KR20220085779A - 다중-표적화 효과기 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220085779A
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바흐람 발라메르
라이언 비요르달
조드 굿리지
톰 통 리
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

게놈 조작된 iPSC의 유도 분화로부터 얻은 기능적으로 향상된 분화 효과기(effector) 세포를 얻기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 제공된 분화 세포(derivative cell)는 개선된 또는 향상된 치료 효과를 전달하는 안정하고 기능적인 게놈 편집을 갖는다. 단독으로, 또는 조합 치료에서의 항체 또는 관문 억제제와 함께 기능적으로 향상된 분화 효과기 세포를 포함하는 치료학적 조성물 및 이의 용도가 또한 제공된다.

Description

다중-표적화 효과기 세포 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2019년 12월 5일에 출원된 미국 임시출원 제62/944,187호 및 2019년 9월 25일에 출원된 미국 임시출원 제62/906,046호의 우선권을 주장하고, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록의 인용에 의한 포함
2020년 9월 25일에 생성되고 크기가 73,729 바이트인 "056932-519001WO_SL_ST25.TXT"의 명칭의 서열 목록은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 광범위하게 기성품 면역세포 산물의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 개시내용은 생체내 치료학적으로 관련된 특성을 전달할 수 있는 다기능성 효과기(effector) 세포를 전달하기 위한 전략에 관한 것이다. 본 개시내용 하에 개발된 세포 산물은 환자 원천 세포 치료의 중대한 제한을 해결한다.
입양 세포 치료의 분야는 현재 환자 원천 세포 및 공여자 원천 세포의 사용에 초점을 두는데, 이는 암 면역요법의 일관된 제조를 달성하고 이익일 수 있는 모든 환자에 치료를 전달하는 것이 특히 어렵게 한다. 유리한 환자 결과를 촉진하기 위해 입양으로 운반된 림프구의 효능 및 지속성을 개선할 필요성이 또한 있다. T 세포 및 자연 살해(NK: natural killer) 세포와 같은 림프구는 선천성 면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 강력한 항종양 효과기이다. 그러나, 입양 세포 치료에 대한 이 면역 세포의 사용은 도전으로 있고, 충족되지 않은 개선 필요성을 갖는다. 따라서, T 세포 및 NK 세포, 또는 입양 면역요법에서의 다른 림프구의 완전한 가능성을 이용하기 위한 상당한 기회가 남아 있다.
반응 속도, 세포 탈진, 수혈된 세포의 소실(생존기간 및/또는 지속성), 표적 소실 또는 계통 스위치를 통한 종양 회피, 종양 표적화 정확성, 오프 타깃 독성, 오프 종양 효과에서 고형 종양, 즉 종양 미세환경에 대한 효능 및 관련된 면역 억제, 동원, 수송 및 침윤에 이르는 문제를 해결하는 기능적으로 개선된 효과기 세포에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 목적은 단일 세포 유래 iPSC(induced pluripotent stem cell: 유도 만능 줄기 세포) 클론 계통으로부터 분화된 분화 비(非)만능 세포를 생성하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이고, iPSC 계통은 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 상기 하나 또는 여러 유전자 변형은 DNA 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 변형은 보유되고, 분화, 확장, 계대배양 및/또는 이식 후 후속하여 유래된 세포에서 기능적으로 있다.
본 출원의 iPSC 유래 비만능 세포는 비제한적인 예로서 CD34 세포, 동형유전자성 내피 세포, HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), 조혈 다능성 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함한다. 본 출원의 iPSC 유래 비만능 세포는 동일한 유전자 변형을 포함하는 iPSC로부터의 분화를 통해 이의 게놈에서 하나 또는 여러 유전자 변형을 포함한다. 유전 조작된 분화 세포(derivative cell)를 얻기 위한 조작된 클론 iPSC 분화 전략은 유도 분화에서의 iPSC의 발생 가능성이 iPSC에서 조작된 양상에 의해 불리하게 영향을 받지 않고, 또한 조작된 양상이 분화 세포에서 의도된 대로 기능할 것을 요한다. 추가로, 이 전략은 말초혈로부터 얻은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 일차(primary) 림프구의 조작에서 현재의 장벽을 극복하는데, 이러한 세포가 조작하기 어렵기 때문이고, 이러한 세포의 조작은 대개 재현성 및 균일성이 결여되어 높은 세포 사멸 및 낮은 세포 확장과 함께 불량한 세포 지속성을 나타내는 세포를 생성시킨다. 더욱이, 이 전략은 이종성 효과기 세포 집단의 생성을 피하고, 달리 시작하기 위해 외생인 일차 세포 원천을 사용하여 이것을 얻는다.
본 발명의 여러 양태는 (I), (II) 또는 (III)을 포함하는 방법을 이용하여 얻은 게놈 조작된 iPSC를 제공하고, 이는 각각 재프로그래밍 과정에 후속하여, 이것과 동시에 그리고 이것 전에 게놈 조작의 전략을 반영한다:
(I): 임의의 순서로 (i) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합이 가능하게 하기 위한 하나 이상의 작제물(들)을 iPSC로 도입하는 단계; (ii) (a) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위(들)에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)을 iPSC로 도입하는 단계; 및 (b) 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입/결실(in/del)을 생성하게 하도록 단계 (I)(ii)(a)의 iPSC를 배양하는 단계(이로써, 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포(differentiated cell)로 분화할 수 있는 게놈 조작된 iPSC를 얻음)인 (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두에 의해 iPSC를 유전 조작하는 것.
(II): (i) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합이 가능하게 하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 단계 (II)(i)의 재프로그래밍하는 비만능 세포로 도입하는 단계(이후, 단계 (II)(ii)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위(들)에서 표적화된 삽입/결실을 생성하게 하도록 배양되고; 그렇게 하여 얻은 게놈 조작된 iPSC는 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하고, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로 분화할 수 있음)를 포함하는, 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍하는 비만능 세포를 유전 조작하는 것.
(III): (i) 임의의 순서로 (a) 선택된 부위(들)에서의 표적화된 통합이 가능하게 하기 위한 하나 이상의 작제물(들); (b) 선택된 부위 인식을 할 수 있는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제를 사용하여 선택된 부위에서의 하나 이상의 이중 가닥 절단(들)인 (a) 및 (b) 중 하나 또는 둘 모두를 비만능 세포로 도입하는 단계(여기서, 단계 (III)(i)(b)의 세포는 내인성 DNA 수선이 선택된 부위에서 표적화된 삽입/결실을 생성하게 하도록 배양됨); 및 (ii) 선택된 부위에서 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 단계 (III)(i)의 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계(이로써, 적어도 하나의 기능적 표적화된 게놈 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻고, 상기 게놈 조작된 iPSC는 부분 분화된 세포 또는 완전 분화된 세포로 분화할 수 있음)인 (i) 및 (ii)를 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 재프로그래밍을 위해 비만능 세포를 유전 조작하는 것.
상기 방법의 일 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서의 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자; 또는 게놈 조작된 iPSC 또는 이의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드는 (1) CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 또는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 포함하는 하나 이상의 외인성 프로모터; 또는 (2) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 선택된 부위에서 포함된 하나 이상의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 카스파제, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR, 또는 B 세포 CD20을 포함하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 게놈 조작된 iPSC가 2개 이상의 자살 유전자를 포함할 때, 자살 유전자는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1을 포함하는 상이한 안전 항구 좌위(safe harbor locus)에 통합된다. 일 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 펩타이드 또는 전체 펩타이드 및/또는 이들의 각각의 수용체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21의 부분 펩타이드 또는 전체 펩타이드 및/또는 이들의 각각의 수용체는 융합 단백질의 형태이다.
일부 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 iPSC 또는 이의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 억제하는 단백질과 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에서 삽입/결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 파괴(disruption)를 위한 내인성 유전자는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 게놈 조작된 iPSC는 AAVS1 좌위에서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 카스파제 및 H11 좌위에서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 티미딘 키나제를 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 접근법 (I), (II) 및/또는 (III)은 게놈 조작된 iPSC의 만능성을 유지하기 위해 게놈 조작된 iPSC를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화된 게놈 편집을 포함하는 얻은 게놈 조작된 iPSC는 기능적이고, 분화 강력하고, 동일한 기능적 게놈 편집을 포함하는 비만능 세포로 분화할 수 있다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 세포 또는 이의 집단을 제공하고, 여기서 (i) 세포는 유도 만능 세포(iPSC), 또는 iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포이고; 세포는 적어도 BCMA-CAR(키메라 항원 수용체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포는 조혈 세포이고, 조혈 세포는 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 더 긴 텔로머라제를 포함하거나; BCMA-CAR은 (i) T 세포 특이적임; (ii) NK 세포 특이적임; (iii) 표면 BCMA에 결합함; (iv) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1의 좌위 중 하나에서 삽입됨; 또는 (v) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨의 특징 중 적어도 하나를 갖고, 삽입은 좌위에서의 유전자의 발현을 선택적으로 넉아웃한다.
상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 (i) CD38 넉아웃; (ii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 B2M null 또는 저, 및 선택적으로 CIITA null 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두에서의 넉아웃의 발현 도입; (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체; (v) BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR); (vi) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체; (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 (ix) HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 및 변이체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가 중 하나 이상을 추가로 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR은 적어도 (a) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역; (b) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역; 또는 (c) 서열 번호 39 내지 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 분화 NK 또는 분화 T 세포이고, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선; (ii) 천연적 면역 세포의 내성의 증가; (iii) 세포독성의 증가; (iv) 종양 침투의 개선; (v) ADCC의 향상 또는 획득; (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; (ix) 종양 항원을 안정화하는 능력; 및 (x) 동족살해를 회피하는 능력의 특징 중 적어도 하나를 포함한다.
상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 (a) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P; (b) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인; (c) 비천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인; (d) 비천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인; (e) 비천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인; (f) 비천연적 자극 도메인; 및 (g) CD16으로부터 기원하지 않는 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 동일한 폴리펩타이드 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 기원한다. 일부 실시형태에서, (a) 비천연적 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D 또는 T 세포 수용체(TCR) 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (b) 비천연적 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4, 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (c) 비천연적 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나; (d) 비천연적 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비천연적 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비천연적 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 CAR을 추가로 포함하고, CAR은 (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이거나; (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이거나; (iii) 스위치 가능한 CAR이거나; (iv) 이합체화된 CAR이거나; (v) 분할 CAR이거나; (vi) 다중사슬 CAR이거나; (vii) 유도성 CAR; (viii) 선택적으로 별개의 작제물 또는 이중시스트론성 작제물에서 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체와 동시발현되거나; (xi) 선택적으로 별개의 작제물 또는 이중시스트론성 작제물에서 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 또는 관문 억제제와 동시발현되거나; (xii) CD19, MICA/B, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적임; 및/또는 (xiii) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAlX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2: epithelial glycoprotein2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM: epithelial cell adhesion molecule), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP: folate-binding protein), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR: acetylcholine receptor), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2: Ganglioside G2), 강글리오사이드 G3(GD3: Ganglioside G3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2: human Epidermal Growth Factor Receptor 2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2: Interleukin-13 receptor subunit alpha-2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR: kinase insert domain receptor), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM: L1 cell adhesion molecule), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1: melanoma antigen family A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA: prostate stem cell antigen), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72: tumor­ associated glycoprotein 72), TIM-3, TRBC1, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2: vascular endothelial growth factor R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1: Wilms tumor protein) 및/또는 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 TRAC 좌위에서 삽입된 CAR을 포함하고/하거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃된다.
사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 표면 발현된 단백질 복합체를 포함하는 상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포 표면 발현된 단백질 복합체는 (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 또는 이의 변이체; 및 이의 수용체 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 포함하거나; (b) (i) 자가 절단 펩타이드를 사용한 IL15 및 IL15Rα의 동시발현; (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질; (iii) 절두된(truncated) IL15Rα의 세포내 도메인과의 IL15/IL15Rα 융합 단백질; (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질; (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질; (vi) IL15와 공통 수용체 γC의 융합 단백질(여기서, 공통 수용체 γC는 천연적 또는 변형됨); 및 (vii) IL15Rβ의 동종이합체 중 적어도 하나를 포함하고, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현될 수 있고; 선택적으로, (c)는 일시적으로 발현된다.
상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 분화 NK 세포는 종양 부위에 T 세포를 동원하고/하거나 이동시킬 수 있고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에 종양 면역억제를 감소시킬 수 있다.
세포가 적어도 하나의 관문 억제제에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 포함하는 상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다.
세포가 iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포인 상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 분화 세포는 분화 CD34 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 다능성 전구 세포, 분화 T 세포 전구세포, 분화 NK 세포 전구세포, 분화 T 세포, 분화 NKT 세포, 분화 NK 세포 또는 분화 B 세포를 포함한다.
상기 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 (i) 하나의 안전 항구 좌위 또는 선택 유전자 좌위에서 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; (ii) 상이한 안전 항구 좌위 또는 2개 이상의 선택 유전자 좌위에서 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하는 IL15Δ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안전 항구 좌위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하고; 선택 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT 중 하나이고; 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합은 그 좌위에서의 유전자의 발현을 선택적으로 넉아웃한다. 일부 실시형태에서, TCR 좌위는 TCR 알파 또는 TCR 베타의 불변 영역이다.
다른 양태에서, 본 발명은 BCMA-CAR, 및 (i) CD38 넉아웃, (ii) 외인성 CD16 또는 이의 변이체, 및 (iii) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체 중 하나 이상을 포함하는 세포 또는 이의 집단을 제공하고; 세포는 면역 효과기 세포이다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR은 적어도 (a) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역; (b) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역; 또는 (c) 서열 번호 39 내지 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 이의 집단은 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선; (ii) 천연적 면역 세포의 내성의 증가; (iii) 세포독성의 증가; (iv) 종양 침투의 개선; (v) ADCC의 향상 또는 획득; (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상; (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상; (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선; (ix) 종양 항원을 안정화하는 능력; 및 (x) 동족살해를 회피하는 능력의 특징 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 계통 또는 NK 계통 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 기재된 것과 같은 세포, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료학적 용도를 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포, 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. 조성물이 관문 억제제를 포함하는 실시형태에서, 관문 억제제는 (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길항제; (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는 (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 조성물의 다양한 실시형태에서, 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함한다. 상기 조성물의 다양한 실시형태에서, 치료제는 감마 세크레타제 억제제(GSI)를 포함한다. 일반적으로, GSI는 노치와 같은 소정의 I형 통합 막 단백질의 가공에 관여된 프로테아제 복합체인 감마 세크레타제의 억제제이다. 상기 조성물의 다양한 실시형태에서, 항체는 (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1, 및/또는 항-CD38 항체; (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 알렘투주맙, 세르툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상; 또는 (c) 다라투무맙을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 입양 세포 치료를 위한 상기에 기재된 임의의 조성물의 치료학적 용도를 제공하고, 이러한 용도는 대상체에게 조성물을 도입함에 의하고, 대상체는 (i) 자가면역 장애; 조혈 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염; (ii) 염증성 자가면역 질환, 혈장 세포의 암 또는 B 림프구의 암; (iii) 자가반응성 혈장 세포 및/또는 자가반응성 기억 B 세포와 연관된 자가면역 질환; (iv) 전신 홍반 루푸스(SLE) 또는 류마티스성 관절염, 다발성 골수종, 형질세포종, 발데스트롬 거대글로불린혈증, 혈장 세포 백혈병 또는 호지킨병; 또는 (v) 다발성 골수종을 갖는다. 이와 같이, 본 발명은 (i) 자가면역 장애; 조혈 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염; (ii) 염증성 자가면역 질환, 혈장 세포의 암 또는 B 림프구의 암; (iii) 자가반응성 혈장 세포 및/또는 자가반응성 기억 B 세포와 연관된 자가면역 질환; (iv) 전신 홍반 루푸스(SLE) 또는 류마티스성 관절염, 다발성 골수종, 형질세포종, 발데스트롬 거대글로불린혈증, 혈장 세포 백혈병 또는 호지킨병; 또는 (v) 다발성 골수종을 치료하기 위한 약제에서 상기에 기재된 임의의 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 기재된 것과 같은 분화 세포의 제조 방법을 제공하고, 제조 방법은 iPSC를 분화시키는 단계를 포함하고, iPSC는 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 (i) CD38 넉아웃; (ii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 B2M null 또는 저, 및 선택적으로 CIITA null 또는 저; (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두에서의 넉아웃의 발현 도입; (iv) 고친화성 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체; (v) BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR); (vi) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체; (vii) 본원에 제공된 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나; (viii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및 (ix) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가 중 하나 이상을 포함한다.
분화 세포를 제조하는 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 넉아웃하도록; 그리고 선택적으로 (i) CD38을 넉아웃하도록; 또는 (ii) B2M 및 CIITA를 넉아웃하도록, 하나의 또는 둘 모두의 CD58 및 CD54를 넉아웃하도록, 또는 HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 외인성 CD16 또는 이의 변이체, 제2 CAR, 및/또는 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체의 발현을 도입하도록 클론성 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 분화 세포의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입-결실(in/del)을 포함하고, 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 클론성 iPSC의 CRISPR 매개된 편집을 제공하고, 편집은 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 넉인을 포함하고, 편집된 클론성 iPSC는 본원에 제공된 것과 같은 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 클론성 iPSC의 편집은 CD38의 넉아웃을 추가로 포함하거나, BCMA-CAR은 (i) T 세포 특이적임; (ii) NK 세포 특이적임; (iii) 세포 표면 BCMA에 결합함; (iv) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역을 포함함; (vi) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역을 포함함; (vii) 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함함; 및 (viii) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨의 특징 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 삽입은 좌위에서의 유전자의 발현을 넉아웃한다. 일부 실시형태에서, 편집은 BCMA-CAR 또는 TCR 좌위의 불변 영역에서의 제2 CAR의 삽입을 추가로 포함하고/하거나, CAR은 TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료 중인 대상체에게 BCMA-CAR, CD38 넉아웃, 및 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하는 효과기 세포를 투여하는 단계를 포함하고, BCMA-CAR은 (i) T 세포 특이적임; (ii) NK 세포 특이적임; (iii) 세포 표면 BCMA에 결합하고 이를 안정화시킴; (iv) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역을 포함함; (vi) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역을 포함함; (vii) 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함함; 및 (viii) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨의 특징 중 적어도 하나를 갖고, 여기서 삽입은 좌위에서의 유전자의 발현을 넉아웃한다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포를 포함하는 분화 조혈 세포를 포함하고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 (i) B2M 및 CIITA 넉아웃; (ii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54 중 하나 또는 둘 모두의 넉아웃; (iii) 제2 CAR, 및/또는 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체의 발현 도입; 및/또는 (iv) 본원에 제공된 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항-CD38 항체 및/또는 감마 세크레타제 억제제(GSI)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 BCMA-CAR, CD38 넉아웃, 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하고, GSI와 접촉되었거나 접촉된다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 다발성 골수종의 재발성 또는 불응성 유형이다.
본원에 제공된 것과 같은 조성물 및 방법의 다양한 목적 및 이점은 동반된 도면과 함께 취해져 하기 설명으로부터 명확해질 것이고, 이는 예시 및 예, 본 발명의 소정의 실시형태의 방식으로 기재된다.
도 1은 iPSC 유래 세포에서 세포 표면 발현된 사이토카인을 위한 여러 작제물 설계의 그래프 표시이다. IL15는 다른 바람직한 사이토카인으로 대체될 수 있는 예시적인 예로서 사용된다.
도 2a 내지 도 2d는, CD38-/-Transgene+ 다능 줄기 세포 및 이로부터 유래된 효과기 세포를 생성하기 위해 외인성 프로모터 또는 CD38 내인성 프로모터(B 및 D 대 A 및 C)에 의해 유도된, 하나 이상의 전이유전자(A 및 B 대 C 및 D)를 갖는 CD38 표적화 전이유전자 넉인 작제물의 다양한 조성을 예시한다.
도 3은 작제물 및 이의 변이체를 사용하여 조작된 다능 줄기 세포로부터 유래된 CD38-/-CD16 IL15 효과기 세포를 생성하기 위한 외인성 프로모터에 의해 유도된 전이유전자를 갖는 CD38 표적화 IL15/IL15ra-2A-hnCD16 넉인 작제물에 포함된 예시적인 핵산 서열을 보여준다.
도 4는 작제물 및 이의 변이체를 사용하여 조작된 다능 줄기 세포로부터 유래된 CD38-/-CD16+ IL15+ 효과기 세포를 생성하기 위한 CD38 내인성 프로모터에 의해 유도된 전이유전자를 갖는 CD38 표적화 IL15/IL15ra-2A-hnCD16 넉인 작제물에 포함된 예시적인 핵산 서열을 보여준다.
도 5는 DAP10이 293T 세포에서 BCMA-CAR 표면 발현을 용이하게 한다는 것을 보여준다.
도 6은 BCMA-CAR 표면 발현이 DAP10 발현의 존재 하에서든 또는 아니든 조작된 iPSC에서 검출되지 않는다는 것을 보여준다.
도 7a 내지 도 7c는 각각의 표시된 iNK 세포주에서의 BCMA-CAR 및 IL15Δ의 표면 발현을 보여주고, DAP10은 검출 가능한 표면 발현이 없음을 제외하고는 동일한 CAR을 포함하는 iPSC로부터 분화된 NK 세포에서 BCMA-CAR 표면 발현에 영향을 미치지 않는다.
도 8은 유세포분석법에 의해 결정된 텔로미어 길이의 그래프 표시이고, iPSC로부터의 성숙 분화 NK 세포는 성체 말초혈 NK 세포와 비교하여 더 긴 텔로머를 유지한다.
도 9는 표시된 것과 같은 iNK 세포주에서의 BCMA-CAR 표면 발현을 도시한다.
도 10은 BCMA-CAR 발현 T 세포가 4시간 사멸 검정에서 특이적 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 11은 BCMA 특이적 CAR 및 다라투무맙이 BCMA-CAR, IL15Δ, CD38 null 및 hnCD16을 포함하는 다중-항원 표적화 iNK 세포에 의한 다발성 골수종 암 세포의 효과적인 제거를 위해 48시간 사멸 검정에서 상호작용한다는 것을 보여준다.
도 12a 내지 도 12b는 다라투무맙과 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 세포의 조합이 다발성 골수종의 파종성 마우스 모델에서 종양 부담을 제거한다는 것을 보여준다. 5 x105개의 MM.1S-루시퍼라제(MM.1S-luc) 세포는 면역손상된 NSG 마우스로 I.V. 주사되었다. 2일 후, 마우스는 비치료되거나 NK 세포 지속성을 지지하도록 제1 주 동안 마우스에 hIL-15의 3개의 I.V. 주사(5 μg)에 의해 단독으로 또는 1 x 107개의 상기 iNK 세포와 조합되어 200 μg의 다라투무맙 (Dara)으로 치료되었다. 도 12a는 대표적인 생물발광 영상을 보여주고, 도 12b는 그룹마다 n=10 마우스에 대한 누적 데이터가 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 세포의 생체내 효능을 입증한다는 것을 보여준다.
도 13은 iNK 세포가 CAR 매개된 기전 및 ADCC 기전 둘 모두를 통해 BCMA+ 다발성 골수종 종양 세포주를 효과적으로 표적화한다는 것을 보여준다. 2 ug/ml의 다라투무맙의 첨가와 함께 또는 이것 없이 3:1의 효과기:표적 비에서 (A) RPMI-8266 및 (B) U266 다발성 골수종 종양 계통에 대한 FT576의 세포독성. 샘플은 37℃에서 4시간 동안 항온처리되고, 표적 세포 아폽토시스는 유세포분석법에 의해 평가되었다. BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 세포는 CAR 발현이 결여된 iNK 세포와 비교하여 다라투무맙의 부재 하에 향상된 세포독성을 나타냈고, 추가 ADCC가 다라투무맙의 존재 하에 세포 유형 둘 모두에 대해 관찰되었다. 막대의 각각의 쌍에서, 비-CAR 대조군은 왼쪽 막대이다.
도 14는 CAR 음성 모 세포와 비교하여 1:1의 E:T 비에서 효과기 세포로서 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 세포를 사용한 다라투무맙의 존재 또는 부재 하의 MM.1S 세포에 대해 수행된 재자극 세포독성 검정의 실시예 결과를 보여준다. X축은 12 단위 증분으로 예시된다. Y축은 0.5 단위 증분으로 예시된다.
도 15는 CAR 및 CD16 자극에 대한 반응에서 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 세포의 사이토카인 생성을 보여준다.
도 16은 동일한 사이토카인 치료가 있는 또는 이것이 없는 CAR T 세포와 비교하여 외인성 사이토카인 지지체의 존재 또는 부재 하에 MM.1S-Luc 세포가 이식되고 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 효과기 세포의 다중 용량으로 치료된 NSG 마우스의 실시예 BLI 영상을 보여준다.
도 17은 감마 세크레타제 억제제가 BCMA-CAR/IL15Δ/CD38 null/hnCD16 효과기 세포 생체내 효능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 비반응된 마우스는 파선을 갖는 개방 정사각형 기호로 표시되지만, 이식되지 않은 대조군 마우스는 개방 기호 및 파선으로 표시된다.
iPSC(유도 만능 줄기 세포)의 게놈 변형은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 게놈 조작된 iPSC에서의 외인성 유전자 발현은 대개 원래의 게놈 조작된 iPSC의 연장된 클론 확장 후, 세포 분화 후 및 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 세포로부터 탈분화된 세포 유형에서 유전자 침묵화 또는 유전자 발현 감소와 같은 문제점에 부딪친다. 다른 한편, T 세포 또는 NK 세포와 같은 일차 면역 세포의 직접적인 조작은 도전적이고, 입양 세포 치료를 위해 조작된 면역 세포의 준비 및 전달에 대한 장애물을 나타낸다. 본 발명은 비제한적인 예로서 HSC(조혈 줄기 세포 및 전구 세포), T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포를 포함하는 iPSC 분화 세포로, 생착, 수송, 호밍, 이동, 세포독성, 생존능력, 유지, 확장, 수명, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간과 관련한 개선된 치료 특성 개선을 제공하는, 자살 유전자 및 다른 기능적 양상을 포함하는 하나 이상의 외인성 유전자를 안정하게 통합하기 위한 효율적이고 신뢰성 있고 표적화된 접근법을 제공한다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 연결되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 흔히 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 맥락에 의해 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다.
본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않고 그러므로 변할 수 있다고 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 이는 청구항에 의해 오로지 한정된다.
본원에 사용된 "일(a)", "하나(an)" 및 "이(the)"라는 관사는 본원에서 그 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두, 또는 임의의 이들의 조합 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 대안의 하나 또는 둘 모두 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 약 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "본질적으로"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 비교하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 이보다 높은 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 기준 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 대략 동일한 분량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"이라는 용어는 상호교환 가능하고, 세포 집단 또는 배양 배지와 같은 조성을 기술하도록 사용될 때 특별 물질 또는 이의 원천이 없는, 예컨대 특별 물질 또는 이의 원천이 95% 없거나, 96% 없거나, 97% 없거나, 98% 없거나, 99% 없거나, 종래의 수단에 의해 측정된 것처럼 검출 불가능한 조성을 지칭한다. 조성에서 소정의 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성에 포함되지 않거나, (2) 기능적으로 불활성이지만 낮은 농도로 조성에 포함됨을 의미한다. 유사한 의미는 "부재"라는 용어에 적용될 수 있고, 여기서 조성의 특정 물질 또는 이의 원천의 부재를 지칭한다.
본 명세서에 걸쳐, 맥락이 달리 요하지 않는 한, "포함한다", "포함한" 및 "포함하는"이라는 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 배제가 아니라 기술된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹의 포함을 함축하는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, "포함한다", "갖는다", "함유한다" 및 "수반한다"라는 용어는 동의어로 사용된다.
"이루어진"에 의해 "이루어진"이라는 구절에 뒤따르는 어떤 것이든 이것을 포함하고, 이것으로 제한됨을 의도된다. 이와 같이, "이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"에 의해 그 구절 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에 기재된 활성 또는 작용과 상호작용하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨이 의도된다. 이와 같이, "본질적으로 이루어진"이라는 구절은 열거된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이지 않고, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 아닌지에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 걸쳐 "하나의 실시형태", "일 실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "소정의 실시형태", "추가의 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 그 실시형태와 연관되어 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 걸쳐 다양한 위치에서의 상기의 구절의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 지칭할 필요는 없다. 더욱이, 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 특정한 특성, 구조 또는 특징이 조합될 수 있다.
"생체외"라는 용어는 일반적으로 바람직하게는 자연 조건의 최소 변경으로 유기체 밖의 인공 환경에서 살아 있는 조직에서 또는 상에서 수행된 실험 또는 측정과 같은 유기체 밖에서 발생하는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 보통 멸균 조건 하에 통상적으로 수시간 또는 약 24시간 이하 동안이지만 상황에 따라 48시간 또는 72시간 또는 더 긴 기간 동안 유기체로부터 취하고 실험실 장치에서 배양된 살아 있는 세포 또는 조직을 수반한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 생체외 처리를 위해 수집되고 동결되고 나중에 해동된다. 살아 있는 세포 또는 조직을 사용하여 수일보다 길게 지속하는 조직 배양 실험 또는 절차는 통상적으로 "시험관내"인 것으로 여겨지지만, 소정의 실시형태에서 이 용어가 생체외와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
"생체내"라는 용어는 일반적으로 유기체 내에서 발생하는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 효능의 증가" 또는 "발생 효능의 증가"라는 용어는 세포의 효능을 증가시키는 방법 또는 덜 분화된 상태로 세포를 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 세포 효능이 증가된 세포는 비재프로그래밍된 상태의 동일한 세포와 비교하여 발달 가소성이 더 높다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 바꾸어 말하면, 재프로그래밍된 세포는 비재프로그래밍된 상태의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태로 있는 것이다.
본원에 사용된 "분화"라는 용어는 비특수화된("비결정된") 세포 또는 덜 특수화된 세포가 예를 들어 혈액 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화 유도된 세포는 세포의 계통 내에 보다 특수화된("결정된") 위치에서 취해진 것이다. "결정된(committed)"이라는 용어는, 분화의 과정에 적용될 때, 정상 상황 하에서 이것이 특정한 세포 유형 또는 세포 유형의 하위집단으로 계속해서 분화하고, 정상 상황 하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 지점으로 분화 경로에서 진행된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 "만능(pluripotent)"이라는 용어는 신체 또는 체세포(즉, 고유배)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽의 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기 세포의 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 생성할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능인 세포(예를 들어, 외배반 줄기 세포 또는 EpiSC)로부터 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기 세포)를 생성할 수 있는 보다 원시인, 보다 만능인 세포에 이르는 발생 가능성의 연속체이다.
본원에 사용된 "유도 만능 줄기 세포" 또는 iPSC와 같은 용어는, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 모든 3개의 배엽 또는 진피 층의 조직으로 분화할 수 있는 세포로 유도되거나 변경되는, 즉 재프로그래밍되는, 분화된 성체, 신생아 또는 태아 세포로부터, 줄기 세포가 생산된다는 것을 의미한다. 생산된 iPSC는 자연에서 발견되므로 세포라 칭하지 않는다.
본원에 사용된 "배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 자연 발생 만능 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 만능성이고, 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 3개의 주요 배엽의 모든 분화체로 발생 동안 생긴다. 이들은 배아외 막 또는 태반에 기여하지 않고, 즉 전능성이 아니다.
본원에 사용된 "다능성 줄기 세포"라는 용어는 모든 3개는 아니지만 1개 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 이와 같이, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"라 칭할 수 있다. 다능성 세포는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 예를 들어 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 다른 계통의 세포가 아니라 소정의 계통에서의 세포의 많은 유형을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 많은 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 이것은 뉴런을 형성하지는 않는다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능보다 발생 가능성의 정도가 덜한 세포의 상태를 지칭한다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가하여 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기 세포 형태; (ii) 비제한된 자가 재생에 대한 가능성; (iii), 비제한적인 예로서 SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하는 만능 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모든 3개의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화시키는 능력; (v) 3개의 체세포 계통으로 이루어진 사합체 형성; 및 (vi) 이들 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이전에 후기 배반포의 외배반 줄기 세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 상태 또는 "준안정" 상태 및 초기/착상전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미경험" 상태 또는 "기초" 상태의 2가지 유형의 만능성은 기재되어 있다. 만능 상태 둘 모두가 상기 기술된 것과 같은 특징을 나타내지만, 미경험 상태 또는 기초 상태는 (i) 암컷 세포에서의 X-염색체의 예비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존기간; (iii) DNA 메틸화의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에서 H3K27me3 억압적 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 프라이밍된 상태의 만능 세포에 대한 분화 마커의 발현 감소를 추가로 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포로 도입되고, 발현되고 이후 생성된 만능 세포로부터 침묵화되거나 제거되는 세포 재프로그래밍의 표준 방법론은 일반적으로 만능성의 프라이밍된 상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에 외인성 전이유전자 발현이 유지되지 않으면 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 있고, 여기서 기초 상태의 특징이 관찰된다.
본원에 사용된 "만능 줄기 세포 형태"라는 용어는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태학적 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비율로 형상이 원형이고 소형이라는 것, 주목할만한 핵소체 존재 및 통상적인 세포간 간격을 특징으로 한다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 임의의 동물, 바람직하게는 인간 환자, 가축 또는 다른 사육동물을 지칭한다.
"만능성 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 만능성 인자는 제한 없이 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 소분자를 포함한다. 예시적인 만능성 인자는 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍제를 포함한다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지들", "배양 배지들"(각각의 경우에 단수형 "배지"), "보충제" 및 "배지 보충제"는 세포 배양물을 배양하는 영양적 조성물을 지칭한다.
"배양한다" 또는 "유지한다"는 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체의 밖에서 세포를 지속시키고/시키거나, 전파(성장)시키고/시키거나, 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지"는 영양소, 호르몬 및/또는 세포를 전파시키고/시키거나 지속시키는 것을 돕는 다른 인자의 원천으로서 배양 배지를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 "중배엽"이라는 용어는 초기 배아발생 동안 생기고, 순환계의 혈액 세포, 근육, 심장, 진피, 골격, 및 다른 지지 조직 및 결합 조직을 포함하는 다양한 특수화된 세포 유형을 생성시키는 3개의 배엽 중 하나를 지칭한다.
본원에 사용된 "한정적 동형유전자성 내피세포"(HE: hemogenic endothelium) 또는 "만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포"(iHE)라는 용어는 내피 조혈 전환(endothelial-to-hematopoietic transition)이라 칭하는 과정에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 생성시키는 내피 세포의 하위집단을 지칭한다. 배아에서의 조혈 세포의 발생은 측판 중배엽으로부터 혈관아세포를 통해 한정적 동형유전자성 내피세포 및 조혈 전구세포로 순차적으로 진행한다.
"조혈 줄기 세포 및 전구 세포", "조혈 줄기 세포", "조혈 전구 세포" 또는 "조혈 전구 세포"라는 용어는 조혈 계통에 대해 결정되지만 추가의 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 지칭하고, 다능성 조혈 줄기 세포(조혈세포), 골수성 전구세포, 거핵세포 전구세포, 적혈구 전구세포 및 림프구성 전구세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(HSC)는 골수성 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구성 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 생성시키는 다능성 줄기 세포이다. 본원에 사용된 "한정적 조혈 줄기 세포"라는 용어는 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함하는 성숙 골수성 세포 및 림프구성 세포 유형 둘 모두를 생성할 수 있는 CD34+ 조혈 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 또한 원시 적혈구, 거핵세포 및 대식세포를 생성하는 원시 조혈 세포의 다양한 하위집단을 포함한다.
본원에 사용된 "T 림프구" 및 "T 세포"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 흉선에서 성숙을 완료하고 신체에서의 특정 외래 항원의 확인 및 다른 면역 세포의 활성화 및 탈활성화를 포함하는 면역계에서 다양한 역할을 갖는 백혈구의 주요 유형을 지칭한다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어 일차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, 비제한적인 예로서 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초혈 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 말초혈 백혈구(PBL: peripheral blood leukocyte), 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte), 기억 T 세포, 미경험 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 등을 포함하는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 헬퍼 T 세포의 추가의 유형은 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 기억 T 세포의 추가의 유형은 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. T 세포는 또한 유전 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다. T 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 또한 분화될 수 있다.
"CD4+ T 세포"는 표면 상에 CD4를 발현하고 세포 매개된 면역 반응과 연관된 T 세포의 하위집단을 지칭한다. 이것은 IFN-감마, TNF-알파, IL2, IL4 및 IL10과 같은 사이토카인의 분비를 포함할 수 있는 자극 후 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는 T 림프구 상에서 분화 항원으로 기원상 정의되지만, 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 세포 상에서 또한 발견되는 55 kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직접합성 복합체: major histocompatibility complex) 클래스 II 제한된 면역 반응에서 관련 인식 요소로 관여하고 있다. 이것은 T 림프구에서 헬퍼/인듀서 하위집단을 한정한다.
"CD8+ T 세포"는 표면 상에 CD8을 발현하고, MHC 클래스 I-제한되고, 세포독성 T 세포로서 작용하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. "CD8" 분자는 흉선세포 및 세포독성 및 억제자 T 림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직접합성 복합체 클래스 I 제한된 상호작용에서 관련 인식 요소이다.
본원에 사용된 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"라는 용어는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 정의되는 말초혈 림프구의 하위집단을 지칭한다. 본원에 사용된 "적응성 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"라는 용어는 상호교환 가능하고, NKG2C 및 CD57 중 적어도 하나, 및 선택적으로 CD16을 발현하는 표현형적으로 CD3- 및 CD56+이지만, PLZF, SYK, FceRγ 및 EAT-2 중 하나 이상의 발현이 결여된 NK 세포의 하위집단을 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 억제성 KIR, NKG2A 및/또는 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 흐린 발현 또는 밝은 발현일 수 있다.
본원에 사용된 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"라는 용어는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 CD1d 제한된 T 세포를 지칭한다. NKT 세포는, 종래의 주요 조직접합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 검출하는 종래의 T 세포와 달리, 비전통적 MHC 분자인 CD1d에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - β 사슬(인간에서의 Vβ11)의 제한된 스펙트럼과 회합된 정규적 α-사슬(인간에서의 Vα24-Jα18)을 발현한다. 비전통적 또는 비-비변이체 II형 NKT 세포라 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성인 TCR αβ 용법을 디스플레이한다. I형 NKT 세포는 면역요법에 적합하다고 여겨진다. 적응성 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 및 CD56의 마커 중 적어도 하나 이상의 발현으로 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "단리된"이라는 용어 또는 기타는 이의 원래의 환경으로부터 분리된 세포 또는 세포의 집단을 지칭하고, 즉 단리된 세포의 환경은 "비단리된" 기준 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 적어도 하나의 성분이 실질적으로 없다. 상기 용어는 세포가 이의 자연 환경에서 발견되면서, 예를 들어 조직 또는 생검 샘플로부터 단리되면서 일부 또는 모든 성분들로부터 제거된 세포를 포함한다. 상기 용어는 세포가 비자연 발생 환경에서 발견되면서, 예를 들어 세포 배양물 또는 세포 현탁액으로부터 단리되면서 적어도 하나의, 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 또한 포함한다. 따라서, 단리된 세포는 세포가 자연에서 발견되면서 또는 비자연 발생 환경에서 성장하거나 저장되거나 존속하면서 다른 물질, 세포 또는 세포 집단을 포함하는 적어도 하나의 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 세포의 특정 예는 부분적으로 순수한 세포 조성, 실질적으로 순수한 세포 조성 및 비자연 발생인 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 환경에서 다른 물질 또는 세포로부터 원하는 세포 또는 이의 집단을 분리하여, 또는 환경으로부터 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 제거하여 단리된 세포를 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "정제한다"라는 용어 또는 기타는 순도의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%까지 증가할 수 있다.
본원에 사용된 "암호화하는"이라는 용어는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생긴 생물학적 특성을 지칭한다. 이와 같이, 유전자는 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 단백질을 생산하면 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록에 제공된 뉴클레오타이드 서열인 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된 비암호화 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화한다고 칭할 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내 어느 하나로 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"는 이것이 복제되고/되거나 발현될 수 있는 표적 세포에 대한 외래 유전 물질의 전달 또는 이동을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 전달되는 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 분자 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합일 수 있다. 벡터의 주요 유형은 플라스미드, 에포솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"통합"에 의해 작제물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 세포 게놈으로 안정하게 삽입된, 즉 세포의 염색체 DNA 내에 핵산 서열에 공유 연결됨이 의도된다. "표적화된 통합"에 의해 작제물의 뉴클레오타이드(들)가 예비선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 마토콘드리아 DNA로 삽입됨이 의도된다. 본원에 사용된 "통합"이라는 용어는 통합 부위에서의 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 결실과 함께 또는 이것 없이 작제물의 하나 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 삽입을 수반하는 과정을 추가로 지칭한다. 삽입 부위에서 결실이 있는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오타이드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는 기준 분자 또는 기준 활성은 숙주 세포 내로 도입되거나 이것에 대해 비천연적이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 숙주 유전 재료로의 암호화 핵산의 도입에 의해, 예컨대 숙주 염색체로의 통합에 의해 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전 재료로서 분자가 도입될 수 있다. 따라서, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 상기 용어는 세포로 발현 가능한 형태의 암호화 핵산의 도입을 지칭한다. "내인성"이라는 용어는 숙주 세포에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되면서 상기 용어는 외인적으로 도입되지 않고 세포 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 "관심 유전자" 또는 "관심 폴리뉴클레오타이드 서열"은 RNA로 전사되고 일부 경우에 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 생체내 폴리펩타이드로 번역되는 DNA 서열이다. 관심 유전자 또는 관심 폴리뉴클레오타이드는 원핵 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 관심 유전자는 miRNA, shRNA, 천연적 폴리펩타이드(즉, 자연에서 발견된 폴리펩타이드) 또는 이들의 단편; 변이체 폴리펩타이드(즉, 천연적 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 천연적 폴리펩타이드의 돌연변이체) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 치료학적 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 영상화 마커, 선택 가능한 마커 등을 암호화할 수 있다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 티민의 경우 우라실(U)인 4개의 뉴클레오타이드 염기로 구성된다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보좀, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 모두를 지칭한다.
본원에 사용된 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 상효교환 가능하게 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩타이드의 아미노산의 최대 수에 대해 제한이 없다. 본원에 사용된 상기 용어는 당해 분야에서 또한 흔히 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머라 칭하는 짧은 사슬과 당해 분야에서 일반적으로 폴리펩타이드 또는 단백질이라 칭하는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는, 다른 것들 중에서, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이합체, 이종이합체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
"작동적으로 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 그 암호화 서열 또는 기능적 RNA와 작동적으로 연결된다(즉, 암호화 서열 또는 기능적 RNA는 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 암호화 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 "유전 각인"이라는 용어는 원천 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료학적 속성에 기여하고, 원천 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC 유래 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전적 정보 또는 후성적 정보를 지칭한다. 본원에 사용된 "원천 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능 세포이고, 원천 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정한 세포 유형으로 더 분화할 수 있다. 원천 세포 유래 iPSC, 및 이로부터 분화된 세포는 맥락에 따라 때때로 총체적으로 "유래" 세포 또는 "분화" 세포라 칭한다. 예를 들어, 본 출원에 걸쳐 사용된 분화 효과기 세포, 또는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연적/천연적 원천으로부터 얻은 이의 일차 대응물과 비교하여 iPSC로부터 분화된 세포이다. 본원에 사용된 것처럼, 우선적 치료학적 속성을 부여하는 유전 각인(들)은 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 선택된 원천 세포의 재프로그래밍을 통해, 또는 게놈 편집을 이용하여 iPSC로 유전 변형된 양상의 도입을 통해 iPSC로 혼입된다. 특이적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 맥락으로부터 얻은 원천 세포의 양태에서, 우선적 치료학적 속성에 기인한 유전 각인은 보유 가능한 표현형, 즉 우선적 치료학적 속성을 나타내는 임의의 맥락 특이적 유전적 특이적 또는 후성적 특이적을 포함할 수 있고, 이는 확인되거나 확인되지 않은 기초하는 분자 사건과 무관하게 선택된 원천 세포의 분화 세포로 전달된다. 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적 원천 세포는 iPSC 및 유래된 조혈 계통 세포에서 보유 가능한 유전 각인을 포함할 수 있고, 유전 각인은 예를 들어 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 예비정렬된 단일특이적 TCR; 예를 들어 선택된 공여자에서 고친화성 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 동형접합성인 추적 가능하고 바람직한 유전 다형; 및 예비결정된 HLA 요건, 즉 증가된 집단을 갖는 일배체형을 나타내는 선택된 HLA 일치된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 것처럼, 우선적 치료학적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료학적 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성과 관련될 수 있다.
본원에 사용된 "향상된 치료 특성"이라는 용어는 동일한 일반 세포 유형의 통상적인 면역 세포와 비교하여 향상된 세포의 치료 특성을 지칭한다. 예를 들어, "향상된 치료 특성"을 갖는 NK 세포는 통상적인, 비변형된 및/또는 자연 발생 NK 세포와 비교하여 향상된, 개선된 및/또는 증강된 치료 특성을 보유할 것이다. 면역 세포의 치료 특성은 세포 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 면역 세포의 치료 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포의 유도 및 면역 조절; 화학요법과 같은 치료에 대한 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성에 의해 나타난다.
본원에 사용된 "인게이저"라는 용어는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구와 종양 세포 사이에 연결을 형성하고; 면역 세포를 활성화할 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 인게이저의 예는 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이적 살해 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다중특이적 살해 세포 인게이저, 또는 다수의 면역 세포 유형과 적합한 보편적 인게이저를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표면 트리거링 수용체"라는 용어는 면역 반응, 예를 들어 세포독성 반응을 촉발하거나 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 트리거링 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 트리거링 수용체는 효과기 세포의 천연 수용체 및 세포 유형과 독립적인 특정한 표적 세포, 예를 들어 종양 세포와 효과기 세포 사이의 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 결합을 용이하게 한다. 이 접근법을 이용하여 보편적 표면 트리거링 수용체를 포함하는 iPSC를 생성하고, 이후 보편적 표면 트리거링 수용체를 발현하는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 이러한 iPSC를 분화시킬 수 있다. "보편적"에 의해 표면 트리거링 수용체가 세포 유형과 무관하게 임의의 효과기 세포에서 발현되고 이를 활성화할 수 있고, 보편적 수용체를 발현하는 모든 효과기 세포가 인게이저의 종양 결합 특이성과 무관하게 표면 트리거링 수용체에 의해 인식 가능한 동일한 에피토프를 갖는 인게이저에 커플링되거나 연결될 수 있음이 의도된다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 인게이저는 보편적 표면 트리거링 수용체와 커플링하도록 사용된다. 이와 같이, 하나 또는 다수의 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정한 유형을 사멸하고, 일부 다른 경우에 종양의 2종 이상의 유형을 사멸하도록 결합될 수 있다. 표면 트리거링 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공자극 도메인 및 인게이저의 에피토프에 특이적인 에피토프 결합 영역을 포함한다. 이중특이적 인게이저는 일 말단에서 표면 트리거링 수용체의 에피토프 결합 영역에 특이적이고, 다른 말단에서 종양 항원에 특이적이다.
본원에 사용된 "안전성 스위치 단백질"이라는 용어는 잠재적인 독성 또는 달리 세포 치료의 불리한 효과를 방지하도록 설계된 조작된 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질 발현은 게놈으로 안전성 스위치 단백질을 암호화하는 유전자가 주로 혼입된 이식된 조작된 세포에 대한 안전성 우려를 해결하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 제어 조절은 가변적일 수 있고, 소분자 매개된 번역후 활성화 및 조직 특이적 및/또는 시간적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 것이다. 안전성 스위치는 아폽토시스의 유도, 단백질 합성의 억제, DNA 복제, 성장 정지, 전사 및 전사후 유전 조절 및/또는 항체 매개된 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 경우에, 안전성 스위치 단백질은 외인성 분자, 예를 들어 프로드럭에 의해 활성화되고, 이것은 활성화될 때 치료학적 세포의 아폽토시스 및/또는 세포사를 촉발한다. 안전성 스위치 단백질의 예는 자살 유전자, 예컨대 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7), 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, B 세포 CD20, 변형된 EGFR, 및 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 전략에서, 불리한 사건의 경우에 투여된 프로드럭은 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고 형질도입된 세포를 사멸한다.
본원에 사용된 "약제학적 활성 단백질 또는 펩타이드"라는 용어는 유기체에 대한 생물학적 효과 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적 활성 단백질은 질환에 대해 치유하는 치유력 있는 또는 일시적인 특성을 갖고, 질환의 중증도를 완화하거나 개선하거나 경감하거나 역전시키거나 축소하도록 투여될 수 있다. 약제학적 활성 단백질은 또한 예방적 특성을 갖고, 질환의 발생을 예방하거나 이것이 나온 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 축소하도록 사용된다. 약제학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적 활성 단편을 포함한다. 이것은 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적 활성 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 약제학적 활성 단백질이라는 용어는 또한 치료학적 이익을 제공하도록 협력하여 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적 활성 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "신호전달 분자"라는 용어는 세포 신호 유도를 조절하거나 이에 참여하거나 이를 억제하거나 활성화하거나 감소시키거나 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 유도는 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발하는 경로를 따른 단백질 복합체의 동원에 의한 화학 변형의 형태의 분자 신호의 전송을 지칭한다. 신호 전달 경로는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, G 단백질 커플링된 수용체 신호전달, 티로신 키나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드 개폐된 이온 채널 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP 의존적 경로 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "표적화 양상"이라는 용어는, 비제한적인 예로서 i) 이것이 고유한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련이 있는 항원 특이성, ii) 이것이 단일클론 항체 또는 이중특이적 인게이저와 관련이 있는 인게이저 특이성, iii) 형질전환된 세포의 표적화, iv) 암 줄기 세포의 표적화 및 v) 특이적 항원 또는 표면 분자의 부재 하의 다른 표적화 전략을 포함하는, 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진하도록 세포로 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 "특이적" 또는 "특이성"이라는 용어는 비특이적 결합 또는 비선택적 결합과 비교하여 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 인게이저의 능력을 지칭하도록 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "입양 세포 치료"라는 용어는 세포 기반 면역요법을 지칭하고, 이는 본원에 사용된 것처럼, 상기 수혈 전에 생체외 증식된, 유전 변형되거나 변형되지 않는 T 세포 또는 B 세포로서 확인된 자가유래 림프구 또는 동종이계 림프구의 수혈을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료학적으로 충분한 양"은 이의 의미 내에서 원하는 치료 효과를 제공한다고 칭해지는 특정한 치료학적 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 비독성이지만 충분하고/하거나 효과적인 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반 건강, 환자의 연령, 및 병태의 병기 및 중증도와 같은 인자에 따라 대상체마다 변할 것이다. 특정 실시형태에서, 치료학적으로 충분한 양은 치료되는 대상체의 질환 또는 병태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화하고/하거나, 감소하고/하거나 개선하기에 충분하고/하거나 효과적이다.
만능 줄기 세포의 분화는 배양 시스템의 변경, 예컨대 배양 배지에서의 자극 물질 또는 세포의 물리적 상태의 변경을 요한다. 대부분의 종래의 전략은 계통 특이적 분화를 개시하도록 흔하고 중요한 중간체로서 배양체(EB)의 형성을 이용한다. "배양체"는 이의 3차원 면적에서 많은 계통을 생성시키므로 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정을 통해, 통상적으로 수시간 내지 수일에, 단순한 EB(예를 들어, 분화하도록 유발된 응집된 만능 줄기 세포)는 계속해서 성숙하여 낭종성 EB로 발생하고, 이때에 통상적으로 수일 내지 수주에 이들은 더 처리되어 계속해서 분화한다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기 세포가 가깝게 근접하게 하여 EB 형성이 개시되고, 통상적으로 이는 만능 세포가 액체 액적에서 침전하게 하는 것, 세포를 "U" 바닥 웰-플레이트로 침전시키는 것 또는 기계적 아지테이션을 포함하는 여러 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진하기 위해, 만능 배양 유지 배지에서 유지된 응집체가 적절한 EB를 형성하지 않으면서, 만능 줄기 세포 응집체는 추가의 분화를 요한다. 이와 같이, 만능 줄기 세포 응집체는 선택된 계통에 대해 신호의 유발을 제공하는 분화 배지로 이동될 필요가 있다. 만능 줄기 세포의 EB 기반 배양은 통상적으로 EB 세포 클러스터 내의 적절한 증식으로 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)을 생성시킨다. 그러나, EB는 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 입증되었지만 환경으로부터의 분화 신호에 대한 3차원 구조에서의 세포의 불일치한 노출 때문에 변동적인 분화 상태의 이종성 세포를 생성시킨다. 게다가, EB는 생성하고 유지하기에 힘들다. 더욱이, EB를 통한 세포 분화는 보통의 세포 확장이 동반되고, 이는 낮은 분화 효율에 또한 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 구별되는 "응집체 형성"은 만능 줄기 세포 유래된 세포의 집단을 증식시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집체 기반 만능 줄기 세포 확장 동안, 배양 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집체의 크기를 증가시켜 더 응집체를 형성하고, 이 응집체는 배양물 내 세포 증식을 유지하고 세포수를 증가시키도록 일상적으로 더 작은 응집체로 기계적으로 또는 효소적으로 분리된다. 유지 배양에서 응집체 내에 배양된 세포는 EB 배양과 달리 만능성의 마커를 유지한다. 만능 줄기 세포 응집체는 분화를 유도하도록 추가의 분화 신호를 요한다.
본원에 사용된 "단층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉 "EB 형성"을 통한 분화와 구별되는 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단층 분화는 본원에 개시된 다른 이점들 중에서 분화 개시를 위한 EB 형성의 필요성을 피한다. 단층 배양이 EB 형성과 같은 배아 발생을 모방하지 않으므로, 특이적 계통에 대한 분화는 EB에서의 모든 3개의 배엽 분화와 비교하여 최소로 여겨진다.
본원에 사용된 "분리된" 세포는 다른 세포 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 방법 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내 응집하는 세포는 효소적으로 또는 기계적으로 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 분리되어 서로 분리될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시형태에서, 부착성 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 분리된다. 이에 같이 분리는 세포외 기질(ECM: extracellular matrix)과 기질(예를 들어, 배양 표면) 사이의 세포 상호작용을 파괴하거나, 세포들 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "지지 세포" 또는 "피더"는 지지 세포가 제2 세포 유형의 지지를 위해 자극, 성장 인자 및 영양소를 제공하면서 제2 유형의 세포가 성장, 증식 또는 분화할 수 있는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 동시배양되는 하나의 유형의 세포를 지칭하는 용어이다. 지지 세포는 선택적으로 이것이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 유래한다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 인간 세포의 소정의 유형은 마우스 배아 섬유아세포 또는 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 일차 배양에 의해 지지될 수 있다. 다른 예에서, 말초혈 유래된 세포 또는 형질전환된 백혈병 세포는 자연 살해 세포의 확장 및 성숙을 지지한다. 지지 세포는 통상적으로 이것이 지지하는 세포를 과성장시키는 것을 방지하도록 조사 또는 미토마이신과 같은 유사분열제 길항제에 의한 처리에 의해 다른 세포와 동시배양될 때 불활성화될 수 있다. 지지 세포는 내피 세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 상기에 제한됨이 없이, 하나의 특정한 지지 세포 유형은 인간 피부 섬유아세포와 같은 인간 피더일 수 있다. 다른 지지 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF: mouse embryonic fibroblast)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 지지 세포는 부분적으로 만능성을 유지하고, 소정의 계통에 대한 분화를 지시하고, 증식 역량을 향상시키고, 효과기 세포와 같은 특수화된 세포 유형에 대한 성숙을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "피더 비함유"(FF) 환경은 본질적으로 피더 또는 기질 세포가 없고/없거나, 지지 세포의 배양에 의해 예비컨디셔닝되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "예비컨디셔닝된" 배지는 적어도 1일 동안과 같은 시간 기간 동안 배지 내에 지지 세포가 배양된 후 수확된 배지를 지칭한다. 예비컨디셔닝된 배지는 배지에서 배양된 지지 세포에 의해 분비된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 많은 매개자 물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 피더 비함유 환경은 피더 또는 기질 세포 둘 모두가 없고, 또한 지지 세포의 배양에 의해 예비컨디셔닝되지 않는다.
iPSC, 및 이로부터 분화된 유래된 비만능 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비만능 세포 및 이로부터 재프로그래밍된 유래된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 맥락에서 사용되는 것과 같은 "기능적"은 (1) 유전자 수준에서는 -- 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해, 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 달성되는, 원하는 세포 발생 단계에서의 성공적인 넉인된, 넉아웃된, 넉다운된 유전자 발현, 형질전환 또는 제어된 유전자 발현, 예컨대 유도성 발현 또는 시간적 발현; 또는 (2) 세포 수준에서는 ― (i) 직접적인 게놈 편집을 통해 상기 세포에서 얻은 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 이의 재프로그래밍을 통한 "계대배양"을 통해 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 변형; (iii) 상기 세포의 초기 발생 단계에 오직 생기는, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서 오직 생기는 유전자 발현 변형의 결과로서 상기 세포에서의 하향 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구세포 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상된 또는 새로 획득된 세포 기능 또는 속성을 통한, 세포 기능/특징의 성공적인 제거, 부가 또는 변경을 지칭한다.
HLA-클래스 I 결핍, 또는 HLA-클래스 II 결핍, 또는 둘 모두를 포함하는 "HLA 결핍"은, 줄어들거나 감소된 수준이 다른 세포 또는 합성 방법에 의해 천연적으로 검출 가능한 수준보다 낮도록, HLA 클래스 I 단백질 이종이합체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이합체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 더 이상 유지하지 않거나 이의 감소된 수준을 갖는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "변형된 HLA 결핍 iPSC"는, 비전통적 HLA 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113, 및 PDL1과 같은, 비제한적인 예로서 개선된 분화 가능성, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생성물(자가분비 또는 주변분비), 화학주성 및 세포 독성과 관련되는 유전자 발현 단백질을 도입하여 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"인 세포는 iPSC 이외의 세포를 또한 포함한다.
FcR로 축약된 "Fc 수용체"는 이것이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, IgG인 항체의 가장 흔한 종류에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 칭하고, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 칭하고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 칭한다. FcR의 종류는 이들을 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해 또한 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 이의 상이한 분자 구조로 인해 이의 항체 친화성가 다른 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)인 여러 구성원을 포함한다.
CFcR로 축약된 "키메라 Fc 수용체"는 비천연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인으로 변형되거나 대체된 이의 천연적 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 조작된 Fc 수용체를 기재하도록 사용된 용어이다. 키메라 Fc 수용체의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자극 도메인은, 비천연적인 막관통 도메인 및 신호전달 도메인의 하나 또는 둘 모두를 갖는 것 이외에도, 수용체의 트리거링 시 세포 활성화, 확장 및 기능을 향상시키도록 조작된 Fc 수용체의 세포내 부분으로 도입될 수 있다. 키메라 Fc 수용체는, 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 달리, 표적화된 세포가 근처에 가깝게 있게 하거나 하지 않으면서 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역, 또는 세포 기능을 활성화하고 인게이저 또는 결합 분자에 포함된 Fc 영역에 결합한다. 예를 들어, Fcγ 수용체는 세포외 도메인에서 IgG의 결합에 반응하여 CFcR을 생성하는 세포내 영역에서 선택된 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하도록 조작될 수 있다. 일 예에서, CFcR은 이의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 대체하여 Fcγ 수용체인 CD16을 조작하여 생산된다. CD16 기반 CFcR의 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해, CD64의 세포외 도메인 또는 CD16의 고친화성 변이체(예를 들어 F176V)가 혼입될 수 있다. 고친화성 CD16 세포외 도메인이 관여된 CFcR의 일부 실시형태에서, 197번 위치에서 세린을 포함하는 단백분해 절단 부위는 수용체의 세포외 도메인에서 비절단성이도록, 즉 분비로 처리되지 않도록 제거되거나 대체되고, 이로써 CD16 기반 CFcR을 얻는다.
FcγR 수용체인 CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. 본원에 사용된 "고친화성 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화성 비절단성 CD16(hnCD16)"은 CD16의 천연 변이체 또는 비천연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화성을 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 분비로 처리된다. F176V 및 F158V는 높은 친화성을 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체이다. 변경되거나 제거된 막 근위 영역(189번 내지 212번 위치)에서 절단 부위(195번 내지 198번 위치)를 갖는 CD16 변이체는 분비로 처리되지 않는다. 절단 부위 및 막 근위 영역은 국제공개 WO 2015148926호에 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. CD16 S197P 변이체는 CD16의 조작된 비절단성 버전이다. F158V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 CD16 변이체는 높은 친화성을 갖고 비절단성이다. 다른 예시적인 고친화성 및 비절단성 CD16(hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개의 엑손 중 하나 이상으로부터 기원한 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD16이다.
I. 향상된 특성을 갖는 입양 세포 치료에 유용한 세포 및 조성물
본원에는 분화 세포의 치료 특성을 향상시키면서 iPSC의 분화 효능 및 iPSC 및 이의 분화 세포의 세포 발생 생물학에 영향을 미치지 않으면서 클론 iPSC의 조절 회로를 체계적으로 조작하기 위한 전략이 제공된다. 분화 세포는 기능적으로 개선되고, 게놈 조작을 통해 iPSC의 수준에서 세포로 도입되는 선택적 양상의 조합 후 입양 세포 치료에 적합하다. 본 발명 이전에는 하나 이상의 제공된 유전 편집을 포함하는 변경된 iPSC가 세포 발생에 들어가는 능력 및/또는 조절된 활성을 보유하면서 기능적인 분화된 세포를 성숙시키고 생성하는 능력을 여전히 갖는지가 불확실하였다. iPSC로부터의 유도 세포 분화 동안 예상치 못한 실패는 비제한적인 예로서 발생 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 결여, HLA 복합체 제시에 대한 요건, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 분비, 및 세포에서 표현형적 변화 및/또는 기능적 변화가 가능하게 하는 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하는 양태 때문이었다. 본 출원은 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 선택된 게놈 변형이 iPSC 분화 효능에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 조작된 iPSC로부터 유래된 기능적인 효과기 세포가 iPSC 분화 후에 효과기 세포에 보유된 개별 게놈 변형 또는 조합된 게놈 변형에 기인한 향상된 및/또는 획득된 치료 특성을 갖는다는 것을 보여주었다.
1. BCMA-CAR
하나 이상의 CAR 설계는 유전 조작된 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포에 적용 가능할 수 있다. 키메라 항원 수용체인 CAR은 항원 인식 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 포함하는 엑토도메인을 일반적으로 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드 또는 리더 서열 및/또는 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도도메인은 CAR을 발현하는 효과기 세포를 활성화하는 신호전달 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 질환 또는 병원균과 연관된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 연관된 항원은 종양 항원이고, 종양은 액체 종양 또는 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 상기 CAR을 발현하는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포를 활성화하는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, CAR은 NK 특이적 신호전달 성분의 포함에 특이적인 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, CAR은 NKT 특이적 신호전달 성분의 포함에 특이적인 NKT 세포이다. 소정의 실시형태에서, 상기 T 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래되고, 분화 T 세포는 T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 NK 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 상기 NKT 세포는 CAR을 발현하는 iPSC로부터 유래된다.
소정의 실시형태에서, 상기 항원 인식 영역은 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 항원 결합 단일 사슬 가변 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다.
일 예에서, 본 명세서는 종양 항원 BCMA(B 세포 성숙 항원)를 표적화하는 항원 인식 영역을 포함하는 CAR을 제공한다. BCMA는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 17(TNFRSF17 또는 CD269)에서 막관통 당단백질이고, 정상 혈장 세포를 제외한 다른 정상 조직에서가 아니라 모든 환자 다발성 골수종 세포에서 상당히 더 높은 수준으로 발현된다. BCMA 표적화 CAR의 일부 실시형태에서, 항원 인식 영역은 CD269의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 scFV이다. 일 실시형태에서, scFV는 서열 번호 33, 서열 번호 35 및 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄의 가변 영역(VH) 및 서열 번호 34, 서열 번호 36 및 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. CAR 구성을 위한 BCMA scFV의 일 실시형태에서, scFV는 각각 서열 번호 33 및 서열 번호 34; 또는 각각 서열 번호 35 및 서열 번호 36, 또는 서열 번호 37 및 서열 번호 38과 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 VH 및 VL을 포함한다. BCMA scFV의 일 실시형태에서, scFV는 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된다. 본 명세서의 다른 양태는 유전 조작된 iPSC 및 이의 분화 세포를 제공하고, 상기 세포는 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 다른 실시형태에서, 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포는 NKT 세포이다. 일부 다른 실시형태에서, 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포는 자연 원천의 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는다. 일 예에서, 본 명세서는 종양 항원 BCMA를 표적화하는 항원 인식 영역을 포함하는 CAR을 제공한다.
서열 번호 33
Figure pct00001
(BCMA scFV 중쇄-1 (VH))
서열 번호 34
Figure pct00002
(BCMA scFV 경쇄-1 (VL))
서열 번호 35
Figure pct00003
(BCMA scFV 중쇄-2 (VH))
서열 번호 36
Figure pct00004
(BCMA scFV 경쇄-2 (VL))
서열 번호 37
Figure pct00005
(BCMA scFV 중쇄-3 (VH))
서열 번호 38
Figure pct00006
(BCMA scFV 경쇄-3 (VL))
서열 번호 39
Figure pct00007
(BCMA scFV-1; VH- 링커 -VL; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 40
Figure pct00008
(BCMA scFV-2; VL- 링커 -VH; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 41
Figure pct00009
(BCMA scFV-3; VH- 링커 -VL; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 42
Figure pct00010
(BCMA scFV-4; VL- 링커 -VH; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 43
Figure pct00011
(BCMA scFV-5; VH- 링커 -VL; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 44
Figure pct00012
(BCMA scFV-6; VL- 링커 -VH; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
본 명세서의 다른 양태에서, 적어도 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전 조작된 iPSC 및 이의 분화 세포는 BCMA 이외의 추가 CAR 표적화 항원을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가 CAR은 종양 항원 MICA 및 MICB(MICA/B)를 표적화한다. MICA/B 표적화 CAR의 일부 실시형태에서, 항원 인식 영역은 MICA 및 MICB의 보존된 α3 도메인에 특이적으로 결합하는 scFV이다. 일 실시형태에서, scFV는 서열 번호 45와 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 표시된 중쇄의 가변 영역 및 서열 번호 46과 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 표시된 경쇄의 가변 영역을 포함한다. MICA/B scFV의 일 실시형태에서, scFV는 서열 번호 47과 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 표시된다. MICA/B scFV의 다른 실시형태에서, scFV는 서열 번호 48과 적어도 약 99%, 약 98%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85% 또는 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 표현된다.
서열 번호 45
Figure pct00013
(118AA. MICA/B scFV 중쇄(HC))
서열 번호 46
Figure pct00014
(107AA. MICA/B scFV 경쇄(LC))
서열 번호 47
Figure pct00015
(MICA/B scFV; HC- 링커 -LC; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
서열 번호 48
Figure pct00016
(MICA/B scFV; LC- 링커 -HC; 신호 펩타이드/리더 ― 다른 신호 펩타이드가 또한 가능함; 링커 ― 다른 링커가 또한 가능함).
본 명세서에 기재된 것처럼, 제공된 것과 같은 MICA/B-CAR에 의해 표적화하는 MICA/B 종양 항원은 많은 인간 및 쥣과 종양 세포주에서 관찰된 표면 MICA/B 분비를 억제하고, 이는 MICA/B 세포 표면 밀도를 증가시키고, 가용성 분비된 MICA/B를 감소시키고, NK 세포 매개된 종양 사멸을 향상시킨다. 제공된 것과 같은 MICA/B-CAR은, 종양 세포 표면 MICA/B를 표적화하고 안정화할 수 있으면서, 종양 MICA 및 MICB에 대한 NKG2D 결합을 방해하지 않는다.
유전 조작된 iPSC 및 분화 효과기 세포에 포함된 MICA/B 이외의 추가 CAR(들)에 의해 표적화될 수 있는 항원의 비제한적인 예는 ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAlX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A 1(MAGE-A1), 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1), 및 당해 분야에 공지된 다양한 병원균 항원을 포함한다. 병원균의 비제한적인 예는 질환을 야기할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물을 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 일 실시형태에서, 상기 세포는 MICA/B-CAR을 추가로 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 다른 실시형태에서, 상기 세포는 CD19-CAR을 추가로 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 또 다른 실시형태에서, 상기 세포는 HER2 CAR을 추가로 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 또 다른 실시형태에서, 상기 세포는 MSLN CAR을 추가로 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 추가의 실시형태에서, 상기 세포는 또한 PSMA CAR을 포함한다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이로부터의 분화 효과기 세포의 또 다른 실시형태에서, 상기 세포는 또한 VEGF-R2 CAR을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA4, PD1, LAG3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체 폴리펩타이드의 천연적 막관통 영역 또는 변형된 막관통 영역의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일 실시형태에서, BCMA-CAR 및/또는 추가 CAR(BCMA 이외의 표적화 항원)은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, BCMA-CAR 및/또는 추가의 CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 엔도도메인(또는 세포내 도메인)의 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 적어도 일부를 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에 개시된 CAR의 신호전달 펩타이드는 CD3ζ의 적어도 하나의 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프)과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성인 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 상기 엔도도메인은 적어도 하나의 공자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 상기 공동자극 신호전달 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD1, LAG3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA4 또는 NKG2D의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 적어도 일부, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 출원에 제공된 BCMA-CAR은 서열 번호 13과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열로 표시된 CD3ζ의 천연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 실시형태에서, CD28로부터 유래된 공동자극 도메인, 및 CD3ζ의 천연적 ITAM1 또는 변형된 ITAM1을 포함하는 CAR은 CD28로부터 유래된 막관통 도메인 및 힌지 도메인을 또한 포함하고, scFv는 힌지를 통해 막관통 도메인에 연결될 수 있고, CAR은 서열 번호 14와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 13
Figure pct00017
서열 번호 14
Figure pct00018
다른 실시형태에서, 본 출원에서 제공된 BCMA-CAR은 NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공자극 도메인, 및 서열 번호 15와 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성의 아미노산 서열에 의해 표시된 천연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 신호전달 도메인을 포함한다. NKG2D로부터 유래된 막관통 도메인, 2B4로부터 유래된 공자극 도메인 및 천연적 CD3ζ 또는 변형된 CD3ζ를 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 상기 CAR은 CD8 힌지를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 구조의 아미노산 서열은 서열 번호 16과 적어도 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 갖는다.
서열 번호 15
Figure pct00019
서열 번호 16
Figure pct00020
비제한적인 CAR 전략은 한 쌍의 세포내 도메인의 이합체화를 통한 이종이합체성인 조건적으로 활성화된 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9587020호 참조); 분할 CAR(여기서, CAR을 생성하기 위한 항원 결합, 힌지 및 엔도도메인의 상동성 재조합)(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20170183407호 참조); 각각 항원 결합 도메인 및 신호전달 도메인에 연결된 2개의 막관통 도메인 사이의 비공유 연결을 허용하는 다중사슬 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20140134142호 참조); 이중특이적 항원 결합 도메인을 갖는 CAR(예를 들어, 미국 특허 제9447194호 참조), 또는 동일한 또는 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 한 쌍의 항원 결합 도메인을 갖는 것(예를 들어, 미국 특허 제8409577호 참조), 또는 탠덤 CAR(예를 들어, 문헌[Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052] 참조); 유도성 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20160046700호, 미국 특허출원공개 US 제20160058857호, 미국 특허출원공개 US 제20170166877호 참조); 스위치 가능한 CAR(예를 들어, 미국 특허출원공개 US 제20140219975호 참조); 및 당해 분야에 공지된 임의의 다른 디자인을 추가로 포함한다.
BCMA CAR 및/또는 추가의 CAR(BCMA 이외의 표적화 항원) 삽입에 적합한 게놈 좌위는 본원에 제공된 것과 같은 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 좌위, 및 통합의 결과로서의 선택 좌위(selected locus)에서의 유전자의 넉다운 또는 넉아웃이 원해지는 유전자 좌위를 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR 삽입에 적합한 게놈 좌위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 TCR 불변 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 TCR 넉아웃으로 이어지고, 선택적으로 CAR 발현이 내인성 TCR 프로모터의 제어 하에 있게 한다. TCR null 및 BCMA CAR을 포함하는 iPSC 분화 세포의 일 특정 실시형태에서, 상기 분화 세포는 T 세포이다. 다른 실시형태에서, iPSC 및 CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 NKG2A 좌위 또는 NKG2D 좌위에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 NKG2A 또는 NKG2D 넉아웃으로 이어지고, 선택적으로 CAR 발현이 내인성 NKG2A 또는 NKG2D 프로모터의 제어 하에 있게 한다. NKG2A 또는 NKG2D null 및 BCMA CAR을 포함하는 iPSC 분화 세포의 일 특정 실시형태에서, 상기 분화 세포는 NK 세포이다. 또 다른 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CD38 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 CD38 넉아웃으로 이어지고, 선택적으로 CAR 발현이 내인성 CD38 프로모터의 제어 하에 있게 한다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CD58 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 CD58 넉아웃으로 이어진다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CD54 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 CD54 넉아웃으로 이어진다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CIS(사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질) 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 CIS 넉아웃으로 이어진다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CBL-B(E3 유비퀴틴-단백질 리가제CBL-B) 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 CBL-B 넉아웃으로 이어진다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 SOCS2(E3 유비퀴틴-단백질 리가제 CBL-B) 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 SOCS2 넉아웃으로 이어진다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 CD56(NCAM1) 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는다. 다른 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 PD1, CTLA4, LAG3 및 TIM3 중 어느 하나의 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 삽입 부위에서의 유전자 넉아웃으로 이어진다. 추가의 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포는 TIGIT의 코딩 영역에서 삽입된 CAR을 갖는데, 이는 TIGIT 넉아웃으로 이어진다.
본원에는 따라서 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 얻은 분화 세포가 제공되고, iPSC 및 분화 세포 둘 모두는 적어도 BCMA-CAR을 포함한다. 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은 BCMA-CAR 및 비제한적인 예로서 BCMA 이외의 표적에 특이적인 제2 CAR; CD38 넉아웃; hnCD16; 외인성 사이토카인 신호전달 성분; HLA-G, CD58 및 CD54 중 적어도 하나의 과발현을 갖는 HLA-I 및/또는 HLA-II 결핍; TCR null; 표면 제시된 CD3; 항원 특이적 TCR; NKG2C; DAP10/12; NKG2C-IL15-CD33("2C1533")을 포함하는 하나 이상의 추가의 변형된 양상을 포함하는 iPSC 및 분화 세포가 또한 제공된다.
2. CD38 넉아웃
세포 표면 분자 CD38은 다발성 골수종 및 CD20 음성 B 세포 악성종양을 포함하는 림프구성 계통 및 골수성 계통 둘 모두로부터 유래된 다수의 혈액학적 악성종양에서 고도로 상향조절되고, 이는 암 세포를 고갈시키는 것을 항체 치료제에 대한 매력적인 표적으로 만든다. 항체 매개된 암 세포 고갈은 보통 직접적인 세포 아폽토시스 유도와 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: 항체 의존적 세포 매개된 세포독성)와 같은 면역 효과기 기전의 활성화의 조합에 기인한다. ADCC 이외에도, 치료학적 항체와 조화된 면역 효과기 기전은 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)을 또한 포함할 수 있다.
CD38은 악성 세포에서 고도로 발현되기 보다는 혈장 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 활성화된 T 세포 및 B 세포에서 또한 발현된다. CD38은 조혈작용 동안 CD34+ 줄기 세포 및 림프구성, 적혈구성 및 골수성의 계통 결정 전구세포 상에서 혈장 세포 단계에 걸쳐 계속되는 성숙의 최종 단계 동안 발현된다. CD38은 II형 막관통 당단백질로서 뉴클레오타이드-대사물질의 생성에 관여된 다기능성 효소 및 수용체 둘 모두로서 세포 기능을 수행한다. CD38은 효소로서 NAD+로부터 ADP-리보스로의 반응의 가수분해 및 합성을 촉매화하여서, CADPR 및 NAADP인 2차 메신저를 생성하고, 이것은 과정이 칼슘 의존적인 세포 부착의 과정에 중요한 소포체 및 리소좀으로부터 칼슘의 방출을 자극한다. CD38은 수용체로서 CD31을 인식하고, 활성화된 NK 세포에서 세포독성 및 사이토카인 방출을 조절한다. CD38은 세포질 Ca2+ 플럭스를 조절하고, 림프구성 및 골수성 세포에서 신호 전달을 매개하기 위해 지질 뗏목에서 세포 표면 단백질과 회합하는 것으로 또한 보고된다.
악성종양 치료에서, CD38 항원 결합 수용체 형질도입된 T 세포의 전신 사용은 CD34+ 조혈 전구 세포, 단핵구, NK 세포, T 세포 및 B 세포의 CD38+ 분획을 용해시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 손상된 수혜자 면역 효과기 세포 기능 때문에 불완전한 치료 반응 및 감소된 또는 제거된 효능을 야기한다. 게다가, CD38 특이적 항체인 다라투무맙으로 치료된 다발성 골수종 환자에서, T 세포 및 B 세포와 같은 다른 면역 세포 유형이 이의 CD38 발현에도 불구하고 영향을 받지 않지만 골수 및 말초혈 둘 모두에서의 NK 세포 감소가 관찰되었다(문헌[Casneuf et al., Blood Advances. 2017; 1(23):2105-2114]). 이론에 의해 구속되지는 않지만, 제공된 것과 같은 BCMA-CAR을 포함하는 CD38 null 효과기 세포는 CD38 매개된 동족살해를 극복하고, 특이적 항체 및/또는 CD38 항원 결합 도메인 유도된 효과기 세포 고갈 또는 감소를 피할 수 있다. 게다가, CD38이 T 세포 또는 B 세포와 같은 활성화된 림프구에서 상향조절되므로, 다라투무맙과 같은 CD38 특이적 항체는 CD38 null인 제공된 것과 같은 적응 동종이계 효과기 세포의 수혜자에서 활성화된 림프구를 제거하거나 이 림프구의 활성화를 억제하도록 사용될 수 있어서, 이 효과기 세포에 대한 숙주 림프구에 의한 동종거부를 감소시키고/시키거나 방지할 수 있고, 이 효과기 세포의 생존기간 및 지속성은 림프고갈에 사용된 CD38 항체의 존재에도 불구하고 증가할 수 있었다. 이와 같이, 본 출원은 또한 수혜자 T 세포 및 B 세포의 활성화에 대하여 CD38 특이적 항체, 분비된 CD38 특이적 인게이져 또는 CD38 CAR(키메라 항원 수용체)을 사용하여 동종거부성을 감소시키거나 방지하고 활성화된 수혜자 T 세포 및 B 세포를 제거하면서 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 향상시키는 전략을 제공한다. 구체적으로는, 제공된 것과 같은 전략은 iPSC 계통을 생성하는 것 및 BCMA-CAR 및 CD38 넉아웃을 갖는 iPSC의 클론성 세포 은행을 제조하는 것 및 조작된 iPSC 계통의 유도 분화를 통해 BCMA-CAR 분화 및 CD38 null(BCMA-CAR CD38-/-) 분화 효과기 세포를 수득하는 것을 포함한다. 본 출원 전에, CD38이 상기 기재된 것과 같은 세포 발생 생물학 및 세포 기능에서 많은 중요한 역할을 하는지를 고려하여 BCMA-CAR 및/또는 CD38 넉아웃을 수반하는 iPSC에서의 편집이 iPSC 분화, 분화 세포 표현형 및 효과기 세포 기능을 포함하는 임의의 양태를 동요시키는지는 알려져 있지 않다.
본원에 제공된 것과 같은 일 실시형태에서, iPSC 계통에서의 CD38 넉아웃은 이대립유전자( bi-allelic) 넉아웃이다. 본원에 개시된 것과 같이, 제공된 CD38 null iPSC 계통은 기능적 분화 조혈 효과기 세포를 생성하도록 유도 분화를 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화 조혈 효과기 세포는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 분화 조혈 효과기 세포는 자연 원천로부터의 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 효과기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, ADCC를 유도하도록 CD38 항체를 사용하거나 표적화된 세포 사멸에 CD38 CAR을 사용할 때, CD38-/- iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 상기 CD38 항체 또는 CD38 CAR에 의해 제거되지 않고, 이로써 이러한 치료제의 존재 하에 및/또는 이러한 치료제에 대한 노출 후 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 이러한 치료제의 존재 하에 및/또는 이에 대한 노출 후 생체내 지속성 및/또는 생존기간이 증가한다. 일부 실시형태에서, CD38 null 효과기 세포는 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, CD38 null 효과기 세포는 iPSC로부터 유래된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, CD38 null iPSC 및 분화 세포는 비제한적인 예로서 외인성 CD16 또는 이의 변이체의 발현, CAR 발현, 사이토카인/사이토카인 수용체 발현, HLA I 및/또는 HLAII 넉아웃, 및 본원에 제공된 것과 같은 추가 양상을 포함하는 본원에 기재된 것과 같은 하나 이상의 추가 게놈 편집을 포함한다.
다른 실시형태에서, CD38에서의 선택된 위치에서의 본원에 제공된 것과 같은 BCMA-CAR을 포함하는 하나 이상의 전이유전자의 삽입과 동시에 CD38의 넉아웃은 예를 들어 CD38 표적화된 넉인/넉아웃(CD38-KI/KO) 작제물에 의해 달성될 수 있다(도 2a 내지 도 2d). 상기 작제물의 일부 실시형태에서, 작제물은 CD38 좌위 내에 위치 선택적 삽입을 위한 한 쌍의 CD38 표적화 상동성 아암을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예비선택된 표적화 부위는 CD38의 엑손 내에 있다. 본원에 제공된 CD38-KI/KO 작제물은 전이유전자(들)가 CD38 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 발현되게 한다. CD38 좌위에서의 선택된 위치에서 2개 이상의 전이유전자가 삽입될 때, 링커 서열, 예를 들어 2A 링커 또는 IRES는 임의의 2개의 전이유전자들 사이에 위치한다. 2A 링커는 FMDV, ERAV, PTV-I 및TaV(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"라고 칭함)로부터 유래된 자가 절단 펩타이드를 암호화하여, 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 및/또는 외인성 프로모터 침묵화의 위험을 감소시키도록 절연인자는 작제물에 포함된다. CD38-KI/KO 작제물에 포함된 외인성 프로모터는 CAG, 또는 비제한적인 예로서 CMV, EF1α, PGK, 및 UBC를 포함하는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있다. 도 3 및 도 4는 선택된 위치에서의 CD38 좌위에서 CD38 발현을 넉아웃하면서 CAG 프로모터(도 3)에 의해 유발되거나 CD38 내인성 프로모터(도 4)에 의해 유발된 hnCD16 및 IL15RF(이 특정 예에서 절두된 IL15RF) 둘 모두를 삽입하도록 설계된 작제물에 대한 예시적인 서열을 입증한다. 도면에 제공된 것처럼 그리고 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 도 3 및 도 4에 예시된 작제물에 포함된 성분의 일부는 선택적이도록 필요하지 않고, 일부 포함된 성분에 대한 핵산 서열은 변할 수 있고, 도면에 제공된 것과 같은 전체 작제물 또는 각각의 성분의 예시적인 핵산 서열과 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 미만, 그러나 50% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BCMA-CAR은 iPSC에서 CD38을 동시에 넉아웃하도록 CD38 좌위에 삽입되었다. 이와 같이, 본 발명은 iPSC 및 BCMA-CAR 및 CD38 넛아웃을 포함하는 이로부터의 분화 세포를 추가로 제공한다.
3. 외인성으로 도입된 CD16 또는 이의 변이체
CD16은 Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a; NM_000569.6) 및 FcγRIIIb(CD16b; NM_000570.4)인 2개의 이소폼을 갖는 것으로 확인되었다. CD16a는 NK 세포에 의해 발현된 막관통 단백질이고, 이는 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 촉진하도록 표적 세포에 부착된 단량체성 IgG에 결합한다. CD16b는 인간 호중구에 의해 배타적으로 발현된다. 본원에 사용된 "고친화성 CD16", "비절단성 CD16" 또는 "고친화성 비절단성 CD16"은 다양한 CD16 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화성을 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구에 대한 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백분해 절단 과정인 엑토도메인 분비로 처리된다. F176V(일부 간행물에서는 F158V라고도 칭함)는 높은 친화성을 갖는 예시적인 CD16 다형 변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 유전 조작된 비절단성 버전의 예이다. F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하는 조작된 CD16 변이체는 높은 친화성을 갖고 비절단성이고, 이는 국제공개 WO 2015/148926호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 게다가, CD64 엑토도메인의 적어도 일부로 본질적으로 대체된 CD16의 엑토도메인을 갖는 키메라 CD16 수용체는 ADCC를 수행할 수 있는 CD16 수용체의 원하는 고친화성 및 비절단성 특징을 또한 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 CD16의 대체 엑토도메인은 CD64의 EC1, EC2 및 EC3 엑손 중 하나 이상(UniPRotKB_P12314, 또는 이의 이소폼 또는 다형 변이체)을 포함한다.
이와 같이, 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)는 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P 둘 모두를 포함하고; 일부 실시형태에서 절단 영역이 제거된 F176V를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, hnCD16은 CD64 엑토도메인의 적어도 일부를 각각 포함하는 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9인 임의의 예시적인 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% 또는 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9는 서열 번호 10 내지 서열 번호 12를 예시함으로써 각각 암호화된다. 본원에 그리고 본 명세서에 걸쳐 사용된 것처럼, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유한 동일한 위치의 수의 함수(즉, %의 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 당해 분야에서 인정된 수학적 알고리즘을 이용하여 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정이 달성될 수 있다.
서열 번호 7:
Figure pct00021
서열 번호 8
Figure pct00022
서열 번호 9
Figure pct00023
서열 번호 10
Figure pct00024
서열 번호 11
Figure pct00025
서열 번호 12
Figure pct00026
따라서, 본원에는 본원에서 고려되고 기재된 것과 같은 다른 편집들 중에서 포함되도록 유전 조작된 클론성 iPSC, 외인성 CD16 또는 이의 변이체가 제공되고, 유전 조작된 iPSC는 iPSC로 도입된 동일한 외인성 CD16을 포함하는 효과기 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16은 고친화성 비절단성 CD16 수용체(hnCD16)이다. iPSC 또는 이의 분화 세포에서 발현된 외인성 hnCD16은 ADCC 항체 또는 이의 단편뿐만 아니라 CD16 또는 상기 hnCD16의 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 결합에서 높은 친화성을 갖는다. 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 본 출원에서 하기에 추가로 기재되어 있다(I.7 부문 참조). 이와 같이, 본 출원은 하기에 V. 부문에 더 자세히 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서의 치료 용도를 위한 충분한 양으로 분화 효과기 세포 상에 발현된 hnCD16의 세포외 도메인과의 고친화성 결합을 통해 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 효과기 세포 또는 이의 세포 집단을 제공하고, 상기 hnCD16은 CD64, 또는 F176V 및 S197P를 갖는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 비천연적 막관통 도메인, 비천연적 자극 도메인 및/또는 비천연적 신호전달 도메인을 포함하도록 키메라 Fc 수용체(CFcR)가 제조되도록, 외인성 CD16의 천연적 CD16 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인이 추가로 변형되거나 대체된다. 본원에 사용된 "비천연적"이라는 용어는 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 상이한 수용체로부터 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인이 유래된다는 것을 의미한다. 여기서 예시에서, CD16 또는 이의 변이체에 기초한 CFcR은 CD16으로부터 유래된 막관통 도메인, 자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, CD16 기반 CFcR은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA4, PD1, LAG3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체 폴리펩타이드로부터 유래된 비천연적 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD16 기반 CFcR은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD1, LAG3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비천연적 자극/억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD16 기반 CFcR은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래된 비천연적 신호전달 도메인을 포함한다. 외인성 CD16의 일 실시형태에서, 제공된 키메라 수용체는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 및 NKG2D 폴리펩타이드 중 하나로부터 둘 모두 유래된 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다른 특정 실시형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다. CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다른 실시형태는 CD3ζ의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고; CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 S197P를 포함한다.
상기에 기재된 것과 같은 CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 다양한 실시형태는 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역; 또는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제의 Fc 영역에 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 결합 시, 키메라 수용체의 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인은 효과기 세포의 활성화 및 사이토카인 분비, 및 항체, 또는 종양 항원 결합 성분뿐만 아니라 Fc 영역을 갖는 상기 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸이 가능하게 한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, CD16 기반 키메라 Fc 수용체의 비천연적 막관통, 자극 및/또는 신호전달 도메인을 통해, 또는 상기 수용체의 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해, CFcR은 효과기 세포의 증식 및/또는 확장 가능성을 증가시키면서 효과기 세포의 사멸 능력에 기여할 수 있었다. 항체 및 인게이저는 항원을 발현하는 종양 세포 및 CFcR을 발현하는 효과기 세포가 가깝게 근접하게 할 수 있고, 이는 또한 종양 세포의 향상된 사멸에 기여한다. 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제에 대한 예시적인 종양 항원은 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린 및 ROR1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 종양 세포를 공격하는 데 있어서 CD16 기반 CFcR을 발현하는 효과기 세포를 결합하기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중특이적, 삼중특이적, 다중특이적 인게이저 또는 결합제는 CD16(또는 CD64)-CD30, CD16(또는 CD64)-BCMA, CD16(또는 CD64)-IL15-EPCAM 및 CD16(또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면으로부터 절단된 일차 NK 세포에 의해 발현된 내인성 CD16과 달리, 분화 NK에서의 CD16의 다양한 비절단성 버전은 CD16 분비를 피하고 일정한 발현을 유지한다. 분화 NK 계통 세포에서, 비절단성 CD16은 TNFα 및 CD107a의 발현을 증가시켜 개선된 세포 기능성을 나타낸다. 비절단성 CD16은 또한 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 및 이중특이적 인게이저, 삼중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저의 결합을 향상시킨다. ADCC는 항체 코팅된 표적 세포에 대한 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개된 용해의 기전이다. 유래된 NK 세포에서의 도입된 hnCD16의 추가의 고친화성 특징은 또한 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 hnCD16를 통한 NK 세포로의 ADCC 항체의 시험관내 로딩이 가능하게 한다. 제공된 것처럼, hnCD16은 일부 실시형태에서 F176V 및 S197P를 포함할 수 있거나, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함할 수 있거나, 비천연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 것처럼, 본 출원은 또한 하기에 더 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 효과기 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다. 일부 실시형태에서, hnCD16을 포함하는 유래 효과기 세포는 본원에 제공된 것과 같은 BCMA-CAR을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR, hnCD16을 포함하는 유래된 효과기 세포는 CD38 넉아웃을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR, hnCD16 및 CD38 넉아웃을 포함하는 유래 효과기 세포는 CD38 항체가 예비로딩된다. 일부 실시형태에서, 예비로딩된 CD38 항체는 다라투무맙이다.
일차 NK 세포와 달리 일차 원천(즉, 말초혈, 제대혈 또는 다른 공여자 조직과 같은 자연적/천연적 원천)으로부터의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 발현된 외인성 CD16을 포함하는 iPSC가 T 세포 발생 생물학을 손상시키지 않았고, 외인성 CD16을 발현할 뿐만 아니라 획득된 ADCC 기전을 통해 기능을 수행할 수 있는 기능적인 분화 T 계통 세포로 분화할 수 있었다는 것은 예상치 못했다. 분화 T 계통 세포에서의 이 획득된 ADCC는 이중 표적화에 대한 접근법으로서 및/또는 CAR-T 세포 치료에 의해 대개 발생한 항원 회피를 구제하도록 추가로 사용될 수 있고, 여기서 CAR(키메라 항원 수용체)에 의한 인식을 피하기 위한 CAR-T 표적화된 항원 발현 또는 돌연변이된 항원의 발현이 감소되거나 소실되면서 종양이 재발한다. 상기 분화 T 계통 세포가 외인성 CD16 발현을 통해 획득된 ADCC를 포함할 때, 그리고 항체가 CAR에 의해 표적화된 종양 항원과 다른 종양 항원을 표적화할 때, CAR-T 항원 회피를 구제하고, CAR-T 치료에서 대개 보이는 표적화된 종양의 재발 또는 재발생을 감소시키거나 방지하기 위해 항체가 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 회피를 감소시키고/시키거나 방지하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 CAR을 발현하는 NK 계통 세포 또는 임의의 인공 효과기 세포에 동등하게 적용 가능하다. 이 항원 회피 감소 및 방지 전략에 사용될 수 있는 다양한 CAR은 하기에 추가로 기술된다.
이와 같이, 본 발명은 외인성 CD16을 포함하는 분화 T 계통 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, 본원에서 얻은 분화 T 계통 세포는 BCMA-CAR 및 외인성 CD16을 포함한다. 추가로 제공된 실시형태에서, 본원에서 얻은 분화 T 계통 세포는 hnCD16 및 BCMA-CAR의 발현 이외에도 CD38 넉아웃을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분화 T 계통 세포에 포함된 hnCD16은 F176V 및 S197P를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 분화 T 계통 세포에 포함된 hnCD16은 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 9에 의해 예시된 것처럼 CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하거나, 비천연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 설명된 것처럼, 이러한 분화 T 계통 세포는 항체의 치료 효과를 향상시키기 위해 ADCC에 의해 매개된 단일클론 항체에 의한 종양을 표적화하기 위한 획득된 기전을 갖는다. 개시된 것처럼, 본 출원은 또한 하기에 더 기술된 것처럼 병태, 질환 또는 감염의 치료에서 치료학적 용도를 위한 충분한 양으로 하나 이상의 예비선택된 ADCC 항체가 예비로딩된 분화 T 계통 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다. 일부 다른 실시형태에서, hnCD16 및 BCMA CAR을 발현하는 분화 T 계통 세포는 또한 CD38 null이어서, 상기 세포는 종양 항원 CD38을 표적화하는 치료제의 존재 하일 때 제거되는 것이 회피될 수 있다. 일 실시형태에서, 종양 항원 CD38을 표적화하는 상기 치료제는 CD38 항체이다. 다른 실시형태에서, 종양 항원 CD38을 표적화하는 상기 치료제는 CD38 결합 영역을 포함하는 CAR, 예를 들어 항-CD38 scFV이다.
4. 외인성으로 도입된 사이토카인 및/또는 사이토카인 신호전달
임상적으로 관련된 사이토카인의 전신 고용량 투여를 피함으로써, 사이토카인 매개된 세포 자율성이 확립되면서 이러한 실행으로 인한 용량 제한 독성의 위험은 감소한다. 가용성 사이토카인을 추가적으로 투여할 필요성 없이 림프구 자율성을 달성하기 위해, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 중 하나 이상의 부분 펩타이드 또는 전체 펩타이드, 이들의 수용체 중 하나 이상의 부분 펩타이드 또는 전체 펩타이드, 및 임의의 이들의 조합을 포함하는 단백질 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 사이토카인 신호전달이 가능하게 하도록 세포로 도입되어서, 사이토카인 독성의 위험이 감소하면서 세포 성장, 증식, 확장 및/또는 효과기 기능을 유지하거나 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면에서 사이토카인 신호전달을 위한 도입된 사이토카인 및/또는 이의 각각의 천연적 수용체 또는 변형된 수용체가 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다.
도 1은 예시적인 예로서 IL15를 사용한 몇몇 작제물 설계를 제시한다. 도 1에서의 임의의 설계의 막관통(TM) 도메인은 IL15 수용체에 천연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
설계 1: IL15의 같은 쪽 제시(cis-presentation)를 제거할 필요 없이 IL15의 다른 쪽 제시(trans-presentation)를 모방하는 자가 절단 펩타이드를 사용하여 IL15 및 IL15Rα는 동시발현된다.
설계 2: IL15Rα는 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, IL15의 같은 쪽 제시의 제거 없이 다른 쪽 제시를 모방할 뿐만 아니라 IL15 막-결합성을 보장한다.
설계 3: 절두된 세포내 도메인을 갖는 IL15Rα가 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, IL15의 다른 쪽 제시를 모방하고, IL15 막-결합성을 유지하고, 이의 세포내 도메인을 통해 일반 IL15R에 의해 매개된 같은 쪽 제시 및/또는 임의의 다른 가능한 신호 전달 경로를 추가로 제거한다. IL15Rα의 세포내 도메인은 수용체가 IL15 반응 세포를 발현하는 데 중요하고, 반응 세포가 증식하고 작용하는 데 중요한 것으로 간주된다. 이러한 절두된 작제물은 서열 번호 18로 표시된 예시적인 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 서열 번호 17과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. 절두된 IL15/IL15Rα의 일 실시형태에서, 작제물은 서열 번호17의 마지막 4개의 아미노산 "KSRQ"를 포함하지 않고, 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 17
Figure pct00027
(379 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
서열 번호 18
Figure pct00028
(1140 n.a.)
서열 번호 21
Figure pct00029
(375 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
당업자는 상기의 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 있다. 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해 이어지거나 링커에 의해 연결된 기능적 펩타이드의 활성을 변경하지 않으면서 다른 서열에 대해 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
설계 4: 디자인 3 작제물이 효과기 세포 생존 및 증식을 촉진하는 데 기능적인 것으로 밝혀져 이러한 디자인에서 IL15 신호전달 복합체가 갖춰진 효과기 세포의 자율적인 특징에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 IL15Rα의 세포질 도메인이 생략될 수 있음을 입증하므로, 디자인 4는 디자인 3의 다른 작용 대안을 제공하는 작제물이고, 이로부터 선택적으로 스시 도메인과 막관통 도메인 사이의 링커와 함께 일 말단에서 IL15과 융합되고 다른 말단에서 막관통 도메인(mb-스시)과 융합된 스시 도메인을 제외하고는 전체 IL15Rα가 본질적으로 제거된다. 세포 표면에서 임의의 막 결합된 단백질의 막관통 도메인을 통해 융합된 IL15/mb-스시가 발현된다. 설계 4와 같은 작제물에 의해, IL15의 바람직한 다른 쪽 제시가 오직 보유될 때 같은 쪽 제시를 포함하는 IL15Rα를 통한 불필요한 신호전달이 제거된다. 일부 실시형태에서, 스시 도메인과 융합된 IL15를 포함하는 성분은 서열 번호 20으로 표시된 예시적인 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 서열 번호 19와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 19
Figure pct00030
(242 a.a.; 신호 및 링커 펩타이드는 밑줄 표시됨)
서열 번호 20
Figure pct00031
(726 n.a.)
당업자는 상기의 신호 펩타이드 및 링커 서열이 예시적이고, 신호 펩타이드 또는 링커로서 사용하기에 적합한 이들의 변형을 어떤 방식으로든 제한하지 않음을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 신호 펩타이드 또는 링커 서열이 있다. 당업자는 신호 펩타이드 및/또는 링커 서열이 신호 펩타이드에 의해 이어지거나 링커에 의해 연결된 기능적 펩타이드의 활성을 변경하지 않으면서 다른 서열에 대해 치환될 수 있다는 것을 이해한다.
설계 5: 천연적 또는 변형된 IL15Rβ는 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합되어서, 항시적 신호전달이 가능하게 하고, IL15 막 결합성 및 다른 쪽 제시를 유지한다.
설계 6: 천연적 또는 변형된 공통 수용체 γC는 사이토카인의 항시적 신호전달 및 막 결합된 다른 쪽 제시를 위한 링커를 통해 C 말단에서 IL15에 융합된다. 공통 수용체 γC는, IL2 수용체 아단위 감마 또는 IL2RG로도 공지된, 공통 감마 사슬 또는 CD132라 또한 칭한다. γC는 비제한적인 예로서 IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 및 IL21 수용체를 포함하는 많은 인터류킨 수용체에 대해 수용체 복합체에 공통인 사이토카인 수용체 아단위이다.
설계 7: IL15의 부재 하에 동종이합체를 형성하는 조작된 IL15Rβ는 사이토카인의 항시적 신호전달을 생성하는 데 유용하다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 하나 이상 및/또는 이의 수용체는 도 1에서의 설계 중 하나 이상을 사용하여 iPSC로 도입되고, iPSC 분화 시 이의 분화 세포로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL2 또는 IL15 세포 표면 발현 및 신호전달은 설계 1 내지 설계 7 중 어느 하나에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 실시형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체 중 어느 하나를 사용하여 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 실시형태에서, IL7 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 또는 사이토카인 특이적 수용체, 예컨대 IL4 수용체 중 어느 하나를 사용하여 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 예시된 작제물을 통해서이다. 도 1에서의 임의의 설계의 막관통(TM) 도메인은 각각의 사이토카인 수용체에 천연적일 수 있거나, 임의의 다른 막 결합된 단백질의 막관통 도메인으로 변형되거나 대체될 수 있다.
CAR 및 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체 신호전달 둘 모두를 포함하는 iPSC 및 이로부터의 분화 세포에서, CAR 및 IL은 별개의 작제물에서 발현될 수 있거나, CAR 및 IL 둘 모두를 포함하는 이중시스트론성 작제물에서 동시발현될 수 있고, IL은 임의의 사이토카인, 사이토카인 수용체, 이들의 변이체 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 도 1에서의 임의의 작제물 설계에 의해 표시된 형태의 IL15는 예를 들어 CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR로 예시된 자가 절단 2A 암호화 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. IL15 및 CAR은 그렇게 단일 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)에 있다. 일 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 3에서 IL15를 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 3에서 IL15를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 작제물은 도 1의 설계 7에서 IL15를 포함한다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR이 발현될 때, 자가 절단 2A 펩타이드는 발현된 CAR 및 IL15가 분리되게 하고, 이후 세포 표면에서 분리된 IL15가 제시될 수 있다. CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 이중시스트론성 설계는 시기 및 분량 둘 모두에서 단일 ORF의 발현을 위한 예를 들어 유도성 프로모터를 혼입하기 위해 선택될 수 있는 동일한 제어 기전 하에 조직화된 CAR 및 IL15 발현이 가능하게 한다. 아프토바이러스(aphthovirus), 예컨대 수족구병 바이러스(FMDV: foot-and-mouth disease virus), 말 비염 A 바이러스(ERAV: equine rhinitis A virus), 토세아 아시그나 바이러스(TaV: Thosea asigna virus) 및 돼지 테스코 바이러스- 1(PTV-I: porcine tescho virus-1)(문헌[Donnelly, ML, et al, J. Gen. Virol, 82, 1027-101 (2001)]; 문헌[Ryan, MD, et al., J. Gen. Virol., 72, 2727-2732 (2001)]) 및 카디오바이러스(cardiovirus), 예컨대 테일로바이러스(Theilovirus)(예를 들어, 테일러 쥣과 뇌척수염) 및 뇌심근염 바이러스를 포함하는 피코르나비리다에(Picornaviridae) 바이러스 패밀리의 구성원에서 자가 절단 펩타이드가 발견되었다. FMDV, ERAV, PTV-I, 및 TaV로부터 유래된 2 A 펩타이드는 때때로 각각 "F2A", "E2A", "P2A", 및 "T2A"라고도 칭한다.
본원에 개시된 것과 같은 IL15에 대한 이중시스트론성 구조 CAR-2A-IL15 또는 IL15-2A-CAR 실시형태는 본원에 제공된 임의의 다른 사이토카인, 예를 들어 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 및 IL21의 발현에 또한 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, IL2 세포 표면 발현 및 신호전달은 설계 1 내지 설계 7 중 어느 것에 예시된 작제물을 통해서이다. 일부 다른 실시형태에서, IL4, IL7, IL9 또는 IL21 세포 표면 발현 및 신호전달은 공통 수용체 및/또는 사이토카인 특이적 수용체 중 어느 하나를 사용하여 설계 5, 설계 6 또는 설계 7에 예시된 작제물을 통해서이다.
5. HLA-I- 및 HLA-II- 결핍
다수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 동종이계 거부 문제를 피하도록 동종이계 수혜자에서 조직접합성에 대해 일치되어야 한다. 본원에는 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 단백질 둘 모두의 발현이 제거되거나 실질적으로 감소된 iPSC 세포주 및 이로부터 분화된 이의 분화 세포가 제공된다. HLA 클래스 I 결핍은 HLA 클래스 I 좌위(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능적 결실, 또는 비제한적인 예로서 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP1 유전자, TAP2 유전자 및 타파신을 포함하는 HLA 클래스-I 연관된 유전자의 결실 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, B2M 유전자는 모든 HLA 클래스 I 이종이합체의 세포 표면 발현에 필수적인 공통 아단위를 암호화한다. B2M null 세포는 HLA-I 결핍이다. HLA 클래스 II 결핍은 비제한적인 예로서 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하는 HLA-II 연관된 유전자의 기능적 결실 또는 감소에 의해 달성될 수 있다. CIITA는 클래스 II 단백질 발현에 필요한 RFX5인 전사 인자의 활성화를 통해 작용하는 전사적 공동활성자이다. CIITA null 세포는 HLA-II 결핍이다. 본원에는 예를 들어 B2M 및 CIITA 발현 둘 모두의 결여를 위한 HLA-I 및 HLA-II 결핍 둘 모두를 갖는 iPSC 계통 및 이의 분화 세포가 제공되고, 여기서 얻은 분화 효과기 세포는 MHC(주요 조직접합성 복합체) 일치에 대한 필요성을 제거하여 동종이계 세포 치료가 가능하게 하고, 숙주(동종이계) T 세포에 의한 인식 및 사멸을 피한다.
그러나, 일부 세포 유형에 대해, 클래스 I 발현의 결여는 NK 세포에 의해 용해로 이어진다. 이 "소실된 자가" 반응을 극복하기 위해, NK 세포 인식 및 조작된 iPSC로부터 유래된 HLA-I 결핍 효과기 세포의 사멸을 피하도록 HLA-G는 선택적으로 넉인될 수 있다. 일 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G 넉인을 추가로 포함한다. 대안적으로, 일 실시형태에서, 제공된 HLA-I 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃의 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. CD58(또는 LFA-3) 및 CD54(또는 ICAM-1)는 신호 의존적 세포 상호작용을 개시하고, 면역 세포를 포함하는 세포 이동을 용이하게 하는 부착 단백질이다. 본 발명 전에는, iPSC에서의 CD58 및/또는 CD54 파괴가 T 세포 및 NK 세포를 포함하는 기능적 면역 효과기 세포에 유도된 iPSC 분화에서 다능 세포 및 발생 생물학에 영향을 미치는지의 여부 및 어떻게 그러는지는 알려져 있지 않았다. CD58 및/또는 CD54 넉아웃이 동종이계 NK 세포 사멸에 HLA-I 결핍 iPSC 유래 효과기 세포의 감수성을 효과적으로 그리고/또는 충분히 감소시킬 수 있는지도 이전에 알려져 있지 않았다. 여기서 CD58 넉아웃이 CD54 넉아웃보다 동종이계 NK 세포 활성화를 감소시키는 데 있어서 더 높은 효율을 갖지만; CD58 및 CD54 둘 모두의 이중 넉아웃이 NK 세포 활성화의 가장 향상된 감소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일부 관찰에서, CD58 및 CD54 이중 넉아웃은 "소실된 자가" 효과를 극복하는 데 있어서 HLA-I 결핍 세포에 대해 HLA-G 과발현보다 훨씬 더 효과적이다.
상기 제공된 것처럼, 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 HLA-G를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD58 null이다. 일부 다른 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD54 null이다. 또한 일부 다른 실시형태, HLA-I 및 HLA-II 결핍 iPSC 및 이의 분화 세포는 CD54 null 및 CD54 null이다. 추가로, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포의 일부 실시형태에서, 상기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍이고, HLA-G를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포의 일부 실시형태에서, 상기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍이고, CD58 null이다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포의 일부 실시형태에서, 상기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍이고, CD54 null이다. iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 세포의 일부 또 다른 실시형태에서, 상기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍이고, 둘 모두는 CD58 null 및 CD54 null이다.
6. 본원에 제공된 유전 조작된 iPSC 계통 및 분화 세포
상기를 고려하여, 본 출원은 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이의 집단, 및 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 기능적 효과기 세포를 제공하고, 각각의 세포는 BCMA-CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원은 iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이의 집단, 및 상기 iPSC를 분화하여 얻은 분화 효과기 세포를 제공하고, 각각의 세포는 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 적어도 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 세포는 조혈 세포이다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 조혈 세포는 T 세포, NK 세포 및 조절 세포와 같은 효과기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 조혈 세포는 자연 원천의 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 효과기 세포를 포함한다.
본원에는 CD38-/-(본원에서 "CD38 null" 또는 CD38 넉아웃이라고도 칭함) iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이의 집단, 및 CD38-/- iPSC의 분화로부터 얻은 CD38 넉아웃을 포함하는 유래된 기능적 분화 세포가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, CD38-/- iPSC, iPS 세포주 세포, 또는 이의 집단, 및 유래된 기능적 분화 세포는 BCMA-CAR을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CD38 좌위에 있다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR 및 CD38 넉아웃을 포함하는 기능적 분화 세포는 조혈 세포이다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR 및 CD38 넉아웃을 포함하는 기능적 분화 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포이다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 조혈 세포는 T 세포, NK 세포 및 조절 세포와 같은 효과기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 분화 조혈 세포는 자연 원천로부터의 T, NK 또는 NKT 세포, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 향상된 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 효과기 세포이다.
본원에는 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 고친화성 비절단성 CD16(hnCD16)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 추가로 제공되고, iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 생산하도록 유도 분화할 수 있다. BCMA-CAR 및 hnCD16 둘 모두를 포함하는 세포는 CAR 결합을 통한 이중 표적화 및 CD16 매개된 ADCC에 적합하고, 이로써 종양 표적화 정확성을 증가시키고, 종양 사멸을 향상시키고, 종양 항원 회피의 영향을 최소화한다. 추가로, 일부 실시형태에서, CD38 항체가 hnCD16 매개된 향상된 ADCC를 유도하도록 사용될 때, iPSC 및/또는 CD38 넉아웃, BCMA-CAR 및 hnCD16을 포함하는 이의 분화 효과기 세포가 효과기 세포 제거, 즉 CD38 발현 효과기 세포의 감소 또는 고갈을 야기하지 않으면서 CD38 발현 (종양) 세포를 표적화할 수 있어서, iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시키도록, iPSC 및/또는 BCMA-CAR 및 hnCD16을 포함하는 이의 분화 효과기 세포는 또한 CD38 null이다. BCMA-CAR, CD38 null 및 외인성 CD16을 포함하는 iPSC 유래 효과기 세포는 CD38 항체 또는 CD38 CAR의 존재 하에 감소된 세포 고갈을 경험하고; 획득된 또는 향상된 ADCC를 가져서, 종양 사멸에 대한 다수의 기전을 제공한다.
본원에는 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 BCMA 이외의 표적 특이성을 갖는 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 제공되고, iPSC는 2개의 상이한 종양 항원을 표적화하는 2개의 CAR을 갖는 기능적 분화 효과기 세포를 생성하도록 유도 분화할 수 있다. 일 실시형태에서, iPSC 및 BCMA-CAR을 포함하는 이의 분화 효과기 세포에 포함된 제2 CAR은 종양 세포 표면 단백질 CD19, MICA/B, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1을 표적화한다. 일 실시형태에서, iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포는 제2 CAR 표적화 CD38을 갖고, 상기 세포는 또한 CD38 null이다. 그러므로, CD38-CAR은 그런데도 CD38 매개된 동족살해로 인해 iPSC 및/또는 이의 분화 효과기 세포의 제거를 야기하지 않는다. 일부 실시형태에서, iPSC 및 CD38 넉아웃을 포함하는 이의 분화 효과기 세포에 포함된 CAR은 CD38을 표적화하지 않는다.
세포 생존, 지속성 및/또는 확장에 기여하는 사이토카인 신호전달이 가능하게 하도록 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체(IL) 또는 이의 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 iPSC가 추가적으로 제공되고, 여기서 iPSC 계통은 개선된 생존, 지속성, 확장 및 효과기 세포 기능을 갖는 기능적 분화 조혈 세포를 생성하도록 유도 분화할 수 있다. 외인성으로 도입된 사이토카인 신호전달(들)은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 임의의 1개 또는 2개, 또는 그 이상의 신호전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달에 대한 사이토카인 및/또는 이의 각각의 수용체의 도입된 부분 펩타이드 또는 전체 펩타이드는 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달은 항시적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 신호전달의 활성화는 일시적이고/이거나 시간적이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 사이토카인/사이토카인 수용체의 일시적/시간적 발현은 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니서클, 또는 mRNA를 포함하는 RNA를 통해서이다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR iPSC 또는 이의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL7 신호전달이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR iPSC 또는 이의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL10 신호전달이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, BCMA-CAR iPSC 또는 이의 분화 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL15 신호전달이 가능하게 한다. 상기 BCMA-CAR IL iPSC의 일부 실시형태에서, IL15 발현은 도 1의 작제물 3을 통해서이다. 상기 BCMA-CAR IL iPSC의 일부 실시형태에서, IL15 발현은 도 1의 작제물 4를 통해서이다. 상기의 실시형태의 상기 BCMA-CAR IL iPSC 및 이의 분화 세포는 자율적으로 시험관내 또는 생체내 추가로 공급된 가용성 사이토카인과 접촉 없이 세포 성장, 증식, 확장 및/또는 효과기 기능을 유지하거나 개선할 수 있다. BCMA-CAR IL iPSC 및 이의 분화 효과기 세포의 일부 실시형태에서, 상기 세포는 CD38 null이고, 효과기 세포 제거를 야기함이 없이 ADCC를 유도하도록 CD38 항체와 사용될 수 있고, 이로써 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 상승적으로 증가시킨다.
BCMA-CAR, B2M 넉아웃 및 CIITA 넉아웃, 및 선택적으로 HLA-G 과발현, CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃 중 하나를 포함하는 iPSC가 또한 제공되고, iPSC는 기능적 분화 조혈 세포를 생산하도록 유도 분화할 수 있다. 상기 BCMA-CAR B2M-/- CIITA-/- iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 HLA-I 및 HLA-II 결핍 둘 모두이다. 추가의 실시형태에서, HLA-I 및 HLA-II 결핍 BCMA-CAR iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 또한 CD38 null이고, 효과기 세포 제거를 야기함이 없이 ADCC를 유도하도록 CD38 항체와 사용될 수 있고, 이로써 iPSC 및 이의 효과기 세포 지속성 및/또는 생존기간을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포는 생체내 지속성 및/또는 생존기간이 증가한다.
상기의 관점에서, 본원에는 BCMA-CAR 및 선택적으로 CD38 넉아웃, hnCD16, 제2 CAR, 외인성 사이토카인/수용체 및 B2M/CIITA 넉아웃 중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함하는 iPSC가 제공되고; B2M이 넉아웃될 때, HLA-G 또는 CD58 및 CD54 넉아웃 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 선택적으로 도입되고, iPSC는 기능적인 분화 조혈 세포를 생산하도록 유도 분화할 수 있다. 본 출원에는 BCMA-CAR, 및 선택적으로 CD38 넉아웃, 외인성 CD16, B2M/CIITA 넉아웃, 제2 CAR, 및 외인성 사이토카인/수용체 단백질 복합체 중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함하는 기능적 iPSC 분화 조혈 세포가 또한 포함되고; B2M이 넉아웃될 때, HLA-G 또는 CD58 및 CD54 넉아웃 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 선택적으로 도입된다. 일부 실시형태에서, 분화 조혈 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 다른 실시형태에서, 분화 조혈 세포는 자연 원천의 NK, T 또는 NKT, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 효과기 세포이다.
본원에 제공된 다른 양태는 IL15 및 IL15Rα의 절두된 융합 단백질을 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래 세포를 포함하고, 융합 단백질은 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 도 1에서 "IL15Rα(ΔICD) 융합" 및 "IL5/mb-스시"로 도시된 것처럼, 이들 실시형태는 본 출원에 걸쳐 총체적으로 IL15Δ로 추가로 축약되고, 표 1에 예시된 "IL"의 실시형태 중 하나이다. "IL"의 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함한다. "IL"의 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함한다. "IL"의 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함한다. "IL"의 일부 실시형태에서, 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 세포내 도메인이 결여된 절두된 IL15/IL15Rα 융합 단백질(IL15Δ)을 포함하는 iPSC 또는 iPSC 유래 세포의 일부 실시형태에서, 상기 세포는 BCMA-CAR 및 선택적으로 CD38 넉아웃, hnCD16, 제2 CAR, 외인성 사이토카인/수용체, 및 B2M/CIITA 넉아웃 중 하나 이상을 추가로 포함하고; B2M이 넉아웃될 때, HLA-G 또는 CD58 및 CD54 넉아웃 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 도입되고, iPSC는 기능적 분화 조혈 세포를 생성하도록 유도 분화를 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화 조혈 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 조혈 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 다른 실시형태에서, 분화 조혈 세포는 자연 원천의 NK, T 또는 NKT, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 효과기 세포이다.
이와 같이, 본 출원은 iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포를 제공하고, 이는 표 1에서 하기 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 본 출원의 표 1에 제공된 것과 같은 "CAR(2nd)"는 BCMA-CAR과 다른 표적화 특이성을 갖는 CAR을 나타내고, 비제한적인 예는 CD19, MICA/B, CD20, CD22, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나를 표적화하는 CAR을 포함한다. 표 1에 제공된 것과 같은 "IL"은 어떤 특이적 사이토카인/수용체 발현이 선택되는지에 따라 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 하나를 나타낸다. 추가로, "IL"은 또한 세포내 도메인이 없음을 제외하고는 IL15 및 IL15Rα의 절두된 융합 단백질로서 상기 기재된 IL15Δ 실시형태를 포함한다. 추가로, iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포는 CAR(BCMA-CAR 또는 제2 CAR) 및 IL 둘 모두를 포함하는 유전자형을 갖고, 상기 세포의 일 실시형태에서, CAR 및 IL은 2A 서열을 포함하는 이중시스트론성 발현 카세트에 포함된다. 비교로서, 일부 다른 실시형태에서, CAR 및 IL은 iPSC 및 이의 기능적인 분화 조혈 세포에 포함된 별개의 발현 카세트에 있다. 하나의 특정 실시형태에서, CAR 및 IL 둘 모두를 발현하는 iPSC 및 이의 기능적 분화 효과기 세포에 포함된, IL은 도 1의 작제물 3 또는 작제물 4에서 IL15이고, IL15 작제물은 CAR과 함께 또는 이와 별개로 발현 카세트에 포함된다.
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
7. 추가의 변형
일부 실시형태에서, 표 1에서의 유전자형 중 어느 하나를 포함하는 iPSC, 및 이의 분화 효과기 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 인게이져, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가적으로 포함할 수 있다.
이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저는 상이한 항체의 2개 이상의 단일-사슬 가변 단편(scFv)으로 이루어진 융합 단백질이고, 적어도 하나의 scFv는 종양 특이적 표면 분자를 통해 효과기 세포 표면 분자에 결합하고 적어도 다른 것은 종양 세포에 결합한다. 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식, 또는 커플링에 사용될 수 있는 예시적인 효과기 세포 표면 분자, 또는 표면 트리거링 수용체는 본원에 개시된 것과 같은 CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C 및 키메라 Fc 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 I.2 부문에 기재된 것과 같이 CD16(F176V 및 선택적으로 S197P를 함유) 또는 CD64 세포외 도메인, 및 천연적 또는 비천연적 막관통 도메인, 자극 도메인 및/또는 신호전달 도메인을 포함하는 hnCD16이다. 일부 실시형태에서, 인게이저 인식을 위한 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 CD16은 CD16 기반 키메라 Fc 수용체(CFcR)이다. 일부 실시형태에서, CD16 기반 CFcR은 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함하고; hnCD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고; CD16의 세포외 도메인은 F176V 및 선택적으로 S197P를 포함한다. 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 인식을 위한 예시적인 종양 세포 표면 분자는 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-카드헤린, ROR1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD19이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-CD30 또는 CD64-CD30이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD16-BCMA 또는 CD64-BCMA이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 CD3-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는, 효과기 NK 세포가 효과기 세포 확장을 용이하게 하기 위한 링커(일부 간행물에서 TriKE 또는 삼중특이적 살해 인게이저라 칭함)로서, 효과기 세포와 종양 세포 항원 결합 도메인, 예를 들어 변형된 IL15 사이의 링커를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-EPCAM 또는 CD64-IL15-EPCAM이다. 다른 실시형태에서, TriKE는 CD16-IL15-CD33 또는 CD64-IL15-CD33이다. 또 다른 실시형태에서, TriKE는 NKG2C-IL15-CD33("2C1533")이다.
일부 실시형태에서, 이중특이적 인게이져 또는 다중특이적 인게이져를 위한 표면 트리거링 수용체는 때때로 세포 유형에 따라 효과기 세포에 내인성일 수 있었다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 표면 트리거링 수용체는 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여, 즉 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 iPSC의 추가 조작을 통해 효과기 세포로 도입될 수 있어서, T, NK 또는 원천 iPSC와 동일한 유전자형 및 표면 트리거링 수용체를 포함하는 임의의 다른 효과기 세포로의 iPSC의 분화를 유도한다.
8. 면역요법을 위한 항체
일부 실시형태에서, 병태, 질환 또는 적응증과 연관된 항원을 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 추가의 치료제는, 본원에 제공된 것과 같은 게놈 조작된 효과기 세포 이외에도, 조합 치료에서 이들 효과기 세포와 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래 효과기 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래 효과기 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 CD20 항체(리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), HER2 항체(트라스투주맙, 페르투주맙), CD52 항체(알렘투주맙), EGFR 항체(세툭시맙), GD2 항체(디누툭시맙), PDL1 항체(아벨루맙), CD38 항체(다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), CD123 항체(7G3, CSL362), SLAMF7 항체(엘로투주맙), MICA/B 항체(7C6, 6F11, 1C2), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 T 세포를 포함한다.
액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 실시형태에서, 조합은 미리선택된 단일클론 항체 및 적어도 BCMA-CAR을 포함하는 iPSC 유래 NK 세포 또는 T 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 다른 실시형태에서, 조합은 예비선택된 단일클론 항체 및 적어도 BCMA-CAR 및 hnCD16을 포함하는 iPSC 유래 NK 세포 또는 T 세포를 포함한다. 액체 종양 또는 고형 종양을 치료하는 데 유용한 조합의 일부 실시형태에서, 조합은 적어도 BCMA-CAR, CD38 null 및 CD38 항체를 포함하는 iPSC 유래 NK 세포 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 조합은 BCMA-CAR, CD38 null 및 hnCD16; 및 CD38 항체, 다라투무맙, 이사툭시맙 및 MOR202 중 하나를 포함하는 iPSC 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 조합은 BCMA-CAR, CD38 null 및 hnCD16, 및 다라투무맙을 포함하는 iPSC 유래 NK 세포를 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 다라투무맙과 조합되어 포함된 iPSC 유래 NK 세포는 BCMA-CAR CD38 null, hnCD16, IL15 및 CAR 표적화 CD38, 또는 CD19, MICA/B, CD20, CD22, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 하나를 포함하고; IL15는 CAR과 동시발현되거나 별개로 발현되고; IL15는 도 1의 작제물 1 내지 작제물 7에 제시된 형태 중 어느 하나로 있다. 일부 특정 실시형태에서, IL15는 CAR과 동시발현되거나 별개로 발현될 때 작제물 3, 작제물 4 또는 작제물 7의 형태로 있다.
9. 관문 억제제
관문은 억제되지 않을 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 분자, 대개 세포 표면 분자이다. 종양이 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대해 면역 내성의 주요 기전으로서 소정의 면역-관문 경로를 끌어들인다는 것이 이제 명확하다. 관문 억제제(CI)는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있고, 이로써 억제성 관문을 차단하여 면역계 기능을 회복할 수 있는 길항제이다. PD1/PDL1 또는 CTLA4를 표적화하는 관문 억제제의 발생은 종양학 풍경을 변화시켰고, 이들 작용제는 다수의 적응증에서 장기간 관해를 제공한다. 그러나, 많은 종양 하위유형은 관문 봉쇄 치료에 내성이고, 재발은 상당한 우려로 남아 있다. 본 출원의 일 양태는 CI와의 조합 치료에 제공된 것과 같은 유전 조작된 기능적 분화 세포를 포함함으로써 CI 내성을 극복하기 위한 치료 접근법을 제공한다. 조합 치료의 일 실시형태에서, 분화 세포는 NK 세포이다. 조합 치료의 다른 실시형태에서, 분화 세포는 T 세포이다. 본원에 제공된 분화 NK 세포는 직접적인 항종양 능력을 나타내는 것 이외에도 PDL1-PD1 매개된 억제에 내성이고, T 세포 이동을 향상시키고, 종양 미세환경에 T 세포를 동원하고, 종양 부위에서 T 세포 활성화를 증대시키는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 기능적으로 강력한 게놈 조작된 분화 NK 세포에 의해 용이해진 T 세포의 종양 침윤은 상기 NK 세포가 국소 면역억제를 완화하고 종양 부담을 감소시키도록 관문 억제제를 포함하는 T 세포 표적화된 면역요법과 상승작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
일 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 유래 NK 세포는 BCMA-CAR 및 선택적으로 CD38 넉아웃, hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, 제2 CAR, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함하고; B2M이 넉아웃될 때, HLA-G 또는 CD58 또는 CD54 넉아웃 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 NK 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 NK 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 이의 항체 기능적 또는 단편 또는 변이체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가적으로 포함한다.
다른 실시형태에서, 관문 억제제 조합 치료를 위한 유래 T 세포는 BCMA-CAR 및 선택적으로 CD38 넉아웃, hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, 제2 CAR, 및 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체 발현의 1개, 2개, 3개 또는 그 이상을 포함하고; B2M이 넉아웃될 때, HLA-G 또는 CD58 또는 CD54 넉아웃 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 분화 T 세포는 표 1에 열거된 유전자형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 분화 T 세포는 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, Fc 수용체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가적으로 포함한다.
상기의 상기 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 BCMA-CAR 및 선택적으로 CD38 넉아웃, hnCD16 발현, B2M/CIITA 넉아웃, 제2 CAR, 및 외인성 표면 마커 사이토카인 발현의 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개를 포함하는 iPSC 클론 계통을 분화하여 얻고; B2M이 넉아웃될 때 HLA-G 또는 CD58 및 CD54 넉아웃 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기의 상기 iPSC 클론성 계통은 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 또는 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 인게이저, 및 이중특이적 인게이저, 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 것과 같은 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포와의 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG3(Lag3, CD223), CTLA4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개 또는 2개, 또는 3개, 또는 그 이상의 관문 억제제는 아테졸리주맙(PDL1 mAb), 아벨루맙(PDL1 mAb), 더발루맙(PDL1 mAb), 트레멜리무맙(CTLA4 mAb), 이필리무맙(CTLA4 mAb), IPH4102(KIR 항체), IPH43(MICA 항체), IPH33(TLR3 항체), 리리무맙(KIR 항체), 모날리주맙(NKG2A 항체), 니볼루맙(PD1 mAb), 펨브롤리주맙(PD1 mAb), 및 임의의 이들의 유도체, 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 많은 miRNA가 면역 관문의 발현을 제어하는 조절자로서 발견되면서 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 마이크로RNA-기반이다(문헌[Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115]). 일부 실시형태에서, 관문 길항제성 miRNA는 miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR-34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 및 miR-29c를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
제공된 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포와의 조합 치료의 일부 실시형태는 적어도 하나의 관문 분자를 표적화하기 위한 적어도 하나의 관문 억제제를 포함하고; 분화 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 갖는다. 제공된 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개 또는 그 이상의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개 또는 그 이상의 관문 억제제를 포함한다. 적어도 하나의 관문 억제제 및 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 분화 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 상기 관문 억제제는 항체, 또는 이의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 또는 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이고, 상기 관문 억제제는 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 분화 세포에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 관문을 억제하는 항체, 또는 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 별개의 작제물에서 또는 CAR 및 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열 둘 모두를 포함하는 이중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현된다. 일부 추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열은 예를 들어 CAR-2A-CI 또는 CI-2A-CAR로 예시된 자가 절단 2A 암호화 서열을 통해 CAR 발현 작제물의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 이와 같이, 관문 억제제의 암호화 서열 및 CAR은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에 있다. 종양 미세환경(TME)을 침윤시킬 수 있는 분화 효과기 세포에 의해 페이로드로서 관문 억제제가 전달되고 발현되고 분비될 때, 이것은 TME 결합 시 억제성 관문 분자에 대응하여서, CAR 또는 활성화 수용체와 같은 활성화 양상에 의한 효과기 세포의 활성화가 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 PD1, PDL-1, TIM3, TIGIT, LAG3, CTLA4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR의 관문 분자 중 적어도 하나를 억제한다. 일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 분화 세포에서 CAR과 동시발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편, 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 일부 다른 실시형태에서, CAR과 동시발현된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
본원에 제공된 분화 세포 및 관문 분자를 억제하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조합 치료의 일부 다른 실시형태에서, 상기 항체는 분화 세포에 의해 또는 이것에서 제조되지 않고, 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 분화 세포의 투여 전에, 이와 같이 또는 이것 후에 추가적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제공된 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포와의 조합 치료에서 1종, 2종, 3종 또는 그 이상의 관문 억제제의 투여는 동시적이거나 순차적이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 조합 치료의 일 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 트레멜리무맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러 중 하나 이상이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 아테졸리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 및 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 니볼루맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다. 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 유래된 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태에서, 치료에 포함된 관문 억제제는 펨브롤리주맙, 또는 이의 인간화된 변이체, 단편 또는 Fc 변형된 변이체, 단편 또는 이의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러이다.
II. iPSC에서 선택 좌위에서 표적화된 게놈 편집을 위한 방법
본원에 상호교환 가능하게 사용된 게놈 편집 또는 게놈성 편집 또는 유전 편집은 DNA가 표적화된 세포의 게놈에서 삽입되고/되거나, 결실되고/되거나, 대체되는 유전 조작의 유형이다. 표적화된 게놈 편집("표적화된 게놈 편집" 또는 "표적화된 유전성 편집"과 상호교환 가능함)은 게놈에서 예비선택된 부위에서 삽입, 결실 및/또는 치환이 가능하게 한다. 표적화된 편집 동안 삽입 부위에서 내인성 서열이 결실될 때, 영향을 받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 결실로 인해 넉아웃되거나 넉다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 정확하게 내인성 유전자 발현을 파괴하도록 또한 사용될 수 있다. 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실과 함께 또는 이것 없이 하나 이상의 외인성 서열의 삽입을 수반하는 과정을 지칭하는 "표적화된 통합"이라는 용어는 본원에서 유사하게 사용된다. 비교하면, 무작위로 통합된 유전자는 위치 효과 및 침묵화로 처리되어 이의 발현이 신뢰성이 없고 예측 불가능하게 만든다. 예를 들어, 센트로머 및 하위텔로머 영역은 전이유전자 침묵화가 되기 특히 쉽다. 호혜적으로, 새로 통합된 유전자는 둘러싼 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미칠 수 있어서, 잠재적으로 세포 거동을 변경하거나 세포 형질전환을 선호한다. 따라서, 안전 항구 좌위, 또는 게놈 안전 항구(GSH: genomic safe harbor)와 같은 예비-선택 좌위에서의 외인성 DNA의 삽입은 안전성, 효율, 카피수 제어 및 신뢰성 있는 유전자 반응 제어에 중요하다. 유리하게는, 외인성 DNA는 예비-선택 좌위에 삽입될 수 있으며 이 좌위에서 넉다운 및 넉아웃을 포함하는 유전자 발현의 파괴가 의도된다.
뉴클레아제 독립적 접근법을 통해 또는 뉴클레아제 의존적 접근법을 통해 표적화된 편집이 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기계를 통해 삽입되는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 측접시키는 상동성 서열에 의해 가이드된다.
대안적으로, 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의해 이중 가닥 절단(DSB: double strand break)의 특이적 도입을 통해 표적화된 편집이 더 높은 빈도로 달성될 수 있었다. 이러한 뉴클레아제 의존적 표적화된 편집은 DSB에 반응하여 생기는 비상동성 말단 봉합(NHEJ: non-homologous end joining)을 포함하는 DNA 수선 기전을 이용한다. NHEJ는 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터 없이는 대개 적은 수의 내인성 뉴클레오타이드의 무작위 삽입 또는 결실(in/del)로 이어진다. 비교하면, 한 쌍의 상동성 아암에 의해 측접된 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 벡터가 존재할 때, 외인성 유전 재료는 상동성 재조합에 의해 상동성 유도 수선(HDR: homology directed repair) 동안 게놈으로 도입되어서, "표적화된 통합"을 생성시킨다. 일부 상황에서, 표적화된 통합 부위는 선택된 유전자의 암호화 영역 내에 있도록 의도되고, 이에 따라 표적화된 통합은 유전자 발현을 파괴시켜서, 하나의 단일 편집 단계에서 동시의 넉인 및 넉아웃(KI/KO)을 생성시킬 수 있었다.
동시에 유전자를 넉아웃하기 위한 관심의 유전자 좌위(GOI)에서 선택된 위치에서의 하나 이상의 전이유전자의 삽입은 예시를 위해 CD38 유전자 좌위를 사용하는 도 2a 내지 도 2d에 예시된 작제물 설계에 의해 달성될 수 있다. 동시의 넉인 및 넉아웃(KI/KO)에 적합한 다른 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 위치 선택적 삽입을 위한 각각의 CD38 표적화 상동성 아암에 의해, 본원에 제공된 작제물은 CD38 내인성 프로모터 하에서 또는 작제물에 포함된 외인성 프로모터 하에서 전이유전자(들)가 발현되게 한다(도 2a를 도 2b와 비교하고, 도 2c를 도 2d와 비교한다). CD38 좌위 내의 선택적 삽입/넉아웃 위치는 작제물에 포함된 플랭킹 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암(LHA/CD38 및 RHA/CD38)의 서열에 적합하다. LHA/CD38 및 RHA/CD38은 CD38 좌위 내의 미리선택된 표적화 부위에 따라 가변적인 길이 및 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예비선택된 표적화 부위는 CD38의 엑손 내에 있다. CD38 좌위에서의 선택된 위치에서 2개 이상의 전이유전자가 삽입될 때, 링커 서열, 예를 들어 2A 링커 또는 IRES는 임의의 2개의 전이유전자들 사이에 위치한다. 2A 링커는 FMDV, ERAV, PTV-I 및TaV(각각 "F2A", "E2A", "P2A" 및 "T2A"라고 칭함)로부터 유래된 자가 절단 펩타이드를 암호화하여, 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 및/또는 외인성 프로모터 침묵화의 위험을 감소시키도록 절연인자는 작제물에 포함된다. 외인성 프로모터는 CAG, 또는 비제한적인 예로서 CMV, EF1α, PGK, 및 UBC를 포함하는 다른 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있다.
특이적인 및 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용 가능한 엔도뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease), 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease), RNA 가이드된 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부: Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat) 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가적으로, phiC31 및 Bxb1 인터그라제를 이용한 DICE(이중 인터그라제 카세트 교환) 시스템은 또한 표적화된 통합에 대한 유망한 도구이다.
ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "징크 핑거 DNA 결합 도메인" 또는 "ZFBD"에 의해 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인이 의도된다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개의 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예는 비제한적인 예로서 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거 및 C4 징크 핑거를 포함한다. "설계된" 징크 핑거 도메인은 설계/조성이 주로 합리적 기준, 예를 들어 치환 규칙의 적용 및 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 가공 정보에 대한 컴퓨터화 알고리즘으로부터 생기는 성질에서 발생하지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 미국 특허 제6,453,242호; 및 미국 특허 제6,534,261호를 참조하고; 또한 국제공개 WO 98/53058호; 국제공개 WO 98/53059호; 국제공개 WO 98/53060호; 국제공개 WO 02/016536호 및 국제공개 WO 03/016496호를 참조한다. "선택된" 징크 핑거 도메인은 주로 경험적 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 제조되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 더 자세히 기재되어 있고, 이의 완전한 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 당해 분야에서 ZFN의 가장 인식되는 예는 징크 핑거 DNA 결합 도메인과의 FokI 뉴클레아제의 융합이다.
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자 유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인" 또는 "TALE DNA 결합 도메인"에 의해 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합을 담당하는 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인이 의도된다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 분비된다. 이 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가고, 이의 DNA 결합 도메인을 통해 효과기 특이적 DNA 서열에 결합하고, 이의 전사촉진 도메인을 통해 이 서열에서 유전자 전사를 활성화한다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 효과기-가변 수의 불완전 34개 아미노산 반복부에 따라 달라지고, 이는 반복 가변-이중잔기(RVD: repeat variable-diresidue)라 칭하는 선택 반복부 위치에서 다형성을 포함한다. TALEN은 본원에 인용되어 포함된 미국 특허출원공개 US 2011/0145940호에 더 자세히 기재되어 있다. 당해 분야에서 TALEN의 가장 인식되는 예는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 대한 FokI 뉴클레아제의 융합 폴리펩타이드이다.
해당 방법에서 사용하는 표적화된 뉴클레아제의 다른 예는 표적화된 Spo11 뉴클레아제, DNA 결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 Spo11 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 관심 DNA 서열에 대한 특이성을 갖는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 등이다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 61/555,857호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가의 예는 개별적으로 사용되든 또는 조합으로 사용되든 비제한적인 예로서 Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른 비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제; cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm 및 cmr을 포함하는 패밀리로부터의 CRISPR 관련된 뉴클레아제; 제한 엔도뉴클레아제; 메가뉴클레아제; 호밍 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.
한 예로서 Cas9를 사용하여, CRISPR/Cas9는 (1) Cas9 엔도뉴클레아제 및 (2) crRNA-tracrRNA 복합체의 2개의 주요 성분을 요한다. 2개의 성분은 동시발현될 때 PAM 및 PAM 근처의 시딩 영역을 포함하는 표적 DNA 서열에 동원된 복합체를 형성한다. 선택된 서열을 표적화하기 위해 Cas9를 가이드하도록 키메라 가이드 RNA(gRNA)를 형성하기 위해 crRNA 및 tracrRNA를 조합할 수 있다. 이후, 이들 2개의 성분은 형질주입 또는 형질도입을 통해 포유동물 세포로 전달될 수 있다.
DICE 매개된 삽입은 각각의 효소의 자체의 작은 attB 및 attP 인식 부위로 치밀히 제한된 외인성 DNA의 단향성 통합을 제공하기 위해 한 쌍의 재조합효소, 예를 들어 phiC31 및 Bxb1을 사용한다. 이 표적 att 부위는 포유동물 게놈에서 천연적으로 존재하지 않으므로, 이것은 처음에 원하는 통합 부위에서 게놈으로 도입되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2015/0140665호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명의 일 양태는 표적화된 게놈 통합에 대한 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 작제물은 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 추가로 포함하고, 표적화된 통합 방법은 세포 숙주 효소 기계에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 세포에 작제물을 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함한다.
표적화된 통합에 유망한 부위는 이론적으로 숙주 세포 또는 유기체에 대한 불리한 효과를 갖지 않으면서 새로 통합된 DNA의 예측 가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 영역 또는 유전자외 영역인 안전 항구 좌위 또는 게놈 안전 항구(GSH)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유용한 안전 항구는 벡터 암호화된 단백질 또는 비암호화 RNA의 원하는 수준을 생성하기에 충분한 전이유전자 발현이 가능하게 해야 한다. 안전 항구는 또한 세포를 악성 형질전환에 취약하게 하지도 세포 기능을 변경하지도 않아야 한다. 가능한 안전 항구 좌위인 통합 부위에 대해, 비제한적인 예로서 서열 주석에 의해 판단되는 것처럼 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재의 조건; 유전자 치밀 부위에서의 유전자간 영역, 또는 반대의 방향에서 전사된 2개의 유전자들 사이의 수렴에서의 위치에 있는 조건; 벡터 암호화된 전사 활성자와 인접한 유전자, 특히 암 관련된 유전자 및 마이크로RNA 유전자의 프로모터 사이의 긴 범위 상호작용의 가능성을 최소화하기 위한 거리의 유지의 조건; 및 유비쿼터스 전사 활성을 나타내는 넓은 공간적 및 시간적 발현된 서열 태그(EST: expressed sequence tag) 발현 패턴에 의해 반영된 것처럼 명백히 유비쿼터스 전사 활성을 가짐의 조건을 포함하는 조건을 충족하는 것이 이상적으로 필요하다. 이 후자의 특징은 줄기 세포에서 특히 중요하고, 여기서 분화 동안, 염색질 개형은 통상적으로 일부 좌위의 침묵화 및 다른 것의 잠재적 활성화로 이어진다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서 삽입에 선택된 정확한 좌위는 반복적 요소 및 보존된 서열이 없어야 하고, 상동성 아암의 증폭을 위한 프라이머가 쉽게 설계될 수 있었다.
인간 게놈 편집, 또는 구체적으로 표적화된 통합에 적합한 부위는 아데노 연관된 바이러스 부위 1(AAVS1), 케모카인(CC 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자 좌위 및 마우스 ROSA26 좌위의 인간 오솔로그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가적으로, 마우스 H11 좌위의 인간 오솔로그는 또한 본원에 개시된 표적화된 통합의 조성물 및 방법을 이용하여 삽입에 적합한 부위일 수 있다. 추가로, 콜라겐 및 HTRP 유전자 좌위는 표적화된 통합에 대한 안전 항구로서 또한 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 선택된 부위의 검증은 특히 특이적 통합 사건에 대해 줄기 세포에서 필요한 것으로 나타났고, 프로모터 선출, 외인성 유전자 서열 및 정렬, 및 작제물 설계를 포함하는 삽입 전략의 최적화가 대개 필요하다.
표적화된 삽입/결실을 위해, 편집 부위는 대개 발현 및/또는 기능이 파괴되도록 의도된 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 면역 반응 조절 및 조정과 연관된다. 일부 다른 실시형태에서, 표적화된 삽입/결실을 포함하는 내인성 유전자는 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약물 표적 후보자, 면역 반응 조절 및 조정, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포, 및 이로부터 유래된 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 억제하는 단백질과 연관된다.
이와 같이, 본 발명의 일 양태는 게놈 안전 항구를 포함하는 선택 좌위 또는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 좌위와 같은 연속적 또는 시간적 유전자 발현에 대해 안전하고 잘 조절되는 것으로 공지되거나 입증된 예비선택 좌위에서 표적화된 통합 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합은 통합의 결과로서 유전자의 넉다운 또는 넉아웃이 원해지는 유전자 좌위 중 하나에 있고, 이러한 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 세포 숙주 효소 기전에 의해 부위 특이적 상동성 재조합이 가능하게 하도록 하나 이상의 외인성 서열 및 원하는 통합 부위에 특이적인 한 쌍의 상동성 아암을 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 ZFN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 ZFN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 TALEN 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 원하는 통합 부위에 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 TALEN 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포에서의 표적화된 통합 방법은 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, Cas9 매개된 삽입이 가능하게 하도록 세포로 Cas9 발현 카세트, 및 원하는 통합 부위에 특이적인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 도입하는 단계를 포함하고, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에서 표적화된 통합의 방법은 세포에서 원하는 통합 부위로 한 쌍의 DICE 재조합효소의 하나 이상의 att 부위를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 세포로 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 도입하는 단계, 및 DICE 매개된 표적화된 통합이 가능하게 하도록 DICE 재조합효소에 대한 발현 카세트를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 원하는 통합 부위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함한다.
추가로, 본원에 제공된 것처럼, 안전 항구에서 표적화된 통합을 위한 상기 방법은 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 및 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물에서 외인성 폴리뉴클레오타이드는 안전 스위치 단백질을 암호화하는 자살 유전자이다. 유도된 세포사에 적합한 자살 유전자 시스템은 비제한적인 예로서 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7) 및 AP1903; 티미딘 키나제(TK) 및 간시클로버(GCV); 사이토신 탈아미노효소(CD) 및 5-플루오로사이토신(5-FC)을 포함한다. 추가적으로, 일부 자살 유전자 시스템은 세포 유형 특이적이고, 예를 들어 B 세포 분자 CD20에 의한 T 림프구의 유전자 변형은 mAb 리툭시맙의 투여 시 이의 제거가 가능하게 한다. 추가로, 세툭시맙에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 변형된 EGFR은 세포가 세툭시맙에 노출될 때 유전 조작된 세포를 고갈시키도록 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 양태는 카스파제 9(카스파제 3 또는 7), 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소, 변형된 EGFR 및 B 세포 CD20으로부터 선택된 안전성 스위치 단백질을 암호화하는 하나 이상의 자살 유전자의 표적화된 통합 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에서의 방법에 의해 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 통합을 위해 작제물에 포함된 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 유도된다. 프로모터는 유도성 또는 항시적일 수 있고, 시간 특이적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 항시적 프로모터는 비제한적인 예로서 사이토메갈로바이러스(CMV), 연장 인자 1α(EF1α), 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 하이브리드 CMV 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 및 유비퀴틴C(UBC) 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 CAG이다.
본원에서의 방법에 의해 통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합 부위에서 숙주 게놈에서의 내인성 프로모터에 의해 추진될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 AAVS1 좌위에서의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 AAVS1 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 ROSA26 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 ROSA26 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 H11 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 H11 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 콜라겐 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 콜라겐 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포의 게놈에서 HTRP 좌위에서의 표적화된 통합에 사용된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 통합된 폴리뉴클레오타이드는 내인성 HTRP 프로모터에 의해 유도된다. 이론적으로, 원하는 위치에서의 오직 정확한 삽입이 내인성 프로모터에 의해 추진된 외인성 유전자의 유전자 발현이 가능하게 할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적화된 통합의 방법을 위해 작제물에 포함된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 하나의 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, 작제물은 모이어티 사이의 더 큰 물리적 분리를 제공하고 효소 기계에 대한 접근 가능성을 최대화하도록 동일한 프로모터에 의해 추진된 2개의 인접한 폴리뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열의 링커 펩타이드는 모이어티(외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이로부터 암호화된 단백질 또는 펩타이드) 사이의 물리적 분리가 관련된 기능에 따라 보다 가요성이거나 보다 경질이 되게 하도록 선택된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커 서열은 별개의 모이어티를 생성하도록 프로테아제에 의해 절단 가능하거나 화학적으로 절단 가능할 수 있다. 링커에서의 효소 절단 부위의 예는 엔테로키나제, Xa 인자, 트립신, 콜라게나제 및 트롬빈과 같은 단백분해 효소에 의한 절단을 위한 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 숙주에 의해 천연적으로 제조된 것이거나, 이것은 외인성으로 도입된다. 대안적으로, 링커에서의 절단 부위는 선택된 화학물질, 예를 들어 시아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 또는 낮은 pH에 대한 노출 시 절단될 수 있는 부위일 수 있다. 선택적인 링커 서열은 절단 부위의 제공 이외의 목적을 제공할 수 있다. 링커 서열은 모이어티가 적절히 작용하도록 다른 인접한 모이어티와 관련하여 모이어티의 효과적인 배치가 가능하게 해야 한다. 링커는 또한 모이어티 사이의 임의의 입체 장애를 막기에 충분한 길이의 단순한 아미노산 서열일 수 있다. 게다가, 링커 서열은 비제한적인 예로서 예를 들어 인산화 부위, 비오티닐화 부위, 황화 부위, γ-카복실화 부위 등을 포함하는 번역후 변형을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 단일의 원치 않는 입체형태의 생물학적 활성 펩타이드를 보유하지 않도록 가요성이다. 링커는 가요성을 제공하도록 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로 주로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 80 또는 90% 이상의 링커 서열은 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 여러 실시형태에서, G4S 링커 펩타이드는 융합 단백질의 말단 가공 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 분리시킨다. 다른 실시형태에서, 2A 링커 서열은 2개의 별개의 단백질이 단일 번역으로부터 제조되게 한다. 적합한 링커 서열은 용이하게 경험적으로 확인될 수 있다. 추가적으로, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열은 종래의 컴퓨터 모델링 기법에 의해 또한 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 서열은 자가 절단 펩타이드를 암호화한다. 일 실시형태에서, 자가 절단 펩타이드는 2A이다. 일부 다른 실시형태에서, 링커 서열은 내부 리보솜 진입 서열(IRES: Internal Ribosome Entry Sequence)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 임의의 2개의 연속적 링커 서열은 상이하다.
특히 공지된 세포로의 유전자 이동의 방법을 이용하여 표적화된 통합을 위한 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물을 세포로 도입하는 방법이 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 작제물은 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 표적 세포(예를 들어, pAl- 11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등에 외인성 폴리뉴클레오타이드를 전달하고/하거나 발현하도록 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 에피솜 벡터는 표적 세포에 외인성 폴리뉴클레오타이드를 전달하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)는 상동성 재조합을 통해 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 유전 조작을 위해 사용될 수 있다. rAAV는 렌티바이러스와 달리 숙주 게놈으로 통합되지 않는다. 게다가, 에피솜 rAAV 벡터는 종래의 표적화 플라스미드의 형질주입과 비교하여 훨씬 더 높은 속도로 상동성 유도 유전자 표적화를 매개한다. 일부 실시형태에서, AAV6 또는 AAV2 벡터는 iPSC의 게놈에서의 표적 부위에서 삽입, 결실 또는 치환을 도입하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
III. 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지하는 방법
본 발명은 하나 이상의 원하는 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하고 유지시키는 방법을 제공하고, 표적화된 편집은 각각의 선택된 편집 부위에서 증식된 게놈 조작된 iPSC 또는 iPSC 유래 비만능 세포에서 온전하고 기능적으로 있는다. 표적화된 편집은 게놈 iPSC 및 이로부터의 분화 세포로 삽입, 결실 및/또는 치환, 즉 선택된 부위에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 도입한다. 환자 원천의, 말초혈 유래된 일차 효과기 세포의 직접적인 조작과 비교하여, 본원에 제공된 것과 같은 iPSC의 편집 및 분화를 통한 게놈 조작된 분화 세포를 수득하는 것의 많은 이익은 조작된 효과기 세포에 대한 비제한된 원천; 특히 다수의 조작된 양상이 관여될 때 효과기 세포의 반복 조작의 필요성이 없음; 얻은 효과기 세포가 연장된 텔로미어를 갖기 위해 재생되고 탈진을 덜 경험함; 효과기 세포 집단은 주로 본원에 제공된 것과 같은 조작된 iPSC에서의 가능해진 클론 선택으로 인해 편집 부위, 카피수, 및 대립유전자 변이의 부재, 랜덤 돌연변이 및 발현 다양성의 측면에서 균일함을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 부위에서 하나 이상의 표적화된 편집을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 운명 유지 배지(FMM: Fate Maintenance Medium)로서 표 2에 기재된 세포 배양 배지에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서 유지되고 계대배양되고 증식되고, 여기서 iPSC는 선택된 부위(들)에서 표적화된 편집 및 기능적 변형을 보유한다. 배지의 성분은 표 2에 도시된 최적 범위 내의 양으로 배지에 존재할 수 있다. FMM에서 배양된 iPSC는 배양 세정 또는 선택의 필요 없이 이의 비분화된, 및 기본 또는 미경험 프로파일; 게놈 안정성을 계속해서 유지시키는 것으로 나타났고; 모든 3개의 체세포 계통, 배양체 또는 단층을 통한 시험관내 분화(배양체 형성 없음); 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화를 용이하게 발생시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제61/947,979호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
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일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK5 억제제가 없거나 본질적으로 없는 배지에서 유지되고 계대배양되고 증식되고, iPSC는 선택된 부위에서 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다.
본 발명의 다른 양태는 iPSC의 표적화된 편집을 통해; 또는 표적화된 편집에 의해 게놈 조작된 비만능 세포를 처음에 생성하고 이후에 비만능 세포와 동일한 표적화된 편집을 포함하는 iPSC를 얻기 위해 선택된/단리된 게놈 조작된 비만능 세포의 재프로그래밍을 통해 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 양태는 세포로 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입/결실을 도입함으로써 현재 재프로그래밍을 겪는 비만능 세포의 게놈 조작을 제공하고, 접촉된 비만능 세포는 재프로그래밍에 충분한 조건 하에 있고, 재프로그래밍에 대한 조건은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 동시의 게놈 조작 및 재프로그래밍에 대한 방법의 다양한 실시형태에서, 표적화된 통합 및/또는 표적화된 삽입/결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 선택적으로 소분자와 접촉시켜 재프로그래밍을 개시하기 전에, 또는 본질적으로 이와 동시에 비만능 세포로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 동시에 게놈 조작하고 재프로그래밍하기 위해, 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실은 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 소분자와 접촉시켜 개시된 재프로그래밍의 수일 과정 후 비만능 세포로 또한 도입될 수 있고, 재프로그래밍 세포가 비제한적인 예로서 SSEA4, Tra181 및 CD30을 포함하는 하나 이상의 내인성 만능 유전자의 안정한 발현을 제시하기 전에 작제물을 보유하는 벡터가 도입된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합과 접촉시켜 재프로그래밍이 개시된다(FRM; 표 2). 일부 실시형태에서, 임의의 상기 방법을 통해 게놈 조작된 iPSC는 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합을 포함하는 혼합물을 사용하여 추가로 유지되고 증식된다(FMM; 표 2).
게놈 조작된 iPSC의 생성 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 표 1에 열거된 유전자형을 갖는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 iPSC로 도입하여 iPSC를 게놈 조작하는 것을 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 포함하는 게놈-조작된 비만능 세포를 얻도록 하나 이상의 표적화된 편집을 비만능 세포로 도입하는 단계, 및 (b) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻도록 게놈 조작된 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 게놈 조작된 iPSC를 생성하는 방법은 (a) 비만능 세포의 재프로그래밍을 개시하도록 비만능 세포를 하나 이상의 재프로그래밍 인자, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및/또는 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 조성물과 접촉시키는 단계; (b) 게놈 조작을 위해 재프로그래밍 비만능 세포로 하나 이상의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 도입하는 단계; 및 (c) 선택된 부위에서 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 포함하는 클론 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 단계를 포함한다.
재프로그래밍 인자는 국제출원 PCT/US2015/018801호 및 국제출원 PCT/US16/57136호에 개시된 것처럼 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. 재프로그래밍 인자는 또한 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있고, 이에 따라 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 플라스미드 및 미니서클과 같은 벡터에 의해 비만능 세포로 도입된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 벡터에 의해 도입된다. 다양한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 센다이 바이러스 벡터에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 고려되는 플라스미드와 다양한 재프로그래밍 인자의 화학량론의 조합에 의해 도입된다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 62/571,105호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 비만능 세포는 동일한 선택 부위 또는 상이한 선택 부위에서 표적화된 통합을 위해 다수의 벡터에 의해 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상이한 프로모터를 포함하는 다수의 작제물에 의해 옮겨진다. 이 외인성 폴리뉴클레오타이드는 자살 유전자, 또는 표적화 양상을 암호화하는 유전자, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 또는 iPSC 또는 이의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비제한적인 예로서 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하는 RNA를 암호화한다. 이 외인성 폴리뉴클레오타이드는 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간 특이적 프로모터, 및 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로모터에 의해 추진될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 유도제의 존재 하에 또는 특정 분화된 세포 유형에서 프로모터를 활성화하는 조건 하일 때 발현 가능하다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 iPSC에서 및/또는 iPSC로부터 분화된 세포에서 발현된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자는 항시적 프로모터에 의해 유도되고, 예를 들어 Capase-9는 CAG에 의해 유도된다. 상이한 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상이한 프로모터를 함유하는 이 작제물은 동시에 또는 연속적으로 비만능 세포로 이송될 수 있다. 다수의 작제물의 표적화된 통합으로 처리되는 비만능 세포는 게놈 조작과 동시에 재프로그래밍을 개시하도록 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 동시에 접촉하여서, 동일한 세포 풀에서 다수의 표적화된 통합을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 얻을 수 있다. 이와 같이, 이 강건한 방법은 하나 이상의 선택된 표적 부위로 통합된 다수의 양상을 갖는 클론 게놈 조작된 hiPSC를 유래하기 위한 동시의 재프로그래밍 및 조작 전략이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
IV. 게놈 조작된 iPSC를 분화하여 유전 조작된 효과기 세포를 얻는 방법
본 발명의 추가의 양태는 기형종 형성에 의한 게놈 조작된 iPSC의 생체내 분화의 방법을 제공하고, 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 원하는 부위(들)에서의 표적화된 통합 및/또는 삽입/결실을 포함하여 온전하고 기능적인 표적화된 편집을 보유한다. 일부 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 또는 게놈 안전 항구의 기준을 충족하는 다른 좌위를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 표적화 양상을 암호화하는, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함하는 기형종을 통해 게놈 조작된 iPSC로부터 생체내 유래된 분화된 세포는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 내인성 유전자에서 하나 이상의 삽입/결실을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 관문 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 하나 이상의 내인성 MHC 클래스 I 억제자 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 주요 조직접합성 복합체와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 삽입/결실은 비제한적인 예로서 B2M, PD1, TAP1, TAP2, 타파신, TCR 유전자를 포함하는 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 B2M(베타-2-마이크로글로불린) 암호화 유전자에서 표적화된 편집을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 것과 같은 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC는 조혈 세포 계통 또는 시험관내 임의의 다른 특정한 세포 유형을 유래하도록 사용되고, 여기서 유래된 비만능 세포는 선택된 부위(들)에서의 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다. 일 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 중배엽 세포, 한정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구세포(MPP), T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, 골수성 세포, 호중구 전구세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 여기서 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 이들 세포는 원하는 부위(들)에서 표적화된 편집을 포함하는 기능적 유전자 변형을 보유한다.
iPSC 유래 조혈 세포 계통을 수득하기 위한 적용 가능한 분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제 출원 PCT/US2016/044122호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 제공된 것처럼, 조혈 세포 계통을 생성하기 위한 방법 및 조성물은 EB 형성의 필요성 없이 확장 가능한 단층 배양 플랫폼에서 혈청 비함유, 피더 비함유 및/또는 기질 비함유 조건 하에서 hiPSC를 포함하는 만능 줄기 세포로부터 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포(HE)를 통해서이다. 제공된 방법에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기 세포로부터 특정한 말단 분화된 세포 및 전환분화된 세포(transdifferentiated cell)로 결정된 전구 세포로, 그리고 만능 중간체를 거치지 않고 조혈 운명으로 직접 이행된 다양한 계통의 세포에 이른다. 유사하게, 줄기 세포를 분화하여 제조될 수 있는 세포는 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 말단 분화된 세포로, 그리고 모든 개재하는 조혈 세포 계통에 이른다.
단층 배양에서 만능 줄기 세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화하고 증식시키는 방법은 만능 줄기 세포를 BMP 경로 활성자 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 것을 포함한다. 제공된 것처럼, 만능 줄기 세포 유래된 중배엽 세포가 얻어지고, 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 증식된다. 이후, 중배엽 세포는 만능 줄기 세포로부터 배양체를 형성함이 없이 한정적 동형유전자성 내피세포(HE) 가능성을 갖는 증식된 중배엽 세포를 얻기 위해 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와의 접촉으로 처리된다. bFGF, 및 선택적으로 ROCK 억제제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속하는 접촉에 의해, 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포는 분화 동안 또한 증식된 한정적 HE 세포로 분화한다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위한 본원에 제공된 방법이 EB 매개된 만능 줄기 세포 분화보다 우수한데, 이는 EB 형성은 보통의 세포 확장 내지는 최소 세포 확장을 야기하고, 집단에서의 세포의 균일한 확장 및 균일한 분화를 요하는 많은 분야에 있어서 중요한 단층 배양을 가능하게 하지 않고, 힘들며 효율이 낮기 때문이다.
제공된 단층 분화 플랫폼은, 조혈 줄기 세포 및 T 세포, B 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 분화된 자손이 유래되게 하는, 한정적 동형유전자성 내피세포를 향한 분화를 용이하게 한다. 단층 분화 전략은 향상된 분화 효율을 대규모 확장과 조합하여서 다양한 치료학적 분야에 대해 치료학적으로 관련된 수의 만능 줄기 세포 유래된 조혈 세포의 전달이 가능하게 한다. 추가로, 본원에 제공된 방법을 이용한 단층 배양은 시험관내 분화, 생체외 조절, 및 생체내 장기간 조혈 자가 재생, 재구성 및 생착의 완전 범위가 가능하게 하는 기능적 조혈 계통 세포를 생성시킨다. 제공된 것처럼, iPSC 유래 조혈 계통 세포는 비제한적인 예로서 한정적 동형유전자성 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, T 세포 전구세포, NK 세포 전구세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함한다.
한정적 조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 (i) 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 만능 줄기 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하도록 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF, 및 GSK3 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음); (iii) 한정적 동형유전자성 내피세포 가능성을 갖는 만능 줄기 세포 유래된 중배엽 세포로부터 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화 및 확장을 개시하도록 한정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 억제제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없음)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포를 시딩하고 증식하기 위해 만능 줄기 세포를 MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC, 또는 미경험 iPSC, 또는 하나 이상의 유전 각인을 포함하는 iPSC이고, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전 각인은 이로부터 분화된 조혈 세포에 보유된다. 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 지시하는 방법의 일부 실시형태에서, 조혈 계통의 세포로의 만능 줄기 세포의 분화는 배양체의 생성이 없고, 단층 배양 형태로 있다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻은 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻은 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 한정적 동형유전자성 내피 세포는 CD34+ CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) pre-T 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시하도록 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) T 세포 전구세포 또는 T 세포로의 pre-T 세포 전구세포의 분화를 개시하도록 pre-T 세포 전구세포를 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 T 세포 전구세포는 CD34+CD45+CD7+이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 T 세포 전구세포는 CD45+CD7+이다.
조혈 계통의 세포로 만능 줄기 세포의 분화를 지시하기 위한 상기 방법의 다른 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) pre-NK 세포 전구세포로의 한정적 동형유전자성 내피세포의 분화를 개시하도록 만능 줄기 세포 유래된 한정적 동형유전자성 내피세포를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로 (ii) NK 세포 전구세포 또는 NK 세포로의 pre-NK 세포 전구세포의 분화를 개시하도록 만능 줄기 세포 유래된 pre-NK 세포 전구세포를 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 NK 전구세포는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포 유래된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 선택적으로 추가로 한정된다.
따라서, 상기 분화 방법을 이용하여, (i) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 CD34+ HE 세포(iCD34); (ii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 동형유전자성 내피세포(iHE); (iii) iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 한정적 HSC; (iv) iMPP-A를 사용하여 다능성 전구 세포(iMPP); (v) iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 T 세포 전구세포(ipro-T); (vi) iTC-B2를 사용하여 T 세포(iTC); (vii) iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 사용하여 NK 세포 전구세포(ipro-NK); 및/또는 (viii) NK 세포(iNK) 및 iNK-B2인 iPSC 유래 조혈 세포의 하나 이상의 집단을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지:
a. iCD34-C는 ROCK 억제제, bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF 및 EPO로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 억제제가 없고;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 억제제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
c. iTC-A2는 ROCK 억제제; SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
e. iNK-A2는 ROCK 억제제, 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하고;
f. iNK-B2는 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH, RUNX1, B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT를 포함하는 하나 이상의 원하는 통합 부위에 통합된 하나 이상의 유도성 자살 유전자를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자, 또는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 비제한적인 예로서 관문 유전자, 내인성 T 세포 수용체 유전자 및 MHC 클래스 I 억제자 유전자를 포함하는 면역 반응 조절 및 매개와 연관된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된 하나 이상의 삽입/결실을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 게놈 조작된 iPSC 유래 세포는 B2M 유전자에서 삽입/결실을 추가로 포함하고, B2M은 넉아웃된다.
추가적으로, 제2 운명의 게놈 조작된 조혈 세포로 제1 운명의 게놈 조작된 조혈 세포를 얻기 위한 적용 가능한 탈분화 방법 및 조성물은 예를 들어 국제공개 WO 2011/159726호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 여기서 제공된 방법 및 조성물은 재프로그래밍 동안 내인성 Nanog 유전자의 발현을 제한함으로써; 및 원하는 세포 유형으로 중간 세포를 분화하기 위한 조건으로 비만능 중간 세포를 처리함으로써 비만능 중간 세포로 출발 비만능 세포를 부분적으로 재프로그래밍하는 것이 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에서의 방법 및 조성물을 사용하여 얻은 게놈 변형된 iPSC 및 이의 분화 세포는 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자형을 포함한다.
V. 유전 조작된 iPSC로부터 분화된 외인성 기능적 양상을 갖는 분화 면역 세포의 치료 용도
일부 실시형태에서, 본 발명은 개시된 것과 같은 방법 및 조성물을 사용하여 게놈 조작된 iPSC로부터 분화된 단리된 집단 또는 하위집단 기능적으로 향상된 분화 면역 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 iPSC 유래 면역 세포에서 보유 가능한 하나 이상의 표적화된 유전 편집을 포함하고, 유전 조작된 iPSC 및 이의 분화 세포는 세포 기반 입양 치료에 적합하다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 CD34 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proT 세포 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proNK 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 면역 조절 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 유전 조작된 면역 세포는 개선된 치료학적 가능성을 위해 생체외 추가로 변경된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 미경험 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포 및/또는 중앙 기억 T 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 I형 NKT 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 입양 NK 세포의 증가된 수 또는 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 MDSC의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 효과기 세포에서 바람직한 치료학적 속성을 전달하도록 선택된 유전 각인을 포함하고, 단 분화 동안 세포 발생 생물학은 파괴되지 않고, 단 유전 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 보유되고 기능적이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 유전 각인은 (i) iPSC로의 비만능 세포의 재프로그래밍 동안 또는 후에 만능 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자 특이적, 질환 특이적 또는 치료 반응 특이적인 원천 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료학적 속성을 포함하고, 만능 세포는 원천 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 또한 포함된 원천 치료학적 속성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 일반적으로 변형된 양상은 안전성 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보자; 또는 iPSC 또는 이의 분화 세포의 생착, 수송, 호밍, 생존능력, 자가 재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존기간을 촉진하는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 변형된 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 유전 변형된 iPSC 및 이의 분화 효과기 세포는 (1) TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, 또는 RFXAP 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 유전자의 결실 또는 발현 감소 중 하나 이상; 및 (2) HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 또는 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체의 발현 도입 또는 발현 증가를 포함하는 추가의 유전 변형된 양상을 추가로 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 하나 이상의 항원 표적화 수용체 발현; (ii) 변형된 HLA; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포의 동원 및 면역 조절; (iv) 감소된 오프 종양 효과를 갖는 개선된 온 타깃 특이성; 및 (v) 개선된 호밍, 지속성, 세포독성, 또는 항원 회피 구제 중 적어도 2개의 조합과 관련된 원천 특이적 면역 세포의 치료학적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC 분화 조혈 세포는 표 1에 열거된 유전자형을 포함하고, 상기 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 또는 IL21을 포함하는 적어도 하나의 사이토카인 및/또는 이의 수용체, 또는 임의의 이들의 변형된 단백질을 발현하고, 적어도 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 NK 세포 특이적이다. 일부 다른 실시형태에서, 사이토카인(들) 및 CAR(들)의 조작된 발현은 T 세포 특이적이다. 일 실시형태에서, CAR은 BCMA 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 분화 조혈 효과기 세포는 항원 특이적이다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 액체 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 분화 효과기 세포는 고형 종양을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 iPSC 분화 조혈 효과기 세포는 종양 항원 회피를 구제할 수 있다.
입양 세포 치료에 적합한 대상체에 대한 본 발명의 면역 세포를 유도함으로써 다양한 질환이 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 것과 같은 iPSC 분화 조혈 세포는 동종이계 입양 세포 치료를 위한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 일부 실시형태에서 입양 세포 치료에 적합한 대상체에게 상기 조성물을 도입함으로써 상기 치료학적 조성물의 치료 용도를 제공하고, 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마바이러스와 연관된 감염을 갖는다. 혈액학적 악성종양의 예는 급성 백혈병 및 만성 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML: acute myelogenous leukemia), 급성 림프아구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia), 림프종, 비호지킨 림프종(NHL: non-Hodgkin lymphoma), 호지킨병, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 고형 암의 예는 뇌, 전립선, 유방, 폐, 대장, 자궁, 피부, 간, 골, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 후두 및 식도의 암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 자가면역 장애의 예는 원형 탈모증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 피부근육염, (1형) 당뇨병, 소아 특발성 관절염의 일부 형태, 사구체신염, 그레이브스병, 길랭 바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 심근염의 일부 형태, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 류마티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 루푸스, 홍반성, 갑상선염의 일부 형태, 포도막염의 일부 형태, 백반증, 다발혈관염 동반 육아종증(베게너)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바이러스 감염의 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스), HSV(단순 포진 바이러스), KSHV(카포시 육종 연관된 헤르페스바이러스), RSV(호흡기 융합 바이러스), EBV(엡스타인 바 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스), VZV(바리셀라 조스터 바이러스), 아데노바이러스, 렌티바이러스, BK 폴리오마바이러스 연관된 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
증상에 대해 또는 재발 예방을 위해 본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포의 치료가 실행될 수 있었다. 본원에 사용된 "치료하는", "치료" 및 기타의 용어는 일반적으로 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 그 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환에 기인한 질환 및/또는 불리한 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료학적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 대상체에서의 임의의 질환 중재를 포괄하고, 질환의 소인이 있을 수 있지만 이것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; 질환의 억제, 즉 이의 발생의 정지; 또는 질환의 경감, 즉 질환 퇴행의 야기를 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 발생 전에, 동안에 및/또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화하거나 감소시키는 진행 중인 질환의 치료는 또한 특히 관심 있다. 특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 치료에 의해 적어도 하나의 연관된 증상에서 함유되고/되거나, 완화되고/되거나, 개선될 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 소정의 실시형태는 세포 치료를 필요로 하는 대상체가 골수 또는 줄기 세포 이식의 후보자, 화학요법 또는 조사 치료를 받는 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어 과증식성 장애 또는 조혈계의 암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어 고형 종양을 갖거나 발생시킬 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 연관된 질환을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 고려한다.
본원에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료에 대한 반응을 평가할 때, 임상 이익률, 사망까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반정량적 측정치, 임상 완전 관해, 임상 부분 관해, 임상 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumor: 고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준 중 적어도 하나를 포함하는 기준에 의해 반응이 평가될 수 있다.
개시된 것과 같은 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료학적 조성물은 다른 치료 전에, 동안에 및/또는 후에 투여될 수 있다. 그러므로 추가의 치료제의 사용 전에, 동안에 및/또는 후에 조합 치료의 방법은 iPSC 유래 면역 세포의 투여 또는 준비를 수반할 수 있다. 상기 제공된 것과 같이, 하나 이상의 추가 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포, 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. iPSC 유래 면역 세포의 투여는 시간, 일 또는 심지어 주에 추가의 치료제의 투여와 시간상 분리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다른 생물학적 활성제 또는 양상, 예컨대 비제한적인 예로서 항종양제, 비약물 치료, 예컨대 수술과 조합될 수 있다.
조합 세포 치료의 일부 실시형태에서, 치료학적 조합은 본원에 제공된 iPSC 유래 조혈 계통 세포 및 항체 또는 항체 단편인 추가의 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 하나 이상의 항원을 표적화하는 다수의 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래 조혈 계통 세포를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 대한 추가의 치료제로서 조합 치료에 적합한 항체는 CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), HER2 항체(예를 들어, 트라스투주맙, 페르투주맙), CD52 항체(예를 들어, 알렘투주맙), EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙), GD2 항체(예를 들어, 디누툭시맙), PDL1 항체(예를 들어, 아벨루맙), CD38 항체(예를 들어, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), CD123 항체(예를 들어, 7G3, CSL362), SLAMF7 항체(엘로투주맙), MICA/B 항체(7C6, 6F11, 1C2), 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 또는 바이오시밀러를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 관문 억제제를 포함한다. 관문은 세포 분자, 대개 억제될 때 면역 반응을 억제하거나 하향조절할 수 있는 세포 표면 분자라 칭한다. 관문 억제제는 관문 유전자 발현 또는 유전자 산물을 감소시키거나, 관문 분자의 활성을 감소시킬 수 있는 길항제이다. 본원에 제공된 것과 같은 NK 세포 또는 T 세포를 포함하는 분화 효과기 세포와의 조합 치료에 적합한 관문 억제제는 PD1(Pdcdl, CD279), PDL-1(CD274), TIM3(Havcr2), TIGIT(WUCAM 및 Vstm3), LAG3(Lag3, CD223), CTLA4(Ctla4, CD152), 2B4(CD244), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39(Entpdl), CD47, CD73(NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2(Pou2f2), 레티노산 수용체 알파(Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 및 억제성 KIR(예를 들어, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 및 3DL2)의 길항제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
제공된 분화 효과기 세포를 포함하는 조합 치료의 일부 실시형태는 관문 분자를 표적화하는 적어도 하나의 억제제를 추가로 포함한다. 제공된 분화 효과기 세포와의 조합 치료의 일부 다른 실시형태는 2개, 3개 또는 그 이상의 관문 분자가 표적화되도록 2개, 3개 또는 그 이상의 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조합 치료를 위한 분화 효과기 세포는 본원에 제공된 것처럼 기능적으로 향상된다. 일부 실시형태에서, 2종, 3종 또는 그 이상의 관문 억제제는 분화 효과기 세포의 투여와 조합 치료와 함께, 이것 전에 또는 이것 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 관문 억제제는 동시에, 또는 한 번에 1회(순차적) 투여된다.
일부 실시형태에서, 임의의 상기 관문 분자를 억제하는 길항제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제성 항체는 쥣과 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 전용 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, 단일 사슬 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 다이설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일-도메인 항원 결합 단편(sdAb, Nanobody), 재조합 중쇄 전용 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함하고, 이는 전체 항체보다 제조하기에 보다 비용 효과적이거나, 보다 용이하게 사용되거나, 보다 민감할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1개, 또는 2개 또는 3개, 또는 이것 초과의 관문 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 적어도 하나를 포함한다.
분화 효과기 세포 및 하나 이상의 관문 억제제를 포함하는 조합 치료는 비제한적인 예로서 피부 T 세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 균상 식육종, 파제트병모양 망상증, 세자리 증후군, 육아종성 이완 피부, 림프종양 구진증, 만성 태선모양 잔비늘증, 급성 두창태선모양 잔비늘증, CD30+ 피부 T 세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 대세포 림프종, 비균상 식육종 CD30 피부 T 대세포 림프종, 다형성 T 세포 림프종, 레네트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종(HL), 두경부 종양; 편평 세포 암종, 횡문근육종, 루이스 폐 암종(LLC), 비소세포 폐암, 식도 편평 세포 암종, 식도 선암, 신장 세포 암종(RCC), 대장직장암(CRC), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 위암, 전립선 소세포 신경내분비 암종(SCNC), 간암, 교모세포종, 간암, 구강 편평 세포 암종, 췌장암, 유두 갑상선암, 간내 담관세포 암종, 간세포 암종, 골암, 전이 및 비인두 암종을 포함하는 액체 암 및 고형 암의 치료에 적용 가능하다.
일부 실시형태에서, 치료 용도를 위한 조합은, 본원에 제공된 것과 같은 분화 효과기 세포 이외에, 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함하는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 화학치료제는 신생물 세포를 우선적으로 사멸하거나 신속히 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하거나, 줄기 암 세포를 근절하는 것으로 발견되고, 신생물 세포의 성장을 예방하거나 감소시키도록 치료학적으로 사용된 세포독성 항종양성 작용제, 즉 화학 작용제를 지칭한다. 화학치료제는 또한 때때로 항종양성 또는 세포독성 약물 또는 작용제라 칭하고, 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금 함유 작용제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(사이클로포스파미드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로르암부실, 헤아메틸멜라민, 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 사이타라빈, 6-머캅토푸린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피포도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오르토퀴논 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌, 악티노마이신 D, 플리카마이신, 푸로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜키신, 시토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 작용제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 사이클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투주맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 사이타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 디에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라디올, 엑세메스탄, 플록수리딘, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마제, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 비노렐빈 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 작용제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 허가되고, 당해 분야에 공지된 것을 포함하여 인간 사용을 위해 허가된 것이다. 이러한 작용제는 임의의 수의 표준 의사 및 종양학자의 참조문헌(예를 들어, 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995])을 통해 또는 국제 암 협회 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해 참조될 수 있고, 이들 둘 모두는 시간마다 업데이트된다.
탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역조절 약물(IMiD)은 NK 세포 및 T 세포 둘 모두를 자극한다. 본원에 제공된 것처럼, IMiD는 암 치료에 대한 iPSC 유래 치료학적 면역 세포와 사용될 수 있다.
환자에 대한 투여에 적합한 조성물은, 치료학적 조성물에 포함된 iPSC 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단 이외에, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어 세포 배양 배지), 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부분적으로 투여되는 특정 조성물에 의해, 또한 치료학적 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제가 결정된다. 따라서, 본 발명의 치료학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제제가 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985](이의 개시내용은 본원에 의해 그 전체가 인용되어 포함됨) 참조).
일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료학적 조성물은 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 MDSC를 포함한다. 본원에 개시된 것과 같은 iPSC 유래 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료학적 조성물은 정맥내 투여, 복강내 투여, 경장 투여 또는 기관 투여 방법에 의해 별개로 또는 원하는 치료 목표에 영향을 미치도록 다른 적합한 화합물과 조합되어 투여될 수 있다.
이 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 약 3 내지 약 10의 치료학적 조성물의 pH를 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량 대 중량 기준으로 약 5%만큼 많을 수 있다. 전해질, 예컨대 비제한적인 예로서 염화나트륨 및 염화칼륨은 치료학적 조성물에 또한 포함될 수 있다. 일 양태에서, 치료학적 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료학적 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 상기 pH 범위의 하나에서 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7이다. 대안적으로, 치료학적 조성물은 pH가 약 6.8 내지 약 7.4의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 치료학적 조성물은 pH가 약 7.4이다.
본 발명은 또한 부분적으로 본 발명의 특정 조성물 및/또는 배양물에서 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 실시형태에 따라 iPSC 유래 면역 세포의 유지, 성장 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 혈청 비함유 및/또는 피더 비함유 배지이다. 다양한 실시형태에서, 혈청 비함유 배지는 동물 비함유이고, 선택적으로 단백질 비함유일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생물약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 동물 비함유 배지는 비동물 원천으로부터 성분이 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 동물 비함유 배지에서 천연적 동물 단백질을 대체하고, 합성 원천, 식물 원천 또는 미생물 원천으로부터 영양소를 얻는다. 단백질 비함유 배지는 반대로 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다. 당업자는 배지의 상기 예가 예시적이고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제제를 어떤 방식으로든 제한하지 않고, 당업자에게 공지되고 이용 가능한 많은 적합한 배지가 있다는 것을 이해할 것이다.
단리된 만능 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성 유래 억제자 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 간엽성 기질 세포를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포 또는 NK 세포를 갖는 치료학적 조성물, 예컨대 약 95%의 T 세포, NK 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포 또는 골수성 유래 억제자 세포(MDSC)의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다. 일부 다른 실시형태에서, 단리된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포는 자연 원천의 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포, 또는 임의의 다른 면역 세포에 존재하거나 통상적이지 않은 기능적 특징 또는 구조적 특징을 갖는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 효과기 세포를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 조합 세포 치료는 치료학적 단백질 또는 펩타이드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 유래된 효과기 세포는 BCMA-CAR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조합 세포 치료는 CD38 특이적 치료학적 단백질 또는 펩타이드 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 유래된 효과기 세포는 BCMA-CAR 및 CD38 null을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조합 세포 치료는 다라투무맙, 이사툭시맙 또는 MOR202, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 유래된 NK 또는 T 세포는 BCMA-CAR, CD38 null 및 외인성 CD16을 포함한다. 일부 또 다른 실시형태에서, 조합 세포 치료는 다라투무맙, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 유래된 효과기 세포는 BCMA-CAR, CD38 null, hnCD16, 및 CD19, BCMA, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나를 표적화하는 제2 CAR을 포함한다. 또 일부 추가의 실시형태에서, 조합 세포 치료는 다라투무맙, 이사툭시맙 또는 MOR202, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 효과기 세포의 집단을 포함하고, 유래된 효과기 세포는 BCMA-CAR, CD38 null, 외인성 CD16, CAR 및 사이토카인, 사이토카인 수용체의 전체 또는 부분 길이, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 단백질 복합체를 포함한다. 또 다른 일 실시형태에서, 조합 세포 치료는 치료학적 단백질 또는 펩타이드, 및 표 1에 열거된 유전자형을 포함하는 게놈 조작된 iPSC로부터 유래된 NK 계통 세포의 집단을 포함하고, 유래된 NK 세포는 HLA-G 과발현 또는 CD58 넉아웃 및 CD54 넉아웃 중 적어도 하나를 가지며 BCMA-CAR, CD38 null, hnCD16, CAR, 하나 이상의 외인성 사이토카인 및 B2M-/-CIITA-/-를 포함한다.
당업자가 이해하는 것처럼, 본원에서의 방법 및 조성물에 기초하여 iPSC로부터 유래된 자가유래 조혈 계통 세포 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 모두는 상기에 기재된 것과 같은 세포 치료에 사용될 수 있다. 자가유래 이식을 위해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 전체 또는 부분 HLA 일치에 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 일치된 HLA가 아니고, 여기서 유래된 조혈 계통 세포는 HLA-I 및 HLA-II null을 갖는 효과기 세포이다.
일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 또는 적어도 5 x 109개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 1 x 106개의 세포; 용량당 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 1x 107개의 세포; 용량당 약 0.5 x 107개의 세포 내지 약 1 x 108개의 세포; 용량당 약 0.5 x 108개의 세포 내지 약 1 x 109개의 세포; 용량당 약 1 x 109개의 세포 내지 약 5 x 109개의 세포; 용량당 약 0.5 x 109개의 세포 내지 약 8 x 109개의 세포; 용량당 약 3 x 109개의 세포 내지 약 3 x 1010개의 세포, 또는 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 60 kg 환자의 경우 1 x 108 세포/용량은 1.67 x 106 세포/kg로 번역된다.
일 실시형태에서, 치료학적 조성물에서의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분 또는 단일 제대혈에서의 면역 세포의 수이거나, 적어도 0.1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 1 x 105 세포/kg 체중, 적어도 5 x 105 세포/kg 체중, 적어도 10 x 105 세포/kg 체중, 적어도 0.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 1.75 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2 x 106 세포/kg 체중, 적어도 2.5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 3 x 106 세포/kg 체중, 적어도 4 x 106 세포/kg 체중, 적어도 5 x 106 세포/kg 체중, 적어도 10 x 106 세포/kg 체중, 적어도 15 x 106 세포/kg 체중, 적어도 20 x 106 세포/kg 체중, 적어도 25 x 106 세포/kg 체중, 적어도 30 x 106 세포/kg 체중, 1 x 108 세포/kg 체중, 5 x 108 세포/kg 체중 또는 1 x 109 세포/kg 체중이다.
일 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 용량은 대상체에게 전달된다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 세포의 유효량은 적어도 2 x 106개의 세포/kg, 적어도 3 x 106개의 세포/kg, 적어도 4 x 106개의 세포/kg, 적어도 5 x 106개의 세포/kg, 적어도 6 x 106개의 세포/kg, 적어도 7 x 106개의 세포/kg, 적어도 8 x 106개의 세포/kg, 적어도 9 x 106개의 세포/kg, 또는 적어도 10 x 106개의 세포/kg, 또는 그 이상의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 효과기 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg, 약 6 x 106개의 세포/kg, 약 7 x 106개의 세포/kg, 약 8 x 106개의 세포/kg, 약 9 x 106개의 세포/kg, 또는 약 10 x 106개의 세포/kg, 또는 그 이상의 세포/kg 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 효과기 세포의 유효량은 약 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 약 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 10 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 2 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 3 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 4 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 6 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 7 x 106개의 세포/kg, 5 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 또는 6 x 106개의 세포/kg 내지 약 8 x 106개의 세포/kg, 및 모든 개재하는 세포 용량이다.
일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료 용도는 단일 용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료학적 용도는 다중 용량 치료(다중사이클 치료 또는 분류화된 치료라고도 함)이다. 일부 실시형태에서, 다중 용량 치료는 매일마다, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다 또는 50일마다, 또는 사이의 임의의 숫자의 일에 하나의 용량이다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자에 대한 투여에 적합하고 준비될 수 있다(즉, 임의의 추가의 가공 없이 투여될 수 있음). 투여에 준비된 세포 기반 조성물은 상기 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가의 가공 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 작용제에 의한 투여 전에 증식되고/되거나 조절된 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 재조합 TCR 또는 CAR을 발현하도록 유전 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호에 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 세포를 활성화하고 증식시킬 수 있다.
소정의 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 이러한 신호를 제공하는 작용제는 용액에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 작용제는 표면에 커플링될 때 동일한 표면에(즉, "시스(cis)" 형성으로) 또는 별개의 표면에(즉, "트랜스(trans)" 형성으로) 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 용액 중의 표면 및 다른 작용제에 커플링될 수 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합될 수 있고, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 소정의 실시형태에서, 작용제 둘 모두는 용액에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 가용성 형태로 있을 수 있고, 이후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 다른 결합제와 같은 표면에 가교결합할 수 있고, 이것은 본 발명의 실시형태에서 T 림프구를 활성화하고 증식하는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 예컨대 미국 특허출원공개 US 20040101519호 및 미국 특허출원공개 US 20060034810호에 개시된 작용제에 결합할 것이다.
치료되는 대상체의 컨디션에 따라 투여량, 빈도 및 프로토콜의 약간의 변동이 반드시 발생할 것이다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 사건에서 개별 대상체에 대한 적절한 용량, 빈도 및 프로토콜을 결정할 것이다.
실시예
하기 실시예는 제한의 방식이 아니라 예시의 방식으로 제공된다.
실시예 1 ― 재료 및 방법
상이한 안전 항구 좌위 통합 전략과 조합되어 다양한 프로모터의 제어 하에 자살 시스템을 효과적으로 선택하고 시험하기 위해, 단일 또는 다수의 유전 조절에 의해 클론 hiPSC의 분화가 가능하게 하도록 단일 세포 계대배양 및 고속, 96웰 플레이트 기반 유세포분석법 분류가 가능하게 하는 출원인의 독점적 hiPSC 플랫폼이 사용되었다.
소분자 배양에서의 hiPSC 유지 : 배양의 포화상태가 75% 내지 90%에 도달하면 hiPSC를 단일 세포로서 일상적으로 계대배양하였다. 단일 세포 분리를 위해, hiPSC를 PBS(Mediatech)로 1회 세척하고, 단일 세포 분리를 보장하도록 37℃에서 3분 내지 5분 동안 Accutase(Millipore)로 처리한 후 피펫팅하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 종래의 배지와 동일한 부피에서 혼합하고, 225 × g에서 4분 동안 원심분리하고, FMM에 재현탁하고, 마트리겔 코팅된 표면에 플레이팅하였다. 계대배양은 통상적으로 1:6 내지 1:8이고, 37℃에서 2시간 내지 4시간 동안 마트리겔로 이전에 코팅된 조직 배양 플레이트로 옮기고, 2일 내지 3일마다 FMM을 공급하였다. 37°C 및 5% CO2에서 설정된 습윤 항온처리기에서 세포 배양을 유지시켰다.
관심 양상의 표적화된 편집을 위한 ZFN, CRISPR에 의한 인간 iPSC 조작 : 한 예로서 ROSA26 표적화된 삽입을 사용하여, ZFN 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 AAVS1 표적화된 삽입을 위해 2.5 ug의 ZFN-L(FTV893), 2.5 ug의 ZFN-R(FTV894)과 5 ug의 공여자 작제물의 혼합물에 의해 형질주입하였다. CRISPR 매개된 게놈 편집을 위해, 200만개의 iPSC를 ROSA26 표적화된 삽입을 위해 5 ug의 ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)와 5 ug의 공여자 작제물의 혼합물로 형질주입하였다. 매개변수 1500V, 10 ms, 3 펄스를 사용하여 Neon 형질주입 시스템(Life Technologies)을 사용하여 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 제2일 또는 제3일에, 플라스미드가 인공 프로모터-드라이버 GFP 및/또는 RFP 발현 카세트를 함유하면 유세포분석법을 이용하여 형질주입 효율을 측정하였다. 형질주입 후 제4일에, 표적화된 세포를 선택하도록 처음 7일 동안 0.1 ug/ml 및 7일 후 0.2 ug/ml의 농도로 푸로마이신을 배지에 첨가하였다. 푸로마이신 선택 동안, 제10일에 세포를 새로운 마트리겔 코팅된 겔에 계대배양하였다. 푸로마이신 선택의 제16일 또는 그 후에, GFP+ iPS 세포 백분율에 대해 살아 있는 유세포분석법에 의해 세포를 분석하였다.
게놈 편집된 iPSC의 벌크 분류 및 클론 분류 : ZFN 또는 CRISPR-Cas9를 사용하여 게놈 표적화된 편집을 갖는 iPSC는 푸로마이신 선택의 20일 후 GFP+SSEA4+TRA181+ iPSC의 벌크 분류되고 클론 분류되었다. 단일 세포 분리된 표적화된 iPSC 풀을 Hank 균형 염 용액(MediaTech), 4% 태아 소 혈청(Invitrogen), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech) 및 10 mM Hepes(Mediatech)를 함유하는 차가운 염색 완충액에 재현탁하고; 최적 수행에 새롭게 만들었다. SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647(BD Biosciences)을 포함하는 접합된 일차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 모든 항체는 100만개의 세포당 100 μL의 염색 완충액 중의 7 μL로 사용되었다. 그 용액을 염색 완충액에서 1회 세척하고, 225 g에서 4분 동안 스피닝하고, 10 μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충액에 재현탁하고, 유세포분석법 분류를 위해 얼음에서 유지시켰다. FACS Aria II(BD Biosciences)에서 유세포분석법 분류를 수행하였다. 벌크 분류를 위해, GFP+SSEA4+TRA181+ 세포를 게이팅하고, 7 ml의 FMM이 충전된 15 ml 정규 관에 분류하였다. 분류된 세포를 클론 분류를 위해 웰당 3 사건의 농도로 100 μM 노즐을 사용하여 96웰 플레이트에 직접 분사하였다. 각각의 웰을 5 μg/mL의 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech)으로 보충되고 5x 마트리겔로 이전에 밤새 코팅된 200 μL의 FMM으로 예비충전하였다. 5x 마트리겔 프리코팅은 1 분취액의 마트리겔을 5 mL의 DMEM/F12에 첨가하는 것을 포함하고, 이후 4℃에서 밤새 항온처리하여 적절한 재현탁이 되게 하고, 마지막으로 웰당 50 μL로 96웰 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 각각의 웰에 첨가하기 직전에 5x 마트리겔을 흡인한다. 분류의 완료 시, 96웰 플레이트를 항온처리 전에 225 g에서 1분 내지 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 7일 동안 방해되지 않게 두었다. 제7일에, 각각의 웰로부터 150 μL의 배지를 제거하고, 100 μL의 FMM으로 대체하였다. 분류 후 제10일에 추가의 100 μL의 FMM을 웰에 재공급하였다. 2일만큼 일찍 콜로니 형성이 검출되었고, 분류 후 제7일 내지 제10일에 대부분의 콜로니가 증식하였다. 제1 계대배양에서, 웰을 PBS로 세척하고, 37℃에서 대략 10분 동안 30 μL의 Accutase로 분리하였다. 연장된 Accutase 처리의 필요성은 연장된 기간 동안 배양에서 한가로이 있는 콜로니의 빽빽함을 반영한다. 세포가 분리하는 것으로 보인 후, 200 μL의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고, 수회 피펫팅하여 콜로니를 파괴한다. 분리된 콜로니를 5x 마트리겔로 이전에 코팅된 96웰 플레이트의 다른 웰로 옮기고, 이후 항온처리 전에 225 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 확장 전에 초기 콜로니를 분산시키도록 이 1:1 계대배양을 수행한다. 3분 내지 5분 동안 Accutase 처리 및 75% 내지 90% 포화상태 시 FMM 중의 1x 마트리겔로 이전에 코팅된 더 큰 웰로의 1:4-1:8의 확장에 의해 후속하는 계대배양을 일상적으로 수행하였다. GFP 형광 수준 및 TRA1-81 발현 수준에 대해 각각의 클론성 세포주를 분석하였다. 거의 100% GFP+ 및 TRA1-81+를 갖는 클론 계통은 추가의 PCR 스크리닝 및 분석을 위해 선택되었다. Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)에서 유세포분석법 분석을 수행하고, Flowjo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다.
실시예 2 ― BCMA-CAR을 포함하는 iPSC 및 이로부터 분화된 효과기 세포
BCMA-CAR 작제물이 표면 발현을 나타낸다는 것을 확인하기 위해, DAP10-Thy1.1을 발현하는 플라스미드와 함께 또는 이것 없이 CAR-2A- IL15/IL15Rα(절두된)(IL15Δ)를 함유하는 플라스미드는 293T 세포로 형질주입되었다. 세포를 수확하고, 표면 발현을 제3일에 검사하였다. 세포를 Thy1.1 및 IL15Ra에 대한 항체, 및 비오티닐화된 BCMA 단백질, 이어서 스트렙타비딘-FITC에 의해 염색하였다. BCMA-CAR, IL15Δ 및 Thy1.1의 세포 표면 발현은 유세포분석법에 의해 평가되었다. 도 5에 도시된 것처럼, 외인성 DAP10은 293T 세포에서 BCMA-CAR 및 IL15Δ 둘 모두의 표면 발현을 용이하게 하는 것으로 나타났다.
BCMA-CAR 작제물이 또한 iPS 세포에서 표면 발현을 나타내는지를 검사하기 위해, CAR-2A- IL15Δ의 렌티바이러스 벡터를 CD38 넉아웃 및 hnCD16을 포함하는 조작된 iPS 세포로 DAP10-Thy1.1과 함께 또는 이것 없이 형질도입하였다. CD38 넉아웃 및 hnCD16을 포함하는 iPS 세포는 CD38 넉아웃 및 고친화성 비절단성 CD16 발현을 얻기 위해 연속하여 또는 동시에 조작되었다. 각각의 조작 단계 후, iPSC는 다음 조작 단계 전에 원하는 표현형에 대해, 예를 들어 B2M 유전자의 넉아웃에 의한 HLA-I의 소실, CIITA의 넉아웃에 의한 HLA-II의 소실, 및 여기서 도입된 BCMA-CAR 및 IL15Δ에 대해 분류되었다. 이후, 조작된 iPSC를 시험관내 또는 분화 세포 생성을 위해 투여할 수 있다.
CD38-/- hnCD16 iPSC를 형질도입한 후 Thy1.1, IL15Δ 및 BCMA-CAR 단백질의 표면 발현은 유세포분석법에 의해 제3일에 조사되었다. iPS 세포에서, 외인성 DAP10은 작제된 것처럼 BCMA-CAR의 표면 발현을 용이하게 하는 데 필요한 것으로 보이지 않는 반면, IL15Δ는 외인성 DAP10의 존재 하에서만 검출 가능하다(도 6). iNK 세포에서의 BCMA-CAR 발현 패턴을 결정하기 위해, IL15Δ 양성 iPS 세포는 DAP10에 의해 또는 이것 없이 형질도입된 iPS 세포로부터 분류되었고, 이것은 이후 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 iNK 세포로 분화되었다. BCMA-CAR 및 IL15Δ를 포함하는 iPSC, 또는 BCMA-CAR 및 IL15Δ 이외에 DAP10을 포함하는 iPSC로부터 분화된 iNK 세포는 이전에 기재된 것과 같은 전이유전자 발현 평가를 위해 표면 염색되었다. BCMA-CAR 및 IL15Δ의 발현은 도 7a 내지 도 7c에 도시된 것과 같이 DAP10의 도입 및 발현에 독립적이다.
텔로미어 단축은 세포 노화에 따라 생기고, 줄기 세포 기능이상 및 세포 노쇠와 연관된다. T 세포 및 NK 세포를 포함하는 생성된 분화 세포가 iPSC에서의 이들 유전 조작된 양상이 원하는 세포 운명으로 세포의 시험관내 유도된 발생을 동요시키지 않으면서 조혈 분화 동안 유지된다는 것을 입증하였지만, 성숙 분화 세포가 성체 말초액 대응 세포와 비교하여 더 긴 텔로머를 유지시킨다는 것이 본원에서 나타났다. 예를 들어, G0/1 세포의 DNA 지수에 대한 보정 없이 대조군(100%)으로서 1301 T 세포 백혈병 계통을 사용하여 iPSC, 성체 말초혈 NK 세포 및 iPSC 유래 NK 계통 세포에 대해 유세포분석법에 의해 텔로미어 길이를 결정하였다. 도 8에 도시된 것처럼, iPSC 유래 NK 세포는 성체 말초혈 NK 세포와 비교할 때 상당히 더 긴 텔로미어 길이를 유지하여서(p=.105, ANOVA), iPSC 유래 NK 세포에서 더 높은 증식, 생존기간 및 지속성 가능성을 나타낸다. iPSC 유래 T 세포와 유사한 관찰이 또한 당해 분야에 공지되어 있다.
실시예 3 ― BCMA-CAR을 발현하는 분화 효과기 세포의 기능 프로파일링
BCMA-CAR 유도된 항원 특이적 활성을 검출하기 위해, BCMA 발현 Nalm6 세포(Nalm-BCMA) 및 모 Nalm6 세포(Nalm-P; BCMA 발현이 없음)를 표적화하는 세포 세포독성 검정이 수행되었다. Nalm6-BCMA 및 Nalm6-P 표적 세포는 각각 세포 증식 염료 eFlour-450 및 eFlour670에 의해 표지되었다. BCMA-CAR을 갖거나 갖지 않는 IL15Δ/CD38 null/hnCD16 iNK 효과기 세포는 30:1 내지 0.03:1의 범위의 효과기:표적 비(E:T)에서 적정되고 표적 세포에 첨가되었다. 효과기가 없는 표적 세포는 자발적 세포사에 대해 대조군으로서 사용되었다. 샘플은 배양의 최종 30분 동안 CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection Reagent(1x400 희석)의 첨가 없이 37℃에서 4시간 동안 항온처리되었다. 도 9에 도시된 것과 같이, iNK 세포를 발현하는 BCMA-CAR은 우수한 항원 특이성을 입증하고, 모 Nalm6과 비교하여 Nalm6 계통을 발현하는 BCMA의 유의미한 사멸을 유도한다.
T 세포에서의 BCMA-CAR 기능성을 분석하기 위해, 비드 자극된 T 세포는 BCMA-CAR을 보유하는 렌티바이러스에 의해 형질도입되었다. 형질도입 후 제6일에, T 세포는 BCMA 발현 종양 표적을 표적화하는 이의 능력에 대해 시험되었다. Nalm6-BCMA 및 모-Nalm6 계통은 상기 기재된 것과 같이 제조되고 형질도입된 T 세포와 항온처리되었다. 도 10에 도시된 것과 같이, BCMA-CAR 형질도입된 T 세포는 명확한 항원 분해를 나타내고, 비형질도입된 T 세포와 비교하여 Nalm6-BCMA 종양 그룹에서 더 많은 세포 세포독성을 유도한다.
BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포의 ADCC 매개된 이중 표적화 능력을 시험하기 위해, MM.1R 골수종 세포는 효과기로서 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포 및 CD19-CAR/hnCD16/IL15Δ/ iNK 세포를 사용하여 재자극 세포독성 검정에서 표적으로서 사용되었다. 표적 및 효과기 세포는 다라투무맙과 함께 또는 이것 없이 48시간 동안 3:1의 효과기 대 표적 비로 항온처리되었다. 48시간 후, 모든 효과기 세포가 수집되고, 새로운 MM.1R 표적을 함유하는 새로운 웰로 옮겨졌다. 추가 48시간 재자극 기간 후, 남은 MM.1R 표적 세포의 수가 결정되었다. 도 11에 도시된 것과 같이, hnCD16 매개된 ADCC를 통한 다라투무맙 및 BCMA-CAR은 다발성 골수종 암 세포의 효과적인 제거에 대해 상승작용되어서, 암 세포의 다수의 항원을 표적화함으로써 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ 효과기 세포 향상된 항-종양 활성이 가능하게 한다.
BCMA-CAR의 생체내 기능은 종양 세포 표적으로서 마우스 골수종 세포를 발현하는 인간-BCMA를 사용하여 또는 내인성 BCMA를 발현하는 인간 세포주를 사용하여 평가되었다. 생체내 평가를 위해, 마우스 또는 인간 T 세포는 다른 편집: IL15Δ, CD38 및 hnCD16과 함께 BCMA-CAR에 의해 형질도입되고, BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ를 포함하는 iPSC 유래 NK 세포 이외에 효과기로서 사용되었다.
BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16의 효능은 마우스 골수종 모델에서 평가되었다. 마우스 흑색종 세포주 B16F10은 인간 BCMA(B16F10-BCMA)로 형질도입되었고, 이 세포는 면역유능 C57BL/6 또는 면역손상된 NSG 마우스로 정맥내로(IV) 또는 피하로(SC) 이식되었다. B16F10-BCMA 종양 세포의 정맥내 주사는 C57BL/6에서 폐 전이 및 NSG 마우스에서 폐 및 간 전이를 생성하고, 피하 이식은 마우스 균주 둘 모두에서 단일 고형 종양을 생성하였다. C57BL/6 마우스에서, 폐 종양 결절(전이)은 B16F10-BCMA 세포의 IV 이식 후에 계수되었다. 종양 이식 후 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 -T 세포 또는 NK 세포의 입양 전달은 이들 동물에서 발생하는 종양 결절의 수를 감소시키는 이들 세포의 능력을 평가하도록 수행되었다. 종양 결절은 전체 형태에 의해 그리고 조직 절편의 현미경 검사에 의해 추가로 평가되었다. 피하 B16-F10-BCMA 모델에서, 종양 진행은 종양 크기의 캘리퍼 측정에 의해 모니터링되었다. 폐에서의 종양 결절 수 및/또는 크기 감소는 모의 형질도입된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 마우스 치료와 비교하여 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 -T 세포 또는 NK 세포를 사용한 B16F10-BCMA 세포에 의한 IV 이식된 C57BL/6 마우스의 치료의 유효성을 반영하였다. 유사하게, B16-F10-MICA 종양 성장의 SC 모델에서, 지연된 종양 진행, 연장된 생존기간, 유도된 종양 회귀 또는 상기의 조합은 또한 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 T 세포 또는 NK 세포 치료의 유효성을 나타냈다.
NSG 마우스에서, 폐 및 간 종양 결절 둘 모두가 계수되었고, 모의 형질도입된 T 세포에 의해 치료된 마우스는 각각의 장기에서 결절의 수를 감소시키는 이의 능력에 대해 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 T 세포와 비교되었다. 마우스 및 인간 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 T 세포 둘 모두는 NSG 마우스에서의 종양 성장을 제어하는 능력에 대해 평가되었다. 인간 또는 마우스 원천으로부터 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 T 세포에 의해 IV 이식된 NSG 마우스의 폐 및 간에서의 종양 결절의 감소된 수 및 크기는 치료의 유효성을 나타내고, 마우스의 연장된 생존기간과 연관된다.
유사한 결과는 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 iNK 세포에 의한 B16-F10-BCMA 종양 보유 NSG 마우스의 치료에서 예상되었다. 도 12a 내지 도 12b는 대표적인 생물발광 영상(도 12a) 또는 시험 그룹당 n=10 마우스에 대한 누적 데이터(도 12b)를 사용한 파종성 이종이식 MM.1S 다발성 골수종 모델에서 다라투무맙과 조합된 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 iNK 세포의 생체내 효율을 보여주고, 세포 하의 또는 다라투무맙 단독의 치료와 비교하여 적어도 30일 동안 재발의 징후 없이 완전한 종양 제거를 입증한다.
다양한 인간 종양 세포주에 대한 BCMA-CAR의 기능이 또한 평가되었다. CI-H929, RPMI-8226, U266 및 KMS11을 포함하는 BCMA를 발현하는 인간 세포주는 면역손상된 NSG 마우스로 이식되었다. 지연된 종양 성장, 유도된 종양 회귀 및 연장된 생존기간은 본원에 제공된 것과 같은 조작된 인간 iPSC로부터 유래된 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 T 세포 또는 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 iNK 세포 중 어느 하나를 사용하여 이들 종양 유형 중 어느 것을 보유하는 NSG 마우스의 치료에서 평가되었다. 도 13은 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16 iNK 세포가 CAR 매개된 기전 및 ADCC 매개된 기전을 통해 BCMA+ 다발성 골수종 종양 세포주를 효과적으로 표적화한다는 것을 보여준다.
BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포의 추가의 세포독성 규명은 연속 재자극 검정을 사용하여 수행되었다. 검정은 1:1의 E:T 비로 효과기 세포로서 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK를 사용하여 다라투무맙의 존재 및 부재 하에 MM.1S 세포에 대해 수행되었다. 효과기의 BCMA-CAR 음성 모 세포(CD38 null/hnCD16/IL15Δ)는 대조군으로서 사용되었다. 세포는 48시간(R1) 동안 항온처리되고, 이후 모든 비부착성 세포가 수집되고, 자극의 추가 회차(R2)를 위해 새로 플레이팅된 MM.1S 표적 세포로 옮겨졌다. 이 절차는 총 3회차의 자극을 위해 1회 더(R3) 반복되었다. 도 14에 도시된 것과 같이, BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포는 종양 세포에 대한 우수한 이중 표적화 사멸 능력을 입증하였다. BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ 효과기 세포는 또한 MM.1S 세포에 의한 3회 연속 시험감염에서 지속적이고 효과적인 세포독성을 나타냈다. 이 세포독성은 다라투무맙의 존재 및 부재 둘 모두에서 명확하였고, CAR 음성 모 대조군과 비교하여 특히 개선된 세포독성을 나타냈다. 특히, BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ 효과기 세포는 단일치료의 연구 아암 둘 모두에서 및 다라투무맙과 조합되어 자극의 각각의 회차에 걸친 개선된 세포독성을 입증하였는데, 이는 항원 매개된 확장 및 탈진의 회피를 제시한다.
사이토카인 생성 검정에서, BCMA-CAR iNK 세포는 효과기 세포로서 사용되고, 4시간 동안 다라투무맙의 존재 하에 표시된 종양 세포주에 의해 자극되었다. 상청액이 수집되고, TNFα 및 IFNγ의 수준은 MesoScale Diagnostics(MSD) 전기화학발광 플랫폼을 사용하여 평가되었다. 도 15에서 입증된 것처럼, 사이토카인 생성의 증가는 종양 세포에 따라 CAR 표적화 또는 ADCC 매개된 표적화 중 어느 하나에 의해 촉진될 수 있어서, 향상된 세포독성에 대해 CAR 및 ADCC 둘 모두를 사용하는 BCMA-CAR/CD16 효과기 세포에서의 이중 표적화 전략의 우수성을 반영한다.
추가로, BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 효과기 세포는 외인성 사이토카인 지지의 부재 하에 생체내 효능을 유지시키는 것으로 관찰되었다(도 16 참조). NSG 마우스는 MM.1S-Luc 세포가 이식되고 제2일, 제9일 및 제16일에 BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 효과기로 치료되거나, 제2일에 BCMA-CAR T 세포로 치료되었다. iNK 효과기 세포의 2개의 뱃지를 사용하였고, 모든 3개의 치료 그룹은 분열되고, 추가 사이토카인 지지체 없이 남겨지거나 IL-15 및 IL-2의 매주 2회 주사에 의해 보충되었다. BLI 영상은 생체내 외인성 사이토카인 지지체의 존재 또는 부재 하에 각각의 세포 그룹에 대해 도 16에 도시되어 있다. iNK 효과기 세포에 의한 MM.1S-이식된 마우스의 치료는 사이토카인 사이에 관찰된 유의차 없이 및 사이토카인 지지 없이 시험된 모든 3개의 뱃지에 대해 종양 회귀 및 지연된 종양 생육을 생성시켰다. 그에 반해서, 1차 CAR-T 세포가 외인성 IL-2 및 IL-15 지지의 존재 하에 효과적이었지만, 이들 세포는 사이토카인이 투여되지 않을 때 상당히 덜 강력하였다. 그러므로, BCMA-CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 효과기 세포는 항-종양 능력을 유지시키면서 사이토카인 지지에 대한 필요 없이 생체내 이의 자율성 및 내구력 특징을 입증하였다.
MM.1S 세포는 2.5E5의 투여 시 제0일에 마우스에 이식되었다. 마우스는 5E6의 투여 시 제3일, 제10일 및 제17일에 CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포의 3 용량으로 치료되었다. 도 17에 도시된 것과 같이, 감마 세크레타제 억제제(GSI)가 투여된 표시된 마우스 그룹은 3주 동안 1주 3회 GSI가 1 mg/kg으로 경구로 투여되었다. 다라투무맙은 표시된 그룹에서 제3일에 100 ug의 단일 용량으로 전달되었다. 비반응된 마우스는 검정 실선으로 도시되지만, 이식되지 않은 대조군 마우스는 파선으로 개방 원으로 도시된다. 도시된 것처럼, CAR/CD38 null/hnCD16/IL15Δ iNK 세포의 생체내 효율은 CD38 항체 또는 감마 세크레타제 억제제 중 어느 하나와 조합되어 증가된다. 더욱이, 효과기 iNK 세포는 CD38 항체 및 GSI 둘 모두와 조합되어 생체내 종양 세포를 효과적으로 사멸할 뿐만 아니라 더 긴 기간 후이식을 통해 생체내 종양 세포 재발을 성공적으로 제어하였다. 이론에 의해 제한됨이 없이, ADCC 매개된 사멸, 종양 세포에서의 증가된 BCMA 밀도, 효과기 세포 자율성 및 동족살해의 회피는 CD38KO, IL15Δ 및 CD16을 추가적으로 포함하는 BCMA-CAR iNK 효과기 세포의 생체내 효율을 상승적으로 향상시키는 기전 중에 있을 수 있었다.
당업자는 본원에 기재된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 나타내고, 본 발명의 범위에 제한으로 의도되지 않음을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 본 개시내용에 변하는 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별 공보가 인용되어 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용이 적합하게 실행될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어 각각의 경우에 본원에서 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 2가지 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면으로 사용되고, 도시되고 기재된 특징의 임의의 균등물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도되지 않지만, 청구된 본 개시내용의 범위 내에 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 이와 같이, 본 개시내용이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있고, 본원에 개시된 선택적인 특징, 변형 및 관념의 변경이 당업자에 의해 유보될 수 있지만, 이러한 변형 및 변경이 청구항에 의해 한정된 것처럼 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다고 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> FATE THERAPEUTICS, INC. <120> MULTI-TARGETING EFFECTOR CELLS AND USE THEREOF <130> 056932-519001WO <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD58 Exon 1 knockout (CD58-gNA-1) <400> 1 gaccacgctg aggaccccca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD58 Exon 1 knockout (CD58-gNA-2) <400> 2 tggttgctgg gagcgacgcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD58 Exon 1 knockout (CD58-gNA-3) <400> 3 catggttgct gggagcgacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD54 Exon 1 knockout (CD54-gNA-1) <400> 4 cccgagcagg accaggagtg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD54 Exon 1 knockout (CD54-gNA-2) <400> 5 cgcactcctg gtcctgctcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> targeting sequence for CD54 Exon 1 knockout (CD54-gNA-3) <400> 6 ctgggaacag agccccgagc 20 <210> 7 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 340 a.a. 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Asn Glu Leu Asn 165 170 175 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 180 185 190 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 195 200 205 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 210 215 220 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 225 230 235 240 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 245 250 255 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 260 <210> 16 <211> 308 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 308 a.a CD8 hinge + NKG2D TM + 2B4 + CD3-zeta <400> 16 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ser Asn Leu 35 40 45 Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg Ile Gly Met 50 55 60 Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp Arg Arg Lys 65 70 75 80 Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile 85 90 95 Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu 100 105 110 Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser 115 120 125 Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser 130 135 140 Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser 145 150 155 160 Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro 165 170 175 Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe 180 185 190 Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 195 200 205 Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 210 215 220 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 225 230 235 240 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 245 250 255 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 260 265 270 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 275 280 285 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 290 295 300 Leu Pro Pro Arg 305 <210> 17 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> construct mimicking trans-presentation of IL15 (design 3) <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 245 250 255 Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 305 310 315 320 Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 340 345 350 Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 355 360 365 Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln 370 375 <210> 18 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary nucleic acid sequence encoding construct mimicking trans-presentation of IL15 (design 3) <400> 18 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780 ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840 cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900 cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960 accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020 ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080 ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140 <210> 19 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fused IL15/mb-Sushi construct (design 4) <400> 19 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg <210> 20 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an exemplary nucleic acid sequence encoding fused IL15/mb-Sushi construct (design 4) <400> 20 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcaga 726 <210> 21 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein construct further modified from SEQ ID NO. 17 <400> 21 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 35 40 45 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 50 55 60 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 85 90 95 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 130 135 140 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu 165 170 175 Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 180 185 190 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 195 200 205 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu 210 215 220 Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 225 230 235 240 Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr 245 250 255 Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser 260 265 270 Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala 275 280 285 Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly 305 310 315 320 Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 340 345 350 Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val 355 360 365 Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu 370 375 <210> 22 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHA/CD38 <400> 22 cagagggcat tgtgtgcaca cacgtataga agcaggcagc ccaccctcat gctttccagg 60 aagcaaatgt ggctcaggtg taaagtgccc ggttgatgaa gggagttagc ggagggagta 120 taaggatgta ctgtctgccc ccttaggaca cctgcagagg attaaggtgg ctgtttctcc 180 ctggaggtgg agtgggtggg tcactgcaca ggagcctata gttgttggtc ttttaaactc 240 ttattggtgt aaccagccac ggaactctga ggcaaggggt tgggggtggg aagggaaaca 300 gagaaaaggc aagtgaaaca gaaggggagg tgcagtttca gaacccagcc agcctctctc 360 ttgctgccta gcctcctgcc ggcctcatct tcgcccagcc aaccccgcct ggagccctat 420 ggccaactgc gagttcagcc cggtgtccgg ggacaaaccc tgctgccggc tctctaggag 480 agcccaactc tgtcttggcg tcagtatcct ggtcctgatc ctcgtcgtgg tgctcgcggt 540 ggtcgtcccg aggtggcgcc agcagtggag cggtccgggc accaccaagc gctttcccga 600 g 601 <210> 23 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insol <400> 23 tcagcctaaa gctttttccc cgtatccccc caggtgtctg caggctcaaa gagcagcgag 60 aagcgttcag aggaaagcga tcccgtgcca ccttccccgt gcccgggctg tccccgcacg 120 ctgccggctc ggggatgcgg ggggagcgcc ggaccggagc ggagccccgg gcggctcgct 180 gctgccccct agcgggggag ggacgtaatt acatccctgg gggctttggg ggggggctgt 240 ccccgtgagc tc 252 <210> 24 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG <400> 24 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420 tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480 cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540 ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600 ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660 cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 720 cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 780 tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 840 tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 900 gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 960 gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 1020 cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 1080 tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 1140 gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 1200 gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 1260 ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 1320 cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 1380 ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg 1440 caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 1500 ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg 1560 tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg 1620 tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 1680 gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 1734 <210> 25 <211> 1137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15RF(tr) <400> 25 atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60 catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120 aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180 actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240 ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300 gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360 ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420 gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480 agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540 cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600 cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660 gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720 atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780 ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840 cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900 cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960 accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020 ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080 ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacag 1137 <210> 26 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 26 ggatccggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 27 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hnCD16 <400> 27 atgtggcagc tgctgctgcc tacagctctc ctgctgctgg tgtccgccgg catgagaacc 60 gaggatctgc ctaaggccgt ggtgttcctg gaaccccagt ggtacagagt gctggaaaag 120 gacagcgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tacagccctg aggacaattc cacacagtgg 180 tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcatcga cgccgccacc 240 gtggacgaca gcggcgagta tagatgccag accaacctga gcaccctgag cgaccccgtg 300 cagctggaag tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggccc ccagatgggt gttcaaagaa 360 gaggacccca tccacctgag atgccactct tggaagaaca ccgccctgca caaagtgacc 420 tacctgcaga acggcaaggg cagaaagtac ttccaccaca acagcgactt ctacatcccc 480 aaggccaccc tgaaggactc cggctcctac ttctgcagag gcctcgtggg cagcaagaac 540 gtgtccagcg agacagtgaa catcaccatc acccagggcc tggccgtgcc taccatcagc 600 agctttttcc cacccggcta ccaggtgtcc ttctgcctcg tgatggtgct gctgttcgcc 660 gtggacaccg gcctgtactt cagcgtgaaa acaaacatca gaagcagcac ccgggactgg 720 aaggaccaca agttcaagtg gcggaaggac ccccaggaca agtga 765 <210> 28 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TKpA <400> 28 gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg 60 caataaaaag acagaataaa acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt 120 cggtcccagg gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc 180 cgcgtttctt ccttttcccc accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca 240 gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata gc 272 <210> 29 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RHA/CD38 <400> 29 gatgcgtcaa gtacactgaa attcatcctg agatgaggtg ggttggcgac taaggcgcac 60 cggtgggcac tgcggggaca gcagggcccc gcgcgcaggg aagccgcccg gatcgcccgg 120 aaccgggcat cttccgtggc gggtcagccg agagcccgcc gggtggtgct gagtagggag 180 tcccgggctc ggggctccgc gggccgcttt caggagcagc tggccttggc accgagcgtg 240 cccgcgggag gcgggggggg gcgctgctcg gtggctctgc tgcgtagccg gtgaacactt 300 ggcaccgatg cccgccttct gggcaaggtg ccctgagccc agcccctcgc cgggctgcag 360 cccaccctcg gcgcgctcag cccgcttcac cgcttcaggg acggaataga actcgcagat 420 gcagggtgtc gctgacattt tcaacttttt ctgcggtttc cgcccgctgt ctctgacccg 480 aaagtgcccc cggacggtta cagaggacac ttaagtggtt tgcaaagcct gtggtagggg 540 aggagggtgt agaagggcca aaccacggaa cttagtttta ttcatttata taaagcagca 600 <210> 30 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHA/CD38 <400> 30 agagggcatt gtgtgcacac acgtatagaa gcaggcagcc caccctcatg ctttccagga 60 agcaaatgtg gctcaggtgt aaagtgcccg gttgatgaag ggagttagcg gagggagtat 120 aaggatgtac tgtctgcccc cttaggacac ctgcagagga ttaaggtggc tgtttctccc 180 tggaggtgga gtgggtgggt cactgcacag gagcctatag ttgttggtct tttaaactct 240 tattggtgta accagccacg gaactctgag gcaaggggtt gggggtggga agggaaacag 300 agaaaaggca agtgaaacag aaggggaggt gcagtttcag aacccagcca gcctctctct 360 tgctgcctag cctcctgccg gcctcatctt cgcccagcca accccgcctg gagccctatg 420 gccaactgcg agttcagccc ggtgtccggg gacaaaccct gctgccggct ctctaggaga 480 gcccaactct gtcttggcgt cagtatcctg gtcctgatcc tcgtcgtggt gctcgcggtg 540 gtcgtcccga ggtggcgcca gcagtggagc ggtccgggca ccaccaagcg ctttcccgag 600 <210> 31 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 31 ggcagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60 cct 63 <210> 32 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RHA/CD38 <400> 32 cgatgcgtca agtacactga aattcatcct gagatgaggt gggttggcga ctaaggcgca 60 ccggtgggca ctgcggggac agcagggccc cgcgcgcagg gaagccgccc ggatcgcccg 120 gaaccgggca tcttccgtgg cgggtcagcc gagagcccgc cgggtggtgc tgagtaggga 180 gtcccgggct cggggctccg cgggccgctt tcaggagcag ctggccttgg caccgagcgt 240 gcccgcggga ggcggggggg ggcgctgctc ggtggctctg ctgcgtagcc ggtgaacact 300 tggcaccgat gcccgccttc tgggcaaggt gccctgagcc cagcccctcg ccgggctgca 360 gcccaccctc ggcgcgctca gcccgcttca ccgcttcagg gacggaatag aactcgcaga 420 tgcagggtgt cgctgacatt ttcaactttt tctgcggttt ccgcccgctg tctctgaccc 480 gaaagtgccc ccggacggtt acagaggaca cttaagtggt ttgcaaagcc tgtggtaggg 540 gaggagggtg tagaagggcc aaaccacgga acttagtttt attcatttat ataaagcagc 600 a 601 <210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV heavy chain-1 (VH) <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV light chain-1 (VL) <400> 34 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV heavy chain-2 (VH) <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV light chain-2 (VL) <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV heavy chain-3 (VH) <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BCMA scFV light chain-3 (VL) <400> 38 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 39 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 39 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu 165 170 175 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn Val 180 185 190 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr 195 200 205 Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu 225 230 235 240 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr 245 250 255 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 260 265 <210> 40 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 40 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln 35 40 45 Ser Val Glu Ser Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp 165 170 175 Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Gly 180 185 190 Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 195 200 205 Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 210 215 220 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 41 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 41 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile 145 150 155 160 Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly 180 185 190 Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 195 200 205 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 225 230 235 240 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile 245 250 255 Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 260 265 270 <210> 42 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 42 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 130 135 140 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 145 150 155 160 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn 195 200 205 Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp 210 215 220 Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr 245 250 255 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 43 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 43 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile 145 150 155 160 Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly 180 185 190 Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 195 200 205 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 225 230 235 240 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His 245 250 255 Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 260 265 270 <210> 44 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 44 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 130 135 140 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 145 150 155 160 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn 195 200 205 Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp 210 215 220 Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr 245 250 255 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 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Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Met Phe Thr Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys 50 55 60 Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser 85 90 95 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 145 150 155 160 Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser 165 170 175 Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 180 185 190 Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Ile Leu 195 200 205 His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 210 215 220 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr 245 250 255 Thr Leu Glu Ile Lys 260 <210> 48 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 48 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Ile Leu His Leu Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Ser Lys Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 130 135 140 Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 145 150 155 160 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asn Tyr Ala 165 170 175 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 180 185 190 Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 195 200 205 Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 210 215 220 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val 225 230 235 240 Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser 260

Claims (40)

  1. 세포 또는 이의 집단으로서,
    (i) 세포는 유도 만능 세포(iPSC: induced pluripotent cell) 또는 iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포이고;
    (ii) 세포는 적어도 BCMA-CAR(키메라 항원 수용체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  2. 제1항에 있어서, iPSC 분화로부터 얻은 분화 세포는 조혈 세포이고, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 더 긴 텔로미어를 포함하고, BCMA-CAR은 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) T 세포 특이적임;
    (ii) NK 세포 특이적임;
    (iii) 표면 BCMA에 결합함;
    (iv) AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1의 좌위 중 하나에서 삽입됨; 또는
    (v) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨이되; 삽입은 그 좌위에서의 유전자의 발현을 선택적으로 넉아웃하는, 삽입됨.
  3. 제1항에 있어서, 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) CD38 넉아웃;
    (ii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 B2M null 또는 저, 및 선택적으로 CIITA null 또는 저;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두에서의 넉아웃;
    (iv) 외인성 CD16 또는 이의 변이체;
    (v) BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR);
    (vi) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및
    (ix) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 및 변이체, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가.
  4. 제1항에 있어서, BCMA-CAR은 적어도 하기를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 서열 번호 39 내지 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV.
  5. 제1항에 있어서, 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 말초혈, 제대혈 또는 임의의 다른 공여자 조직으로부터 얻은 이의 천연적 대응 세포와 비교하여, 하기를 포함하는 특징 중 적어도 하나를 갖는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선;
    (ii) 자연 면역 세포에 내성의 증가;
    (iii) 세포독성의 증가;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) ADCC의 향상 또는 획득;
    (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선;
    (ix) 종양 항원을 안정화시키는 능력; 및
    (x) 동족살해(fratricide)를 피하는 능력.
  6. 제3항에 있어서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 고친화성 비절단성 CD16(hnCD16)을 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  7. 제3항에 있어서, 외인성 CD16 또는 이의 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) CD16의 엑토도메인 도메인에서의 F176V 및 S197P;
    (b) CD64로부터 기원한 전체 또는 부분 엑토도메인;
    (c) 비(非)천연적(또는 비-CD16) 막관통 도메인;
    (d) 비천연적(또는 비-CD16) 세포내 도메인;
    (e) 비천연적(또는 비-CD16) 신호전달 도메인;
    (f) 비천연적 자극 도메인; 및
    (g) CD16으로부터 기원하지 않고, 동일한 폴리펩타이드 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 기원한 막관통 도메인, 신호전달 도메인 및 자극 도메인.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 비천연적 막관통 도메인은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D 또는 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor) 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (b) 비천연적 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (c) 비천연적 신호전달 도메인은 CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137(41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C 또는 NKG2D 폴리펩타이드로부터 유래되거나;
    (d) 비천연적 막관통 도메인은 NKG2D로부터 유래되고, 비천연적 자극 도메인은 2B4로부터 유래되고, 비천연적 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래되는, 세포 또는 이의 집단.
  9. 제3항에 있어서, 세포는 BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 CAR을 추가로 포함하고, CAR은
    (i) T 세포 특이적 또는 NK 세포 특이적이고/이거나;
    (ii) 이중특이적 항원 결합 CAR이고/이거나;
    (iii) 스위치 가능한 CAR이고/이거나;
    (iv) 이합체화된 CAR이고/이거나;
    (v) 분할 CAR이고/이거나;
    (vi) 다중사슬 CAR이고/이거나;
    (vii) 유도성 CAR이고/이거나;
    (viii) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체에 의해 동시발현되고/되거나;
    (xi) 선택적으로 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 또는 관문 억제제에 의해 동시발현되고/되거나;
    (xii) CD19, MICA/B, CD20, CD22, CD38, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2, MSLN, VEGF-R2, PSMA 및 PDL1 중 적어도 하나에 특이적이고/이거나;
    (xiii) ADGRE2, 탄산무수화효소 IX(CAlX), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 감염된 세포의 항원, 상피 당단백질2(EGP 2: epithelial glycoprotein2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM: epithelial cell adhesion molecule), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb­ B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산-결합 단백질(FBP: folate-binding protein), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR: acetylcholine receptor), 엽산 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2: Ganglioside G2), 강글리오사이드 G3(GD3: Ganglioside G3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2: human Epidermal Growth Factor Receptor 2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Rα2: Interleukin-13 receptor subunit alpha-2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR: kinase insert domain receptor), 루이스 A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM: L1 cell adhesion molecule), LILRB2, 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1: melanoma antigen family A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PRAME, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA: prostate stem cell antigen), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72: tumor­associated glycoprotein 72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF­ R2: vascular endothelial growth factor R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1: Wilms tumor protein) 및 병원균 항원 중 어느 하나에 특이적인, 세포 또는 이의 집단.
  10. 제3항에 있어서, 세포는 적어도 TRAC 좌위에서 삽입된 CAR을 포함하고/하거나, TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃되는, 세포 또는 이의 집단.
  11. 제3항에 있어서, 세포 표면 발현된 단백질 복합체는
    (a) IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, 또는 이들의 변이체; 및 이들의 수용체 또는 이들의 변이체 중 적어도 하나를 포함하거나;
    (b) 하기 중 적어도 하나를 포함하고;
    (i) 자가 절단 펩타이드를 사용한 IL15 및 IL15Rα의 동시발현;
    (ii) IL15와 IL15Rα의 융합 단백질;
    (iii) 절두된 IL15Rα의 세포내 도메인과의 IL15/IL15Rα 융합 단백질;
    (iv) IL15와 IL15Rα의 막 결합된 스시(Sushi) 도메인의 융합 단백질;
    (v) IL15와 IL15Rβ의 융합 단백질;
    (vi) IL15와 천연적 또는 변형된 공통 수용체 γC의 융합 단백질; 및
    (vii) IL15Rβ의 동종이합체;
    여기서, (i) 내지 (vii) 중 어느 하나는 별개의 작제물에서 또는 이중시스트론성 작제물에서 CAR과 동시발현될 수 있고;
    선택적으로,
    (c) 일시적으로 발현되는, 세포 또는 이의 집단.
  12. 제3항에 있어서, 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포이고, 분화 NK 세포는 종양 부위에 T 세포를 동원하고/하거나 이동시킬 수 있고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 하나 이상의 관문 억제제의 존재 하에 종양 면역억제를 감소시킬 수 있는, 세포 또는 이의 집단.
  13. 제3항 또는 제12항에 있어서, 관문 억제제는 PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 하나 이상의 관문 분자에 대한 길항제인, 세포 또는 이의 집단.
  14. 제13항에 있어서, 관문 억제제는 하기를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (b) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나.
  15. 제1항에 있어서, 분화 세포는 분화 CD34 세포, 분화 조혈 줄기 세포 및 전구 세포, 분화 조혈 다능성 전구 세포, 분화 T 세포 전구세포, 분화 NK 세포 전구세포, 분화 T 세포, 분화 NKT 세포, 분화 NK 세포 또는 분화 B 세포를 포함하는, 세포 또는 이의 집단.
  16. 제1항에 있어서, 세포는 하기를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 하나의 안전 항구 좌위(safe harbor locus) 또는 선택 유전자 좌위(selected gene locus)에 통합된 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 상이한 안전 항구 좌위 또는 2개 이상의 선택 유전자 좌위에서 통합된 2개 초과의 외인성 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (iii) 서열 번호 17, 서열 번호 19 또는 서열 번호 21과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하는 IL15Δ를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, 안전 항구 좌위는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, GAPDH 또는 RUNX1 중 적어도 하나를 포함하고; 선택 유전자 좌위는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT 중 하나이고; 외인성 폴리뉴클레오타이드의 통합은 좌위에서의 유전자의 발현을 선택적으로 넉아웃하는, 세포 또는 이의 집단.
  18. 제17항에 있어서, TCR 좌위는 TCR 알파 또는 TCR 베타의 불변 영역인, 세포 또는 이의 집단.
  19. 세포 또는 이의 집단으로서, BCMA-CAR, 및 (i) CD38 넉아웃, (ii) 외인성 CD16 또는 이의 변이체, 및 (iii) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체 중 하나 이상을 포함하고; 세포는 면역 효과기 세포인, 세포 또는 이의 집단.
  20. 제19항에 있어서, BCMA-CAR은 적어도 하기를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (a) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 서열 번호 39 내지 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV.
  21. 제19항에 있어서, 하기 특징 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 또는 이의 집단:
    (i) 지속성 및/또는 생존기간의 개선;
    (ii) 자연 면역 세포에 내성의 증가;
    (iii) 세포독성의 증가;
    (iv) 종양 침투의 개선;
    (v) ADCC의 향상 또는 획득;
    (vi) 종양 부위에 방관자 면역 세포를 이동시키고/시키거나 활성화하거나 동원하는 데 있어서의 능력의 향상;
    (vii) 종양 면역억제를 감소시키는 능력의 향상;
    (viii) 종양 항원 회피를 구제하는 능력의 개선;
    (ix) 종양 항원을 안정화시키는 능력; 및
    (x) 동족살해를 피하는 능력.
  22. 제19항에 있어서, 면역 효과기 세포는 T 계통 또는 NK 계통 세포인, 세포 또는 이의 집단.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 세포 또는 이의 집단을 포함하는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 세포 및 하나 이상의 치료제를 포함하는, 치료 용도를 위한 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 관문 억제제, 미토겐, 성장 인자, 소형 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 지지 세포, 지지 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 하나 이상의 관심 다중핵산을 포함하는 벡터, 항체 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편, 화학치료제 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함하는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    (1) 관문 억제제는
    (a) PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara(레티노산 수용체 알파), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E 또는 억제성 KIR을 포함하는 관문 분자에 대한 하나 이상의 길항제;
    (b) 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 이필리무맙, IPH4102, IPH43, IPH33, 리리무맙, 모날리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 이들의 유도체 또는 기능적 균등물 중 하나 이상; 또는
    (c) 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 적어도 하나를 포함하거나;
    (2) 치료제는 베네토클락스, 아자시티딘 및 포말리도마이드 중 하나 이상을 포함하거나;
    (3) 치료제는 감마 세크레타제 억제제(GSI)를 포함하는, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 항체는 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-EGFR, 항-CD123, 항-GD2, 항-PDL1 및/또는 항-CD38 항체;
    (b) 리툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 디누툭시맙, 아벨루맙, 다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202, 7G3, CSL362, 엘로투주맙, 및 이들의 인간화된 변이체 또는 단편 또는 Fc 변형된 변이체 또는 단편, 및 이들의 기능적 균등물 및 바이오시밀러 중 하나 이상; 또는
    (c) 다라투무맙.
  28. 입양 세포 치료에 적합한 대상체에게 조성물을 투여하는 것에 의한, 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조성물의 치료학적 용도로서, 대상체는 (i) 자가면역 장애; 조혈 악성종양; 고형 종양; 암 또는 바이러스 감염; (ii) 염증성 자가면역 질환, 혈장 세포의 암 또는 B 림프구의 암; (iii) 자가반응성 혈장 세포 및/또는 자가반응성 기억 B 세포와 연관된 자가면역 질환; (iv) 전신 홍반 루푸스(SLE) 또는 류마티스성 관절염, 다발성 골수종, 형질세포종, 발데스트롬 거대글로불린혈증, 혈장 세포 백혈병 또는 호지킨병; 또는 (v) 다발성 골수종을 갖는, 치료학적 용도.
  29. iPSC를 분화시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분화 세포를 제조하는 방법으로서, iPSC는 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 하기 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i) CD38 넉아웃;
    (ii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 B2M null 또는 저, 및 선택적으로 CIITA null 또는 저;
    (iii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두에서의 넉아웃;
    (iv) 고친화도 비절단성 CD16(hnCD16) 또는 이의 변이체;
    (v) BCMA 이외의 표적화 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR);
    (vi) 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체;
    (vii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나;
    (viii) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 및 TIGIT 중 적어도 하나에서의 결실 또는 발현 감소; 및
    (ix) 이의 천연적 대응 세포와 비교하여 HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, 항원 특이적 TCR, Fc 수용체, 관문 억제제, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 및 이중특이적 인게이저 또는 다중특이적 인게이저 또는 보편적 인게이저와 커플링하기 위한 표면 트리거링 수용체 중 적어도 하나에서의 발현 도입 또는 발현 증가.
  30. 제29항에 있어서, BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 넉아웃하기 위해; 그리고 선택적으로 하기를 하기 위해 클론성 iPSC를 게놈 조작하는 단계를 추가로 포함하는, 분화 세포를 제조하는 방법:
    (i) CD38을 넉아웃하기 위해; 또는
    (ii) B2M 및 CIITA를 넉아웃하도록, 하나의 또는 둘 모두의 CD58 및 CD54를 넉아웃하도록, 또는 HLA-G 또는 비절단성 HLA-G, 외인성 CD16 또는 이의 변이체, 제2 CAR, 및/또는 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체의 발현을 도입하도록.
  31. 제30항에 있어서, 게놈 조작은 표적화된 편집을 포함하는, 분화 세포를 제조하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 표적화된 편집은 결실, 삽입 또는 삽입/결실(in/del)을 포함하고, 표적화된 편집은 CRISPR, ZFN, TALEN, 호밍 뉴클레아제, 상동성 재조합, 또는 이들 방법의 임의의 다른 기능적 변형에 의해 수행되는, 분화 세포를 제조하는 방법.
  33. 클론성 iPSC의 CRISPR 매개된 편집으로서, 편집은 BCMA-CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 넉인을 포함하고, 편집된 클론성 iPSC는 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR 매개된 편집.
  34. 33항에 있어서, 편집은 CD38의 넉아웃을 추가로 포함하거나, BCMA-CAR은 하기 특징 중 적어도 하나를 포함하는, CRISPR 매개된 편집.
    (i) T 세포 특이적임;
    (ii) NK 세포 특이적임;
    (iii) 표면 BCMA에 결합함;
    (iv) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역을 포함함;
    (vi) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역을 포함함;
    (vii) 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함함; 및
    (viii) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨이되, 삽입은 그 좌위에서의 유전자의 발현을 넉아웃하는, 삽입됨.
  35. 제33항에 있어서, 편집은 BCMA-CAR 또는 TCR 좌위의 불변 영역에서의 제2 CAR의 삽입을 추가로 포함하고/하거나, CAR은 TCR의 내인성 프로모터에 의해 추진되고/되거나, TCR은 CAR 삽입에 의해 넉아웃되는, CRISPR 매개된 편집.
  36. 다발성 골수종의 치료를 개선하는 방법으로서, 치료 중인 대상체에게 BCMA-CAR, CD38 넉아웃, 및 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하는 효과기 세포를 투여하는 단계를 포함하고, BCMA-CAR은 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는, 방법:
    (i) T 세포 특이적임;
    (ii) NK 세포 특이적임;
    (iii) 세포 표면 BCMA에 결합하고 이를 안정화함;
    (iv) 서열 번호 33, 서열 번호 35 또는 서열 번호 37 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 중쇄 가변 영역을 포함함;
    (vi) 서열 번호 34, 서열 번호 36 또는 서열 번호 38 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 경쇄 가변 영역을 포함함;
    (vii) 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43 또는 서열 번호 44 중 어느 하나와 적어도 약 99%, 98%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표현된 scFV를 포함함; 및
    (viii) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP, TCR, NKG2A, NKG2D, CD38, CD58, CD54, CD56, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3 또는 TIGIT의 유전자 좌위 중 하나에서 삽입됨이되, 삽입은 그 좌위에서의 유전자의 발현을 넉아웃하는, 삽입됨.
  37. 제36항에 있어서, 효과기 세포는 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포를 포함하는 분화 조혈 세포를 포함하고, 분화 NK 세포 또는 분화 T 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법:
    (i) B2M 및 CIITA 넉아웃;
    (ii) HLA-G 또는 비절단성 HLA-G의 발현 도입, 또는 CD58 및 CD54의 하나 또는 둘 모두의 넉아웃;
    (iii) 제2 CAR, 및/또는 사이토카인, 사이토카인 수용체의 부분 길이 또는 전체 길이, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 세포 표면 발현된 단백질 복합체의 발현 도입; 및/또는
    (iii) 표 1에 열거된 유전자형 중 적어도 하나.
  38. 제36항에 있어서, 항-CD38 항체 및/또는 GSI를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제36항에 있어서, BCMA-CAR, CD38 넉아웃 및 고친화성 비절단성 CD16 또는 이의 변이체를 포함하는 효과기 세포는 GSI와 접촉되었거나 접촉된, 방법.
  40. 제36항에 있어서, 다발성 골수종은 다발성 골수종의 재발성 또는 불응성 유형인, 방법.
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