ES2749451T3

ES2749451T3 - Moléculas de unión para BCMA y CD3

Info

Publication number: ES2749451T3
Application number: ES12803509T
Authority: ES
Inventors: Peter Kufer; Tobias Raum; Patrick Hoffmann; Roman Kischel; Ralf Lutterbuese; Doris Rau; Paul Adam; Eric Borges; Barbara Hebeis; Susanne Hipp
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2032-11-15
Also published as: JP2020202838A; EA201490932A1; WO2013072415A1; ME03521B; LT2780375T; IL232603B; EP2780375A1; TWI679212B; KR20140105758A; EP3623385A1; EP3623385A8; EP2780374A1; BR112014010940A2; PT2780375T; MA35450B1; KR102229469B1; EA028162B1; ECSP14004893A; KR102346029B1; US20220251243A1

Abstract

Una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que (a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y a la agrupación de epítopos 4 de BCMA; y (b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y En la que la agrupación de epítopos 3 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, Y en la que dicha molécula de unión es un polipéptido.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión para BCMA y CD3

Antecedentes

La BCMA (antígeno de maduración de la célula B, TNFRSF17, CD269) es una proteína transmembrana que pertenece a la superfamilia del receptor TNF. La BCMA se presenta originalmente como una proteína de membrana integral en el aparato de Golgi de los linfocitos B maduros humanos, es decir, como una proteína intracelular (Gras et al., (1995) International Immunol 7(7):1093-1105) que muestra que BCMA parece tener un papel importante durante el desarrollo y homeostasis de las células B. El descubrimiento de Gras et al. podría asociarse con el hecho de que la proteína de BCMA que se describía en Gras et al., es, debido a una translocación cromosómica, una proteína de fusión entre BCMA e IL-2. Mientras se establece que BCMA es, sin embargo, un marcador de células B que es esencial para el desarrollo y la homeostasis de las células B (Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111-2114) debido a su interacción presumiblemente esencial con sus ligandos BAFF (factor de activación de células B), también designados como TALL-1 o TNFSF13B y APRIL (ligando que induce la proliferación de A).

La expresión de BCMA está restringida a la línea de las células B y está presente principalmente en células plasmáticas y plasmablastos y en algún grado en células B de memoria, aunque virtualmente ausentes en las células B periféricas y vírgenes. BCMA se expresa también en células de mieloma múltiple (MM). Junto con sus miembros de la familia activador transmembrana e interactor del ligando de ciclofilina (TACI, en inglés) y el factor de activación de las células B del receptor de la familia TNF (BAFF-R), la BCMA regula diferentes aspectos de la inmunidad humoral, el desarrollo de las células B y la homeostasis. La expresión de BCMA aparece más tarde en la diferenciación de células B y contribuye a la supervivencia a largo plazo de plasmablastos y células plasmáticas en la médula ósea. La supresión dirigida del gen de BCMA en ratones no afecta a la generación de células B maduras, la calidad y magnitud de las respuestas inmunes humorales, la formación del centro germinal y la generación de células plasmáticas de vida corta. Sin embargo, dichos ratones tienen números significativamente reducidos de células plasmáticas de vida larga en la médula ósea, que indica la importancia de BCMA para su supervivencia (O’Connor et al., 2004).

En línea con este descubrimiento, BCMA también soporta el crecimiento y la supervivencia de células de mieloma múltiple (MM). Novak et al encontró que las líneas celulares de MM y las células de MM recién aisladas expresan BCMA y proteína TACI en sus superficies celulares y tienen expresión variable de proteína BAFF-R en su superficie celular (Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694).

El mieloma múltiple (MM) es la segunda malignidad hematológica más común y constituye el 2% de todas las muertes por cáncer. MM es una enfermedad heterogénea y está provocada principalmente por translocaciones cromosómicas entre otras t(11;14), t(4;14), t(8;14), del(13), del(17) (Drach et al., (1998) Blood 92(3):802-809; Gertz et al., (2005) Blood 106(8):2837-2840; Facon et al., (2001) Blood 97(6):1566-1571). Los pacientes afectados por MM pueden experimentar una variedad de síntomas relacionados con la enfermedad debido a, infiltración de médula ósea, destrucción ósea, fallo renal, inmunodeficiencia, y la carga psicosocial de un diagnóstico de cáncer. A partir de 2006, la tasa de supervivencia relativa a 5 años para m M fue aproximadamente 34% resaltando que MM es una enfermedad difícil de tratar donde actualmente no hay opciones curativas.

Nuevas terapias interesantes tales como estrategias de quimioterapia y trasplante de células madre empiezan a estar disponibles y tienen tasas de supervivencia mejoradas aunque a menudo producen efectos secundarios indeseados, y por consiguiente MM permanece aún incurable (Lee et al., (2004) J Natl Compr Canc Netw 8 (4):379-383). Hasta la fecha, las dos opciones de tratamiento usadas más frecuentemente para pacientes con mieloma múltiple son combinaciones de esteroides, talidomida, lenalidomida, bortezomib o varios agentes citotóxicos, y para pacientes más jóvenes los conceptos de quimioterapia de alta dosis con trasplante de células madre autólogas.

La mayoría de los trasplantes son del tipo autólogo, es decir usando las células del propio paciente. Dichos trasplantes, aunque no son curativos, se ha mostrado que prolonga la vida en pacientes seleccionados. Pueden realizarse como terapia inicial en pacientes recién diagnosticados o en el momento de la recaída. A veces, en pacientes seleccionados, puede recomendarse más de un trasplante para controlar de forma adecuada la enfermedad.

Los agentes quimioterapéuticos usados para tratar la enfermedad son ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y melfalano, terapias de combinación con agentes inmunomoduladores tales como talidomida (Thalomid®), lenalidomida (Revlimid®), bortezomib (Velcade®) y corticosteroides (p.ej., dexametasona) han surgido como opciones importantes para el tratamiento de mieloma, tanto en pacientes recién diagnosticados como en pacientes con enfermedad avanzada en quién ha fallado la quimioterapia o trasplante.

Las terapias usadas actualmente son normalmente no curativas. El trasplante de células madre puede no ser una opción para muchos pacientes debido a la avanzada edad, presencia de otra enfermedad seria u otras limitaciones físicas. La quimioterapia controla parcialmente el mieloma múltiple, raramente lleva a la remisión completa. Por consiguiente, hay una necesidad urgente de nuevos tratamientos innovadores.

Bellucci et al. (Blood, 2005; 105(10) identificó anticuerpos específicos de BCMA en pacientes de mieloma múltiple después de que han recibido infusiones de linfocito donantes (DLI, en inglés). El suero de estos pacientes fue capaz de mediar la lisis de células específicas para BCMA mediante ADCC y CDC y se detectó solamente en pacientes con respuestas antitumorales (4/9), aunque no en pacientes que no responden (0/6). Los autores especulan que la inducción de anticuerpos específicos de BCMA contribuye a la eliminación de las células de mieloma y remisión a largo plazo de pacientes.

Ryan et al. (Mol. Cancer Ther. 2007; 6(11) presentó la generación de un anticuerpo específico de BCMA antagonista que previene la activación de NF-kB que está asociada con una potente ruta de señalización pro-supervivencia en células B normales y malignas. Además, el anticuerpo confirió una potente citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC, en inglés) a las líneas celulares de mieloma múltiple in vitro que se mejoró significativamente mediante diseño de Fc.

La publicación internacional WO 2009/132058 proporciona un ensayo diagnóstico para medir los niveles de BCMA en la superficie de las células B. Se tratan también anticuerpos biespecíficos dirigidos contra marcadores de células B y moléculas receptoras de células T.

Otras estrategias en la lucha contra tumores de transmisión sanguínea o trastornos autoinmunes se centran en la interacción entre BAFF y APRIL, es decir, ligandos de la superfamilia de ligandos TNF, y sus receptores TACI, BAFF-R y BCMA que se activan por BAFF y/o APRIL. Por ejemplo, fusionando el dominio Fc de la inmunoglobulina humana a TACI, Zymogenetics, Inc. ha generado Atacicept (TACI-Ig) para neutralizar ambos de estos ligandos y evitar la activación del receptor. Atacicept está actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de lupus sistémico eritematoso (LSE, fase III), esclerosis múltiple (EM, fase II) y artritis reumatoide (AR, fase II), además de en ensayos clínicos en fase I para el tratamiento de las malignidades de células B leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de no Hodgkins (LNH) y MM. En estudios preclínicos el atacicept reduce el crecimiento y la supervivencia de células de MM primarias y líneas celulares de MM in vitro (Moreaux et al, Blood, 2004, 103) e in vivo (Yaccoby et al, Leukemia, 2008, 22, 406-13), demostrando la importancia de los ligandos TACI para las células de MM. Como la mayoría de células de MM y líneas celulares derivadas expresan BCMA y TACI, ambos receptores contribuirían al crecimiento y supervivencia mediado por el ligando. Estos datos sugieren que antagonizar tanto BCMA como TACI sería beneficioso en el tratamiento de trastornos de células plasmáticas. Además, se han descrito anticuerpos específicos para BCMA que reaccionan de forma cruzada con TACI (publicación internacional WO 02/066516).

Human Genome Sciences y GlaxoSmithKline han desarrollado un anticuerpo dirigido a BAFF que se llama Belimumab. Belimumab bloquea la unión de BAFF soluble a sus receptores BAFF-R, BCMA y TACI en las células B. Belimumab no se une a las células B directamente, sino mediante unión con BAFF, belimumab inhibe la supervivencia de las células B, incluyendo las células B autorreactivas, y reduce la diferenciación de las células B en células plasmáticas productoras de inmunoglobulina.

Sin embargo, a pesar del hecho de que BCMA; BAFF-R y TACI, es decir, los receptores de células B que pertenecen a la superfamilia del receptor TNF, y sus ligandos BAFF y APRIL están sometidos a terapias en la lucha contra el cáncer y/o trastornos autoinmunes, hay aún una necesidad de tener opciones adicionales disponibles para el tratamiento de dichas condiciones médicas.

Por consiguiente, se proporciona en la presente medios y métodos para la solución de este problema en forma de una molécula de unión que es al menos biespecífica con un dominio de unión a células citotóxicas, es decir, células T citotóxicas, y con un segundo dominio de unión a BCMA.

Debe tomarse nota de que como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una” y “el/la”, incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia “al método” incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en la presente memoria.

A menos que se indique otra cosa, el término “al menos” que precede a una serie de elementos se va a entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de verificar usando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que dichos equivalentes estén incluidos por la presente invención.

El término “y/o” donde se use en la presente memoria incluye el significado de “y”, “o” y “todo o cualquier combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor” o “aproximadamente” como se usa en la presente memoria significa en ±20%, preferiblemente en ±15%, más preferiblemente en ±10%, y lo más preferiblemente en ±5% de un valor o intervalo dado. A lo largo de esta memoria y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto solicite otra cosa, la palabra “comprender”, y variaciones tal como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas expresados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en la presente memoria el término “que comprende” puede sustituirse con el término “que contiene” o “que incluye” o a veces cuando se usa en la presente memoria con el término “que tiene”.

Cuando se usa en la presente memoria “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en la presente memoria, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y nuevas de la reivindicación.

En cada ejemplo en la presente memoria cualquiera de los términos “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede sustituirse con cualquiera de los otros dos términos.

Varios aspectos y realizaciones de la invención se describen a continuación.

La presente invención se refiere a una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) el primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y al agrupación de epítopos 4 de BCMA; y

(b) el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y

en la que la agrupación de epítopos 3 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y en la que dicha molécula de unión es un polipéptido.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión anterior, en la que el primer dominio de unión no es capaz de unirse al dominio extracelular quimérico de BCMA como se representa en SEQ ID NO:1015.

La presente invención se refiere además a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer dominio de unión es capaz además de unirse a BCMA de macaco.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer y/o el segundo dominio de unión comprenden las CDRs de un anticuerpo.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer y el segundo dominio forman una molécula que se selecciona del grupo que consiste en (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpo u oligómeros de los mismos.

La presente invención se refiere adicionalmente a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:231, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:232, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:233, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:234, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:235 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:236;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:241, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:242, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:243, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:244, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:245 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:246;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:251, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:252, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:253, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:254, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:255 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:256;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:261, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:262, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:263, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:264, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:265 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:266;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:271, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:272, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:273, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:274, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:275 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:276;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:281, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:282, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:283, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:284, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:285 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:286;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:291, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:292, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:293, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:294, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:295 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:296;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:301, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:302, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:303, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:304, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:305 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:306;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:391, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:392, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:393, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:394, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:395 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:396;

(k) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:401, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:402, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:403, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:404, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:405 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:406;

(l) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:411, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:412, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:413, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:414, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:415 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:416;

(m) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:421, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:422, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:423, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:424, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:425 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:426;

(n) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:431, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:432, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:433, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:434, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:435 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:436;

(o) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:441, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:442, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:443, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:444, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:445 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:446;

(p) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:451, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:452, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:453, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:454, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:455 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:456;

(q) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:461, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:462, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:463, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:464, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:465 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:466;

(r) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:471, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:472, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:473, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:474, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:475 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:476;

(s) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:481, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:482, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:483, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:484, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:485 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:486;

(t) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:491, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:492, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:493, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:494, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:495 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:496; y

(u) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:501, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:502, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:503, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:504, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:505 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:506.

La presente invención también se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH como se representa en SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:497 y SEQ ID NO:507.

Adicionalmente, la presente invención también se refiere a la molécula mencionada anteriormente, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL como se representa en SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:418, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:498 y SEQ ID NO:508. Adicionalmente, la presente invención también se refiere a la molécula de unión mencionada anteriormente, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en: (a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:237, y una región VL como se representa en SEQ ID (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:247, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:248 (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:257, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:258 (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:267, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:268 (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:277, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:278 (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:287, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:288 (g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:297, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:298 (h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:307, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:308 (i) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:397, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:398 (k) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:407, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:408 (l) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:417, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:418 (m) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:427, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:428 (n) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:437, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:438 (o) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:447, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:448 (p) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:457, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:458 (q) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:467, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:468 (r) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:477, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:478 (s) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:487, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:488 (t) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:497, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:498 y

(u) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:507, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:508 Además, la presente invención se refiere también a la molécula de unión mencionada anteriormente, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:300 o SEQ ID NO:500.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión como se define anteriormente.

Además, la presente invención también se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención también se refiere a una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico como se define anteriormente o con el vector como se define anteriormente.

La presente invención también se refiere a un proceso para la producción de una molécula de unión como se define anteriormente, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped como se define en la presente memoria bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión como se define en la presente memoria y recuperar la molécula de unión producida del cultivo.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión como se define en la presente memoria, o producida según el proceso definido anteriormente.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, o producida según el proceso definido para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere adicionalmente a un kit que comprende una molécula de unión como se define anteriormente, una molécula de ácido nucleico como se define en la presente memoria, un vector como se define anteriormente y/o una célula huésped como se define anteriormente también.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que dicho segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 humano y a CD3 de macaco.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que dichos dominios de unión están derivados de un anticuerpo, lipocalina o anticalina.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que el primer y/o segundo dominio de unión es un anticuerpo.

La presente invención se refiere además a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que dicho anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, humanizados y humanos.

La presente invención se refiere además a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que el anticuerpo incluye fragmentos de Fab, F(ab’)2, Fv, fragmentos de scFv, anticuerpos de dominio único, nanocuerpos, diacuerpos, anticuerpos DART, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem, minicuerpos, anticuerpos DART Fc, anticuerpos DART IgG y multicuerpos.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo maduro en afinidad.

Además, la presente invención se refiere a la molécula de unión como se menciona anteriormente, en la que dicha unión a la agrupación de epítopos 3 de BCMA se prueba mediante intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano o mediante barrido de alanina.

Descripción general

Las agrupaciones de epítopos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 están comprendidas por el dominio extracelular de BCMA. El “dominio extracelular de BCMA” o “ECD de BCMA” se refiere a una forma de BCMA que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático de BCMA. Se entenderá por el experto que el dominio transmembrana identificado para el polipéptido de BCMA de la presente invención se identifica conforme al criterio empleado de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana puede variar aunque lo más probablemente no por más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio mencionado específicamente en la presente memoria. Un ECD de BCMA preferido se muestra en SEQ ID NO:1007. Un ECD murino preferido se muestra en SEQ ID NO:1008.

La agrupación de epítopos 1 corresponde a los aminoácidos 1 a 7 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), la agrupación de epítopos 2 corresponde a los aminoácidos 8 a 21 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), la agrupación de epítopos 3 corresponde a los aminoácidos 24 a 41 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), la agrupación de epítopos 4 corresponde a los aminoácidos 42 a 54 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), la agrupación de epítopos 5 corresponde al aminoácido 22 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), la agrupación de epítopos 6 corresponde al aminoácido 25 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007), y la agrupación de epítopos 7 corresponde al aminoácido 39 del dominio extracelular de BCMA humano (SEQ ID NO:1007). Se prevé que las agrupaciones de epítopos 5 a 7 representen sustituciones de aminoácidos sencillos.

CD3 es un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas distintas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD35, y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de célula T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T.

La lisis redirigida de células diana por medio del reclutamiento de células T mediante moléculas biespecíficas implica la formación de sinapsis citolítica y la distribución de perforina y granzimas. Las células T implicadas son capaces de lisis de la célula diana en serie, y no están afectadas por mecanismos de escape inmunológico que interfieren con el procesado y la presentación del antígeno peptídico, o diferenciación de células T clónicas; véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 2007/042261.

El término “molécula de unión” en el sentido de la presente descripción indica cualquier molécula capaz de unirse (específicamente) a, interactuar con o reconocer las moléculas diana BCMA y CD3. Según la presente invención, las moléculas de unión son polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteínicas y partes no proteínicas (p.ej., conectores químicos o agentes de reticulación química tal como glutaraldehído).

Una molécula de unión, por así decirlo, proporciona la estructura para dichos uno o más dominios de unión de manera que dichos dominios de unión pueden unirse/interactuar con las moléculas diana BCMA y CD3. Por ejemplo, dicha estructura podría estar proporcionada por la proteína A, en particular, el dominio Z de la misma (afficuerpo), ImmE7 (proteínas de inmunidad), BPTI/APPI (dominios de Kunitz), proteína de unión a Ras AF-6 (dominios PDZ), caribdotoxina (toxina de escorpión), CTLA-4, Min-23 (knottins), lipocalinas (anticalinas), neocarzinostatina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición de consenso de anquirina o tiorredoxina (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren y Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)). Una molécula de unión preferida es un anticuerpo.

También se prevé que la molécula de unión de la invención tenga, además de su función para unirse a las moléculas diana BCMA y CD3, una función adicional. En este formato, la molécula de unión es una molécula de unión tri- o multifuncional enfocándose en células plasmáticas a través de la unión con BCMA, mediando la actividad de la célula T citotóxica a través de la unión a CD3 y proporcionando una función adicional como un dominio constante Fc totalmente funcional que media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo a través del reclutamiento de células efectoras como células NK, una etiqueta (fluorescente etc.), un agente terapéutico como, p.ej., una toxina o radionucleido, y/o medios para mejorar la vida media en suero, etc.

El término “biespecífico” como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula de unión que comprende al menos un primer y un segundo dominio de unión, en la que el primer dominio de unión es capaz de unirse a un antígeno o diana, y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a otro antígeno o diana. La “molécula de unión” de la invención también comprende moléculas de unión multiespecíficas como p.ej., moléculas de unión triespecíficas, incluyendo las últimas tres dominios de unión.

Se prevé que la molécula de unión se produzca mediante (o sea obtenible mediante) métodos de presentación sobre fagos o de cribado de bibliotecas más que mediante injerto de secuencias CDR a partir de un anticuerpo pre-existente (monoclonal) en una estructura, por ejemplo, una estructura como se describe en la presente memoria.

El término “dominio de unión” caracteriza en conexión con la presente invención un dominio que es capaz de unirse específicamente a/interactuar con un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana BCMA y CD3.

Los dominios de unión pueden derivarse de un donante de dominio de unión tal como por ejemplo un anticuerpo, proteína A, ImmE7 (proteínas de inmunidad), BPTI/APPI (dominios Kunitz), proteína de unión a Ras AF-6 (dominios PDZ), caribdotoxina (toxina de escorpión), CTLA-4, Min-23 (knottins), lipocalinas (anticalinas), neocarzinostatina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición de consenso de anquirina o tiorredoxina (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004), Nygren y Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)). Un dominio de unión preferido está derivado de un anticuerpo. Se prevé que un dominio de unión de la presente invención comprenda al menos dicha parte de cualquiera de los dominios de unión mencionados anteriormente que se necesita para unirse a/interactuar con un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana BCMA y CD3.

Se prevé que el dominio de unión de los donantes de dominio de unión mencionados anteriormente se caracteriza por esa parte de estos donantes que es responsable de la unión a la respectiva diana, es decir, cuando esa parte se elimina de donante del dominio de unión, dicho donante pierde su capacidad de unión. “Pierde” significa una reducción de al menos 50% de la capacidad de unión cuando se compara con el donante de unión. Los métodos para mapear estos sitios de unión se conocen bien en la técnica - está por lo tanto en el conocimiento estándar del experto el situar/mapear el sitio de unión de un donante del dominio de unión y, así, “derivar” dicho dominio de unión desde los respectivos donantes del dominio de unión.

El término “epítopo” se refiere a un sitio en un antígeno al que un dominio de unión, como un anticuerpo o inmunoglobulina o derivado o fragmento de un anticuerpo o de una inmunoglobulina, se une de forma específica. Un “epítopo” es antigénico y por consiguiente el término epítopo se denomina también a veces en la presente memoria como “estructura antigénica” o “determinante antigénico”. Por consiguiente, el dominio de unión es un “sitio de interacción con el antígeno”. Dicha unión/interacción se entiende también que define un “reconocimiento específico”. En un ejemplo, dicho dominio de unión que se une (específicamente) a/interactúa con un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana BCMA y CD3 es un anticuerpo o inmunoglobulina, y dicho dominio de unión es una región VH y/o VL de un anticuerpo o de una inmunoglobulina. Los “epítopos” pueden estar formados tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegado terciario de una proteína.

Un “epítopo lineal” es un epítopo donde una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye al menos 3 o al menos 4, y más normalmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una única secuencia.

Un “epítopo conformacional”, en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (p.ej., un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no se reconoce necesariamente por el dominio de unión). Típicamente un epítopo conformacional comprende un número aumentado de aminoácidos respecto al epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de los epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, el antígeno para uno de los dominios de unión está comprendido en la proteína BCMA). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o la estructura polipeptídica que forma el epítopo conformacional se yuxtapone permitiendo al anticuerpo reconocer al epítopo. Los métodos de determinación de la conformación de epítopos incluyen, aunque no están limitados a, cristalografía de rayos X, espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN-2D) y marcaje de espín dirigido al sitio y espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR). Además, los ejemplos proporcionados describen un método adicional para probar si un dominio de unión dado se une a una o más agrupación(ones) de epítopos de una proteína dada, en particular BCMA.

Como se usa en la presente memoria, el término “agrupación de epítopos” indica la totalidad de epítopos que se sitúan en un tramo contiguo definido de un antígeno. Una agrupación de epítopos puede comprender uno, dos o más epítopos. Las agrupaciones de epítopos que se definieron - en el contexto de la presente invención - en el dominio extracelular de BCMA se describen anteriormente y se representan en la Figura 1.

Los términos “(capaz de) unirse a”, “que reconoce específicamente”, “dirigido a” y “que reacciona con” significan de acuerdo con esta invención que un dominio de unión es capaz de interactuar específicamente con uno o más, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres y lo más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un epítopo.

Como se usa en la presente memoria, los términos “que interactúa específicamente”, “que se une específicamente” o “se une(n) específicamente” significan que un dominio de unión muestra una afinidad apreciable por una proteína o antígeno particular y, generalmente, no muestra reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3. “Afinidad apreciable” incluye la unión con una afinidad de aproximadamente 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es aproximadamente 10-12 a 10-8 M, 10 12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de aproximadamente 10-11 a 10-9 M. Si un dominio de unión reacciona específicamente con o se une a una diana pueden probarse fácilmente, entre otros, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencialmente o no es capaz de unirse a proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de BCMA y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).

Se cree que la unión específica se efectúa por motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por consiguiente, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria además del resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción con el antígeno con su antígeno específico puede dar por resultado una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción con el antígeno con su antígeno específico puede dar por resultado de forma alternativa o adicional el inicio de una señal, p.ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

El término “no se une esencialmente a” o “no es capaz de unirse a” significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a otra proteína o antígeno distinto de BCMA o CD3, es decir, no muestra reactividad de más de 30%, preferiblemente no más de 20%, no más preferiblemente no más de 10%, particularmente preferiblemente no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3, por lo que la unión a BCMA o CD3, respectivamente, se ajusta para ser 100%.

“Proteínas” (que incluyen fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que tienen normalmente menos de 30 aminoácidos) comprenden uno o más aminoácidos acoplados los unos a los otros por medio de un enlace peptídico covalente (dando por resultado una cadena de aminoácidos). El término “polipéptido” como se usa en la presente memoria describe un grupo de moléculas, que consisten en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula polipeptídica. Las moléculas polipeptídicas que forman dichos dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de dichos multímeros se denominan, por consiguiente, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo para un heteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma que se da de forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a polipéptidos/proteínas modificadas de forma natural en las que la modificación se efectúa p.ej., mediante modificaciones post-traduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un “polipéptido” cuando se refiere a la presente memoria puede también estar modificado químicamente tal como pegilado. Dichas modificaciones se conocen bien en la técnica.

El término “aminoácido” o “residuo de aminoácido” se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I); leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque pueden usarse aminoácidos modificados, sintéticos o raros cuando se desee. Generalmente, los aminoácidos pueden agruparse como los que tienen una cadena lateral no polar (p.ej. Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada de forma negativa (p.ej., Asp, Glu); una cadena lateral cargada de forma positiva (p.ej., Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar no cargada (p.ej., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).

La definición del término “anticuerpo” incluye realizaciones tales como anticuerpos monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, humanizados y humanos. Además de los anticuerpos de longitud completa, la definición también incluye derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo, como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos o derivados de anticuerpo comprenden además F(ab’)2, Fv, fragmentos de scFv o anticuerpos de dominio único tales como anticuerpos de dominio o nanocuerpos, anticuerpos de dominio variable único o dominio variable único de inmunoglobulina que comprende meramente un dominio variable, que sería VHH, VH o VL, que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V; véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit.; Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009. Dicho término también incluye diacuerpos o anticuerpos de re-direccionamiento de afinidad dual (DART). Se prevén adicionalmente diacuerpo de cadena sencilla (biespecífico), diacuerpo en tándem (Tandab), “minicuerpos” ejemplificados por una estructura que es como sigue: (v H-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 o (scFv-CH3-scFv)2, “DART Fc” y “DART IgG”, multicuerpos tales como triacuerpos.

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina incluyen no solo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de dominio variable único de anticuerpo.

Se conocen varios procedimientos en la técnica y pueden usarse para la producción de dichos anticuerpos y/o fragmentos. Por consiguiente, los derivados (de anticuerpo) pueden producirse mediante peptidomiméticos. Además, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, entre otros, la patente de EE.UU.

4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para polipéptido(s) elegido(s). Además, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica, que proporciona anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Ejemplos para dichas técnicas incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de la células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). La resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore puede usarse para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo de un polipéptido diana, tal como CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Se prevé además en el contexto de esta invención que el término “anticuerpo” comprende constructos de anticuerpo, que pueden expresarse en un huésped como se describe en la presente memoria a continuación, p.ej. constructos de anticuerpos que pueden transfectarse y/o transducirse por medio, entre otros, de virus o vectores plasmídicos.

Además, el término “anticuerpo” como se emplea en la presente memoria también se refiere a derivados o variantes de los anticuerpos descritos en la presente memoria que presentan la misma especificidad que los anticuerpos descritos. Ejemplos de “variantes de anticuerpo” incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos “maduros en afinidad” (véase, p.ej., Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con función(ones) efectora(s) alterada(s) (véase, p.ej., Patente de EE.UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.).

Un método ejemplar de fabricación de anticuerpos incluye el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas, p.ej., bibliotecas de expresión de fagos o ribosomas. La expresión de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., Patente de EE.UU. núm. 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628.

Además del uso de bibliotecas de expresión, el antígeno especificado puede usarse para inmunizar a un animal no humano, p.ej., un roedor, p.ej., un ratón, hámster o rata. En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpo de ratón con grandes fragmentos de los sitios de Ig humana. Usando la tecnología de hibridoma, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos del antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, p.ej., Xe No MOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, documentos US 2003-0070185 y las publicaciones internacionales WO 96/34096 y W o 96/33735.

Un anticuerpo o fragmento del mismo puede además modificarse por supresión específica de epítopos de células T humanas o “desinmunización” mediante los métodos descritos en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse para péptidos que se unen a CMH clase II; estos péptidos representan epítopos de células T potenciales (como se define en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de células T potenciales, puede aplicarse una estrategia de modelado por ordenador denominada “enhebrado de péptidos”, y además pueden buscarse en una base de datos de péptidos de unión a CMH clase II humano los motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en las publicaciones internacionales WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 principales alotipos DR de CMH clase II, y por consiguiente constituyen epítopos potenciales de célula T. Los epítopos potenciales de célula T detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de aminoácidos sencillos. Típicamente, se hacen sustituciones conservativas. A menudo, aunque no de forma exclusiva, puede usarse un aminoácido común a una posición en secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana, p.ej., se describen en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.

227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5):237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Estas secuencias pueden usarse como una fuente de secuencia humana, p.ej., para regiones estructurales y CDRs. Las regiones estructurales humanas de consenso pueden usarse también, p.ej., como se describe en la Patente de EE.UU. núm. 6.300.064.

El apareamiento de una VH y VL forma un sitio único de unión al antígeno. El dominio CH más cercano a VH se designa como CH1. Cada cadena L se une a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que los cadenas H se unen la una a la otra mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denominadas regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 y FR4), que forman una estructura para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones que determinan la complementariedad, CDRs). Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDRs se denominan como CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, los constituyentes de CDR en la cadena pesada se denominan como H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes de CDR en la cadena ligera se denominan como L1, L2 y L3.

El término “variable” se refiere a las partes de los dominios de inmunoglobulina que muestran variabilidad en su secuencia y que están implicados en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el (los) “dominio(s) variable(s)”). La variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en sub-dominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera.

Estos sub-dominios se denominan regiones “hipervariables” o “regiones que determinan la complementariedad” (CDRs). Las partes más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan las regiones “estructurales” (FRM). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera que se dan de forma natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM, que adoptan en la mayor parte una configuración en láminas p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen en estrecha proximidad mediante la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión al antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, como, por ejemplo, citotoxicidad mediada por la célula, dependiente del anticuerpo, y activación del complemento.

El término “región hipervariable” (también conocida como “regiones que determinan la complementariedad” o CDRs) cuando se usa en la presente memoria se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son (normalmente) tres o cuatro regiones cortas de variabilidad de secuencia extrema) en el dominio de la región V de una inmunoglobulina que forma el sitio de unión al antígeno y son los principales determinantes de la especificidad del antígeno. Hay al menos dos métodos para identificar los residuos CDR: (1) una estrategia basada en la variabilidad de la secuencia de las especies cruzadas (es decir, Kabat et al., loc. cit.); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Sin embargo, en la medida en que dos técnicas de identificación de residuo definan regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, pueden combinarse para definir una CDR híbrida. Sin embargo, en general, los residuos de CDR se identifican preferiblemente de acuerdo con el denominado sistema (de numeración) Kabat.

Los términos “dominio de unión al antígeno”, “fragmento de unión al antígeno” y “región de unión al anticuerpo” cuando se usa en la presente memoria se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre el anticuerpo y el antígeno. La parte del antígeno que se reconoce específicamente y se une por el anticuerpo se denomina como el “epítopo” como se describe anteriormente en la presente memoria. Como se menciona anteriormente, un dominio de unión al antígeno puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo retienen alguna función de unión al antígeno del dominio de unión al antígeno intacta. Ejemplos de fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que tiene un dominio VH, (6) una región de determinación de la complementariedad aislada (CDR) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), prefiriéndose el último (por ejemplo, derivado de una biblioteca scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH se codifican por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que los permite componerse como una única cadena de proteína en que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase p.ej., Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan por la función de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos.

El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se dan de forma natural y/o modificaciones post traducción (p.ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con los preparados de anticuerpo convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se va a construir como que necesita la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención puede hacerse mediante el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (véase, p.ej., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” pueden aislarse también a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es (son) idéntica(s) a u homóloga(s) a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos, además de fragmentos de dichos anticuerpos, mientras muestran la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos “primitivizados” que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivado de un primate no humano (p.ej., mono del viejo mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humanas.

Un anticuerpo monoclonal puede obtenerse de un animal no humano, y después modificarse, p.ej., humanizados, desinmunizados, quiméricos, pueden producirse usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Una variedad de estrategias para hacer anticuerpos quiméricos se han descrito. Véase p.ej., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 81:6851,1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Boss et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494, GB 2177096. Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (p.ej., murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras sub-secuencias de unión al antígeno de anticuerpos) de secuencias generalmente humanas, que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del recipiente se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los residuos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los “anticuerpos humanizados” como se usan en la presente memoria pueden comprender además residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar más y optimizar el rendimiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Los anticuerpos humanizados pueden producirse también, por ejemplo, usando ratones transgénicos que expresan genes de cadena pesada y ligera humanos, pero son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón endógena. Winter describe un método de injerto de CDR ejemplar que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria (Patente de Ee .UU. núm. 5.225.539). Todos las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden sustituirse con al menos una parte de un CDR no humano, o solo algunos de las CDRs pueden sustituirse con CDRs no humanos. Solo es necesario sustituir el número de CDRs necesarios para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden, por ejemplo, generarse sustituyendo secuencias del dominio variable Fv que no están implicados directamente en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y mediante los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205 y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todos o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo frente a una diana predeterminada, como se describe anteriormente, además de a partir de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizada puede entonces clonarse en un vector de expresión apropiado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de la línea germinal y/o mutaciones regresivas. Dichas moléculas de inmunoglobulina alterada pueden hacerse mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica (p.ej., Teng et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 80:7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), y pueden hacerse según las enseñanzas del documento EP 239400.

El término “anticuerpo humano” incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (Véase Kabat et al., (1991) loc. cit.). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p.ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs, y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustituidas con un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana.

Como se usa en la presente memoria, “anticuerpo generado in vitro” se refiere a un anticuerpo donde toda o parte de la región variable (p.ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes (p.ej., una expresión en fagos in vitro, chip de proteína o cualquier otro método en que las secuencias candidatas puedan probarse por su capacidad para unirse a un antígeno). Este término por consiguiente excluye preferiblemente secuencias generadas por reordenación genómica en una célula inmune.

Un anticuerpo o inmunoglobulina “biespecífico” o “bifuncional” es un anticuerpo o inmunoglobulina híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadenas pesadas/ligeras y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véase, p.ej., songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990). Numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica están disponibles para obtener anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse usando métodos de ADN recombinante (Patente de EE.UU. núm.

4.816.567). Los anticuerpos monoclonales pueden producirse también por generación de hibridomas (véase p.ej., Kohler y Milstein (1975) Nature, 256:495-499) de acuerdo con métodos conocidos. Los hibridomas formados de esta manera se criban entonces usando métodos estándar, tales como ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y análisis por resonancia del plasmón superficial (BIOCORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Cualquier forma del antígeno especificado puede usarse como el inmunógeno, p.ej., antígeno recombinante, formas que se dan de forma natural, cualquier variante o fragmento de los mismos, además de péptido antigénico de los mismos.

Los términos “CDR” y sus plurales “CDRs”, se refieren a una región de determinación de complementariedad (CDR) de las que tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDRs contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y están separadas por secuencias de aminoácidos que comprenden las regiones de andamiaje o estructurales. Los límites y longitudes de CDR de definición exacta están sujetos a diferentes clasificaciones y sistemas de numeración. Las CDRs pueden denominarse por lo tanto por Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límite, que incluyen el sistema de numeración descrito en la presente memoria. A pesar de los límites distintos, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de solapamiento en lo que constituye las denominadas “regiones hipervariables” en las secuencias variables. Las definiciones de CDR según estos sistemas pueden por lo tanto diferir en longitud y áreas límite con respecto a la región estructural adyacente. Véase por ejemplo, Kabat, Chothia y/o MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987, 196:901; y MacCallum et al. J. Mol. Biol., 1996, 262:732). Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el denominado sistema Kabat.

Típicamente, las CDRs forman una estructura en bucle que puede clasificarse como una estructura canónica. El término “estructura canónica” se refiere a la conformación de la cadena principal que se adopta por los bucles de unión al antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha encontrado que cinco de los seis bucles de unión al antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede caracterizarse por los ángulos de torsión del esqueleto polipeptídico. Los bucles correspondientes entre anticuerpos pueden tener, por lo tanto, estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de secuencias de aminoácidos en la mayor parte de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196:901; Chothia et al., Nature, 1989, 342:877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol., 1996, 263:800). Además, hay una relación entre la estructura en bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular se determina por la longitud del bucle y los residuos de aminoácidos que se encuentran en posiciones clave en el bucle, además de en la estructura conservada (es decir, fuera del bucle). La asignación a una clase canónica particular puede por lo tanto hacerse en base a la presencia de estos residuos de aminoácidos claves. El término “estructura canónica” puede incluir además consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, como se cataloga por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un patrón ampliamente adoptado para numerar los residuos de aminoácidos de cualquier dominio variable de anticuerpo de manera coherente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otras partes de la presente memoria. Pueden usarse también consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, esas diferencias no totalmente reflejadas por la numeración de Kabat pueden describirse por el sistema de numeración de Chothia et al. y/o revelarse por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bi y tri-dimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo dada puede ponerse en una clase canónica que permita, entre otras cosas, identificar las secuencias de la estructura apropiadas (p.ej., en base al deseo de incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos del anticuerpo y las consideraciones estructurales como se describen en Chothia et al., loc. cit., y sus implicaciones para construir aspectos canónicos de estructuras de anticuerpo, se describen en la bibliografía.

CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular en el sitio de unión al anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o mayor que 26 aminoácidos. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura de subunidad, p.ej., una estructura CH, VH, CL, VL, CDR, FR, comprende fragmentos activos, p.ej., la parte de la subunidad de VH, VL o CDR las uniones al antígeno, es decir, el fragmento de unión al antígeno, o, p.ej., la parte de la subunidad CH que se une a y/o activa, p.ej., un receptor Fc y/o complemento. Las CDRs típicamente se refieren a las CDRs Kabat, como se describe en Sequences of Proteins of immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU. (1991), eds. Kabat et al. Otro patrón para caracterizar el sitio de unión al antígeno es referirse a los bucles hipervariables como se describe por Chothia. Véase, p.ej., Chothia, et al. (1987; J. Mol. Biol. 227:799-817); y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Aún otro patrón es la definición de AbM usada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, generalmente, p.ej., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Las realizaciones descritas con respecto a las CDRs Kabat pueden implementarse de forma alternativa usando relaciones descritas similares con respecto a bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos por AbM.

La secuencia de genes de anticuerpos después del montaje y mutación somática es altamente variada, y estos genes variados se estiman que codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmune proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término “repertorio” se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivados totalmente o parcialmente a partir de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La(s) secuencia(s) puede(n) generarse por reordenación in vivo de los segmentos V, D, y J de cadenas pesadas, y los segmentos V y J de cadenas ligeras. De forma alternativa, la(s) secuencia(s) puede(n) generarse a partir de una célula en respuesta a que se dé la reordenación, p.ej., estimulación in vitro. De forma alternativa, parte o todo de la secuencia(s) puede obtenerse por empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis, y otros métodos, véase, p.ej., Patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo unas en una colección genéticamente diversa.

El término “región estructural” se refiere a las partes reconocidas en la técnica de una región variable del anticuerpo que existe entre las CDRs más divergentes (es decir, hipervariables). Dichas regiones estructurales se denominan típicamente como estructuras 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4) y proporcionan un andamiaje para la presentación de las seis CDRs (tres de la cadena pesada y tres de la cadena ligera) en el espacio tridimensional, para formar una superficie de unión al antígeno.

La molécula de unión de la presente invención es preferiblemente una molécula de unión “aislada”. “Aislada” cuando se usa para describir la molécula de unión descrita en la presente memoria, significa una molécula de unión que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su medio de producción. Preferiblemente, la molécula de unión aislada está libre de asociación con todos los demás componentes de su medio de producción. Los componentes contaminantes de su medio de producción, tal como los que resultan de células transfectadas recombinantes, son materiales que interferirían típicamente con usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la molécula de unión se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul Coomassie o, preferiblemente, tinción en plata. Normalmente, sin embargo, un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión descritas en la presente memoria se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en las moléculas de unión ácido nucleico o mediante síntesis peptídica.

Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos en las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, con tal que el constructo fina posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden además alterar procesos post-traduccionales de las moléculas de unión, tal como cambiar el número o posición de sitios de glucosilación. Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos pueden sustituirse en una CDR, mientras que 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden sustituirse en las regiones estructurales (FRs). Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas como se describe en la presente memoria. Adicionalmente o alternativamente, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos pueden insertarse o suprimirse en cada una de las CDRs (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden insertarse o suprimirse en cada uno de los FRs.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de las moléculas de unión que son posiciones preferidas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis de cribado de alanina” como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana en la molécula de unión se identifica(n) (p.ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se sustituye(n) por un aminoácido neutro o cargado de forma negativa (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Esas posiciones de aminoácidos que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones después se refinan introduciendo variantes adicionales o distintas a, o para, los sitios de sustitución. Por consiguiente, mientras el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos se predetermina, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, el barrido de ala o mutagénesis aleatoria se lleva a cabo a un codón o región diana y los variantes de molécula de unión expresada se criban para la actividad deseada.

Preferiblemente, las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que oscilan en longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, además de inserciones dentro de la secuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Una variante de inserción de la molécula de unión incluye la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima o una fusión a un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen preferiblemente al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos en la molécula de unión sustituidos por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, aunque las alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera se contemplan también.

Por ejemplo, si una secuencia de CDR incluye 6 aminoácidos, se prevé que uno, dos o tres de estos aminoácidos se sustituyan. De forma similar, si una secuencia de CDR incluye 15 aminoácidos se prevé que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos se sustituyan.

Generalmente, si los aminoácidos se sustituyen en una o más o todas las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia “sustituida” obtenida entonces sea al menos 60%, más preferiblemente 65%, incluso más preferiblemente 70%, particularmente preferiblemente 75%, más particularmente preferiblemente 80% idéntica a la secuencia de CDR “original”. Esto significa que es dependiente de la longitud de la CDR a cuyo grado es idéntica a la secuencia “sustituida”. Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente 80% idéntica a su secuencia sustituida para tener al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDRs de la molécula de unión pueden tener diferentes grados de identidad a su secuencias sustituidas, p.ej., CDRL1 puede tener 80%, mientras que CDRL3 puede tener 90%.

Las sustituciones preferidas (o reemplazos) son sustituciones conservativas. Sin embargo, cualquier sustitución (que incluya la sustitución no conservativa o una o más de las “sustituciones ejemplares” enumeradas en la Tabla 1, posterior) está prevista mientras la molécula de unión retenga su capacidad para unirse a BCMA por medio del primer dominio de unión y a CD3 épsilon por medio del segundo dominio de unión y/o sus CDRs tengan una identidad a la secuencia entonces sustituida (al menos 60%, más preferiblemente 65%, incluso más preferiblemente 70%, particularmente preferiblemente 75%, más particularmente preferiblemente 80% idéntica a la secuencia de CDR “original”).

Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan por resultado un cambio en la actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados “sustituciones ejemplares” en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, pueden introducirse y los productos cribarse para una característica deseada.

Tabla 1: Sustituciones de aminoácidos

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la molécula de unión de la presente invención se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se dan de forma natural se dividen en grupos en base a las propiedades de la cadena lateral común: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada de la molécula de unión puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el reticulado aberrante. Por el contrario, puede(n) añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p.ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo parental del que se han generado. Una forma conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica la maduración de afinidad usando la expresión en fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (p.ej., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes del anticuerpo así generadas se presentan en una forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones al producto génico III de M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes expresadas en fagos se criban después para su actividad biológica (p.ej. afinidad de unión) como se describe en la presente memoria. Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, puede realizarse la mutagénesis de barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. De forma alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígenoanticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el dominio de unión y, p.ej., BCMA humano. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez que las variantes se generan, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente memoria y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el desarrollo adicional.

Otras modificaciones de la molécula de unión se contemplan en la presente memoria. Por ejemplo, la molécula de unión puede unirse a uno de una variedad de polímeros no proteicos, p.ej., polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. La molécula de unión puede además estar atrapada en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de distribución de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Las moléculas de unión descritas en la presente memoria pueden formularse como inmuno-liposomas. Un “liposoma” es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para la distribución de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen normalmente en una formación bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 77: 4030 (1980); Patente de EE.UU. núms. 4.485.045 y 4.544.545; y la publicación internacional WO 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de EE.UU. núm. 5.013.556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos de Fab’ del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido en el liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).

Cuando se usan técnicas recombinantes, la molécula de unión puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmático, o secretarse directamente en el medio. Si la molécula de unión se produce intracelularmente, como una primera etapa, los residuos particulados, tanto células huésped como fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugado o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplasmático de E. coli.

La composición de la molécula de unión preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión de la invención. El término “ácido nucleico” se conoce bien por el experto e incluye ADN (tal como ADNc) y ARN (tal como ARNm). El ácido nucleico puede ser bicatenario y monocatenario, lineal y circular. Dicha molécula de ácido nucleico está comprendida preferiblemente en un vector que está comprendido preferiblemente en una célula huésped. Dicha célula huésped es, p.ej., después de la transformación o transfección con la secuencia de ácido nucleico de la invención, capaz de expresar la molécula de unión. Para este propósito la molécula de ácido nucleico está unida de forma operativa con secuencias de control.

Un vector de la presente invención es una molécula de ácido nucleico usada como un vehículo para transferir material genético (extraño) en una célula. El término “vector” incluye - aunque no está restringido a - plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores diseñados comprenden un origen de replicación, un sitio de multiclonado y un marcador seleccionable. El vector en sí mismo es generalmente una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia ADN, que comprende un ingerto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como el “esqueleto” del vector. Los vectores modernos pueden incluir características adicionales además del inserto de transgén y un esqueleto: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen reportero, secuencia de direccionamiento, etiqueta de purificación de proteína. Los vectores llamados vectores de expresión (constructos de expresión) específicamente son para la expresión del transgén en la célula diana, y generalmente tienen secuencias de control como una secuencia promotora que conduce la expresión del transgén. La inserción de un vector en la célula diana se llama normalmente “transformación” para células bacterianas, “transfección” para células eucariotas, aunque la inserción de un vector vírico se llama también “transducción”.

Como se usa en la presente memoria, el término “célula huésped” de la presente invención pretende referirse a una célula en que un ácido nucleico que codifica la molécula de unión de la invención se introduce por medio de la transformación, transfección y similares. Debería entenderse que dichos términos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden darse en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, aunque están aún incluidas en el alcance del término como se usa en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de una molécula de unión de la invención que incluye, aunque no está limitada a, transcripción, modificación posttranscripcional, traducción, modificación post-traduccional y secreción.

El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de forma operable en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucariotas se sabe que utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está “unido de forma operable” cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción se une de forma operable al ADN por un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une de forma operable a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une de forma operable a una secuencia de codificación si está situada para facilitar la traducción. Generalmente, “unido de forma operable” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligado a sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o conectores se usan de acuerdo con la práctica convencional. Los términos “célula huésped”, “célula diana” o “célula recipiente” pretenden incluir cualquier célula individual o cultivo celular que puede ser o ha(n) sido recipientes para vectores o la incorporación de moléculas de ácido nucleico exógeno, polinucleótidos y/o proteínas. También se pretende que incluyan la progenie de una única célula, y la progenie puede no necesariamente completamente idéntica (en morfología o en genómica o complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación natural, accidental o deliberada. Las células pueden ser procariotas o eucariotas, e incluyen aunque no están limitadas a células bacterianas, células de levadura, células animales y células de mamíferos, p.ej., murina, rata, macaco o humano.

Las células huésped adecuadas incluyen células huésped procariotas y eucariotas incluyendo levaduras, hongos, células de insectos y células de mamífero.

La molécula de unión de la invención puede producirse en bacterias. Después de la expresión, la molécula de unión de la invención, preferiblemente la molécula de unión se aísla de la pasta de célula E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de, p.ej., cromatografía de afinidad y/o exclusión de tamaño. La purificación final puede realizarse de forma similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado p.ej., en células CHO.

Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonado o expresión adecuados para la molécula de unión de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es la usada más habitualmente entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están normalmente disponibles y son útiles en la presente memoria, tales como huéspedes Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces tal como, p.ej., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500J, K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402226); Pichia pastoris (documento EP 183070); Cándida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis, y hongos filamentosos tal como, p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Células huésped adecuadas para la expresión de la molécula de unión glucosilada de la invención, preferiblemente moléculas de unión derivadas de anticuerpo se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas de baculovirus y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas víricas para la transfección están disponibles públicamente, p.ej., la variante L-1 de Atographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden usarse como el virus en la presente memoria según la presente invención, particularmente por transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de célula vegetal de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, arabidopsis y tabaco pueden utilizarse también como huéspedes. Los vectores de clonaje y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivo de células vegetales se conocen por los expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Hiatt et al., Nature (1989) 342:76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10:790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8:745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32:979-986.

Sin embargo, el interés ha sido máximo en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células renales de hámster infantil (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/ DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (v Er O-76, ATCC CRL 1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, 1413 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Cuando se usan técnicas recombinantes, la molécula de unión de la invención puede producirse de forma intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si la molécula de unión se produce de forma intracelular, como una primera etapa, los restos particulados, o células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugado o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse por centrifugado. Donde se secreta el anticuerpo en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran primero generalmente usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas precedentes para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes inesperados.

La molécula de unión de la invención preparada a partir de las células huésped puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida.

La matriz a la que se une el ligando de afinidad es lo más a menudo agarosa, aunque otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesado más cortos que las que pueden alcanzarse con agarosa. Cuando la molécula de unión de la invención comprende un dominio CH3, la resina ABXM Bakerbond (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina cromatografía SEPHAROSE™ en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromato-enfocado, SDS-PAGE, y precipitación en sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

En otro aspecto de la presente invención, los procesos se proporcionan para producir moléculas de unión de la invención, comprendiendo dichos procesos cultivar una célula diana definida en la presente memoria bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión y recuperar la molécula de unión producida del cultivo.

El término “cultivar” se refiere al mantenimiento in vitro, diferenciación, crecimiento, proliferación y/o propagación de células bajo condiciones adecuadas en un medio.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una molécula de unión de la invención, o producida según el proceso de la invención. Específicamente, dicha composición es una composición farmacéutica.

Como se usa en la presente memoria, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica preferida particular de esta invención comprende la molécula de unión de la invención. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para la administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o por inyección directa en el tejido. Se prevé en particular que dicha composición se administre a un paciente por medio de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas pueden efectuarse por diferentes medios, p.ej., por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como un ejemplo no limitante, la administración ininterrumpida, es decir, continua, puede realizarse mediante un pequeño sistema de bombeo usado por el paciente para medir el influjo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende la molécula de unión de la invención puede administrarse usando dichos sistemas de bombeo. Dichos sistemas de bombeo se conocen generalmente en la técnica, y normalmente dependen del intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico a infundir. Cuando se intercambia el cartucho de dicho sistema de bombeo, puede ocurrir una interrupción temporal del flujo de otra forma ininterrumpido de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes de la sustitución del cartucho y la fase de administración después de la sustitución del cartucho se considerarían aún dentro del significado de que los medios farmacéuticos y los métodos de la invención juntos constituyen una “administración ininterrumpida” de dicho agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de estas moléculas de unión de la invención pueden ser intravenosas o subcutáneas por medio de un dispositivo de distribución de fluido o sistema de bombeo pequeño que incluyen un mecanismo de conducción de fluido para conducir al fluido fuera de un recipiente y un mecanismo de impulsión para impulsar el mecanismo de conducción. Los sistemas de bombeo para la administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y distribuir la composición adecuada en el cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bombeo pueden fijarse directamente o unirse a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo así un contacto directo entre el sistema de bombeo y la piel del paciente. El sistema de bombeo puede unirse a la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bombeo puede ser de tamaño pequeño con un recipiente para pequeños volúmenes. Como un ejemplo no limitante, el volumen del recipiente para la composición farmacéutica adecuada a administrar puede estar entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche puesto en la piel y sustituido a intervalos. Un experto en la técnica está al tanto de sistemas de parches para la distribución de fármacos adecuados para este propósito. Es digno de mención que la administración transdérmica es especialmente susceptible a la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche gastado puede conseguirse de forma ventajosa simultáneamente con la colocación de un nuevo segundo parche, por ejemplo en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche gastado e inmediatamente antes de la eliminación del primer parche gastado. No surgen problemas de interrupción de flujo o fallo de la célula de potencia.

Las composiciones inventivas pueden comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen disoluciones, p.ej., soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales conocidos. Las formulaciones pueden comprender carbohidratos, disoluciones tampón, aminoácidos y/o tensioactivos. Los carbohidratos pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. En general, como se usa en la presente memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para recipientes a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: agentes tamponantes adicionales; conservantes; co-disolventes; antioxidantes, que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (p.ej., complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; contraiones que forman sal, tal como sodio, alcoholes de azúcar polihídrico; aminoácidos, tal como alanina, glicina, asparagina, 2-fenilalanina y treonina; azúcares o alcoholes de azúcar, tal como trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (p.ej., inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tal como glutatión, ácido tióctico, tioglucolato sódico, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato sódico; proteínas de bajo peso molecular, tal como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; y polímeros hidrófilos, tal como polivinilpirrolidona. Dichas formulaciones pueden usarse para administraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bombeo. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de >1,2 KD y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de >3 KD. Los ejemplos no limitantes para detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Los ejemplos no limitantes para poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas tampón usados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse p.ej. mediante estudios de escalado de dosis mediante la administración de dosis crecientes del polipéptido de la invención que muestra la especificidad entre especies descrita en la presente memoria a primates que no son chimpancé, por ejemplo macacos. Como se describe anteriormente, la molécula de unión de la invención que muestra la especificidad entre especies descrita en la presente memoria puede usarse de forma ventajosa de forma idéntica en las pruebas preclínicas en primates que no son chimpancés y como fármaco en humanos. Estas composiciones pueden administrarse además en combinación con otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse de forma simultánea con la composición que comprende el polipéptido de la invención como se define en la presente memoria o de forma separada antes o después de la administración de dicho polipéptido en intervalos y dosis definidos de forma temporal. El régimen de dosificación se determinará por el médico que atiende y los factores clínicos. Como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, que incluyen la talla del paciente, área superficial del cuerpo, edad, el compuesto particular a administrar, sexo, tiempo y ruta de administración, salud general y otros fármacos que se administran al mismo tiempo.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones, acuosas o no acuosas, estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleatos de etilo. Vehículos acuosos que incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución salina y medio tamponado.

Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer), y similares. Los conservantes y otros aditivos pueden estar presentes además como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención comprendería vehículos proteicos, como, p.ej., albúmina sérica o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se prevé que la composición de la invención comprendería, además del polipéptido de la invención definido en la presente memoria, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso previsto de la composición. Dichos agentes serían fármacos que actúan en el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (p.ej., corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan en el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidas en la técnica. Se prevé también que la molécula de unión de la presente invención se aplique en una co-terapia, es decir, en combinación con otro medicamento antineoplásico.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en la presente memoria puede determinarse por ejemplos mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en la publicación internacional WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). “Eficacia” o “eficacia in vivo" como se usa en la presente memoria se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando p.ej., criterios de respuesta NCI estandarizados. El éxito o eficacia in vivo de la terapia que usa una composición farmacéutica de la invención se refiere a la efectividad de la composición para su propósito previsto, es decir, la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir, disminución de células patológicas, p.ej., células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse mediante métodos estándar establecidos para las entidades de enfermedad respectivas que incluyen, aunque no están limitadas a conteos de glóbulos blancos, diferenciales, Clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse varios parámetros de química clínica específicos de la enfermedad y otros métodos estándar establecidos. Además, la tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía de resonancia magnética nuclear (p.ej., para evaluación de la respuesta basada en criterios del Instituto nacional del cáncer [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-López A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas. Grupo de trabajo internacional patrocinado por NCI. J Clin Oncol. Abril de 1999; 17(4):1244]), barrido de tomografía de emisión de positrones, conteos de glóbulos blancos, diferenciales, Clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de nodo linfático, y pueden usarse varios parámetros de química clínica específicos de linfoma (p.ej., lactato deshidrogenasa) y otros métodos estándar establecidos.

Otro desafío principal en el desarrollo de fármacos de manera que la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de propiedades farmacocinéticas. Para este fin, puede establecerse un perfil farmacocinético del candidato a fármaco, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar una condición dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una entidad de enfermedad incluyen, aunque no están limitados a: vida media, volumen de distribución, metabolismo del primer paso hepático y el grado de unión al suero en sangre. La eficacia de un agente de fármaco dado puede estar influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

“Vida media” significa el tiempo donde el 50% de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p.ej., metabolismo, excreción, etc.

Por “metabolismo de primer paso hepático” se entiende la propensión de un fármaco a metabolizarse tras el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado.

“Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco a lo largo de los diversos compartimientos del cuerpo, como p.ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco en estos compartimientos.

“Grado de unión al suero sanguíneo” significa la propensión de un fármaco para interactuar con y unirse a las proteínas en suero sanguíneo, tal como albúmina, llevando a una reducción o pérdida de actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen la biodisponibilidad, demora (Tlag), Tmax, velocidades de absorción, más comienzo y/o Cmax para una cantidad dada de fármaco administrado. “Biodisponibilidad” significa la cantidad de un fármaco en el compartimiento sanguíneo. “Demora” significa el retraso de tiempo entre la administración del fármaco y su detección y medibilidad en sangre o plasma.

“Tmax” es el tiempo después del cual se alcanza la máxima concentración en sangre, y “Cmax” es la concentración en sangre obtenida de forma máxima con un fármaco dado. El tiempo para alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se necesita para su efecto biológico está influido por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos que muestran especificidad entre especies, que puede determinarse en las pruebas de animales preclínicas en primates que no son chimpancés como se resume anteriormente, también se describen p.ej., en la publicación por Schlereth et al. (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

El término “toxicidad” como se usa en la presente memoria se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en sucesos adversos o sucesos adversos severos. Estos sucesos secundarios se referirían a la falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad podría incluir además efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.

El término “seguridad”, “seguridad in vivo" o “tolerabilidad” como se usa en la presente memoria define la administración de un fármaco sin que induzca sucesos adversos severos directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo más largo de aplicación del fármaco. La “seguridad”, “seguridad in vivo" o “tolerabilidad” pueden evaluarse p.ej. a intervalos regulares durante el tratamiento y periodo de seguimiento. Las medidas incluyen evaluación clínica, p.ej., manifestaciones en órganos, y cribado de anormalidades de laboratorio. La evaluación clínica puede realizarse y las desviaciones de los descubrimientos normales pueden grabarse/codificarse según los estándares NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones en órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardiaca, coagulación y similares, como se describe p.ej., en los Criterios de terminología normales para sucesos adversos v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden probarse incluyen por ejemplo hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, fluido linfoide o espinal, licor y similares. La seguridad puede por consiguiente evaluarse p.ej. mediante examen físico, técnicas de formación de imágenes (es decir ultrasonido, rayos X, barridos CT, formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir electrocardiograma), signos vitales, midiendo los parámetros de laboratorio y grabando los sucesos adversos. Por ejemplo, los sucesos adversos en primates no chimpancé en los usos y métodos según la invención pueden examinarse por métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

El término “dosis efectiva” o “dosificación efectiva” se define como una cantidad suficiente para alcanzar o al menos alcanzar parcialmente el efecto deseado. El término “dosis terapéuticamente efectiva” se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya experimenta la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la infección y el estado general del sistema inmune del propio paciente. El término “paciente” incluye humanos y otros sujetos mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

El término “dosis efectiva y no tóxica” como se usa en la presente memoria se refiere a una dosis tolerable de una molécula de unión inventiva que es suficientemente alta para provocar la disminución de células patológicas, eliminación tumoral, encogimiento tumoral o estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos graves. Dichas dosis efectivas y no tóxicas pueden determinarse p.ej., mediante estudios de escalado de dosis descritas en la técnica y deberían estar por debajo de la dosis que induce los sucesos laterales adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, DLT).

Los términos anteriores se mencionan en p.ej., en la evaluación de seguridad preclínica de compuestos farmacéuticos derivados de biotecnología S6; Guía tripartita harmonizada de ICH; encuentro del Comité de conducción de ICH el 16 de julio de 1997.

La dosis apropiada, o cantidad terapéuticamente efectiva, de la molécula de unión de la invención dependerá de la condición a tratar, la gravedad de la condición, terapia anterior y el historial clínico del paciente y la respuesta al agente terapéutico. La dosis apropiada puede ajustarse según el juicio del médico que trata de manera que pueda administrarse al paciente una vez o en una serie de administraciones. La composición farmacéutica puede administrarse como un agente terapéutico solo o en combinación con terapias adicionales tales como terapias anticancerígenas como se necesite.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, de forma subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular y/o intrasinovial. La administración parenteral puede ser por inyección de bolo o infusión continua.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado puede reconstituirse en, p.ej., agua bacteriostática para inyección (ABPI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o la misma formulación en que la proteína ha estado antes de la liofilización.

Preferiblemente, la molécula de unión de la invención o producida mediante un proceso de la invención se usa en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico.

La presente invención también se refiere a la molécula de unión de la invención o producida por un proceso de la invención para usar en un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico que comprende la etapa de administrar a un paciente que lo necesita la molécula de unión de la invención o producida mediante un proceso de la invención.

Las formulaciones descritas en la presente memoria son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, mejora y/o prevención de la condición médica patológica como se describe en la presente memoria en un paciente que lo necesita. El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. El tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado, o célula de un paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno, o una predisposición hacia una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, hacer mejoras o afectar a la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

Aquellos “que necesitan el tratamiento” incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, además de aquellos en que el trastorno se va a prevenir. El término “enfermedad” es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la formulación proteica descrita en la presente memoria. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión. Ejemplos no limitantes de enfermedades/trastornos a tratar en la presente memoria incluyen enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico.

Preferiblemente, la molécula de unión de la invención es para usar en la prevención, tratamiento o mejora de trastornos de células B que correlacionan con la (sobre)expresión de BCMA tal como trastornos de células plasmáticas y/o enfermedades autoinmunes. La enfermedad autoinmune es, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso o artritis reumatoide.

La citotoxicidad mediada por moléculas de unión biespecífica a BCMA/CD3 puede medirse de varias formas. Las células efectoras pueden ser p.ej. células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de sangre periférica (humana) no estimuladas (PBMC). Si las células diana son de origen de macaco o expresan o están transfectadas con BCMA de macaco, las células efectoras deberían también ser de origen de macaco tal como una línea de células T de macaco, p.ej., 4119LnPx. Las células diana expresarían (al menos el dominio extracelular de) BCMA, p.ej., BCMA humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de forma estable o temporal con BCMA, p.ej., BCMA humano o de macaco. De forma alternativa, las células diana pueden ser una línea celular expresadora natural positiva para BCMA, tal como la línea celular de mieloma múltiple humano L363 o NCI-H929. Normalmente los valores CE50 se espera que sean menores con líneas celulares diana que expresan mayores niveles de BCMA en la superficie celular. La relación de efector a célula diana (E:T) es normalmente aproximadamente 10:1, pero puede también variar. La actividad citotóxica de moléculas de unión biespecífica a BCMA/CD3 puede medirse en un ensayo de liberación de cromo 51 (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). Las modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica) son también posibles. Otros métodos para medir la citotoxicidad se conocen bien por el experto y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP que incluyen ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforodamina B (SRB), ensayo WST, ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad con base celular. Se representa por el valor CE50, que corresponde a la mitad de la concentración efectiva máxima (concentración de la molécula de unión que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre la base y el máximo).

También se proporciona mediante la presente invención un método para el tratamiento o mejora de trastornos de células B que correlacionan con la (sobre)expresión de BCMA tal como trastornos de células plasmáticas, y/o enfermedades autoinmunes, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita la molécula de unión de la invención. La enfermedad autoinmune es, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso o artritis reumatoide.

En los trastornos de células plasmáticas, un clon de células plasmáticas se multiplica de forma incontrolada. Como resultado, este clon produce vastas cantidades de un único anticuerpo (monoclonal) conocido como la M-proteína. En algunos casos, tal como gammopatías monoclonales, el anticuerpo producido está incompleto, consistiendo solo en cadenas ligeras o cadenas pesadas. Estas células plasmáticas anormales y los anticuerpos que producen están normalmente limitados a un tipo.

Preferiblemente, el trastorno de células plasmáticas se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteosclerótico, enfermedades de la cadena pesada, gammopatía monoclonal de importancia no determinada y mieloma múltiple latente.

La presente invención también se refiere a kits que comprenden una molécula de unión de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención, o una célula huésped de la invención. El kit puede comprender uno o más viales que contienen la molécula de unión e instrucciones de uso. El kit puede contener también medios de administrar la molécula de unión de la presente invención tal como una jeringa, bomba, infusor o similares, medios para reconstituir la molécula de unión de la invención y/o medios para diluir la molécula de unión de la invención.

En otro aspecto de la invención, el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon. En aún otro aspecto de la invención, el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 humano y a CD3 de macaco, preferiblemente a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon de macaco. Adicionalmente o alternativamente, el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y/o Saimirí sciureus. Según estas realizaciones, uno o ambos dominios de unión de la molécula de unión de la invención son preferiblemente especies cruzadas específicas para miembros del orden de mamíferos de los primates. Los dominios de unión de CD3 específicos de especies cruzadas se describen, por ejemplo, en la publicación internacional WO 2008/119567.

Se prefiere particularmente para la molécula de unión de la presente invención que el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:27 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:28 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:29 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:117 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:118 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:119 de la publicación internacional WO 2008/119567; y

(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:153 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:154 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:155 de la publicación internacional WO 2008/119567.

En una realización preferida de forma alternativa de la molécula de unión de la presente invención, el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:12 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:13 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:14 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:30 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:31 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:32 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:48 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:49 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:50 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:66 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:67 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:68 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:84 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:85 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:86 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:102 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:103 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:104 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:120 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:121 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:122 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:138 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:139 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:140 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:156 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:157 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:158 de la publicación internacional WO 2008/119567; y

(j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:174 de la publicación internacional WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:175 de la publicación internacional WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:176 de la publicación internacional WO 2008/119567.

Se prefiere adicionalmente para la molécula de unión de la presente invención que el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO:35, 39, 125, 129, 161 o 165 de la publicación internacional WO 2008/119567.

Se prefiere de forma alternativa que el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO:15, 19, 33, 37, 51,55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 de la publicación internacional WO 2008/119567.

Más preferiblemente, la molécula de unión de la presente invención se caracteriza por el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 que comprende una región VL y una región VH seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una región VL como se representa en SEQ ID NO:17 o 21 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:15 o 19 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(b) una región VL como se representa en la SEQ ID NO:35 o 39 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:33 o 37 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(c) una región VL como se representa en SEQ ID NO:53 o 57 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:51 o 55 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(d) una región VL como se representa en SEQ ID NO:71 o 75 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:69 o 73 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(e) una región VL como se representa en SEQ ID NO:89 o 93 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:87 o 91 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(f) una región VL como se representa en SEQ ID NO:107 o 111 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:105 o 109 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(g) una región VL como se representa en SEQ ID NO:125 o 129 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:123 o 127 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(h) una región VL como se representa en SEQ ID NO:143 o 147 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:141 o 145 de la publicación internacional WO 2008/119567;

(i) una región VL como se representa en SEQ ID NO:161 o 165 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:159 o 163 de la publicación internacional WO 2008/119567; y

(j) una región VL como se representa en SEQ ID NO:179 o 183 de la publicación internacional WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO:177 o 181 de la publicación internacional WO 2008/119567.

Según una realización preferida de la molécula de unión de la presente invención, en particular el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3, los pares de regiones VH y regiones VL están en el formato de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Las regiones VH y VL se disponen en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH está situada de forma N-terminal a una secuencia conectora. La región VL está situada de forma C-terminal de la secuencia conectora.

Una realización preferida de la molécula de unión descrita anteriormente de la presente invención se caracteriza por el segundo dominio de unión capaz de unirse a CD3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NOs:23, 25, 41,43, 59, 61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 de la publicación internacional WO 2008/119567.

En una realización, el primero o el segundo dominio de unión es o se deriva de un anticuerpo. En otra realización, ambos dominios de unión son o se derivan de un anticuerpo.

Se prefiere además para la molécula de unión de la invención que el primer y el segundo dominio formen una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpo u oligómeros de los mismos.

Se prevé además que las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 de la presente invención sean capaces de mostrar eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse p.ej. en un estudio como se describe en los ejemplos añadidos, p.ej., en el Ejemplo A19 (modelo de xenoinjerto tumoral humano en etapa avanzada). El experto sabe cómo modificar o adaptar ciertos parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 a administrar, y las líneas temporales, mientras alcance aún un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] es 70 o 60 o menos, más preferiblemente 50 o 40 o menos, incluso más preferiblemente al menos 30 o 20 o menos y lo más preferiblemente 10 o menos, 5 o menos o incluso 2,5 o menos.

Preferiblemente, las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 de la presente invención no inducen/median la lisis o no inducen/median esencialmente la lisis de células negativas a BCMA tal como HL60, MES-SA y SNU-16. El término “no inducen la lisis”, “no inducen esencialmente la lisis”, “no median la lisis” o “no median esencialmente la lisis” significa que una molécula de unión de la presente invención no induce o media la lisis de más del 30%, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, particularmente preferiblemente no más del 9%, 8%, 7%, 6% o 5% de células negativas a BCMA, por lo cual la lisis de una línea celular positiva para BCMA tal como NCI-H929, L-363 u OPM-2 se ajusta para ser 100%. Esto se aplica para concentraciones de la molécula de unión de al menos hasta 500 nM. El experto sabe cómo medir la lisis celular sin más preámbulos. Además, la memoria enseña una instrucción específica de cómo medir la lisis celular; véase p.ej., el ejemplo A20 posterior.

La presente invención también proporciona moléculas de unión que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostrados en SEQ ID NOs:1-1000 y 1022-1093.

Preferiblemente, una molécula de unión comprende tres secuencias VH CDR (denominadas “VH CDR1 ”, “VH CDR2”, “VH CDR3”, véase la 4a columna de la Tabla de secuencias anexa) de una molécula de unión denominada “BCMA-(X)”, en la que X es 1-100 (véase la 2a columna de la Tabla de secuencias anexa) y/o tres secuencias VL CDR (denominadas “VL CDR1”, “VH CDR2”, “VH CDR3”, véase la 4a columna de la Tabla de secuencias anexa) de una molécula de unión denominada BCMA-X, en la que X es 1-100 (véase la 2a columna de la Tabla de secuencias anexa).

Preferiblemente, una molécula de unión comprende una secuencia VH y/o VL como se da en la Tabla de secuencias anexa (véase la 4a columna de la Tabla de secuencias anexa: “VH” y “VL”).

Preferiblemente, una molécula de unión comprende una secuencia scFV como se da en la Tabla de secuencias anexa (véase la 4a columna de la Tabla de secuencias anexa: “scFv”).

Preferiblemente, una molécula de unión comprende una secuencia de molécula biespecífica como se da en la Tabla de secuencias anexa (véase la 4a columna de la Tabla de secuencias anexa: “molécula biespecífica”).

Se describe también en la presente memoria un agente de unión biespecífico comprende al menos dos dominios de unión, comprendiendo un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en el que dicho primer dominio de unión se une al antígeno de maduración de células B BCMA y en el que dicho segundo dominio de unión se une a CD3 (punto general 1) incluyendo además los siguientes puntos generales (GI):

GI 2. El agente de unión biespecífico del punto 1, en el que dicho primer dominio de unión se une al dominio extracelular de BCMA y dicho segundo dominio de unión se une a la cadena £ de CD3.

GI 3. Un agente de unión bioespecífico del punto general 1 o 2 que está en el formato de un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo.

GI 4. Un agente de unión biespecífico del punto general 3 en el formato de un anticuerpo de longitud completa, en el que dicho primer dominio de unión a BCMA se deriva de ratón dicho y en el que dicho segundo dominio de unión a CD3 se deriva de la rata.

GI 5. Un agente de unión biespecífico del punto general 3, que está en el formato de un fragmento de anticuerpo en forma de un diacuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada conectada a un dominio variable de cadena ligera en la misma cadena polipeptídica de manera que los dos dominios no se emparejan.

GI 6. Un agente de unión biespecífico del punto general 1 o 2 que está en el formato de un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico que consiste en dos moléculas scFv conectadas por medio de un péptido conector o mediante una molécula de albúmina sérica humana.

GI 7. El agente de unión biespecífico del punto general 6, regiones de cadena pesada (VH) y las correspondientes regiones de cadena ligera (VL) variable están dispuestas, desde el extremo N al extremo C, en el orden

VH(BCMA)-VL(BCMA)-VH(CD3)-VL(CD3),

VH(CD3)-VL(CD3)-VH(BCMA)-VL(BCMA) o

VH(CD3)-VL(CD3)-VL(BCMA)-VH(BCMA).

GI 8. Un agente de unión biespecífico del punto general 1 o 2, que está en el formato de un dominio de inmunoglobulina de dominio único seleccionado de VHHs o VHs.

GI 9. El agente de unión biespecífico del punto general 1 o 2, que está en el formato de una molécula Fv que tiene cuatro dominios variables de anticuerpo con al menos dos dominios de unión, en el que al menos un dominio de unión es específico a BCMA humano y al menos un dominio de unión es específico a CD3 humano.

GI 10. Un agente de unión biespecífico del punto general 1 o 2, que está en el formato de una molécula de unión de cadena sencilla que consiste en un primer dominio de unión específico para BCMA, una subregión constante que está situada en el extremo C a dicho primer dominio de unión, un conector tipo escorpión situado en el extremo C a la subregión constante, y un segundo dominio de unión específico para CD3, que está situado en el extremo C a dicha subregión constante.

GI 11. El agente de unión biespecífico del punto general 1 o 2, que está en el formato de una molécula tipo anticuerpo que se une a BCMA por medio de los dos Fv de cadena pesada/cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y que se une a CD3 por medio de un dominio de unión que se ha diseñado en bucles que no son CDR de la cadena pesada o la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

GI 12. Un agente de unión biespecífico del punto 1 que está en el formato de una molécula de repetición de anquirina biespecífica.

GI 13. Un agente de unión biespecífico del punto general 1, en el que dicho primer dominio de unión tiene un formato seleccionado de los formatos definidos en cualquiera de los puntos 3 a 12 y en el que dicho segundo dominio de unión tiene un formato diferente seleccionado de los formatos definidos en cualquiera de los puntos 3 a 12.

GI 14. Un agente de unión biespecífico del punto general 1 que ese un péptido bicíclico.

GI 15. Una composición farmacéutica que contiene al menos un agente de unión biespecífico de cualquiera de los puntos generales 1 a 14.

GI 16. Un agente de unión biespecífico de cualquiera de los puntos generales 1 a 14 o una composición farmacéutica del punto 14 para el tratamiento de trastornos de células plasmáticas u otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

GI 17. Un agente de unión biespecífico de cualquiera de los puntos generales 1 a 14 o una composición farmacéutica del punto 15 para el tratamiento de trastornos de células plasmáticas seleccionados de plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteosclerótico, enfermedades de la cadena pesada, gammopatía monoclonal de importancia indeterminada, mieloma múltiple latente.

Las variaciones de los puntos anteriores son derivables de EP-Nr. 10 191 418.2 que se describen también en la presente memoria.

Descripción detallada

La presente invención se refiere específicamente a grupos de moléculas de unión que se agrupan como sigue. Las definiciones, realizaciones y/o aspectos como se describen anteriormente son aplicables al grupo de moléculas de unión que sigue.

Primer grupo de moléculas de unión (A)

La presente invención se refiere al primer grupo de moléculas de unión que comprenden un primer y un segundo dominio de unión, en el que el primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y a la agrupación del epítopos 4 de BCMA, y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) el primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y la agrupación de epítopos 4 de BCMA; y

(b) el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y

En el que la agrupación de epítopos 3 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002.

Se prevé también que el primer dominio de unión de la presente invención sea capaz de unirse de forma simultánea a la agrupación de epítopos 3 (SEQ ID NO:1016) y 4 (SEQ ID NO:1019) de BCMA humano.

En un aspecto adicional, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente invención no es capaz de unirse al dominio extracelular quimérico de BCMA como se representa en SEQ Id NO:1015. En otras palabras, la agrupación de epítopos E7, o más específicamente, el residuo de aminoácido 39 (arginina) de SEQ ID NO:1002, juega un papel antigénico importante en la unión del primer dominio de unión a BCMA. Si este aminoácido se intercambia por otro aminoácido, preferiblemente por medio de una sustitución no conservativa, tal como una sustitución con prolina o alanina, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente invención no es capaz de unirse más al dominio extracelular de BCMA.

El término “no es capaz de unirse” significa que el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente invención no se une a BCMA quimérico humano/murino, p.ej., como se representa en SEQ ID NO:1015, es decir, no muestra reactividad de más de 30%, preferiblemente más de 20%, más preferiblemente más de 10%, particularmente preferiblemente más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5%, preferiblemente bajo las condiciones aplicadas en los Ejemplos A anexos, con BCMA quimérico humano/murino p.ej., como se representa en SEQ ID NO:1015.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente invención es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA humano, preferiblemente ECD de BCMA humano. Por consiguiente, cuando la agrupación de epítopos respectiva en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (dando por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en la que la agrupación de epítopos 3 y/o 4 humana se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina; véase de forma ejemplar SEQ ID NO:1011 y 1012, respectivamente), se dará una disminución en la unión del dominio de unión. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en comparación a la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano, por lo que la unión a la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano se ajusta para ser 100%. Se prevé que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino mencionadas anteriormente se expresen en células CHO. Se prevé también que al menos una de las quimeras de BCMA humano/BCMA murino, preferiblemente la quimera E3 murina/BCMA humano se condense con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM; véase la Figura 2a.

Un método para probar esta pérdida de unión debido al intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano (p.ej. murino) se describe en los Ejemplos A anexos, en particular en los Ejemplos A1-A3. Un método adicional para determinar la contribución de un residuo específico de un antígeno diana al reconocimiento mediante una molécula de unión o dominio de unión dados es barrido de alanina (véase p.ej., Morrison KL y Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. Junio de 2001; 5(3):302-7), donde cada residuo a analizar se sustituye por alanina, p.ej., por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Se usa la alanina por su grupo funcional metilo, no voluminoso, químicamente inerte, que sin embargo imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los demás aminoácidos. A veces los aminoácidos voluminosos tales como valina o leucina pueden usarse en casos donde se desea la conservación del tamaño de residuos mutados. El barrido de alanina es una tecnología madura que se ha usado durante un largo periodo de tiempo.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente invención se une a la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA humano y es capaz además de unirse a BCMA de macaco, preferiblemente a la agrupación de epítopos 3 y/o 4 de BCMA de macaco (SEQ ID NO:1020 y 1021, respectivamente) tal como de Macaca mulatta o Macaca fascicularis. Se prevé que el primer dominio de unión se una o no a BCMA murino.

Por consiguiente, en una realización, un dominio de unión que se une a BCMA humano, en particular a la agrupación de epítopos 3 y 4 del dominio de proteína extracelular de BCMA formado por los residuos de aminoácidos 24 a 41 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia humana como se representa en SEQ ID NO:1002, también se une a BCMA de macaco, en particular a la agrupación de epítopos 3 y/o 4 del dominio de proteína extracelular de BCMA formado por los residuos de aminoácidos 24 a 41 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia de BCMA de macaco como se representa en SEQ ID NO:1006.

En una realización, un primer dominio de unión de una molécula de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA, en la que la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 40 y 41 a 53, respectivamente, de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002 (polipéptido de longitud completa de BCMA humano) o SEQ ID NO:1007 (dominio extracelular de BCMA humano: aminoácidos 1 54 de SEQ ID NO:1002).

En un aspecto de la presente invención, el primer dominio de unión de la molécula de unión es adicionalmente o alternativamente capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y/o 4 de BCMA de Callithrixjacchus, Saguinus oedipus y/o Saimiri sciureus.

La afinidad del primer dominio de unión por BCMA humano es preferiblemente <40 nM, más preferiblemente <35 nM, <15 nM, o <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM, y lo más preferiblemente <0,05 nM. La afinidad del primer dominio de unión por BCMA de macaco es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM, y lo más preferiblemente <0,05 nM o incluso <0,01 nM. La afinidad puede medirse por ejemplo en un ensayo Biacore o en un ensayo Scatchard, p.ej., como se describe en los ejemplos. El intervalo de afinidad para la unión a BCMA de macaco frente a BCMA humano es preferiblemente [1:10-1:5] o [5:1-10:1], más preferiblemente [1:5-5:1], y lo más preferiblemente [1:2-3:1] o incluso [1:1 -3:1]. Otros métodos de determinación de la afinidad se conocen bien por el experto.

La citotoxicidad mediada por moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 puede medirse de varias formas. Las células efectoras pueden ser p.ej., células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de sangre periférica (humana) no estimuladas (PBMC). Si las células diana son de origen de macaco o expresan o están transfectadas con BCMA de macaco, las células efectoras deberían ser también de origen de macaco tal como una línea de células T de macaco, p.ej., 4119LnPx. Las células diana expresarían (al menos el dominio extracelular de) BCMA, p.ej., BCMA humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que está transfectada de forma estable o temporal con BCMA, p.ej., BCMA humano o de macaco. De forma alternativa, las células diana pueden ser una línea celular expresadora natural positiva para BCMA, tal como la línea celular de mieloma múltiple humano L363 o NCI-H929. Normalmente los valores CE50 se espera que sean menores con líneas celulares diana que expresan niveles mayores de BCMA en la superficie celular. La relación efector a célula diana (E:T) es normalmente aproximadamente 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 puede medirse en un ensayo de liberación de cromo 51 (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). Las modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica) también son posibles. Otros métodos de medida de la citotoxicidad se conocen bien por el experto y comprenden ensayos MTT o MTS. Los ensayos basados en ATP que incluyen ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforodamina B (SRB), ensayo WST, ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por moléculas de unión biespecífica a BCMA/CD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. Se representa por el valor CE50, que corresponde a la mitad de la concentración efectiva máxima (concentración de la molécula de unión que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre la base y el máximo). Preferiblemente, el valor CE50 de las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 es <20.000 pg/ml, más preferiblemente <5000 pg/ml, incluso más preferiblemente <1000 pg/ml, incluso más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml, y lo más preferiblemente <5 pg/ml.

Cualquiera de los valores CE50 dados anteriormente puede combinarse con cualquiera de los escenarios indicados de un ensayo de citotoxicidad basado en células. Por ejemplo, cuando se usan células T CD8 positivas (humanas) o una línea de células T de macaco como células efectoras, el valor CE50 de la molécula de unión biespecífica a BCMA/CD3 es preferiblemente <1000 pg/ml, más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si en este ensayo las células diana son células transfectadas con BCMA (humano o de macaco) tal como células CHO, el valor CE50 de la molécula de unión biespecífica a BCMA/CD3 es preferiblemente <150 pg/ml, más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <50 pg/ml, incluso más preferiblemente <30 pg/ml, incluso más preferiblemente <10 pg/ml y lo más preferiblemente <5 pg/ml. Si las células diana es una línea celular expresadora natural positiva para BCMA, entonces el valor CE50 es preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <200 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, incluso más preferiblemente <150 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml, y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o menos. Cuando se usan PBMCs (humanas) como células efectoras, el valor CE50 de la molécula de unión biespecífica a BCMA/CD3 es preferiblemente <1000 pg/ml, más preferiblemente <750 pg/ml, más preferiblemente <500 pg/ml, incluso más preferiblemente <250 pg/ml, incluso más preferiblemente <100 pg/ml y lo más preferiblemente <50 pg/ml, o menos.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 individuales (tal como anticuerpos) se denomina como “intervalo de potencia”. Este intervalo de potencia puede calcularse p.ej. como la relación entre valores CE50 del monómero y el dímero de la molécula. Los intervalos de potencia de las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 probadas de la presente invención son preferiblemente <5, más preferiblemente <4, incluso más preferiblemente <3, incluso más preferiblemente <2 y lo más preferiblemente <1.

Preferiblemente, las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 de la presente invención no se unen a o reaccionan de forma cruzada con BAFF-R humano y/o TACI humano. Los métodos para detectar reactividad cruzada con BAFF-R humano y/o TACI humano se describen en el ejemplo A9.

Se prefiere también que las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 de la presente invención tengan porcentajes de dímero de igual a o menos que 1,5%, preferiblemente igual a o menos que 0,8% después de tres ciclos de congelación/descongelación. Un ciclo de congelación-descongelación y la determinación del porcentaje de dímero pueden determinarse de acuerdo con el Ejemplo A16.

Las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 (tal como anticuerpos) de la presente invención preferiblemente muestran una termoestabilidad favorable con temperaturas de fusión por encima de 60°C, más preferiblemente entre 62°C y 63°C (véase el Ejemplo A17).

Para determinar la interacción potencial de moléculas de unión biespecíficas de BCMA/CD3 (tal como anticuerpos) con proteínas plasmáticas humanas, puede realizarse la prueba de interferencia en plasma (véase p.ej. el Ejemplo A18). En una realización preferida, no hay una reducción significativa de la unión a la diana de las moléculas de unión biespecíficas a BCMA/CD3 mediada por las proteínas plasmáticas. El valor de interferencia plasmática relativa es preferiblemente <2.

En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la invención comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

En aún otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:497 y SEQ ID NO:507.

En otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:418, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:498 y SEQ ID NO:508.

En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en:

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:237, y una región VL como se representa en SEQ ID (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:247, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:248 (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:257, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:258 (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:267, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:268 (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:277, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:278 (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:287, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:288 (g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:297, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:298 (h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:307, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:308 (i) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:397, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:398 (k) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:407, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:408 (l) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:417, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:418 (m) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:427, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:428 (n) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:437, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:438 (o) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:447, y una región VL como se representa en SEQ ID (p) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:457, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:458; (q) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:467, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:468; (r) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:477, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:478; (s) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:487, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:488; (t) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:497, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:498;

y

(u) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:507, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:508. En un ejemplo, el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:479, SEQ ID NO:489, SEQ ID NO:499 y SEQ ID NO:509.

Un CDR-H1 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos DYYIN. Un CDR-H2 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos WIYFASGNSEYNQKFTG. Un CDR-H3 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos LYDYDWYFDV. Un CDR-L1 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos KSSQSLVHSNGNTYLH. Un CDR-L2 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos KVSNRFS. Un CDR-L2 preferido se muestra en la secuencia de aminoácidos AETSHVPWT o SQSSIYPWT.

Se prefiere una molécula de unión que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:300. Se prefiere también una molécula de unión que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:500.

Además, la presente descripción se refiere al uso de la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA, preferiblemente BCMA humano, para la generación de una molécula de unión, preferiblemente un anticuerpo, que es capaz de unirse a BCMA, preferiblemente BCMA humano. La agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA corresponde preferiblemente a residuos de aminoácidos 24 a 41 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002. Además la presente descripción proporciona un método para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica, que es capaz de unirse a BCMA, preferiblemente BCMA humano, que comprende (a) Inmunizar a un animal con un polipéptido que comprende la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA, preferiblemente BCMA humano, en el que la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 41 y 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002,

(b) Obtener dicho anticuerpo, y

(c) Opcionalmente convertir dicho anticuerpo en una molécula de unión biespecífica que es capaz de unirse a BCMA humano y preferiblemente a CD3.

Preferiblemente, la etapa (b) incluye que el anticuerpo obtenido se prueba como sigue:

Cuando la agrupación de epítopos respectiva en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (que da por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en el que la agrupación de epítopos humana 3 y/o 4 se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina), se dará una disminución en la unión del anticuerpo. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano, por lo que la unión a la respectiva agrupación de epítopos 3 y 4 en la proteína de BCMA humano se ajusta para ser 100%. Se prevé que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino mencionadas anteriormente se expresen en las células CHO. Se prevé además que al menos una de las quimeras de BCMA humano/BCMA murino se condensa con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM: véase la Figura 2a. Un método para probar esta pérdida de unión debido al intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano (p.ej. murino) se describe en los Ejemplos A anexos, en particular los Ejemplos A1-A3.

El método puede incluir además probar con respecto a si el anticuerpo se une a la agrupación de epítopos 3 y 4 de BCMA humano y es además capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y/o 4 de BCMA de macaco tal como BCMA de Macaca mulatta o Macaca fascicularis (SEQ ID NOs:1017 y 121).

Segundo grupo de moléculas de unión (B)

El segundo grupo de moléculas de unión de la presente descripción se refiere a una molécula de unión biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que el primer dominio de unión es capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA humano y al dominio extracelular de BCMA murino, y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3.

Por consiguiente, en un primer aspecto del segundo grupo de la presente descripción proporciona una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA humano y al dominio extracelular de BCMA murino; y

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y

En la que el dominio extracelular de BCMA humano corresponde a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1007, y el dominio extracelular de BCMA murino corresponde a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1008.

El primer dominio de unión es capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA humano y al dominio extracelular de BCMA murino. El dominio extracelular de BCMA humano (secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1007) corresponde a los residuos de aminoácidos 1-54 del polipéptido de longitud completa BCMA humano que se representa en SEQ ID NO:1002. El dominio extracelular de BCMA murino (secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1008) corresponde a los residuos de aminoácidos 1 -49 del polipéptido de longitud completa de BCMA murino que se representa en SEQ ID NO:1004.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente descripción se une además a BCMA de macaco tal como BCMA de Macaca mulatta (SEQ ID NO:1017) o Macaca fascicularis (SEQ ID NO:1017).

En un aspecto de la presente descripción, el primer dominio de unión de la molécula de unión es capaz adicionalmente o alternativamente de unirse a BCMA de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y/o Saimirí sciureus.

La afinidad del primer dominio de unión por BCMA humano es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, lo más preferiblemente <1 nM.

En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente descripción comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:83, CDR-L1 como se representa en s Eq ID NO:84, CDR-L2 como se representa en s Eq ID NO:85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:86;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:93, CDR-L1 como se representa en s Eq ID NO:94, CDR-L2 como se representa en s Eq ID NO:95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:96;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:101, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:102, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:103, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:104, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:105 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:106;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:111, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:112, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:113, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:114, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:115 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:116;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:121, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:122, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:123, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:124, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:125 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:126;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:136;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:141, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:142, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:143, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:144, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:145 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:146; y

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:151, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:152, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:153, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:154, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:155 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:156.

En aún otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:147 y SEQ ID NO:157.

En otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:148 y SEQ ID NO:158.

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:87, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:88; (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:97, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:98; (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:107, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:108; (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:117, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:118; (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:127, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:128; (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:137, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:138; (g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:147, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:148;

y

(h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:157, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:158. En un ejemplo, el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:149 y SEQ ID NO:159.

El segundo grupo de moléculas de unión de la presente descripción también se refiere a los siguientes puntos:

1. Una molécula de unión que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse al complejo receptor CD3 de células T ; y

2. La molécula de unión según el punto 1, en la que el primer dominio de unión es además capaz de unirse a BCMA de macaco.

3. La molécula de unión según el punto 1 o 2, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon, preferiblemente CD3 épsilon humano.

4. La molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 3, en la que el primer y/o el segundo dominio de unión se derivan de un anticuerpo.

5. La molécula de unión según el punto 4, que se selecciona del grupo que consiste en (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpos y oligómeros de los mismos.

6. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende c Dr -H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:83, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:86;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:93, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:94, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:96;

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH como se representa en SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:147 y SEQ ID NO:157.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL como se representa en SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:148 y SEQ ID NO:158.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:87, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:88;

(b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:97, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:98;

(c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:107, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:108;

(d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:117, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:118;

(e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:127, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:128;

(f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:137, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:138;

(g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:147, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:148; y

(h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:157, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:158.

La molécula de unión según el punto 9, en la que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:149 y SEQ ID NO:159.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos I a 10.

Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define en el punto 11.

Una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico como se define en el punto I I o con el vector como se define en el punto 12.

14. Un proceso para la producción de una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 10, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped como se define en el punto 13 bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 10 y recuperar la molécula de unión producida del cultivo.

15. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 10, o producida según el proceso del punto 14.

16. La molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 10, o producida según el proceso del punto 14 para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes.

17. Una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 10, o producida según al proceso del punto 14 para usar en un método para el tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita la molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 10, o producida según el proceso del punto 14.

18. La molécula de unión para el uso según el punto 17, en la que el trastorno de células plasmáticas se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteosclerótico, enfermedades de la cadena pesada, gammopatía monoclonal de importancia indeterminada y mieloma múltiple latente.

19. La molécula de unión para el uso según el punto 17, en la que la enfermedad autoinmune es lupus sistémico eritematoso o artritis reumatoide.

20. Un kit que comprende una molécula de unión como se define en cualquiera en los puntos 1 a 10, una molécula de ácido nucleico como se define en el punto 11, un vector como se define en el punto 12, o una célula huésped como se define en el punto 13.

Tercer grupo de moléculas de unión (C)

El tercer grupo de moléculas de unión de la presente descripción se refiere a una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que el primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA, y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3.

Por consiguiente, en un primer aspecto la presente descripción proporciona una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 1 (MLQMAGQ) (SEQ ID NO:1018) y 4 (NASVTNSVKGTNA) (SEQ ID NO:1019) de BCMA; y

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y

En la que la agrupación de epítopos 1 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 7 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002.

Se prevé también que el primer dominio de unión de la presente descripción es capaz de unirse de forma simultánea a la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA humano.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente descripción es capaz de unirse a la agrupación del epítopos 1 y 4 de BCMA humano, preferiblemente ECD de BCMA humano. Por consiguiente, cuando la respectiva agrupación del epítopos en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (dando por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en la que la agrupación de epítopos 1 y/o 4 humana se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina; véase ejemplarmente SEQ ID NO:1009 y 1012, respectivamente), se dará una disminución en la unión del dominio de unión. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano, por lo que la unión a la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano se ajusta para ser 100%. Se prevé que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino se expresan en células CHO. Se prevé también que al menos una de las quimeras de BCMA humano/BCMA murino, preferiblemente la quimera de E1 murino/BCMA humano se condensa con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM; véase Figura 2a.

Un método para probar esta pérdida de unión debido al intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano (p.ej., murino) se describe en los ejemplos anexos, en particular en los Ejemplos C1-3.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente descripción se une a la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA humano, y es capaz además de unirse a la agrupación de epítopos 1 y/4 de BCMA de macaco (SEQ ID NO:1020 y 1021, respectivamente) tal como de Macaca mulatta o Macaca fascicularis.

Por consiguiente, en una realización, un dominio de unión que se une a BCMA humano, en particular a la agrupación de epítopos 1 y 4 del dominio de proteína extracelular de BCMA formada por residuos de aminoácidos 1 a 7 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia humana como se representa en SEQ ID NO:1002, además se une a BCMA de macaco, en particular a la agrupación de epítopos 1 y/o 4 del dominio de proteína extracelular de BCMA formada por residuos de aminoácidos 1 a 7 y 41 a 53, respectivamente, de la secuencia de BCMA de macaco como se representa en SEQ ID NO:1006.

En una realización, un primer dominio de unión de una molécula de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA, en la que la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 7 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002 (polipéptido de longitud completa de BCMA humano) o SEQ ID NO:1007 (dominio extracelular de BCMA humano: aminoácidos 1 -54 de la SEQ ID NO:1002).

En un aspecto de la presente descripción, el primer dominio de unión de la molécula de unión es capaz adicionalmente o alternativamente de unirse a la agrupación de epítopos 1 y/o 4 de BCMA Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y/o Saimirí sciureus.

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:511, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:512, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:513, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:514, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:515 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:516;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:521, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:522, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:523, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:524, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:525 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:526;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:531, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:532, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:533, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:534, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:535 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:536;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:541, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:542, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:543, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:544, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:545 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:546;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:551, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:552, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:553, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:554, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:555 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:556;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:561, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:562, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:563, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:564, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:565 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:566; y

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:571, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:572, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:573, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:574, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:575 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:576.

En aún otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:567 y SEQ ID NO:577.

En otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO:518, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:568 y SEQ ID NO:578.

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:517, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:518 (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:527, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:528 (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:537, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:538 (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:547, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:548 (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:557, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:558 (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:567, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:568 y

(g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:577, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:578 En un ejemplo, el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:519, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:549, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:569 y SEQ ID NO:579.

Además, la presente descripción se refiere al uso de la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA, preferiblemente BCMA humano, para la generación de una molécula de unión, preferiblemente un anticuerpo, que es capaz de unirse a BCMA, preferiblemente BCMA humano. La agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA preferiblemente corresponde a residuos de aminoácidos 1 a 7 y 42 a 54, respectivamente, de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002. Además, la presente descripción proporciona un método para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica, que es capaz de unirse a BCMA, preferiblemente BCMA humano, que comprende (a) Inmunizar un animal con un polipéptido que comprende la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA, preferiblemente BCMA humano, en la que la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA corresponde a los residuos aminoácidos 1 a 7 y 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002,

(b) Obtener dicho anticuerpo, y

(c) Convertir opcionalmente dicho anticuerpo en una molécula de unión biespecífica que es capaz de unirse a BCMA humano y preferiblemente a CD3.

Cuando la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (que da por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en la que la agrupación de epítopos humana 1 y/o 4 se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina, se dará una disminución en la unión del anticuerpo. Dicha disminución es preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano, por lo cual la unión a la respectiva agrupación de epítopos 1 y 4 en la proteína de BCMA humano se ajusta para ser 100%.

El método puede incluir además pruebas en cuanto a si el anticuerpo se une a la agrupación de epítopos 1 y 4 de BCMA humano y es además capaz de unirse a la agrupación de epítopo 1 y/o 4 de BCMA de macaco.

El tercer grupo de moléculas de unión de la presente descripción también se relaciona con los siguientes puntos: 1. Una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 1 (MLQMAGQ) y 4 (NASVTNSVKGTNA) de BCMA; y

En la que la agrupación de epítopos 1 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 7 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002.

2. La molécula de unión según el punto 1, en la que el primer dominio de unión es capaz adicionalmente de unirse a la agrupación de epítopo 1 (MLQMARQ) y 4 (NAs Mt NSVKGMNA) de BCMA de macaco.

La molécula de unión según el punto 1 o 2, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 humano y a CD3 de macaco.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer y/o el segundo dominio de unión se derivan de un anticuerpo.

La molécula de unión según el punto 5, que se selecciona del grupo que consiste de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpos y oligómeros de los mismos.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende c Dr -H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH como se representa en SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:527, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:557, SEQ ID NO:567 y SEQ ID NO:577.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL como se representa en SEQ ID NO:518, SEQ ID NO:528, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:548, SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:568 y SEQ ID NO:578.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en:

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:517, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:518;

(b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:527, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:528;

(c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:537, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:538;

(d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:547, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:548;

(e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:557, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:558;

(f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:567, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:568; y

(g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:577, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:578.

Una molécula de unión según el punto 10, en la que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SeQ ID NO:519, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:539, SEQ ID NO:549, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:569 y SEQ ID NO:579.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 11.

Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define en el punto 12.

Una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico como se define en el punto 12 o con el vector como se define en el punto 13.

Un proceso para la producción de una molécula de unión según cualquiera en puntos 1 a 11, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped como se define en el punto 14 bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 11 y recuperar la molécula de unión producida del a cultura.

Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 11, o producida según el proceso del punto 15.

La molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 11, o producida según el proceso del punto 15 para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes.

Una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 11, o producida según el proceso del punto 15 para usar en un método para el tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes, que comprenden la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita la molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 11, o producida según al proceso del punto 15.

La molécula de unión para el uso según el punto 18, en la que el trastorno de células plasmáticas se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteosclerótica, enfermedades de cadena pesada, gammopatía monoclonal de importancia indeterminada, y mieloma múltiple latente.

La molécula de unión para el uso según el punto 18, en la que la enfermedad autoinmune es lupus sistémico eritematoso.

Un kit que comprende una molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 11, una molécula de ácido nucleico como se define en el punto 12, un vector como se define en el punto 13 y/o una célula huésped como se define en el punto 14.

El uso de la agrupación de epítopos 1 y una agrupación de epítopos 4 de BCMA para la generación de una molécula de unión, preferiblemente un anticuerpo, que es capaz de unión a BCMA, en la que la agrupación de epítopos 1 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 7 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopo 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002.

Un método para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica, que es capaz de unirse a BCMA, que comprende

(a) Inmunizar un animal con un polipéptido que comprende la agrupación de epítopos 1 y una agrupación de epítopos 4 de BCMA, en la que la agrupación de epítopos 1 de BCMA corresponde a residuos de aminoácidos 1 a 7 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002,

(b) Obtener dicho anticuerpo, y

(c) Opcionalmente convertir dicho anticuerpo en una molécula de unión biespecífico que es capaz de unirse a BCMA humano y preferiblemente al complejo receptor CD3 de células T.

Cuarto grupo de moléculas de unión (D)

El cuarto grupo de moléculas de unión de la presente descripción se refiere a una molécula de unión que comprende al menos un primer y un segundo dominio de unión que es biespecífico, en la que el primer dominio de unión es capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA humano y a al menos un dominio extracelular quimérico de BCMA que se genera intercambiando una agrupación de epítopos o aminoácido del antígeno BCMA humano con la respectiva agrupación de epítopos o aminoácido de un antígeno BCMA no humano; y el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3.

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a

(i) El dominio extracelular de BCMA humano que corresponde a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1007, y

(ii) Al menos uno de los dominios extracelulares quiméricos de BCMA seleccionados del grupo que consiste en dominios de BCMA que corresponden a las secuencias de aminoácidos como se representan en SEQ ID NO:1009, SEQ ID NO:1010, SEQ ID NO:1011, SEQ ID NO:1012, SEQ ID NO:1013, SEQ ID NO:1014 y SEQ ID NO:1015; y

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3.

En una realización preferida, dicho primer dominio de unión como se define en (a)(ii), en la presente memoria, es capaz de al menos unirse a los dominios extracelulares quiméricos de BCMA como se representa en SEQ ID NO:1011. En otra realización según la presente descripción, el primer dominio de unión es capaz de unirse a dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos los dominios extracelulares quiméricos de BCMA como se representa en SEQ ID NO:1009, SEQ ID NO:1010, SEQ ID NO:1011, SEQ ID NO:1012, SEQ ID NO:1013, SEQ ID NO:1014 y SEQ ID NO:1015. En el contexto de esta realización, se prefiere la unión al dominio extracelular quimérico de BCMA como se representa en SEQ ID NO:1011 en combinación con uno o más de los demás dominios extracelulares quiméricos.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente descripción es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 1 a 7 de BCMA humano, preferiblemente ECD de BCMA humano. Por ejemplo, cuando la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (p.ej., que da por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en el que, por ejemplo, la agrupación de epítopos humana 1 y/o 4 se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina; véase de forma ejemplar SEQ ID NO:1009 y 1012, respectivamente), el dominio de unión es aún capaz de unión.

Se prevé que el primer dominio de unión sea capaz de unirse a un constructo de BCMA quimérico que comprende una o más de las agrupaciones de epítopos murinas mencionadas anteriormente en un ECD de BCMA humano en cada posible combinación. Por ejemplo, cuando la respectiva agrupación de epítopos en la proteína de BCMA humano se intercambia con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA murino (p.ej., que da por resultado un constructo que comprende BCMA humano, en el que, por ejemplo, la agrupación de epítopos humana 3 se sustituye con la respectiva agrupación de epítopos murina; véase de forma ejemplar SEQ ID NO:1011), el dominio de unión es aún capaz de unión. Cuando más de una agrupación de epítopos en el ECD de BCMA humano se sustituye por la respectiva agrupación de epítopos murina, se prefiere que al menos una agrupación de epítopos en la quimera sea aún de ECD de BCMA humano, preferiblemente al menos una, dos, tres o cuatro agrupación(ones) de epítopos seleccionada(s) de agrupaciones de epítopos 1, 2, 3 y 4 sea(n) de ECD de BCMA humano.

Se prevé que las quimeras de BCMA humano/BCMA murino mencionadas anteriormente se expresen en células CHO. Se prevé además que al menos una de las quimeras BCMA humano/BCMA murino, por ejemplo, la quimera E1 murina/BCMA humano se condense con un dominio transmembrana y/o dominio citoplasmático de una proteína unida a membrana diferente tal como EpCAM; véase la Figura 2a.

Un método para probar la unión debido al intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano (p.ej., murino) se describe en los ejemplos anexos, en particular en los Ejemplos D1-3.

En un aspecto, se prefiere que el primer dominio de unión de la molécula de unión según la presente descripción no sea capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA murino que corresponde a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1008.

El término “no es capaz de unirse” significa que el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente descripción no se une a BCMA murino (SEq ID NO:1008), es decir, no muestra reactividad de más de 30%, preferiblemente más de 20%, más preferiblemente más de 10%, particularmente preferiblemente más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5%, preferiblemente bajo las condiciones aplicadas en los ejemplos anexos, con BCMA murino.

Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por consiguiente, se consigue la unión como un resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria además del resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción al antígeno con su antígeno específico puede dar por resultado una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción al antígeno con su antígeno específico puede alternativamente o adicionalmente dar por resultado el inicio de una señal, p.ej., debido la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

En un aspecto, el primer dominio de unión de la presente descripción es más capaz de unirse a BCMA de macaco (SEQ ID NO:1020 y 1021, respectivamente) tal como de Macaca mulatta o Macaca fascicularis. Se prevé además que el primer dominio de unión no se una a BCMA murino.

La afinidad del primer dominio de unión para BCMA humano es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, lo más preferiblemente <1 nM.

En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión de la presente descripción comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 seleccionado del grupo que consiste en:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:841, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:842, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:843, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:844, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:845 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:846;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:851, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:852, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:853, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:854, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:855 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:856;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:861, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:862, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:863, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:864, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:865 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:866;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:871, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:872, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:873, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:874, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:875 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:876;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:881, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:882, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:883, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:884, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:885 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:886;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:891, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:892, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:893, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:894, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:895 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:896;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:901, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:902, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:903, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:904, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:905 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:906;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:911, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:912, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:913, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:914, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:915 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:916;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:921, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:922, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:923, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:924, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:925 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:926;

(k) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:931, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:932, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:933, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:934, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:935 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:936;

(l) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:941, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:942, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:943, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:944, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:945 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:946; y

(m) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:951, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:952, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:953, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:954, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:955 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:956.

En aún otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO:847, SEQ ID NO:857, SEQ ID NO:867, SEQ ID NO:877,SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO:897, SEQ ID NO:907, SEQ ID NO:917, SEQ ID NO:927, SEQ ID NO:937, SEQ ID NO: 947 y SEQ ID NO:957.

En otra realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO:848, SEQ ID NO:858, SEQ ID NO:868, SEQ ID NO:878, SEQ ID NO:888, SEQ ID NO:908, SEQ ID NO:918, SEQ ID NO:928, SEQ ID NO:938, SEQ ID NO:948 y SEQ ID NO:958.

En una realización, el primer dominio de unión de la molécula de unión comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID

y una región VL como se representa en SEQ ID (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:857, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:858 (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:867, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:868 (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:877, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:878 (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:887, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:888 (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:897, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:898 (g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:907, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:908 (h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:917, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:918 (i) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:927, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:928 (k) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:937, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:938 (l) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:947, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:948 y

(m) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:957, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:958 En un ejemplo, el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:849, SEQ ID NO:859, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:879, SEQ ID NO:889, SEQ ID NO:899, SEQ ID NO:909, SEQ ID NO:919, SEQ ID NO:929, SEQ ID NO:939, SEQ ID NO:949 y SEQ ID NO:959.

El cuarto grupo de moléculas de unión de la presente descripción también se refiere a los siguientes puntos:

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a

(ii) Al menos uno de los dominios extracelulares quiméricos de BCMA seleccionado del grupo que consiste en dominios de BCMA que corresponden a las secuencias de aminoácidos como se representan en SEQ ID NO:1009, SEQ ID NO:1010, SEQ ID NO:1011, SEQ ID NO:1012, SEQ ID NO:1013, SEQ ID NO:1014 y SEQ ID NO:1015; y

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse al complejo receptor CD3 de células T.

2. La molécula de unión según el punto 1, en la que el primer dominio de unión es capaz además de unirse a BCMA de macaco.

3. La molécula de unión según el punto 1 o 2, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.

4. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse al CD3 humano y a CD3 de macaco.

5. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión no es capaz de unirse al dominio extracelular de BCMA murino que corresponde a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:1008.

6. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer y/o el segundo dominio de unión se derivan de un anticuerpo.

7. La molécula de unión según el punto 6, que se selecciona del grupo que consiste en (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpos y oligómeros de los mismos.

8. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas del grupo que consiste en:

9. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH como se representan en SEQ ID NO:847, SEQ ID NO:857, SEQ ID NO:867, SEQ ID NO:877, SEQ ID NO:887, SEQ ID NO:897, SEQ ID NO:907, SEQ ID NO:917, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO:937, SEQ ID NO:937, SEQ ID NO:947 y SEQ ID NO:957.

10. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL como se representa en SEQ ID NO:848, SEQ ID NO:858, SEQ ID NO:868, SEQ ID NO:878, SEQ ID NO:888, SEQ ID NO:898, SEQ ID NO:908, SEQ ID NO:918, SEQ ID NO:928, SEQ ID NO:938, SEQ ID NO:948 y SEQ ID NO:958.

11. La molécula de unión según cualquiera de los puntos anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:847, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:848; (b) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:857, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:858; (c) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:867, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:868; (d) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:877, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:878; (e) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:887, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:888; (f) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:897, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:898; (g) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:907, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:908; (h) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:917, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:918; (i) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:927, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:928; (k) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:937, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:938; (l) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:947, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:948;

y

(m) Una región VH como se representa en SEQ ID NO:957, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:958.

12. La molécula de unión según el punto 11, en la que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:849, SEQ ID NO:859, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:879, SEQ ID NO:889, SEQ ID NO:899, SEQ ID NO:909, SEQ ID NO:919, SEQ ID NO:929, SEQ ID NO:939, SEQ ID NO:949 y SEQ ID NO:959.

13. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 12.

14. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define en el punto 13.

15. Una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico como se define en el punto 13 o con el vector como se define en el punto 14.

16. Un proceso para la producción de una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 12, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped como se define en el punto 15 bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 12 y recuperar la molécula de unión producida a partir del cultivo.

17. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 12, o producida según el proceso del punto 16.

18. La molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 12, o producida según el proceso del punto 16 para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes.

19. Una molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 12, o producida según el proceso del punto 16 para usar en un método para el tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita la molécula de unión según cualquiera de los puntos 1 a 12, o producida según el proceso del punto 16.

20. La molécula de unión para el uso según el punto 19, en la que el trastorno de células plasmáticas se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmacitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmacitoma óseo solitario, plasmacitoma extramedular, mieloma osteosclerótico, enfermedades de la cadena pesada, gammopatía monoclonal de importancia indeterminada, y mieloma múltiple latente.

21. La molécula de unión para el uso según el punto 19, en la que la enfermedad autoinmune es lupus sistémico eritematoso.

22. Un kit que comprende una molécula de unión como se define en cualquiera de los puntos 1 a 12, una molécula de ácido nucleico como se define en el punto 13, un vector como se define en el punto 14 o una célula huésped como se define el punto 15.

La siguiente denominación de las figuras y ejemplos representa su correlación con uno de los grupos (A) a (D) de las moléculas de unión descritas anteriormente en la presente memoria. En otras palabras, las Figuras A [+número] y los Ejemplos A [+número] se refieren al grupo (A), las Figuras B [+número] y los Ejemplos B [+número] se refieren al grupo (B), las Figuras C [+número] y los Ejemplos C [+numero] se refieren al grupo (C), y las Figuras D [+número] y los Ejemplos D [+número] se refieren al grupo (D).

Las Figuras muestran:

Figura 1:

Alineamiento de la secuencia del dominio extracelular (ECD) de BCMA humano (residuos de aminoácidos 1 -54 de la proteína de longitud completa) y BCMA murino (residuos de aminoácidos 1-49 de la proteína de longitud completa). Se resaltan las regiones (dominios o residuos de aminoácidos) que se intercambiaron en los constructos quiméricos, como se designan para la agrupación de epítopos. Las cisteínas están representadas por cajas negras. Se indican los enlaces disulfuro.

Figura 2:

Mapeo de epítopos de los constructos de BCMA. BCMA humano y murino (figura 2a) además de siete constructos de BCMA humano-murino quiméricos (figura 2b) expresados en la superficie de células CHO como se muestra por citometría de flujo. La expresión de BCMA humano en CHO se detectó con un anticuerpo de BCMA anti-humano monoclonal. La expresión de BCMA murino se detectó con un anticuerpo de BCMA anti-murino monoclonal. El anticuerpo monoclonal unido se detectó con un anticuerpo específico de Fc-gamma de IgG anti-rata conjugado a ficoeritrina.

Figura A3:

Ejemplos de moléculas de unión específicas para las agrupaciones de epítopos E3 y E4, como se detectan en el mapeo de epítopos de los constructos de BCMA quimérico (véase el ejemplo A3). Algunas moléculas de unión son capaces adicionalmente de unirse al residuo de aminoácido arginina en la posición 39 (“E7”) del BCMA humano.

Figura B3:

Ejemplo de una molécula de unión específica para BCMA humano y murino (véase el ejemplo B3)

Figura C3:

Ejemplo de una molécula de unión específica para las agrupaciones de epítopos E1 y E4, como se detecta en el mapeo de epítopos de los constructos de BCMA quimérico (véase el ejemplo C3).

Figura D3:

Ejemplo de una molécula de unión que se une a BCMA humano, no presenta reactividad cruzada con BCMA murino y que se une adicionalmente a los diferentes constructos de BCMA quimérico, como se detecta en el mapeo de epítopos (véase el ejemplo D3).

Figura A4:

Determinación de constantes de unión de moléculas de unión biespecífica (anti BCMA x anti CD3) en BCMA humano y de macaco usando el sistema Biacore. El antígeno se inmovilizó en densidad de baja a intermedia (100 RU) en el chip CM5. Las diluciones de aglutinantes se hicieron flotar sobre la superficie del chip y se determinó la unión usando Software BiaEval. Las respectivas constantes de disociación y la constante de unión (KD) de los respectivos aglutinantes se representan debajo de cada gráfica.

Figura B4:

La funcionalidad y la resistencia de unión de moléculas scFv maduras de afinidad se analizaron en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA humano. Los resultados se representan como histogramas FACS de diluciones 1:3 en serie de extractos de células E. coli periplasmáticos, representando el log de intensidad de fluorescencia frente al número celular relativo.

Figura C4:

La funcionalidad y la resistencia de unión de moléculas scFv maduras de afinidad se analizaron en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA humano y BCMA de macaco. Los resultados se representan como histogramas de FACS de diluciones 1:3 en serie de extractos de células E. coli periplasmáticos, representando el log de intensidad de fluorescencia frente al número de células relativo.

Figura D4:

Determinación de constantes de unión de moléculas de unión biespecíficas (anti BCMA x anti CD3) en BCMA humano y de macaco usando el sistema Biacore. El antígeno se inmovilizó en densidad de baja a intermedia (100 RU) en un chip CM5. Las diluciones de aglutinantes se hicieron flotar sobre la superficie del chip y la unión se determinó usando Software BiaEval. Las respectivas constantes de disociación y la constante de unión (KD) de los aglutinantes respectivos se representan debajo de cada gráfico.

Figura A5:

Actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA como se mide en un ensayo de liberación de 51cromo de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA humano (figura izquierda) y células CHO transfectadas con BCMA de macaco (figura derecha). Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura D5:

Figura A6

Determinación de las constantes de unión de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 en BCMA humano y de macaco y en CD3 humano y de macaco usando el sistema Biacore. El antígeno se inmovilizó en densidad de baja a intermedia (100-200 RU) en un chip CM5. Las diluciones de anticuerpos biespecíficos se hicieron flotar sobre la superficie del chip y se determinó la unión usando Software BiaEval. Las respectivas constantes de asociación y disociación y la constante de unión resultante (KD) de los respectivos anticuerpos biespecíficos se representan debajo de cada gráfico.

Figura A7

Análisis FACS de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 en las líneas celulares indicadas: 1) células CHO transfectadas con BCMA humano, 2) línea de células T humanas CD3 positivo humano HBP-ALL, 3) células CHO transfectadas con BCMA de macaco, 4) línea de células T de macaco 4119 LnPx, 5) línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCI-H929 y 6) células CHO no transfectadas. Controles negativos [1) a 6)]: detección de anticuerpos sin anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 anterior.

Figura A8

El análisis de Scatchard de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en células que expresan BCMA. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de anticuerpo monomérico hasta la saturación. Los anticuerpos se detectaron por citometría de flujo. Los valores de medidas triplicadas se representaron como curvas hiperbólicas y como curvas sigmoides para demostrar un intervalo de concentración válido usado. Se determinó la unión máxima usando la evaluación de Scatchard, y se calcularon los respectivos valores KD.

Figura A9

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7, como se mide en un ensayo de liberación de cromo 51 de 18 horas frente a células CHO transfectadas con BCMA humano. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura A10

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC humanas no estimuladas. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA humano. Relación de efector a célula diana (E:T):10:1.

Figura A11

El análisis FACS de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 en células CHO transfectadas con BAFF-R y TACI. Líneas celulares: 1) células CHO transfectadas con BAFF-R humano, 2) células CHO transfectadas con TACI humano, 3) línea celular de mieloma múltiple L363; controles negativos: anticuerpos de detección sin anticuerpo biespecífico de BCMA/Cd3 anterior. Controles positivos: detección de BAFF-R: BAFF-R anti hu de cabra (R&D AF1162; 1:20) detectado por PE-anticuerpo anti-cabra (Jackson 705-116-147; 1:50) detección de TACI: anticuerpo anti TACI de conejo (abcam AB 79023; 1:100) detectado por PE anticuerpo anti-conejo de cabra (Sigma P9757; 1:20).

Figura A12

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 como se mide en un ensayo de liberación de cromo 51 de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363 (es decir expresador natural). Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura A13

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC humanas no estimuladas. Células diana: línea celular de mieloma múltiple humano L363 (expresador de BCMA natural). Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura A14

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC humanas no estimuladas. Células diana: línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCI-H929. Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura A15

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: línea de células T de macaco 4119LnPx. Células diana: células CHO transfectadas con BCMA de macaco. Relación de efector a célula diana (E:T): 10:1.

Figura A16:

La actividad antitumoral de un anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 en un modelo de xenoinjerto NCI-H929 en etapa avanzada (véase el Ejemplo A16).

Figura A17:

Ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando líneas celulares de mieloma múltiple humanas NCI-H929, L-363 y OPM-2 como células diana y PBMC humanas como células efectoras (48 h; E:T = 10:1). La figura representa los niveles de citoquina [pg/ml] que se determinaron para Il-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gamma a concentraciones crecientes de un anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 (véase el Ejemplo A22).

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran la invención. Estos ejemplos no deberían construirse para limitar el alcance de esta invención. Los ejemplos se incluyen con propósitos de ilustración, y la presente invención está limitada solo por las reivindicaciones.

Ejemplos A

Ejemplo A1

Generación de células CHO que expresan BCMA quimérico

Para la construcción de las moléculas de mapeo del epítopo quimérico, la secuencia de aminoácidos de los respectivos dominios del epítopo o el residuo de aminoácido sencillo de BCMA humano se cambió a la secuencia murina. Las siguientes moléculas se construyeron:

• ECD de BCM humano/E1 murino (SEQ ID NO:1009)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 1 (residuos de aminoácidos 1-7 de SEQ ID NO.1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 1 -4 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ supresión de los residuos de aminoácido 1-3 y mutación G6Q en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E2 murino (SEQ ID NO:1010)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 2 (residuos de aminoácidos 8-21 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 5-18 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ mutaciones S9F, Q10H y N11S en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E3 murino (SEQ ID NO:1011)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 3 (residuos de aminoácidos 24-41 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 21 -36 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ supresión de residuos de aminoácidos 31 y 32 y mutación Q25H, S30N, L35A y R39P en SEQ ID NO:1002 o 1007 • ECD de BCMA humano/E4 murino (SEQ ID NO:1012)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 4 (residuos de aminoácidos 42-54 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 37-49 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ mutaciones N42D, A43P, N47S, N53Y y A54T en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E5 murino (SEQ ID NO:1013)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácido en la posición 22 de SEQ ID NO:1002 o 1007 (isoleucina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de s Eq ID NO:1004 o 1008 (lisina, posición 19)

^ mutación I22K en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E6 murino (SEQ ID NO:1014)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácido en la posición 25 de SEQ ID NO:1002 o 1007 (glutamina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de s Eq ID NO:1004 o 1008 (histidina, posición 22)

^ mutación Q25H en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E7 murino (SEQ ID NO:1015)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácidos en la posición 39 de SEQ ID NO:1002 o 1007 (arginina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de SEQ ID NO:1004 o 1008 (prolina, posición 34)

^ mutación R39P en SEQ ID NO:1002 o 1007

A) Los constructos de ADNc se clonaron en el vector de expresión de mamífero pEF-DHFR y se transfectaron de forma estable en las células CHO. La expresión de BCMA humano en las células CHO se verificó en un ensayo FACS usando un anticuerpo de BCMA anti-humano monoclonal. La expresión de BCMA murino se demostró con un anticuerpo de BCMA anti-ratón monoclonal. La concentración usada de los anticuerpos de BCMA fue 10 Mg/ml en PBS/2% de FCS. Los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con un anti-rata-IgG-Fcy-PE (1:100 en PBS/2% de FCS; Jackson-Immuno-Research núm. 112-116-071). Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del primer anticuerpo. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (versión 7.6). La expresión superficial de las quimeras de BCMA humano-murino, células CHO transfectadas se analizaron y se confirmaron en un ensayo de citometría de flujo con diferentes anticuerpos anti-BCMA (Figura 2).

B) Para la generación de células CHO que expresan BCMA transmembrana humano, de macaco, de ratón y quimérico humano/ratón, las secuencias de codificación de BCMA humano, de macaco, de ratón y las quimeras de BCMA humano-ratón (secuencias BCMA como se publica en GenBank, números de acceso NM_001192 [humano]; NM_011608 [ratón] y XM_001106892 [macaco]) se obtuvieron por síntesis génica según los protocolos estándar. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos y la secuencia de codificación de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA respectivamente en caso de las quimeras con los respectivos dominios de epítopo de la secuencia humana intercambiada por la secuencia murina.

Excepto para los constructos de ECD de BCMA humano/E4 murino y BCMA humano la secuencia de codificación del dominio extracelular de las proteínas de BCMA estaba seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial seguido por el dominio intracelular de EpCAM humano (aminoácidos 226-314; la secuencia como se publica en el número de acceso de GenBank NM_002354).

Todas las secuencias de codificación estaban seguidas por un codón de parada. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron también para introducir sitios de restricción adecuados. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Todos los procedimientos mencionados anteriormente se realizaron según protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Para cada antígeno se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificados por secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica de los constructos. La expresión de proteínas eucarióticas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de hasta 20 nM de MTX.

Ejemplo A2

2.1 Expresión temporal en células HEK 293

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificadas por secuencia se usaron para la transfección y expresión de proteínas en el Sistema de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtuvieron los sobrenadantes que contenían las proteínas expresadas, las células se eliminaron por centrifugado y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C.

2.2 Expresión estable en las células CHO

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificadas por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica de los constructos. La expresión de proteínas eucarióticas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo aumentando concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM de MTX. Después de dos pasos de cultivo estacionario las células se cultivaron en botes rotatorios con medio de soja líquida HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Plurónico F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la cosecha. Las células se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20°C.

2.3 Purificación de proteína

La purificación de proteínas de BCMA solubles se realizó como sigue: se usaron Ákta® Explorer System (GE Healthcare) y Unicorn® Software para la cromatografía. Se realizó la cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se cargó con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. La columna se equilibró con tampón A (tampón de fosfato sódico 20 mM pH 7,2, NaCl 0,1 M) y el sobrenadante del cultivo celular (0,2 gm) filtrado se aplicó a la columna (10 ml) a un caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para eliminar la muestra no unida. La proteína de unión se eluyó usando un gradiente de dos etapas de tampón B (tampón de fosfato sódico 20 mM pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:

Etapa 1: tampón B al 10% en 6 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón B al 100% en 6 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 se acumularon para purificación adicional. Todos los compuestos químicos eran de grado de investigación y se compraron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

Se realizó cromatografía por filtración en gel en una columna de grado preparativo HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con Equi-tampón (citrato 10 mM, lisina-HCl 25 mM, pH 7,2 para proteínas expresadas en células HEK y PBS 7,4 para proteínas expresadas en células CHO). Las muestras de proteína eluida (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y electroinmunotransferencia para la detección. Las concentraciones de proteína se determinaron usando OD280 nm.

Las proteínas obtenidas por medio de la expresión temporal en células HEK 293 se usaron para inmunizaciones. Las proteínas obtenidas por medio de expresión estable en células CHO se usaron para la selección de aglutinantes y para la medida de la unión.

Ejemplo A3

Agrupación de epítopos de fragmentos de scFv murinos

Las células transfectadas con BCMA humano o murino, o con moléculas de BCMA quiméricas se tiñeron con extracto periplásmico no diluido, en bruto, que contenía scFv de unión a BCMA humano/macaco. Se detectaron scFv unidos con 1 pg/ml de un anticuerpo anti-FLAG (Sigma F1804) y un anticuerpo específico de Fc gamma anti-ratón marcado con R-PE (1:100; Dianova núm. 115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con 2% de FCS. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del extracto periplásmico. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (Versión 7.6).

Ejemplo A4

Obtención de formas recombinantes diferentes de BCMA humano y de macaco soluble

A) Las secuencias de codificación de BCMA humano y rhesus (como se publica en GenBank, números de acceso NM_001192 [humano], XM_001106892 [rhesus]) que codifican secuencias de albúmina humana, Fcy1 humano y albúmina murina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificial que codifican proteínas de fusión soluble de BCMA humano y de macaco respectivamente y albúmina humana, Fc de IgG1 humana y albúmina murina respectivamente además de proteínas solubles que comprende solo los dominios extracelulares de BCMA. Para generar los constructos para la expresión de las proteínas de BCMA humano y de macaco solubles, se obtuvieron fragmentos de ADNc por mutagénesis de PCR de los ADNc de BCMA de longitud completa descritos anteriormente y clonado molecular según los protocolos estándar.

Para las fusiones con albúmina humana, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y rhesus respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de albúmina sérica humana, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para las fusiones con IgG1 murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de la parte bisagra y Fc gamma de IgG1 humana, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de hexahistidina y un codón de parada.

Para las fusiones con albúmina murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de albúmina sérica murina, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para los constructos de dominio extracelular soluble, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1 -Gly1 -conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta FLAG, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Los fragmentos de ADNc se diseñaron también para introducir sitios de restricción en el comienzo y al final de los fragmentos. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’, se utilizaron en los siguientes procedimientos de clonado. Los fragmentos de ADNc se clonaron por medio de EcoRI y Sall en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al., Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Los procedimientos mencionados anteriormente se realizaron todos según los protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).

B) Las secuencias de codificación de BCMA humano y de macaco como se describen anteriormente y las secuencias de codificación de albúmina humana, Fcy1 humana, Fcy1 murina, FcY2a murina, albúmina murina, albúmina de rata, Fcy1 de rata y FcY2b de rata se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificiales que codifican proteínas de fusión solubles de BCMA humano y de macaco respectivamente y albúmina humana, Fc de IgG1 humana, Fc de IgG1 murina, Fc de IgG2a murina, albúmina murina, Fc de IgG1 de rata, IgG2b de rata y albúmina de rata respectivamente además de proteínas solubles que comprenden solo los dominios extracelulares de BCMA. Para generar los constructos para la expresión de las proteínas de BCMA humano y de macaco solubles se obtuvieron fragmentos de ADNc mediante mutagénesis por PCR de los ADNc de BCMA de longitud completa descritos anteriormente y clonado molecular según los protocolos estándar.

Para las fusiones con albúminas los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos y la secuencia de codificación de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguida en la estructura por la secuencia de codificación del dominio extracelular de la respectiva proteína de BCMA seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de la respectiva albúmina sérica, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para las fusiones con Fcs de IgG los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos y la secuencia de codificación de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguida en la estructura por la secuencia de codificación del dominio extracelular de la respectiva proteína de BCMA seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, excepto para el Fc de IgG1 humana donde se usó un Ser1-Gly1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de la parte de bisagra y Fc gamma de la respectiva IgG, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para los constructos del dominio extracelular soluble se diseñaron fragmentos de ADNc modificados para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos y la secuencia de codificación de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguida en la estructura por la secuencia de codificación del dominio extracelular de la respectiva proteína de BCMA seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para el clonado de los constructos se introdujeron sitios de restricción adecuados. Los fragmentos de ADNc se clonaron todos en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. 2001). Los procedimientos mencionados anteriormente se realizaron todos según protocolos estándar (Sambrook, 2001).

Los siguientes constructos se diseñaron para permitir el pegado y lavado (panning en inglés) dirigido en distintos epítopos. La secuencia de codificación de quimeras de BCMA murino-humano y quimeras de BCMA murino-macaco (secuencias de BCMA de ratón, humano y de macaco como se describen anteriormente) y secuencias de codificación de albúmina murina y Fcy1 murina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificiales que codifican proteínas de fusión solubles de quimeras de BCMA murino-humano y murino-macaco respectivamente y Fc de IgG1 murina y albúmina murina, respectivamente. Para generar los constructos para la expresión de las quimeras de BCMA murino-humano y murino-macaco solubles se obtuvieron fragmentos de ADNc de BCMA murino (aminoácidos 1-49) con los respectivos dominios de epítopos mutados a la secuencia humana y de macaco respectivamente por síntesis génica según los protocolos estándar. El clonado de constructos se realizó como se describe anteriormente y según los protocolos estándar (Sambrook, 2001).

Se construyeron las siguientes moléculas:

• Fc de IgG 1 murino, aminoácidos 1-4 humanos

• albúmina murina, aminoácidos 1-4 humanos

• Fc de IgG 1 murina, aminoácidos 1-4 rhesus

albúmina murina, aminoácidos 1-4 rhesus

Fc de IgG1 murina, aminoácidos 5-18 humanos

albúmina murina, aminoácidos 5-18 humanos

Fc de IgG1 murina, aminoácidos 5-18 rhesus

albúmina murina, aminoácidos 5-18 rhesus

Fc de IgG1 murina, aminoácidos 37-49 humanos

albúmina murina, aminoácidos 37-49 humanos

Fc de IgG1 murina, aminoácidos 37-49 rhesus

albúmina murina, aminoácidos 37-49 rhesus

Ejemplo A5

5.1 Determinación basada en Biacore de la afinidad de anticuerpo biespecífico de BCMA y CD3 humano y de macaco

Se realizaron experimentos por análisis Biacore usando proteínas de fusión de BCMA recombinante con albúmina sérica humana (ALB) para determinar la unión a la diana BCMA. Para las medidas de afinidad de CD3, se usaron proteínas de fusión recombinante que tenían los 27 aminoácidos N-terminales del CD3 épsilon (CD3e) condensado con la parte Fc de anticuerpo humano. Esta proteína recombinante existe en una versión CD3e1 -27 humana y en una versión CD3e cynomolgus, ambas portando el epítopo del aglutinante CD3 en los anticuerpos biespecíficos.

En detalle, los Chips Sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizaron con aproximadamente 100 a 150 RU del respectivo antígeno recombinante usando tampón acetato pH 4,5 según el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecífico se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de migración HBS-EP (GE Healthcare). El caudal fue 30 a 35 ^l/min durante 3 min, después se aplicó tampón de migración HBS-EP durante 8 min de nuevo a un caudal de 30 a 35 ^l/ml. La regeneración del chip se realizó usando glicina 10 mM NaCl 0,5 M pH 2,45. Se analizaron los conjuntos de datos usando el Software BiaEval (véase la Figura A4). En general se realizaron dos experimentos independientes.

5.2 Afinidad de unión a BCMA humano y de macaco

Las afinidades de unión de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 a BCMA humano y de macaco se determinaron por análisis Biacore usando proteínas de fusión de BCMA recombinante con albúmina (ALB) de ratón.

En detalle, los Chips Sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizaron con aproximadamente 150 a 200 RU del respectivo antígeno recombinante usando tampón acetato pH 4,5 según el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecífico se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de migración HBS-EP (GE Healthcare). Para las determinaciones de afinidad a BCMA el caudal fue 35 ^l/min durante 3 min, después se aplicó tampón de migración HBS-EP durante 10, 30 o 60 min de nuevo a un caudal de 35 |jl/ml. La regeneración del chip se realizó usando un tampón que consistía en una mezcla 1:1 de glicina 10 mM NaCl 0,5 M pH 1,5 y disolución de cloruro de guanidina 6 M. Se analizaron los conjuntos de datos usando Software BiaEval (véase la Figura A6). En general se realizaron dos experimentos independientes.

Se realizó una unión de confirmación a CD3 épsilon humano y de macaco en experimentos únicos usando las mismas concentraciones que se aplicaron para la unión a BCMA; la determinación de la constante de disociación se hizo para un tiempo de disociación de 10 min.

Todos los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 según la invención, es decir aquellos de la agrupación de epítopos “E3/E4±E7”, mostraron altas afinidades con BCMA humano en el intervalo sub-nanomolar. La unión a BCMA de macaco estaba equilibrada, mostrando también afinidades en el intervalo sub-nanomolar. Las afinidades y los intervalos de afinidad de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Afinidades de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 a BCMA humano y de macaco como se determinaron por análisis Biacore, e intervalos de afinidad calculados (ma BCMA: hu BCMA).

5.3 Determinación basada en Biacore de la afinidad del anticuerpo biespecífico a BCMA humano y de macaco

Las afinidades de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 a BCMA soluble recombinante en chips CM5 en medidas Biacore se repitieron para reconfirmar las KDs y especialmente las constantes de disociación usando periodos de disociación más largos (60 min en vez de 10 min como se usó en el experimento anterior). Todos los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 probados se sometieron a dos medidas de afinidad independientes con cinco concentraciones diferentes cada una.

Las afinidades de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 fueron claramente sub-nanomolares, véanse los ejemplos en la Tabla 3.

Tabla 3: Afinidades (KD) de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 a partir de experimentos Biacore usando tiempos de disociación extendidos (dos experimentos independientes cada uno).

Ejemplo A6

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies

Para la confirmación de la unión a BCMA y CD3 humano y de macaco, los anticuerpos biespecíficos se probaron por citometría de flujo usando células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco, respectivamente, la línea celular de mieloma múltiple humano NCI-H929 que expresa BCMA humano nativo, línea celular de leucemia de células T humana que expresa CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de células T de macaco que expresa CD3 4119LnPx (Knappe A, et al., Blood, 2000, 95, 3256-3261). Además, se usaron células CHO no transfectadas como control negativo.

Para la citometría de flujo se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 gl de anticuerpo biespecífico purificado a una concentración de 5 gg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 gl de PBS/2% de FCS). Después de lavar, los anticuerpos PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 tiñeron las células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco, la línea celular de mieloma múltiple que expresa BCMA humano NCI H929 además de las células T humanas y de macaco. Además, no hubo tinción de células CHO no transfectadas (véase la Figura A7).

Ejemplo 7

Determinación basada en Scatchard de la afinidad de anticuerpos biespecíficos a BCMA humano y de macaco

Para el análisis Scatchard, se realizaron experimentos de unión por saturación usando un sistema de detección monovalente desarrollado en Micromet (Anti-His Fab/Alexa 488) para determinar de forma precisa la unión monovalente de los anticuerpos biespecíficos a la respectiva línea celular.

Se incuban 2 x 104 células de la respectiva línea celular (línea de células CHO que expresa BCMA humano de forma recombinante, línea de células CHO que expresa BCMA de macaco de forma recombinante) cada una con 50 |ul de una serie de diluciones en grupos de tres (ocho diluciones a 1:2) del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA empezando a 100 nM seguido por 16 h de incubación a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Después, las células se incuban durante 30 min más con 30 |ul de una disolución de Anti-His Fab/Alexa 488 (Micromet; 30 |ug/ml). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 150 |ul de tampón FACS que contiene 3,5% de formaldehído, se incuban durante 15 min más, se centrifugan, se resuspenden en tampón FACS y se analizan usando una máquina FACS Cantoll y Software FACS Diva. Los datos se generan a partir de dos conjuntos independientes de experimentos. Los valores se representan como curvas de unión en hipérbole. El respectivo análisis Scatchard se calcula para extrapolar la unión máxima (Bmax). Se determinan las concentraciones de anticuerpos biespecíficos a la mitad de la unión máxima reflejando las respectivas KDs. Los valores de medidas triplicadas se representan como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina usando la evaluación de Scatchard y se calculan las respectivas KDs.

Las afinidades de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 a células CHO transfectadas con BCMA humano o de macaco se determinaron por análisis de Scatchard como el método más fiable para medir los intervalos de afinidad potencial entre BCMA humano y de macaco.

Se incubaron células que expresan el antígeno de BCMA con concentraciones crecientes del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 monomérico hasta que se alcanzó la saturación (16 h). El anticuerpo biespecífico unido se detectó por citometría de flujo. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 a la mitad de la unión máxima reflejando las respectivas KDs.

Los valores de medidas triplicadas se representaron como curvas hiperbólicas y como curvas con forma de S para demostrar intervalos de concentración apropiados desde la unión mínima a la óptima. La unión máxima (Bmax) se determinó (Figura A8) usando la evaluación de Scatchard y las respectiva KDs se calcularon. Los valores representados en la Tabla 4 se derivaron a partir de dos experimentos independientes por anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3.

El análisis de Scatchard basado en células confirmó que los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 son sub-nanomolares en la afinidad a BCMA humano y están presentes con un pequeño intervalo de afinidad a BCMA entre especies de 1,9-2,9.

Se identificó otro grupo de anticuerpos durante la agrupación de epítopos (véanse los Ejemplos A1 y A2), que es capaz de unirse a las agrupaciones de epítopos 1 y 4 de BCMA (“E1/E4”). La agrupación de epítopos 1 es MLQMAGQ (SEQ ID NO:1018) y la agrupación de epítopos 4 es NASVTNSVKGTNA (SEQ ID NO:1019). En contraste con los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7, los anticuerpos de la agrupación de epítopos “E1/E4” muestran un mayor intervalo de afinidad entre BCMA humano y de macaco de 3,9-4,5.

Tabla 4: Afinidades (KD) de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 a partir del análisis de Scatchard basado en células (dos experimentos independientes cada uno) con el intervalo de afinidad calculado KD de BCMA de macaco/KD de BCMA humano.

Ejemplo A8

Actividad citotóxica

8.1 Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas.

Se obtuvieron células T estimuladas enriquecidas por células T CD8+ como sigue: una placa de petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-ones GmbH, Kremsmünster) se recubrió con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 gg/ml durante 1 hora a 372C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3-5x107 PBMC humanas a la placa de petri prerecubierta en 120 ml de Rp Mi 1640 con glutamina estabilizada/10% de FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) se enriquecieron por supresión de células T CD4+ y células NK CD56+ usando Dynal-Beads según el protocolo del fabricante.

Las células diana CHO transfectadas con BCMA humano o de macaco (células diana positivas para BCMA) se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 51Cr de 11,1 MBq en un volumen final de 100 gl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 gl de RPMI suplementado con una relación E:T de 10:1. Una concentración de partida de 0,01-1 gg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y disoluciones umbral del mismo se usaron. El tiempo de incubación para el ensayo fue 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante respecto a la diferencia de la lisis máxima (adición de Tritón-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadruplicado. La medida de actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3’’ (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidales se usaron para la comparación de actividad citotóxica (véase la Figura A5).

8.2 Potencia de redireccionamiento de células T efectoras humanas estimuladas frente a células CHO transfectadas con BCMA humano

Se analizó la actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo A8.1.

Todos los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 mostraron potente actividad citotóxica frente a células CHO transfectadas con BMCA humano con valores CE50 en un intervalo entre 1 dígito de pg/ml y 2 dígitos bajos de pg/ml (Figura A9 y Tabla 5). Por lo tanto la agrupación de epítopos E3/E4±E7 se presenta con una relación de actividad al epítopo muy favorable que soporta una actividad citotóxica mediada por el anticuerpo biespecífico muy potente.

Tabla 5: Valores CE50 [pg/ml] de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 analizados en un ensayo de citotoxicidad por liberación de cromo 51 (51Cr) usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras.

8.3 ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas

Aislamiento de las células efectoras

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se prepararon por centrifugado de gradiente de densidad de Ficoll a partir preparados de linfocitos enriquecidos (capas leuco-plaquetarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para trasfusiones. Las capas leuco-plaquetarias se suministraron por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon en el mismo día de la recogida de sangre. Después del centrifugado de densidad de Ficoll y lavados exhaustivos con PBS de Dulbecco (Gibco), se eliminaron los eritrocitos que quedaban de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 |uM). Las plaquetas se eliminaron por medio del sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos que quedan principalmente incluyen linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/CO2 al 5% en medo RPMI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Supresión de células de CD14+ y CD56+

Para la supresión de células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS, núm. 130-050 201), para la supresión de células NK microperlas de CD56 humano (MACS, núm. 130-050-401). Se contaron las PBMC y se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó y el gránulo de células se resuspendió en tampón de aislamiento MACS [80 |ul/107 células; PBS (Invitrogen, núm. 20012-043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, núm.10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, núm. E-6511)]. Se añadieron Microperlas de CD14 y Microperlas de CD56 (20 |ul/107 células) y se incubaron durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1-2 ml/107 células). Después del centrifugado (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en tampón de aislamiento MACS (500 |ul/108 células). Las células CE14/CD56 negativas se aislaron entonces usando Columnas LS (Miltenyi Biotec, núm. 130-042-401). PBMC sin células CD14+/CD56+ se cultivaron en medio completo de r Pm I es decir RPMI1640 (Biochrom AG, núm. FG1215) suplementado con FBS al 10% (Biochrom AG, núm. S0115), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, núm. K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, núm. L1613), piruvato sódico 1 mM (Biochrom AG, núm. L0473) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, núm. A2213) a 37°C en una incubadora hasta que se necesitara.

Marcado de célula diana

Para el análisis de la lisis celular en ensayos de citometría de flujo, el tinte de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, núm. V22886) se usó para marcar las células CHO transfectadas con BCMA humano o BCMA de macaco como células diana (células diana positivas para BCMA humano/de macaco) y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se cosecharon, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/ml en PBS que contenía 2% de FBS (v/v) y el tinte de membrana DiO (5 |ul/106 células). Después de la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó usando disolución EosinG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, núm.

45380).

Análisis basada en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectado con BCMA de macaco o humano (o células diana positivas para BCMA) en presencia de diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3. Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando por resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 |ul de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 |ul de diluciones en serie de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 y un anticuerpo biespecífico de control negativo (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo de RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 continuó durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%. Después las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos, y se monitorizó la pérdida de integridad de la membrana de la célula diana añadiendo yoduro de propidio (PI, en inglés) a una concentración final de 1 |ug/ml. PI es un tinte impermeable de membrana que normalmente se excluye de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Las células diana se identificaron como células positivas para DiO. Las células diana negativas a PI se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la siguiente fórmula:

Citotoxicidad [%] = n (células diana muertas) x 100 / n (células diana)

n = número de sucesos

Usando el software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), el porcentaje de citotoxicidad se representó frente a las correspondientes concentraciones de anticuerpo biespecífico. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de curvas de respuesta a la dosis sigmoides con pendiente fija y se calcularon los valores CE50.

8.4 PBMC humanas no estimuladas frente a células diana transfectadas con BCMA humano

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana, y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se realizó como se describe anteriormente (Ejemplo A8.3).

Los resultados de los ensayos de citotoxicidad basados en FACS con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA humano como dianas se muestran en la Figura A10 y la Tabla 6. Tabla 6: valores CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana.

Ejemplo A9

9.1 Exclusión de reactividad cruzada con el receptor de BAFF

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con 2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con 2% de FCS). Después de lavar, los anticuerpos PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con 2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Se mostró que los aglutinantes biespecíficos no tenían reactividad cruzada con el receptor de BAFF.

9.2 Exclusión de reactividad cruzada de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 con el receptor de BAFF humano (BAFF-R) y TACI

Para la exclusión de la unión a BAFF-R humano y TACI, se probaron los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 mediante citometría de flujo usando células CHO transfectadas con BAFF-R humano y TACI, respectivamente. Además, se usaron células de mieloma múltiple L363 como control positivo para la unión a BCMA humano. La expresión del antígeno de BAFF-R y TACI en células CHO se confirmó mediante dos anticuerpos de control positivo. La citometría de flujo se realizó como se describe en el ejemplo anterior.

El análisis citométrico de flujo confirmó que ninguno de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 tiene reacción cruzada con BAFF-R humano o TACI humano (véase Figura A11).

Ejemplo A10

Actividad citotóxica

La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA tipo humano en la redirección de las células T efectoras frente a células diana que expresan BCMA se analiza en cinco ensayos de citotoxicidad in vitro adicionales:

1. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T efectoras humanas estimuladas frente a una línea celular de tumor (humano) positiva para BCMA se mide en un ensayo de liberación de cromo 51.

2. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a células CHO transfectadas con BCMA humano se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

3. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a línea celular tumoral (humana) positiva para BCMA se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

4. Para la confirmación de que los anticuerpos biespecíficos de BCMA que tienen reacción cruzada son capaces de redireccionar células T de macaco frente a células CHO transfectadas con BCMA de macaco, se realiza un ensayo de citotoxicidad basado en FACS con una línea de células T de macaco como células T efectoras.

5. El intervalo de potencia entre las formas monomérica y dimérica de los anticuerpos biespecíficos de BCMA se determina en un ensayo de liberación de cromo 51 usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana y células T humanas estimuladas como células efectoras.

Ejemplo A11

Células T humanas estimuladas frente a la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) usando la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363 (DSMZ núm. ACC49) como fuente de células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras. El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo A8.1.

De acuerdo con los resultados de los ensayos de liberación de cromo 51 con linfocitos T CD8 humanos enriquecidos estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA como dianas, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 son potentes en la actividad citotóxica (Figura A12 y Tabla 7).

Inesperadamente, sin embargo, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E1/E4 -aunque potentes en la actividad citotóxica frente a células CHO transfectadas con BCMA humano - probaron que era más bien débilmente citotóxica frente a la línea celular de mieloma múltiple humano L363 que expresa BCMA nativo a baja densidad en la superficie celular (Figura A12 y Tabla 7). Sin desear estar atados por la teoría, los inventores creen que el epítopo E1/E4 de BCMA humano podría ser menos bien accesibles en los expresadores de BCMA naturales que en células transfectadas con BCMA.

Tabla 7: Valores CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de las agrupaciones de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3/E4±E7 (filas 3 y 4) de/durante 8 horas, analizadas en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) con la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363 como fuente de células diana, y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como células efectoras.

Ejemplo A12

PBMC humanas no estimuladas frente a la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363

Se analizó además la actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA L363 (DSMZ, ACC49) -que muestra la expresión superficial más débil de BCMA nativo de todas las líneas de células T diana probadas -como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se realizó como se describe anteriormente (Ejemplo A8.3).

Como se observa en el ensayo de liberación de cromo 51 con linfocitos T CD8 humanos enriquecidos estimulados frente a la línea celular de mieloma múltiple humano L363, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E1/E4 - en contraste a su potente actividad citotóxica frente a células CHO transfectadas con BCMA humano - probó que eran de nuevo menos potentes en la redirección de la actividad citotóxica de PBMC no estimuladas frente a la línea celular de mieloma múltiple humano L363 que expresa BCMA nativo a baja densidad en la superficie celular. Esto está en línea con la teoría proporcionada anteriormente, es decir, el epítopo E1/E4 de BCMA humano puede ser menos bien accesible en los expresadores de BCMA naturales que en las células transfectadas con BCMA. Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 se presentaron con valores CE50 en pg/ml de 3 dígitos en este ensayo (véase la Figura A13 y la Tabla 8).

Tabla 8: Valores CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de agrupaciones de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3/E4±E7 (filas 3 y 4) como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y la línea celular de mieloma múltiple humano L363 como fuente de células diana.

De forma esperada, los valores de CE50 fueron mayores en ensayos de citotoxicidad con PBMC no estimuladas como células efectoras que en ensayos de citotoxicidad que usaban células T CD8 humanas estimuladas enriquecidas.

Ejemplo A13

PBMC humanas no estimuladas frente a la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCI-H929

La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCI-H922 (ATCC CRL-9068) como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se realizó como se describe anteriormente (Ejemplo A8.3).

Los resultados de este ensayo con otra línea celular de mieloma múltiple humano (es decir NCl-H929) que expresa BCMA nativo en la superficie celular confirman los obtenidos con línea celular de mieloma múltiple humano L363. De nuevo, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E1/E4 - en contraste con su potente actividad citotóxica frente a células CHO transfectadas con BCMA humano - probaron que eran menos potentes en la redirección de la actividad citotóxica de PBMC no estimuladas frente a células de mieloma múltiple humano confirmando la teoría de que el epítopo E1/E4 de BCMA humano puede ser menos accesible en expresadores de BCMA natural que en las células transfectadas con BCMA. Dicho intervalo de actividad entre células diana transfectadas con BCMA y expresadores naturales como se ve para los aglutinantes E1/E4 no se encontró para los aglutinantes E3/E4±E7. Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 se presentaron con valores de CE50 en pg/ml de 2 dígitos y por lo tanto redirigieron a las PBMC no estimuladas contra las células diana NCI-H929 con valores de CE50 sorprendentemente buenos (véase la Figura A14 y la Tabla 9).

Tabla 9: Valores de CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de agrupaciones de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3/E4±E7 (filas 3 y 4) como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y la línea celular de mieloma múltiple humano NCI-H929 como fuente de células diana.

Como se esperaba, los valores de CE50 fueron menores con la línea celular de mieloma múltiple humano NCI-H929, que expresa niveles mayores de BCMA en la superficie celular en comparación con L363.

Ejemplo A14

Células T de macaco frente a células diana que expresan BCMA de macaco

Finalmente, la actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA de macaco como células diana, y una línea de células T de macaco como fuente de células efectoras.

La línea de células T de macaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) se usó como fuente de células efectoras. El marcaje de células diana de células CHO transfectadas con BCMA de macaco y el análisis basado en citometría de flujo de la actividad citotóxica se realizó como se describe anteriormente.

Las células T de macaco de la línea celular 4119LnPx se indujeron para matar de forma eficiente a las células CHO transfectadas con BCMA de macaco mediante anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7. Los anticuerpos se presentaron de forma muy potente con valores de CE50 en pg/ml de 1 dígito en este ensayo, confirmando que estos anticuerpos son muy activos en el sistema del macaco. Por otro lado, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E1/E4 mostraron una potencia significativamente más débil con valores de CE50 en el intervalo de pg/ml de 2 dígitos a 3 dígitos (véase la Figura A15 y la Tabla 10). Los anticuerpos específicos de E3/E4±E7 son por tanto aproximadamente 20 a más de 100 veces más potentes en el sistema de macaco.

Tabla 10: Valores de CE50 [pg/ml] de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de agrupaciones de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3/E4±E7 (filas 3 y 4) como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con la línea de células T de macaco 4119LnPx como células efectoras y células CHO transfectadas con BCMA de macaco como células diana.

Ejemplo A15

Intervalo de potencia entre monómero y dímero de anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3

Para determinar la diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 individuales (denominada como intervalo de potencia), se realizó un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 como se describe anteriormente (Ejemplo A8.1) con monómero y dímero de anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 purificado. El intervalo de potencia se calculó como la relación entre los valores CE50 del monómero y el dímero del anticuerpo biespecífico. Los intervalos de potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 probados de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 estuvieron entre 0,2 y 1,2. No es por tanto el dímero sustancialmente más activo en comparación con su respectivo monómero.

Ejemplo A16

Conversión de monómero a dímero después de tres ciclos de congelación/descongelación

El monómero de anticuerpo de BCMA/CD3 biespecífico se sometió a tres ciclos de congelación/descongelación seguido por SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en dímero de anticuerpo.

Se ajustaron 15 pg de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 pg/ml con tampón genérico y después se congelaron a -80°C durante 30 min seguido por descongelación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de tres ciclos de congelación/descongelación el contenido de dímero se determinó por HP-SEC. Para este fin, se descongelaron alícuotas de 15 pg de las isoformas monoméricas de los anticuerpos y se ecualizaron a una concentración de 250 pg/ml en el tampón SEC original (ácido cítrico 10 mM - HCl de lisina 75 mM - trehalosa al 4% -pH 7,2) seguido por incubación a 37°C durante 7 días. Una columna SEC de alta resolución TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Tokio - Japón) se conectó a un Purificador Ákta 10 FPLC (GE Lifesciences) equipado con un Automuestreador A905. El equilibrado de la columna y el tampón de migración consistió en KH2PO4 100 mM - Na2SO4 200 mM ajustado a pH 6,6. Después de 7 días de incubación, la disolución de anticuerpo (15 pg de proteína) se aplicó a la columna equilibrada y la elución se realizó a un caudal de 0,75 ml/min a una presión máxima de 7 MPa. El proceso total se monitorizó a 280, 254 y 210 nm de absorbancia óptica. El análisis se hizo por integración de picos de la señal de 210 nm grabado en la hoja de evaluación del proceso del software Ákta Unicorn. El contenido de dímero se calculó dividiendo el área del pico dímero por el área total del pico de monómero más dímero.

Los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 se presentaron con porcentajes de dímero de 0,8 a 1,5% después de tres ciclos de congelación/descongelación, que se considera bueno. Sin embargo, las tasas de conversión de dímero de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E1/E4 alcanzaron valores desfavorablemente altos, excediendo el umbral a valores de dímero desventajosos de >2,5% (4,7% y 3,8%, respectivamente), véase la Tabla 11.

Tabla 11: Porcentaje de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 monoméricos frente a diméricos de agrupaciones de epítopos E1/E4 (filas 1 y 2) y E3/E4±E7 (filas 3 y 4) después de tres ciclos de congelación/descongelación como se determina por Cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HP-SEC).

Ejemplo A17

Termoestabilidad

Las curvas de temperatura de fusión se determinaron por calorimetría de barrido diferencial (DSC) para determinar estabilidades de proteína biofísica intrínseca de los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3. Estos experimentos se realizaron usando un dispositivo VP-DSC MicroCal LLC (Northampton, MA, EE.UU.). La absorción de energía de una muestra que contenía anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 se grabó de 20 a 90°C en comparación a una muestra que solo contenía el tampón de formulación del anticuerpo.

En detalle, los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 se ajustaron a una concentración final de 250 pg/ml en el tampón de almacenamiento. Se transfirieron 300 pl de las disoluciones de proteína preparadas en una placa de pocillo y se puso en la posición del bastidor del automuestreador enfriado del dispositivo DSC. Se llenaron pocillos adicionales con el tampón de migración de SEC como material de referencia para la medida. Para el proceso de medida la disolución de proteína se transfirió mediante el automuestreador a un capilar. Un capilar adicional se llenó con el tampón de migración de SEC como referencia. El calentamiento y la grabación de energía de calentamiento necesaria para calentar ambos capilares a igual temperatura que oscilaba de 20 a 90°C se hizo para todas las muestras.

Para la grabación de la respectiva curva de fusión, la temperatura de la muestra total se aumentó en pasos. A cada temperatura T se grabó la referencia de absorción de energía de la muestra y el tampón de formulación. La diferencia en la absorción de energía Cp (Kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia se representó frente a la respectiva temperatura. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de absorción de energía.

Todos los anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 probados de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 mostraron termoestabilidad favorable con temperaturas de fusión por encima de 60°C, de forma más precisa entre 62°C y 63°C.

Ejemplo A18

Exclusión de interferencia en plasma por citometría de flujo

Para determinar la interacción potencial de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 con proteínas plasmáticas humanas, se estableció una prueba de interferencia en plasma. Para este fin, se incubaron 10 pg/ml de los respectivos anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 durante una hora a 37°C en plasma humano al 90%. Posteriormente, la unión a células CHO que expresan BCMA humano se determinó por citometría de flujo.

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de anticuerpo purificado a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS/2% de FCS). Después de lavar, los anticuerpos de PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS/2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Los datos obtenidos se compararon con un ensayo de control usando PBS en vez de plasma humano. La unión relativa se calculó como sigue:

(señal de la muestra de PBS/señal sin agente de detección)/(señal de muestra de plasma/señal sin agente de detección)

En este experimento se volvió obvio que no había reducción significativa de unión a diana de los respectivos anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 mediada por las proteínas plasmáticas. El valor de interferencia en plasma relativo estuvo entre 1,28 ± 0,38 y 1,29 ± 0,31 (considerándose un valor de “2” como el umbral inferior para las señales de interferencia).

Ejemplo A19

Eficacia terapéutica de anticuerpos biespecíficos de BCMA/CD3 en modelos de xenoinjerto en tumor humano En el día 1 del estudio, 5x106 células de la línea celular de cáncer humano NCI-H929 se inyectaron de forma subcutánea en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID hembra.

En el día 9, cuando el volumen medio del tumor había alcanzado aproximadamente 100 mm3, se trasplantaron células T CD3+ humanas expandidas in vitro en los ratones por inyección de aproximadamente 2x107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 (n=5) no recibieron células efectoras y se usaron como un control no trasplantado para la comparación con el grupo de control de vehículo 2 (n=10 que reciben células efectoras) para monitorizar el impacto de células T solas en el crecimiento tumoral.

El tratamiento de anticuerpo comenzó en el día 13, cuando el volumen medio del tumor había alcanzado aproximadamente 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada grupo de tratamiento en el día del comienzo del tratamiento no era estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de la varianza). Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg/día del anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 BCMA-50 x CD3 (grupo 3, n=8) mediante inyección de bolo intravenoso durante 17 días.

Los tumores se midieron mediante un calibrador durante el estudio y el progreso se evaluó por comparación entre grupos de volúmenes tumorales (VT). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determinó calculando VT como % de T/C = 100 x (VT medio del grupo analizado)/(VT medio del grupo de control 2). Los resultados se muestran en la Tabla 12 y la Figura 16.

Tabla 12: volumen tumoral medio (VT) e inhibición del crecimiento tumoral (T/C) en los días 13 a 30

Ejemplo A20

Exclusión de lisis de células negativas diana

Un ensayo de lisis in vitro se realizó usando la línea celular de mieloma múltiple humano positiva para BCMA NCl-H929 y células T purificadas a una relación de efector a célula diana de 5:1 y con un tiempo de incubación de 24 horas. El anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 de la agrupación del epítopos E3/E4±E7 (BCMA-50) mostró alta potencia y eficacia en la lisis de NCI-H929. Sin embargo, no se detectó lisis en las líneas celulares negativas para BCMA HL60 (AML/ morfología de mieloblasto), MES-SA (sarcoma de útero, morfología de fibroblasto), y SNU-16 (carcinoma de estómago, morfología epitelial) para hasta 500 nM del anticuerpo.

Ejemplo A21

Inducción de la activación de células T de diferentes subconjuntos de PBMC

Un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (48 h; E:T = 10:1) se realizó usando líneas celulares de mieloma múltiple humano NCI-H929, L-363 y OPM-2 como células diana y diferentes subconjuntos de PBMC humanas (CD4+/CD8+/CD25+/CD69+) como células efectoras. Los resultados (véase la Tabla 13) muestran que el grado de activación, como se mide por el valor CE50, está esencialmente en el mismo intervalo para los diferentes subconjuntos de PBMC analizados.

Tabla 13: valores de CE50 [ng/ml] del anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 BCMA-50 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 como se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con diferentes subconjuntos de PBMC humanas como células efectoras y diferentes líneas celulares de mieloma múltiple humano como células diana.

Ejemplo A22

Inducción de la liberación de citoquina

Un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (48 H; E:T = 10:1) se realizó usando líneas celulares de mieloma múltiple humano NCI-H929, L-363 y OPM-2 como células diana y PBMC humanas como células efectoras. Los niveles de liberación de citoquina [pg/ml] se determinaron a concentraciones crecientes de un anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7. Las siguientes citoquinas se analizaron: II-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y la Figura 17.

Tabla 14: Liberación de IL-2, IL-6, IL-10, TNF e IFN-gamma [pg/ml] inducida por 2,5 pg/ml de un anticuerpo biespecífico de BCMA/CD3 de la agrupación de epítopos E3/E4±E7 (BCMA-50) en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con PBMC humanas como células efectoras y diferentes líneas celulares de mieloma múltiple humano como las células diana (E:T = 10:1).

Ejemplos B

Ejemplo B1

Generación de células CHO que expresan BCMA quimérico

Para la construcción de las moléculas de mapeo del epítopo quimérico, la secuencia de aminoácidos de los respectivos dominios de epítopos o el residuo de aminoácido individual de BCMA humano se cambió a la secuencia murina. Las siguientes moléculas se construyeron:

• ECD de BCMA humano/E1 murino (SEQ ID NO:1009)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 1 (residuos de aminoácidos 1-7 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 1 -4 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ supresión de residuos de aminoácidos 1 -3 y mutación G6Q en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E2 murino (SEQ ID NO:1010)

Dominio BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 2 (residuos de aminoácidos 8-21 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 5-18 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ mutaciones S9F, Q10H y N11S en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E3 murino (SEQ ID NO:1011)

Dominio BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que la agrupación de epítopos 3 (residuos de aminoácidos 24-41 de SEQ ID NO:1002 o 1007) se sustituye por la respectiva agrupación murina (residuos de aminoácidos 21-36 de SEQ ID NO:1004 o 1008)

^ supresión de residuos de aminoácidos 31 y 32 y mutación Q25H, S30N, L35A y R39P en la SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E4 murino (SEQ ID NO:1012)

^ mutaciones N42D, A43P, N47S, N53Y y A54T en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E5 murino (SEQ ID NO:1013)

^ mutación I22K en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E6 murino (SEQ ID NO:1014)

^ mutación Q25H en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E7 murino (SEQ ID NO:1015)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácido en la posición 39 de SEQ ID NO:1002 o 1007 (arginina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de SEQ ID NO:1004 o 1008 (prolina, posición 34)

^ mutación R39P en la SEQ ID NO:1002 o 1007

Los constructos de ADNc se clonaron en el vector de expresión de mamífero pEF-DHFR y se transfectaron de forma estable en células CHO. La expresión de BCMA humano en células CHO se verificó en un ensayo FACS usando un anticuerpo de BCMA anti-humano monoclonal. La expresión de BCMA murino se demostró con un anticuerpo de BCMA anti-ratón monoclonal. La concentración usada de los anticuerpos de BCMA fue 10 Mg/ml en PBS/2% de FCS. Los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con un anti-rata-IgG-Fcy-PE (1:100 en PBS/2% de FCS; Jackson-Immuno-Research núm. 112-116-071). Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del primer anticuerpo. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (versión 7.6). La expresión superficial de quimeras de BCMA humano-murino, células CHO transfectadas se analizaron y se confirmaron en un ensayo de citometría de flujo con diferentes anticuerpos anti-BCMA (Figura 2).

Ejemplo B2

2.1 Expresión temporal en células HEK 293

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificados por secuencia se usaron para la transfección y expresión de proteínas en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtuvieron sobrenadantes que contenían las proteínas expresadas, las células se eliminaron por centrifugado y los sobrenadante se almacenaron a -20°C.

2.2 Expresión estable en células CHO

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificados por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica de los constructos. La expresión de proteínas eucarióticas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM de MTX. Después de dos pasos de cultivo estacionario las células se cultivaron en botes giratorios con medio de soja líquida HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la cosecha. Las células se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20°C.

Ejemplo B3

Agrupación de epítopos de fragmentos de scFv murino

Las células transfectadas con BCMA humano o murino, o con moléculas de BCMA quimérico se tiñeron con extracto periplásmico no diluido, en bruto, que contenía scFv que se une a BCMA humano/de macaco. Los scFv unidos se detectaron con 1 pg/ml de un anticuerpo anti-FLAG (Sigma F1804) y un anticuerpo específico de Fc gamma anti-ratón marcado con R-PE (1:100; Dianova núm. 115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con 2% de FCS. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del extracto periplásmico. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (Versión 7.6).

Ejemplo B4

Obtención de diferentes formas recombinantes de BCMA humano y de macaco soluble

Las secuencias de codificación de BCMA humano y rhesus (como se publica en GenBank, números de acceso NM_001192 [humano], XM_001106892 [Rhesus]) que codifican secuencias de albúmina humana, Fcy1 humano y albúmina murina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificial que codifican proteínas de fusión solubles de BCMA humano y de macaco respectivamente y albúmina humana, Fc de IgG1 humano y albúmina murina respectivamente además de proteínas solubles que comprenden solo los dominios extracelulares de BCMA. Para generar los constructos para la expresión de proteínas de BCMA humano y de macaco solubles, se obtuvieron fragmentos de ADNc por mutagénesis por PCR de los ADNc de BCMA de longitud completa descritos anteriormente y clonado molecular según los protocolos estándar.

Para las fusiones con IgG1 murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de la parte de bisagra y Fc gamma de IgG 1 humana, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de hexahistidina y un codón de parada.

Para las fusiones con albúmina murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 correspondientes al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de albúmina sérica murina, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para los constructos de dominio extracelular solubles, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Los fragmentos de ADNc se diseñaron además para introducir sitios de restricción al principio y al final de los fragmentos. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y Sall en el extremo 3’, se utilizaron en los siguientes procedimientos de clonado. Los fragmentos de ADNc se clonaron por medio de EcoRI y Sall en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Los procedimientos mencionados anteriormente se realizaron todos según protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)).

Ejemplo B5

Determinación basada en Biacore de la afinidad de anticuerpo biespecífico a BCMA y CD3 humano y de macaco

Los experimentos de análisis Biacore se realizaron usando proteínas de fusión de BCMA recombinante con albúmina (ALB) sérica humana para determinar la unión a la diana BCMA. Para las medidas de afinidad a CD3, se usaron las proteínas de fusión recombinantes que tenían los 27 aminoácidos N-terminales del CD3 épsilon (CD3e) condensados a la parte Fc de anticuerpo humano. Esta proteína recombinante existe en una versión CD3e1-27 humana y en una versión CD3e cynomolgus, ambas portando el epítopo del aglutinante CD3 en los anticuerpos biespecíficos.

En detalle, se inmovilizaron Chips de sensor CM5 (GE Healthcare) con aproximadamente 100 a 150 RU del respectivo antígeno recombinante usando tampón acetato pH 4,5 según el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecífico se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de migración HBS-EP (GE Healthcare). El caudal era 30 a 35 pl/min durante 3 min, después se aplicó tampón de migración HBS-EP durante 8 min de nuevo a un caudal de 30 a 35 pl/ml. La regeneración del chip se realizó usando glicina 10 mM NaCl 0,5 M pH 2,45. Los conjuntos de datos se analizaron usando software BiaEval. En general se realizaron dos experimentos independientes.

Ejemplo B6

Análisis de citometría de flujo

Se analizaron la funcionalidad y resistencia de unión de moléculas scFv maduras de afinidad en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco. En resumen, aproximadamente 105 células se incubaron con 50 pl de diluciones 1:3 en serie de extractos de células E. coli periplasmáticas durante 50 min en hielo. Después de lavar con PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%, las células se incubaron con 30 pl de Flag-M2 IgG (Sigma, 1:900 en PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%) durante 40 min en hielo. Después de un segundo lavado, las células se incubaron con 30 pl de un IgG anti-ratón de cabra etiquetado con R-Ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch, 1:100 en PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%) durante 40 min en hielo. Las células se lavaron después de nuevo y se resuspendieron en 200 pl de PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%. La fluorescencia relativa de las células teñidas se midió usando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD). Los resultados se representan como histogramas FACS, representando el log de la intensidad de la fluorescencia frente al número celular relativo (véase la Figura B4).

Ejemplo B7

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con 2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con 2% de FCS). Después de lavar, los anticuerpos PentaHis unidos se detectaron con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con 2% de FCS.

Ejemplo B8

Determinación basada en Scatchard de afinidad de anticuerpo biespecífico a BCMA humano y de macaco

Para el análisis de Scatchard, los experimentos de unión por saturación se realizan usando un sistema de detección monovalente desarrollado en Micromet (anti-His Fab/Alexa 488) para determinar de forma precisa la unión monovalente de los anticuerpos biespecíficos a la respectiva línea celular.

Se incuban 2 x 104 células de la respectiva línea celular (línea de células CHO que expresa BCMA humano de forma recombinante, línea de células CHO que expresa BCMA de macaco de forma recombinante) con cada 50 pl de una serie de diluciones en grupo de tres (ocho diluciones a 1:2) del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA empezando a 100 nM seguido por 16 h de incubación a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Después, las células se incuban durante 30 min más con 30 pl de una disolución anti-His Fab/Alexa488 (Micromet; 30 pg/ml). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 150 pl de tampón FACS que contiene 3,5% de formaldehído, se incuban durante 15 min más, se centrifugan, se resuspenden en tampón FACS y se analizan usando una máquina FACS Cantoll y software FACS Diva. Los datos se generan a partir de dos conjuntos de experimentos independientes. Los valores se representan como curvas de unión en hipérbole. El respectivo análisis de Scatchard se calcula para extrapolar la unión máxima (Bmax). Las concentraciones de anticuerpos biespecíficos a la mitad de la unión máxima se determinan reflejando las respectivas KDs. Los valores de medidas triplicadas se representan como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina usando la evaluación de Scatchard y se calculan las respectivas KDs.

Ejemplo B9

Actividad citotóxica

9.1 Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas

Las células T estimuladas enriquecidas por células T CD8+ se obtuvieron como se describe a continuación.

Se recubrió una placa de petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3-5 x 107 PBMC humanas a la placa de petri pre-recubierta en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/10% de FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.

Los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) se enriquecieron por disminución de células T CD4+ y células NK CD56+ usando Dynal-Beads según el protocolo del fabricante.

Las células diana CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 51Cr 11,1 MBq en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en un ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI suplementado con una relación E:T de 10:1. Se usó una concentración de partida de 0,01 - 1 pg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de las mismas. El tiempo de incubación para el ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante respecto a la diferencia de lisis máxima (adición de Tritón-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadruplicado. La medida de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3’’ (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemania). El análisis de los resultados se realizó con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidales se usaron para la comparación de la actividad citotóxica.

9.2 Ensayo de citotoxicidad basada en FACS con PBMC humanas no estimuladas

Aislamiento de las células efectoras

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparados de linfocitos enriquecidos (capas leuco-plaquetarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leuco-plaquetarias se suministraron por un banco de sangre local y se prepararon PBMC en el mismo día de la recogida de sangre. Después de la centrifugación por densidad de Ficoll y exhaustivos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos que quedaban se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 pM). Las plaquetas se eliminaron por medio del sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos que quedaban incluyen principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/CO2 al 5% en medio RPMI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Disminución de células CD14+ y CD56+

Para la disminución de células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS núm. 130-050 201), para la disminución de células NK microperlas de CD56 humano (MACS, núm. 130-050-401). Las PBMC se contaron y centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó y el gránulo celular se resuspendió en tampón de aislamiento MACS [80 pL/107 células; PBS (Invitrogen, núm. 20012-043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, núm. 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, núm. E-6511)]. Se añadieron microperlas de CD14 y microperlas de CD56 (20 pL/107 células) y se incubaron durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1-2 mL/107 células). Después del centrifugado (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en tampón de aislamiento MACS (500 pL/108 células). Las células negativas CD14/CD56 se aislaron entonces usando columnas LS (Miltenyi Biotec, núm. 130-042-401). Se cultivaron PBMC sin células CD14+/CD56+ en medio completo RPMI es decir RPMI1640 (Biochrom AG, núm. FG1215) suplementado con FBS al 10% (Biochrom AG, núm. S0115), 1x de aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, núm. K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom Ag , núm. L1613), piruvato sódico 1 mM (Biochrom AG, núm. L0473) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, núm. A2213) a 37°C en una incubadora hasta necesitarse.

Marcado de células diana

Para el análisis de la lisis celular en los ensayos de citometría de flujo, se usó tinte de membrana fluorescente DiOCis (DiO) (Molecular Probes, núm. V22886) para marcar las células CHO transfectadas con BCMA humano o BCMA de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se cosecharon, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/mL en PBS que contenía FBS al 2% y el tinte de membrana DiO (5 pL/106 células). Después de la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/mL. La vitalidad de las células se determinó usando disolución EosinG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, núm. 45380).

Análisis basado en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de las células CHO transfectadas con BCMA humano o de macaco en presencia de diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos de BCMA.

Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando por resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pL de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pL de diluciones en serie de los anticuerpos biespecíficos de BCMA y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpo biespecífico continuó durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%. Después las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y la pérdida de integridad de la membrana de la célula diana se monitorizó añadiendo yoduro de propidio (PI) a la concentración final de 1 pg/mL. PI es un tinte impermeable de membrana que normalmente está excluido de células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson).

Las células diana se identificaron como células positivas para DiO. Las células diana negativas para PI se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la siguiente fórmula:

^{cél „}Citotôxicidad ^{, m}|%^/TJ = ^{^}----- ^u - ^l - ^a - ^{s diana muertas} ------------------- x 100

^células diana

n es el número de sucesos

Usando software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), el porcentaje de citotoxicidad se representó frente a las correspondientes concentraciones de anticuerpo biespecífico. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de las curvas de respuesta a la dosis sigmoides con pendiente fija y se calcularon los valores de CE50.

Ejemplo B10

Exclusión de reactividad cruzada con el receptor de BAFF

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con 2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con 2% de FCS). Después de lavar, se detectaron anticuerpos PentaHis unidos con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con 2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Se mostró que los aglutinantes biespecíficos no tenían reactividad cruzada con el receptor de BAFF.

Ejemplo B11

Actividad citotóxica

La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA tipo humano en la redirección de células T efectoras frente a las células diana que expresan BCMA se analiza en cinco ensayos la citotoxicidad in vitro adicionales:

1. La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T efectoras humanas estimuladas frente a una línea celular tumoral (humana) positiva para BCMA se mide en un ensayo de liberación de cromo 51.

2. La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a células CHO transfectadas con BCMA humano se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

3. La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a una línea celular tumoral (humano) positiva para BCMA se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

4. Para la confirmación de que los anticuerpos biespecíficos de BCMA con reactividad cruzada son capaces de redireccionar células T de macaco frente a células CHO transfectadas con BCMA de macaco, se realiza un ensayo de citotoxicidad basado en FACS con una línea de células T de macaco como células T efectoras.

5. El intervalo de potencia entre formas monomérica y dimérica de anticuerpos biespecíficos de BCMA se determina en un ensayo de liberación de cromo 51 usando células CHO transfectadas con BCMA como células diana y células T humanas estimuladas como células efectoras.

Ejemplos C

Ejemplo C1

Generación de células CHO que expresan BCMA quimérico

Para la construcción de las moléculas de mapeo del epítopo quimérico, la secuencia de aminoácidos de los respectivos dominios de epítopo o el residuo de aminoácido individual de BCMA humano se cambió a la secuencia murina. Las siguientes moléculas se construyeron:

• ECD de BCMA humano/E1 murino (SEQ ID NO:1009)

^ supresión de residuos de aminoácidos 1-3 y mutación G6Q en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E2 murino (SEQ ID NO:1010)

^ mutaciones S9F, Q10H y N11S en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E3 murino (SEQ ID NO:1011)

• ECD de BCMA humano/E4 murino (SEQ ID NO:1012)

^ mutaciones N42D, A43P, N47S, N53Y y A54T en la SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E5 murino (SEQ ID NO:1013)

^ mutación I22K en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E6 murino (SEQ ID NO:1014)

^ mutación Q25H en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E7 murino (SEQ ID NO:1015)

^ mutación R39P en la SEQ ID NO:1002 o 1007

Los constructos de ADNc se clonaron en el vector de expresión de mamífero pEF-DHFR y se transfectaron de forma estable en células CHO. La expresión de BCMA humano en células CHO se verificó en un ensayo FACS usando un anticuerpo de BCMA anti-humano monoclonal. La expresión de BCMA murino se demostró con un anticuerpo de BCMA anti-ratón monoclonal. La concentración usada de los anticuerpos de BCMA fue 10 |ug/ml en PBS/2% de FCS. Los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con un anti-rata-IgG-Fcy-PE (1:100 en PBS/2% de FCS; Jackson-Immuno-Research núm. 112-116-071). Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del primer anticuerpo. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (versión 7.6). La expresión superficial de quimeras de BCMA humano-murino, células CHO transfectadas se analizaron y se confirmaron en un ensayo de citometría de flujo con diferentes anticuerpos anti-BCMA (Figura 2).

Ejemplo C2

2.1 Expresión temporal en células HEK 293

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificados por secuencia se usaron para la transfección y expresión de proteínas en el Sistema de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes que contenían las proteína expresadas se obtuvieron, las células se eliminaron por centrifugado y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C.

2.2 Expresión estable en células CHO

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificados por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica de los constructos. La expresión de proteínas eucarióticas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM de MTX. Después de dos pasos de cultivo estacionario las células se cultivaron en botes rotatorios con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Plurónico F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la cosecha. Las células se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20°C.

Ejemplo C3

Agrupación de epítopos de fragmentos scFv murinos

Las células transfectadas con BCMA humano o murino, o con moléculas de BCMA quiméricas se tiñeron con extracto periplásmico no diluido, en bruto, que contenía scFv que se une a BCMA humano/de macaco. Se detectaron scFv unidos con 1 |ug/ml de un anticuerpo anti-FLAG (Sigma F1804) y un anticuerpo específico de Fc gamma anti-ratón marcado con R-PE (1:100; Dianova núm. 115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con 2% de FCS. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del extracto periplásmico. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (Versión 7.6).

Ejemplo C4

Obtención de formas recombinantes diferentes de BCMA humano y de macaco solubles

Las secuencias de codificación de BCMA humano y rhesus (como se publica en GenBank, números de acceso NM_001192 [humano], XM_001106892 [rhesus]) que codifican secuencias de albúmina humana, Fcy1 humano y albúmina murina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificial que codifican proteínas de fusión soluble de BCMA humano y de macaco respectivamente y albúmina humana, Fc de IgG1 humana y albúmina murina respectivamente además de proteínas solubles que comprenden solo los dominios extracelulares de BCMA. Para generar los constructos para la expresión de las proteínas de BCMA humano y de macaco solubles, se obtuvieron fragmentos de ADNc por mutagénesis de PCR de los ADNc de BCMA de longitud completa descritos anteriormente y el clonado molecular según los protocolos estándar.

Para las fusiones con IgG1 murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprenden los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 que corresponden al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de la parte de bisagra y Fc gamma de IgG1 humana, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de hexahistidina y un codón de parada.

Para las fusiones con albúmina murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguidos por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprende los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 correspondientes al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly4-Ser1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de albúmina sérica murina, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Para los constructos de dominio extracelular soluble, los fragmentos de ADNc modificados se diseñaron para contener primero un sitio Kozak para la expresión eucariótica de los constructos seguido por la secuencia de codificación de las proteínas de BCMA humano y de macaco respectivamente, que comprende los aminoácidos 1 a 54 y 1 a 53 correspondientes al dominio extracelular de BCMA humano y rhesus, respectivamente, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de un Ser1-Gly1-conector artificial, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta Flag, seguida en la estructura por la secuencia de codificación de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de parada.

Ejemplo C5

Determinación basada en Biacore de la afinidad del anticuerpo biespecífico de BCMA y CD3 humano y de macaco

Se realizaron experimentos de análisis Biacore usando proteínas de fusión de BCMA recombinante con albúmina sérica humana (ALB) para determinar la unión a la diana de BCMA. Para las medidas de afinidad de CD3, se usan proteínas de fusión recombinantes que tienen los 27 aminoácidos N-terminales del CD3 épsilon (CD3e) condensados con la parte Fc de anticuerpo humano. Esta proteína recombinante existe en una versión CD3e1 -27 humana y en una versión CD3e cynomolgus, ambas portando el epítopo del aglutinante CD3 en los anticuerpos biespecíficos.

En detalle, los Chips Sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizan con aproximadamente 100 a 150 RU del respectivo antígeno recombinante usando tampón acetato pH 4,5 según el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecífico se cargan en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de migración HBS-EP (GE Healthcare). El caudal es 30 a 35 pl/min durante 3 min, después se aplicó tampón de migración HBS-EP durante 8 min de nuevo a un caudal de 30 a 35 pl/ml. La regeneración del chip se realiza usando glicina 10 mM NaCl 0,5 M pH 2,45. Se analizan conjuntos de datos usando Software BiaEval. En general se realizaron dos experimentos independientes.

Ejemplo C6

Análisis de citometría de flujo

Se analizaron la funcionalidad y resistencia de unión de moléculas scFv maduras de afinidad en FACS usando células CHO transfectadas con BCMA humano y de macaco. En resumen, aproximadamente 105 células se incubaron con 50 de diluciones 1:3 en serie de extractos de células E. coli periplasmáticas durante 50 min en hielo. Después de lavar con PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%, las células se incubaron con 30 pl de Flag-M2 IgG (Sigma, 1:900 en PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%) durante 40 min en hielo. Después de un segundo lavado, las células se incubaron con 30 pl de una IgG anti-ratón de cabra etiquetada con R-Ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch, 1:100 en PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%) durante 40 min en hielo. Las células se lavaron después de nuevo y se resuspendieron en 200 pl de PBS/10% de FCS/azida sódica al 0,05%. La fluorescencia relativa de las células teñidas se midió usando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD). Los resultados se representan como histogramas FACS, representando el log de la intensidad de la fluorescencia frente al número celular relativo (véase la Figura C4).

Ejemplo C7

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies

Ejemplo C8

Determinación basada en Scatchard de afinidad del anticuerpo biespecífico a BCMA humano y de macaco

Para el análisis de Scatchard, los experimentos de unión por saturación se realizan usando un sistema de detección monovalente desarrollado en Micromet (anti-His Fab/Alexa 488) para determinar de forma precisa la unión monovalente de los anticuerpos biespecíficos de la respectiva línea celular.

Se incuban 2 x 104 células de la respectiva línea celular (línea de células CHO que expresa BCMA humano de forma recombinante, línea de células CHO que expresa BCMA de macaco de forma recombinante) con cada 50 pl de una serie de diluciones en grupos de tres (ocho diluciones a 1:2) del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA empezando a 100 nM seguido por 16 h de incubación a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Después, las células se incuban durante 30 min más con 30 pl de una disolución anti-His Fab/Alexa488 (Micromet; 30 pg/ml). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 150 pl de tampón FACS que contiene formaldehído al 3,5%, se incuban durante 15 min más, se centrifugan, se resuspenden en tampón FACS y se analizan usando una máquina FACS Cantoll y software FACS Diva. Los datos se generan a partir de dos conjuntos de experimentos independientes. Los valores se representan como curvas de unión en hipérbole. El respectivo análisis de Scatchard se calcula para extrapolar la unión máxima (Bmax). Las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de la mitad de la unión máxima se determinan reflejando las respectivas KDs. Los valores de medidas triplicadas se representan como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina usando la evaluación de Scatchard y se calculan las respectivas KDs.

Ejemplo C9

Actividad citotóxica

9.1 Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas

Las células diana CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 51Cr de 11,1 MBq en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI suplementado con una relación E:T de 10:1. Se usaron una concentración de partida de 0,01 - 1 pg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de las mismas. El tiempo de incubación para el ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante respecto a la diferencia de lisis máxima (adición de Tritón-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadruplicado. La medida de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3’’ (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemania). El análisis de los resultados se realizó con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidales se usaron para la comparación de la actividad citotóxica.

9.2 Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas

Aislamiento de las células efectoras

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparados de linfocitos enriquecidos (capas leuco-plaquetarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leuco-plaquetarias se suministraron por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon en el mismo día de la recogida de sangre. Después de la centrifugación por densidad de Ficoll y exhaustivos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos que quedaban se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 pM). Las plaquetas se eliminaron por medio del sobrenadante tras la centrifugación de las PBMC a 100 x g. Los linfocitos que quedaban incluyen principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/CO2 al 5% en medio RPMI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Disminución de células CD14+ y CD56+

Para la disminución de células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS núm. 130-050 201), para la disminución de células NK microperlas de CD56 humano (MACS, núm. 130-050-401). Las PBMC se contaron y se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó y el gránulo celular se resuspendió en tampón de aislamiento MACS [80 pL/107 células; PBS (Invitrogen, núm. 20012 043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, núm. 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, núm. E-6511)]. Se añadieron microperlas de CD14 y microperlas de CD56 (20 pL/107 células) y se incubaron durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1-2 mL/107 células). Después del centrifugado (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en tampón de aislamiento MACS (500 pL/108 células). Las células negativas CD14/CD56 se aislaron entonces usando columnas LS (Miltenyi Biotec, núm. 130-042-401). Las PBMC sin células CD14+/CD56+ se cultivaron en medio completo RPMI es decir RPMI1640 (Biochrom AG, núm. FG1215) suplementado con FBS al 10% (Biochrom AG, núm. S0115), 1x de aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, núm. K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, núm. L1613), piruvato sódico 1 mM (Biochrom AG, núm. L0473) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, núm. A2213) a 37°C en una incubadora hasta necesitarse.

Marcado de células diana

Para el análisis de la lisis celular en ensayos de citometría de flujo, se usó tinte de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, núm. V22886) para marcar las células CHO transfectadas con BCMA humano o BCMA de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se cosecharon, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/mL en PBS que contenía 2% de FBS (v/v) y el tinte de membrana DiO (5 pL/106 células). Después de la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/mL. La vitalidad de las células se determinó usando disolución EosinG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, núm. 45380).

Análisis basado en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de las células CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano en presencia de diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos de BCMA.

Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando por resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pL de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pL de diluciones en serie de los anticuerpos biespecíficos de BCMA y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por el anticuerpo biespecífico continuó durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%. Después las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y se monitorizó la pérdida de integridad de la membrana celular diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/mL. PI es un tinte impermeable de membrana que normalmente está excluido de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

Citot ^{. ■ - j}oxicidad ^{. r élulas diana muertas * nr.}|ⁿ%^/Jⁱ= ^{^c}--------------------------- x 100

^células diana

n = número de sucesos

Ejemplo C10

Exclusión de reactividad cruzada con el receptor BAFF

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 gl de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 gg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con 2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 gl de PBS con 2% de FCS). Después de lavar, se detectaron los anticuerpos PentaHis unidos con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con 2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Se mostró que los aglutinantes biespecíficos no tenían reactividad cruzada con el receptor de BAFF.

Ejemplo C11

Actividad citotóxica

La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA tipo humano en la redirección de células T efectoras frente a las células diana que expresan BCMA se analiza en cinco ensayos de citotoxicidad in vitro adicionales:

2. La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a células CHO transfectadas con BCMA humano se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS. 3. La potencia de anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a una línea celular tumoral (humana) positiva para BCMA se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

4. Para la confirmación de que los anticuerpos biespecíficos de BCMA reactivos cruzados son capaces de redireccionar células T de macaco frente a células CHO transfectadas con BCMA de macaco, se realiza un ensayo de citotoxicidad basado en FACS con una línea de células T de macaco como células T efectoras.

5. El intervalo de potencia entre formas monomérica y dimérica de anticuerpos biespecíficos de BCMA se determina en un ensayo de liberación de cromo 51 usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana y células T humanas estimuladas como células efectoras.

Ejemplos D

Ejemplo D1

Generación de células CHO que expresan BCMA quimérico

• ECD de BCMA humano/E1 murino (SEQ ID NO:1009)

• ECD de BCMA humano/E2 murino (SEQ ID NO:1010)

^ mutaciones S9F, Q10H y N11S en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E3 murino (SEQ ID NO:1011)

^ mutaciones N42D, A43P, N47S, N53Y y A54T en la SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E5 murino (SEQ ID NO:1013)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácido en la posición 22 de la SEQ ID NO:1002 o 1007 (isoleucina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de la SEQ ID NO:1004 o 1008 (lisina, posición 19)

^ mutación I22K en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E6 murino (SEQ ID NO:1014)

^ mutación Q25H en SEQ ID NO:1002 o 1007

• ECD de BCMA humano/E7 murino (SEQ ID NO:1015)

Dominio de BCMA extracelular quimérico: dominio de BCMA extracelular humano en el que el residuo de aminoácido en la posición 39 de la SEQ ID NO:1002 o 1007 (arginina) se sustituye por su respectivo residuo de aminoácido murino de la SEQ ID NO:1004 o 1008 (prolina, posición 34)

^ mutación R39P en la SEQ ID NO:1002 o 1007

Ejemplo D2

2.1 Expresión temporal en células HEK 293

2.2 Expresión estable en células CHO

Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias de nucleótidos verificadas por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica de los constructos. La expresión de proteínas eucarióticas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación génica de los constructos se indujo aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM de MTX. Después de dos pasos de cultivo estacionario las células se cultivaron en botes rotatorios con medio de soja líquida HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Plurónico F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la cosecha. Las células se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20°C.

Ejemplo D3

Agrupación de epítopos de fragmentos scFv murinos

Las células transfectadas con BCMA humano o murino, o con moléculas de BCMA quiméricas se tiñeron con extracto periplásmico no diluido, en bruto, que contenía scFv que se une a BCMA humano/de macaco. Se detectaron scFv unidos con 1 pg/ml de un anticuerpo anti-FLAG (Sigma F1804) y un anticuerpo específico de Fc gamma anti-ratón marcado con R-PE (1:100; Dianova núm. 115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con 2% de FCS. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/2% de FCS en vez del extracto periplásmico. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron mediante software FlowJo (Versión 7.6).

Ejemplo D4

Las secuencias de codificación de BCMA humano y rhesus (como se publica en GenBank, números de acceso NM_001192 [humano], XM_001106892 [rhesus]) que codifican secuencias de albúmina humana, Fcy1 humano y albúmina murina se usaron para la construcción de secuencias de ADNc artificiales que codifican proteínas de fusión solubles de BCMA humano y de macaco respectivamente y albúmina humana, Fc de IgG1 humana y albúmina murina respectivamente además de proteínas solubles que comprenden solo los dominios extracelulares de BCMA. Para generar los constructos para la expresión de las proteínas solubles de BCMA humano y de macaco, se obtuvieron fragmentos de ADNc por mutagénesis de PCR de los ADNc de BCMA de longitud completa descritos anteriormente y el clonado molecular según los protocolos estándar.

Ejemplo D5

Determinación basada en Biacore de la afinidad del anticuerpo biespecífico a BCMA y CD3 humano y de macaco

Se realizaron experimentos de análisis Biacore usando proteínas de fusión de BCMA recombinante con albúmina sérica humana (ALB) para determinar la unión a la diana BCMA. Para las medidas de afinidad de CD3, se usaron proteínas de fusión recombinantes que tenían los 27 aminoácidos N-terminales del CD3 épsilon (CD3e) condensados con la parte Fc de anticuerpo humano. Esta proteína recombinante existe en una versión CD3e1 -27 humana y en una versión CD3e cynomolgus, ambas portando el epítopo del aglutinante CD3 en los anticuerpos biespecíficos.

En detalle, los Chips Sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizaron con aproximadamente 100 a 150 RU del respectivo antígeno recombinante usando tampón acetato pH 4,5 según el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecífico se cargaron en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de migración HBS-EP (GE Healthcare). El caudal fue 30 a 35 pl/min durante 3 min, después se aplicó tampón de migración HBS-EP durante 8 min de nuevo a un caudal de 30 a 35 pl/ml. La regeneración del chip se realizó usando glicina 10 mM NaCl 0,5 M pH 2,45. Se analizaron los conjuntos de datos usando Software BiaEval (véase la Figura D4). En general se realizaron dos experimentos independientes.

Ejemplo D6

Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies

Ejemplo D7

Se incuban 2 x 104 células de la respectiva línea celular (línea de células CHO que expresa BCMA humano de forma recombinante, línea de células CHO que expresa BCMA de macaco de forma recombinante) con cada 50 pl de una serie de diluciones en grupos de tres (ocho diluciones a 1:2) del respectivo anticuerpo biespecífico de BCMA empezando a 100 nM seguido por 16 h de incubación a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Después, las células se incuban durante 30 min más con 30 pl de una disolución anti-His Fab/Alexa488 (Micromet; 30 pg/ml). Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 150 pl de tampón FACS que contiene formaldehído al 3,5%, se incuban durante 15 min más, se centrifugan, se resuspenden en tampón FACS y se analizan usando una máquina FACS Cantoll y software FACS Diva. Los datos se generan a partir de dos conjuntos de experimentos independientes. Los valores se representan como curvas de unión en hipérbole. El respectivo análisis de Scatchard se calcula para extrapolar la unión máxima (Bmax). Las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de la mitad de la unión máxima se determinan reflejando las respectivas KDs. Los valores de medidas por triplicado se representan como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina usando la evaluación de Scatchard y se calculan las respectivas KDs.

Ejemplo D8

Actividad citotóxica

8.1 Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas

Se recubrió una placa de petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3-5 x 107 de PBMC humanas a la placa de petri pre-recubierta en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/10% de FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.

Las células diana CHO transfectadas con BCMA de macaco o humano se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 51Cr de 11,1 MBq en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI suplementado con una relación E:T de 10:1. Se usaron una concentración de partida de 0,01 - 1 pg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de las mismas. El tiempo de incubación para el ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante respecto a la diferencia de lisis máxima (adición de Tritón-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadruplicado. La medida de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3’’ (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemania). El análisis de los resultados se realizó con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidales se usaron para la comparación de la actividad citotóxica (véase la Figura D5).

8.2 Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humano no estimulado

Aislamiento de las células efectoras

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas por centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparados de linfocitos enriquecidos (capas leuco-plaquetarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leuco-plaquetarias se suministraron por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon en el mismo día de la recogida de sangre. Después de la centrifugación por densidad de Ficoll y exhaustivos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos que quedaban se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO310 mM, EDTA 100 pM). Las plaquetas se quitaron por medio del sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos que quedaban incluyen principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/CO2 al 5% en medio RPMI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Disminución de células CD14+ y CD56+

Para la disminución de células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS núm. 130-050 201), para la disminución de células NK microperlas de CD56 humano (MACS, núm. 130-050-401). Las PBMC se contaron y se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó y el gránulo celular se resuspendió en tampón de aislamiento MACS [80 pL/107 células; PBS (Invitrogen, núm. 20012 043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, núm. 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, núm. E-6511)]. Se añadieron microperlas de CD14 y microperlas de CD56 (20 pL/107 células) y se incubaron durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1-2 mL/107 células). Después del centrifugado (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en tampón de aislamiento MACS (500 pL/108 células). Las células negativas CD14/CD56 se aislaron entonces usando columnas LS (Miltenyi Biotec, núm. 130-042-401). Las PBMC sin células CD14+/CD56+ se cultivaron en medio completo de RPMI es decir RPMI1640 (Biochrom AG, núm. FG1215) suplementado con FBS al 10% (Biochrom AG, núm. S0115), 1x de aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, núm. K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, núm. L1613), piruvato sódico 1 mM (Biochrom AG, núm. L0473) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, núm. A2213) a 37°C en una incubadora hasta necesitarse.

Marcado de células diana

Análisis basado en citometría de flujo

Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando por resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pL de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pL de diluciones en serie de los anticuerpos biespecíficos de BCMA y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por el anticuerpo biespecífico continuó durante 48 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 7%. Después las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y se monitorizó la pérdida de integridad de la membrana de la célula diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/mL. PI es un tinte impermeable de membrana que normalmente está excluido de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

^{. ■ - j} ^{, r„,i ^célu iana muertas * nr.} Citotoxicidad |%J ^{las d} = --------------------------- x 100

^células diana

n = número de sucesos

Usando software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), el porcentaje de citotoxicidad se representó frente a las correspondientes concentraciones de anticuerpo biespecífico. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de las curvas sigmoides de respuesta a la dosis con pendiente fija y se calcularon los valores de CE50.

Ejemplo D9

Exclusión de reactividad cruzada con el receptor BAFF

Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las respectivas líneas celulares durante 30 min en hielo con 50 pl de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 pg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS con 2% de FCS y la unión de los constructos se detectó con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con 2% de FCS). Después de lavar, se detectaron los anticuerpos PentaHis unidos con un anticuerpo específico de Fc gamma (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con 2% de FCS. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron mediante software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Se mostró que los aglutinantes biespecíficos no tenían reactividad cruzada con el receptor de BAFF.

Ejemplo D10

Actividad citotóxica

1. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T efectoras humanas estimuladas frente a una línea celular tumoral (humana) positiva para BCMA se mide en un ensayo de liberación de cromo 51.

3. La potencia de los anticuerpos biespecíficos de BCMA en la redirección de células T en PBMC humanas no estimuladas frente a una línea celular tumoral (humana) positiva para BCMA se mide en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS.

5. El intervalo de potencia entre las formas monomérica y dimérica de anticuerpos biespecíficos de BCMA se determina en un ensayo de liberación de cromo 51 usando células CHO transfectadas con BCMA humano como células diana y células T humanas estimuladas como células efectoras.

Claims

1. Una molécula de unión que es al menos biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión, en la que

(a) El primer dominio de unión es capaz de unirse a la agrupación de epítopos 3 y a la agrupación de epítopos 4 de BCMA; y

(b) El segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3; y

En la que la agrupación de epítopos 3 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 24 a 41 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002, y la agrupación de epítopos 4 de BCMA corresponde a los residuos de aminoácidos 42 a 54 de la secuencia como se representa en SEQ ID NO:1002,

Y en la que dicha molécula de unión es un polipéptido.

2. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que el primer dominio de unión no es capaz de unirse al dominio extracelular quimérico de BCMA como se representa en SEQ ID NO:1015.

3. La molécula de unión según la reivindicación 1 o 2, en la que el primer dominio de unión es además capaz de unirse al BCMA de macaco.

4. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 épsilon.

5. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer y/o segundo dominio de unión comprenden las CDRs de un anticuerpo.

6. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer y el segundo dominio forman una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2, (mAb de dominio único)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpo u oligómeros de los mismos.

7. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:251, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:252, CDR-3 como se representa en SEQ ID NO:253, c Dr -L1 como se representa en SEQ ID NO:254, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:255 y c Dr -L3 como se representa en SEQ ID NO:256;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO:301, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO:302, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:303, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:304, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:305 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:306; CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO:393, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO:394, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO:395 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO:396;

8. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en regiones VH como se representa en SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:497 y SEQ ID NO:507.

9. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en regiones VL como se representa en SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:418, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:498 y SEQ ID NO:508.

10. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende una región VH y una región VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una región VH como se representa en SEQ ID NO:237, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:238;

NO:248;

(c) una región VH como se representa en SEQ ID NO:257, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:258;

(d) una región VH como se representa en SEQ ID NO:267, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:268;

(e) una región VH como se representa en SEQ ID NO:277, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:278;

(f) una región VH como se representa en SEQ ID NO:287, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:288;

(g) una región VH como se representa en SEQ ID NO:297, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:298;

(h) una región VH como se representa en SEQ ID NO:307, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:308;

(i) una región VH como se representa en SEQ ID NO:397, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:398;

(k) una región VH como se representa en SEQ ID NO:407, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:408;

(l) una región VH como se representa en SEQ ID NO:417, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:418;

(m) una región VH como se representa en SEQ ID NO:427, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:428;

(n) una región VH como se representa en SEQ ID NO:437, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:438;

(o) una región VH como se representa en SEQ ID NO:447, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:448;

(p) una región VH como se representa en SEQ ID NO:457, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:458;

(q) una región VH como se representa en SEQ ID NO:467, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:468;

(r) una región VH como se representa en SEQ ID NO:477, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:478;

(s) una región VH como se representa en SEQ ID NO:487, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:488;

(t) una región VH como se representa en SEQ ID NO:497, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:498; y

(u) una región VH como se representa en SEQ ID NO:507, y una región VL como se representa en SEQ ID NO:508.

11. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:300 o SEQ ID NO:500.

12. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12.

14. Una célula huésped transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14 o con el vector según la reivindicación 13.

15. Un proceso para la producción de una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula huésped según la reivindicación 14 en condiciones que molécula de unión producida del cultivo.

16. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o producida según el proceso de la reivindicación 15.

17. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o producida según el proceso de la reivindicación 15 para usar en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en trastornos de células plasmáticas, otros trastornos de células B que correlacionan con la expresión de BCMA y enfermedades autoinmunes.

18. Un kit que comprende una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, un vector según la reivindicación 13, y/o una célula huésped según la reivindicación 14.

19. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho segundo dominio de unión es capaz de unirse a CD3 humano y a CD3 de macaco.

20. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que dichos dominios de unión están derivados de un anticuerpo, lipocalina o anticalina.

21. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que el primer y/o el segundo dominio de unión es un anticuerpo.

22. La molécula de unión según la reivindicación 20 o 21, en la que dicho anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, humanizados y humanos.

23. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que dicho anticuerpo incluye fragmentos Fab, F(ab’)2, Fv, fragmentos scFv, anticuerpos de dominio único, nanocuerpos, diacuerpos, anticuerpos DART, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem, minicuerpos, anticuerpos DART Fc, anticuerpos DART IgG y multicuerpos.

24. La molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo maduro de afinidad.

25. La molécula de unión según la reivindicación 1, en la que dicha unión a la agrupación de epítopos 3 de BCMA se prueba mediante intercambio con la respectiva agrupación de epítopos de un antígeno BCMA no humano o mediante barrido de alanina.