JP6200806B2 - 二重特異的融合タンパク質 - Google Patents
二重特異的融合タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6200806B2 JP6200806B2 JP2013511403A JP2013511403A JP6200806B2 JP 6200806 B2 JP6200806 B2 JP 6200806B2 JP 2013511403 A JP2013511403 A JP 2013511403A JP 2013511403 A JP2013511403 A JP 2013511403A JP 6200806 B2 JP6200806 B2 JP 6200806B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- seq
- domain
- mhsa
- growth factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Description
本願は、2010年5月21日に出願された米国仮特許出願第61/347,040;2011年5月20日に出願された米国特許出願第13/112,907および2011年5月20日に出願された、代理人整理番号132463−010104の、「二重特異的タンパク質」と題する米国特許出願の優先権を主張し、これらは出典明示によりその全体を本明細書に組み入れる。
本発明は、一般に治療用途を有する融合タンパク質に関し、より具体的には二重特異的融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む医薬組成物、および損傷組織を修復するためのそのような融合タンパク質の使用方法に関する。
組織再生は、目標が罹患したまたは損傷した組織の生物学的機能を回復することにある、総合的な科学である。組織再生は心筋梗塞などの主要な臨床上の問題に対処する。冠状動脈狭窄が心臓の一部への血液供給を断ち切ると、心臓発作として一般的に知られる、心筋梗塞が起こる。結果としての酸素不足は、心臓が内因性の再生プログラムおよび自己修復を十分に活性化できないことにより、不可逆の組織損傷(壊死およびアポトーシス)を引き起こす。そのような組織の損傷はうっ血性心不全、心臓がもはや血液を効率的に輸送することができない状態、の主な原因である。米国では、毎年100万件より多い心臓発作があり、そして、およそ500万人はうっ血性心不全に苦しめられている。
本発明は、二重特異的融合タンパク質、二重特異的融合タンパク質をコードする核酸分子およびそのような二重特異的融合タンパク質を用いる治療方法を提供する。ある実施態様において、本発明は:(a)組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている;(b)組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体に結合する、を含む二重特異的融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質はさらにペプチド半減期モジュレータを含む。
配列番号1は、抗DNAscFv SI−1のアミノ酸配列である。
本発明の態様は、2個の結合ドメイン、特定の標的分子または標的細胞に結合特異性を有する標的化ドメインおよび組織再生を調節する受容体に結合特異性を有する活性化ドメインを含む二重特異的融合タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態において、活性化ドメインが細胞を活性化する役割を果たす間、標的化ドメインは二重特異的融合タンパク質の標的を標的細胞または組織に絞る役割を果たし、その結果、標的組織の再生を促進する。本明細書で用いられる「二重特異的タンパク質」は2個以上の特定の分子に特異的に結合する能力を有する融合タンパク質をいう。
組織に関する標的分子(例えば、虚血関連分子)への結合は、標的化ポリペプチドドメインによって仲介される。このドメインは、この機能を果たすいかなるポリペプチド配列であってもよい。好ましくは、標的分子への標的化ドメインの結合は、生物活性を有さない。本明細書で用いられる、「生物活性」は、融合タンパク質のドメインへの分子の露出により実施される既知の活性として定義されたものをいう。
Kd=Koff/Kon
Greenberg et al., Chapter 7. Mouse models of ischemic angiogenesis and ischemia−reperfusion injury. Methods Enzymol. 444:159−74 (2008)。
Chimenti et al., Myocardial infarction: animal models. Methods Mol. Med. 98:217−26 (2004)。
Black SC, In vivo models of myocardial ischemia and reperfusion injury: application to drug discovery and evaluation. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 43(2):153−67 (2000)。
活性化ドメインは、細胞ネットワークの活性または1個の位置から他の位置までの細胞の動員を検出可能に調節するあらゆるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面にて受容体と結合することにより、信号変換経路を活性化することができる。いくつかの実施形態において、ある活性化ドメインは、増殖因子ポリペプチド、サイトカインポリペプチド(例えば、ケモカインポリペプチド)、またはあらゆる受容体アゴニストまたはインテグリン結合リガンドである。
そのような調節が、細胞増殖の誘導、細胞成長の誘導、細胞生存の促進および/または、アポトーシスの抑制などの細胞ネットワークの活動の増加か減少であり得ること、明らかであろう。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは他の因子または細胞(例えば、幹細胞)を動員できる。
ある実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面で増殖因子と結合する、増殖因子ポリペプチドである。代表的なそのような増殖因子受容体は、上皮成長因子(EGF)、ニューレグリン/ヘレグリン(NRG/HRG)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン様成長因子(例えば、IGF−I)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、そのアイソフォーム(例えば、VEGF−AまたはVEGF−C)、テラトカルシノーマ由来増殖因子1(TDGF1)、形質転換増殖因子アルファ(TGF−α)、形質転換増殖因子ベータ(TGF−β)、およびそのアイソフォーム、例えば、TGF−β1、TGF−β2、トロンボポエチン(THPO)またはペリオスチンである。他のそのような受容体は、マスト/幹細胞増殖因子受容体(SCFR)、肝細胞増殖因子受容体(HGF受容体、すなわち、c−Met)、ErbB−2、ErbB−3、ErbB−4、高親和性神経成長因子受容体、BDNF/NT−3増殖因子受容体、NT−3増殖因子受容体、または血管内皮増殖因子受容体1(VEGFR−I)を含む。
患者の損傷組織の修復は、あらゆる臨床的に関連している規格を使用して評価できる。例えば、筋細胞また線維芽細胞の数などの細胞数、または瘢痕化の量の定量によって、または出力のための機能的アッセイ、またはLVEDP、LVDP、+dp/dT、LV重量、室体積、および拡張期壁応力を含む心臓の機能評価の構造的態様と共に、梗塞組織の修復を測定できる。そのような評価のための方法は周知であり、文献に十分に記載される。一般に、そのような臨床的評価のいずれかにおいて、有意な(例えば、少なくとも2倍の)変化をもたらすならば、二重特異的融合タンパク質は損傷組織を修復するといえる。
当業者は、治療への応用で用いられる二重特異的タンパク質が、それらの比較的低い分子量のため最適の血清半減期を示さない可能性を理解するであろう。したがって、いくつかの治療への応用では、二重特異的タンパク質の半減期を調節することが、望ましくなり得る。いくつかの実施形態において、器官の病的な障害をうけたまたは損傷した領域での二重特異的タンパク質の蓄積を達成するために、二重特異的タンパク質は半減期モジュレータと結合(conjugate)される。そのような半減期モジュレータは融合タンパク質の生体内の半減期を増加させることができる。例えば、半減期変調器を含む二重特異的タンパク質の半減期は約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約24時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約1週間以上である。
上述されたものの追加の要素が、本明細書において提供された二重特異的融合タンパク質に任意に含まれていることは、明らかであろう。そのような要素は、二重特異的融合タンパク質の発現の促進、調製または精製、あるいは標的化の機能を果たすことを含む様々な目的のために存在し得る。例えば、N−端末リーダーポリペプチドが存在し得る。代表的なリーダーポリペプチドは、配列番号:41−42、87−91、または244のいずれか一つに記載される配列を含むかまたは有する。あるいはまた、二重特異的融合タンパク質は精製を容易にするためにポリヒスチジン(例えば、ヘキサヒスチジン)タグを含み得る。そのようなタグは、少なくとも6個のヒスチジンの連続したアミノ酸残基を含み、C−またはN−末端に位置し得る。ある実施形態において、ヘキサヒスチジンタグは二重特異的融合タンパク質のC−末端にて含まれる。追加アミノ酸残基もまた、残りの二重特異的融合タンパク質とポリヒスチジンの結合点に存在し得る。本明細書にて提供されるある二重特異的融合タンパク質は、配列番号:43、44または92−94に記載されるようなC−末端ポリヒスチジン含有ポリペプチドを含む。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);および
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(c)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(d)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(e)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);および
(f)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
(a)リーダーポリペプチド(例えば、配列番号:41−42、87−91または244に記載される配列を含むか有する);
(b)活性化ドメイン(例えば、配列番号:3−9、32−40、または50−64のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(c)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(d)標的化ポリペプチドドメイン(例えば、配列番号:1、2、30、31、72、73、76−83または85−86に記載される配列を含むか有する);
(e)任意に、短いコネクタポリペプチド;
(f)半減期モジュレータ(例えば、配列番号:10、12、14−29、45−49、65−71、または105のいずれか一つに記載される配列を含むか有する);
(g)ポリヒスチジン含有ポリペプチド(例えば、配列番号:43−44または92−94に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド)。
二重特異的タンパク質は液相および固相ペプチド合成および組換えDNA技術を含む標準的な技術を用いて合成し得る。固相合成のため、配列のC−末端アミノ酸は不溶性担体に取り付けられ、残余のアミノ酸は順に結合される。約50アミノ酸より長いポリペプチドに関しては、より短い領域がこの方法で合成され、続いてより長いポリペプチドを形成するため濃縮され得る。カルボキシル末端の活性化による(例えば、カップリング試薬N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による)ペプチド結合を形成する方法は当分野で周知である。
本発明はまた、本明細書に記載されるように、少なくとも1個の二重特異的融合タンパク質を少なくとも1個の生理学的に許容できる担体と共に含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、組織損傷を防ぐ、または損傷組織を修復または再生するために、組織損傷にり患しているかまたはそのリスクを有する患者を治療するために使用され得る。そのような患者は例えば心筋梗塞、腎臓損傷および/または脳梗塞を経験した患者を含む。所望により、幹細胞または損傷組織の修復を容易にする他の剤などの他の活性成分が医薬組成物に含まれ得る。
医薬組成物は、患者の病理的組織障害を治療するために患者(好ましくは牛、豚、馬、鶏肉、猫、犬、またはより好ましくはヒト、などの哺乳動物)に投与できる。本発明の文脈において、「治療」なる用語は予防的および治療的投与の両方を含む。予防的応用では、本明細書に記載される医薬組成物は、組織損傷の予防、遅延または重症度の減少のために、病理的組織障害にり患しているかそうでなければリスクのある患者に投与される。治療的応用では、治療は、病理的組織障害の重症度を減少させるか、または障害の後に組織を再生させるために実施される。いくつかの実施形態において、他の治療用の組成物と組み合わせて医薬組成物を投与できる。
標的化ポリペプチドドメインがDNAと結合し、活性化ドメインがNRG1である二重特異的融合タンパク質が調製された。2個のドメインが改質ヒト血清アルブミン(HSA)リンカーによって連結された。NRG1は短いコネクタポリペプチドを組み込むHSAリンカーのアミノ末端に組換え的に融合され、抗DNA scFvは追加の短いコネクタポリペプチドを組み込む改質されたHSAリンカーのカルボキシ末端に組換え的に融合された。改質されたHSAリンカーは2個のアミノ酸置換を含む。天然のHSAの位置34のシステイン残基は、この部位での酸化による潜在的なタンパク質の多様性を減少させるためにセリンに変異した。天然のHSAのアミノ酸503の、脱アミドに高感受性で、減少した薬理半減期をもたらし得るアスパラギン残基は、グルタミンに変異した。改質されたHSAリンカーは二重特異的融合タンパク質に延長された循環半減期を与える。
実施例1で調製された代表的な二重特異的融合タンパク質(そこでは、標的化ポリペプチドドメインがDNAと結合し、活性化ドメインがNRG1である)の両方の部分の活性は、二重特異的融合タンパク質の両方のアームがそれらの基質に同時に結合したときにだけ活性を与えるように設計されたELISAを用いて試験された。ELISAは、本質的にStokes et al., J. Clin. Pathol. 35(5): 566−573 (1982)およびGripenberg et al., Scand. J. Immunol. 1:151−157 (1978)に記載されるとおりに実施された。より具体的に、二重特異的融合タンパク質の、1から50ng/mlのPBS溶液が、DNA(抗DS−DNA抗体ELISAキット(Alpha Diagnostic International, Dist by AutogenBioclear, UK)で予備吸着されたプレートのウェルに添加され、検出抗体が添加される工程まで、製造者の指示通りに培養し、洗浄された。この段階で、100μlの1から50ng/mlビオチン化ヤギ抗ヒトNRG1−β1(R&D Systems BAF377)(「活性化アーム」への抗体)のPBS/1%BSA/0.05%Tween溶液が全てのウェルに加えられ、室温で1時間培養され、0.05%Tween−20と共にPBSで洗浄された。PBSで希釈された100μlのストレプトアビジン−HRP(2ug/mlのストック(R&D System 890803)の1:200の希釈)が各々のウェルに加えられ、室温で30分間培養された。0.05%Tween−20と共にPBSでの最終洗浄の後、100μlのSuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(製造者の説明書通りに、Piere, cat#34077)が添加され、蛍光(代表的な陽性シグナル)が、Fusion Microplate reader (Packard)または同様の機器で測定された。
実施例1で調製された代表的な二重特異的融合タンパク質のin vivo活性は、融合タンパク質の活性化ドメインによって制御される分子におけるシグナル変化を検出することによって、決定される。この融合タンパク質NRG1の活性化ドメインにおいて、活性は、未処理または模擬処理された心臓と比較して、二重特異的融合で処理された心臓における、リン酸化ErbB−3の増加の検出によって評価される。心筋梗塞は、C57BL/6マウスで気管内挿管、換気、および開胸に続く左冠状動脈(LCA)のライゲーションで発生する。冠動脈閉塞症は左室壁の色変化の迅速な検査および胸の閉鎖前の心電図のST上昇によって確認される。模擬処理マウスは、LCAライゲーションなしで同じ外科の手順を受けた。
実施例1の代表的な二重特異的融合タンパク質を含む組成物を、上述通りの心筋梗塞の誘導に続いて、マウスに投与した。投与は静脈注射である(例えば、尾静脈)。投与に続いて、心臓機能は以下の通り評価される。マウスを抱水クロラール(400mg/kg体重、腹腔内)で麻酔し、閉胸標本における左室(LV)圧およびLV+および−dP/dtの測定のため、右頚動脈にマイクロチップ圧力トランスデューサ(モデルSPR−671、Millar)をカニューレ挿入する。測定は二重特異的融合タンパク質による処理が心臓機能に影響することを確認するために未処理の対照マウスから得られたものと比較される。これらの測定の少なくとも一つを用いて評価した心臓機能において、有意な改善が観察された。
標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が設計され、発現され、精製された。標的化ドメインおよび活性化ドメインの様々な組み合わせは、異なる方向におけるmHSA(配列番号10)半減期モジュレータ、異なる短いコネクタポリペプチド配列、および異なるポリペプチドリーダー配列で組み立てられた。合成DNA配列は、意図する発現生物(例えば、CHOまたはPichia pastoris)のコドン使用頻度、特定の制限酵素認識部位を含めるまたは避けるという要望、および当分野で既知のコドン最適化のための他の要素を考慮して各々のアミノ酸配列について設計された。DNA配列は、発現プラスミド、該プラスミドは発現生物に形質転換され、融合タンパク質が過剰発現される、に構築され、および/または組み立てられた。各々の融合タンパク質は、Cibacron Blue Sepharoseクロマトグラフィー、Ni親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む異なる方法の組合せを用いて精製された。
興味のあるタンパク質をコードする遺伝子が、組み換えタンパク質の分泌発現を許容するために、pPinkα−HCプラスミド(Invitrogen A11151キットを含む)を使用して、Saccharomyces cerevisiaeα接合因子分泌シグナル(配列番号244、245)でインフレームでクローニングされた。加えて、His6−タグをコードするDNAは、Ni親和性クロマトグラフィーにおいて組み換えタンパク質の精製の選択肢を許容するために遺伝子の3’末端に加えられた。簡潔に、プラスミドは化学的に有用なPichiaPink Strain2(Invirogen、カタログ番号A11154)に形質転換され、培養物はBMGY(バッファー複合グリセロール培地=1%酵母エキス、2%ペプトン、100mM燐酸カリウム、pH6.0、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの1.34%Yeast Nitrogen Base、0.0004%ビオチン、1%グリセロール)中で、振盪培養器で30℃でOD600=2〜6まで生育された。このとき細胞はペレット状となり、タンパク質の発現が元の培地の1/5容量のBMMY(バッファー複合メタノール培地=1%酵母エキス、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム、pH6.0、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの1.34%Yeast Nitrogen Base、0.0004%ビオチン、0.5〜1%メタノール)での培地の交換により誘導された。培養物は、その後、振盪培養器で20〜30℃にて追加の24〜48時間で生育された。12〜24時間ごとに、追加のメタノール(最終濃度0.5〜1%(v/v)まで)が培地に追加された。採取時点で、細胞は遠心分離によりペレット状となり、上澄みが回収され、滅菌ろ過され、精製まで(典型的には採取から3日以内)4℃にて保管された。
低塩溶出バッファーでの溶出に続いて、5カラム容量の高塩(HS)溶出バッファー(20mM Tris、pH7.1、1M NaCl、45mMオクタン酸ナトリウム)で追加のタンパク質を溶出した。画分は、タンパク質含有量のために遠心限外濾過(Sartorius−Stedim、VS2022)で濃縮され、PD−10カラム(GE17−0851−01)を使用して0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2に脱塩してSDS−PAGEによって分析された。興味があるタンパク質を含む画分がプールされた。AnxV_mHSA_NRG1b(EGF)(配列番号120)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。精製された融合タンパク質は約50%の純度であった。SDS−PAGEの分析はゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の予想されたMW(112kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。8.AnxVm1234_mHSA_NRG1b(EGF)(配列番号116)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。SDS−PAGE分析は約50%の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいMW(112kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。AnxV_mHSA_IGF1(配列番号134)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。SDS−PAGE分析は約50%の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいMW(111kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。AnxVm1234_mHSA_IGF1(配列番号114)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。SDS−PAGE分析は約50%の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいMW(111kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。AnxVm1234_mHSA_FGF2(配列番号264)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。SDS−PAGE分析は約50%の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいMW(120kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。IGF1_mHSA_B7scFv(配列番号150)融合タンパク質の画分はSDS−PAGEにより分析された。SDS−PAGE分析は50%より高い純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいMW(102kDa)であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のMWで特徴付けられた。aDNASI1_mHSA_FGF2(配列番号124)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され20%未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(110kDa)に対応するバンドを示した。下側のMWバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。aDNASI1_mHSA_NRG1b(EGF)(配列番号126)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され50%未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(110kDa)に対応するバンドを示した。下側のMWバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。IGF1_mHSA_Syt1(配列番号152)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され約50%の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(91kDa)に対応するバンドを示した。下側のMWバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。Syt1_mHSA_IGF1(配列番号170)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され50%未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(91kDa)に対応するバンドを示した。下側のMWバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。IGF1_mHSA_aDNASI1(配列番号154)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され約50%の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(102kDa)に対応するバンドを示した。NRG1b(EGF)_mHSA_B7scFv(配列番号156)融合タンパク質はSDS−PAGEにより分析され50%未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいMW(102kDa)に対応するバンドおよび切断産物に対応し得る下側のMWバンドを示した。
興味のあるタンパク質を発現する安定したSelexis CHO細胞株は、振盪培養器で5〜8%のCO2、37℃にて無血清培地で培養された。成長に使用される培地は:1LのEx−Cell登録商標 CD CHO Fusion培地(Sigma、14365C−1000ML)、40mLの200mM L−グルタミン(Invitrogen、25030−081)、10mLの100X HT補完剤(Invitrogen、11067−030)であった。細胞の播種密度は0.3〜0.5×106細胞/mLであった。いったん2〜4×106細胞/mLに達すると、希望の培養液量(6L)に達するまで、培養物が希釈された。Cell Boost溶液(1LのddH2O、35gのCell Boost5(HyClone、30865.01)、20gのD−グルコース、NaOHでpHを7.0に調整)は、最終的な大きい培養物に、播種した3〜5日後に(Cell Boostの量=培養物の7−12%)加えられた。興味のある分泌タンパク質を含む細胞上清が、培養物生存率が90%より下に下降すると(培養物をその最終容量に希釈した後〜1週間)、すぐに採取された。細胞上清が遠心分離によって採取され、滅菌ろ過された。精製が1週間以内に実施される場合は、上清は4℃で保存され、そうでなければ、上清は−80℃で保存された。
標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が作成され、標的化ドメインを通してin vitroでの損傷細胞に特異的に結合するその能力が検証された。使用される標的化ドメインは、アポトーシスの間、外側の細胞表面で露出されるようになるホスファチジルセリンに結合する、ヒトアネキシンV(AnxV、配列番号31)であった。特異的結合は、異なる活性化ドメインをもつ融合タンパク質、および異なる融合方向性(例えば、N−末端活性化ドメインとC−末端標的化ドメイン、およびN−末端標的化ドメインとC−末端活性化ドメイン)による融合タンパク質を含む、さまざまな融合タンパク質に示された。特異的結合はまた、心筋細胞およびと胚幹細胞由来(ESC由来)心臓細胞を含む、異なる細胞型の損傷細胞への結合も示した。いくつかの場合、心筋梗塞後のin vivoでの細胞損傷状態を模擬するための酸化的ストレスを誘導するため、細胞は過酸化水素(H2O2)で損傷された。アネキシンVの非結合性変異体(AnxVm1234、配列番号84)含む融合タンパク質は、損傷細胞に結合せず、融合タンパク質の結合がアネキシンV標的化ドメインによって調節されたことを示した。全体的に見て、これらのデータは融合された標的化ドメインの特異的結合を通して、活性化ドメインを特異的に損傷細胞に送達する融合タンパク質の能力を示す。
融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV(配列番号136)およびIGF1_mHSA_AnxVm1234(配列番号138)は、実施例5に記載の通り、発現され、精製された。両方のタンパク質は、製造者の指示に従い、Alexa Fluor 488(Alexa Fluor 488マイクロスケールタンパク質標識化キット、Invitrogen、A30006)で共有結合で標識化された。HL−1細胞(William C. Claycomb、Louisiana State University Health Sciences Center)、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレート(BD/Falcon、353072)に、10%FBS(Sigma、 12103C)、2mM L−グルタミン(Invitrogen/Gibco、25030)、100U/mLペニシリン+100ug/mLストレプトマイシン(Invitrogen/Gibco、15070)および0.1mMノルエピネフリン(Sigma、A0937)を含む完全培地(Claycomb培地(Sigma、51800C)中に1:3で播種され、37℃および5%のCO2で培養された。2日後に、細胞に、400uM H2O2(Sigma、 H1009)が補足された培地0.1mL/ウェルが供給され、37℃および5%のCO2で15分間培養された。次に、H2O2が補足された培地を各ウェルから吸引し、完全培地に置き換え、細胞は37℃および5%のCO2で20〜24時間培養された。翌日、離れた細胞を集めるため、各ウェルからの培地が96−deepwell v−bottomプレート(USA Scientific、1896−1110)に移された。細胞は1回、PBS(Sigma、D8537)で洗浄され、次に、40μLの0.025% トリプシン−EDTAを使用してトリプシン処理され、37℃の培養器に置かれた。細胞分離は顕微鏡で監視され、トリプシンを非活性化するために10%FBSを加えた100uL/ウェルのDMEMが加えられた。細胞は冷PBSで洗浄され、100μLの結合バッファー(Annexin V−FITCアポトーシス検出キット、BD Biosciences、556547の成分)に再懸濁された。Alexa Fluor 488標識化融合タンパク質が次いで添加され、氷上で1時間、暗所で培養された。アポトーシスを起こした細胞の陽性対照検出は、アネキシンV−FITCアポトーシス検出キット(BD Biosciences、556547)を用いて得られた。どちらの場合も、3μLのヨウ化プロピジウム(PI)が培養の最終15分で添加された。細胞はBD FACSCanto IIフローサイトメータで、適切な非染色および単一染色(single stain)された対照を較正のために使用して、分析された。
実施例6Aで観察された、アポトーシスを起した心臓細胞への結合がIGF1_mHSA_AnxV融合タンパク質のAnxV標的化ドメインに特異的であり、細胞表面IGF受容体へのIGF1ドメインの結合の結果でないことを検証するため、いかなる/全てのIGF1細胞表面受容体を飽和および遮断するためのIGF1予備培養工程を含めた実験を繰り返した。H2O2濃度を200μMとした以外は、実施例6Aと同じ方法を用いた。加えて、結合バッファーへの細胞の再懸濁の後に、しかしAlexa Fluor 488で標識された融合タンパク質の添加の前に、いかなる/全てのIGF1細胞表面受容体を予備遮断するために、800nMのIGF1(Calbiochem、407240)が添加され、10分間培養された。
AnxV_mHSA(配列番号252)およびAnxVm1234_mHSA(配列番号250)は、製造者の指示に従って、Alex Fluor 647(Alexa Fluor 647カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Invitrogen、A−20006)に直接結合(conjugate)された。胚幹細胞由来(ESC由来)心臓細胞(Peter Zandstra , University of Toronto)は、本質的にはYang et al (Nature 2008, 453:524−8)に記載の通りに得られた。Bauwens CL,et al.. Tissue Eng Part A. 2011 Apr 25., Geometric Control of Cardiomyogenic Induction in Human Pluripotent Stem Cells.”からプロトコルを得た。凝集を基にしたhESCsの分化が、以前に記載した心筋系列への分化に向けられる、無血清のプロトコルを使用して実施された。HESC凝集体サイズは、マイクロウェルの加工された表面(textured surface)を含む、AggreWell TMインサート(STEMCELL Technologies)中で、定められた細胞濃度での強制的な凝集によって制御された。簡潔に、フィーダー枯渇hESCの単一細胞懸濁液は1000細胞/ウェルの密度でAggrewellに沈降された。細胞は低酸素状態で、ROCK阻害剤および0.5ng/mlのBMP4の添加と共に、基本培地としてのGlutamax、アスコルビン酸、トランスフェリン、ペニシリン/ストレプトマイシンが補足されたStemPro34中で一晩凝集させた。1日目に、培地は、10ng/mlのBMP4、3ng/mlのアクチビンA、および5ng/mlのbFGFをもつ基本培地で置き換えられた。4日目に、細胞はマイクロウェルから取り出され、DMEM F12で洗浄され、5%KOSRを補足して、10ng/mlのVEGFおよび150ng/mlのDkk1をもつ基本培地中の低クラスタプレートに移された。8日目に、培地を10ng/mlのVEGF、150ng/mlのDkk1、および5ng/mlのbFGFをもつ基本培地で置き換えられた。12日目に、再び培地を置き換え(同じサイトカイン)、16日目までに細胞を正常酸素圧条件に移した。
アポトーシスを起したESC由来心臓細胞との融合タンパク質AnxV_mHSA_NRG1b(配列番号120)の結合は、共有結合している蛍光色素分子での融合タンパク質の第一の改変の代わりに、二次検出計画を使用することで示された。融合タンパク質は製造者の指示に従ってAlexa Fluor 647(Alexa Fluor 647カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Invitrogen、A−20006)によってそれ自身が共有結合で標識された抗HSA抗体(アフィニティー精製したヤギ抗ヒトアルブミン抗体、Bethyl Labs、A80−129A)を使用して検出された。心臓細胞は実施例6Cに記載の通り、アネキシンV−FITC検出キットで共培養される間、AnxV_mHSA_NRG1b(EGF)と培養された。融合タンパク質は抗HSA Alexa Fluor 647二次抗体により検出された。Alexa Fluor 647からの蛍光シグナルは、アポトーシス検出キットからのFITCシグナルと強く相関した(図18)。これはAnxV_mHSA_NRG1b(EGF)がアポトーシスを起したESC由来心臓細胞に特異的に結合することを示した。さらに、融合タンパク質を除いた(図18の「リガンドなし」)が、二次検出試薬でまだ培養された対照実験は、Alexa Fluor 647シグナルとアポトーシスを基にするFITC信号に少しの相関関係も示さず、これは、元のAlexa Fluor 647蛍光シグナルが二次抗体単独での結合によるものではなく、融合タンパク質自身の結合によるものであることを示した。
患者の疾患関連領域に治療額を局所化するプロセスは、興味のある領域に制限されるかまたは特に豊富である分子エピトープを標的とすることによって達成できる。例えば、心筋梗塞は、この目的に利用できる、組織損傷の数個の標的分子(例えば、DNA、心臓ミオシン、およびホスファチジルセリン)を露出できる。いくつかの融合タンパク質が、これらの標的分子に特異的な標的化ドメインを含むように作成された。特に、アネキシンVおよびシナプトタグミンはホスファチジルセリンを標的とするために使用でき、SI−1一本鎖可変断片(aDNASIscFv)はDNAを標的とするために使用できる。しかしながら、当業者は、融合タンパク質に結合ドメインを含めることが各々の個々のドメインの特性の欠失または変化(例えば、結合親和性の変化、生物活性の変化)をもたらし得ることを理解するであろう。本明細書に開示された融合タンパク質の機能性が維持されるかどうかを決定するため、ELISAを基にしたin vitroでの結合テストが開発され、適用された。本質的には、アッセイは、標的化に適した融合タンパク質が、ウェル表面に覆われた同族の標的分子とのそれらの相互作用によって、激しい洗浄にも関わらず、マイクロプレートウェルに保持されたことを示した。融合タンパク質の存在は免疫化学的に定量された。同族の標的分子が存在しない、または同族でない標的分子が存在するとき、予期しない標的化ドメインの交差反応の不存在下で、保持は予想されなかった。同族の標的分子のあるときの保持、およびないときのクリアランスの組み合わせは、結合特異性および標的化機能の証拠であった。
精製融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激細胞において下流のシグナル伝達を測定することにより、in vitroで示された。融合タンパク質の有効性は野生型、非融合活性化ドメインのものと比較された。異なる活性化ドメイン、異なる標的化ドメイン、および異なる融合方向性があるさまざまな融合タンパク質が作成され、生物活性を示した。これらのデータは、融合タンパク質が生物活性であり、生存促進または増殖の経路などの細胞経路にシグナル伝達できるように作成できることを示す。
実施例5に記載のように、融合タンパク質NRG1b(EGF)_mHSA_AnxV(配列番号142)およびAnxV_mHSA_NRG1b(EGF)(配列番号120)が作成された。野生型NRG1b(EGF)はR&D Systems(396HB/CF)から入手された。DU145細胞、ヒト前立腺癌、上皮性細胞は、10%のFBS(Hyclone、SH30071)、2mMのL−グルタミン(Invitrogen/Gibco、25030)および50U/mLペニシリン+50ug/mLストレプトマイシン(Invitrogen/Gibco、15070)を含む完全培地RPMI−1640((Invitrogen/Gibco、11875))中で、96ウェルプレート(BD/Falcon、353072)に25,000の細胞/ウェルで播種されて、一晩、37℃および5%のCO2で培養された。翌日、培地が吸引され、細胞は0.1mL/ウェルのPBS(カルシウムおよびマグネシウムのない、Sigma、D8537)で洗浄され、細胞は0.1mL/ウェルのRPMI−1640+0.5%のFBSで再供給され、細胞は20〜24時間、37℃および5%のCO2で培養された。翌日、細胞は、既存の0.1mL/ウェルに25μL/ウェルで添加する希釈された融合タンパク質または対照タンパク質で37℃および5%CO2で10分間刺激された。刺激はウェルから培地を吸引して停止され、0.2mL/ウェルの冷PBSで洗浄された。細胞はあらかじめ調製された、25μL/ウェルの完全M−PER溶解バッファー(哺乳動物タンパク質抽出試薬(Pierce/ThermoScientific、78501)150mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche complete mini、04 693 124 001)、およびホスファターゼ阻害剤(Roche PhosSTOP、04 906 837 001))で溶解された。プレートは密封され、細胞はオービタルシェーカーで4℃にて30分間溶解され、溶解物はドライアイス上で寒気凍結され、−78℃で保管された。384ウェル平滑白色プレート(MaxiSorp、Nunc、460372)が、抗Akt捕捉抗体(clone SKB1、Millipore、05−591)でコートされ、密封され、室温で一晩保管された。
融合タンパク質、IGF1_mHSA_AnxV(配列番号136)、IGF1_mHSA_AnxVm1234(配列番号138)、およびIGF1_mHSA_B7scFv(配列番号150)は、実施例5に記載の通り作成された。野生型IGF1はCalbiochem(407240)から入手された。DU145細胞は、実施例8Aに記載の通り、生育され、刺激された。3個すべてのIGF1を基にしたタンパク質融合が、DU145癌細胞で、野生型IGF1と同様のpAkt刺激で、生物活性を示した(図23〜24参照)。
融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV(配列番号136)は、実施例5に記載の通り作成された。野生型IGF1はCalbiochem(407240)から入手された。HL−1細胞(William C. Claycomb、Louisiana State University Health Sciences Center)、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン/フィブロネクチンでプレコートされた96ウェルのプレート(BD/Falcon、353072)に、10%FBS(Sigma、 12103C)、2mM L−グルタミン(Invitrogen/Gibco、25030)、100U/mLペニシリン+100ug/mLストレプトマイシン(Invitrogen/Gibco、15070)および0.1mMノルエピネフリン(Sigma、A0937)を含む完全培地(Claycomb培地(Sigma、51800C)中に60,000細胞/ウェルで播種され、37℃および5%のCO2で一晩培養された。細胞は実施例8Aに記載の通り、洗浄され、ELISAプロトコルに供された。
胚幹細胞(ESC、Peter Zandstra’s lab at The University of Torontoにより提供された)から得られた心筋細胞は、ゼラチンでプレコートされた96ウェルプレートに、38.5X StemPro−34栄養補助剤(StemPro−34培地にて提供)、2mM L−グルタミン(Invitrogen/Gibco、25030)、50U/mLペニシリン+50ug/mLストレプトマイシン(Invitrogen/Gibco、15070)、0.4mMモノチオグリセロール(Sigma、M6145)、50ug/mLアスコルビン酸(Sigma、A4544)、150ug/mLトランスフェリン(Sigma、T8158)、10ng/mL VEGF(R&D Systems、293−VE)、150ng/mL DKK−1(R&D Systems、5439−DK)、および5ng/mL塩基性FGF(FGF2、PeproTech、100−18b)が補足されたStemPro−34培地(Invitrogen/Gibco、10639)中に、40,000細胞/ウェルで播種され、37℃および5%のCO2で一晩培養された。刺激の24時間前に、増殖培地は栄養補助剤および増殖因子なしのStemPro−34に変更した。細胞は実施例8Aに記載の通り、刺激され、溶解された。ELISAにおいて、96ウェルの高結合性黒色ELISAプレートがホスホ−Erk1/Erk2捕捉抗体(R&D Systems、DYC1018)でコートされ、密封され、室温にて一晩保管された。翌日、溶解物は、ホスホ−Erk1/Erk2標準(R&D Systems、DYC1018)およびホスホ−Erk1/Erk2検出抗体(R&D Systems、DYC1018)が、Akt標準と抗ホスホ−Akt検出抗体の代わりに活性Erk1/Erk2レベルを測定するために使用されたことを除いて、実施例8Aに記載の通り、ELISAプロトコルに供された。融合タンパク質AnxV_mHSA_FGF2(配列番号118)は、pERK ESC由来心臓細胞の刺激について野生型FGF2と比較され、生物活性を示した(図26)。
融合タンパク質が、その標的化ドメインを通して細胞に特異的に結合し、次にそれらの活性化ドメインを通して細胞のシグナル伝達経路を刺激する能力はin vitroで示された。使用される標的化ドメインは、ヒトアネキシンV(AnxV、配列番号31)であった。AnxVはアポトーシスの間、外側の細胞表面に露出されるようになるホスファチジルセリンに結合できる。使用される活性化ドメインは、細胞表面で発現されたIGF1受容体に結合するIGF1(配列番号3)であった。いったん結合すると、IGF1受容体は細胞内シグナル伝達を開始する。融合タンパク質は、最初に、心筋梗塞後のin vivoでの細胞の損傷状態を模擬する、アポトーシスを起した心臓細胞に結合された。融合タンパク質結合細胞は、次いで、正常な心臓細胞におけるIGF1シグナル伝達を刺激するために使用され、これは梗塞域でまたは近くで、損傷または正常な細胞の近傍のシグナル伝達を活性化する融合タンパク質の傍分泌作用を模擬した。ホスホ−Akt、IGF1シグナルの下流標的、はELISAによって測定された。細胞結合融合タンパク質は心臓細胞においてAktシグナル伝達を刺激できた。野生型IGF1はAktシグナル伝達を誘導せず、これは、融合タンパク質のアネキシンV標的化ドメインが、シグナル伝達を起すために重要であることを示した。同様に、AnxV_mHSA融合タンパク質はAktシグナル伝達を誘導せず、これは、標的化ドメイン自身がシグナル伝達に十分でなかったことを示した。まとめると、これらのデータは、標的損傷組織に特異的である能力があること、および傍分泌様形式で活性化ドメインを通じて細胞経路でシグナル伝達を行う能力があるという融合タンパク質の二重機能性を示す。この結果は、正常組織でなく損傷組織に特異的に蓄積され、活性化ドメインを通して生存または再生を調節するという融合タンパク質の治療的な役割を示す。
第二の工程では、細胞結合融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激をうけた、細胞結合融合タンパク質がある血清飢餓心筋細胞、によってin vitroで評価された。刺激を停止させるために洗浄した後、刺激細胞における下流のシグナル伝達は、ホスホ−Akt(pAkt)のELISAにより測定された。融合タンパク質によって誘導されたpAktのレベルは、市販で得られた非結合型のものの活性化ドメインならびにアネキシンV標的化ドメインを含む融合タンパク質のものと比較された。
。
われわれは、アポトーシスを起こしたおよび壊死した細胞でAnxV標的化ドメインを通してホスファチジルセリンに特異的に結合する、融合タンパク質IGF1_mHSA_AnxV(配列番号:136)が、IGF1_mHSA_AnxVm1234(配列番号:138)(ホスファチジルセリンと結合しない変異体)よりも、心筋梗塞の次の損傷した心臓組織において長期間蓄積するであろうという仮説を試験した。実験的な心筋梗塞(MI)はマウスで誘導され、そして、被験物質は静脈に注入され(IGF1_mHSA_AnxV、IGF1_mHSA_AnxVm1234、またはビヒクルのみの対照のいずれか)、動物は12時間24時間または72時間後に殺処分され、心臓の梗塞した、境界域、および遠隔(無損傷の)領域でのタンパク質の蓄積がELISAおよび免疫組織化学により観察された。免疫組織化学は、投与後24時間で、IGF1_mHSA_AnxVが梗塞の縁の境界域に局在し、一方で結合性がない変異体のいずれも梗塞、境界域、または遠隔(正常な)領域で見られないことを示した。ELISAのデータは、標的タンパク質、IGF1_mHSA_AnxV、が、結合性がない変異タンパク質IGF1_mHSA_AnxVm1234よりも、より大きい範囲および長期間心臓の梗塞域および境界域に蓄積することを示した。これらのデータはIGF1_mHSA_AnxV、原型的な標的融合タンパク質、の、心筋梗塞に続く、損傷心臓組織に特異的に蓄積して、持続し、融合された活性化ドメインの特異的送達を可能にする、能力を示す。
群1:ビヒクルのみの対照
群2:15μgのIGF1_mHSA_AnxV
群3:15μgのIGF1_mHSA_AnxVm1234
各々の群で、5匹のネズミがそれぞれの以下の時に殺処分された:投与後12、24および72時間。それぞれの群/時点において、心臓の梗塞領域またはその境界領域におけるIGF1_mHSA_AnxVまたはIGF1_mHSA_AnxVm1234に特異的な抗HSAシグナルを特定するという目標のために、3匹の動物が免疫組織化学のために、2匹がELISAのために準備された。詳細なプロトコルは以下の通り。
免疫組織化学はMass Histology Service Inc.、Worcester(MA)、GLP準拠の組織病理学実験室で実施された。処理のためのそれらの標準プロトコルおよび特異的タンパク質の検出のための固定組織の染色が使用された。簡潔に、亜鉛ホルマリンで固定された心臓は、心室まで解剖されて、標準系のアルコールおよびキシレンを通して、慣習的に処理された。各心臓がパラフィンに包埋され、、Leicaミクロトーム上で各々厚さ6ミクロンの断片が作成され、顕微鏡スライドに置かれた。各心臓において、8個の連続して横断する断片が作られ、スライドに置かれ、100μm開けて(skip)、他の8個の断片が作られ、100μm開けて、これが心臓の長さを通して繰り返された。
心臓あたり4個の試料(図28)が以下のELISAのために調製された。試料は、Eppendorf safe−lock マイクロ遠心チューブに移され、氷上で解凍された。各チューブに、Pierce Halt Protease Inhibitor Cocktail(バッファーに100倍希釈)を、1:5比の(mg組織試料):(uLバッファー)で含むRIPAバッファーが加えられた。少なくとも100μLのバッファーは各サンプルに使用された。ZROB05およびZROB10ビーズの1:2比のビーズ:バッファーの50/50混合物が加えられた。チューブは速度9に設定されたBullet Blender組織ホモジナイザーに置かれ、3分間均質化され、均質化が完全でなかった場合、繰り返された。試料は遠心分離され、そして、各試料で総タンパク量を決定するためのBCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイ実施するためにアリコートを取った。
Claims (38)
- (a)損傷細胞の細胞外空間に露出されているホスファチジルセリンに結合特異性を有する標的化ドメイン、ここで該標的化ドメインはアネキシン、またはそれらの断片である;
(b)組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該増殖因子受容体に結合する;および
(c)二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:
を含む二重特異的融合タンパク質。 - (a)損傷細胞の細胞外空間に露出されているホスファチジルセリンに結合特異性を有する少なくとも1個の標的化ドメイン、ここで該標的化ドメインはアネキシン、またはそれらの断片を含む;
(b)組織の細胞表面に関する少なくとも1個の増殖因子受容体に結合特異性を有する少なくとも1個の活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を促進するように該活性化ドメインが該増殖因子受容体に結合する;および
(c)二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ:
を含む融合タンパク質。 - 標的化ドメインが生物活性を有さない、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインおよび活性化ドメインが、同じ細胞の異なる分子と結合する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインおよび活性化ドメインが、異なる細胞の異なる分子と結合する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 活性化ドメインが、線維芽細胞増殖因子、ニューレグリン/ヘレグリン、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、間質細胞由来因子、血小板由来増殖因子、テラトカルシノーマ由来増殖因子、マスト細胞/幹細胞増殖因子、高親和性神経成長因子、BDNF/N−3増殖因子、NT−3増殖因子、骨形態形成タンパク質、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが、10−6Mから10−12Mの範囲の解離定数Kdで、標的分子と結合する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあり、活性化ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端にある、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが活性化ドメインのアミノ末端にある、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが活性化ドメインのカルボキシ末端にある、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが融合タンパク質のカルボキシ末端にあり、活性化ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にある、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 半減期モジュレータが非免疫原性のタンパク質である、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 半減期モジュレータがヒト血清アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスサイレチン、単一鎖の抗体Fcドメイン、プロリン−、アラニン−、および/または、セリン−豊富な配列、アルブミン結合ドメイン抗体、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せのうちの一からの配列を含む、請求項12に記載の融合タンパク質。
- 半減期モジュレータが血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも90%同一である少なくとも100個の連続したアミノ酸を含む、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 半減期モジュレータが配列番号10、12、14〜29、45〜49、65〜71または105のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の融合タンパク質。
- アネキシンがアネキシンVであり、配列番号31、81、82または83のいずれか一つに記載される配列を有する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 半減期モジュレータを融合タンパク質に結びつけるコネクタをさらに含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- in vivoで2時間から24時間の間の半減期を示す、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- in vivoで24時間より長い時間の半減期を示す、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- in vivoで1週間より長い期間の半減期を示す、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、細胞動員、アポトーシスの抑制、および/または、細胞増殖の誘導を促進する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、細胞の損傷を防ぎ、細胞の成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進する、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 組織が、心臓組織または腎組織、骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経組織である、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- さらにリーダーポリペプチドを含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- リーダーポリペプチドが、配列番号41〜42、87〜91または244に記載される配列を含む、請求項24に記載の融合タンパク質。
- ポリヒスチジン含有ポリペプチドをさらに含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 標的化ドメインが配列番号31、81〜83のいずれか一つに記載される配列を含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 活性化ドメインが配列番号3〜9、32〜40、50〜56、または60〜64のいずれか一つに記載される配列を含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- ポリヒスチジン含有ポリペプチドが、配列番号43〜44、または92〜94のいずれか一つに記載される配列を有する、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 活性化ドメインがNRG1beta、IGF1、SDF−1、IL−33、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 医薬上好適な担体および治療上有効量の請求項1〜30のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
- 組織再生を調節するように、対象の組織損傷を治療するための、請求項31に記載の医薬組成物。
- (i)組織の損傷細胞の細胞外空間に露出されているホスファチジルセリンに結合特異性を有する、アネキシンまたはその断片である標的化ドメイン;および(ii)増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を含み、それによって標的化ドメインがホスファチジルセリンに特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の増殖因子受容体を活性化する、
組織再生または生存を促進するための二重特異的融合タンパク質。 - (i)組織の損傷細胞の細胞外空間に露出されているホスファチジルセリンに結合特異性を有する、アネキシンまたはその断片である標的化ドメイン;(ii)増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン;(iii)二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータを含み、それによって標的化ドメインがホスファチジルセリンに特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の増殖因子受容体を特異的に活性化する、
組織再生または生存を促進するための二重特異的融合タンパク質。 - 標的化ドメインおよび活性化ドメインが異なる細胞に関する分子に結合する、請求項33または34に記載の二重特異的融合タンパク質。
- 幹細胞をさらに含む、請求項31に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- アネキシンが、ホスファチジルセリン結合親和性を維持している間、アネキシンの内在化を減少させるように改質される、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US34704010P | 2010-05-21 | 2010-05-21 | |
US61/347,040 | 2010-05-21 | ||
PCT/US2011/037459 WO2011146902A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-05-20 | Bi-specific fusion proteins |
US13/068,808 US9238080B2 (en) | 2010-05-21 | 2011-05-20 | Bi-specific fusion proteins |
US13/112,907 | 2011-05-20 | ||
US13/112,907 US8691771B2 (en) | 2010-05-21 | 2011-05-20 | Bi-specific fusion proteins for tissue repair |
US13/068,808 | 2011-05-20 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016130526A Division JP6174763B2 (ja) | 2010-05-21 | 2016-06-30 | 二重特異的融合タンパク質 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013530146A JP2013530146A (ja) | 2013-07-25 |
JP2013530146A5 JP2013530146A5 (ja) | 2014-07-03 |
JP6200806B2 true JP6200806B2 (ja) | 2017-09-20 |
Family
ID=44972647
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013511403A Active JP6200806B2 (ja) | 2010-05-21 | 2011-05-20 | 二重特異的融合タンパク質 |
JP2016130526A Active JP6174763B2 (ja) | 2010-05-21 | 2016-06-30 | 二重特異的融合タンパク質 |
JP2017132859A Active JP6822911B2 (ja) | 2010-05-21 | 2017-07-06 | 二重特異的融合タンパク質 |
JP2019117073A Active JP6965311B2 (ja) | 2010-05-21 | 2019-06-25 | 二重特異的融合タンパク質 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016130526A Active JP6174763B2 (ja) | 2010-05-21 | 2016-06-30 | 二重特異的融合タンパク質 |
JP2017132859A Active JP6822911B2 (ja) | 2010-05-21 | 2017-07-06 | 二重特異的融合タンパク質 |
JP2019117073A Active JP6965311B2 (ja) | 2010-05-21 | 2019-06-25 | 二重特異的融合タンパク質 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (11) | US9238080B2 (ja) |
EP (1) | EP2571992B1 (ja) |
JP (4) | JP6200806B2 (ja) |
CN (1) | CN103124788B (ja) |
AU (1) | AU2011255238B2 (ja) |
BR (1) | BR112012029611A2 (ja) |
CA (1) | CA2800173C (ja) |
ES (1) | ES2674567T3 (ja) |
WO (1) | WO2011146902A1 (ja) |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010059315A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
EP2396347B1 (en) | 2009-02-11 | 2017-04-12 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
CN102741280B (zh) | 2009-10-30 | 2015-12-02 | 诺维信生物制药丹麦公司 | 白蛋白变体 |
ES2678144T3 (es) | 2010-02-16 | 2018-08-09 | Medimmune, Llc | Composiciones relacionadas con SAH y métodos de uso |
US10233228B2 (en) | 2010-04-09 | 2019-03-19 | Albumedix Ltd | Albumin derivatives and variants |
US9238080B2 (en) | 2010-05-21 | 2016-01-19 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific fusion proteins |
US9045564B2 (en) | 2011-02-15 | 2015-06-02 | Medimmune, Llc | HSA-related compositions and methods of use |
WO2012149254A2 (en) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | The Feinstein Institute For Medical Research | Mfg-e8 and uses thereof |
CN104011072B (zh) | 2011-05-05 | 2018-10-12 | 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 | 白蛋白变体 |
EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
AU2013234299B2 (en) | 2012-03-16 | 2017-06-22 | Albumedix Ltd. | Albumin variants |
MX349035B (es) | 2012-05-17 | 2017-07-07 | Extend Biosciences Inc | Portadores para el suministro mejorado de farmaco. |
US9790264B2 (en) | 2012-06-25 | 2017-10-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compounds and methods for modulating pharmacokinetics |
EP3369747A1 (en) | 2012-06-25 | 2018-09-05 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Targeted theratpeutics |
WO2014036520A1 (en) | 2012-08-30 | 2014-03-06 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapies comprising anti-erbb3 agents |
GB2512156A (en) | 2012-11-08 | 2014-09-24 | Novozymes Biopharma Dk As | Albumin variants |
WO2014139468A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Admark Healthcare, Llc | Fusion protein molecules and method of use |
CA2941072A1 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods related to engineered fc constructs |
EP3157947A1 (en) * | 2014-06-23 | 2017-04-26 | Novartis AG | Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof |
US10588980B2 (en) | 2014-06-23 | 2020-03-17 | Novartis Ag | Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules |
CN105273087A (zh) * | 2014-07-14 | 2016-01-27 | 复旦大学 | NGF-Fc融合蛋白及其制备方法 |
US9585934B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-03-07 | Extend Biosciences, Inc. | Therapeutic vitamin D conjugates |
US9789197B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-10-17 | Extend Biosciences, Inc. | RNAi vitamin D conjugates |
WO2016065052A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Extend Biosciences, Inc. | Insulin vitamin d conjugates |
CN107750165A (zh) | 2015-04-17 | 2018-03-02 | 梅里麦克制药股份有限公司 | 借助塞里班土单抗的组合治疗 |
CN104946656B (zh) * | 2015-06-08 | 2018-08-17 | 吉林省农业科学院 | 一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法 |
TWI829617B (zh) | 2015-07-31 | 2024-01-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Flt3及cd3抗體構築體 |
TWI796283B (zh) | 2015-07-31 | 2023-03-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Msln及cd3抗體構築體 |
TWI744242B (zh) | 2015-07-31 | 2021-11-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Egfrviii及cd3抗體構築體 |
JP7007261B2 (ja) | 2015-08-20 | 2022-01-24 | アルブミディクス リミティド | アルブミン変異体及びコンジュゲート |
GB2542391A (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-22 | Annexin Pharmaceuticals Ab | Process of manufacture |
ES2863278T3 (es) * | 2015-10-02 | 2021-10-11 | Silver Creek Pharmaceuticals Inc | Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos |
CN108430511B (zh) * | 2015-12-21 | 2021-06-04 | 合肥立方制药股份有限公司 | 一种药物设计方法和获得的药物及其应用 |
JP6904959B2 (ja) * | 2016-01-04 | 2021-07-21 | クール ファーマシューティカルズ ディベロップメント カンパニー インコーポレイテッド | 結合エピトープを含有する融合タンパク質を封入する粒子 |
EA039859B1 (ru) | 2016-02-03 | 2022-03-21 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3 |
MA43955B1 (fr) | 2016-02-03 | 2022-02-28 | Amgen Inc | Anticorps anti-bcma et anti-cd3 bispécifiques de format bite |
US20190091227A1 (en) | 2016-03-15 | 2019-03-28 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating er+, her2-, hrg+ breast cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody |
IL263213B1 (en) | 2016-05-23 | 2024-01-01 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods relating to engineered FC constructs |
CA3049383A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods related to engineered fc constructs |
CA3069017A1 (en) * | 2017-07-03 | 2019-01-10 | Torque Therapeutics, Inc. | Immunostimulatory fusion molecules and uses thereof |
US11352404B2 (en) * | 2017-07-24 | 2022-06-07 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Phosphatidylserine targeting fusion molecules and methods for their use |
CN113214410A (zh) * | 2017-11-04 | 2021-08-06 | 海南大学 | 一种表达促皮质素与胰岛素样生长因子1融合蛋白的重组质粒、重组菌的构建方法 |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8819826D0 (en) | 1988-08-20 | 1988-09-21 | Kabivitrum Ab | Glycosylated igf-1 |
US5679771A (en) | 1990-02-13 | 1997-10-21 | Gropep Pty. Ltd. | Method for treating intestinal diseases |
US6566098B1 (en) | 1990-09-14 | 2003-05-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA encoding truncated hepatocyte growth factor variants |
AU660297B2 (en) * | 1990-11-09 | 1995-06-22 | Stephen D. Gillies | Cytokine immunoconjugates |
US5632986A (en) | 1991-05-09 | 1997-05-27 | The University Of Washington | Phospholipid-targeted thrombolytic agents |
AU7042994A (en) * | 1993-05-21 | 1994-12-20 | Amgen, Inc. | Recombinant (neu) differentiation factors |
WO1995032003A1 (en) | 1994-05-24 | 1995-11-30 | Amgen Boulder Inc. | Modified insulin-like growth factors |
US5780052A (en) * | 1995-04-24 | 1998-07-14 | Northeastern University | Compositions and methods useful for inhibiting cell death and for delivering an agent into a cell |
EP0854884A1 (en) | 1996-04-17 | 1998-07-29 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Ligand inhibitors of insulin-like growth factor binding proteins and methods of use therefor |
US6121416A (en) | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
BR9912053A (pt) | 1998-07-13 | 2001-04-03 | Univ Texas | Processos de tratamento de câncer utilizando conjugados terapêuticos que se ligam a aminofosfolipìdios |
US6387663B1 (en) * | 1998-07-31 | 2002-05-14 | University Of Southern California | Targeting pharmaceutical agents to injured tissues |
AUPP785098A0 (en) | 1998-12-21 | 1999-01-21 | Victor Chang Cardiac Research Institute, The | Treatment of heart disease |
JP2002535967A (ja) | 1999-01-06 | 2002-10-29 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | インシュリン様成長因子(igf)i変異体 |
US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
EP1223953B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-02-01 | University of Southern California | Matrix-targeted fusion polypeptides for tissue regeneration and wound healing |
GB2360771A (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-03 | Antisoma Res Ltd | Compounds for targeting |
AU8844301A (en) | 2000-08-29 | 2002-03-13 | Univ Colorado State Res Found | Method for treating the central nervous system by administration of igf structural analogs |
HUP0302525A2 (hu) * | 2001-01-05 | 2003-10-28 | Abgenix, Inc. | Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok |
US7635680B2 (en) * | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Attenuation of reperfusion injury |
JP4641705B2 (ja) | 2001-04-30 | 2011-03-02 | ザイストール セラピューティクス, インコーポレイテッド | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 |
US7049286B2 (en) * | 2001-08-30 | 2006-05-23 | Diatos, S.A. | Insulin conjugates and methods of use thereof |
AU2008200706B2 (en) | 2001-10-16 | 2010-05-27 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Methods and compositions for targeting underglycosylated proteins across the blood brain barrier |
US20030072761A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-04-17 | Lebowitz Jonathan | Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier |
AU2003241313A1 (en) | 2002-04-23 | 2003-11-10 | Roger Williams Hospital | Compositions and methods for stem cell delivery |
EP1509541B1 (en) | 2002-06-06 | 2011-11-23 | Tze Chein Wun | Novel recombinant anticoagulant proteins |
US9321832B2 (en) | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
US20040213738A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-28 | Susan Croll-Kalish | CIRL3-Like proteins, nucleic acids, and methods of modulating CIRL3-L-mediated activity |
ATE448789T1 (de) | 2003-05-19 | 2009-12-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Sulfatgruppen-transferase-hemmer |
WO2005033134A2 (en) | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Secreted protein therapeutics and uses thereof |
BRPI0406605B8 (pt) * | 2003-11-13 | 2021-05-25 | Hanmi Holdings Co Ltd | conjugado de proteína, método para a preparação do mesmo e composição farmacêutica para intensificar a duração e estabilidade in vivo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo |
EA011859B9 (ru) * | 2004-01-05 | 2013-07-30 | Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. | Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени |
WO2005117973A2 (en) * | 2004-05-05 | 2005-12-15 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific binding agents for modulating biological activity |
WO2006004910A2 (en) | 2004-06-28 | 2006-01-12 | Transtarget Inc. | Improved bispecific antibodies |
US7511016B2 (en) * | 2004-07-07 | 2009-03-31 | Mosamedix B.V. | Annexins, derivatives thereof, and annexin-cys variants, as well as therapeutic and diagnostic uses thereof |
US7531318B2 (en) | 2004-08-20 | 2009-05-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Screening of agents for activity against ischemic myocardial insults |
JP2008510732A (ja) | 2004-08-20 | 2008-04-10 | ザ・ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム | 心臓組織の損傷を処置、予防、阻害、または緩和する方法 |
CA2582552A1 (en) | 2004-10-21 | 2006-05-04 | Igf Oncology, Llc | Toxins and radionuclides coupled to igf-1 receptor ligands for treatment of cancer |
AU2005319155B2 (en) * | 2004-12-21 | 2013-01-31 | Musc Foundation For Research Development | Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration |
WO2006074390A2 (en) | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating obesity with combination therapeautics of igf-i fusion polypeptides |
EP1841467A4 (en) | 2005-01-14 | 2009-01-28 | Cytogen Corp | COMBINATION CANCER THERAPY WITH ANTI-PSMA ANTIBODIES |
AU2006206187B2 (en) * | 2005-01-24 | 2011-03-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Fc-fusion constructs binding to phosphatidylserine and their therapeutic use |
CA2599606A1 (en) | 2005-02-23 | 2006-08-31 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific binding agents for modulating biological activity |
US7521211B2 (en) * | 2005-04-05 | 2009-04-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | IGF-1 and IGF-2 chimeric polypeptides and therapeutic uses thereof |
EP1890722A2 (en) * | 2005-05-27 | 2008-02-27 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Methods of and compositions for stimulation of glucose uptake into muscle cells and treatment of diseases |
JP2009504157A (ja) * | 2005-08-12 | 2009-02-05 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
WO2007044887A2 (en) | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Transtarget, Inc. | Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies |
JP5558719B2 (ja) | 2005-12-12 | 2014-07-23 | モサメディックス・ビー.ブイ. | 治療および診断におけるプレターゲッティングに適したアネキシン誘導体 |
US7776816B2 (en) | 2006-01-20 | 2010-08-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Preserving hypoxic tissue |
CA2638811A1 (en) * | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Medimmune, Llc | Protein formulations |
BRPI0707824A2 (pt) | 2006-02-15 | 2011-05-10 | Imclone Systems Inc | proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno |
WO2007109254A2 (en) | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Stabilized polypeptide compositions |
US9187517B2 (en) * | 2006-11-13 | 2015-11-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods of promoting cardiac repair using growth factors fused to heparin binding sequences |
US8003761B2 (en) * | 2007-01-23 | 2011-08-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
SE530073C2 (sv) | 2007-01-23 | 2008-02-26 | Teknikbolaget K Samuelsson Ab | Sprutmunstycksanordning för brandsläckningssystem |
US11535673B2 (en) | 2007-04-05 | 2022-12-27 | President and Fellows of Harvard CoHege | Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof |
US8889140B2 (en) | 2007-05-31 | 2014-11-18 | Transtarget, Inc. | Compositions and methods for tissue repair |
EP2152751A1 (en) | 2007-05-31 | 2010-02-17 | Genmab A/S | Fusion or linked proteins with extended half life |
CN101970678B (zh) | 2007-06-21 | 2014-08-20 | 慕尼黑科技大学 | 具有增加的体内和/或体外稳定性的生物学活性蛋白 |
WO2009030720A2 (en) | 2007-09-06 | 2009-03-12 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Process for producing a recombinant protein |
CA2721093A1 (en) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
WO2010059315A1 (en) | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
US20100197890A1 (en) | 2009-01-31 | 2010-08-05 | Mctavish Hugh | Anti-cancer protein-platinum conjugates |
WO2011011071A2 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Ipsen Pharma S.A.S. | Analogues of insulin-like growth factor-1 (igf-1) |
KR101417872B1 (ko) | 2009-07-22 | 2014-07-09 | 입센 파마 에스.에이.에스 | 59번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인슐린 유사 성장 인자-1(igf-1)의 유사체 |
AU2010306774A1 (en) | 2009-10-14 | 2012-05-03 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific binding agents targeting IGF-1R and ErbB3 signalling and uses thereof |
CN102741280B (zh) | 2009-10-30 | 2015-12-02 | 诺维信生物制药丹麦公司 | 白蛋白变体 |
US9238080B2 (en) * | 2010-05-21 | 2016-01-19 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific fusion proteins |
EP2649177B1 (en) | 2010-12-08 | 2018-09-05 | ViaCyte, Inc. | Agents and methods for inhibiting human pluripotent stem cell growth |
EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
CN109180802A (zh) | 2011-12-15 | 2019-01-11 | 爱德迪安(北京)生物技术有限公司 | 具有降血糖作用的化合物、组合物及其用途 |
AU2013323669B2 (en) | 2012-09-26 | 2018-03-01 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin analog dimers |
KR20150134417A (ko) | 2013-03-29 | 2015-12-01 | 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. | 연골-결합 융합 단백질 |
US9675671B2 (en) | 2014-01-12 | 2017-06-13 | Igf Oncology, Llc | Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof |
WO2020069673A1 (en) | 2018-10-06 | 2020-04-09 | Mediatek Inc. | Method and apparatus of shared merge candidate list region for video coding |
-
2011
- 2011-05-20 US US13/068,808 patent/US9238080B2/en active Active
- 2011-05-20 WO PCT/US2011/037459 patent/WO2011146902A1/en active Application Filing
- 2011-05-20 BR BR112012029611A patent/BR112012029611A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-05-20 US US13/112,907 patent/US8691771B2/en active Active
- 2011-05-20 ES ES11729797T patent/ES2674567T3/es active Active
- 2011-05-20 EP EP11729797.8A patent/EP2571992B1/en active Active
- 2011-05-20 CN CN201180035656.1A patent/CN103124788B/zh active Active
- 2011-05-20 CA CA2800173A patent/CA2800173C/en active Active
- 2011-05-20 AU AU2011255238A patent/AU2011255238B2/en active Active
- 2011-05-20 JP JP2013511403A patent/JP6200806B2/ja active Active
-
2014
- 2014-02-24 US US14/187,728 patent/US9982060B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-14 US US14/967,980 patent/US9718892B2/en active Active
-
2016
- 2016-06-30 JP JP2016130526A patent/JP6174763B2/ja active Active
-
2017
- 2017-06-09 US US15/618,478 patent/US10407512B2/en active Active
- 2017-07-06 JP JP2017132859A patent/JP6822911B2/ja active Active
-
2018
- 2018-04-19 US US15/957,252 patent/US10858450B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-25 JP JP2019117073A patent/JP6965311B2/ja active Active
- 2019-07-29 US US16/524,451 patent/US10988547B2/en active Active
-
2020
- 2020-10-23 US US17/078,978 patent/US11673970B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-25 US US17/212,270 patent/US11814443B2/en active Active
-
2023
- 2023-05-03 US US18/311,306 patent/US20230322951A1/en active Pending
- 2023-10-09 US US18/483,308 patent/US20240101713A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6174763B2 (ja) | 二重特異的融合タンパク質 | |
CN105524176B (zh) | 双特异性融合蛋白 | |
US11879002B2 (en) | Bi-specific therapeutic proteins, in vivo methods of use thereof and encoding nucleic acids thereof | |
AU2013202341A1 (en) | Bi-specific fusion proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20140120 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140519 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150714 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151014 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160301 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160630 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160805 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20160826 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170501 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170828 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6200806 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |