673, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 674, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 675 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 676;
(34) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 681, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 682, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 683, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 684, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 685 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 686;
(35) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 691, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 692, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 693, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 694, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 695 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 696;
(36) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 701, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 702, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 703, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 704, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 705 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 706;
(37) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 711, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 712, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 713, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 714, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 715 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 716;
(38) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 721, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 722, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 723, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 724, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 725 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 726;
(39) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 731, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 732, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 733, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 734, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 735 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 736;
(40) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 741, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 742, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 743, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 744, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 745 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 746;
(41) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 751, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 752, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 753, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 754, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 755 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 756;
(42) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 761, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 762, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 763, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 764, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 765 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 766;
(43) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 771, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 772, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 773, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 774, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 775 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 776;
(44) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 781, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 782, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 783, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 784, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 785 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 786;
(45) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 791, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 792, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 793, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 794, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 795 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 796;
(46) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 801, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 802, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 803, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 804, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 805 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 806;
(47) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 811, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 812, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 813, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 814, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 815 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 816;
(48) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 821, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 822, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 823, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 824, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 825 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 826;
(49) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 831, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 832, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 833, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 834, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 835 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 836;
(50) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 961, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 962, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 963, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 964, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 965 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 966;
(51) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 971, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 972, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 973, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 974, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 975 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 976;
(52) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 981, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 982, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 983, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 984, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 985 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 986; and
(53) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 991, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 992, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 993, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 994, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 995 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 996.
En otra realización más, el prim er dom in io de unión de la m olécula de unión com prende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987 y SEQ ID NO: 997.
En otra realización, el prim er dom in io de unión de la molécula de unión com prende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL com o se representa en la SEQ ID in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988 y SEQ ID NO: 998.
En una realización, el prim er dom in io de unión de la molécula de unión com prende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en:
(1) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 7, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 8;
(2) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 17, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 18;
(3) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 27, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 28;
(4) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 37, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 38;
(5) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 47, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 48;
(6) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 57, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 58;
(7) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 67, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 68;
(8) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 77, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 78;
(9) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 167, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 168;
(10) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 177, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 178;
(11) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 187, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 188;
(12) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 197, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 198;
(13) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 207, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 208;
(14) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 217, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 218;
(15) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 227, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 228;
(16) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 317, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 318;
(17) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 327, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 328;
(18) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 337, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 338;
(19) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 347, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 348;
(20) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 357, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 358;
(21) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 367, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 368;
(22) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 377, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 378;
(23) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 387, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 388;
(24) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 587, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 588;
(25) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 597, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 598;
(26) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 607, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 608;
(27) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 617, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 618;
(28) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 627, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 628;
(29) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 637, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 638;
(30) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 647, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 648;
(31) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 657, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 658;
(32) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 667, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 668;
(33) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 677, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 678;
(34) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 687, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 688;
(35) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 697, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 698;
(36) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 707, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 708;
(37) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 717, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 718
(38) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 727, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 728
(39) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 737, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 738
(40) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 747, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 748
(41) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 757, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 758
(42) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 767, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 768
(43) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 777, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 778
(44) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 787, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 788
(45) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 797, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 798
(46) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 807, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 808
(47) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 817, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 818
(48) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 827, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 828
(49) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 837, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 838
(50) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 967, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 968
(51) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 977, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 978
(52) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 987, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 988 and
(53) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 997, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 998.
En un ejem plo, el prim er dom in io de unión com prende una secuencia de am inoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 989, y SEQ ID NO: 999.
Se prefiere que una m olécula de unión de la presente invención tenga una región CDR-H3 de 12 am inoácidos de longitud, en donde un resto de tirosina (Y) está presente en la posición 3, 4 y 12. Una CDR-H3 preferida se muestra en las SEQ ID NO: 43, 193, 333, 613, 703, 733, 823 o 973. Por consiguiente, una m olécula de unión de la presente invención tiene en una realización preferida una CDR-H3 m ostrada en las SEQ ID NO: 43, 193, 333, 613, 703, 733, 823 o 973.
Se prefiere una m olécula de unión que tiene la secuencia de am inoácidos m ostrada en la SEQ ID NO: 340. Tam bién se prefiere una m olécula de unión que tiene la secuencia de am inoácidos m ostrada en o SEQ ID NO: 980.
La m olécula de unión de la presente invención es preferib lem ente una m olécula de unión "aislada". "A islada" cuando se usa para describ ir la m olécula de unión descrita en la presente m emoria, significa una m olécula de unión que se ha identificado, separado y/o recuperado de un com ponente de su entorno de producción. Preferiblem ente, la m olécula de unión aislada carece de asociación con todos los dem ás com ponentes de su entorno de producción. Los com ponentes contam inantes de su entorno de producción, com o el que resulta de las células transfectadas recom binantes, son m ateriales que típ icam ente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzim as, horm onas y otros solutos prote icos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la m olécula de unión se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al m enos 15 restos de secuencia de am inoácidos N-term inal o internos mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta hom ogeneidad por SDS-PAG E bajo en condic iones no reductoras o reductoras usando azul Coom assie o, preferib lem ente, tinción con plata. Sin em bargo, norm alm ente, un anticuerpo aislado se preparará m ediante al menos una etapa de purificación.
Se contem plan m odificaciones de las secuencias de am inoácidos de las m oléculas de unión descritas en la presente m emoria. Por ejem plo, puede ser deseable m ejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de am inoácidos de las m oléculas de unión se preparan introduciendo cam bios de nucleótidos adecuados en el ácido nucleico de las m oléculas de unión, o por síntesis de péptidos.
Dichas m odificaciones incluyen, por ejem plo, elim inaciones y/o inserciones en, y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de am inoácidos de las m oléculas de unión. Se hace cua lquier com binación de elim inación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cam bios de am inoácidos tam bién pueden alte rar los procesos postraduccionales de las m oléculas de unión, tal com o cam biando el número o la posición de los sitios de glucosilación. Preferiblem ente, se pueden sustitu ir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 am inoácidos en una CDR, m ientras que se pueden sustitu ir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 am inoácidos en las regiones arm azón (FR). Las sustituciones son preferib lem ente sustituciones conservadoras com o se describe en la presente m emoria. Adicional o alternativam ente, se pueden insertar o e lim inar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 am inoácidos en cada una de las CDR (por supuesto dependiendo de su longitud), m ientras que se pueden insertar o e lim inar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 am inoácidos en cada una de las FR.
Un m étodo útil para la identificación de ciertos restos o regiones de las m oléculas de unión que son ubicaciones preferidas para la m utagénesis se denom ina "m utagénesis de barrido de alanina" com o describen Cunningham y W ells en Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un resto o grupo de restos d iana dentro de la molécula de unión (p. ej., restos cargados tales com o arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un am inoácido neutro o con carga negativa (lo más preferib lem ente a lanina o polia lanina) para afectar a la interacción de los am inoácidos con el epítopo.
Aquellas ubicaciones de am inoácidos que dem uestran sensib ilidad funcional a las sustituciones después se refinan introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para in troducir una variación de secuencia de am inoácidos está predeterm inado, la naturaleza de la mutación por sí m ism a no necesita ser predeterm inada. Por ejem plo, para analizar el rendim iento de una m utación en un sitio dado, se lleva a cabo un barrido de ala o m utagénesis a leatoria en un codón o región diana y se seleccionan las variantes de las m oléculas de unión expresadas según la actividad deseada.
Preferiblem ente, las inserciones de secuencia de am inoácidos incluyen fusiones am ino y/o carboxilo term inales que varían en longitud desde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos a polipéptidos que contienen cien o más restos, así com o inserciones in trasecuencia de restos de am inoácidos sim ples o m últiples. Una varian te de inserción de la molécula de unión incluye la fusión al extrem o N o C del anticuerpo a una enzim a o una fusión a un po lipéptido que aum enta la sem ivida en el suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de am inoácidos. Estas variantes tienen preferib lem ente al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de am inoácidos en la m olécula de unión sustitu idos por un resto diferente. Los sitios de m ayor interés para la m utagénesis por sustitución incluyen las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particu lar las regiones hipervariables, pero tam bién están contem pladas alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera.
Por ejem plo, si una secuencia de CDR abarca 6 am inoácidos, está previsto que uno, dos o tres de estos am inoácidos sean sustitu idos. De m anera sim ilar, si una secuencia de CDR abarca 15 am inoácidos, está previsto que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos am inoácidos sean sustitu idos.
En general, si se sustituyen am inoácidos en una o más o todas las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustitu ida" obtenida en ese m om ento sea al m enos 60%, más preferib lem ente 65%, incluso más preferib lem ente 70%, en particular preferib lem ente 75%, más en particular preferib lem ente 80% idéntica a la secuencia de CDR "original". Esto significa que depende de la longitud de la CDR en qué grado es idéntica a la secuencia "sustitu ida". Por ejem plo, una CDR que tiene 5 am inoácidos es preferib lem ente 80% idéntica a su secuencia sustitu ida para tener al menos un am inoácido sustitu ido. Por consiguiente, las CDR de la m olécula de unión pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustitu idas, p. ej., la CDRL1 puede tener 80%, m ientras que la CDRL3 puede tener 90%.
Las sustituciones (o reem plazos) preferidas son sustituciones conservadoras. Sin em bargo, está prevista cua lquier sustitución (incluyendo sustitución no conservadora o una o más de las "sustituciones de ejem plo" citadas en la Tabla 1, a continuación) con la condición de que la m olécula de unión conserve su capacidad de unirse al BCMA por el prim er dom in io de unión y al CD3 épsilon por el segundo dom in io de unión y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia entonces sustitu ida (al menos 60%, más preferib lem ente 65%, incluso más preferib lem ente 70%, en particu lar preferib lem ente 75%, más en particular preferib lem ente 80% idéntica a la secuencia "original" de la CDR). Las sustituciones conservadoras se m uestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones producen un cam bio en la actividad biológica, entonces se pueden in troducir cam bios más sustancia les, denom inados "sustituciones de ejem plo" en la Tabla 1, o com o se describe más adelante en referencia a las clases de am inoácidos, y los productos se seleccionan según una característica deseada.
Tabla 1: Sustituciones de am inoácidos
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Las m odificaciones sustancia les en las propiedades biológicas de la m olécula de unión de la presente invención se logran seleccionando sustituciones que difieren significativam ente en su efecto en el m antenim iento de (a) la estructura de la cadena principal de po lipéptido en el área de la sustitución, por ejem plo, com o una conform ación en lám ina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la m olécula en el sitio diana, o (c) el volum en de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos según las propiedades com unes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) arom áticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras im plicarán el intercam bio de un m iem bro de una de estas clases por otra clase. C ualquier resto de ciste ína que no esté im plicado en el m antenim iento de la conform ación adecuada de la molécula de unión se puede sustitu ir, generalm ente por serina, para m ejorar la estabilidad oxidativa de la m olécula y ev ita r la reticulación aberrante. A la inversa, se puede añad ir enlace(s) de cisteína al anticuerpo para m ejorar su estabilidad (en particu lar cuando el anticuerpo es un fragm ento de anticuerpo tal com o un fragm ento Fv).
Un tipo particularm ente preferido de varian te de sustitución im plica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo original (p. ej., un anticuerpo hum anizado o humano). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarro llo posterio r tendrán propiedades biológicas m ejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del cual se generan. Una form a conveniente de generar dichas variantes de sustitución im plica la m aduración de afinidad usando la presentación en fagos. Brevem ente, varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posib les sustituciones de am inoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan en una form a m onovalente a partir de partículas de fagos filam entosos com o fusiones con el producto del gen III de M13 em paquetado dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos después se seleccionan según su actividad biológica (p. ej., afin idad de unión) com o se describe en la presente memoria. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para m odificar, se puede llevar a cabo la m utagénesis de barrido de alanina para identificar los restos de la región hipervariable que contribuyen significativam ente a la unión al antígeno. A lternativam ente, o adicionalm ente, puede ser beneficioso analizar una estructura crista lina del com ple jo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el dom inio de unión y, p. ej., el BCMA humano. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técn icas elaboradas en la presente m em oria. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se som ete a cribado com o se describe en la presente m em oria y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el desarro llo posterior.
Están contem pladas otras m odificaciones de la m olécula de unión en la presente memoria. Por ejem plo, la molécula de unión puede estar unida a uno de una variedad de polím eros no proteicos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol, po lioxia lqu ilenos o copolím eros de polietilenglicol y polipropilenglicol. La m olécula de unión tam bién puede estar atrapada en m icrocápsulas preparadas, por ejem plo, por técn icas de coacervación o por polim erización interfacial (por ejem plo, h idroxim etilce lu losa o m icrocápsulas de ge la tina y m icrocápsulas de po li(m etacrilato de metilo), respectivam ente), en sistem as colo idales de sum inistro de fárm acos (por ejem plo, liposom as, m icroesferas de albúm ina, m icroem ulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en m acroem ulsiones. Dichas técn icas se describen en Rem ington's Pharm aceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980).
Las m oléculas de unión descritas en la presente m em oria tam bién se pueden form ular com o inm unoliposom as. Un "liposom a" es una pequeña vesícu la com puesta de varios tipos de lípidos, fosfo líp idos y/o tensioactivo que es útil para sum inistrar un m edicam ento a un m am ífero. Los com ponentes del liposom a norm alm ente se disponen en una form ación de bicapa, s im ilar a la disposición de los lípidos de las m em branas biológicas. Los liposom as que contienen el anticuerpo se preparan por m étodos conocidos en la técn ica, ta l com o se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); patentes n° 4.485.045 y 4.544.545; y W O 97/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposom as con tiem po en la circulación m ejorado se describen en la patente de EE.UU. N° 5.013.556. Se pueden generar liposom as particularm ente útiles por el m étodo de evaporación de fase inversa con una com posición lipídica que com prende fosfatid ilco lina, colestero l y fosfatid ile tano lam ina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposom as se extruyen a través de filtros de tam año de poros defin ido para dar liposom as con el d iám etro deseado. Los fragm entos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden con jugar con los liposom as com o se describe en Martin et al. J. Biol. Chem 257: 286-288 (1982) por una reacción de intercam bio de disulfuro. O pcionalm ente un agente qu im ioterapéutico está contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
Cuando se usan técn icas recom binantes, la m olécula de unión se puede producir de form a intracelular, en el espacio perip lásm ico, o secre tar directam ente al medio. Si la m olécula de unión se produce de form a intracelular, com o prim er paso, los residuos en partículas ya sean células hospedantes o fragm entos lisados, se elim inan, por ejemplo, por centrifugación o u ltrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedim iento para a is lar anticuerpos que se secretan al espacio perip lásm ico de E. coli.
La com posición de la m olécula de unión preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, crom atogra fía de hidroxilapatita, e lectroforesis en gel, d iális is y crom atogra fía de afinidad, siendo la crom atogra fía de afinidad la técn ica de purificación preferida.
La presente invención tam bién se refiere a una secuencia de ácido nucle ico que cod ifica una m olécula de unión de la invención. La expresión "ácido nucleico" es bien conocida para el experto y abarca ADN (tal com o el ADNc) y ARN (tal com o ARNm ). El ácido nucleico puede ser b icatenario y m onocatenario, lineal y circular. Dicha m olécula de ácido nucleico está com prendida preferib lem ente en un vecto r que está com prendido preferib lem ente en una célu la hospedante. Dicha célu la hospedante, p. ej., después de la transform ación o transfección con la secuencia de ácido nucleico de la invención, es capaz de expresar la m olécula de unión. Para ese propósito, la m olécula de ácido nucleico está operativam ente un ida con secuencias de control.
Un vecto r de la presente invención es una m olécula de ácido nucleico usada com o un vehículo para transferir m aterial genético (extraño) a una célula. El térm ino "vector" abarca, pero no se lim ita a, plásm idos, virus, cósm idos y crom osom as artificiales. En general, los vectores genéticam ente m odificados com prenden un origen de replicación, un sitio de m ulticlonación y un m arcador seleccionable. El vecto r en sí m ism o en general es una secuencia de nucleótidos, norm alm ente una secuencia de ADN que com prende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve com o la "cadena principal" del vector. Los vectores m odernos pueden abarcar características adicionales adem ás del inserto de transgén y una cadena principal: prom otor, m arcador genético, resistencia a antibióticos, gen indicador, secuencia de direccionam iento, m arcador de purificación de proteínas. Los vectores llam ados vectores de expresión (construcciones de expresión) específicam ente son para la expresión del transgén en la célu la diana, y en general tienen secuencias de contro l tales com o una secuencia prom otora que acciona la expresión del transgén. La inserción de un vecto r en la célu la d iana norm alm ente se denom ina "transform ación" para las células bacterianas, "transfección" para las células eucariotas, aunque la inserción de un vecto r viral tam bién se denom ina "transducción".
Com o se usa en la presente m emoria, el térm ino "cé lula hospedante" de la presente invención pretende referirse a una célu la en la que se introduce un ácido nucleico que codifica la m olécula de unión de la invención por medio de transform ación, transfección y sim ilares. Debe entenderse que dichos térm inos se refieren no solo a la célu la objeto particu lar sino a la progenie o progenie potencial de d icha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas m odificaciones en las generaciones siguientes debido a m utaciones o influencias am bientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la cé lu la original, pero aún se incluye dentro del a lcance del térm ino com o se usa en la presente memoria.
Com o se usa en la presente memoria, el térm ino "expresión" incluye cua lqu ier etapa im plicada en la producción de una m olécula de unión de la invención que incluye, pero no se lim ita a, transcripción, m odificación postranscripcional, traducción, m odificación postraduccional y secreción.
La expresión "secuencias de contro l" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia cod ificante operativam ente unida en un organism o hospedante particular. Las secuencias de contro l que son adecuadas para procariotas, por ejem plo, incluyen un prom otor, opcionalm ente una secuencia de operador y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas usan prom otores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "operativam ente unido" cuando está puesto en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejem plo, el ADN para una secuencia previa o líder secretora está operativam ente unido al ADN para un polipéptido si se expresa com o una preproteína que partic ipa en la secreción del polipéptido; un prom otor o potenciador está operativam ente unido a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosom as está operativam ente unido a una secuencia de codificación si está situado de m anera que facilite la traducción. En general, "operativam ente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin em bargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La conexión se logra mediante ligado en sitios de restricción convenientes. Si d ichos sitios no existen, se usan los adaptadores o conectores o ligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Las expresiones "cé lu la hospedante", "cé lula diana" o "cé lula receptora" se pretende que incluyan cua lqu ie r cé lu la individual o cultivo ce lu la r que pueda ser o ha sido receptor de vectores o de la incorporación de m oléculas de ácido nucleico, po linucleótidos y/o proteínas exógenas. Tam bién se pretende que incluya la progenie de una sola célula, y la progenie puede no ser necesariam ente com pletam ente idéntica (en m orfología o en el com plem ento de ADN genóm ico o total) a la cé lu la parental original debido a una m utación natural, accidental o deliberada. Las células pueden ser procariotas o eucariotas, e incluyen, pero no se lim itan a, célu las bacterianas, célu las de levadura, células anim ales y células de mam ífero, p. ej., murinas, de rata, de m acaco o humanas.
Las célu las hospedantes adecuadas incluyen célu las hospedante procariotas y eucariotas que incluyen levaduras, hongos, células de insectos y células de mam íferos.
La m olécula de unión de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, la m olécula de unión de la invención, preferib lem ente la m olécula de unión se aísla de la pasta de células de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar, p. ej., por crom atogra fía de afinidad y/o exclusión por tam año. La purificación final se puede llevar a cabo de m anera sim ilar al procedim iento para purificar el anticuerpo expresado p. ej., en células CHO. Adem ás de los procariotas, los m icrobios eucariotas tales com o hongos filam entosos o levaduras son hospedantes de clonación o expresión adecuados para la m olécula de unión de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería com ún, es el más usado entre los m icroorganism os hospedantes eucariotas inferiores. Sin em bargo, una serie de otros géneros, especies y cepas están habitualm ente d isponib les y son útiles en la presente m emoria, tales com o Schizosaccharomyces pombe, hospedantes de K luyverom yces tales como, por ejem plo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgarícus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATc C 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrow ia (docum ento EP 402226); Pichia pastoris (docum ento EP 183070); Candida Trichoderma reesia (docum ento EP 244 234); Neurospora crassa; Schw anniom yces tales com o Schwanniomyces occidentalis; y hongos filam entosos ta les como, p. ej., Neurospora, Penicillium , Tolypocladium , y hospedantes Aspergillus ta les com o A. nidulans y A. niger.
Las células hospedantes adecuadas para la expresión de la m olécula de unión glicosilada de la invención, preferib lem ente las m oléculas de unión derivadas de anticuerpos proceden de organism os m ulticelu lares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado num erosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedantes de insectos perm isivas de hospedantes tales com o Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (m osca de la fruta) y Bombyx morí. Están públicam ente d isponib les una variedad de cepas vira les para la transfección, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden usar com o los virus en la presente m em oria de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tom ate, Arabidopsis y tabaco tam bién se pueden usar com o hospedantes. Los vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en el cultivo de células vegetales son conocidos por los expertos en la m ateria. Véase, p. ej., H iatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol B io l32: 979-986.
Sin em bargo, el interés ha sido m ayor en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedim iento de rutina. E jemplos de líneas celu lares hospedantes de m am ífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transform ada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón em brionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecim iento en cultivo en suspensión, G raham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hám ster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hám ster chino/-D HFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (V e RO-76, ATCC CRL1587); células de carcinom a de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC c C l 34); células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulm ón hum ano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas hum anas (Hep G2,1413 8065); tum or m amario de ratón (MMT 060562, a T c C CCL5 1); células TRI (M ather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; célu las FS4; y una línea de hepatom a humano (Hep G2).
Cuando se usan técn icas recom binantes, la m olécula de unión de la invención se puede producir de form a intracelular, en el espacio perip lásm ico, o secretar directam ente en el medio. Si la m olécula de unión se produce de form a intracelular, com o una prim era etapa, los residuos en partículas ya sean células hospedantes o fragm entos lisados, se elim inan, por ejem plo, por centrifugación o u ltrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedim iento para a is lar anticuerpos que son secretados al espacio perip lásm ico de E. coli. Brevem ente, la pasta ce lu lar se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fen ilm etilsu lfonilo (PMSF) durante aproxim adam ente 30 m inutos. Los residuos celulares se pueden e lim inar por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los líquidos sobrenadantes de dichos sistem as de expresión en general prim ero se concentran usando un filtro de concentración de proteínas disponib le en el m ercado, por ejem plo, una unidad de ultrafiltración Am icon o M illipore Pellicon. Se puede inclu ir un inhib idor de proteasa tal com o PMSF en cualqu iera de las etapas anteriores para inhib ir la proteólis is y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecim iento de contam inantes adventicios.
La m olécula de unión de la invención preparada a partir de las células hospedante se puede purificar usando, por ejem plo, crom atogra fía de hidroxilapatita, e lectroforesis en gel, d iális is y crom atogra fía de afinidad, siendo la crom atogra fía de afinidad la técn ica de purificación preferida.
La m atriz a la que está unido el ligando de afinidad es lo más frecuentem ente agarosa, pero hay otras matrices disponib les. Las m atrices m ecánicam ente estables, com o el v idrio de poro contro lado o el poli(estiren ivin il)benceno perm iten caudales más rápidos y tiem pos de procesam iento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando la m olécula de unión de la invención com prende un dom inio CH3, es útil la resina Bakerbond ABXM (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) para la purificación. Otras técn icas para la purificación de proteínas, tales com o el fraccionam iento en una colum na de intercam bio iónico, precip itación con etanol, HPLC de fase inversa, crom atogra fía en sílice, crom atogra fía en heparina, crom atografía en SEPHARO SE™ en una resina de intercam bio aniónico o catiónico (tal com o una colum na de poli(ácido aspártico), crom atoenfoque, SDS-PAGE, y precip itación con sulfato am ónico, tam bién están disponib les dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan procedim ientos para producir m oléculas de unión de la invención, com prendiendo dichos procedim ientos cu ltivar una célu la hospedante defin ida en la presente m em oria en condiciones que perm itan la expresión de la m olécula de unión y recuperar la m olécula de unión producida del cultivo.
El térm ino "cultivo" se refiere al m antenim iento, diferenciación, crecim iento, proliferación y/o propagación in vitro de células en condiciones adecuadas en un medio.
La presente invención tam bién se refiere a com posiciones que com prenden una m olécula de unión de la invención, o producidas de acuerdo con el procedim iento de la invención. Específicam ente, d icha com posición es una com posición farm acéutica.
Com o se usa en la presente m emoria, la expresión "com posición farm acéutica" se refiere a una com posición para adm in istrar a un paciente, preferib lem ente un paciente humano. La com posición farm acéutica preferida particular de esta invención com prende la m olécula de unión de la invención. Preferiblem ente, la com posición farm acéutica com prende form ulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes. En una realización preferida, la com posición farm acéutica com prende una com posición para adm inistración parenteral, transdérm ica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o por inyección directa en el tejido. En particular, está previsto que dicha com posición se adm in istre a un paciente por infusión o inyección. La adm inistración de las com posiciones adecuadas se puede realizar de diferentes maneras, p. ej., por adm inistración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intram uscular, tóp ica o intradérm ica. En particular, la presente invención proporciona una adm inistración in interrum pida de la com posición adecuada. Como un ejem plo no lim itante, la adm inistración ininterrum pida, es decir, continua se puede realizar mediante un pequeño sistem a de bom ba que lleva el paciente para m edir la entrada de flu jo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La com posición farm acéutica que com prende la m olécula de unión de la invención se puede adm in istrar usando dichos sistem as de bom beo. Dichos sistem as de bom beo son generalm ente conocidos en la técnica, y habitualm ente se basan en el intercam bio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se infunde. C uando se intercam bia el cartucho en dicho sistem a de bomba, se puede producir una interrupción tem poral del flu jo por lo dem ás in interrum pido de agente terapéutico al cuerpo del paciente. En ese caso, la fase de adm inistración antes de la sustitución del cartucho y la fase de adm inistración después de la sustitución del cartucho todavía se considerarían, dentro del s ignificado de los medios y m étodos farm acéuticos de la invención, que juntas constituyen una "adm in istración in interrum pida" de dicho agente terapéutico.
La adm inistración continua o in interrum pida de estas m oléculas de unión de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de sum inistro de flu ido o un pequeño sistem a de bom ba que incluye un m ecanism o de propulsión de flu ido para propu lsar el flu ido fuera de un depósito y un m ecanism o de accionam iento para accionar el m ecanism o de propulsión. Los sistem as de bom beo para adm inistración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y sum in istrar la com posición adecuada en el cuerpo del paciente. Dichos sistem as de bom bas se pueden fija r o un ir directam ente a la piel del paciente independientem ente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, perm itiendo así un contacto d irecto entre el sistem a de bom ba y la piel del paciente. El sistem a de bom ba se puede fija r a la piel del paciente desde 24 horas hasta varios días. El sistem a de bom ba puede ser de tam año pequeño con un depósito para volúm enes pequeños. Como ejem plo no lim itante, el volum en del depósito para la com posición farm acéutica adecuada que se va a adm in istrar puede estar entre 0,1 y 50 ml.
La adm inistración continua puede ser transdérm ica por medio de un parche que se lleva en la piel y reem plazado a intervalos. Un experto en la técn ica conoce los sistem as de parches para el sum inistro de fárm acos adecuados para este propósito. Es de destacar que la adm inistración transdérm ica es especia lm ente adecuada para la adm inistración in interrum pida, ya que el cam bio de un prim er parche agotado se puede lograr ventajosam ente sim ultáneam ente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejem plo, en la superfic ie de la piel inm ediatam ente adyacente al prim er parche agotado e inm ediatam ente antes de la retirada del prim er parche agotado. No surgen problem as de interrupción del flu jo o fallo de la batería.
Las com posiciones de la invención pueden com prender adem ás un vehículo farm acéuticam ente aceptable. Los ejem plos de vehículos farm acéuticos adecuados son bien conocidos en la técn ica e incluyen soluciones, por ejem plo, soluciones salinas tam ponadas con fosfato, agua, em ulsiones, tales com o em ulsiones de aceite/agua, d iversos tipos de agentes hum ectantes, soluciones estériles, liposom as, etc. Las com posic iones que com prenden dichos vehículos se pueden form ular por m étodos convencionales bien conocidos. Las form ulaciones pueden com prender hidratos de carbono, soluciones tam pón, am inoácidos y/o tensioactivos. Los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferib lem ente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. En general, com o se usa en la presente m emoria, "vehículo farm acéuticam ente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, m edios de dispersión, recubrim ientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, com patib les con la adm inistración farm acéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farm acéuticam ente activas es bien conocido en la técnica. Los vehículos, excip ientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones usadas e incluyen: agentes de tam ponam iento ad icionales; conservantes; cod iso lventes; antioxidantes, que incluyen ácido ascórbico y m etionina; agentes quelantes tales com o EDTA; com ple jos metálicos (p. ej., com ple jos de Zn-proteína); polím eros biodegradables, ta les com o poliésteres; contra iones form adores de sales, tales com o sodio, alcoholes de azúcares polihídricos; am inoácidos, tales com o alanina, glicina, asparagina, 2-fen ila lanina y treonina; azúcares o alcoholes de azúcares, tales com o trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, m ioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, m ioinisitol, galactito l, glicerol, ciclito les (p. ej., inositol), po lie tilenglico l; agentes reductores que contienen azufre, tales com o glutatión, ácido tióctico, tiog lico la to de sodio, tioglicerol, [alfa]-m onotioglicerol y tiosu lfa to de sodio; proteínas de bajo peso m olecular, ta les com o seroalbúm ina humana, seroalbúm ina bovina, ge la tina u otras inm unoglobulinas; y po lím eros hidrófilos, ta les com o polivinilp irrolidona. Dichas form ulaciones se pueden usar para adm in istraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistem as de bomba. Los am inoácidos pueden ser am inoácidos con carga, preferib lem ente lisina, acetato de lisina, arginina, glutam ato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferib lem ente con un peso m olecu lar de >1,2 KD y/o un poliéter, preferib lem ente con un peso m olecular de >3 KD. Los ejem plos no lim itantes para detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Los ejem plos no lim itantes de poliéteres preferidos son PEG 3000, P e G 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistem as tam pón usados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden com prender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato.
Las com posiciones de la presente invención se pueden adm in istrar al sujeto en una dosis adecuada que se puede determ inar, p. ej., mediante estudios de aum ento de dosis adm in istrando dosis crecientes del polipéptido de la invención que presenta la especific idad cruzada de especies descrita en la presente m em oria para prim ates no chim pancés, por ejem plo macacos. Com o se ha expuesto antes, la m olécula de unión de la invención que presenta especific idad de especies cruzada descrita en la presente m em oria se puede usar ventajosam ente en fo rm a idéntica en ensayos preclínicos en prim ates no chim pancés y com o fárm aco en seres hum anos. Estas com posiciones tam bién se pueden adm in istrar en com binación con otros fárm acos prote icos y no proteicos. Estos fárm acos se pueden adm in istrar sim ultáneam ente con la com posición que com prende el polipéptido de la invención com o se define en la presente m em oria o por separado antes o después de la adm inistración de dicho po lipéptido en intervalos y dosis oportunam ente definidos. La pauta posológica será determ inada por el médico que atiende y factores clínicos. Com o es bien sabido en la técn ica m édica, las dosis para cua lqu ier paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tam año del paciente, superfic ie específica corpora l, edad, el com puesto particu lar que se va a adm inistrar, sexo, tiem po y vía de adm inistración, salud general y otros m edicam entos que se están adm inistrando sim ultáneam ente.
Las preparaciones para adm inistración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y em ulsiones acuosas o no acuosas estériles. E jemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales com o aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales com o el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, em ulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución salina y medios tam ponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y c loruro de sodio, lactato de R inger o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen recargadores de flu idos y nutrientes, recargadores de e lectro litos (tales com o los que se basan en dextrosa de Ringer) y sim ilares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejem plo, antim icrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y sim ilares. Adem ás, la com posición de la presente invención podría com prender vehículos proteicos, como, p. ej., a lbúm ina sérica o inm unoglobulina, preferib lem ente de origen humano. Está previsto que la com posición de la invención pueda com prender, adem ás del po lipéptido de la invención definido en la presente m emoria, agentes bio lógicam ente activos adicionales, dependiendo del uso previsto de la com posición. Dichos agentes pueden ser fárm acos que actúan sobre el sistem a gastro intestinal, fárm acos que actúan como citostáticos, fárm acos que previenen la hiperuricem ia, fárm acos que inhiben las inm unorreacciones (p. ej., corticosteroides), fárm acos que m odulan la respuesta inflam atoria, fárm acos que actúan sobre el sistem a circulatorio y/o agentes tales com o las c itoquinas conocidas en la técnica. Tam bién está previsto que la m olécula de unión de la presente invención se aplique en una terap ia conjunta, es decir, en com binación con otro m edicamento antineoplásico.
La actividad biológica de la com posición farm acéutica defin ida en la presente m em oria se puede determ inar, por ejem plo, por ensayos de citotoxicidad, com o se describe en los siguientes ejem plos, en la publicación internacional W o 99/54440 o por Schlereth et al. (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "E ficacia" o "eficacia in vivo", com o se usa en la presente m em oria, se refiere a la respuesta a la terap ia por la com posición farm acéutica de la invención, usando, p. ej., criterios de respuesta de NCI estandarizados. El éxito o la eficacia in vivo de la terapia usando una com posición farm acéutica de la invención se refiere a la efectividad de la com posición para su propósito previsto, es decir, la capacidad de la com posición para causar el efecto deseado, es decir, el agotam iento de células patológicas, por ejem plo, células tum orales. La eficacia in vivo se puede contro lar mediante m étodos convencionales establecidos para las respectivas entidades de la enferm edad, que incluyen, pero no se lim itan a recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, separación de células activadas por fluorescencia, aspiración de m édula ósea. Adem ás, se pueden usar varios parám etros de quím ica clín ica específicos de la enferm edad y otros m étodos convencionales establecidos. Adem ás, se pueden usar tom ografía asistida por ordenador, rayos X, tom ografía de resonancia m agnética nuclear (p. ej., para la evaluación de respuesta basada en criterios del Instituto Nacional del Cáncer [Cheson BD, Horning Sj , Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, L ister TA, Vose J, G rillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, K lippensten D, H iddem ann W , Castellino R, Harris NL, A rm itage JO, Carter W , Hoppe R, Canellos GP. "Report of an in ternational workshop to standardize response criteria fo r non-Hodgkin 's lymphomas". G rupo de trabajo internacional patrocinado por el NCI. J Clin Oncol. 1999 Abr;17(4):1244]), barrido por tom ografía por em isión de positrones, recuento de glóbulos blancos, d iferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de m édula ósea, biopsias/h isto logías de ganglios linfáticos y d iversos parám etros quím icos clín icos específicos del linfoma (p. ej. lactato deshidrogenasa) y otros m étodos estándar establecidos.
Otro desafío im portante en el desarro llo de fárm acos tales com o la com posición farm acéutica de la invención es la m odulación predecible de las propiedades farm acocinéticas. Con este fin, se puede estab lecer un perfil farm acocinético del candidato a fárm aco, es decir, un perfil de los parám etros farm acocinéticos que afectan la capacidad de un fárm aco particular para tra tar una afección dada. Los parám etros farm acocinéticos del fárm aco que influyen en la capacidad de un fárm aco para tra tar una determ inada entidad de la enferm edad incluyen, entre otros: sem ivida, volum en de distribución, m etabolism o hepático de prim er paso y el grado de unión al suero sanguíneo. La eficacia de un agente farm acológico dado puede estar influida por cada uno de los parám etros m encionados antes.
"Sem ivida" significa el tiem po en el que 50% de un fárm aco adm in istrado es elim inado por procesos biológicos, p. ej., m etabolism o, excreción, etc.
Por "m etabolism o hepático de prim er paso" se entiende la tendencia de un fárm aco a ser m etabolizado tras el prim er contacto con el hígado, es decir, durante su prim er paso a través del hígado.
"Volum en de distribución" s ignifica el grado de retención de un fárm aco por los d iversos com partim entos del cuerpo, com o p. ej., espacios in tracelulares y extrace lu lares, te jidos y órganos, etc. y la d istribución del fárm aco dentro de estos com partim entos.
"G rado de unión al suero sanguíneo" significa la tendencia de un fárm aco a in teractuar y unirse a las proteínas del suero sanguíneo, tales com o la albúm ina, lo que conduce a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fárm aco.
Los parám etros farm acocinéticos tam bién incluyen biodisponibilidad, tiem po de retraso (Tlag), Tmáx, tasas de absorción, más inicio y/o Cm áx para una cantidad dada de fárm aco adm inistrado. "B iodisponib ilidad" significa la cantidad de un m edicam ento en el com partim ento sanguíneo. "T iem po de retraso" significa el retraso de tiem po entre la adm inistración del m edicam ento y su detección y m ensurabilidad en sangre o plasma.
"Tmáx" es el tiem po después del cual se alcanza la concentración sanguínea m áxim a del fárm aco, y "Cmáx" es la concentración sanguínea m áxim a obten ida con un fárm aco dado. En el tiem po para alcanzar una concentración sanguínea o tisu lar del m edicam ento que se requiere para su efecto biológico influyen todos los parám etros. Los parám etros farm acocinéticos de los anticuerpos biespecíficos m onocatenarios que presentan especific idad cruzada de especies, que se pueden determ inar en ensayos preclínicos con anim ales en prim ates no chim pancés com o se ha descrito antes, tam bién se exponen, por ejem plo, en la publicación de Schlereth et al. (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).
El térm ino "toxicidad" com o se usa en la presente m em oria se refiere a los efectos tóxicos de un fárm aco que se ponen de m anifiesto en sucesos adversos o sucesos adversos graves. Estos sucesos secundarios se pueden referir a una fa lta de to lerab ilidad del fárm aco en general y/o una fa lta de to le rancia local después de la adm inistración. La toxicidad tam bién podría incluir efectos teratogén icos o cancerígenos causados por el fárm aco.
El térm ino "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerab ilidad" com o se usa en la presente m em oria define la adm inistración de un fárm aco sin inducir sucesos adversos graves directam ente después de la adm inistración (tolerancia local) y durante un período más largo de aplicación del fárm aco. La "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerab ilidad" se pueden evaluar, p. ej., a intervalos regulares durante el período de tratam iento y seguim iento. Las m ediciones incluyen evaluación clínica, p. ej., m anifestaciones de órganos y detección de anom alías de laboratorio. Se puede llevar a cabo la evaluación clín ica y reg istrar/codificar las desviaciones respecto a los hallazgos normales de acuerdo con los estándares NCI-CTC y/o MedDRA. Las m anifestaciones de los órganos pueden incluir criterios com o alerg ia/inm unología, sangre/m édula ósea, arritm ia cardíaca, coagulación y sim ilares, com o se establece, p. ej. en los criterios com unes de term inología para sucesos adversos v3.0 (CTCAE). Los parám etros de laboratorio que se pueden analizar incluyen, por ejem plo, hem atología, quím ica clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y exam en de otros flu idos corpora les tales com o suero, plasma, líquido linfoide o cefa lorraquídeo, líquido y sim ilares. La seguridad se puede evaluar, p. ej., por un exam en físico, técn icas de imagen (es decir, ultrasonidos, rayos X, barridos de TC, im ágenes de resonancia m agnética (MRI), otras m edidas con d ispositivos técn icos (es decir, e lectrocardiogram a), signos vitales, m idiendo parám etros de laboratorio y registrando los sucesos adversos. Por ejem plo, los sucesos adversos en prim ates no chim pancés en los usos y m étodos de acuerdo con la invención se pueden exam inar por m étodos histopato lógicos y/o histoquím icos.
La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define com o una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcia lm ente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticam ente eficaz" se define com o una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcia lm ente la enferm edad y sus com plicaciones en un paciente que ya padece la enferm edad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la infección y del estado general del propio sistem a inm unitario del sujeto. El térm ino "paciente" incluye sujetos hum anos y otros m am íferos que reciben tratam iento profiláctico o terapéutico.
La expresión "dosis eficaz y no tóxica" com o se usa en la presente m em oria se refiere a una dosis to le rab le de una m olécula de unión de la invención que es suficientem ente alta para producir el agotam iento de las células patológicas, elim inación del tum or, contracción del tum or o estabilización de la enferm edad sin o esencia lm ente sin efectos tóxicos im portantes. Dichas dosis eficaces y no tóxicas se pueden determ inar, p. ej., m ediante estudios de aum ento de dosis descritos en la técn ica y deben estar por debajo de la dosis que induce sucesos secundarios adversos graves (toxicidad lim itante de la dosis, DLT).
Los térm inos anteriores tam bién se m encionan, p. ej., en la Evaluación preclín ica de seguridad de los productos farm acéuticos derivados de b iotecnología S6; G uía Tripartita A rm onizada de la ICH; Reunión del Com ité D irectivo de ICH el 16 de ju lio de 1997.
La dosis adecuada, o cantidad terapéuticam ente eficaz, de la m olécula de unión de la invención dependerá de la afección que se va a tratar, la gravedad de la afección, la terap ia previa y el historial c línico y la respuesta del paciente al agente terapéutico. La dosis adecuada se puede ajustar de acuerdo con el criterio del médico encargado, de modo que se pueda adm in istrar al paciente una vez o a lo largo de una serie de adm inistraciones. La com posición farm acéutica se puede adm in istrar com o un solo producto terapéutico o en com binación con terapias adicionales ta les com o terap ias con tra el cáncer según sea necesario.
Las com posiciones farm acéuticas de esta invención son particularm ente útiles para la adm inistración parenteral, es decir, vía subcutánea, intram uscular, intravenosa, in traarticu lar y/o intrasinovial. La adm in istración parenteral puede ser por inyección en bolo o en infusión continua.
Si la com posición farm acéutica se ha liofilizado, el m aterial liofilizado primero se reconstituye en un líquido adecuado antes de la adm inistración. El material liofilizado se puede reconstituir, p. ej., en agua bacteriostá tica para inyección (BW FI), disolución salina fisio lógica, d isolución salina tam ponada con fosfato (PBS) o la m isma form ulación en la que la proteína había estado antes de la liofilización. Preferiblem ente, la m olécula de unión de la invención o producida por un procedim iento de la invención se usa en la prevención, tratam iento o m ejora de una enferm edad seleccionada de una enferm edad proliferativa, una enferm edad tum ora l o un trastorno inm unológico.
La presente invención tam bién se refiere a un m étodo para la prevención, tratam iento o m ejora de una enferm edad seleccionada de una enferm edad proliferativa, una enferm edad tum ora l o un trastorno inm unológico que com prende la etapa de adm in istrar a un paciente que lo necesite la m olécula de unión de la invención o producida por un procedim iento de la invención.
Las form ulaciones descritas en la presente m em oria son útiles com o com posiciones farm acéuticas en el tratam iento, m ejora y/o prevención de la afección m édica patológica com o se describe en la presente m emoria, en un paciente que lo necesite. El térm ino "tratam iento" se refiere tanto al tratam iento terapéutico com o a las medidas profilácticas o preventivas. El tratam iento incluye la aplicación o adm inistración de la form ulación al cuerpo, un te jido aislado o una cé lu la de un paciente que tiene una enferm edad/trastorno, un síntom a de una enferm edad/trastorno o una predisposición a una enferm edad/trastorno, con el propósito de curar, remediar, aliviar, m itigar, alterar, remediar, beneficiar, m ejorar o afectar a la enferm edad, el síntom a de la enferm edad o la predisposición a la enferm edad. Aquellos "que necesitan tratam iento" incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así com o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. El térm ino "enferm edad" es cua lqu ier afección que se beneficiaría del tratam iento con la form ulación de proteínas descrita en la presente m emoria. Esto incluye trastornos o enferm edades crón icas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al m am ífero a la enferm edad en cuestión. Los ejem plos no lim itantes de enferm edades/trastornos que se van a tra tar en la presente m em oria incluyen enferm edad proliferativa, una enferm edad tum oral o un trastorno inm unológico.
Preferiblem ente, la m olécula de unión de la invención es para usar en la prevención, tratam iento o m ejora de trastornos de células B que se corre lacionan con la (sobre)expresión de BCMA, ta les com o trastornos de células plasm áticas y/o enferm edades autoinm unitarias. La enferm edad autoinm unitaria es, por ejem plo, lupus eritem atoso sistém ico o artritis reum atoide.
La presente invención tam bién proporciona un m étodo para el tratam iento o m ejora de trastornos de células B que se corre lacionan con la (sobre)expresión de BCMA, ta les com o trastornos de células plasm áticas y/o enferm edades autoinm unitarias, que com prende la etapa de adm in istrar a un sujeto que lo necesita la m olécula de unión de la invención. La enferm edad autoinm unitaria es, por ejem plo, lupus eritem atoso sistém ico o artritis reumatoide.
En los trastornos de células plasm áticas, un clon de células plasm áticas se m ultiplica sin control. Com o resultado, este clon produce grandes cantidades de un solo anticuerpo (m onoclonal) conocido com o la proteína M. En algunos casos, tales com o las gam m apatías m onoclonales, el anticuerpo producido es incom pleto y consiste solo en cadenas ligeras o pesadas. Estas células plasm áticas anorm ales y los anticuerpos que producen norm alm ente están lim itados a un tipo. Preferiblem ente, el trastorno de células plasm áticas se selecciona del grupo que consiste en m ielom a múltiple, plasm acitom a, leucem ia de células plasm áticas, m acroglobulinem ia, am iloidosis, m acroglobulinem ia de W aldenstrom , p lasm acitom a óseo solitario, p lasm acitom a extram edular, m ielom a osteoesclerótico, enferm edades de la cadena pesada, gam m apatía m onoclonal de s ignificado incierto, y m ieloma m últiple quiescente.
La presente invención tam bién se refiere a kits que com prenden una m olécula de unión de la invención, una m olécula de ácido nucleico de la invención, un vecto r de la invención o una célu la hospedante de la invención. El kit puede com prender uno o más via les que contienen la m olécula de unión e instrucciones de uso. El kit tam bién puede contener m edios para adm in istrar la m olécula de unión de la presente invención, ta les com o una jeringa, bomba, infusor o sim ilar, m edios para reconstitu ir la m olécula de unión de la invención y/o medios para d ilu ir la m olécula de unión de la invención.
Adem ás, la presente descripción se refiere al uso del grupo de epítopos 3 del BCMA, preferib lem ente BCMA humano, para la generación de una m olécula de unión, preferib lem ente un anticuerpo, que es capaz de unirse al BCMA, preferib lem ente BCMA humano. El grupo de epítopos 3 del BCMA corresponde preferib lem ente a los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia com o se representa en la SEQ ID NO: 1002.
Adem ás, la presente descripción proporciona un m étodo para la generación de un anticuerpo, preferib lem ente una m olécula de unión biespecífica, que es capaz de unirse al BCMA, preferib lem ente BCMA humano, que com prende (a) inm unizar un anim al con un polipéptido que com prende el grupo de epítopos 3 del BCMA, preferib lem ente BCMA humano, en donde el grupo de epítopos 3 del BCMA corresponde a los restos de am inoácidos 24 a 41 de la secuencia com o se representa en la SEQ ID NO: 1002,
(b) obteniendo dicho anticuerpo, y
(c) opcionalm ente convertir dicho anticuerpo en una m olécula de unión biespecífica que es capaz de unirse al BCMA hum ano y preferib lem ente a CD3.
Preferentem ente, la etapa (b) incluye que el anticuerpo obtenido se ensaya com o sigue:
cuando el grupo de epítopos respectivo en la proteína BCMA hum ana se intercam bia con el grupo de epítopos respectivo de un antígeno BCMA m urino (lo que da com o resultado una construcción que com prende BCMA humano, en donde el grupo de epítopos 3 hum ano se sustituye por el grupo de epítopos 3 m urinos; véase SEQ ID NO: 1011), se producirá una dism inución en la unión del anticuerpo. Dicha dism inución es preferib lem ente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferib lem ente al m enos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en com paración con el grupo de epítopos respectivo en la proteína BCMA humana, de modo que la unión al grupo de epítopos respectivo en la proteína BCMA hum ana se establece que es 100% Está previsto que las quim eras de BCMA hum ano/BCM A m urino m encionadas antes se expresen en células CHO. Tam bién está previsto que las qu im eras BCMA hum ano/BCM A murino se fusionen con un dom inio transm em brana y/o dom inio c itop lasm ático de una proteína unida a la m em brana diferente tal com o EpCAM; véase la Figura 2a.
En los e jem plos adjuntos, en particular en los e jem plos 1-3, se describe un m étodo para ensayar esta pérdida de unión debido al in tercam bio por el grupo de epítopos respectivo de un antígeno BCMA no hum ano (p. ej., murino). El m étodo puede incluir adem ás ensayar si el anticuerpo se une al grupo de epítopos 3 del BCMA hum ano y es capaz de unirse adem ás al grupo de epítopos 3 del BCMA de m acaco tal com o BCMA de M acaca m ulatta (SEQ ID n O: 1017) o M acaca fascicu laris (SEQ ID NO: 1017).
Se proporcionan adem ás m oléculas de unión que com prenden una cualquiera de las secuencias de am inoácidos m ostradas en las SEQ ID NO: 1-1000 y 1022-1093.
Preferiblem ente, una m olécula de unión com prende tres secuencias de VH CDR (denom inadas "VH CDR1", "VH CDR2", "VH CDR3", véase la 4a colum na de la tab la de secuencias adjunta) de una m olécula de unión denom inada "BCM A-(X)", en donde X es 1-100 (véase la 2a colum na de la tab la de secuencias adjunta) y/o tres secuencias de VL CDR (denom inadas "VL CD R 1", "VH CDR2", "VH CDR3", véase la 4a colum na de la tab la de secuencias adjunta) de una m olécula de unión denom inada BCMA-X, en donde X es 1-100 (véase la 2a colum na de la tab la de secuencias adjunta).
Preferiblem ente, una m olécula de unión com prende una secuencia de VH y/o VL com o se da en la Tabla de Secuencias adjunta (véase la 4a colum na de la Tabla de Secuencias adjunta: "VH" y "VL").
Preferiblem ente, una m olécula de unión com prende una secuencia de scFv com o se da en la Tabla de Secuencias ad junta (véase la 4a colum na de la Tabla de Secuencias adjunta: "scFv").
Preferiblem ente, una m olécula de unión com prende una secuencia de m olécula biespecífica com o se da en la Tabla de secuencia adjunta (véase la 4a colum na de la Tabla de secuencia adjunta: "m olécula biespecífica").
Tam bién se describe en la presente m em oria un agente de unión biespecífico que com prende al m enos dos dom in ios de unión, que com prende un prim er dom in io de unión y un segundo dom inio de unión, en donde dicho prim er dom inio de unión se une al antígeno de m aduración de células B BCMA y en donde dicho segundo dom inio de unión se une a CD3 (ítem 1), incluyendo tam bién los siguientes ítems:
Ítem 2. El agente de unión biespecífico del ítem 1, en donde dicho prim er dom in io de unión se une al dom inio extrace lu lar de BCMA y d icho segundo dom in io de unión se une a la cadena £ de CD3.
Ítem 3. Un agente de unión biespecífico del ítem 1 o 2, que está en el form ato de un anticuerpo de longitud com pleta o un fragm ento de anticuerpo.
Ítem 4. Un agente de unión biespecífico del ítem 3, en el form ato de un anticuerpo de longitud com pleta, en donde dicho prim er dom inio de unión a BCMA deriva de dicho ratón y en donde dicho segundo dom in io de unión a CD3 deriva de rata.
Ítem 5. Un agente de unión biespecífico del ítem 3, que está en el form ato de un fragm ento de anticuerpo en form a de un d iacuerpo que com prende un dom in io variab le de cadena pesada conectado a un dom in io variab le de cadena ligera en la m ism a cadena de po lipéptido de m anera que los dos dom inios no em parejan.
Ítem 6. Un agente de unión biespecífico de los ítems 1 o 2, que está en el form ato de un anticuerpo biespecífico m onocatenario que consiste en dos m oléculas scFv conectadas por un péptido conector o por una m olécula de albúm ina de suero humano.
Ítem 7. El agente de unión biespecífico del ítem 6, las regiones de cadena pesada (VH) y las correspondientes regiones de cadena ligera variab le (VL) está dispuesto, desde el extrem o N al extrem o C, en el orden
VH(BC M A)-VL(BCM A) -VH(CD3)-VL(CD3),
VH(CD3)-VL(CD3) -VH(BC M A)-VL(BCM A) o
VH CD 3)-VL(C D3)-VL(BCM A)-VH(BC M A).
Ítem 8. Un agente de unión biespecífico del ítem 1 o 2, que está en el form ato de un dom inio de inm unoglobulina de dom in io único seleccionado de VHH o VH.
Ítem 9. El agente de unión biespecífico de los ítems 1 o 2, que está en el form ato de una m olécula Fv que tiene cuatro dom inios variab les de anticuerpo con al menos dos dom in ios de unión, en donde al m enos un dom inio de unión es específico para BCMA hum ano y al m enos uno el dom inio de unión es específico para CD3 humano.
Ítem 10. Un agente de unión biespecífico de los ítems 1 o 2, que está en el form ato de una m olécula de unión m onocatenaria que consiste en un prim er dom in io de unión específico para BCMA, una subregión constante que se encuentra C-term inal respecto a dicho prim er dom inio de unión, un conector Scorpion situado C-term inal respecto a la subregión constante, y un segundo dom inio de unión específico para CD3, que está situado C-term inal respecto a d icha subregión constante.
Artícu lo 11. El agente de unión biespecífico del artículo 1 o 2, que está en el form ato de una m olécula s im ilar a anticuerpo que se une al BCMA a través de las dos cadena pesada/cadena ligera de Fv de un anticuerpo o un fragm ento de anticuerpo y que se une a CD3 a través de un dom in io de unión que se ha m odificado genéticam ente en bucles no CDR de la cadena pesada o la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragm ento de anticuerpo.
Ítem 12. Un agente de unión biespecífico del ítem 1, que está en el form ato de una m olécula de repetición de anquirina biespecífica.
Ítem 13. Un agente de unión biespecífico del ítem 1, en donde dicho prim er dom inio de unión tiene un form ato seleccionado de los form atos definidos en uno cualquiera de los ítems 3 a 12 y en donde dicho segundo dom inio de unión tiene un form ato diferente seleccionado de los form atos definidos en uno cua lqu iera de los ítems 3 a 12. Ítem 14. Un agente de unión biespecífico del ítem 1 que es un péptido bicíclico.
Ítem 15. Una com posición farm acéutica que contiene al menos un agente de unión biespecífico de uno cualquiera de los ítems 1 a 14.
Ítem 16. Un agente de unión biespecífico de uno cualquiera de los ítems 1 a 14 o una com posición farm acéutica del ítem 14 para el tratam iento de trastornos de células plasm áticas u otros trastornos de células B que se corre lacionan con la expresión de BCMA y para el tratam iento de enferm edades autoinm unitarias.
Ítem 17. Un agente de unión biespecífico de cualqu iera de los ítems 1 a 14 o una com posición farm acéutica del ítem 15 para el tratam iento de trastornos de células plasm áticas seleccionados de plasm acitom a, leucem ia de células p lasm áticas, m ielom a múltiple, m acroglobulinem ia, am iloidosis, m acroglobulinem ia de W aldenstrom , plasm acitom a óseo solitario, plasm acitom a extram edular, m ielom a osteoesclerótico, enferm edades de la cadena pesada, gam m apatía m onoclonal de significado incierto, m ielom a m últiple quiescente.
Las variaciones de los ítems anteriores se pueden ob tener del docum ento EP 10191418.2 que tam bién se describen en la presente memoria.
Las figuras m uestran:
Figura 1:
A lineación de secuencias del dom in io extrace lu lar (ECD) del BCMA hum ano (restos de am inoácidos 1-54 de la proteína de longitud com pleta) y BCMA murino (restos de am inoácidos 1-49 de la proteína de longitud com pleta). Están destacadas las regiones (dom inios o restos de am inoácidos) que se cam biaron en las construcciones quim éricas, com o se designó para el grupo de epítopos. Las cisteínas están representadas por cajas negras. Los en laces disulfuro están indicados.
Figura 2:
Cartografía de epítopos de las construcciones de BCMA. El BCMA hum ano y murino (figura 2a) así com o siete construcciones qu im éricas de BCMA hum ano-m urino (figura 2b) expresadas en la superfic ie de células CHO como se m uestra por c itom etría de flujo. La expresión del BCMA hum ano en CHO se detectó con un anticuerpo m onoclonal anti-BCM A humano. La expresión del BCMA murino se detectó con un anticuerpo m onoclonal anti-BCMA m urino. El anticuerpo m onoclonal unido se detectó con un anticuerpo anti-IgG -Fc-gam m a específico de rata conjugado con ficoeritrina.
Figura 3:
Ejem plos de m oléculas de unión específicas para el grupo de epítopos E3, com o se detecta por cartografía de epítopos de las construcciones qu im éricas de BCMA (véase el ejem plo 3).
Figura 4:
Determ inación de las constantes de unión de m oléculas de unión biespecíficas (anti BCMA x anti CD3) en BCMA hum ano y de m acaco usando el sistem a Biacore. El antígeno se inm ovilizó con densidad de baja a interm edia (100 UR) en el chip CM5. Las diluciones de los ligantes se hicieron flo ta r sobre la superfic ie del chip y la unión se determ inó usando el software BiaEval. Las respectivas velocidades de disociación y constante de unión (KD) de los respectivos ligantes se representan debajo de cada gráfico.
Figura 5:
Actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA m edida en un ensayo de liberación de 51crom o de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 hum anas enriquecidas estim uladas. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA hum ano (figura izquierda) y células CHO transfectadas con BCMA de m acaco (figura derecha). Relación de célu la e fectora a d iana (E:T): 10:1.
F igura 6:
Determ inación de las constantes de unión de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 en BCMA hum ano y de m acaco y en CD3 hum ano y de m acaco usando el sistem a Biacore. El antígeno se inmovilizó con densidad de baja a interm edia (100-200 UR) en el chip CM5. Las diluciones de anticuerpos biespecíficos se hicieron flo ta r sobre la superficie del chip y se determ inó la unión usando el software BiaEval. Las respectivas constantes de velocidad de asociación y disociación y constante de unión (KD) resultante de los respectivos anticuerpos se representan debajo de cada gráfico.
Figura 7:
Análisis de FACS de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 en las líneas celulares indicadas: 1) células CHO transfectadas con BCMA hum ano, 2) línea de células T hum anas CD3 positivas humanas HBP-ALL, 3) células CHO transfectadas con BCMA de macaco, 4) línea de células T de m acaco 4119 LnPx, 5) línea ce lu la r de m ielom a m últiple hum ano BCMA positiva NCI-H929 y 6) células CHO no transfectadas. Controles negativos [1) a 6)]: anticuerpos de detección sin anticuerpo biespecífico BCM A/CD3 previo.
Figura 8:
Análisis de Scatchard de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 en células que expresan BCMA. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de anticuerpo m onom érico hasta saturación. Los anticuerpos se detectaron por c itom etría de flujo. Los valores de las m ediciones por trip licado se representaron gráficam ente com o curvas hiperbólicas y com o curvas sigm oideas para dem ostrar un intervalo de concentración válido usado. La unión m áxim a se determ inó usando la evaluación de Scatchard, y se calcularon los respectivos valores de KD.
Figura 9:
Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3, m edido en un ensayo de liberación de 51-crom o de 18 horas contra células CHO transfectadas con BCMA humano. Células efectoras: células T CD8 hum anas enriquecidas estim uladas. Relación de célu la e fectora a diana (E:T): 10:1.
F igura 10:
Actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 m edida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC hum anas no estim uladas. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA humano. Relación de célu la e fectora a d iana (E:T): 10:1.
F igura 11:
Análisis de FACS de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 en células CHO transfectadas con BAFF-R y TACI. Líneas celulares: 1) célu las CHO transfectadas con BAFF-R humano, 2) células CHO transfectadas con TACI humano, 3) línea ce lu la r de m ielom a m últiple L363; contro les negativos: anticuerpos de detección sin anticuerpo biespecífico de BCM A/CD3 previo. Controles positivos: detección de BAFF-R: anti-BAFF-R hu de cabra (RyD AF1162; 1:20) detectado por el anticuerpo anti-IgG de cabra-PE (Jackson 705-116-147; 1:50), detección de TACI: anticuerpo de conejo anti-TACI (abcam AB 79023; 1:100) detectado por anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-PE (S igm a P9757; 1 :20).
Figura 12:
Actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 m edida en un ensayo de liberación de 51-crom o de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 hum anas enriquecidas estim uladas. Células diana: línea ce lu lar de m ielom a múltiple hum ano BCMA positiva L363 (es decir, expresador natural). Relación de célu la efectora a diana (E:T): 10:1.
Figura 13:
Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 m edida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC hum anas no estim uladas. Células diana: línea ce lu lar de m ielom a múltiple humano L363 (expresador natural de BCMA). Relación de cé lu la efectora a d iana (E:T): 10:1.
F igura 14:
Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 m edida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC hum anas no estim uladas. Células diana: línea ce lu lar de m ielom a múltiple hum ana BCM A-positiva NCI-H929. Relación de célu la e fectora a diana (E:T): 10:1.
F igura 15:
Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 m edida en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: línea de células T de m acaco 4119LnPx. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA de macaco. Relación de cé lu la e fectora a d iana (E:T): 10:1.
F igura 16:
Actividad antitum oral de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 en un m odelo de xenoin jerto de NCI-H929 en etapa avanzada (véase el Ejemplo 16).
F igura 17:
Ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando líneas celu lares de m ielom a m últiple hum ano NCI-H929, L-363 y OPM-2 com o células d iana y PBMC hum anas com o células efectoras (48 h; E:T = 10:1). La figura representa los niveles de citoquinas [pg/m l] que se determ inaron para II-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gam m a en concentraciones crecientes de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 (véase el E jemplo 22).
Ejemplos:
Los siguientes e jem plos ilustran la invención. Estos e jem plos no deben interpretarse com o lim itantes del a lcance de esta invención. Los ejem plos se incluyen con fines ilustrativos, y la presente invención está lim itada solo por las reivindicaciones.
Ejemplo 1
G eneración de células CHO que expresan BCMA quim érico
Para la construcción de las m oléculas de cartografía de epítopos quim éricos, la secuencia de am inoácidos de los respectivos dom in ios de epítopos o el resto de am inoácido individual del BCMA hum ano se cam bió por la secuencia murina. Se construyeron las siguientes moléculas:
- ECD de BCMA hum ano / E1 murino (SEQ ID NO: 1009)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: Dominio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el grupo de epítopos 1 (restos de am inoácidos 1-7 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007) se reem plaza por el respectivo grupo murino (restos de am inoácidos 1 -4 de SEQ ID NO: 1004 o 1008)
^ e lim inación de restos de am inoácidos 1 -3 y mutación G6Q en SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E2 murino (SEQ ID NO: 1010)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: Dominio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el grupo de epítopos 2 (restos de am inoácidos 8-21 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007) se reem plaza por el respectivo grupo murino (restos de am inoácidos 5-18 de la SEQ ID NO: 1004 o 1008)
^ m utaciones S9F, Q10H y N11S en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E3 murino (SEQ ID NO: 1011)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: Dominio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el grupo de epítopos 3 (restos de am inoácidos 24-41 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007) se reem plaza por el respectivo grupo murino (restos de am inoácidos 21-36 de la SEQ ID NO: 1004 o 1008)
^ e lim inación de los restos de am inoácidos 31 y 32 y mutación Q25H, S30N, L35A y R39P en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E4 murino (SEQ ID NO: 1012)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: Dominio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el grupo de epítopos 4 (restos de am inoácidos 42-54 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007) se reem plaza por el respectivo grupo murino (restos de am inoácidos 37-49 de la SEQ ID NO: 1004 o 1008)
^ m utaciones N42D, A43P, N47S, N53Y y A54T en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E5 murino (SEQ ID NO: 1013)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: dom inio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el resto de am inoácido en la posición 22 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007 (isoleucina) se reem plaza por su respectivo resto de am inoácido murino de la SEQ ID NO: 1004 o 1008 (lisina, posición 19)
^ m utación I22K en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E6 murino (SEQ ID NO: 1014)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: dom inio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el resto de am inoácido en la posición 25 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007 (glutam ina) se reem plaza por su respectivo resto de am inoácido murino de la SEQ ID NO: 1004 o 1008 (histidina, posición 22 )
^ m utación Q25H en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
- ECD de BCMA hum ano / E7 murino (SEQ ID NO: 1015)
Dominio extrace lu lar de BCMA quim érico: dom inio extrace lu lar de BCMA hum ano en donde el resto de am inoácido en la posición 39 de la SEQ ID NO: 1002 o 1007 (arginina) se reem plaza por su respectivo resto de am inoácido murino de la SEQ ID NO: 1004 o 1008 (prolina, posición 34)
^ m utación R39P en la SEQ ID NO: 1002 o 1007
A) Las construcciones de ADNc se clonaron en el vecto r de expresión de m am ífero pEF-DHFR y se transfectaron establem ente en células CHO. La expresión de BCMA hum ano en células CHO se verificó en un ensayo FACS usando un anticuerpo m onoclonal anti-BCM A hum ano. La expresión de BCMA m urino se dem ostró con un anticuerpo m onoclonal anti-BCM A de ratón. La concentración usada de los anticuerpos de BCMA era de 10 pg/m l en PBS/FCS al 2%. Los anticuerpos m onoclonales unidos se detectaron con un anticuerpo anti-IgG -Fcy de rata-PE (1:100 en PBS/FCS al 2%; Jackson-Im m uno-Research n° 112-116-071). Como contro l negativo, las células se incubaron con PBS/FCS al 2% en lugar del prim er anticuerpo. Las m uestras se m idieron por c itom etría de flu jo en un instrum ento FACSCanto II (Becton D ickinson) y se analizaron mediante el software FlowJo (Versión 7.6). La expresión en la superfic ie de células CHO transfectadas de las quim eras de BCM A hum ano-m urino, se analizó y confirm ó en un ensayo de c itom etría de flujo con diferentes anticuerpos anti-BCM A (Figura 2)
B) Para la generación de células CHO que expresan BCMA transm em brana humano, de macaco, de ratón y qu im érico hum ano/ratón, las secuencias codificantes del BCMA humano, de m acaco, de ratón y las quim eras de BCMA hum ano-ratón (secuencias de BCMA publicadas en G enBank, núm eros de acceso NM _001192 [humano]; NM _011608 [ratón] y XM _001106892 [m acaco]) se obtuvieron por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. Los fragm entos de la síntesis génica se diseñaron para contener prim ero un sitio Kozak para la expresión eucariota de las construcciones y la secuencia codificante de un péptido líder de inm unoglobulina de 19 am inoácidos, seguido dentro del m arco de lectura de la secuencia codificante de las proteínas BCMA respectivam ente en el caso de las quim eras con los dom in ios de epítopos respectivos de la secuencia humana in tercam biados por la secuencia murina.
Excepto por las construcciones de ECD de BCMA hum ano / E4 murino y BCM A humano, la secuencia codificante del dom in io extrace lu lar de las proteínas BCMA era seguida dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un conector artificial Ser1-Gly4-Ser1 seguido por el dom inio in tracelu lar de EpCAM hum ana (am inoácidos 226­ 314; secuencia com o se publica en el número de acceso de G enBank NM _002354).
Todas las secuencias codificantes estaban seguidas por un codón de parada. Los fragm entos de la síntesis génica tam bién se diseñaron para introducir sitios de restricción adecuados. Los fragm entos de síntesis génica se clonaron en un plásm ido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Todos los procedim ientos antes m encionados se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sam brook, M olecular C loning; A Laboratory M anual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001)). Para cada antígeno, se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada por secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucario ta de las construcciones. La expresión de la proteína eucario ta en células CHO deficientes en DHFR se llevó a cabo com o describe Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La am plificación de genes de las construcciones se indujo m ediante concentraciones crecientes de m etotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
Ejemplo 2
2.1 Expresión transito ria en células HEK 293
Se usaron clones de los plásm idos de expresión con secuencias de nucleótidos verificadas por secuencia para la transfección y la expresión de proteínas en el s istem a de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, A lem ania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se obtuvieron los líquidos sobrenadantes que contenían las proteínas expresadas, las células se separaron por centrifugación y los líquidos sobrenadantes se alm acenaron a -202C.
2.2 Expresión estable en células CHO
Los clones de los plásm idos de expresión con secuencias de nucleótidos verificadas por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión de las construcciones en eucariotas. La expresión de la proteína en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se llevó a cabo com o describe Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La am plificación génica de las construcciones fue inducida por concentraciones crecientes de m etotrexato (MTX) hasta una concentración fina l de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, las células se cultivaron en botellas giratorias con medio de soja líquido HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-G lutam ina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recolección. Las células se separaron por centrifugación y el líquido sobrenadante que contenía la proteína expresada se alm acenó a -20°C. 2.3 Purificación de proteínas
La purificación de las proteínas solubles BCMA se llevó a cabo com o sigue: se usó el sistem a Á kta® Explorer System (GE Healthcare) y el software Unicorn® para la crom atografía. La crom atografía de afinidad con metal inm ovilizado ("IMAC") se llevó a cabo usando un Fractogel EMD che la te® (Merck) que se cargó con ZnCl2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. La colum na se equilibró con tam pón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,1 M) y el líquido sobrenadante de cultivo ce lu lar filtrado (0,2 pm) se aplicó a la co lum na (10 ml) con un caudal de 3 m l/m in. La colum na se lavó con tam pón A para separar la m uestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de dos etapas de tam pón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCl 0,1 M, im idazol 0,5 M) de acuerdo con el siguiente procedim iento:
Etapa 1: 10% de tam pón B en 6 volúm enes de colum na
Etapa 2: 100% de tam pón B en 6 volúm enes de colum na
Las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 se m ezclaron para una purificación adicional. Todos los productos quím icos eran de calidad para investigación y se com praron a S igm a (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La crom atografía de filtración en gel se llevó a cabo en una colum na calidad prep. HiLoad 16/60 Superdex 200 (G E/Am ersham ) equilib rada con tam pón de equilibrado (citrato 10 mM, lisina-HCl 25 mM, pH 7,2 para proteínas expresadas en células HEK y PBS a pH 7,4 para proteínas expresadas en células CHO). Las muestras de proteínas elu idas (caudal 1 ml/m in) se som etieron a SDS-PAG E estándar y transferencia W estern para la detección. Las concentraciones de proteína se determ inaron usando DO280 nm.
Las proteínas obtenidas por expresión transito ria en células HEK 293 se usaron para inm unizaciones. Las proteínas obtenidas por expresión estable en células CHO se usaron para la selección de ligandos y para la m edición de la unión.
Ejemplo 3
Grupo de epítopos de fragm entos scFv murinos
Las células transfectadas con BCMA hum ano o murino, o con m oléculas de BCMA quim éricas se tiñeron con extracto perip lásm ico bruto, sin d ilu ir que contenía scFv que se une al BCMA hum ano/m acaco. Los scFv unidos se detectaron con 1 pg/m l de un anticuerpo anti-FLAG (Sigm a F1804) y un anticuerpo anti-Fc gam m a de ratón específico m arcado con R-PE (1 :100; D ianova n° 115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con FCS al 2%. Como contro l negativo, las células se incubaron con PBS/FCS al 2% en lugar del extracto perip lásm ico. Las m uestras se m idieron por c itom etría de flu jo en un instrum ento FACSCanto II (Becton D ickinson) y se analizaron m ediante el software FlowJo (Versión 7.6); véase la Figura 3.
Ejemplo 4
Obtención de diferentes form as recom binantes de BCMA hum ano y de m acaco solubles
A) Las secuencias codificantes de BCMA hum ano y de rhesus (como se publica en G enBank, núm eros de acceso NM _001192 [humano], XM _001106892 [rhesus]), secuencias codificantes de albúm ina humana, Fcy1 hum ano y albúm ina m urina se usaron para la construcción de secuencias artific iales de ADNc que codifican proteínas de fusión solubles de BCMA hum ano y de m acaco respectivam ente y a lbúm ina humana, IgG1 Fc hum ana y a lbúm ina murina respectivam ente, así com o proteínas solubles que com prenden solo los dom inios extrace lu lares de BCMA. Para generar las construcciones para la expresión de las proteínas BCMA hum anas y de m acaco solubles, se obtuvieron fragm entos de ADNc por m utagénesis por PCR de los ADNc de BCMA de longitud com pleta descritos antes y clonación m olecular de acuerdo con protocolos estándar.
Para las fusiones con albúm ina humana, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para con tener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas, seguido de la secuencia codificante de las proteínas BCMA hum anas y de rhesus (o M acaca mulatta) respectivam ente, que com prenden los am inoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dom inio extrace lu lar de BCMA hum ano y de rhesus, respectivam ente, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly4-Ser1 artificial, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de seroalbúm ina humana, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histidina m odificado (SG HHG G HHG G HH) y un codón de parada.
Para las fusiones con IgG1 murina, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para con tener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas, seguido de la secuencia codificante de las proteínas BCMA hum anas y de m acaco, respectivam ente, que com prenden los am inoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dom in io extrace lu lar de BCMA hum ano y de rhesus, respectivam ente, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly4-Ser1 artificial, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de la bisagra y la parte Fc gam m a de IgG1 humana, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de hexahistid ina y un codón de parada.
Para las fusiones con albúm ina murina, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para contener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas, seguido de la secuencia codificante de las proteínas BCMA hum anas y de macaco, respectivam ente, que com prenden los am inoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dom inio extrace lu lar del BCMA hum ano y de rhesus, respectivam ente, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly4-Ser1 artificial, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de seroalbúm ina murina, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histidina m odificado (SG HHG G HHG G HH) y un codón de parada.
Para las construcciones del dom in io extrace lu lar soluble, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para contener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas, seguido de la secuencia codificante de las proteínas BCMA hum anas y de m acaco, respectivam ente, que com prenden los am inoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dom in io extrace lu lar del BCMA hum ano y de rhesus, respectivam ente, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly1 artificial, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histid ina m odificada (SG HHG G HHG G HH) y un codón de parada.
Los fragm entos de ADNc tam bién se diseñaron para in troducir sitios de restricción al princip io y al final de los fragm entos. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extrem o 5' y Sal I en el extrem o 3', se usaron en los s iguientes procedim ientos de clonación. Los fragm entos de ADNc se clonaron por EcoRI y SalI en un plásm ido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Todos los procedim ientos m encionados se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, M olecu lar C loning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001)).
B) Las secuencias codificantes del BCMA hum ano y de m acaco com o se ha descrito antes y las secuencias cod ificantes de albúm ina humana, Fc y1 humana, Fcy1 murina, FcY2a murina, a lbúm ina murina, a lbúm ina de rata, Fcy1 de rata y FcY2b de rata se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificial que codifican proteínas de fusión solubles de BCMA hum ano y de m acaco respectivam ente y a lbúm ina humana, IgG1 Fc humana, IgG1 Fc murina, IgG2a Fc murina, a lbúm ina murina, IgG 1 Fc de rata, IgG2b de rata y a lbúm ina de rata respectivam ente, así com o proteínas solubles que com prenden solo los dom inios extrace lu lares de BCMA. Para generar las construcciones para la expresión de las proteínas solubles de BCMA hum anas y de macaco, se obtuvieron fragm entos de ADNc por m utagénesis por PCR de los ADNc de BCMA de longitud com ple ta descritos antes y clonación m olecular de acuerdo con protocolos estándar.
Para las fusiones con albúm inas, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para contener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas y la secuencia codificante de un péptido líder de inm unoglobulina de 19 am inoácidos, seguido dentro del marco de lectura de la secuencia codificante del dom inio extrace lu lar de la proteína BCMA respectiva seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante del conector Ser1-Gly4-Ser1 artificial, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de la seroalbúm ina respectiva, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histid ina modificado (SG HHG G HHG G HH) y un codón de parada.
Para las fusiones con Fc de IgG, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para con tener prim ero un sitio Kozak para la expresión en eucariota de las construcciones y la secuencia codificante de un péptido líder de inm unoglobulina de 19 am inoácidos, seguido dentro del m arco de lectura de la secuencia codificante del dom inio extrace lu lar de la proteína BCM A respectiva seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly4-Ser1 artificial, excepto para Fc de IgG 1 hum ano donde se usó un conector Ser1-Gly1 artificial, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de la b isagra y parte de Fc gam m a de la respectiva IgG, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histid ina m odificada (S G H HG G HHG G HH) y un codón de parada.
Para las construcciones del dom in io extrace lu lar soluble, los fragm entos de ADNc m odificado se diseñaron para contener prim ero un sitio Kozak para la expresión de las construcciones en eucariotas y la secuencia codificante de un péptido líder de inm unoglobulina de 19 am inoácidos, seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante del dom in io extrace lu lar de la proteína BCM A respectiva seguido dentro del m arco de lectura por la secuencia codificante de un conector Ser1-Gly1 artificial, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador Flag, seguido dentro del marco de lectura por la secuencia codificante de un m arcador de histid ina m odificada (SG H H G G H H G G H H ) y un codón de parada.
Para la c lonación de las construcciones se introdujeron sitios de restricción adecuados. Todos los fragm entos de ADNc se clonaron en un plásm ido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. 2001). Todos los procedim ientos antes m encionados se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sam brook, 2001).
Las siguientes construcciones se diseñaron para perm itir la selección por pasos dirig ida en epítopos distintos. La secuencia codificante de las quim eras de BCMA m urino-hum ano y qu im eras de BCMA m urino-m acaco (secuencias de BCMA de ratón, humano y m acaco com o se ha descrito antes) y las secuencias codificantes de albúm ina murina y Fcy1 m urina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificial que codifican proteínas de fusión solubles de quim eras de BCMA m urino-hum ano y m urino-m acaco respectivam ente y Fc de IgG1 murino y albúm ina murina, respectivam ente. Para generar las construcciones para la expresión de las quim eras de BCMA m urinohum ano y m urino-m acaco solubles, se obtuvieron fragm entos de ADNc de BCMA murino (am inoácido 1-49) con los respectivos dom in ios de epítopos m utados a la secuencia hum ana y de macaco, respectivam ente, mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. La clonación de construcciones se llevó a cabo com o se ha descrito antes y de acuerdo con protocolos estándar (Sam brook, 2001).
Se construyeron las siguientes moléculas:
- am inoácido 1-4 humano, Fc de IgG 1 murino
- am inoácido 1-4 humano, a lbúm ina murina
- am inoácido 1-4 rhesus, Fc de IgG 1 murino
- am inoácido 1-4 rhesus, a lbúm ina murina
- am inoácido 5-18 humano, Fc de IgG 1 murino
- am inoácido 5-18 humano, a lbúm ina murina
- am inoácido 5-18 rhesus, Fc de IgG 1 murino
- am inoácido 5-18 rhesus, a lbúm ina murina
- am inoácido 37-49 humano, Fc de IgG1 murino
- am inoácido 37-49 humano, a lbúm ina murina
- am inoácido 37-49 rhesus, Fc de IgG 1 murino
- am inoácido 37-49 rhesus, a lbúm ina murina
Ejemplo 5
5.1 Determ inación basada en Biacore de la afinidad de anticuerpos biespecíficos por BCMA y CD3 hum anos y de m acaco
Los experim entos de análisis de B iacore se llevaron a cabo usando proteínas de fusión recom binantes de BCMA con seroalbúm ina hum ana (ALB) para determ inar la unión de la d iana BCMA. Para las m ediciones de afinidad de CD3, se usaron proteínas de fusión recom binantes que tienen los 27 am inoácidos N-term inales de CD3 épsilon (CD3e) fusionados con la parte Fc del anticuerpo humano. Esta proteína recom binante existe en una versión CD3e1-27 hum ana y en una versión CD3e de macaco, am bas con el epítopo del ligante CD3 en los anticuerpos biespecíficos.
En detalle, los chips CM5 Sensor (GE Healthcare) se inm ovilizaron con aproxim adam ente de 100 a 150 UR del antígeno recom binante respectivo usando tam pón de acetato a pH 4,5 de acuerdo con el m anual del fabricante. Las muestras de anticuerpos biespecíficos se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3.13 nM dilu idas en tam pón de ejecución HBS-EP (GE Healthcare). El caudal era de 30 a 35 pl/m in durante 3 m inutos, después se aplicó tam pón de ejecución HBS-EP durante 8 m inutos nuevam ente con un caudal de 30 a 35 pl/m l. La regeneración del chip se llevó a cabo usando glic ina 10 mM NaCl 0,5 M a pH 2,45. Los conjuntos de datos se analizaron usando el software B iaEval (véase la Figura 4). En general se realizaron dos experim entos independientes.
5.2 Afinidad de unión al BCMA hum ano y de m acaco
Las afin idades de unión de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 a BCMA hum ano y de m acaco se determ inaron por análisis B iacore usando proteínas de fusión recom binantes de BCMA con albúm ina de ratón (ALB). En detalle, los chips CM5 S ensor (GE Healthcare) se inm ovilizaron con aproxim adam ente 150 a 200 UR del antígeno recom binante respectivo usando tam pón de acetato a pH 4,5 de acuerdo con el m anual del fabricante. Las muestras de anticuerpos biespecíficos se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3.13 nM dilu idas en tam pón de ejecución HBS-EP (GE Healthcare). Para las determ inaciones de afinidad por el BCMA, el caudal era de 35 pl/m in durante 3 m inutos, después se aplicó tam pón de ejecución HBS-EP durante 10, 30 o 60 m inutos nuevam ente con un caudal de 35 pl/m l. La regeneración del chip se llevó a cabo usando un tampón que consistía en una m ezcla 1 :1 de glic ina 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 1,5 y disolución de cloruro de guanid ina 6 M. Los conjuntos de datos se analizaron usando el software B iaEval (véase la Figura 6). En general se realizaron dos experim entos independientes.
La unión confirm atoria de CD3 épsilon hum ano y de m acaco se llevó a cabo en experim entos individuales usando las m ism as concentraciones aplicadas que para la unión de BCMA; la determ inación de la velocidad de disociación se realizó durante 10 m inutos de tiem po de disociación.
Todos los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 m ostraron altas afin idades para BCMA hum ano en el intervalo sub-nanom olar hasta el intervalo de 1 díg ito picom olar. La unión al BCMA de m acaco era equilibrada, m ostrando tam bién afin idades en el orden de 1 díg ito nanom olar hasta el intervalo subnanom olar. Las afin idades y las d iferencias de afinidad de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 se m uestran en la Tabla 2. Tabla 2: A fin idades de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 por el BCMA hum ano y de macaco, determ inado por el análisis Biacore, y diferencias de afinidad calculadas (ma BCMA: hu BCMA).
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5.3 Determ inación basada en Biacore de la afinidad de anticuerpos biespecíficos por BCMA hum ano y de m acaco Las afin idades de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 por el BCMA soluble recom binante en chips CM5 en las m ediciones de Biacore se repitieron para reconfirm ar las KD y en especial las velocidades de disociación usando períodos de disociación más largos (60 m inutos en lugar de 10 m inutos com o se usó en el experim ento anterior). Todos los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 ensayados se som etieron a dos m ediciones de afinidad independientes con cinco concentraciones d iferentes cada una.
Las afin idades de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 eran claram ente del orden subnanom olas hasta 1 dígito picom olar, véase los e jem plos en la Tabla 3.
Tabla 3: A finidades (KD) de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 de los experim entos de Biacore usando tiem pos de disociación pro longados (dos experim entos independientes cada uno).
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Ejemplo 6
Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies
Para la confirmación de la unión a BCMA y CD3 humanos y de macaco, los anticuerpos biespecíficos se ensayaron por citometría de flujo usando células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco, respectivamente, la línea celular de mieloma múltiple humano NCI-H929 que expresa BCMA humano natural, la línea celular de leucemia de células T humanas que expresa CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de células T de macaco que expresa CD3 4119LnPx (Knappe A, et al., Blood, 2000, 95, 3256-3261). Además, se usaron células CHO no transfectadas como control negativo.
Para citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 minutos sobre hielo con 50 pl de anticuerpo biespecífico purificado en una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 2% y la unión de las construcciones se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS/FCS al 2%). Después del lavado, los anticuerpos PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo Fc gamma específico (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/FCS al 2%. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).
Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 tiñeron las células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco, la línea celular de mieloma múltiple que expresa BCMA humano NCI-H929, así como las células T humanas y de macaco. Además, no hubo tinción de células CHO no transfectadas (véase la Figura 7). Ejemplo 7
Determinación basada en Scatchard de la afinidad de anticuerpos biespecíficos por BCMA humano y de macaco Para el análisis de Scatchard, los experimentos de unión de saturación se llevan a cabo usando un sistema de detección monovalente desarrollado en Micromet (anti-His Fab/Alexa 488) para determinar con precisión la unión monovalente de los anticuerpos biespecíficos a la línea celular respectiva.
Se incuban 2 x 104 células de la línea celular respectiva (línea celular CHO que expresa BCMA humano de forma recombinante, línea celular CHO que expresa BCMA de macaco de forma recombinante) con 50 pl de cada una de una serie de diluciones triples (ocho diluciones a 1:2) del anticuerpo biespecífico de BCMA respectivo que empieza en 100 nM seguido de 16 h de incubación a 4°C con agitación y una etapa de lavado residual. Después, las células se incuban durante 30 minutos más con 30 pl de una disolución anti-His Fab/Alexa488 (Micromet; 30 pg/ml). Después de una etapa de lavado, las células se vuelven a suspender en 150 pl de tampón FACS que contiene 3,5% de formaldehído, se incuban durante 15 minutos más, se centrifugan, se vuelven a suspender en tampón FACS y se analizan usando una máquina FACS Cantoll y el software FACS Diva. Los datos se generan a partir de dos conjuntos independientes de experimentos. Los valores se representan gráficamente como curvas de unión hiperbólicas. Se calcula el respectivo análisis de Scatchard para extrapolar la unión máxima (Bmáx). Las concentraciones de anticuerpos biespecíficos en la unión semimáxima se determinan reflejando las KD respectivas. Los valores de las mediciones por triplicado se representan gráficamente como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina usando la evaluación de Scatchard y se calculan las KD respectivas.
Las afinidades de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 por células CHO transfectadas con BCMA humano o de macaco se determinaron por análisis de Scatchard como el método más fiable para medir potenciales diferencias de afinidad entre BCMA humano y de macaco.
Las células que expresan el antígeno BCMA se incubaron con concentraciones crecientes del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 monomérico hasta alcanzar la saturación (16 h). El anticuerpo biespecífico unido se detectó por citometría de flujo. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en la unión semimáxima que reflejaban las KD respectivas.
Los valores de las mediciones por triplicado se representaron gráficamente como curvas hiperbólicas y como curvas en forma de S para demostrar intervalos de concentración adecuados de unión mínima a óptima. La unión máxima (Bmáx) se determinó (Figura 8) usando la evaluación de Scatchard y se calcularon las KD respectivas. Los valores representados en la Tabla 4 se obtuvieron de dos experimentos independientes por anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3.
El análisis de Scatchard basado en células confirmó que los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 tienen afinidad del orden subnanomolar por el BCMA humano y presentan una diferencia de afinidad por BCMA entre especies pequeña inferior a cinco.
Tabla 4: Afinidades (KD) de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 a partir del análisis de Scatchard basado en células (dos experimentos independientes cada uno) con la diferencia de afinidad calculada de KD de BCMA de macaco / KD de BCMA humano.
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Ejemplo 8
Actividad citotóxica
8.1 Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas
Las células T estimuladas enriquecidas con células T CD8+ se obtuvieron como se describe a continuación.
Una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) se recubrió con un anticuerpo anti-CD3 específico disponible en el mercado (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC humanas a la placa de Petri previamente recubierta en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/FCS al 10%/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que antes.
Los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) se enriquecieron por agotamiento de células T CD4+ y células NK CD56+ usando Dynal-Beads de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células diana CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 gl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI complementado con una relación E:T de 10:1. Se usó una concentración inicial de 0,01 - 1 pg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones de tres veces del mismo. El tiempo de incubación para el ensayo era de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el líquido sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. La medición de la actividad de cromo en los líquidos sobrenadantes se llevó a cabo en un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 parar Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores de CE50 se calcularon mediante el programa de análisis a partir de las curvas sigmoidales de respuesta a la dosis usadas para la comparación de la actividad citotóxica (véase la Figura 5).
8.2 Potencia de redireccionamiento de células T efectoras humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con BCMA humano
La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (51Cr) usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8.1.
Todos los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 mostraron actividad citotóxica muy potente contra células CHO transfectadas con BCMA humano con valores de CE50 del orden de 1 dígito de pg/ml o incluso inferior (Figura 9 y Tabla 5). Por lo tanto, el grupo de epítopos E3 presenta una relación epítopo-actividad muy favorable que apoya una actividad citotóxica mediada por anticuerpos biespecíficos muy potente.
Tabla 5: valores de CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 analizados en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (51Cr) usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras.
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8.3 Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas
Aislamiento de células efectoras
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocitarias), un producto secundario de bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leucocitarias fueron suministradas por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon el mismo día de la extracción de sangre. Después de la centrifugación de densidad de Ficoll y lavados exhaustivos con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos restantes se separaron de las PBMC mediante incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 |uM). Las plaquetas se separaron por el líquido sobrenadante tras centrifugación de las PBMC a 100 x g. Los linfocitos restantes abarcan principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/5% de CO2 en medio RPMI (Gibco) con FCS al 10% (Gibco).
Agotamiento de células CD14+ y CD56+
Para el agotamiento de las células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS, n° 130­ 050-201), para el agotamiento de las células NK microperlas de CD56 humano (MACS, n° 130-050-401). Las PBMC se contaron y se centrifugaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con 300 x g. El líquido sobrenadante se descartó y el sedimento celular se volvió a suspender en tampón de aislamiento MACS [80 |jl/107 células; PBS (Invitrogen, n° 20012-043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, n° 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, n° E-6511)]. Se añadieron microperlas de CD14 y microperlas de CD56 (20 |ul/107 células) y se incubaron durante 15 minutos a 4 -8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1 - 2 ml/107 células). Después de la centrifugación (véase antes), el líquido sobrenadante se descartó y las células se volvieron a suspender en tampón de aislamiento MACS (500 |ul/108 células). Después las células CD14/CD56 negativas se aislaron usando columnas LS (Miltenyi Biotec, n° 130-042-401). Se cultivaron PBMC sin células CD14+/CD56+ en medio RPMI completo, es decir, RPMI1640 (Biochrom a G, n° FG1215) complementado con FBS al 10% (Biochrom AG, n° S0115), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, n° K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, n° L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, n° L0473) y penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Biochrom AG, n° A2213) a 37°C en una incubadora hasta que sea necesario.
Marcaje de células diana
Para el análisis de la lisis celular en ensayos de citometría de flujo, se usó el colorante de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, n° V22886) para marcar células Ch O transfectadas con BCMA humano o BCMA de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/ml en PBS que contenía FBS al 2% (v/v) y el colorante de membrana DiO (5 jl/106 células). Después de la incubación durante 3 minutos a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó usando una disolución de Eosina G isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, n° 45380).
Análisis basado en citometría de flujo
Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano en presencia de diluciones seriadas de anticuerpos biespecíficos de BCMA.
Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 |ul de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 |ul de diluciones seriadas de los anticuerpos biespecíficos de BCMA y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio RPMI completo como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpos biespecíficos continuó durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%. Después, las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y se vigiló la pérdida de integridad de la membrana celular diana mediante la adición de yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 |ug/ml. El PI es un colorante impermeable a la membrana que normalmente es excluido de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se convierten en identificables por emisión fluorescente.
Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).
Las células diana se identificaron como células DiO positivas. Las células diana PI negativas se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
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n= número de sucesos
Usando el software G raphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), se representó gráficam ente el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de anticuerpos biespecíficos correspondientes. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística param étrica para eva luar las curvas de respuesta a la dosis sigm oidea con pendiente fija y se calcularon los valores de CE50.
8.4 PBMC hum anas no estim uladas contra células diana transfectadas con BCMA humano
La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA hum ano com o células diana, y PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras. El ensayo se llevó a cabo com o se ha descrito antes (E jem plo 8.3).
Los resultados de los ensayos de citotoxicidad basados en FACS con PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA hum ano com o células diana se m uestran en la figura 10 y tab la 6. Tabla 6: Valores de CE50 [pg/m l] de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 com o se m ide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA hum ano com o células diana.
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Ejemplo 9
9.1 Exclusión de reactividad cruzada con el receptor de BAFF
Para la c itom etría de flujo, se incubaron 200.000 célu las de las líneas celulares respectivas durante 30 minutos sobre hielo con 50 pl de m oléculas b iespecíficas purificadas en una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con FCS al 2% y la unión de las construcciones se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Q iagen; dilu ido 1 :20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después del lavado, se detectaron anticuerpos de PentaHis unidos con un anticuerpo específico de Fc gam m a (Dianova) conjugado con ficoeritrina, dilu ido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Las m uestras se m idieron por c itom etría de flu jo en un instrum ento FACSCanto II y se analizaron m ediante el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Se mostró que los ligantes biespecíficos no tienen reacción cruzada con el receptor de BAFF.
9.2 Exclusión de la reactividad cruzada de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 con el receptor de BAFF (BAFF-R) y TACI hum anos
Para la exclusión de la unión a BAFF-R y TACI hum anos, los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 se ensayaron por c itom etría de flu jo usando células CHO transfectadas con BAFF-R y TACI humanos, respectivam ente. Además, se usaron células de m ielom a m últiple L363 com o contro l positivo para la unión al BCMA humano. La expresión del antígeno BAFF-R y TACI en célu las CHO se confirm ó mediante dos anticuerpos de contro l positivo. La c itom etría de flu jo se llevó a cabo com o se describe en el ejem plo anterior.
El análisis de c itom etría de flu jo confirm ó que ninguno de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 reacciona de form a cruzada con BAFF-R hum ano o TACI hum ano (véase la Figura 11).
Ejemplo 10
Actividad citotóxica
La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA de tipo hum ano en el redireccionam iento de células T efectoras contra células d iana que expresan BCMA se analiza en cinco ensayos de citotoxicidad in vitro adicionales: 1. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en el redireccionamiento de células T efectoras humanas estimuladas contra una línea celular tumoral BCMA positiva (humana) se mide en un ensayo de liberación de 51-cromo.
2. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en el redireccionamiento de células T en PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con BCMA humano se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.
3. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en el redireccionamiento de células T en PBMC humanas no estimuladas contra una línea celular tumoral (humana) BCMA positiva se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.
4. Para confirmar que los anticuerpos biespecíficos de BCMA de reacción cruzada son capaces de redirigir las células T de macaco contra las células CHO transfectadas con BCMA de macaco, se lleva a cabo un ensayo de citotoxicidad basado en FACS con una línea de células T de macaco como células T efectoras.
5. La diferencia de potencia entre las formas monoméricas y diméricas de los anticuerpos biespecíficos de BCMA se determina en un ensayo de liberación de 51-cromo usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana y células T humanas estimuladas como células efectoras.
Ejemplo 11
Células T humanas estimuladas contra la línea celular de mieloma múltiple humana BCMA positiva L363
La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (51Cr) usando la línea celular de mieloma múltiple humana BCMA positiva L363 (DSMZ N° ACC49) como fuente de células diana y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8.1.
De acuerdo con los resultados de los ensayos de liberación de 51-cromo con linfocitos T CD8 humanos enriquecidos estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA humano como dianas, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 son muy potentes en la actividad citotóxica (Figura 12 y Tabla 7).
Se identificó otro grupo de anticuerpos durante la agrupación de epítopos (véanse los Ejemplos 1 y 3), que es capaz de unirse a los grupos de epítopos 1 y 4 del BCMA ("E1/E4"). Inesperadamente, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E1/E4, aunque potentes en la actividad citotóxica contra células CHO transfectadas con BCMA humano, demostraron ser citotóxicos bastante débiles contra la línea celular de mieloma múltiple humano L363 que expresa BCMA natural en baja densidad en la superficie de la célula (Figura 12 y Tabla 7). Sin desear estar limitados por la teoría, los autores de la invención creen que el epítopo E1/E4 del BCMA humano podría ser menos accesible en los expresadores de BCMA naturales que en las células transfectadas con BCMA.
Tabla 7: valores de CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de los grupos de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3 (filas 3 a 8) analizados en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (51Cr) de 18 horas con la línea celular de mieloma múltiple humana BCMA positiva L363 como fuente de células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras.
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Ejemplo 12
PBMC humanas no estimuladas contra la línea celular de mieloma múltiple humano BCMA positiva L363
La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó además en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea celular de mieloma múltiple humana BCMA positiva L363 (DSMZ, ACC49), que muestra la expresión de superficie más débil del BCMA natural de todas las líneas de células T diana, como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo como se ha descrito antes (Ejemplo 8.3).
Com o se observó en el ensayo de liberación de 51-crom o con linfocitos T CD8 hum anos enriquecidos estim ulados contra la línea ce lu lar de m ielom a múltiple humano L363, los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E1/E4, en contraste con su potente actividad citotóxica contra células CHO transfectadas con BCMA hum ano, dem ostró de nuevo ser m enos potente para redirig ir la actividad citotóxica de PBM C no estim uladas contra la línea ce lu la r de m ielom a m últiple hum ano L363 que expresa BCMA natural en baja densidad en la superficie celular. Esto está en línea con la teoría proporcionada en lo que antecede, es decir, el epítopo E1/E4 del BCMA hum ano puede ser m enos accesib le en los expresadores de BCMA naturales que en las células transfectadas con BCMA. Los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos e 3 presentaban valores de CE50 del orden de pg/m l de 3 díg itos en este ensayo (véase la F igura 13 y Tabla 8).
Tabla 8: Valores de CE50 [pg/m l] de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 de los grupos de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3 (filas 3 a 8) medidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras y la línea ce lu la r de m ielom a múltiple humano L363 com o fuente de células diana.
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Com o se esperaba, los valores de CE50 eran m ayores en los ensayos de citotoxicidad con PBMC no estim uladas com o células efectoras que en los ensayos de citotoxicidad que usan células T CD8 hum anas estim uladas enriquecidas.
Ejemplo 13
PBMC hum anas no estim uladas contra la línea ce lu lar de m ielom a m últiple humano BCMA positiva NCI-H929
La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea ce lu la r de m ielom a múltiple humano BCMA positiva NCI-H929 (ATCC CRL-9068) com o fuente de células d iana y PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras. El ensayo se llevó a cabo com o se ha descrito antes (E jem plo 8.3).
Los resultados de este ensayo con otra línea ce lu la r de m ielom a m últiple hum ano (es decir, NCI-H929) que expresa el BCMA natural en la superfic ie ce lu lar confirm an los obtenidos con la línea ce lu lar de m ielom a múltiple humano L363. De nuevo, los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E1/E4, en contraste con su potente actividad citotóxica contra células CHO transfectadas con BCMA hum ano, dem ostraron ser menos potentes para red irig ir la actividad citotóxica de PBMC no estim uladas contra células de m ielom a múltiple humano confirm ando la teoría de que el epítopo E1/E4 del BCMA hum ano puede ser m enos accesib le en los expresadores de BCMA naturales que en las célu las transfectadas con BCMA. Dicha d ife rencia de actividad entre las célu las diana transfectadas con BCMA y los expresadores naturales com o se ve para los ligandos E1/E4 no se encontró para el E3. Los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 presentaban valores de CE50 del orden de pg/m l de 2 a 3 díg itos y, por lo tanto, redirigían las PBMC no estim uladas contra las células diana NCI-H929 con va lores de CE50 m uy buenos (véase la Figura 14 y Tabla 9).
Tabla 9: valores de CE50 [pg/m l] de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 de los grupos de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3 (filas 3 a 8) medidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC hum anas no estim uladas com o células efectoras y la línea ce lu lar de m ie lom a m últiple humano NCI-H929 com o fuente de células diana.
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Com o se esperaba, los valores de CE50 eran más bajos con la línea ce lu la r de m ielom a múltiple hum ano NCI-H929, que expresa niveles más altos de BCMA en la superfic ie ce lu lar en com paración con L363.
Ejemplo 14
Células T de m acaco contra células d iana que expresan BCMA de macaco
Finalmente, se analizó la actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA de m acaco com o células diana, y una línea de células T de m acaco com o fuente de células efectoras.
La línea de células T de m acaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95: 3256-61 (2000)) se usó com o fuente de células efectoras. El m arcado de células diana de célu las CHO transfectadas con BCMA de m acaco y el análisis basado en c itom etría de flu jo de la actividad citotóxica se llevaron a cabo com o se ha descrito antes.
Las células T de m acaco de la línea ce lu lar 4119LnPx se indujeron para m atar e ficazm ente células CHO transfectadas con BCMA de m acaco mediante anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3. Los anticuerpos presentaban m ucha potencia con valores de CE50 de pg/ml de 1 a 2 dígitos en este ensayo, lo que confirm a que estos anticuerpos son muy activos en el sistem a de macaco. Por otro lado, los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E1/E4 m ostraron una potencia s ignificativam ente más débil con valores de CE50 del orden de pg/m l de 2 a 3 díg itos (véase la Figura 15 y Tabla 10). Los anticuerpos específicos de E3 son, por lo tanto, de aproxim adam ente 3 a casi 100 veces más potentes en el sistem a de macaco.
Tabla 10: Valores de CE50 [pg/m l] de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 de los grupos de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3 (filas 3 a 8) m edidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con la línea de células T de m acaco 4119LnPx com o células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA de m acaco como células diana.
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Ejemplo 15
Diferencia de potencia entre el m onóm ero y el dím ero del anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3
Con el fin de determ inar la d iferencia en la actividad citotóxica entre la isoform a m onom érica y la d im érica de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 individuales (denom inado una dife rencia de potencia), se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-crom o com o se describe en lo que antecede (E jem plo 8.1) con m onóm ero y dím ero de anticuerpo biespecífico de BCM A/CD3 purificado. La dife rencia de potencia se calculó com o la relación entre los valores de CE50 del m onóm ero y dím ero del anticuerpo biespecífico. Las diferencias de potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 ensayados del grupo de epítopos E3 estaban entre 0,03 y 1,2. Por lo tanto, no hay dím ero sustancia lm ente más activo en com paración con su respectivo monómero.
Ejemplo 16
Conversión de m onóm ero a dím ero después de tres ciclos de congelación/descongelación
El m onóm ero de anticuerpo biespecífico de BCM A/CD3 se som etió a tres ciclos de congelación/descongelación seguidos de SEC de alto rendim iento para determ inar el porcentaje de anticuerpo inicia lm ente m onóm ero, que se había convertido en dím ero de anticuerpo.
Se ajustaron 15 pg de anticuerpo m onóm ero a una concentración de 250 pg/m l con tam pón genérico y después se congelaron a -80°C durante 30 m inutos seguido de descongelación durante 30 m inutos a tem peratura ambiente. Después de tres ciclos de congelación/descongelación, el contenido de dím ero se determ inó por HP-SEC. Con este fin, se descongelaron partes alícuotas de 15 pg de las isoform as m onóm eras de los anticuerpos y se igualaron a una concentración de 250 pg/m l en el tam pón de SEC original (ácido cítrico 10 mM - lisina HCl 75 mM - treha losa al 4% -pH 7,2) seguido de incubación a 37°C durante 7 días. Se conectó una colum na de SEC de alta resolución TSK Gel G 3000 SW XL (Tosoh, Tokio-Japón) a un FPLC Ákta Purifier 10 (GE Lifesciences) equipado con un inyector autom ático A905. El tam pón de equilibrado de la colum na y el de análisis consistían en KH2PO4 100 mM - Na2SO4 200 mM ajustado a pH 6,6. Después de 7 días de incubación, la d isolución de anticuerpo (15 pg de proteína) se aplicó a la colum na equilibrada y la elución se llevó a cabo con un caudal de 0,75 m l/m in a una presión m áxim a de 7 MPa. Todo el experim ento se siguió a 280, 254 y 210 nm de absorbancia óptica. El análisis se hizo por integración del pico de la señal de 210 nm registrada en la hoja de evaluación del experim ento del software Ákta Unicorn. El contenido de dím ero se calculó d iv idiendo el área del pico del dím ero entre el área tota l del pico del m onóm ero más el dímero.
Los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E3 presentaron porcentajes de dím ero de 0,7 a 1,1% después de tres ciclos de congelación/descongelación, lo que se considera bueno. Sin em bargo, las tasas de conversión de dím ero de los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 del grupo de epítopos E1/E4 alcanzaron va lores desfavorablem ente altos, que superaban el umbral para valores de dím ero desventa josos de >2,5% (4,7% y 3,8%, respectivam ente), véase la Tabla 11.
Tabla 11: Porcentaje de anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 m onóm eros frente a dím eros de los grupos de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3 (filas 3 a 8) después de tres ciclos de congelación/descongelación, determ inado por crom atogra fía de exclusión por tam año de alto rendim iento (HP-SEC)
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Ejemplo 17
Term oestabilidad
Las curvas de fusión de tem peratura se determ inaron por calorim etría d iferencia l de barrido (DSC) para determ inar las estabilidades biofísicas intrínsecas de proteínas de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3. Estos experim entos se llevaron a cabo usando un dispositivo VP-DSC de M icroCal LLC (Northam pton, MA, EE.UU.). Se registró la absorción de energía de una m uestra que contiene el anticuerpo biespecífico de BCM A/CD3 de 20 a 90°C en com paración con una m uestra que solo contenía el tam pón de form ulación del anticuerpo.
En detalle, los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 se ajustaron a una concentración final de 250 pg/m l en tam pón de alm acenam iento. Se transfirieron 300 pl de las d isoluciones de proteínas preparadas a una placa de pocillos profundos y se colocaron en la posición de la rejilla del inyector autom ático enfriado del d ispositivo de DSC. Se llenaron pocillos adicionales con el tam pón de análisis SEC com o material de referencia para la m edición. Para el proceso de m edición, el inyector autom ático transfirió la d isolución de proteína a un capilar. Se llenó un capilar adicional con el tam pón de análisis de SEC com o referencia. Se hizo el calentam iento y el registro de la energía de calentam iento requerida para ca len ta r ambos capilares a la m ism a tem peratura en el intervalo de 20 a 90°C para todas las muestras.
Para el registro de la respectiva curva de fusión, la tem peratura global de la m uestra se increm entó gradualm ente. A cada tem peratura T se registró la absorción de energ ía de la m uestra y la referencia del tam pón de form ulación. Se represento gráficam ente la d iferencia en la absorción de energía Cp (kcal/m ol/°C) de la m uestra m enos la referencia frente a la respectiva tem peratura. La tem peratura de fusión se define com o la tem peratura en el prim er m áximo de absorción de energía.
Todos los anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 ensayados del grupo de epítopos E3 m ostraron una term oestabilidad favorable con tem peraturas de fusión superiores a 60°C, más precisam ente entre 61,622C y 63,05°C.
Ejemplo 18
Exclusión de in terferencia del p lasm a por c itom etría de flujo.
Para determ inar la potencial interacción de los anticuerpos b iespecíficos de BCM A/CD3 con proteínas plasm áticas humanas, se estableció un ensayo de interferencia del plasma. Con este fin, se incubaron 10 pg/m l de los respectivos anticuerpos biespecíficos de BCM A/CD3 durante una hora a 37°C en plasm a hum ano al 90%. Posteriorm ente, se determ inó la unión a células CHO que expresan BCMA hum ano por c itom etría de flujo.
Para la c itom etría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 m inutos sobre hielo con 50 pl de anticuerpo purificado en una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 2% y la unión de las construcciones se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Q iagen; dilu ido 1 :20 en 50 pl de PBS/FCS al 2%). Después del lavado, los anticuerpos PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo Fc gamma específico (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/FCS al 2%. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).
Los datos obtenidos se compararon con un ensayo de control usando PBS en lugar de plasma humano. La unión relativa se calculó de la siguiente manera:
(señal de muestra de PBS/señal sin agente de detección)/(señal de muestra de plasma/señal sin agente de detección).
En este experimento se hizo evidente que no había una reducción significativa de la unión a la diana de los respectivos anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 mediado por proteínas plasmáticas. El valor relativo de interferencia del plasma era inferior a un valor de 2 en todos los casos, más precisamente entre 1,29 ± 0,25 y 1,70 ± 0,26 (considerándose un valor de "2" como umbral inferior para las señales de interferencia). Ejemplo 19
Eficacia terapéutica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en modelos de xenoinjerto de tumor humano El día 1 del estudio, se inyectaron subcutáneamente 5x106 células de la línea celular de cáncer humano NCI-H929 en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID hembra.
El día 9, cuando el volumen tumoral medio había alcanzado aproximadamente 100 mm3, las células T CD3+ humanas expandidas in vitro se trasplantaron a los ratones por inyección de aproximadamente 2x107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 (n = 5) no recibieron células efectoras y se usaron como control sin trasplante para compararlos con el grupo de control de vehículo 2 (n = 10, que reciben células efectoras) para vigilar el impacto de las células T solas en el crecimiento tumoral.
El tratamiento con anticuerpos empezó el día 13, cuando el volumen tumoral medio había alcanzado aproximadamente 200 mm3. El tamaño tumoral medio de cada grupo de tratamiento el día del inicio del tratamiento no era estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg/día de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 BCMA-98 x CD3 (grupo 3, n = 7) o BCMA-34 x CD3 (grupo 4, n = 6) mediante inyección intravenosa de bolo durante 17 días.
Los tumores se midieron mediante calibre durante el estudio y el progreso se evaluó por comparación intergrupal de volúmenes tumorales (VT). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determinó calculando los VT como T/C% = 100 x (mediana de VT del grupo analizado)/(mediana de VT del grupo de control 2). Los resultados se muestran en la Tabla 12 y la Figura 16.
Tabla 12: Mediana del volumen tumoral (VT) e inhibición del crecimiento tumoral (T/C) los días 13 a 30.
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Ejemplo 20
Exclusión de la lisis de células negativas diana
Se llevó a cabo un ensayo de lisis in vitro usando la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCI-H929 y células T purificadas en una relación de célula efectora a diana de 5:1 y con un tiempo de incubación de 24 horas. Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 (BCMA-34 y BCMA-98) mostraron alta potencia y eficacia en la lisis de NCI-H929. Sin embargo, no se detectó lisis en las líneas celulares negativas de BCMA HL60 (AML/morfología de mieloblastos), MES-SA (sarcoma del útero, morfología de fibroblastos) y SNU-16 (carcinoma de estómago, morfología epitelial) hasta 500 nM del respectivo anticuerpo.
Ejemplo 21
Inducción de la activación de células T de diferentes subconjuntos de PBMC
Se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (48 h; E:T = 10:1) usando líneas celulares de mieloma múltiple humano NCI-H929, L-363 y OPM-2 como células diana y diferentes subconjuntos de PBMC humanas (CD4+ /CD8+ /CD25+ /CD69+) como células efectoras. Los resultados (véase la Tabla 13) muestran que el grado de activación, medido por el valor de CE50, está esencialmente en el mismo intervalo para los diferentes subconjuntos de PBMC analizadas.
Tabla 13: Valores de CE50 [ng/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 medidos en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con diferentes subconjuntos de PBMC humanas como células efectoras y diferentes líneas celulares de mieloma múltiple humano como células diana.
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Ejemplo 22
Inducción de liberación de citoquinas
Se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (48 h; E: T = 10: 1) usando las líneas celulares de mieloma múltiple humano NCI-H929, L-363 y OPM-2 como células diana y PBMC humanas como células efectoras. Los niveles de liberación de citoquinas [pg/ml] se determinaron con concentraciones crecientes de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3. Se analizaron las siguientes citoquinas: II-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y la Figura 17.
Tabla 14: Liberación de IL-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gamma [pg/ml] inducida por 2,5 pg/ml de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 del grupo de epítopos E3 (BCMA-98 y BC m A-34) en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas como células efectoras y diferentes líneas celulares de mieloma múltiple humano como células diana (E:T = 10:1).
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en donde
    (a) el primer dominio de unión es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC); y (b) el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y
    en donde el grupo de epítopos 3 del BCMA corresponde a los restos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en la S e Q ID NO: 1002,
    y en donde dicha molécula de unión es un polipéptido.
    2. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer dominio de unión además es capaz de unirse al grupo de epítopos 3 del BCMA de macaco (Cq Lr CSSTPPLTCQRYC).
    3. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.
    4. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el primer y/o el segundo dominio de unión comprende las CDR de un anticuerpo.
    5. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el primer y el segundo dominio forman una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, mAb de dominio único-scFv, diacuerpo u oligómeros de los mismos.
    6. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
    (1) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 1, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 2, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 3, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 4, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 6;
    (2) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 11, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 13, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 14, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 15 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 16;
    (3) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 21, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 22, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 23, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 24, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 25 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 26;
    (4) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 31, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 32, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 33, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 34, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 36;
    (5) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 41, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 42, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 43, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 44, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 46;
    (6) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 51, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 52, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 53, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 54, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 56;
    (7) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 61, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 62, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 63, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 64, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 66;
    (8) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 71, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 72, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 73, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 74, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 76;
    (9) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 161, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 162, CDR-h 3 como se representa en la SEQ ID NO: 163, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 166;
    (10) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 171, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 172, CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 173, CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 176;
    (11) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 181, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 182, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 183, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 184, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 185 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 186;
    (12) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 191, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 192, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 193, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 194, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 195 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 196;
    (13) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 201, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 202, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 203, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 204, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 205 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 206;
    (14) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 211, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 212, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 213, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO:214, CDR-L2 com o se representa en la SEQ ID NO: 215 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 216;
    (15) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 221, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 222, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 223, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 224, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 225 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 226;
    (16) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 311, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 312, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 313, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 314, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 315 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 316;
    (17) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 321, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 322, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 323, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 324, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 325 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 326;
    (18) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 331, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 332, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 333, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 334, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 335 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 336;
    (19) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 341, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 342, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 343, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 344, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 345 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 346;
    (20) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 351, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 352, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 353, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 354, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 355 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 356;
    (21) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 361, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 362, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 363, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 364, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 365 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 366;
    (22) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 371, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 372, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 373, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 374, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 375 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 376;
    (23) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 381, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 382, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 383, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 384, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 385 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 386;
    (24) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 581, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 582, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 583, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 584, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 585 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 586;
    (25) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 591, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 592, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 593, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 594, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 595 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 596;
    (26) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 601, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 602, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 603, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 604, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 605 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 606;
    (27) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 611, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 612, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 613, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 614, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 615 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 616;
    (28) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 621, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 622, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 623, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 624, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 625 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 626;
    (29) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 631, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 632, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 633, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 634, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 635 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 636;
    (30) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 641, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 642, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 643, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 644, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 645 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 646;
    (31) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 651, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 652, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 653, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 654, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 655 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 656;
    (32) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 661, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 662, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 663, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 664, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 665 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 666;
    (33) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 671, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 672, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 673, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 674, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 675 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 676;
    (34) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 681, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 682, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 683, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 684, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 685 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 686;
    (35) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 691, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 692, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 693, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 694, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 695 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 696;
    (36) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 701, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 702, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 703, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 704, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 705 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 706;
    (37) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 711, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 712, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 713, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 714, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 715 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 716;
    (38) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 721, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 722, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 723, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 724, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 725 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 726;
    (39) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 731, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 732, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 733, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 734, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 735 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 736;
    (40) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 741, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 742, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 743, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 744, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 745 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 746;
    (41) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 751, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 752, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 753, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 754, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 755 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 756;
    (42) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 761, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 762, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 763, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 764, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 765 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 766;
    (43) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 771, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 772, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 773, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 774, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 775 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 776;
    (44) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 781, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 782, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 783, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 784, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 785 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 786;
    (45) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 791, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 792, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 793, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 794, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 795 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 796;
    (46) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 801, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 802, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 803, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 804, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 805 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 806;
    (47) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 811, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 812, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 813, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 814, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 815 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 816;
    (48) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 821, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 822, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 823, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 824, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 825 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 826;
    (49) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 831, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 832, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 833, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 834, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 835 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 836;
    (50) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 961, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 962, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 963, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 964, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 965 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 966;
    (51) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 971, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 972, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 973, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 974, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 975 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 976;
    (52) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 981, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 982, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 983, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 984, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 985 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 986; and
    (53) CDR-H1 com o se representa en la SEQ ID NO: 991, CDR-H2 com o se representa en la SEQ ID NO: 992, CDR-H3 com o se representa en la SEQ ID NO: 993, CDR-L1 com o se representa en la SEQ ID NO: 994, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 995 y CDR-L3 com o se representa en la SEQ ID NO: 996.
    7. La m olécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el prim er dom in io de unión com prende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH com o se representa en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987 y SEQ ID NO: 997.
    8. La m olécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el prim er dom in io de unión com prende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL com o se representan en la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988 y SEQ ID NO: 998.
    9. La m olécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el prim er dom in io de unión com prende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en:
    (1) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 7, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 8; (2) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 17, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 18; (3) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 27, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 28; (4) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 37, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 38; (5) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 47, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 48;
    (6) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 57, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 58;
    (7) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 67, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 68;
    (8) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 77, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 78;
    (9) una región VH com o se epresenta en la SEQ ID NO: 167, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 168;
    (10) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 177, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 178;
    (11) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 187, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 188;
    (12) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 197, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 198;
    (13) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 207, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 208;
    (14) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 217, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 218;
    (15) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 227, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 228;
    (16) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 317, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 318;
    (17) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 327, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 328;
    (18) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 337, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 338;
    (19) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 347, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 348;
    (20) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 357, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 358;
    (21) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 367, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 368;
    (22) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 377, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 378;
    (23) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 387, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 388;
    (24) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 587, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 588;
    (25) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 597, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 598;
    (26) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 607, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 608;
    (27) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 617, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 618;
    (28) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 627, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 628;
    (29) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 637, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 638;
    (30) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 647, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 648;
    (31) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 657, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 658;
    (32) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 667, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 668;
    (33) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 677, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 678;
    (34) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 687, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 688;
    (35) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 697, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 698;
    (36) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 707, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 708;
    (37) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 717, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 718;
    (38) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 727, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 728;
    (39) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 737, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 738;
    (40) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 747, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 748;
    (41) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 757, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 758;
    (42) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 767, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 768;
    (43) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 777, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 778;
    (44) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 787, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 788;
    (45) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 797, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 798;
    (46) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 807, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 808;
    (47) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 817, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 818;
    (48) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 827, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 828;
    (49) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 837, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 838;
    (50) una región VH com o se representa en la SEQ ID NO: 967, y una región VL com o se representa en la SEQ ID NO: 968;
    (51) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 977, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 978;
    (52) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 987, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 988; and
    (53) una región VH como se representa en la SEQ ID NO: 997, y una región VL como se representa en la SEQ ID NO: 998.
    10. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 340 o SEQ iD NO: 980.
    11. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por una CE50 (pg/ml) de 350 o menos, preferiblemente 320 o menos.
    12. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por una CE50 (pg/ml) que iguala a la CE50 (pg/ml) de una cualquiera de las moléculas de unión biespecíficas de BCMA/CD3 como se expone en la SEQ ID NO:829xCD3, SEQ ID NO:619xCD3 SEQ ID NO:49xCD3, SEQ ID NO:979xCD3, SEQ ID NO:709xCD3, SEQ ID NO:339xCD3, SEQ ID NO:739xCD3 o SEQ ID NO:199xCD3.
    13. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
    14. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 13.
    15. Una célula hospedante transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 15 o con el vector como se define en la reivindicación 14.
    16. Un procedimiento para producir una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedante como se define en la reivindicación 15 en condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y recuperar la molécula de unión producida del cultivo.
    17. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 16.
    18. Una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 16 para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que se correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunitarias.
    19. Un kit que comprende una molécula de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 13, un vector como se define en la reivindicación 14 y/o una célula hospedante como se define en la reivindicación 15.
    20. La molécula de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho segundo dominio de unión es capaz de unirse al CD3 humano y al CD3 de macaco.
    21. La molécula de unión de la reivindicación 1, en donde dichos dominios de unión derivan de un anticuerpo, lipocalina o anticalina.
    22. La molécula de unión de la reivindicación 1, en donde dicho primer y/o segundo dominio de unión es un anticuerpo.
    23. La molécula de unión de la reivindicación 21 o 22, en donde dicho anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, quiméricos, monocatenarios, humanizados y humanos.
    24. La molécula de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde dicho anticuerpo incluye fragmentos Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos scFv, anticuerpos de dominio único, nanocuerpos, diacuerpos, anticuerpos DART, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem, minicuerpos, anticuerpos Fc DART, anticuerpos IgG DART y multicuerpos.
    25. La molécula de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de afinidad madurada.
    26. La molécula de unión de la reivindicación 1, en donde dicha unión al grupo de epítopos 3 del BCMA se ensaya por intercambio por el respectivo grupo de epítopos de un antígeno BCMA no humano o por barrido de alanina.
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