JP6174763B2 - 二重特異的融合タンパク質 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，０４０；２０１１年５月２０日に出願された米国特許出願第１３／１１２，９０７および２０１１年５月２０日に出願された、代理人整理番号１３２４６３−０１０１０４の、「二重特異的タンパク質」と題する米国特許出願の優先権を主張し、これらは出典明示によりその全体を本明細書に組み入れる。
技術分野
本発明は、一般に治療用途を有する融合タンパク質に関し、より具体的には二重特異的融合タンパク質、そのような融合タンパク質を含む医薬組成物、および損傷組織を修復するためのそのような融合タンパク質の使用方法に関する。
背景技術
組織再生は、目標が罹患したまたは損傷した組織の生物学的機能を回復することにある、総合的な科学である。組織再生は心筋梗塞などの主要な臨床上の問題に対処する。冠状動脈狭窄が心臓の一部への血液供給を断ち切ると、心臓発作として一般的に知られる、心筋梗塞が起こる。結果としての酸素不足は、心臓が内因性の再生プログラムおよび自己修復を十分に活性化できないことにより、不可逆の組織損傷（壊死およびアポトーシス）を引き起こす。そのような組織の損傷はうっ血性心不全、心臓がもはや血液を効率的に輸送することができない状態、の主な原因である。米国では、毎年１００万件より多い心臓発作があり、そして、およそ５００万人はうっ血性心不全に苦しめられている。
損傷した心臓組織の再生のための効果的な治療方法は全くない。うっ血性心不全のための現在の療法は、不整脈、動脈硬化の進行、および再発性心筋梗塞を予防することに向けられ、根本的な組織損傷に対処するものではない。うっ血性心不全と診断された患者の半数以上は、診断から５年以内に死亡する。
幹細胞治療は心臓の修復のための潜在的な新しい戦略である。実験室レベルでは、幹細胞から心筋細胞を生成することが可能である。このことは、幹細胞が患者の心臓組織などの損傷組織を修復できることを示唆するが、このようなアプローチに基づくいかなる治療療法も現在利用可能ではない。幹細胞治療で直面する１つの困難は、臨床的に有意な修復をもたらすことができる程度の、損傷組織への十分な数の幹細胞の標的化である。
その結果、当分野において、損傷組織の修復または再生のための方法、または組織修復を促進するための幹細胞などの細胞の標的化を改良するための方法の必要性がある。本発明はこの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
発明の概要
本発明は、二重特異的融合タンパク質、二重特異的融合タンパク質をコードする核酸分子およびそのような二重特異的融合タンパク質を用いる治療方法を提供する。ある実施態様において、本発明は：（ａ）組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている；（ｂ）組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体に結合する、を含む二重特異的融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質はさらにペプチド半減期モジュレータを含む。
本発明のある実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、（ａ）組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている；（ｂ）組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが表面関連分子（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが表面関連分子に結合する；および（ｃ）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
本発明の他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、（ａ）組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン；（ｂ）組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該分子に結合する；および（ｃ）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
本発明の他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、（ａ）組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン；（ｂ）組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する結合ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を促進するように該結合ドメインが該分子に結合する；および（ｃ）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
本発明のさらに他の実施態様において、二重特異的融合タンパク質は、（ａ）組織に関する少なくとも１個の標的分子に結合特異性を有する少なくとも１個の標的化ドメイン；（ｂ）組織の細胞表面に関する少なくとも１個の分子に結合特異性を有する少なくとも１個の活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を促進するように該活性化ドメインが該分子に結合する；および（ｃ）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
いくつかの実施形態において、活性化ドメインまたは結合ドメインは増殖因子受容体、サイトカイン受容体または幹細胞関連抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは生物活性を有さない。標的化ドメインおよび活性化ドメインは、同じ細胞の異なる分子と結合でき、また異なる細胞の異なる分子に結合できる。
いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ニューレグリン／ヘレグリン（ＮＲＧ／ＨＲＧ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、チモシン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）／マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、ペリオスチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、間質細胞由来因子（ＳＤＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、テラトカルシノーマ由来増殖因子（ＴＤＧＦ）、ベータ−神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、ベータセルリン、ベータ−カテニン、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ＧＨ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、インスリン、インターロイキン（ＩＬ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１／ＣＣＬ２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｗｎｔ、活性化受容体に特異性を有する抗体、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは配列番号３−９、３２−４０または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含む。
標的化ドメインおよび活性化ドメインは、融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端にあることができる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは融合タンパク質のアミノ末端にあり、活性化ドメインは融合タンパク質のカルボキシ末端にある。いくつかの実施形態において、標的化ドメインはカルボキシ末端にあり、活性化ドメインは融合タンパク質のアミノ末端にある。
いくつかの実施例において、半減期モジュレータは非免疫原性のタンパク質である。半減期モジュレータはヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩ、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスサイレチン抗体Ｆｃドメイン、抗体Ｆｃドメインの単一鎖版、プロリン−、アラニン−、および／または、セリン−豊富な配列、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せのうちの一からの配列を含むことができる。例えば、半減期モジュレータは血清アルブミンアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１または１０５のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、標的化ドメインはミオシン、心臓ミオシン、ＤＮＡ、ホスファチジルセリン、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群から選択される標的分子と結合する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、１０−６Ｍから１０−１２Ｍの範囲の解離定数Ｋｄで、標的分子と結合する。標的化ドメインはアネキシン、シナプトタグミン、抗ホスファチジルセリン抗体、ＰＳ４Ａ７、ラクトアドヘリン、抗ミオシン抗体、抗ＤＮＡ抗体、ａＤＮＡＳＩ１、ａＤＮＡＳＩ２２、それらの変異体、それらの断片、およびそれらの組合せからなる群より選択できる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号１−２、３０−３１、７２−７３、７６−８３または８５−８６のいずれか一つに記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、抗体は配列番号１、２、３０、７３、７６−８０のいずれか一つに記載される配列を有するｓｃＦｖ抗体である。いくつかの実施形態において、アネキシンはアネキシンＶであり、配列番号３１、８１、８２または８３のいずれか一つに記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号１、２、３０、３１または７２−８６のいずれか一つに記載される配列を含む。
いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は半減期モジュレータを融合タンパク質に結びつけるコネクタをさらに含む。二重特異的融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで２時間から６時間の間、６時間から２４時間の間、２４時間より長い時間、または１週間より長い期間の半減期を示すことができる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞動員、アポトーシスの抑制、および／または、細胞増殖の誘導を促進する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞の損傷を防ぎ、細胞の成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、かつ／または、幹細胞の分化を促進する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は組織再生を促進する。組織は、心臓組織、腎組織、骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経系であり得る。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質はさらにリーダーポリペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。リーダーポリペプチドは、配列番号４１、４２、８７−９１または２４４のいずれか一つに記載される配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質はポリペプチドアフィニティータグを含む。いくつかの実施形態において、アフィニティータグは融合タンパク質のアミノ末端、融合タンパク質のカルボキシ末端、または融合タンパク質の中間にある。いくつかの実施形態において、融合タンパク質はヘキサヒスチジン含有ポリペプチドを含む。ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドは、配列番号４３、４４、または９２−９４のいずれか一つに記載される配列を有することができる。
本明細書において提供される二重特異的結合剤は、必ずしも２個の結合特異性に制限されるというわけではない。ある実施形態において、標的化ドメインに加えて、二重特異的融合タンパク質は、ペプチド結合を経て直接または間接的に結び付けられる２個以上の活性化ドメインを含む。ある実施形態において、活性化ドメインに加えて、二重特異的融合タンパク質はペプチド結合を経て直接または間接的に結び付けられる２個以上の標的化ドメインを含む。
他の実施態様において、本発明は、上記の二重特異的融合タンパクを生理学的に許容される担体との組合せで含む、医薬組成物を提供する。
さらに他の実施態様の中で、病理的な組織障害に苦しむ患者に医薬組成物を投与して、その結果患者の病理的な組織障害を低下させることを含む、患者の病理的な組織障害を治療するための方法が提供される。
本発明の態様は対象の組織再生または生存を促進する方法に関し、その方法は、（ａ）（ｉ）組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている；および（ｉｉ）増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を含む二重特異的融合タンパク質を提供すること；および（ｂ）それを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが組織の損傷細胞に関する標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の増殖因子受容体を活性化すること、を含む。
いくつかの実施形態において、対象の組織再生または生存を促進する方法は、（ａ）（ｉ）標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン；（ｉｉ）受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン；（ｉｉｉ）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータを含む二重特異的融合タンパク質を提供すること；および（ｂ）それを必要とする患者に治療上有効な量の二重特異的融合タンパク質を投与し、それによって標的化ドメインが標的分子に特異的に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化し、かつ、それによって活性化ドメインが増殖因子受容体にさらされると、組織の再生を促進するように活性化ドメインが第二の細胞の受容体を特異的に活性化すること、を含む。
いくつかの実施形態において、第一および第二の細胞は同じである。また他の実施形態において、第一および第二の細胞は異なる。いくつかの実施形態において、第一の細胞は生存細胞であり、第二の細胞は損傷細胞である。また他の実施形態において、第一の細胞は損傷細胞であり、第二の細胞は生存細胞である。いくつかの実施形態において、方法は患者に幹細胞を投与することをさらに含む。
ある実施形態において、病理的な組織損害は心筋梗塞に関する心臓組織の損傷である。他の実施形態において、病理的な組織損害は腎臓組織の損傷である。他の実施形態において、病理組織損害は骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経系におけるものである。ある実施形態において、そのような方法は患者に幹細胞を投与することをさらに含む。
上記で説明されるように、二重特異的融合タンパク質をコードする核酸分子も本明細書において提供される。ある実施形態において、核酸分子はＤＮＡであり、かつ、ＤＮＡはさらに二重特異的融合タンパク質コード配列に任意に結び付けられ、コーディング配列の転写および翻訳が少なくとも１個の真核細胞型で現れるような、転写および翻訳調節塩基配列を含む。
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、以下の詳細な記載を参照することにより明らかになるであろう。
配列表の記載
配列番号１は、抗ＤＮＡｓｃＦｖ ＳＩ−１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、抗ＤＮＡｓｃＦｖ ＳＩ−２２のアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉ（成熟形態）に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｄ１２Ａ置換を有するヒトＩＧＦ−１に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５は、Ｅ９Ａ置換を有するヒトＩＧＦ−１に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ１ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ１ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ２融合に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ２ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）リンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換を有するＨＳＡリンカーの核酸配列である。
配列番号１２は、ＨＳＡのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＨＳＡの核酸配列である。
配列番号１４は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換およびポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換およびポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換およびポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換およびポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換およびポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ポリペプチドコネクタを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号２４は、Ｃ３４Ｓ置換を有するＨＳＡリンカー、ドメインＩのアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ＨＳＡリンカー、ドメインＩＩのアミノ酸配列である。
配列番号２６は、Ｎ５０３Ｑ置換を有するＨＳＡリンカー、ドメインＩＩＩのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ＨＳＡリンカー、ドメインＩのアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＨＳＡリンカー、ドメインＩＩＩのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ヒトアルファ−フェトプロテインのアミノ酸配列である。
配列番号３０は、抗ホスファチジルセリンｓｃＦｖ ＰＳ４Ａ７のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ヒトアネキシンＶ（ＡｎｘＶ）のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ１ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ１ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ２ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ２ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ヒトＶＥＧＦアルファ単量体に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ヒトＶＥＧＦアルファ二量体に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ヒトＦＧＦ２に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ヒトＮＲＧ１アルファ、ＥＧＦ様ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４０は、ヒトＮＲＧ１アルファ、全配列に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、二重特異的融合タンパク質リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、二重特異的融合タンパク質リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、Ｃ−末端ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４４は、Ｃ−末端ヘキサヒスチジン含有ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４６は、Ｎ末端およびＣ末端の短いコネクタポリペプチドを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４７は、Ｎ末端およびＣ末端の短いコネクタポリペプチドを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４８は、Ｎ末端およびＣ末端の短いコネクタポリペプチドを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号４９は、Ｎ末端およびＣ末端の短いコネクタポリペプチドを有するＨＳＡリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ヒトＦＧＦ２に対応する増殖因子ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ヒトＨＧＦアルファ鎖に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ１ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５３は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ２ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ヒトＨＧＦアルファ鎖Ｋ２ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５５は、ヒトＮＲＧ１ベータ細胞外ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５６は、ヒトＮＲＧ１ベータＥＧＦ様ドメインに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５７は、ヒト完全長ペリオスチンのアミノ酸配列である。
配列番号５８は、ヒトペリオスチンの領域のアミノ酸配列である。
配列番号５９は、ヒト骨形成タンパク質−２に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６０は、一本鎖ヒト骨形成タンパク質−２に対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６１は、血管内皮増殖因子Ｂに対応する増殖因子ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６２は、ヒト血管内皮増殖因子Ｂの一部のアミノ酸配列である。
配列番号６３は、ヒト血管内皮増殖因子Ｂの一部のアミノ酸配列である。
配列番号６４は、ヒト血管内皮増殖因子Ｂの一部のアミノ酸配列である。
配列番号６５は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩのアミノ酸配列である。
配列番号６６は、改質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ビタミンＤ結合タンパク質（ｍＶＤＢＰ）のアミノ酸配列である。
配列番号６７は、改質ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩのアミノ酸配列である。
配列番号６８は、ヒトＡＦＰのアミノ酸配列である。
配列番号６９は、改質ＡＦＰのアミノ酸配列である。
配列番号７０は、アルブミン結合ドメインヒト抗体（ａｌｂｕｄＡｂ）のアミノ酸配列である。
配列番号７１は、ｓｃＦｃと名づけられた、単量体の異型Ｆｃのアミノ酸配列である。
配列番号７２は、シナプトタグミンＩのアミノ酸配列である。
配列番号７３は、抗ＤＮＡｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号７４は、非結合性シナプトタグミンＩ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号７５は、非結合性ｓｃＦｖ変異体（ＤＡｓｃＦｖ）のアミノ酸配列である。
配列番号７６は、Ｂ７ｓｃＦｖ抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号７７は、ＦＤ２抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号７８は、ＭＣＡ１抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号７９は、ＭＣＢ１１抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号８０は、Ｓ３Ｆ５抗ミオシンｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列である。
配列番号８１は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍＣ３１７Ｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号８２は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍ３）のアミノ酸配列である。
配列番号８３は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍ２３）のアミノ酸配列である。
配列番号８４は、ヒトアネキシンＶの非結合性変異体（ＡｎｘＶｍ１２３４）のアミノ酸配列である。
配列番号８５は、ラクトアドヘリンの変異体のアミノ酸配列である。
配列番号８６は、ラクトアドヘリンの変異体のアミノ酸配列である。
配列番号８７は、アルファ接合因子のアミノ酸配列である。
配列番号８８は、ａｐｐ８リーダーポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８９は、ａｇａ２シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９０は、ＳＵＣ２シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９１は、合成シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９２は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
配列番号９３は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
配列番号９４は、ヘキサヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
配列番号９５から１０４、および配列番号１８２から１８４は、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列に対応する。
配列番号１０５は、プロリン−、アラニン−および／またはセリン−豊富な配列のアミノ酸配列である。
配列番号１０６は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１０７は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１０８は、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１０９は、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１１０は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１１１は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１１２は、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１１３は、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１１４は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１１５は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１１６は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１１７は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１１８は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１１９は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１２０は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１２１は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１２２は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１２３は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１２４は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１２５は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１２６は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１２７は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１２８は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１２９は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１３０は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１３１は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１３２は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１３３は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１３４は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１３５は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１３６は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１３７は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１３８は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１３９は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１４０は、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４１は、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１４２は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４３は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１４４は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４５は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１４６は、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４７は、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１４８は、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４９は、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１５０は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１５１は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１５２は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１５３は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１５４は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１５５は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１５６は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１５７は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１５８は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１５９は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１６０は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１６１は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１６２は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１６３は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１６４は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１６５は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１６６は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１６７は、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１６８は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１６９は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１７０は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１７１は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１７２は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１７３は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１７４は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１７５は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１７６は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１７７は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１７８は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１７９は、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１８０は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１８１は、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１８５は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＤＡｓｃＦｖ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１８６は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＤＡｓｃＦｖ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号１８７−１９０は、ヒトＦＧＦ２（配列番号：３８）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号１９１−１９４は、ＨＧＦアルファ鎖Ｎ−Ｋ１ドメイン（配列番号：６、配列番号：３２）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号１９５−１９７は、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号３）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号１９８は、ヒトＮＲＧ１アルファ、全配列（配列番号４０）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号１９９は、ヒトＮＲＧ１アルファ、ＥＧＦ様ドメイン（配列番号３９）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２００−２０２は、ヒトＮＲＧ１ベータＥＧＦ様ドメイン（配列番号５６）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０３は、ヒトペリオスチンの領域（配列番号５８）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０４は、ヒト骨形成タンパク質−２（配列番号５９）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０５は、一本鎖ヒト骨形成タンパク質−２（配列番号６０）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０６は、ヒトＶＥＧＦアルファ単量体（配列番号３６）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０７は、ヒトＶＥＧＦアルファ二量体（配列番号３７）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２０８−２０９は、血管内皮増殖因子Ｂ（配列番号６１）に対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２１０−２１１は、ヒト血管内皮増殖因子Ｂに対応する増殖因子ポリペプチドの核酸配列である。
配列番号２１２−２１４は、Ｃ３４ＳおよびＮ５０３Ｑ置換を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）リンカー（配列番号１０）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２１５は、改質ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩ（配列番号６７）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２１６は、改質ＡＦＰ（配列番号６９）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２１７は、アルブミン結合ドメインヒト抗体（配列番号７０）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２１８は、ｓｃＦｃと名づけられた、単量体の異型Ｆｃ（配列番号７１）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２１９は、改質ビタミンＤ結合タンパク質、ｍＶＤＢＰ（配列番号６６）に対応する半減期モジュレータの核酸配列である。
配列番号２２０−２２１は、抗ＤＮＡｓｃＦｖ抗体（配列番号７３）に対応する核酸配列である。
配列番号２２２は、抗ＤＮＡｓｃＦｖ ＳＩ−１（配列番号１）に対応する核酸配列である。
配列番号２２３は、Ｂ７ｓｃＦｖ抗ミオシンｓｃＦｖ抗体（配列番号７６）に対応する核酸配列である。
配列番号２２４は、抗ホスファチジルセリンｓｃＦｖ ＰＳ４Ａ７（配列番号３０）に対応する核酸配列である。
配列番号２２５−２２７は、ヒトアネキシンＶ（配列番号３１）に対応する核酸配列である。
配列番号２２８は、ヒトアネキシンＶの変異体（Ｃ３１７Ｓ、配列番号８１）に対応する核酸配列である。
配列番号２２９−２３０は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍ３、配列番号８２）に対応する核酸配列である。
配列番号２３１−２３２は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍ２３、配列番号８３）に対応する核酸配列である。
配列番号２３３−２３４は、ヒトアネキシンＶの変異体（ＡｎｘＶｍ１２３４、配列番号８４）に対応する核酸配列である。
配列番号２３５は、シナプトタグミンＩ（配列番号７２）に対応する核酸配列である。
配列番号２３６−２３７は、非結合性ｓｃＦｖ変異体（ＤＡｓｃＦｖ；配列番号７５）に対応する核酸配列である。
配列番号２３８は、リーダーポリペプチドに対応する核酸配列である。
配列番号２３９は、アルファ接合因子に対応する核酸配列である。
配列番号２４０は、ａｐｐ８リーダーポリペプチドに対応する核酸配列である。
配列番号２４１は、ａｇａ２シグナルペプチドに対応する核酸配列である。
配列番号２４２は、ＳＵＣ２シグナルペプチドに対応する核酸配列である。
配列番号２４３は、合成シグナルペプチドに対応する核酸配列である。
配列番号２４４は、アルファ因子シグナル配列に対応するアミノ酸配列である。配列番号２４５は、アルファ因子シグナル配列に対応する核酸配列である。
配列番号２４６は、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２４７は、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２４８は、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２４９は、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２５０は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２５１は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２５２は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２５３は、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２５４は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２５５は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２５６は、ＡｎｘＶｍ２３＿ｍＨＳＡ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２５７は、ＡｎｘＶｍ２３＿ｍＨＳＡ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２５８は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２５９は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２６０は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２６１は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２６２は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２６３は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２６４は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２６５は、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２６６は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２６７は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２６８は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ２３融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２６９は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ２３融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２７０は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２７１は、ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２７２は、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２７３は、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２７４は、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２７５は、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
配列番号２７６は、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２７７は、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の核酸配列である。
図１は、精製ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（１３６）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（１３８）、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（１４２）およびＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
図２は、アポトーシスを起こした心臓細胞における陽性対照の、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加えるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出のフローサイトメトリーである。
図３は、図２に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図４は、アポトーシスを起こした心臓細胞における、ヨウ化プロピジウムを加えるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶのフローサイトメトリーである。
図５は、図４に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図６は、アポトーシスを起こした心臓細胞における、ヨウ化プロピジウムを加えるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４のフローサイトメトリーである。
図７は、図６に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図８は、アポトーシスを起こした心臓細胞における陽性対照の、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加えるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出のフローサイトメトリーである。
図９は、図８に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図１０は、ＩＧＦ１での予備遮断（ｐｒｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）なしの、アポトーシスを起こした心臓細胞における、ヨウ化プロピジウムを加えるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶのフローサイトメトリーである。
図１１は、図１０に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図１２は、ＩＧＦ１での予備遮断（ｐｒｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）なしの、アポトーシスを起こした心臓細胞における、ヨウ化プロピジウムを加えるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４のフローサイトメトリーである。
図１３は、図１２に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図１４は、８００ｎＭのＩＧＦ１で１０分間の予備遮断を行う、アポトーシスを起こした心臓細胞における、ヨウ化プロピジウムを加えるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶのフローサイトメトリーである。
図１５は、図１４に示されたＦＩＴＣおよびＰＩチャネルのフローサイトメトリーヒストグラムである。
図１６は、ＥＳＣ由来心臓細胞がドキソルビシン処理の有無に関わらずアポトーシスを起こした集団を示すことを示すグラフである。Ａｎｎ−ＨＳＡ＝ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ。Ｍ１２３４−Ａｎｎ−ＨＳＡ＝ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ。
図１７は、アポトーシスを起こしたＥＳＣ由来心臓細胞への、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡではなく、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡの特異的結合性を示すフローサイトメトリーである。 図１７は、アポトーシスを起こしたＥＳＣ由来心臓細胞への、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡではなく、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡの特異的結合性を示すフローサイトメトリーである。
図１８は、アポトーシスを起こしたＥＳＣ由来心臓細胞への、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）の特異的結合性を示すフローサイトメトリーである。 図１８は、アポトーシスを起こしたＥＳＣ由来心臓細胞への、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）の特異的結合性を示すフローサイトメトリーである。
図１９は、ホスファチジルセリンへの、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの特異的結合性を示すグラフである。
図２０は、ＤＮＡへの、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１の特異的結合性を示すグラフである。
図２１は、ＤＵ１４５細胞における、融合タンパク質ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、および陽性対照ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）によるｐＡｋｔの刺激を示すグラフである。
図２２は、ＤＵ１４５細胞における、融合タンパク質ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、および陽性対照ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）によるｐＡｋｔの刺激を示すグラフである。
図２３は、ＤＵ１４５細胞における、融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４および陽性対照ＩＧＦ１によるｐＡｋｔの刺激を示すグラフである。
図２４は、ＤＵ１４５細胞における、融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ、および陽性対照ＩＧＦ１によるｐＡｋｔの刺激を示すグラフである。
図２５は、心臓細胞における、ＩＧＦ１、およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶによるｐＡｋｔの用量反応刺激を示すグラフである。
図２６は、ＥＳＣ由来心筋細胞における、ＦＧＦ２およびＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２によるｐＥｒｋの刺激を示すグラフである。
図２７は、アポトーシスを起こしたＨＬ−１細胞と予備混合したタンパク質（黒い棒）、および未処理のＨＬ−１細胞と予備混合したタンパク質（灰色の棒）によって誘導されたｐＡｋｔレベルを示すグラフである。
図２８は、ＥＬＩＳＡ測定のための１群あたり２個の心臓を調製するための心臓の切開を示す。右上の差し込みは切片Ｂ１の断面図を示す。切片Ａおよび切片Ｂ１遠隔部（ｒｅｍｏｔｅ）の大部分が健康な組織を含む一方で、切片Ｂ１−梗塞部（ｉｎｆａｒｃｔ）およびＢ２は梗塞のほとんどすべておよびその近傍の境界領域を含む。ＬＶ：左室。
図２９は、投与後３回での心臓におけるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶおよび非結合性ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４融合タンパク質の測定を示すグラフである。黒い棒は梗塞および境界領域で見られたタンパク質の濃度を示し、灰色の棒は非梗塞領域で見られたタンパク質の濃度を示す。１群あたり２個のマウスが示される。群２は標的化タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶを投与されたマウスに対応し、群３は非結合性変異体ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４を投与されたマウスに対応する。
図３０はマウスがＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶで処理された２４時間後の免疫組織化学的染色した心臓部の代表的な顕微鏡写真である。
図３１は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４で処理されたマウスからの梗塞した組織および境界領域を示す心臓の切片を免疫組織化学的染色した代表的な顕微鏡写真である。時点は投与後２４時間であった。
図３２は、マウス実験において用いられる第一の抗ＨＳＡ抗体による、ＨＳＡ含有タンパク質またはＨＳＡ生成組織の染色特異性を示すために用いられる、対照の顕微鏡写真である。
発明の詳細な説明
本発明の態様は、２個の結合ドメイン、特定の標的分子または標的細胞に結合特異性を有する標的化ドメインおよび組織再生を調節する受容体に結合特異性を有する活性化ドメインを含む二重特異的融合タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態において、活性化ドメインが細胞を活性化する役割を果たす間、標的化ドメインは二重特異的融合タンパク質の標的を標的細胞または組織に絞る役割を果たし、その結果、標的組織の再生を促進する。本明細書で用いられる「二重特異的タンパク質」は２個以上の特定の分子に特異的に結合する能力を有する融合タンパク質をいう。
いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は（１）組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている；および（２）組織の細胞の増殖因子受容体またはサイトカイン受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが増殖因子受容体またはサイトカイン受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが増殖因子受容体またはサイトカイン受容体に結合する、を含む。
いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は（１）組織の損傷細胞に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメインであって、該分子は生存細胞の細胞内にあり、損傷細胞の細胞外空間に露出されている；（２）組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが膜関連分子にさらされると、組織の再生または生存を調節するように活性化ドメインが膜関連分子に結合する、および（３）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は：（１）虚血関連分子に結合する標的化ポリペプチドドメイン；および（２）組織再生または生存を調節するような増殖因子ポリペプチドまたはサイトカインポリペプチドなどの活性化ドメイン、を含む。
いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は（１）組織に関する標的分子に結合特異性を有する標的化ドメイン；（２）組織の細胞表面に関する分子に結合特異性を有する結合ドメイン（例えば、活性化ドメイン）であって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生または生存を促進するように結合ドメインが該分子に結合する、および（３）二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む。
ある実施形態において、二重特異的融合タンパク質は半減期モジュレータ（ＨＬＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＭはポリペプチドである。ＨＬＭは２個の末端、Ｎ末端およびＣ末端を有することができ、一方の末端において、標的化ポリペプチドドメインとペプチド結合を経て連結され、他方の末端において活性化ドメインとペプチド結合を経て連結される。他の実施形態において、半減期モジュレータは一方の末端（Ｎ末端またはＣ末端）にて活性化ドメインまたは標的化ドメインと連結される。従って、半減期モジュレータは二重特異性融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端にあることができる。半減期モジュレータは標的化ドメインまたは活性化ドメインとペプチド結合を経て連結され得る。
本発明の他の態様は、（１）組織に関する少なくとも１個の標的分子に結合特異性を有する少なくとも１個の標的化ドメイン；（２）組織の細胞表面に関する少なくとも１個の分子に結合特異性を有する少なくとも１個の（活性化ドメインなどの）結合ドメインであって、該結合ドメインが該分子にさらされると、組織の再生を促進するように該結合ドメインが該分子に結合する；および（３）任意に、二重特異的融合タンパク質の半減期を調節する、半減期モジュレータ、を含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は２個以上の標的化ドメイン、各々の標的化ドメインは組織に関する標的分子に結合親和性を有する、を含み得る。各々の標的化ドメインは、同じ結合特異性（例えば、同じ標的分子への結合特異性）、または異なる結合特異性（例えば、異なる標的分子への結合特異性）を有し得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は２個以上の活性化ドメインを含む。各々の活性化ドメインは、同じ結合特異性（例えば、細胞上の同じ受容体への結合特異性）、または異なる結合特異性（例えば、細胞上の異なる受容体への結合特異性）を有し得る。
当業者は、そのような二重特異的融合タンパク質が組織再生で使われることができるのを理解するであろう。いくつかの実施形態において、組織または臓器障害に続いて、または組織の細胞が損傷され得る事象に続いて、損傷細胞において二重特異的融合タンパク質を使用できる。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は１個以上の増殖因子および／またはサイトカイン（例えば、ケモカイン）および／またはインテグリンを発現する細胞を活性化できる。他の実施形態において、例えば損傷、または組織の細胞が損傷され得る事象かまたは機能不全になり得る事象（例えば、糖尿病におけるベータ細胞機能障害）に続いて、１個以上の増殖因子および／またはサイトカイン（例えば、ケモカイン）受容体および／またはインテグリンを組織に発現する細胞（例えば、幹細胞、先祖細胞または免疫細胞）を供給するために、二重特異的融合タンパク質が使われることができる。さらにまた、ｉｎ ｖｉｖｏで、そのような二重特異的融合タンパク質の投与は、損傷組織または損傷器官の修復または再生を容易にするために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された二重特異的タンパク質は、組織生存の調節において使われることができる。例えば、二重特異的タンパク質は、細胞の生存力を高めるか、または維持できる。いくつかの実施形態において、二重特異的融合タンパク質は生存促進経路または細胞生存経路を活性化できる。いくつかの実施形態において、二重特異性タンパク質はアポトーシスを調節できる。
いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は（ａ）標的化ポリペプチドドメインであって、該標的化ドメインが標的分子に結合し、その結果組織の第一の細胞に二重特異的融合タンパク質を標的化する、および（ｂ）受容体に結合特異性を有する活性化ドメイン、を有することができる。活性化ドメインが受容体にさらされると、活性化ドメインは細胞動員、アポトーシスの抑制、細胞増殖の誘導、生存促進経路の活性化、再生、組織の生存を促進するように第二の細胞の受容体を活性化できる。当業者は、二重特異的融合タンパク質が最初の細胞集団に結合し、同じ細胞集団（例えば、自己分泌方法）上、または、異なった細胞集団（例えば、傍分泌方法）上で働くことができるのを理解するであろう。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは損傷している第一の細胞集団に関する標的分子に特異的に結合し、活性剤ドメインは生存細胞の第二の細胞集団の受容体に結合する。さらにまたいくつかの実施形態において、標的化ドメインは第一の細胞集団の表面にて組織特異的標的分子に特異的に結合し、活性剤ドメインは第二の細胞集団に特異的に働く。第一の細胞は、生存細胞、または「リスク」細胞であり得る。本明細書で使用される「リスク」細胞はまだアポトーシスを受けていないか、または損傷していないが、損傷するリスクにさらされている生存細胞のことをいう。
いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は、組織または器官の異なる細胞上で異なる分子に結合する、２個の異なる（標的化ドメインおよび活性剤ドメインなどの）結合ドメインを持有する。さらに、他の実施形態において、二重特異的タンパク質は、組織の同じ標的細胞上で異なる分子に結合する２個の異なる結合ドメインを有し、標的化ドメインは標的細胞に特異的に結合するように選択され、活性化ドメインは組織再生を促進するように選択される。
本明細書で使用される「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結びつけられた複数のアミノ酸残基からなる分子をいう。本用語はそのように結びつけられたアミノ酸残基の数に関して全く意味を有さない。
本明細書で使用される「二重特異的」なる用語は、融合タンパク質の、２個の異なるリガンド：（標的化ポリペプチドドメインにより結合した）標的分子および活性化ドメインの受容体、と相互作用する能力をいう。標的化ポリペプチドドメインおよび活性化ドメインの結合特性について、以下でさらに詳細に議論する。
本明細書で使用される「標的分子」なる用語は、組織（例えば、罹患しているまたは損傷している組織）に関するあらゆる分子をいう。「標的細胞」は二重特異的タンパク質またはその標的化ドメインが特異的に結合できる細胞を意味する。好ましい標的分子は、標的細胞の外部で露出されるか、または増える。いくつかの実施形態において、標的分子は損傷細胞に関し、標的分子は生存細胞または損傷細胞の細胞内部に存在し、かつ損傷細胞の細胞外空間に露出される。そのような分子は、例えば壊死（ＤＮＡなど）またはアポトーシス（例えば、ホスファチジルセリン）を受ける細胞で露出される分子、ミオシン（その組織型特異的サブタイプを含む）、ＩＣＡＭ−１またはＰ−セレクチンを含む。さらに他の実施形態において、標的分子は、正常または機能的な細胞または組織で検出されるレベルと比べて、罹患したまたは機能不全の細胞または組織の表面で存在するかまたは増やされた分子である。
細胞は脂質二重層を含む原形質膜（または細胞膜）によって境界される。細胞膜はサイトゾル（細胞の内側または細胞質側）に面する表面および細胞外空間または細胞外部に面する表面を有すると考えられ得る。アポトーシスの間、陰イオンリン脂質の内側から原形質膜の外葉までの二層間の運動が起こる。アネキシンＶ、シナプトタグミンＩまたはラクトアドヘリンなどのリン脂質結合タンパク質は、細胞膜外葉のホスファチジルセリンの存在を検出するために使用される。ホスファチジルセリンは、通常、生存細胞または非損傷細胞では細胞質側に制限され、アポトーシスにおいて細胞表面外側または細胞外空間に露出されるようになる、リン脂質である。ホスファチジルセリンは、ｉｎ ｖｉｖｏの画像解析においてマーカーとして使用された（表２を参照）。
いくつかの実施形態において、標的分子は「虚血関連分子」である。「虚血関連分子」は、虚血または酸欠の後に、有意に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高い）で検出されるあらゆる分子である。本明細書で提供されるものを含む、いかなる好適な結合アッセイも、虚血関連分子を特定するために使用され得る。検出される増加するレベルの分子は、上方調節または減少した代謝の結果によるものであり得、または増加する接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）（例えば、細胞損傷からもたらされる）のためであり得る。ある実施形態において、虚血関連分子が虚血後組織の細胞において、虚血事象を受けていない同じ組織の細胞に比べて有意に高いレベル（例えば、少なくとも２倍高い）で検出される（すなわち、分子は、虚血後組織で特有かまたは増やされる。更なる実施形態において、虚血関連分子は細胞損傷に関連する（すなわち、分子は同じ型の非損傷細胞より損傷細胞において有意に高いレベルで検出される）。ある虚血関連分子は、虚血事象の後（または心臓の虚血を再現するために使用されるモデル系において）、心臓で増やされる（２倍またはより高い)。そのような分子は、例えば、壊死（ＤＮＡなどの）またはアポトーシスを受ける筋細胞または他の心臓細胞で露出される分子、コラーゲン（コラーゲンＩ、ＩＩＩ）、ミオシン（その組織型特異的サブタイプを含む）または虚血後心臓で増やされる他の細胞外基質タンパク質などの傷ついた心臓組織で増やされる分子を含む。そのような分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血再かん流またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの模擬虚血再かん流に続く、または酸欠、ＡＴＰ減少、増加する活性酸素種（ＲＯＳ）、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）生産、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞の血清飢餓などの状態への暴露に続く、増加を基に特定できる。
標的化ポリペプチドドメイン
組織に関する標的分子（例えば、虚血関連分子）への結合は、標的化ポリペプチドドメインによって仲介される。このドメインは、この機能を果たすいかなるポリペプチド配列であってもよい。好ましくは、標的分子への標的化ドメインの結合は、生物活性を有さない。本明細書で用いられる、「生物活性」は、融合タンパク質のドメインへの分子の露出により実施される既知の活性として定義されたものをいう。
いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、標的分子、その断片またはその変異体に結合親和性を有する非抗体の自然発生のポリペプチドである。さらに、他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは１個以上の抗体可変領域を含む。当業者は、直接または間接的に標的分子に結合できるいかなる標的化ドメインも検討されることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、標的化ドメインは、アネキシンＶ（配列番号：３１）、その断片、またはその変異体(配列番号：８１−８３）である。アネキシンＶはホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合する。いくつかの実施形態において、アネキシンＶは、二量体構成を減少させるために、システイン３１６をセリンまたはアラニンで置換するように改質される。いくつかの実施形態において、アネキシンＶは、ホスファチジルセリン結合親和性を維持している間、アネキシンＶの内在化を減少させるように改質される。いくつかの実施形態において、アネキシンＶの１個以上の残基が、標的分子への結合の、より好適なオンレート、または標的分子への結合の、より好適なオフレート、を達成するように結合性を改質するために改変され得る。いくつかの実施形態においてＤ１４４がＮに置換され、かつ／またはＥ２２８がＡに置換されたアネキシンＶの変異体を使用できる（Ｍｉｒａ， １９９７； Ｋｅｎｉｓ， ２００４； Ｋｅｎｉｓ ２０１０およびＵｎｇｔｈｕｍ，２０１０を参照)。
他の実施形態において、標的化ドメインは、シナプトタグミンＩ、その断片、またはその変異体である。シナプトタグミンＩ（ＳｙｔＩ）は約５〜４０ｎＭの結合親和性でＣａ（２＋）依存の方法でホスファチジルセリンと結合することが示された。いくつかの実施形態において、標的化ドメインとして、シナプトタグミン（例えば、Ｃ２Ｂ）の２個のＣ２ドメインの１個を使用できる。いくつかの実施形態において、標的化ドメインはシグナル伝達または膜輸送（例えば、プロテインキナーゼＣ、血液凝固因子Ｖ、およびＶＩＩＩ）に関与するＣａ２＋依存膜標的化タンパク質のＣ２ドメインである。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号：７２において記載される配列を有する。乳脂肪球−ＥＧＦ８としても知られるラクトアドヘリンは、マクロファージによって分泌される４５ｋＤａのホスファチジルセリン結合性糖蛋白質である。ラクトアドヘリンはアミノ末端にＥＧＦ様ドメイン、およびカルボキシ末端に２個のＣ−ドメインを含む。従って、いくつかの実施形態において、標的化ドメインはラクトアドヘリン、その断片またはその変異体のＣ−ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ２ドメインの１個以上の残基が、標的分子への結合の、より好適なオンレート、または標的分子への結合の、より好適なオフレート、を達成するように結合性を改質するために改変され得る。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは配列番号：８５または８６において記載される配列を有する。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドドメインはＴ細胞免疫グロブリンムチン１および４（ＴＩＭタンパク質）を含む。他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは血漿２糖蛋白質１を通して間接的にホスファチジルセリンと結合できる３Ｇ４抗体または抗体ドメインを含む。さらに、他の実施形態において、標的化ポリペプチドドメインはホスファチジルセリンと結合できる抗ホスファチジルセリン抗体（例えば、ＰＳ４Ａ７、配列番号３０）または抗体ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは標的分子に結合するポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの代表的なものは、本明細書で配列番号３１、７２、８１−８３または８５−８６として提供される配列を含むかまたは有する。そのようなポリペプチド核酸配列の代表的なものは、本明細書で配列番号２２５−２３２または２３５として提供される配列を含むかまたは有する。
標的化ドメインとして天然ポリペプチドを使用できる。しかしながら、そのような天然配列の部分および改変された配列を有するポリペプチドを、そのようなポリペプチドが以下により詳細に記載されるように、適切な結合親和性（Ｋｄ）で標的分子と結合する能力を有する限り、使用でき得ることは明らかであろう。
本発明で用いられる、「抗体」は、免疫グロブリンの遺伝子によって実質的にコードされた１個以上のポリペプチドからなるタンパク質である。典型的な抗体は、２個の相同な対のポリペプチド鎖から構成される四量体であり、各々の対は１個の「軽」（約２５ｋＤ）、および１個の「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。「ＶＬ」および「ＶＨ」はそれぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。「抗体可変領域」は、主として抗原認識に関与するアミノ酸残基を含む抗体の可変鎖（ＶＬまたはＶＨ）のＮ−末端領域である。当業者は容易に、抗体可変領域を特定し、抗原認識をもたらすために必要な最小サイズを決定することができる。通常、抗体可変領域は少なくとも７０個のアミノ酸残基、および、より一般的に少なくとも１００個のアミノ酸残基を含む。抗体可変領域を含むポリペプチドは、さらに他の軽鎖、および／または重鎖系列を含み得、さらに抗体由来ではない配列を（必要ではないが）含み得る。抗体可変領域の配列は自然に発生し得るか、または、機能（抗原認識）が維持される限り、標準技術を用いて改質され得ることは、明らかであろう。抗体可変領域を含むあるポリペプチドは、一本鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、可変重鎖領域および可変軽鎖領域が連続したポリペプチドを形成するように（直接またはペプチドリンカーを通して）結合している一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体は、化学的に合成され得るか、または直接あるいはペプチドコードリンカーにより連結されたＶＨ−およびＶＬ−コード配列を含む核酸から発現され得る。
「結合」または「特異的結合」は本明細書において相互に用いられ、二重特異的タンパク質が特定の分子（例えば、標的化ドメインが標的分子に実質的な親和性を示すか、または活性化ドメインが受容体などの細胞表面に関する分子に実質的な親和性を示す）または、分子に接している細胞または組織に実質的な親和性を示すことを示し、融合タンパク質（または、その標的化ポリペプチドドメインまたはその活性化ドメイン)が特定の分子に実質的な親和性を有する場合に起こるといわれており、他の分子と有意な交差反応性を示さないものは選択的である。好ましい実質的な結合は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍまたはそれより良い解離定数（Ｋｄ）での結合を含む。例えば、抗体抗原相互作用のＫｄは５０％の抗体と抗原分子が熱力学平衡で共に結合する抗体の濃度（モル濃度として表現される)を示す。したがって、適当な固定抗原濃度のときに、５０％の高い（すなわち、強い）親和性抗体が、より低い親和性の抗体が同じパーセントでの結合を達成するために必要であろうものよりも低い抗体濃度にて、抗原分子と結合するであろう。Ｋｄはまた、オンおよびオフレート（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）の動的な比であり；すなわち、Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎである。したがって、低いＫｄ値は、より高い（より強い）親和性を示す。本明細書で用いられる、「より良い」親和性は、より強い親和性であり、その比較対象よりも低い数値の解離定数によって特定される、すなわち、１０−１０ＭのＫｄは１０−９ＭのＫｄよりも低い数値であり、それゆえより良い親和性を示す。１０−７Ｍより良い（すなわち、より低いＫｄ値であり、それゆえより強い）親和性、好ましくは１０−８Ｍより良い親和性が一般に好ましい。本明細書で説明されたものの中間的な値も考慮され、好ましい結合親和性は解離定数の範囲として示すことができ、例えば、本明細書で開示される抗体の好ましい結合親和性は、１０−６から１０−１２Ｍ（すなわり、マイクロモルからピコモル）、好ましくは１０−７から１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８から１０−１２Ｍ、さらにより良い範囲のＫｄ値により示される。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、目標からはずれた抗原（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ）に結合しないであろうものである。例えば、一の実施形態において、心臓ミオシンに特異的および選択的に結合する抗体は、心臓ミオシン以外のミオシン分子または非ミオシンタンパク質またはペプチドよりも、心臓ミオシンに対して少なくとも２、好ましくは３、または４以上の桁の量のより良い親和性（すなわち、２、３、または４以上の桁の量のより低いＫｄ値を示す結合）を示すであろう。結合親和性および選択性は、そのような特性を決定するために当分野で認識されるいずれの方法を用いることで決定でき、それは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または競合結合アッセイの使用を含む。
当技術分野で周知の技術のいずれかを用いて、結合を評価およびＫｄ値を測定し得る。例えば、虚血関連ＤＮＡ分子への結合は、標的ＤＮＡ断片で適切な固相担体（例えば、ビーズ、ＥＬＩＳＡプレートまたはＢＩＡＣＯＲＥチップ）をコーティングすることによって、一般的に評価される。ＤＮＡのいかなる配列にも結合する標的化ポリペプチドドメインでは、１０塩基対以上の（一本鎖または二本鎖）のＤＮＡ断片は固体基質に固定化される。特定の配列またはＤＮＡ複合体（例えば、ＤＮＡヒストン複合体）に結合する標的化ポリペプチドでは、適切な対応する標的が固定化される。虚血関連分子を添加する前に、タンパク質の非特異的結合部位はＢＳＡ、乳、またはいかなる他の適切な遮断剤で遮断される。非コートウェルまたは非標的分子でコートされたウェルは特異性の対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の役割を果たす。二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）の増加する濃度は、標的でコートされた基質または対照基質で培養される。標的と結合しない融合タンパク質またはドメインはまた、特異性の対照として試験される。二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）の標的特異的、用量依存的結合は、使用される固相担体および結合技術に対応する標準プロトコルを用いる、増加用量の関数として、対照に対する標的への二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）結合の量を測定することにより評価される。そのようなプロトコルの代表的なものは、Ｗａｓｓａｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５１（２）：２４１−５３（２００６）；Ｅｐｕｂ ２００６ Ｆｅｂ １０ （ＢＩＯＣＯＲＥ）；およびＭｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． １２７（１）：２５−８（１９９０）（ＥＬＩＳＡ）を含む。加えて、固定化された標的分子の量を変える研究または競合としての可溶性標的分子の量の増加を含む研究が、結合および特異性を監視するために実施され得る。
標的分子への結合についての結合親和性および動的オンおよびオフレートは、標準的な技術を用いて測定され、他の陰性対照分子（例えば、無関係の標的化ポリペプチドまたは標的化ポリペプチドを欠く融合タンパク質または非結合性標的ポリペプチドをもつ融合タンパク質）および陽性対照分子（例えば、標的分子と結合する親抗体、または標的分子と結合することが知られている他の抗体または抗体断片）と比較される。例えば、非結合性標的化ポリペプチドは、非結合性アネキシンＶ変異体（配列番号：８４、核酸配列灰列番号２３３−２３４）、非結合性シナプトタグミン変異体（配列番号：７４）または非結合性ｓｃＦｖ（配列番号：７５；核酸配列配列番号２３６−２３７）であり得る。
ある実施形態において、Ｋｄは、バイオセンサー（例えば表面プラスモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）または共鳴ミラー分析（ｒｅｓｏｎａｎｔ ｍｉｒｒｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＡｓｙｓ）を用いて測定される。そのような測定は、Ｈｅｆｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ， ｉｎ ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， ｐｐ． ９９−１１６ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９６）、およびそれらに引用された文献に記載されるように実施し得る。簡潔には、動的オンおよびオフレート（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）が、虚血関連分子が組み合わせられたセンサーチップを使用して測定される。結合（Ｋｏｎ）を評価するために、結合が質量感知検出を用いて監視される間に、異なる濃度の二重特異性タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）溶液がチップを流れる。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いて、Ｋｏｎは、Ｒが観察されたシグナルであるところの、ｄＲ／ｄｔに対するＲのプロットの傾きである。結合に続いて、解離は、緩衝液をチップに流すことにより、測定され、Ｋｏｆｆは類似した方法で測定される。そして、Ｋｄは、以下の式を用いることで計算される:
Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ
本発明の文脈では、二重特異的融合タンパク質が、１０−８Ｍより低い、好ましくは１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍより低いＫｄで結合していれば、標的分子と結合している。また、このアッセイでの標的分子への二重特異的融合タンパク質の結合は陰性対照への二重特異的融合タンパク質の結合よりも、有意に高い（例えば、少なくとも２、１０、または１００倍高い）。好ましくは、固定化された標的への結合もまた、過剰の可溶性標的の使用に匹敵し得る。
上で述べたように、ある標的分子は損傷細胞に特異的（または、その中で増やされる）である。代表的な標的分子はホスファチジルセリン、ＤＮＡ、ミオシン、心臓ミオシン、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）、ホスファチジルセリン、Ｐ−セレクチン、およびＩＣＡＭ−１を含むが、これらに限られるものではない。損傷細胞への結合は、壊死またはアポトーシスを誘導された状態にさらされた培養細胞を用いることで、簡便にｉｎ ｖｉｖｏで示される。例えば壊死は、虚血／再かん流を刺激された培養心筋細胞で誘導され、本質的にはＳｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９４：８３３−８４１ （２００８）で説明されるように、アポトーシスを受けた細胞数の控除が後に続く、ＬＤＨ放出アッセイ、またはトリパンブルーアッセイを使用することで監視できる。このアッセイは、下記でより詳細に議論するように、総死細胞の数および、総数および壊死に起因するアポトーシスを起こした細胞の数の違いを定量化する。アポトーシスを誘導する状態は、Ｈ２Ｏ２への露出を含み、アポトーシスは、例えば、アネキシンＶ結合、アポトーシスによって活性化される既知のカスパーゼによる標的ペプチド配列の開裂、またはＤＮＡラダーリング（本質的にＫｕｒａｍｏｃｈｉ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（４９）： ５１１４１−４７（２００４）に記載されるような、ＴＵＮＥＬアッセイにより測定される）を含む、当分野で既知のさまざまな技術のいずれかを使用することで監視できる。壊死またはアポトーシスを受ける細胞への結合は、アポトーシスまたは壊死の誘導に続いて、細胞に蛍光標識された二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）または適切な対照タンパク質を加えることにより、評価し得る。数分から１日間の範囲の時間の細胞でのタンパク質の培養の後、細胞は洗浄され、次に、免疫蛍光、フローサイトメトリー、または同様の技術を使用して、細胞に結合した蛍光が測定される。あるいは、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）または、ＥＬＩＳＡ実施で一般的な習慣である、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）に結合する抗体と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）した酵素の使用または放射性同位元素標識法を含む、他の結合二重特異的タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）の検出方法が使用され得る。障害を被っていない細胞（例えば、アポトーシスおよび壊死を受けていない細胞）と比較して、虚血後の細胞（例えば、壊死またはアポトーシスを受けている細胞）へのより高い（例えば２倍より高い）結合が検出されれば、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）は標的細胞に結合している。
ｉｎ ｖｉｖｏ標的化は、例えば、動物モデルへの虚血の誘導、および虚血の前後の標的組織において投与された二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）のレベルを比較することによって、示され得る。損傷細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ標的化は、動物モデルにおける組織損傷の誘導、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）の投与、および損傷細胞と非損傷細胞における二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）のレベルの比較によって示され得る一の実施形態において、二重特異的融合タンパク質は、虚血再かん流傷害に続く、組織の損傷領域を標的化するよう設計される。このような場合には、ｉｎ ｖｉｖｏ標的化の実証は、好ましくは虚血に続く血液供給の回復を引き起こす方法で、組織損傷を誘導することにより、実施し得る。多数の方法が、異なった組織でこれを行うために利用可能である。例えば、簡単な止血帯でマウスの後肢への血流を一時的に妨げることができる。あるいは、腎臓に導く動脈上で一時的な鉗子を使うことができる。マウス、ラット、犬、およびブタに示されるように、冠動脈の一時的な遮断で心臓の虚血再かん流傷害を誘導できる。動物モデルにおける組織損傷を引き起こすための代表的な方法を表１にまとめる。
Figure 0006174763
虚血再かん流傷害のための動物モデルは以下の参照でさらに詳細である:
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ７． Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４４４：１５９−７４ （２００８）。
Ｃｈｉｍｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ： ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ９８：２１７−２６ （２００４）。
Ｂｌａｃｋ ＳＣ， Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４３（２）：１５３−６７ （２０００）。
標的化の特異性は、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）沈着の比較を、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ４（１２）： ３０３３−３９ （１９９０）に示されるように、固定された腎臓と固定されていない腎臓において、またはＺｂｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９２： Ｈ１８９１−Ｈ１８９７ （２００７）示されるように、放射性標識二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）を用いて、処理された後肢と未処理の後肢において、行うことにより照明できる。あるいは、二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）は、均質化された組織において、ＥＬＩＳＡを用いて検出できるか、または画像化に適切な金属（例えば、Ｔｃ９９、ＹまたはＧｄ）で標識した二重特異的融合タンパク質（または標的化ポリペプチドドメイン）を用いてリアルタイムで画像化できる。心臓の損傷領域での特異的な沈着は、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２（１３）：１５６４−８ （２０００）に記載されるように測定できる。タンパク質の損傷組織への標的化を実行するための代表的な方法は表２に示される。
Figure 0006174763
上述のとおり、ある標的化ポリペプチドドメインは、標的分子（例えば、ＤＮＡ、ミオシン（心臓ミオシン）はｃ−Ｍｅｔ、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１）に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、標的化ドメインは抗ミオシン抗体（例えば、ヒトの心臓ミオシンに対するＲ１１Ｄ−１０、心臓ミオシン重鎖に対する２Ｇ４−ｓＤ７、ヒトの心臓ミオシン重鎖に対する１Ｂ２および５Ｃ２、ヒトの心臓ミオシンに対する２Ｆ４、ミオシンに対するモノクロナール抗体、Ｂ７抗体、Ｂ７ ｓｃＦｖ、または当分野で既知の他の抗体）である。いくつかの実施形態において、ある標的化ポリペプチドドメインは、標的分子に結合するｓｃＦｖ抗体を含む。例えば、標的化ドメインは抗ＤＮＡ Ｓｌ−１ ｓｃＦｖ（ａＤＮＡＳｌ１、配列番号１または７３）、抗ＤＮＡ ＳＩ−２２ｓｃＦｖ（ａＤＮＡＳｌ２２、配列番号：２）であり得る。そのような抗体およびｓｃＦｖ抗体の代表的なものは、本明細書において提供される配列番号１、２、３０、７３および７６−８０の配列を含むかまたは有する。いくつかの実施形態において、そのような抗体およびｓｃＦｖ抗体核酸配列の代表的なものは、本明細書において提供される配列番号２２０−２２４の配列を含むかまたは有する。
またあるいは、機能的に関連する抗体も標的化ポリペプチドドメインとして使用され得ることが明らかであろう。抗体は主に６個の重および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に位置するアミノ酸残基を通して、標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲｓ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲｓの外側の配列に比べて、個々の抗体の間で多様性がある。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体抗原相互作用の原因となるので、異なる抗体からの枠組み配列と１個の抗体からのＣＤＲ系列を組み合わせることにより、元の抗体の特性を模倣するよう改質された抗体を生成することが可能である。そのような枠組み配列は、生殖系抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベースから得ることができる。
したがって、本明細書において提供される標的化ポリペプチドドメイン配列の１個以上のＣＤＲを、元の標的化ポリペプチドドメインの結合特性を保有する機能的に関連する抗体を作成するために使用できる。一の実施形態において、追加の、組み換え型に操作された標的化ポリペプチドドメインを作成するために、配列番号：１、２、３０、７３および７６−８０から選択される１個以上のＣＤＲ領域が、既知のヒトのフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に組合せられる。重および軽鎖可変枠組み領域はいくつかのまたは異なった抗体配列に由来することができる。ＣＤＲ領域は、ＶｂａｓｅやＩＭＧＴなどのデータベースにおける既知の配列との位置あわせを用いることで容易に同定される。得られる標的化ポリペプチドドメインは、配列番号：１、２、３０、７３および７６−８０の標的化ポリペプチドドメインと１個以上のＣＤＲを共有する。ある実施形態において、標的化ポリペプチドドメインは、配列番号：１、２、３０、７３および７６−８０に記載されるＣＤＲの１個以上を含む。
当分野において、抗体の重および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗原への抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことは周知である。従って、ある実施形態において、本明細書に記載される特定の抗体の重および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体が、生成される。抗体はさらに本明細書に記載される抗体の重および／または、軽鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２を含むことができる。
上述した改変抗体のＣＤＲ１、２および／または３領域は、本明細書において開示されるように、正確なアミノ酸配列を含むことができる。しかしながら、当業者は、特に、エピトープ特異性を改変せずにＣＤＲ３配列よりもより多くの変異を許容する、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２系列のために、正確なＣＤＲ配列からの何らかの逸脱（そのような逸脱は、例えば、保存アミノ酸配列の置換である）が可能であり得ることを理解するであろう。従って、他の実施形態において、改変抗体は、本明細書で指定された抗体の対応するＣＤＲと、例えば、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％同一の、１個以上のＣＤＲ１およびＣＤＲ２から構成され得る。
他の実施形態において、ＣＤＲの１個以上の残基が、結合のより好適なオンレート、または結合のより好適なオフレートを達成する結合を改質するために改変され得る。この戦略を用いて、はるかに高い結合親和力（例えば、Ｋｄ＝１０−１０以下）を有する抗体を得ることができる。ＣＤＲ領域を改変し、続いて得られた結合性分子を結合における所望の変化のために選別するために当分野で周知の親和性成熟の技術が使用できる従って、ＣＤＲが改変されるときに、結合性と低い免疫原生の最良の組合せに最適化された抗体を得るように、結合親和性の変化ならびに免疫原性を監視および記録できる。
これらの改質後の抗原結合親和性が実質的に減少しない限り、１個以上の、抗体の可変領域の重および／または軽鎖の結合領域（すなわち、非ＣＤＲ残基）または枠組み配列内で改質させることもできる。
活性化ドメイン
活性化ドメインは、細胞ネットワークの活性または１個の位置から他の位置までの細胞の動員を検出可能に調節するあらゆるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面にて受容体と結合することにより、信号変換経路を活性化することができる。いくつかの実施形態において、ある活性化ドメインは、増殖因子ポリペプチド、サイトカインポリペプチド（例えば、ケモカインポリペプチド）、またはあらゆる受容体アゴニストまたはインテグリン結合リガンドである。
そのような調節が、細胞増殖の誘導、細胞成長の誘導、細胞生存の促進および／または、アポトーシスの抑制などの細胞ネットワークの活動の増加か減少であり得ること、明らかであろう。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは他の因子または細胞（例えば、幹細胞）を動員できる。
増殖因子ポリペプチドは検出可能に増殖因子受容体（ＨＧＦまたはＩＧＦ受容体など）の活性化を調節する。そのようなポリペプチドのいくつかは、適切な標的細胞において対応する増殖因子受容体の活性化の測定により決定されるとして、少なくとも１０％の野生型生物活性を保有する、野生型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＨＧＦアルファ鎖（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｐ１４２１０）、またはその誘導体である。活性化は、例えば、本質的にはＮｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：７０１８−７０２３ （１９９８）に記載されるＡＫＴのような、受容体キナーゼまたは下流タンパク質のりん酸化の測定により評価され得る。当分野で既知のＭＴＴおよびＣＴＧアッセイもまた、使用され得る。
いくつかの実施形態において、活性化ドメインは増殖因子である。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは前述のまたは変異体のタンパク質を含む。代表的な活性化ドメインは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、基本的な線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られている）、線維芽細胞増殖因子２、１４６ａａ（ＦＧＦ２−１４６ａａ）、線維芽細胞増殖因子２、１５７ａａ（ＦＧＦ２−１５７ａａ）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、線線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞増殖因子−ＮＫ１ドメイン（ＨＧＦ−ＮＫ１）、肝細胞増殖因子−Ｋ１ドメイン（ＨＧＦ−Ｋ１）、肝細胞増殖因子−ＮＫ２ドメイン（ＨＧＦ−ＮＫ２）、肝細胞増殖因子Ｋ２ドメイン（ＨＧＦ−Ｋ２）、ニューレグリン（ＮＲＧ、ヘレグリン（ＨＲＧ）としても知られている）、ニューレグリン−１ベータ細胞外ドメイン（ＮＲＧ１ｂｅｔａ−ＥＣＤ）、ニューレグリン−１ベータＥＧＦ様ドメイン（ＮＲＧ１ｂｅｔａ−ＥＧＦ）、チモシン、チモシンベータ４（Ｔｂｅｔａ４）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）幹細胞因子（ＳＣＦ、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）としても知られている）、ペリオスチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子−Ａとしても知られている（ＶＥＧＦ−Ａ））、血管内皮増殖因子−Ａ−１２１（ＶＥＧＦ−Ａ−１２１）、血管内皮増殖因子−Ａ−１６５（ＶＥＧＦ−Ａ−１６５）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子−Ｂ−１６７（ＶＥＧＦ−Ｂ−１６７）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、間質細胞由来因子（ＳＤＦ）、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、間質細胞由来因子−１アルファ（ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来増殖因子−ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、テラトカルシノーマ由来増殖因子（ＴＤＧＦ）、テラトカルシノーマ由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ベータ−神経成長因子（ｂｅｔａ−ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−ｂｅｔａ１）、形質転換増殖因子−ベータ２（ＴＧＦ−ｂｅｔａ２）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、一本鎖ＢＭＰ−２（ｓｃＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質３（ＢＭＰ３）骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、ベータセルリン、ベータ−カテニン、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ＧＨ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、インスリン、インターロイキン（ＩＬ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１、ＣＣＬ２としても知られている）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）、Ｗｎｔ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ１１、または活性化受容体のための特異性を有する抗体、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限られるものではない。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、増殖因子か増殖因子ドメインの一本鎖を含むように設計される。例えば、活性化ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１０３）を経て共に結合する増殖因子ドメイン（例えば、ＢＭＰ−２）の２個以上のコピーを含めるように設計され得る。
代表的な増殖因子ポリペプチドは、本明細書において配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４で記載される配列を有する。代表的な増殖因子は、本明細書において配列番号：１８７−２１１で記載される核酸配列によってコードされ得る。
標的化ドメインのいくつかのＣＤＲのために上述したとおり、ポリペプチドドメイン、１個以上のドメインを共有する活性化ドメイン、モジュール、または活性化ドメインもしくは配列番号：３−９、３２−４０または５０−６４の変異体をもつアミノ酸配列が検討される。そのようなドメイン、モジュール、またはアミノ酸配列が特定され得、そのような活性化ドメインが、周知の技術を用いることで構成され得る。したがって、ある実施形態において、活性化ドメインは、少なくとも１個のドメイン、モジュール、アミノ酸配列または配列番号：３−９、３２−４０または５０−６４に記載される変異体を含む。同様に、サイトカインポリペプチドは、同じ方法を基に、対応するサイトカイン受容体の活性化を調節する。
ある実施形態において、活性化ドメインは、細胞表面で増殖因子と結合する、増殖因子ポリペプチドである。代表的なそのような増殖因子受容体は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ニューレグリン／ヘレグリン（ＮＲＧ／ＨＲＧ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、そのアイソフォーム（例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ）、テラトカルシノーマ由来増殖因子１（ＴＤＧＦ１）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、およびそのアイソフォーム、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）またはペリオスチンである。他のそのような受容体は、マスト／幹細胞増殖因子受容体（ＳＣＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦ受容体、すなわち、ｃ−Ｍｅｔ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、高親和性神経成長因子受容体、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体、ＮＴ−３増殖因子受容体、または血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−Ｉ）を含む。
代表的なサイトカイン受容体は、例えばＦＬサイトカイン受容体、サイトカイン受容体共通ガンマ鎖のための受容体、インターロイキン−１０受容体アルファ鎖、インターロイキン−１０受容体ベータ鎖、インターロイキン−１２受容体ベータ−１鎖、インターロイキン−１２受容体ベータ−２鎖、インターロイキン−１３受容体アルファ−１鎖、インターロイキン−１３受容体アルファ−２鎖、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１７Ｂ受容体、インターロイキン２１受容体前駆体、インターロイキン−１受容体Ｉ型、インターロイキン−１受容体ＩＩ型、インターロイキン−２受容体アルファ鎖、インターロイキン−２受容体ベータ鎖、インターロイキン−３受容体アルファ鎖、インターロイキン−４受容体アルファ鎖、インターロイキン−５受容体アルファ鎖、インターロイキン−６受容体アルファ鎖、インターロイキン−６受容体ベータ鎖、インターロイキン−７受容体アルファ鎖、高親和性インターロイキン−８受容体Ａ、高親和性インターロイキン−８受容体Ｂ、インターロイキン−９受容体、インターロイキン−１８受容体１、インターロイキン−１受容体様１前駆体、インターロイキン−１受容体様２、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体５、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体１、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体３型、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体５型、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体６型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体１型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体２型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体３型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体４型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体６型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体７型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体８型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体９型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体１０型、Ｃ−Ｃケモカイン受容体１１型、ケモカイン受容体様２、およびケモカインＸＣ受容体を含む。さらに、他の活性化ドメインは溶質キャリヤー有機アニオン輸送体ファミリーのための受容体、メンバー１Ａ２（ＳＬＣＯ１Ａ２）、スフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）オステオポンチン（ＯＰＮ）とも呼ばれる、腫瘍タンパク質５３（ＴＰ５３）、トロポニンＴ１型（ＴＮＮＴ１）、ＴＳＰＹ様タンパク質２（ＴＳＰＹＬ２）、ビスファチン、ＷＡＰ４二硫化中核ドメイン１（ＷＦＤＣ１）、チモシンベータ４、無羽型（ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ）ＭＭＴＶ結合部位ファミリー、メンバー１１（ＷＮＴ１１）である。代表的な活性化ドメインは、例えばレジスチン、間質性細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、シグナル誘導性増殖関連遺伝子１（ＳＩＰＡ１）、および上述された他のリガンドのいずれか、ならびに実質的に同族の受容体に結合する能力を保有する上述の部分や誘導体、を含む。
インテグリンは、他の細胞またはそれを囲む組織への細胞接着を仲介する受容体である。ンテグリンは細胞表面と、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどの細胞外基質成分を結合する。代表的なインテグリンは、例えば、α１β１、α２β１、α４β１、α５β１、α６β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、α６β４、を含む。
初期の試験として、適切な受容体への二重特異的融合タンパク質（または、その活性剤ドメイン）の結合は、当分野で既知の技術を用いることで評価され得る。１個の代表的なアッセイでは、適切な受容体の組換え型の細胞外ドメインで適切な固相担体をコーティングすることにより、結合が示される。二重特異的融合タンパク質の活性化ドメインによって認識されない受容体からの細胞外ドメインは、特異的対照として用いられる。また、いかなる固定された受容体も有しない支持基質は、参照として用いられる。虚血関連分子への結合のための上記と同様の方法は、使用される固相担体および結合技術に対応する標準プロトコルを用いて、受容体への特異的、用量依存的結合について実行される。また、受容体の量を変化させるか、または競合としての可溶性標的のレベルを増やすことを含む研究が、結合性および特異性を監視するために実行される。あるいは、二重特異的融合タンパク質は支持体に固定化され、対応する受容体の可溶性の細胞外ドメインの結合は、用量依存性、特異的結合性を示すために用いられる。
二重特異的融合タンパク質の受容体への結合のための結合親和力および動的オンおよびオフレートは標準技術を用いて測定され、他の陰性対照分子（対照活性化ドメインと無関係の融合タンパク質、活性剤ドメインを欠いている融合タンパク質)および陽性対照分子（増殖因子またはサイトカインなどの、組換え型の野生型受容体リガンド）と比較される。二重特異的融合タンパク質の平衡および動的結合パラメータはまた、リガンドの他の分子との融合が、リガンドのその対応する受容体との通常の結合に影響するかどうか測定するために、非融合の野生型リガンドで測定した同じパラメータと比較される。そのような情報は、二重特異的融合タンパク質の有効量を決定するために使用され得る。
二重特異的融合タンパク質は陰性対照で観察されたそれよりも有意に高い親和性（例えば、少なくとも１００倍）で固定化された増殖因子受容体、またはサイトカイン受容体に結合する。さらに、固定化された受容体への結合は、過剰の可溶性ポリペプチド、可溶性受容体、またはポリペプチドもしくは受容体に結合し、それらの相互作用を遮断する抗体を使用することで競合できる。好ましくは、二重特異的融合タンパク質は、天然のリガンドのその受容体への結合性の１０００倍以内の親和性で、受容体またはサイトカインと結合する。
二重特異的融合タンパク質（または活性化ドメイン）は、同族の受容体活性化を調節する能力をさらに有する。そのような活性は、例えば、新生子ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）または細胞株などの培養心筋細胞を使用する、虚血再かん流の細胞モデルを使用して評価され得る。一般に、模擬的な虚血（ＳＩ）は代謝阻害剤（デオキシグルコースおよびジチオン酸塩）および代謝物質（高カリウム、乳酸、低ｐＨ）または嫌気性チャンバーでの酸欠によって引き起こされる。再かん流は、酸素処理された緩衝液中の再懸濁によって模倣される。いかなる外因性の代謝阻害剤または代謝物質がない場合、虚血―酸欠および代謝物質蓄積の２個の第一の構成要素を提供する、虚血のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成人心筋細胞ペレットモデルが、開発された。表３は、二重特異的融合タンパク質が心筋細胞の損害を防いで、心臓幹細胞の成長、運動性または分化を促進する、および／または損傷組織の修復を促進する能力を示すための代表的な方法を示す。
Figure 0006174763
天然の増殖因子およびサイトカインは活性化ドメインとして使用できる。しかしながら、そのような天然配列の部分および改変された配列を有するポリペプチドを、そのようなポリペプチドが同族の受容体（例えば、以下で議論するアッセイの一つを使用する）を活性化する能力を保有し、そのようなポリペプチドが検出可能に受容体を、好ましくは天然のリガンドで観察されるものの少なくとも１％（好ましくは、少なくとも１０％）程度受容体を活性化する条件で、使用でき得ることは明らかであろう。増殖因子受容体と結合するいくつかの活性化ドメインは、本明細書において配列番号：３−９、３２−４０、および５０−６４にて提供される。そのような配列を含む融合タンパク質の活性は当分野において周知である（例えば、Ｈａｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１９（４）：６０４−６０９ （１９９６）； Ｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：７０１８−２３ （１９９８））。
特定用途のための活性化ドメインは所望の治療結果に基づいて選択され得る。一般に、例えばＦＧＦ２、ＶＥＧＦアルファまたはその部分または誘導体を含み、同族の受容体に結合する能力を実質的に保有する活性剤ドメインは、血管新生を増加させるために使用され得る。生存の増加、および幹細胞の分化（再生）の目的のために、ＩＧＦ、ＨＧＦまたはＮＲＧ１（または、その部分または派生物）を含む活性化ドメインが、使用され得る。
いくつかの場合、同時に活性化ドメインと標的化ポリペプチドの両方の活動を評価することは望ましい。ＥＬＩＳＡはこの目的のために都合よく使用され得る。
標的化ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ）の基質はＥＬＩＳＡプレートに吸着され、その後適切なＢＳＡ含有バッファーで遮断される。その後、二重特異的融合タンパク質が添加され、続いて活性化の組換基質（例えば、活性剤が増殖因子であれば、基質は組換え型同族の受容体か受容体断片（細胞外ドメインである)が添加される。この基質は、検出のために蛍光標識されるか、またはリガンド結合にそれほど影響しない受容体の領域に標識した抗体を用いて検出される。
一般に、二重特異的融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、二重特異的融合タンパク質の活性化ドメインによって制御される分子のシグナル伝達の変化を検出することによって、評価される。これは典型的に、細胞表面受容体のリン酸化状態の変化または処理組織のフローサイトメトリー、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ、ホスホラベリング、またはウェスタン分析によって検出されるホスホ−ＡＫＴまたはホスホ−ＥＲＫなどの下流の伝達物質に関与する。他の機能評価は、染色による生存細胞の数およびのための試験、アネキシンＶ結合によるアポトーシスのレベル（免疫蛍光を経て）、またはフローサイトメトリー、カスパーゼ活性の検出、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数の減少）またはＤＮＡラダーリングを含む。各々の場合において、アッセイで検出された制御された分子のレベル、機能活性、またはリン酸化における変化が有意（例えば、少なくとも２倍）に誘導されていれば、二重特異的融合タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで機能する。
患者の損傷組織の修復は、あらゆる臨床的に関連している規格を使用して評価できる。例えば、筋細胞また線維芽細胞の数などの細胞数、または瘢痕化の量の定量によって、または出力のための機能的アッセイ、またはＬＶＥＤＰ、ＬＶＤＰ、＋ｄｐ／ｄＴ、ＬＶ重量、室体積、および拡張期壁応力を含む心臓の機能評価の構造的態様と共に、梗塞組織の修復を測定できる。そのような評価のための方法は周知であり、文献に十分に記載される。一般に、そのような臨床的評価のいずれかにおいて、有意な（例えば、少なくとも２倍の）変化をもたらすならば、二重特異的融合タンパク質は損傷組織を修復するといえる。
半減期モジュレータ
当業者は、治療への応用で用いられる二重特異的タンパク質が、それらの比較的低い分子量のため最適の血清半減期を示さない可能性を理解するであろう。したがって、いくつかの治療への応用では、二重特異的タンパク質の半減期を調節することが、望ましくなり得る。いくつかの実施形態において、器官の病的な障害をうけたまたは損傷した領域での二重特異的タンパク質の蓄積を達成するために、二重特異的タンパク質は半減期モジュレータと結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）される。そのような半減期モジュレータは融合タンパク質の生体内の半減期を増加させることができる。例えば、半減期変調器を含む二重特異的タンパク質の半減期は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約２４時間以上である。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータを含む二重特異的タンパク質の半減期は約１週間以上である。
標的化ポリペプチドドメインと活性化ドメインはペプチド結合を通して直接連結され得る。いくつかの実施形態において、それらは半減期モジュレータを経て連結され得る。好ましい実施形態において、半減期モジュレータはポリペプチドである。従って、半減期モジュレータは２個の末端、Ｎ−末端、およびＣ−末端を有することができる。いくつかの実施形態において、連結する、半減期モジュレータが、ペプチド結合を経てある末端で標的化ポリペプチドドメインに連結され、ペプチド結合を経てもう片方の末端で活性化ドメインに連結される。ある実施形態において、リンカーはＮ−末端において標的化ポリペプチドドメインのＣ−末端と、Ｃ−末端において活性化ドメインのＮ−末端と連結される。他の実施形態において、リンカーはＣ−末端において標的化ポリペプチドドメインと、Ｎ−末端において活性化ドメインと連結される。またさらに、他の実施形態において、半減期モジュレータは二重特異的タンパク質の末端の一つで連結される。例えば、いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはＣ−末端において活性化ドメインのＮ−末端と連結される。他の実施形態において、半減期モジュレータは標的化ドメインのＣ−末端において連結される。他の実施例において、半減期モジュレータはＮ−末端において活性化ドメインのＣ−末端と連結できる。さらにまた、他の実施形態において、半減期モジュレータはＮ−末端において標的化ドメインのＣ−末端と連結できる。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、腎クリアランスを最小にするように、二重特異的タンパク質の大きさを約７０ｋＤａを超えるか相当半径に推進するように設計される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ＦｃＲｎ受容体仲介の再生を通して、または、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清成分への結合を通して二重特異的融合タンパク質の半減期を延長するように設計される。
好ましくは、半減期モジュレータはヒトにおいて非免疫原性である。半減期モジュレータは、少なくとも１００の連続したアミノ酸から成る領域の上で少なくとも５０％の配列同一性を保有する、ヒト血清タンパク質またはその誘導体であり得る。本明細書で用いられる、「配列同一性」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の参照配列との比較に関連して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が最適に並べられるとき、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が同じであるか、または参照配列内の対応する位置で、特定の割合で同じヌクレオチドまたは残基を有する。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータに存在する１個以上のグリコシル化部位のグリコシル化で半減期モジュレータを改質できる。例えば、以下のアミノ酸：アスパラギン、セリン、トレオニンを半減期モジュレータのグリコシル化を改質するために加えるか、または除くことができる。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質の半減期モジュレータのグリコシル化は二重特異的タンパク質の半減期を調節できる。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ配列は、グリコシル化を減少させるように改質される。そのような改質は、Ａｓｎ（Ｎ）のＧｌｎ（Ｑ）またはＡｌａ（Ａ）による置換、および／または、Ｓｅｒ（Ｓ）のＴｈｒ（Ｔ）またはＡｌａ（Ａ）による置換を含む。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、一つにはＦｃＲＮとの結合および再生利用のため、天然に長い血清半減期を有する。ＨＳＡは血液で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて安全性が示されている。いくつかの実施形態において、ＨＳＡの５０３位置のアスパラギン、脱アミド化され、半減期を減少させ得る、をＮ５０３Ｑ置換により除去できる。いくつかの実施形態において、ＨＳＡのシステインＣ３４をセリンまたはアラニン（ＳまたはＡ）に置換して遊離システインを除去し、交互に起きるジスルフィド結合構成を最小にし得る。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはＮ５０３Ｑ置換および追加のグリシン末端をもつ改質ＨＳＡのドメインＩＩＩ（ｍＨＳＡ＿ｄＩＩＩ）の改質型である。そのような改質型はＦｃＲｎに結合するＨＳＡ特性および増加された血清半減期を保有する。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒト血清アルブミンアミノ酸配列（配列番号：１２）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、配列番号１０、１２、２４−２８、６５、または６７に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号２１２−２１５に記載された配列を含む。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトアルファ・フェトプロテイン（ＡＦＰ）アミノ酸配列（配列番号：２９、６８）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＡＦＰのＮ−結合型グリコシル化部位はＮ２５１Ｑ置換で除去される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号２９、６８、または６９に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号２１６に記載された配列を含む。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＶＤＢＰのＮ−結合型グリコシル化部位はＮ２８８ＱまたはＮ２８８Ｔ置換で除去される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは配列番号６６に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号２１９に記載された配列を含む。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、トランスサイレチンＮ１１８ Ｎ−結合型グリコシル化部位を除去するように改質される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはトランスサイレチンの単量体型である。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ヒトＦｃアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。抗体のＦｃドメインは天然に、ＦｃＲｎと結合し、延長された半減期をもたらす能力を有する。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃドメインはＦｃ（ガンマ）Ｒと結合しないように操作される。例示的な実施形態において、ＦｃドメインはＮ３９７をＱで置換するよう操作される（Ｎ２９７Ｑ変異体）。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはｓｃＦｃと名づけられたＦｃの単量体型変異体である。例えば、天然に二量体化してＦｃを形成するＩｇＧ重鎖サブセットはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を創出するために、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１０４）のような可動性リンカーとヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３との結合により一本鎖を形成する操作される。例示的な実施形態において、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）はＮ３９７をＱで置換およびＣ２２０をＳで置換（Ｎ２９７Ｑ、Ｃ２２０Ｓ）するように操作される。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｃドメインは配列番号７１に記載された配列を含む。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号２１８に記載された配列を含む。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎは、ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎを模倣するプロリン−、アラニン−、および／または、セリン豊富な配列（ＷＯ／２００８、１５５１３４を参照）である。プロリン、アラニン、および／またはセリンのポリペプチド伸長は大きい流体力学半径で準構造化された立体的なドメインを形成し、その結果、融合タンパク質のクリアランスを抑える。いくつかの実施形態において、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎアミノ酸配列は約２００、３００、４００、５００または６００のアミノ酸長である。例えば、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎはアミノ酸配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号：１０５）の２０回の反復である。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータは、アルブミン結合ドメインヒト抗体（ａｌｂｕｄＡｂ）アミノ酸配列（配列番号：７０）と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％同一の少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。アルブミン結合ドメイン抗体は、血清アルブミンに非共有的に結合することによって、融合タンパク質半減期を増加させることができる（ＷＯ２００８／０９６１５８を参照）。いくつかの実施形態において、アルブミン結合ドメインヒト抗体は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ｋｅｘ２プロテアーゼ部位を除去し、Ｃ−端末アルギニンを除去するために操作される。いくつかの実施形態において、半減期モジュレータ核酸配列は配列番号２１７に記載された配列を含む。
そのような半減期モジュレータの代表的なものとして、配列番号１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１または１０５のいずれかに記載された配列を含む。
いくつかの実施形態において、半減期モジュレータはジスルフィド結合を形成する能力を減少するためにシステイン残基をセリンまたはアラニン残基で置換するように改質できる。
半減期モジュレータは、二重特異的融合タンパク質と、単独または短い（例えば、２から２０のアミノ酸残基）のコネクタポリペプチドを用いて、組み込まれ得るか、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）され得る。いくつかの実施形態において、コネクタポリペプチドは、半減期モジュレータの一または両端の、Ｎ−末端において、Ｃ−末端において、またはＮ−末端およびＣ−末端の両方に存在しています。リンカーのＮ−末端での使用のための好適な短いコネクタポリペプチドは、例えば−Ｇｌｙ−Ａｌａ−（ＧＡ）および−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（ＡＳ）などのジペプチドを含む。リンカーのＣ−末端での使用のための好適な短いコネクタポリペプチドは例えば−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−（ＬＱ）および−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（ＴＧ）などのジペプチドを含む。いくつかの実施形態において、コネクタは２個のアミノ酸より長い。例えば、コネクタは５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００長のアミノ酸である。好ましくは、そのようなコネクタは、柔軟（例えば、グリシン豊富）であるかまたは構造化（例えば、アルファ・ヘリックス豊富)されている。いくつかの実施形態において、コネクタまたはポリペプチドリンカーは配列番号：４１−４２、８７−９１に記載された配列を有する。いくつかの実施形態において、コネクタはトランスサイレチンなどのヒトタンパク質に基づく。
配列番号：４６−４９は、Ｎ−およびＣ−末端の両方に代表的なコネクタジペプチドを持つ配列番号：４５の半減期モジュレータを記載する。しかしながら、そのような短いコネクタポリペプチドおよび、存在するなら、配列番号：９５−１０４または１８２−１８４に記載されるコネクタは、半減期モジュレータの１個または両方のいずれかに位置し得ることは明らかであろう。
ある好適な半減期モジュレータは、半減期モジュレータなしの融合タンパク質と比べて、二重特異的融合タンパク質の長期の半減期を提供する。半減期モジュレータの半減期への効果は、生理条件下で安定性を決定するアッセイを用いることで評価できる。例えば、二重特異的融合タンパク質は、試料が培養直後および２４時間毎に取り除かれる条件で、３７℃で１２０時間、血清（例えば、ヒト血清）中で培養できる。続いて、上述された結合アッセイは、各々の時点で機能的な二重特異的融合タンパク質のレベルを検出するために実施される。続いて、このレベルは半減期比較を提供するために半減期モジュレータなしで（または異なった半減期モジュレータを使用して）組み立てられた二重特異的融合タンパク質のレベルが比較される。
任意の要素および代表的な二重特異的融合タンパク質
上述されたものの追加の要素が、本明細書において提供された二重特異的融合タンパク質に任意に含まれていることは、明らかであろう。そのような要素は、二重特異的融合タンパク質の発現の促進、調製または精製、あるいは標的化の機能を果たすことを含む様々な目的のために存在し得る。例えば、Ｎ−端末リーダーポリペプチドが存在し得る。代表的なリーダーポリペプチドは、配列番号：４１−４２、８７−９１、または２４４のいずれか一つに記載される配列を含むかまたは有する。あるいはまた、二重特異的融合タンパク質は精製を容易にするためにポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）タグを含み得る。そのようなタグは、少なくとも６個のヒスチジンの連続したアミノ酸残基を含み、Ｃ−またはＮ−末端に位置し得る。ある実施形態において、ヘキサヒスチジンタグは二重特異的融合タンパク質のＣ−末端にて含まれる。追加アミノ酸残基もまた、残りの二重特異的融合タンパク質とポリヒスチジンの結合点に存在し得る。本明細書にて提供されるある二重特異的融合タンパク質は、配列番号：４３、４４または９２−９４に記載されるようなＣ−末端ポリヒスチジン含有ポリペプチドを含む。
ある二重特異的融合タンパク質は、以下の一つを満たす一般構造体を有する(Ｎ−末端からＣ−末端を、左から右に示す）：
Figure 0006174763
代表的な二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；および
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
例えば、そのような二重特異的融合タンパク質のいくつかは以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｄ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｅ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；および
（ｆ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
他の二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
さらに他の二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
さらに他の二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
さらに他の二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
さらに他の二重特異的融合タンパク質は以下を含む（Ｎ−端末からＣ−端末まで）：
（ａ）リーダーポリペプチド（例えば、配列番号：４１−４２、８７−９１または２４４に記載される配列を含むか有する）；
（ｂ）活性化ドメイン（例えば、配列番号：３−９、３２−４０、または５０−６４のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｃ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｄ）標的化ポリペプチドドメイン（例えば、配列番号：１、２、３０、３１、７２、７３、７６−８３または８５−８６に記載される配列を含むか有する）；
（ｅ）任意に、短いコネクタポリペプチド；
（ｆ）半減期モジュレータ（例えば、配列番号：１０、１２、１４−２９、４５−４９、６５−７１、または１０５のいずれか一つに記載される配列を含むか有する）；
（ｇ）ポリヒスチジン含有ポリペプチド（例えば、配列番号：４３−４４または９２−９４に記載される配列を含むか有するポリペプチドなどのヘキサヒスチジン含有ポリペプチド）。
いくつかの実施形態において、短いコネクタポリペプチドは配列番号：９５−１０４または１８２−１８４に記載される配列を含む。
いくつかの実施形態において、任意の短いコネクタポリペプチドはジペプチド（Ｇｌｙ−Ａｌａ；Ａｌａ−Ｓｅｒ；Ｌｅｕ−Ｇｌｎ；Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）または配列番号：９５−１０４および１８２−１８４に列挙される配列を有するポリペプチドである。
代表的な二重特異的融合タンパク質は、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）、ａＰＳ４Ａ７＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、Ｂ７ｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２を含むが、これらに限られない。代表的な二重特異的融合タンパク質は、配列番号：１０６、１０８、１１０、１１２、１１８、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０に記載される配列を有することができ、または配列番号：１０７、１０９、１１１、１１３、１１９、１２１、１２５、１２７、１２９、１３１、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７９または１８１に記載される配列を有する核酸からコードできる。
代表的な二重特異的融合タンパク質は、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１１１）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＶＥＧＦＢ（１６７）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２、ＨＧＦ（ＮＫ１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、ＶＥＧＦＢ（１６７）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、ＶＥＧＦＢ（１１１）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＤＡｓｃＦｖ、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＤＡｓｃＦｖ、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＤＡｓｃＦｖ、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）、およびＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２を含むが、これらに限定されない非結合性標的化ポリペプチドを含む。代表的な二重特異的融合タンパク質は、配列番号：１１４、１１６、１３８、１８５、２４６、２４８、２５４、２５８、２６０、２６２、２６４、２７２、２７４、２７６に記載される配列を有することができ、または配列番号：１１５、１１６、１２３、１３９、１８６、２４７、２４９、２５５、２５９、２６１、２６３、２６５、２７３、２７５または２７７に記載される配列を有する核酸からコードできる。
二重特異的融合タンパク質の調製
二重特異的タンパク質は液相および固相ペプチド合成および組換えＤＮＡ技術を含む標準的な技術を用いて合成し得る。固相合成のため、配列のＣ−末端アミノ酸は不溶性担体に取り付けられ、残余のアミノ酸は順に結合される。約５０アミノ酸より長いポリペプチドに関しては、より短い領域がこの方法で合成され、続いてより長いポリペプチドを形成するため濃縮され得る。カルボキシル末端の活性化による（例えば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）ペプチド結合を形成する方法は当分野で周知である。
組換えＤＮＡ技術のため、二重特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡは、化学的または融合タンパク質の各々をコードするＤＮＡを分離およびライゲートして調製される。二重特異的融合タンパク質の各セグメントをコードするＤＮＡは既知の遺伝子から分離またはｄｅ ｎｏｖｏで合成され得る。ＤＮＡの直接化学合成のための方法は当分野で周知であり、そのような合成は、自動合成器を使用することにより慣習的に実施される。化学合成は一本鎖のポリヌクレオチドを製造し、それは、相補的な配列とのハイブリダイゼーション、またはＤＮＡポリメラーゼを使用することにより二本鎖に変換される。一般に、化学ＤＮＡ合成が二重特異的融合タンパク質より短い系列に制限される間、完全な二重特異的融合タンパク質がより短い配列のインフレームでのライゲーションで得られ得ることは明らかであろう。あるいは、二重特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローニングによって調製される。クローニング技術は当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）などの標準的な文献により十分に説明される。ＤＮＡの一部が、完全な長さのコード配列を生成するようにインフレームで一緒にライゲートされ得る。
いったん二重特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡを得ると、ＤＮＡは原核生物または真核宿主細胞における発現のためにベクターにクローニングされ得る。そのようなベクターにＤＮＡを組込むための技術は当業者に周知である。そのような発現ベクターの中では、二重特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現に必要なヌクレオチド配列（例えば、適当なプロモーターと必要なら終結シグナル）に動作可能に連結される。プロモーターは、（典型的には５’からコード配列に位置する）、隣接して連結されるコード配列の転写を指示するヌクレオチド配列である。終結シグナルは、翻訳を停止する終止コドンおよび／または転写の終止シグナルであり得る。また、追加の調節要素（例えば、エンハンサー要素）も発現ベクターの中に存在し得る。そのようなベクターは、好ましくは核外遺伝子またはウイルス・ベクターである。好ましくは、発現ベクターはさらに選択への抵抗を与える選択可能なマーカーを含む。これによって、細胞がベクターをその染色体に安定して統合することができ、（順にクローニングされ、細胞株に拡張できる増殖巣を形成できる。さまざまな選択可能なマーカーは当分野で既知であり、例えば、アンピシリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、アミノグルコシドＧ−４１８、ハイグロマイシン、およびプロマイシンへの耐性遺伝子を含む。当業者は、大腸菌、他の細菌性宿主、酵母およびＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株などの様々な高等真核細胞を含む、タンパク質の発現のために利用可能は多数の発現系に詳しい。
宿主細胞は、標準方法を使用することで二重特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換されるか、またはトランスフェクトされる。宿主細胞における発現はＤＮＡの対応するｍＲＮＡへの転写、続いて二重特異的融合タンパク質を生成するｍＲＮＡの翻訳をもたらす。
いったん発現されると、二重特異的融合タンパク質は、例えば、硫安沈殿またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどを含む標準的な手順に従って精製できる。医薬用途において、少なくとも約９０〜９５％の同一性の実質的に純粋な構造が好ましく、９８から９９％以上の同一性が最も好ましい。部分的にまたは望ましい同一性までいったん精製されると、治療上使用されるには、ポリペプチドは実質的にエンドトキシンを含まないものであるべきである。
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されるように、少なくとも１個の二重特異的融合タンパク質を少なくとも１個の生理学的に許容できる担体と共に含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、組織損傷を防ぐ、または損傷組織を修復または再生するために、組織損傷にり患しているかまたはそのリスクを有する患者を治療するために使用され得る。そのような患者は例えば心筋梗塞、腎臓損傷および／または脳梗塞を経験した患者を含む。所望により、幹細胞または損傷組織の修復を容易にする他の剤などの他の活性成分が医薬組成物に含まれ得る。
本明細書で使用される、「生理学的に許容できる」なる用語は、動物、特にヒトにおける使用のために、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているかまたは、米国薬局方または他の一般に認識された薬局方に記載されることを意味する。「担体」なる用語は二重特異的融合タンパク質と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。生理学的に許容できる担体は石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水または油などの無菌液体（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、または胡麻油）であり得る。医薬組成物が静脈に投与されるとき、水は好ましい担体である。食塩水、および水溶性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体、特に注射剤に使うことができる。好適な医薬賦形剤は例えばでんぷん、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物はまた、所望により、少量の湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。
医薬組成物は予防および／または、治療の処置のために、いかなる適切な投与方法、例えば、非経口、鼻腔内、または、経皮などの局所投与を含む、のために製剤化され得る。これらの組成物は、投与方法に適合する、溶液、懸濁液、タブレット、錠剤、カプセル剤、粉末、エアロゾルおよび徐放性製剤などの様々な周知のあらゆる形態をとることができる。組成物は伝統的なバインダーとトリグリセリドなどの担体で座薬として製剤化できる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。投与と担体の好適な調剤のモードの例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，” Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ （２１ｓｔ ｅｄ．， ２００５）に記載される通りである。
一般的に、本明細書で提供された医薬組成物は、非経口（例えば、静脈、筋肉内の、または、皮下の注射）、または経口摂取または局所適用で投与される。非経口的投与において、担体で二重特異的融合タンパク質を懸濁するか、または溶解することができる。一般に、無菌の水性担体、例えば水、バッファー、塩水またはリン酸緩衝生理食塩水など、が好ましい。また、無菌の固定油は溶剤または懸濁化剤として使用され得る。この目的のため、合成モノ−またはジグリセリドを含む、いかなる無菌の固定油を使用し得る。また、オレイン酸などの脂肪酸は注射用組成物の調製に使用される。医学的に許容できる、ｐＨ調整および緩衝剤、等張化剤、分散剤、懸濁化剤、湿潤剤、洗浄剤、保存料、局部麻酔薬および緩衝剤などの補助剤も、生理的状態に近似するために含まれ得る。
一の好ましい実施形態において、医薬組成物は患者（例えば、ヒト）への静脈内投与のために製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は無菌の等張水系バッファー溶液である。必要であるところでは、組成物が、可溶化剤および、注射の場所で苦痛を和らげるためにリグノカインなどの局部麻酔薬も含み得る。一般に、成分は、単位剤形、例えば、凍結乾燥した粉末または活性剤の量を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封された（例えば、密封して封をされた）容器における無水の濃縮物、において別々に、または共に混合されて供給される。点滴によって投与される組成物であるところでは、無菌の医薬グレードの水または塩水を含む点滴ボトルに分注される。組成物が注射で投与されるところでは、成分が投与の前に混合され得るように、注射用蒸留水か塩水のアンプルを提供できる。
経口での使用を意図する組成物は例えば、タブレット、トローチ、ドロップ、水性または油性の懸濁液、分散性粉末または顆粒、乳剤、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤として存在し得る。そのような組成物は、甘味剤、香味剤、着色剤および保存料などの１個以上の成分を含み得る。タブレットは、タブレットの製造に適した生理学的許容できる賦形剤と混合された有効成分を含む。そのような賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤および平滑剤を含む。経口用途のための製剤化もまた、有効成分が不活性の固体の希釈剤に混合されるハードなゼラチンカプセル、または有効成分が水または油媒体に混合されるソフトなゼラチンカプセルとして存在し得る。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した１個以上の賦形剤と混合された有効成分を含む。そのような賦形剤は懸濁化剤および分散または湿潤剤を含む。加水による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤懸濁化剤および１個以上の保存料との混合物において有効成分を提供する。
油性の懸濁液は、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または液状パラフィンなどの鉱油において有効成分を懸濁することにより製剤化され得る。医薬組成物はまた、水中油型乳化物であり得る。油相は植物油、鉱油、またはそれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、例えば、天然に生成するガム類、天然に生成するリン脂質および無水物を含む。
医薬組成物は、通常の滅菌処理で滅菌され得るか、または滅菌ろ過され得る。無菌の水溶液はそのまま使用されるために包装され得るか、または投与の前に無菌の水性担体と組み合わせられる凍結乾燥製品として凍結乾燥され得る。水性医薬組成物のｐＨは典型的に３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から７．５などの、７から８であろう。
本明細書で提供される二重特異的融合タンパク質は一般的に、患者への単回投与量で治療法上有効な量を送達するような濃度で医薬組成物内に存在する。治療法上有効な量は、損傷組織の検出可能な修復または再生、または組織の損傷の兆候の減少のように、認識できる患者の利益をもたらす量である。治療上有効な量は、表３で例示された動物モデルの一つ以上における検出可能な組織修復または再生を達成するために十分な量から近似できる。それにもかかわらず、使用される二重特異的融合タンパク質の活性；患者の年令、体重、健康全般、性別、および食事；投与の時間と経路；排せつ速度；複合薬などのあらゆる同時処理；治療中の患者における組織損傷の型と重症度、を含むさまざまな要素が治療法上有効な量に影響するのは、明らかであろう。最適な用量は、当分野で周知の、慣用の試験、および手順を用いることで確立され得る。一般に、用量は投与量あたり約０．５ｍｇから約４００ｍｇの二重特異的融合タンパク質（例えば、１投与量あたり０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、または４００ｍｇ)までの範囲である。一般に、１日あたり、体重キログラムあたり約０．１ｍｇから約１００ｍｇの範囲の投与量レベルを提供する組成物が好ましい。ある実施形態において、単位用量形態は約１０ｍｇから１００ｍｇの間の二重特異的融合タンパク質を含む。
医薬組成物は、組織損傷の治療または予防のため（例えば、心筋梗塞または腎臓損傷の治療のため）にパッケージ化され得る。パッケージ化された医薬製剤は、治療上有効量の本明細書に記載されたような少なくとも１個の医薬組成物を保持する容器および含まれる組成物が患者における組織損傷（心筋梗塞または腎臓損傷など）の治療のために使用されることを示す使用説明（例えば、ラベル）を含む。医薬組成物は、各々が密封された容器において固定量の二重特異的融合タンパク質を含む、複数の単回投与単位でパッケージされ得る。あるいは、容器は医薬組成物の複数回投与を保持し得る。
治療方法
医薬組成物は、患者の病理的組織障害を治療するために患者（好ましくは牛、豚、馬、鶏肉、猫、犬、またはより好ましくはヒト、などの哺乳動物）に投与できる。本発明の文脈において、「治療」なる用語は予防的および治療的投与の両方を含む。予防的応用では、本明細書に記載される医薬組成物は、組織損傷の予防、遅延または重症度の減少のために、病理的組織障害にり患しているかそうでなければリスクのある患者に投与される。治療的応用では、治療は、病理的組織障害の重症度を減少させるか、または障害の後に組織を再生させるために実施される。いくつかの実施形態において、他の治療用の組成物と組み合わせて医薬組成物を投与できる。
代表的な病理的組織障害は、心臓組織の損傷（例えば、心筋梗塞に関する障害）、腎臓組織の損傷、および組織の損傷、および虚血性脳梗塞（例えば、脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）としても知られている脳の局所貧血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、重篤な肢虚血または他の虚血）に続く組織損傷を含む。いくつか実施形態において、障害から組織を保護するためおよび／または組織または器官障害後の組織および／または血液供給の再生のため、医薬組成物を使用できる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物を自己免疫疾患、例えばＬｕｐｕｓとしても知られる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を予防する、遅延、減少、または治療するために投与できる。ＳＬＥは多くの組織または系、例えば、関節、皮膚、肝臓、腎臓、血球、心臓、肺、神経系、血管、が攻撃されて、炎症を起こすようになるところの自己免疫疾患である。免疫系は自己に対して、特に核タンパク質およびＤＮＡに対して抗体を生産する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、障害から組織を保護するため、および障害の後に組織を再生するために投与できる。いくつかの実施形態において、既存の免疫抑制または他の治療と組み合わせて医薬組成物を投与できる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、Ｉ型糖尿病を予防、遅延、減少または治療するために投与できる。Ｉ型糖尿病において、生体の自己免疫系はすい臓のインシュリン生産ベータ細胞を破壊する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、ベータ細胞を再生するために投与できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、当分野で既知のＩ型糖尿病治療と組み合わせて投与できる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、組織または器官の変性を予防、遅延、減少または治療するために投与できる。例えば、医薬組成物をアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、またはルー・ゲーリッグ病としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの脳、脊椎または神経の変性を治療するために使用できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、当分野で既知の既存の治療と組み合わせて投与できる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、それを必要とする対象に、骨および／または軟骨に関する疾患を予防、遅延、減少またはを治療するために投与できる。いくつかの実施形態において、骨および／または軟骨組織を再生するために医薬組成物を使用できる。医薬組成物は、当分野で既知の既存の治療と組み合わせて投与できる。
例えば、リポソームでカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、二重特異的融合タンパク質を発現できる組換え細胞、受容体介在、またはレトロウイルス、または他の核酸ベクターを含むあらゆる様々な既知の送達系を、二重特異的融合タンパク質を投与するために使用できる。二重特異的融合タンパク質は、いかなる便利な経路、例えば、注入、静脈内ボーラス、上皮または皮膚粘膜内（例えば、口腔粘膜、直腸または腸の粘膜など）を通した吸収で投与され得、他の生理活性物質と共に投与され得る。投与は、全身または局所とできる。加えて、二重特異的融合タンパク質を心室内およびくも膜下注入を含む、あらゆる適当な経路で中枢神経系に導入することが望ましく；脳室内注射は例えば、オマヤ槽などの貯蔵槽に取り付けられた心室内カテーテルによって容易にされ得る。さらに、経肺投与も、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む製剤によって用いることができる。
特定の実施形態において、本発明の二重特異的融合タンパク質を、局所的に、治療が必要である領域に投与することが望ましいことであり得；これは、例えば、外科手術の際の局所注入、局所的適用の方法により（例えば、外科後の創傷包帯と併せて）、注射、カテーテル、座薬、またはインプラント、該インプラントは、多孔質、無孔またはゲル状材料を有する、により達成され得る。他の実施形態において、リポソームなどの小胞を二重特異的融合タンパク質を送達するために利用できる。さらに別の実施形態において、制御放出系；例えば、そのような制御放出系は治療標的またはその近く（例えば、組織損傷をうけているか、またはリスクのある生体の器官）に位置し得る、で二重特異的融合タンパク質を送達する。そのような送達系の使用は当業者に周知である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される二重特異的融合タンパク質は、その損傷組織に幹細胞を動員する能力により、少なくとも部分的に、病理的組織障害を治療するために効果的である。ある場合において、十分な幹細胞が患者（例えば、心臓幹細胞）の中に存在し得る。しかしながら、ある実施形態において、幹細胞（例えば、自己骨髄由来幹細胞）を共投与することは、有益であり得る。そのような幹細胞は、二重特異的融合タンパク質の前または後に投与されるか、または同時に（同じ医薬組成物においてまたは分離された組成物において）、投与され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される二重特異的タンパク質は、組織生存の増進に有効である。いくつかの実施形態において、二重特異的タンパク質は、投与され、特定の組織または器官（例えば、心臓）を標的化することができる。二重特異的タンパク質はその後、標的化ドメインの組織関連標的分子との結合を通して、特定の組織または器官（例えば、他の器官ではない、心臓）で蓄積できる。いったん標的分子と結合すると、二重特異的融合タンパク質は標的分子から解離、離れて再度標的分子、傍分泌様方法における組織の異なる細胞（例えば、損傷細胞または「リスク」細胞)の増殖因子受容体、またはサイトカイン受容体と再結合（ｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ）できる。
上述のように、至適用量は、当分野で既知の要素に依存するが、一般に、投与量あたり約０．５ｍｇから約４００ｍｇの二重特異的融合タンパク質（例えば、投与量あたり１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、または４００ｍｇ）の範囲である。治療法上、二重特異的融合タンパク質の（上記の医薬組成物中の）一投与量は、時間、日、週、月、または年あたり１回以上（例えば、時、日、週、月、または年あたり２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回）治療的に患者に投与できる。より一般的に、体重のキログラムあたり約０．１ｍｇから約１００ｍｇの範囲の二重特異的融合タンパク質の量を含む日ごとまたは週ごとの単回投与で、投与される。
他の実施形態において、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、週あたり約０．１ｍｇから週あたり約２５００ｍｇ、週あたり約０．１ｍｇから週あたり約１０ｍｇ、週あたり約１ｍｇから週あたり約１００ｍｇ、週あたり約１０ｍｇから週あたり約５００ｍｇ、週あたり約１００ｍｇから週あたり約２５００ｍｇ、週あたり約１０ｍｇから週あたり約１００ｍｇ、週あたり約１００ｍｇから週あたり約１０００ｍｇの範囲の投与量で患者に投与され得る。あるいは、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、一日おきに約０．１ｍｇから一日おきに約５００ｍｇ、一日おきに約１ｍｇから一日おきに約７５ｍｇ、一日おきに約１０ｍｇから一日おきに約５０ｍｇ、一日おきに約２０ｍｇから一日おきに約４０ｍｇの範囲の投与量で投与され得る。あるいは、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、週あたり約０．１ｍｇを３回から週あたり約１００ｍｇを３回、週あたり約１ｍｇを３回から週あたり約７５ｍｇを３回、週あたり約１０ｍｇを３回から週あたり約５０ｍｇを３回、週あたり約２０ｍｇを３回から週あたり約４０ｍｇを３回、の範囲の投与量で投与され得る。
さらなる実施形態において、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）に１、２、３または４時間；日あたり１、２、３または４回；１日おきまたは３、４、５、または６日おき；週あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回；二週おきに；月あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０回；２ヶ月おきに；６ヶ月あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回；年あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回；または半年おきに投与される。治療計画の間、二重特異的融合タンパク質を含む医薬組成物が、必ずというわけではないが、異なる頻度で投与され得ることは、明らかであろう。
以下の実施例が限定の目的でなく、例示の目的で提供される。特に明記しない限り、すべての試薬および溶剤は、標準の商用グレードであり、更なる精製なしで使用される。慣用的な変更を使用して、以下の実施例で提供された手順は、本発明の範囲内で、異なる二重特異的融合タンパク質および医薬組成物を調製および使用するために、当業者により変更され得る。
実施例１ 代表的な二重特異的融合タンパク質の調製
標的化ポリペプチドドメインがＤＮＡと結合し、活性化ドメインがＮＲＧ１である二重特異的融合タンパク質が調製された。２個のドメインが改質ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）リンカーによって連結された。ＮＲＧ１は短いコネクタポリペプチドを組み込むＨＳＡリンカーのアミノ末端に組換え的に融合され、抗ＤＮＡ ｓｃＦｖは追加の短いコネクタポリペプチドを組み込む改質されたＨＳＡリンカーのカルボキシ末端に組換え的に融合された。改質されたＨＳＡリンカーは２個のアミノ酸置換を含む。天然のＨＳＡの位置３４のシステイン残基は、この部位での酸化による潜在的なタンパク質の多様性を減少させるためにセリンに変異した。天然のＨＳＡのアミノ酸５０３の、脱アミドに高感受性で、減少した薬理半減期をもたらし得るアスパラギン残基は、グルタミンに変異した。改質されたＨＳＡリンカーは二重特異的融合タンパク質に延長された循環半減期を与える。
実施例２ 二重特異的融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
実施例１で調製された代表的な二重特異的融合タンパク質（そこでは、標的化ポリペプチドドメインがＤＮＡと結合し、活性化ドメインがＮＲＧ１である）の両方の部分の活性は、二重特異的融合タンパク質の両方のアームがそれらの基質に同時に結合したときにだけ活性を与えるように設計されたＥＬＩＳＡを用いて試験された。ＥＬＩＳＡは、本質的にＳｔｏｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ３５（５）： ５６６−５７３ （１９８２）およびＧｒｉｐｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １：１５１−１５７ （１９７８）に記載されるとおりに実施された。より具体的に、二重特異的融合タンパク質の、１から５０ｎｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液が、ＤＮＡ（抗ＤＳ−ＤＮＡ抗体ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｄｉｓｔ ｂｙ ＡｕｔｏｇｅｎＢｉｏｃｌｅａｒ， ＵＫ）で予備吸着されたプレートのウェルに添加され、検出抗体が添加される工程まで、製造者の指示通りに培養し、洗浄された。この段階で、１００μｌの１から５０ｎｇ／ｍｌビオチン化ヤギ抗ヒトＮＲＧ１−β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ３７７）（「活性化アーム」への抗体）のＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ溶液が全てのウェルに加えられ、室温で１時間培養され、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共にＰＢＳで洗浄された。ＰＢＳで希釈された１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（２ｕｇ／ｍｌのストック（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０８０３）の１：２００の希釈）が各々のウェルに加えられ、室温で３０分間培養された。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共にＰＢＳでの最終洗浄の後、１００μｌのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（製造者の説明書通りに、Ｐｉｅｒｅ， ｃａｔ＃３４０７７）が添加され、蛍光（代表的な陽性シグナル）が、Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （Ｐａｃｋａｒｄ）または同様の機器で測定された。
検出されたシグナル量は、二重特異的融合タンパク質があるウェルで、ＤＮＡがないウェルまたは効力のないアーム（すなわち、活性化ドメインまたは標的化ポリペプチドドメインを含まない）を含む陰性対照に比べて、優位に高い(少なくとも１００倍高い）。加えて、シグナルはウェルに加えられた二重特異的融合タンパク質の量により変化することが見られた。
実施例３ 二重特異的融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性
実施例１で調製された代表的な二重特異的融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、融合タンパク質の活性化ドメインによって制御される分子におけるシグナル変化を検出することによって、決定される。この融合タンパク質ＮＲＧ１の活性化ドメインにおいて、活性は、未処理または模擬処理された心臓と比較して、二重特異的融合で処理された心臓における、リン酸化ＥｒｂＢ−３の増加の検出によって評価される。心筋梗塞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで気管内挿管、換気、および開胸に続く左冠状動脈（ＬＣＡ）のライゲーションで発生する。冠動脈閉塞症は左室壁の色変化の迅速な検査および胸の閉鎖前の心電図のＳＴ上昇によって確認される。模擬処理マウスは、ＬＣＡライゲーションなしで同じ外科の手順を受けた。
対照および二重特異的融合タンパク質処理マウスからの、心筋梗塞の誘導に続くかまたは正常なマウスの心臓は、Ｄｈｅｉｎ， Ｍｏｈｒ ａｎｄ Ｄｅｌｍａｒ， Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００５， ｐ． ４７３ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されるように、取り出され、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、包埋され、区分され、標本にされた。ホスホ−ＥｒｂＢ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｖｅｒｌｙ（ＭＡ））は、免疫蛍光によるホスホ−ＥｒｂＢ３の検出に使用される。未処理の心臓に対して、処理したものにおいてホスホ−ＥｒｂＢ３レベルの２倍の増加かそれ以上が観察され、機能的な活性化剤を暗示した。この増加は、シグナルを示す細胞の数（１領域あたりの数、または全体に占める割合)、細胞あたりのシグナル強度の増加、またはそれらの両方のいずれかである。
実施例４ 二重特異的融合タンパク質を用いるマウスでの組織損傷修復
実施例１の代表的な二重特異的融合タンパク質を含む組成物を、上述通りの心筋梗塞の誘導に続いて、マウスに投与した。投与は静脈注射である（例えば、尾静脈）。投与に続いて、心臓機能は以下の通り評価される。マウスを抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）で麻酔し、閉胸標本における左室（ＬＶ）圧およびＬＶ＋および−ｄＰ／ｄｔの測定のため、右頚動脈にマイクロチップ圧力トランスデューサ（モデルＳＰＲ−６７１、Ｍｉｌｌａｒ）をカニューレ挿入する。測定は二重特異的融合タンパク質による処理が心臓機能に影響することを確認するために未処理の対照マウスから得られたものと比較される。これらの測定の少なくとも一つを用いて評価した心臓機能において、有意な改善が観察された。
実施例５ 融合タンパク質の発現および精製
標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が設計され、発現され、精製された。標的化ドメインおよび活性化ドメインの様々な組み合わせは、異なる方向におけるｍＨＳＡ（配列番号１０）半減期モジュレータ、異なる短いコネクタポリペプチド配列、および異なるポリペプチドリーダー配列で組み立てられた。合成ＤＮＡ配列は、意図する発現生物（例えば、ＣＨＯまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のコドン使用頻度、特定の制限酵素認識部位を含めるまたは避けるという要望、および当分野で既知のコドン最適化のための他の要素を考慮して各々のアミノ酸配列について設計された。ＤＮＡ配列は、発現プラスミド、該プラスミドは発現生物に形質転換され、融合タンパク質が過剰発現される、に構築され、および／または組み立てられた。各々の融合タンパク質は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、Ｎｉ親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む異なる方法の組合せを用いて精製された。
完全な融合タンパク質または融合タンパク質に組み込まれるべき部分（例えば、個々の標的化ドメイン、半減期モジュレータドメイン、または活性化ドメイン）をコードするＤＮＡは、商業ソース（ＢｉｏＢａｓｉｃ、ＤＮＡ２．０）より購入した。アミノ酸配列は明らかに定義された。コドン使用頻度や制限部位（要求されるか、または禁止される）などの制約は業者に伝えられた。興味のあるタンパク質をコードする最終的なＤＮＡ配列が、ｉｓｏ−コード配列の理論上のプールから、それらの規制、および低い発現（ｍＲＮＡレベルにおける高い二次構造の回避など）、および業者の選好を避けるための一般的な戦略に従い、業者により選択された。いくつかの場合、コドン使用頻度はＣＨＯまたはかＰｉｃｈｉａ単独に合わせた。他の場合において、各々の生物の分配でまれなコドンを避けるために、組合せコドン使用頻度表が用いられた。いくつかの場合、完全長の融合タンパク質は、発現ベクターにおいて業者により供給された。他の場合において、興味のある発現ベクターのサブクローニングが必要であった。サブクローニング操作は、ＩＩ型制限酵素とＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いる伝統的な方法を使用することで実行された。代わりの組み合わせおよび標的化、活性化、および半減期モジュレータドメインの方向をもつ融合タンパク質を精算するための追加の分子クローニングは、これらの技術ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することで実施された。融合タンパク質は、機能的ドメインのいずれかの容易な置換または再構築のため、ＤＮＡレベルで機能的なドメインの間の連結点に位置する１個以上のＩＩ型制限部位と設計された。必要ならば、制限部位またはリンカー領域が、ＰＣＲに使用されるプライマーにそれらを組み込むことにより配列に加えられた。
いくつかの場合、タンパク質は、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１１５１キット）を用いて、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓで発現された。興味のあるタンパク質をコードする遺伝子が、組換えタンパク質の分泌を許容する発現ｐＰｉｎｋα−ＨＣプラスミドを使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α接合因子分泌シグナルで、インフレームでクローニングされた。他の場合において、タンパク質は、Ｓｅｌｅｘｉｓ／ＣＨＯのクローン系を用いて精製された。興味があるタンパク質をコードする遺伝子は、組換えタンパク質の発現を許容するために、Ｓｅｌｅｘｉｓベクターにクローニングされ、ポリクローナルＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトされた。ｐＰｉｎｋα−ＨＣプラスミドは、大腸菌において環状プラスミドの増殖および選択のための細菌性の複製起点（ｐＵＣ）および耐性マーカー（アンピシリン）を含む。それはまた、Ｐｉｃｈｉａへの形質転換の間に線形ベクターの統合を標的化するために用いられる、ＴＲＰ２遺伝子、およびＰｉｃｈｉａのアデニン栄養要求性の補足のために含まれる、ＡＤＥ２遺伝子も含む。ＡＯＸ１プロモーターはメタノール誘導で高レベルの転写を確実にし、ＣＹＣ１配列は効率的な転写終結を確実にする。プラスミドへのＡＤＥ２欠損Ｐｉｃｈｉａの統合はアデニン欠損培地における生存駆動の選択（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）ならびにコロニー色調に基づくスクリーニングを可能にした。高いコピー要素は白く見えたが、低いコピー要素はＰｉｃｈｉａ空胞における、プリン前駆体の蓄積のためピンクまたは赤に見えた。白いコロニーがタンパク質産生のために選択され、いくつかの場合において、いくつかのコロニーが大規模生産（リットル）の前に小規模のタンパク質生産（ミリリットル）の効率のためにスクリーニングされた。ｐＰｉｎｋα−ＨＣプラスミドマップおよび詳細はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより利用可能である。
他の場合では、タンパク質は、Ｓｅｌｅｘｉｓ／ＣＨＯクローン系を使用することで精製された。例示的な発現ベクターはｐＭＰ２０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ）であり、例示的細胞株はＣＨＯ−ｋｌ−Ｓ（ＳＥＬＥＸＩＳ）である。ｐＭＰ２０Ｋは一般的に使用された遺伝要素を使用する。発現はヒトのＧＡＰＤプロモーターによって駆動される。Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ＲｅｇｉｏｎまたはＭＡＲ要素といわれる遺伝要素は、染色質の動的組織化を制御し、周囲の染色質の効果から隣接する遺伝子を隔離し、その結果、コピー数依存、位置依存の遺伝子発現を増加させる。ＭＡＲ要素は、組換えタンパクの所望のレベルの発現を示すクローンの分離の確率を改善し、生産の安定性を増加させることを示した。発現プラスミドに加えて、抗生物質耐性プラスミド（ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ＳＥＬＥＸＩＳなど）もまた、安定した形質転換体の選択のために、使用された。発現プラスミドは直線化され（例えば、Ｐｖｕｌで）、その後ＱＩＡＱＵＩＣＫ精製（ＱＩＡＧＥＮ）が続いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＯｐｔｉＭｅｍＩ（Ｇｉｂｃｏ）におけるＣＨＯ細胞へのトランスフェクションのために使用された。トランスフェクトされた細胞は、１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２Ｈａｍｓ培地で２日間選択圧なし、その後４日間の選択圧で回復され、次いで、選択圧ありの無血清培地に変更された。ＨｙＣｌｏｎｅ登録商標（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ＨＴ補完剤（ＧＩＢＣＯ）と共に、ＨＳＡ−融合ＢＢＡに使用される。
発現に続いて、製造者の指示（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って、タンパク質はＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、Ｎｉ親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせで精製された。タンパク質生産は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により監視された。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのタンパク質の発現とクロマトグラフィーによるその後の精製。
興味のあるタンパク質をコードする遺伝子が、組み換えタンパク質の分泌発現を許容するために、ｐＰｉｎｋα−ＨＣプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１１５１キットを含む）を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅα接合因子分泌シグナル（配列番号２４４、２４５）でインフレームでクローニングされた。加えて、Ｈｉｓ６−タグをコードするＤＮＡは、Ｎｉ親和性クロマトグラフィーにおいて組み換えタンパク質の精製の選択肢を許容するために遺伝子の３’末端に加えられた。簡潔に、プラスミドは化学的に有用なＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ Ｓｔｒａｉｎ２（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１１５４）に形質転換され、培養物はＢＭＧＹ（バッファー複合グリセロール培地＝１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ６．０、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの１．３４％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．０００４％ビオチン、１％グリセロール）中で、振盪培養器で３０℃でＯＤ６００＝２〜６まで生育された。このとき細胞はペレット状となり、タンパク質の発現が元の培地の１／５容量のＢＭＭＹ（バッファー複合メタノール培地＝１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、硫酸アンモニウム含有、アミノ酸なしの１．３４％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．０００４％ビオチン、０．５〜１％メタノール）での培地の交換により誘導された。培養物は、その後、振盪培養器で２０〜３０℃にて追加の２４〜４８時間で生育された。１２〜２４時間ごとに、追加のメタノール（最終濃度０．５〜１％（ｖ／ｖ）まで）が培地に追加された。採取時点で、細胞は遠心分離によりペレット状となり、上澄みが回収され、滅菌ろ過され、精製まで（典型的には採取から３日以内）４℃にて保管された。
以下の融合タンパク質は、下記の方法に基づいて精製されたＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６、１３７）；ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号１３８、１３９）；ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１４２、１４３）；ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号２５４、２５５）；ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１４４、１４５）。組み換えタンパク質は、製造者の指示に従い、重力流で、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−５３１８−０４；樹脂１ｍＬ／５０ｍＬの上澄み）を使用するＮｉ親和性クロマトグラフィーによって精製された。これらの精製からの素通り画分はその後、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０にバッファー交換し、遠心分離を用いて、同じバッファーで平衡したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ１ｍＬカートリッジ(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４１２−０１）にロードされた。製造者の指示に従い、タンパク質は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出バッファーとしての３０ｍＭオクタン酸ナトリウムを使用することで精製された。Ｎｉ親和性クロマトグラフィーおよびＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーからの溶出液は、組み合わせられ、遠心濃縮器を用いて、ＰＢＳ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）ｐＨ７．２に濃縮／バッファー交換された。試料は、次にＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１１９５−０１）にロードされ、タンパク質はＰＢＳ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、ｐＨ７．２、１．３ｍＬ／分の流速で溶出した。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で同定されるような、興味のあるタンパク質を含む画分がプールされ、遠心濃縮器を用いて濃縮された。
最終的な純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。図１はＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（１３６）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（１３８）、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（１４２）、およびＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１はタンパク質分子量標準に対応する。レーン２、４、６は非還元性条件のタンパク質試料に対応する。レーン３、５、７、９は還元性条件（５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））のタンパク質試料に対応する。図１に示されるように、融合タンパク質（配列番号１３６）はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の正しい分子量（ＭＷ）（ＭＷ＝１１１ｋＤａが予想される）に泳動した。純度は＞８０％である。ＤＴＴがないとき、いくつかのダイマー（＜１０％の総タンパク量）が存在し、タンパク質は二重バンドとして泳動した。切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、観測された二重バンドパターンの原因であるかもしれない。図１に示すように、以下のタンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号１３８）、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１４２）、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号２５４）はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の正しい分子量（ＭＷ）（ＭＷ＝１１１ｋＤａが予想される）に泳動した。これらの融合タンパク質の純度は８０％より優れていた。ＤＴＴがないとき、いくつかのダイマー（＜１０％の総タンパク量）が存在し、ダイマーはＤＴＴの添加で除去された。
精製の後に、ＦＧＦ２＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質（配列番号１４４）の純度は約５０％であった。融合タンパク質は二重バンドとして泳動し、そのうちの一つは正しいＭＷ（１２０ｋＤａ）であり、一つは下側のＭＷであった。この結果は、下側の分子量バンドが切断産物であることを示唆し得る。
組み換え型の融合タンパク質ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号１１８）は、製造者の指示に従い、重力流で、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−５３１８−０４；樹脂１ｍＬ／５０ｍＬの上澄み）を使用するＮｉ親和性クロマトグラフィーによって精製された。結合／洗浄バッファーは２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールから構成され、溶出バッファーは２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４５０ｍＭイミダゾールから構成された。精製に続いて、純度がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価された。融合タンパク質は、ゲルの上を正しいＭＷ（１２０ｋＤａ）で泳動し、８０％より優れた純度を示した。
ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２０、１２１）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１１６、１１７）、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１３４、１３５）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１１４、１１５）、ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号２６４、２６５）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ（配列番号１５０、１５１）、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号１２４、１２５）、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２６、１２７）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１（配列番号１５２、１５３）、Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１７０、１７１）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１（配列番号１５４、１５５）ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ（配列番号１５６、１５７）は、下記の方法に従って精製された。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−０９４８−０３）は、通常の手順を用いてＥｃｏｎｏ−ｐａｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ７３２−１０１０）カラム（内径１．５ｃｍ；４ｍＬ樹脂／カラム）に充てんされた。クロマトグラフィーは８チャンネルぜん動ポンプを用いて実施された。カラムは５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０を含むバッファー（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された。タンパク質を発現する上澄みの伝導度は脱イオン水でＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒに適合するように（伝導度計を用いて測定されるものとして）調製された。各々のタンパク質発現培養物からの上澄みは４〜５ｍＬ／ｍｉｎでカラムにロードされた。カラムは５〜１０カラム容量のＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄された。タンパク質はその後、５〜１０カラム容量の低塩（ＬＳ）溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．１、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４５ｍＭオクタン酸ナトリウム）で溶出された。いくつかの場合（配列番号１２０、１１６、１３４、１１４、２６４を有するタンパク質）において、この溶出工程は５×１．５ｍＬ画分（Ａ１〜５）に続いて、７×４ｍＬの画分（Ｂ１〜７）に分割された。
低塩溶出バッファーでの溶出に続いて、５カラム容量の高塩（ＨＳ）溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．１、１Ｍ ＮａＣｌ、４５ｍＭオクタン酸ナトリウム）で追加のタンパク質を溶出した。画分は、タンパク質含有量のために遠心限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ、ＶＳ２０２２）で濃縮され、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ１７−０８５１−０１）を使用して０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に脱塩してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。興味があるタンパク質を含む画分がプールされた。ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２０）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。精製された融合タンパク質は約５０％の純度であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析はゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の予想されたＭＷ（１１２ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。８．ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１１６）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は約５０％の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１１２ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１３４）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は約５０％の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１１１ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１１４）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は約５０％の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１１１ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号２６４）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は約５０％の純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１２０ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ（配列番号１５０）融合タンパク質の画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は５０％より高い純度を示し、ゲル上に二重バンドを示した。バンドの一つは完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１０２ｋＤａ）であり、バンドの一つはそれが切断産物であったと示唆し得る下側のＭＷで特徴付けられた。ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号１２４）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され２０％未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１１０ｋＤａ）に対応するバンドを示した。下側のＭＷバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２６）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され５０％未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１１０ｋＤａ）に対応するバンドを示した。下側のＭＷバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１（配列番号１５２）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され約５０％の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（９１ｋＤａ）に対応するバンドを示した。下側のＭＷバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。Ｓｙｔ１＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号１７０）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され５０％未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（９１ｋＤａ）に対応するバンドを示した。下側のＭＷバンドの存在は、タンパク質が開裂または切断され得たことを示唆した。ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１（配列番号１５４）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され約５０％の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１０２ｋＤａ）に対応するバンドを示した。ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ（配列番号１５６）融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され５０％未満の純度を示し、完全長の融合タンパク質の正しいＭＷ（１０２ｋＤａ）に対応するバンドおよび切断産物に対応し得る下側のＭＷバンドを示した。
ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ（配列番号２５２、２５３）およびＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ（配列番号２５０、２５１）融合タンパク質は下記の方法で精製された。タンパク質は硫酸アンモニウム（８２％の最終濃度まで加えられる）によりＰｉｃｈｉａ発現上澄みから沈殿された。沈殿は、ＰＢＳバッファーに再懸濁され、一晩、ＰＢＳに対して透析された。透析に続いて、タンパク質は５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６/６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１１９５−０１）にロードされた。タンパク質は同じバッファーで溶出され、溶出液からの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、興味のあるタンパク質を含む画分がプールされた。次に、このプールされた溶出液は２０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化された１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−５０５３−０１）にロードされた（１ｍＬ/分の流速で）。タンパク質は溶出バッファー（２０ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で、１ｍＬ/分にて２０カラム容量の勾配で溶出した。画分は集められ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。興味のあるタンパク質を含む画分がプールされた。最終純度は還元剤の存在または不存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。融合タンパク質ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ（配列番号２５２）はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、完全長のタンパク質の予想されたＭＷ（１０４ｋＤａ）に対応するバンドと共に９０％より高い純度を示した。いくつかのダイマー（総タンパク量の＜１０％）が存在したが、ＤＴＴの存在で除去された。融合タンパク質ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ（配列番号２５２）はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、完全長のタンパク質の予想されたＭＷ（１０４ｋＤａ）に対応するバンドと共に、９０％より高い純度を示した。いくつかのダイマー（総タンパク量の＜１０％）が存在したが、ＤＴＴの存在で除去された。
Ｓｅｌｅｘｉｓ／ＣＨＯ発現系におけるタンパク質の発現とクロマトグラフィーによるその後の精製。
興味のあるタンパク質を発現する安定したＳｅｌｅｘｉｓ ＣＨＯ細胞株は、振盪培養器で５〜８％のＣＯ２、３７℃にて無血清培地で培養された。成長に使用される培地は：１ＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ登録商標 ＣＤ ＣＨＯ Ｆｕｓｉｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ、１４３６５Ｃ−１０００ＭＬ）、４０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０−０８１）、１０ｍＬの１００Ｘ ＨＴ補完剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０６７−０３０）であった。細胞の播種密度は０．３〜０．５×１０６細胞／ｍＬであった。いったん２〜４×１０６細胞／ｍＬに達すると、希望の培養液量（６Ｌ）に達するまで、培養物が希釈された。Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ溶液（１ＬのｄｄＨ２Ｏ、３５ｇのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５（ＨｙＣｌｏｎｅ、３０８６５．０１）、２０ｇのＤ−グルコース、ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整)は、最終的な大きい培養物に、播種した３〜５日後に（Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔの量＝培養物の７−１２％）加えられた。興味のある分泌タンパク質を含む細胞上清が、培養物生存率が９０％より下に下降すると（培養物をその最終容量に希釈した後〜１週間）、すぐに採取された。細胞上清が遠心分離によって採取され、滅菌ろ過された。精製が１週間以内に実施される場合は、上清は４℃で保存され、そうでなければ、上清は−８０℃で保存された。
融合タンパク質ａＤＮＡＳＩ１（Ｌ２３）＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）（配列番号１１０、１１１）、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号２４６、２４７）、ＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）（配列番号２４８、２４９）は下記の方法で精製された。Ｓｅｌｅｘｉｓ／ＣＨＯ発現からの上澄みは、ｄｄＨ２Ｏで１：０．５に希釈され、５ｍＬ Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに２回通された。タンパク質は４５ｍＭオクタン酸ナトリウを含むバッファーで希釈され、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質は、次に、ｄｄＨ２Ｏで１：１に希釈し、１ｍＬのＱ陰イオン交換カラムにロードされて、緩やかな勾配（勾配＝１０％Ｂ、Ａ＝１：１ ＰＢＳ：水、Ｂ＝ＰＢＳ中の１Ｍ ＮａＣｌ、ＰＢＳ＝標準Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ、Ｍｇ／Ｃａなし）で溶出した。興味のあるタンパク質を含む画分はプールされ、アリコート中で凍結された。最終的な純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価された。すべての精製タンパク質が、９０％より高い純度を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドに泳動した。図１４は予想された１１４ｋＤａのＭＷにおける単一のバンドを有するａＤＮＡＳＩ１（Ｌ２３）＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）（配列番号１１０）融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した。図１５は予想された１０２ｋＤａのＭＷにおける単一のバンドを有するＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＩＧＦ１（配列番号２４６）融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した。図１５は予想された１１５ｋＤａのＭＷにおける単一のバンドを有するＤＡｓｃＦｖ＿ｍＨＳＡ＿ＨＧＦ（ＮＫ１）（配列番号２４８）融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した。
実施例６ 二重特異的融合タンパク質の損傷細胞への特異的結合
標的化ドメイン、半減期モジュレータ、および活性化ドメインを含む融合タンパク質が作成され、標的化ドメインを通してｉｎ ｖｉｔｒｏでの損傷細胞に特異的に結合するその能力が検証された。使用される標的化ドメインは、アポトーシスの間、外側の細胞表面で露出されるようになるホスファチジルセリンに結合する、ヒトアネキシンＶ（ＡｎｘＶ、配列番号３１）であった。特異的結合は、異なる活性化ドメインをもつ融合タンパク質、および異なる融合方向性（例えば、Ｎ−末端活性化ドメインとＣ−末端標的化ドメイン、およびＮ−末端標的化ドメインとＣ−末端活性化ドメイン）による融合タンパク質を含む、さまざまな融合タンパク質に示された。特異的結合はまた、心筋細胞およびと胚幹細胞由来（ＥＳＣ由来）心臓細胞を含む、異なる細胞型の損傷細胞への結合も示した。いくつかの場合、心筋梗塞後のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞損傷状態を模擬するための酸化的ストレスを誘導するため、細胞は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で損傷された。アネキシンＶの非結合性変異体（ＡｎｘＶｍ１２３４、配列番号８４）含む融合タンパク質は、損傷細胞に結合せず、融合タンパク質の結合がアネキシンＶ標的化ドメインによって調節されたことを示した。全体的に見て、これらのデータは融合された標的化ドメインの特異的結合を通して、活性化ドメインを特異的に損傷細胞に送達する融合タンパク質の能力を示す。
細胞への融合タンパク質の結合はフローサイトメトリーを使用して観察された。アポトーシス細胞死は過酸化水素Ｈ２Ｏ２）処理からの酸化的ストレスによって誘導された。アポトーシスを起こした細胞または死細胞が、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）での標識化、または蛍光アネキシンＶを基にした市販のアポトーシス検出キットによる標識化により同定された。いくつかの場合、融合タンパク質はまず、後の検出のために蛍光染料で、共有結合で標識化された。これらの場合において、融合タンパク質の非結合性変異体で培養された同等な細胞が、ＰＩ陽性であるが融合タンパク質蛍光陰性である一方、アポトーシスを起こした細胞への融合タンパク質の特異的結合は、ＰＩおよび融合タンパク質蛍光の両方に陽性である細胞を観察することにより示された。他の場合において、融合タンパク質は最初に共有結合で標識化されず、代わりに、タンパク質融合で半減期モジュレータに結合する蛍光標識された二次抗体が、融合タンパク質の検出のために使用された。これらの場合では、アポトーシスを起こした細胞への融合タンパク質の特異的結合は、市販のアネキシンＶを基にした検出キットからの蛍光シグナルの量と、融合タンパク質二次抗体からの蛍光シグナルの量の間の強い相関関係を示すことにより、示された。
Ａ．ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶのアポトーシスを起こした心臓細胞への特異的結合。
融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号１３８）は、実施例５に記載の通り、発現され、精製された。両方のタンパク質は、製造者の指示に従い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８マイクロスケールタンパク質標識化キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３０００６）で共有結合で標識化された。ＨＬ−１細胞（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ． Ｃｌａｙｃｏｍｂ、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ）、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン／フィブロネクチンでプレコートされた９６ウェルのプレート（ＢＤ／Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７２）に、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、 １２１０３Ｃ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１５０７０）および０．１ｍＭノルエピネフリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ０９３７）を含む完全培地（Ｃｌａｙｃｏｍｂ培地（Ｓｉｇｍａ、５１８００Ｃ）中に１：３で播種され、３７℃および５％のＣＯ２で培養された。２日後に、細胞に、４００ｕＭ Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ、 Ｈ１００９）が補足された培地０．１ｍＬ／ウェルが供給され、３７℃および５％のＣＯ２で１５分間培養された。次に、Ｈ２Ｏ２が補足された培地を各ウェルから吸引し、完全培地に置き換え、細胞は３７℃および５％のＣＯ２で２０〜２４時間培養された。翌日、離れた細胞を集めるため、各ウェルからの培地が９６−ｄｅｅｐｗｅｌｌ ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレート(ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８９６−１１１０）に移された。細胞は１回、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）で洗浄され、次に、４０μＬの０．０２５％ トリプシン−ＥＤＴＡを使用してトリプシン処理され、３７℃の培養器に置かれた。細胞分離は顕微鏡で監視され、トリプシンを非活性化するために１０％ＦＢＳを加えた１００ｕＬ／ウェルのＤＭＥＭが加えられた。細胞は冷ＰＢＳで洗浄され、１００μＬの結合バッファー（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６５４７の成分）に再懸濁された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識化融合タンパク質が次いで添加され、氷上で１時間、暗所で培養された。アポトーシスを起こした細胞の陽性対照検出は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６５４７)を用いて得られた。どちらの場合も、３μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が培養の最終１５分で添加された。細胞はＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータで、適切な非染色および単一染色（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔａｉｎ）された対照を較正のために使用して、分析された。
アポトーシスを起こした細胞は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓアポトーシス検出キットからのアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で共標識（ｃｏ−ｌａｂｅｌ）された（図２および３）。５６％の細胞は、アポトーシスまたは細胞死の遅延を示す、二重陽性の象限にあった。陽性および陰性の集団は適正に分離された。
ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号１３８）は、それぞれ、７．１および８．１ｍｏｌ染料／ｍｏｌタンパク質の標識化度（ＤＯＬ）を達成して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８でそれぞれ標識された。アポトーシスを起こした細胞はまた、８０ｎｇ（７．１ｎＭ）のＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶおよびＰＩ（図４および５）、または８０ｎｇ（７．１ｎＭ）のＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４およびＰＩ（図６および７）で共標識された。ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶによって標識された細胞は、融合タンパク質がアポトーシスを起した細胞または死細胞に特異的に結合したことを示す、アポトーシス検出キットの陽性対照と非常に類似した、非常によく分離された二重陽性のピーク（細胞の５３％）を示した。他方では、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４によって標識された細胞は二重陽性のピークを示さず（細胞の０％）、これは非結合性標的化アームが、計画されたようにアポトーシスを起した細胞または死細胞に結合しなかったことを示した。まとめると、これらのデータは、標的化ドメインとしてのアネキシンＶ（ＡｎｘＶ）を含む融合タンパク質がアポトーシスを起したまたは死滅した心臓細胞に特異的に結合でき、従って、障害をうけたまたは損傷した心臓組織を治療するために、活性化ドメインなどの生物学的（例えば、治療法の）効果を有する融合剤または分子を送達するために使用され得ることを示した。
Ｂ．ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶのアポトーシスを起こした心臓細胞への特異的結合。
実施例６Ａで観察された、アポトーシスを起した心臓細胞への結合がＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質のＡｎｘＶ標的化ドメインに特異的であり、細胞表面ＩＧＦ受容体へのＩＧＦ１ドメインの結合の結果でないことを検証するため、いかなる／全てのＩＧＦ１細胞表面受容体を飽和および遮断するためのＩＧＦ１予備培養工程を含めた実験を繰り返した。Ｈ２Ｏ２濃度を２００μＭとした以外は、実施例６Ａと同じ方法を用いた。加えて、結合バッファーへの細胞の再懸濁の後に、しかしＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識された融合タンパク質の添加の前に、いかなる／全てのＩＧＦ１細胞表面受容体を予備遮断するために、８００ｎＭのＩＧＦ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、４０７２４０）が添加され、１０分間培養された。
図８および９におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ陽性対照は、約４０％が、遅延されたアポトーシスまたは細胞死の集団を示す、二重陽性であることを示した。図１０および１１は、実施例６Ａに示されたように、非結合性対照融合、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４が結合を示さなかった（図１２および１３）一方で、アポトーシスを起した細胞へのＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの結合を示した。次に、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが感知され得る程度にＩＧＦ１ドメインを通して細胞に結合しなかったことを示すために、アッセイはＩＧＦ１遮断工程を加えて繰り返された。図１４および１５は、過剰なＩＧＦ１の存在下、およびそこでの培養後でさえ、アポトーシスを起した細胞とＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの結合を示した。これらのデータは、ＡｎｘＶ標的化ドメインが、タンパク質融合体のアポトーシスを起した細胞への特異的結合に関与することを示した。
Ｃ．ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡの、アポトーシスを起したＥＳＣ由来心臓細胞への特異的結合。
ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ（配列番号２５２）およびＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ（配列番号２５０）は、製造者の指示に従って、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−２０００６）に直接結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された。胚幹細胞由来（ＥＳＣ由来）心臓細胞（Ｐｅｔｅｒ Ｚａｎｄｓｔｒａ ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）は、本質的にはＹａｎｇ ｅｔ ａｌ （Ｎａｔｕｒｅ ２００８， ４５３：５２４−８）に記載の通りに得られた。Ｂａｕｗｅｎｓ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ． ２０１１ Ａｐｒ ２５．， Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．”からプロトコルを得た。凝集を基にしたｈＥＳＣｓの分化が、以前に記載した心筋系列への分化に向けられる、無血清のプロトコルを使用して実施された。ＨＥＳＣ凝集体サイズは、マイクロウェルの加工された表面（ｔｅｘｔｕｒｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）を含む、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ＴＭインサート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、定められた細胞濃度での強制的な凝集によって制御された。簡潔に、フィーダー枯渇ｈＥＳＣの単一細胞懸濁液は１０００細胞／ウェルの密度でＡｇｇｒｅｗｅｌｌに沈降された。細胞は低酸素状態で、ＲＯＣＫ阻害剤および０．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４の添加と共に、基本培地としてのＧｌｕｔａｍａｘ、アスコルビン酸、トランスフェリン、ペニシリン／ストレプトマイシンが補足されたＳｔｅｍＰｒｏ３４中で一晩凝集させた。１日目に、培地は、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、３ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、および５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦをもつ基本培地で置き換えられた。４日目に、細胞はマイクロウェルから取り出され、ＤＭＥＭ Ｆ１２で洗浄され、５％ＫＯＳＲを補足して、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１５０ｎｇ／ｍｌのＤｋｋ１をもつ基本培地中の低クラスタプレートに移された。８日目に、培地を１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌのＤｋｋ１、および５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦをもつ基本培地で置き換えられた。１２日目に、再び培地を置き換え（同じサイトカイン）、１６日目までに細胞を正常酸素圧条件に移した。
ＰＩ標識およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出キットに基づき、Ｈ２Ｏ２またはドキソルビシン処理なしでも、心臓細胞は測定可能なアポトーシスを起した集団を示す（図１６）。ドキソルビシンの更なる添加はアポトーシスを起した画分を増加させなかった。それにもかかわらず、アポトーシスを起した細胞集団はアポトーシス標的化融合タンパク質の結合を試験するのに十分であった。心臓細胞集団はまた、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出キットで共培養される間、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡまたはＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡのどちらかと共に培養された。ＡｎｘＶｍ１２３４＿ｍＨＳＡ融合からではなく、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合でのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からの蛍光シグナルは、アポトーシス検出キットからのＦＩＴＣシグナルと強く相関し（図１７）、これはＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡがアポトーシスを起したＥＳＣ由来心臓細胞に特異的に結合することを示した。
Ｄ．ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）の、アポトーシスを起したＥＳＣ由来心臓細胞への特異的結合。
アポトーシスを起したＥＳＣ由来心臓細胞との融合タンパク質ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（配列番号１２０）の結合は、共有結合している蛍光色素分子での融合タンパク質の第一の改変の代わりに、二次検出計画を使用することで示された。融合タンパク質は製造者の指示に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−２０００６）によってそれ自身が共有結合で標識された抗ＨＳＡ抗体（アフィニティー精製したヤギ抗ヒトアルブミン抗体、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ、Ａ８０−１２９Ａ）を使用して検出された。心臓細胞は実施例６Ｃに記載の通り、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出キットで共培養される間、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）と培養された。融合タンパク質は抗ＨＳＡ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体により検出された。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からの蛍光シグナルは、アポトーシス検出キットからのＦＩＴＣシグナルと強く相関した（図１８）。これはＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）がアポトーシスを起したＥＳＣ由来心臓細胞に特異的に結合することを示した。さらに、融合タンパク質を除いた（図１８の「リガンドなし」）が、二次検出試薬でまだ培養された対照実験は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７シグナルとアポトーシスを基にするＦＩＴＣ信号に少しの相関関係も示さず、これは、元のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７蛍光シグナルが二次抗体単独での結合によるものではなく、融合タンパク質自身の結合によるものであることを示した。
実施例７． 融合タンパク質のそれらの標的への特異的結合
患者の疾患関連領域に治療額を局所化するプロセスは、興味のある領域に制限されるかまたは特に豊富である分子エピトープを標的とすることによって達成できる。例えば、心筋梗塞は、この目的に利用できる、組織損傷の数個の標的分子（例えば、ＤＮＡ、心臓ミオシン、およびホスファチジルセリン）を露出できる。いくつかの融合タンパク質が、これらの標的分子に特異的な標的化ドメインを含むように作成された。特に、アネキシンＶおよびシナプトタグミンはホスファチジルセリンを標的とするために使用でき、ＳＩ−１一本鎖可変断片（ａＤＮＡＳＩｓｃＦｖ）はＤＮＡを標的とするために使用できる。しかしながら、当業者は、融合タンパク質に結合ドメインを含めることが各々の個々のドメインの特性の欠失または変化（例えば、結合親和性の変化、生物活性の変化）をもたらし得ることを理解するであろう。本明細書に開示された融合タンパク質の機能性が維持されるかどうかを決定するため、ＥＬＩＳＡを基にしたｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合テストが開発され、適用された。本質的には、アッセイは、標的化に適した融合タンパク質が、ウェル表面に覆われた同族の標的分子とのそれらの相互作用によって、激しい洗浄にも関わらず、マイクロプレートウェルに保持されたことを示した。融合タンパク質の存在は免疫化学的に定量された。同族の標的分子が存在しない、または同族でない標的分子が存在するとき、予期しない標的化ドメインの交差反応の不存在下で、保持は予想されなかった。同族の標的分子のあるときの保持、およびないときのクリアランスの組み合わせは、結合特異性および標的化機能の証拠であった。
マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５０４１）は、興味のあるエピトープでコーティングされた。ホスファチジルセリン（ＰＳ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ ８４００３２）は、５０μＬ／ウェルの１２．５μｇ／ｍＬのメタノール中の溶液を蒸発して乾燥することにより被覆された。ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｄ３６６４）は、１０μｇ／ｍＬのＤＮＡおよびＤＮＡ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ １７２５０）の予備混合された１：１の溶液の５０μＬをウェルに添加することにより、被覆された。ミオシンは、ＤｕｂｌｅｃｃｏのＰＢＳ中の１０ｇ／ｍＬ溶液を培養することにより、被覆された。全ての被覆反応が室温にて２時間、２００ｒｐｍで振動しながら実施された。洗浄の後、２５０μＬ／ウェルでタンパク質なしの遮断バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ ３７５７２）が加えられ、プレートは室温で３〜４時間培養された。さらなる洗浄の後、１００μＬのクロマトグラフィー精製融合タンパク質が、１６０ｎｇｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でウェルに加えられた。結合は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４中で、室温で２時間進行した。さらなる洗浄の後、１００ｕＬの検出抗体（ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトアルブミン抗、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ Ａ８０−１２９Ｐ）が、各々ＰＢＳＴで１：５，０００または１：５０，０００の希釈度でウェルに添加され、３０〜６０分間培養された。さらなる洗浄の後、７５μＬのペルオキシダーゼ基質（Ｐｉｅｒｃｅ ＴＭＢ Ｕｌｔｒａ３４０２８）がアプライされ、有意な着色を観察して、反応は７５μＬのＳｔｏｐ溶液（ＫＰＬ５０−８５−０５）でクエンチされた。ウェルの吸光度はプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｍ２００ Ｐｒｏ）で４５０ｎｍにて読みとられた。すべての融合タンパク質および抗体の組み合わせは三重で実施された。すべての洗浄工程は、自動化９６ウェルプレート洗浄器（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｅｌｘ４０５）を用いて、サイクルの間に、５秒の浸漬のある２５０μＬのＰＢＳＴ投入および吸引、および振盪工程がある工程の４サイクルで構成された。模擬コートされた空のウェル（溶媒、コート試薬、またはバッファーのみ）および融合タンパク質のないウェルは陰性対照として含まれた。
融合タンパク質は、実施例５で詳述されるように、作成された。ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｓｙｔ１（配列番号１５２）およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）はホスファチジルセリンに特異的に結合することを示した（図１９）。ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号１２４）、ａＤＮＡＳＩ１＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２６）、および、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ａＤＮＡＳＩ１（配列番号１５４）は、ＤＮＡに特異的に結合することを示した（図２０）。
融合タンパク質は、標的分子と特異的に結合することを示し、これは標的化ドメインを半減期モジュレータおよび活性化ドメインに融合したあとで、機能的な結合の保持を示し、さらにまた融合タンパク質に融合される能力を有する標的化ドメイン（ならびに標的）の幅を実証する。ホスファチジルセリンなどの特定の標的はアネキシンＶおよびシナプトタグミンなどのさまざまな結合ドメインに対処し得る。逆に、ａＤＮＡＳＩ１がそのメンバーである、抗体由来ｓｃＦｖのような、特定のタンパク質のクラスは、対応する多種の標的分子またはエピトープに結合するメンバーの大きな多様性を有する。融合タンパク質へのｓｃＦｖの成功した組み込みは、他の融合タンパク質における抗体由来標的化の応用の可能性を示すものである。ａＤＮＡＳＩ１ドメインはさらに、Ｎ−またはＣ−端末融合方向性のいずれにおいて、ならびに様々な活性化ドメインを含む融合において機能的であることが示された。総合すると、これらの結果は、融合タンパク質の標的化が、特定の標的エピトープ、特定の標的化ドメインのクラス、特定の翻訳方向性、または特定の活性化ドメイン含有分子制限されないであろうことを確証する。
実施例８．細胞活性の改質
精製融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激細胞において下流のシグナル伝達を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで示された。融合タンパク質の有効性は野生型、非融合活性化ドメインのものと比較された。異なる活性化ドメイン、異なる標的化ドメイン、および異なる融合方向性があるさまざまな融合タンパク質が作成され、生物活性を示した。これらのデータは、融合タンパク質が生物活性であり、生存促進または増殖の経路などの細胞経路にシグナル伝達できるように作成できることを示す。
各融合タンパク質は陽性対照、市販で得られた非融合型のその活性化ドメイン、と並んで試験された。活性標的化ドメイン（例えば、ＡｎｘＶ）ならびに非結合対照標的化ドメイン（例えば、ＡｎｘＶｍ１２３４またはＤＡｓｃＦｖ）のある融合タンパク質の両方が使用され、活性化ドメインの活性が標的化ドメインの固有性および機能から独立していることが示された。刺激されるべき細胞が生育され、血清飢餓し、その後融合タンパク質で刺激された。次に、タンパク質は洗い流され、細胞活性はホスホ−Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）またはホスホ−Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）のいずれかのためにＥＬＩＳＡによって測定された。
Ａ．ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質を用いる癌細胞でのＡＫＴ活性の刺激。
実施例５に記載のように、融合タンパク質ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１４２）およびＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）（配列番号１２０）が作成された。野生型ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（３９６ＨＢ/ＣＦ）から入手された。ＤＵ１４５細胞、ヒト前立腺癌、上皮性細胞は、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）および５０Ｕ/ｍＬペニシリン＋５０ｕｇ/ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１５０７０）を含む完全培地ＲＰＭＩ−１６４０（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１１８７５））中で、９６ウェルプレート（ＢＤ/Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７２）に２５，０００の細胞／ウェルで播種されて、一晩、３７℃および５％のＣＯ２で培養された。翌日、培地が吸引され、細胞は０．１ｍＬ／ウェルのＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムのない、Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）で洗浄され、細胞は０．１ｍＬ／ウェルのＲＰＭＩ−１６４０＋０．５％のＦＢＳで再供給され、細胞は２０〜２４時間、３７℃および５％のＣＯ２で培養された。翌日、細胞は、既存の０．１ｍＬ／ウェルに２５μＬ／ウェルで添加する希釈された融合タンパク質または対照タンパク質で３７℃および５％ＣＯ２で１０分間刺激された。刺激はウェルから培地を吸引して停止され、０．２ｍＬ／ウェルの冷ＰＢＳで洗浄された。細胞はあらかじめ調製された、２５μＬ／ウェルの完全Ｍ−ＰＥＲ溶解バッファー（哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７８５０１）１５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ、０４ ６９３ １２４ ００１）、およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ＰｈｏｓＳＴＯＰ、０４ ９０６ ８３７ ００１））で溶解された。プレートは密封され、細胞はオービタルシェーカーで４℃にて３０分間溶解され、溶解物はドライアイス上で寒気凍結され、−７８℃で保管された。３８４ウェル平滑白色プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、４６０３７２）が、抗Ａｋｔ捕捉抗体（ｃｌｏｎｅ ＳＫＢ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−５９１）でコートされ、密封され、室温で一晩保管された。
翌日、細胞溶解物が解凍され、ＥＬＩＳＡプレート洗浄および遮断された。解凍された溶解物はプールされ、ＥＬＩＳＡプレートは再度洗浄され、Ａｋｔ標準またなプールされた溶解物がＥＬＩＳＡプレートに加えられ、プレートは室温で２時間培養された。ＥＬＩＳＡプレートは洗浄され、抗ホスホ−Ａｋｔ検出抗体（ビオチニル化したマウスｍＡｂ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５１０２）が加えられ、プレートは１．５時間室温で培養された。プレートは洗浄され、そして、ストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８９０８０３）が添加され、プレートは３０分間、室温で培養された。プレートは再度洗浄され、基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７０６９）が添加され、蛍光がプレートリーダーで読み取られた。ｐＡｋｔ標準曲線は直線（両対数スケール）に合わせられた。
ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）およびＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの活性は図２１に示される。市販野生型ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）と融合タンパク質の両方が、ｐＡｋｔ経路を刺激する、生物活性を示した。同様に、図２２は野生型および逆方向融合タンパク質、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）の活性を示す。これらの結果は、ＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）活性化ドメインからｍＨＳＡおよびＡｎｘＶに翻訳されるように融合しても、実施例５で発現および精製されたＮＲＧ１ｂ（ＥＧＦ）融合タンパク質が生物活性であるのと同様に、その生物活性が無効にならなかったことを示す。
Ｂ．ＩＧＦ１融合タンパク質を用いる癌細胞でのＡＫＴ活性の刺激。
融合タンパク質、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号１３８）、およびＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿Ｂ７ｓｃＦｖ（配列番号１５０）は、実施例５に記載の通り作成された。野生型ＩＧＦ１はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（４０７２４０）から入手された。ＤＵ１４５細胞は、実施例８Ａに記載の通り、生育され、刺激された。３個すべてのＩＧＦ１を基にしたタンパク質融合が、ＤＵ１４５癌細胞で、野生型ＩＧＦ１と同様のｐＡｋｔ刺激で、生物活性を示した（図２３〜２４参照)。
Ｃ．ＩＧＦ１融合タンパク質を用いる心臓細胞でのＡＫＴ活性の刺激。
融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）は、実施例５に記載の通り作成された。野生型ＩＧＦ１はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（４０７２４０）から入手された。ＨＬ−１細胞（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ． Ｃｌａｙｃｏｍｂ、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ）、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン／フィブロネクチンでプレコートされた９６ウェルのプレート（ＢＤ／Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７２）に、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、 １２１０３Ｃ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１５０７０）および０．１ｍＭノルエピネフリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ０９３７）を含む完全培地（Ｃｌａｙｃｏｍｂ培地（Ｓｉｇｍａ、５１８００Ｃ）中に６０，０００細胞／ウェルで播種され、３７℃および５％のＣＯ２で一晩培養された。細胞は実施例８Ａに記載の通り、洗浄され、ＥＬＩＳＡプロトコルに供された。
ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ融合タンパク質は、心臓細胞に生物活性を示し、その効力は野生型ＩＧＦ１に匹敵する程度であった（用量反応活性、図２５を参照）。これらのデータは、半減期モジュレータと標的化ドメインに融合された活性化ドメインが、作成でき、細胞を強力に刺激する能力を保持できることを示す。
ＦＧＦ２融合タンパク質は心臓細胞のＥＰＫ活性を刺激する。
胚幹細胞（ＥＳＣ、Ｐｅｔｅｒ Ｚａｎｄｓｔｒａ’ｓ ｌａｂ ａｔ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏにより提供された)から得られた心筋細胞は、ゼラチンでプレコートされた９６ウェルプレートに、３８．５Ｘ ＳｔｅｍＰｒｏ−３４栄養補助剤（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地にて提供）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン＋５０ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１５０７０）、０．４ｍＭモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６１４５）、５０ｕｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ａ４５４４）、１５０ｕｇ／ｍＬトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８１５８）、１０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９３−ＶＥ）、１５０ｎｇ／ｍＬ ＤＫＫ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５４３９−ＤＫ）、および５ｎｇ／ｍＬ塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ２、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００−１８ｂ）が補足されたＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１０６３９）中に、４０，０００細胞／ウェルで播種され、３７℃および５％のＣＯ２で一晩培養された。刺激の２４時間前に、増殖培地は栄養補助剤および増殖因子なしのＳｔｅｍＰｒｏ−３４に変更した。細胞は実施例８Ａに記載の通り、刺激され、溶解された。ＥＬＩＳＡにおいて、９６ウェルの高結合性黒色ＥＬＩＳＡプレートがホスホ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１０１８）でコートされ、密封され、室温にて一晩保管された。翌日、溶解物は、ホスホ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２標準（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１０１８）およびホスホ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２検出抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１０１８）が、Ａｋｔ標準と抗ホスホ−Ａｋｔ検出抗体の代わりに活性Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２レベルを測定するために使用されたことを除いて、実施例８Ａに記載の通り、ＥＬＩＳＡプロトコルに供された。融合タンパク質ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ＿ＦＧＦ２（配列番号１１８）は、ｐＥＲＫ ＥＳＣ由来心臓細胞の刺激について野生型ＦＧＦ２と比較され、生物活性を示した（図２６）。
実施例９．アポトーシスを起こした細胞で蓄積する融合タンパク質の蓄積および細胞活性の刺激
融合タンパク質が、その標的化ドメインを通して細胞に特異的に結合し、次にそれらの活性化ドメインを通して細胞のシグナル伝達経路を刺激する能力はｉｎ ｖｉｔｒｏで示された。使用される標的化ドメインは、ヒトアネキシンＶ（ＡｎｘＶ、配列番号３１）であった。ＡｎｘＶはアポトーシスの間、外側の細胞表面に露出されるようになるホスファチジルセリンに結合できる。使用される活性化ドメインは、細胞表面で発現されたＩＧＦ１受容体に結合するＩＧＦ１（配列番号３）であった。いったん結合すると、ＩＧＦ１受容体は細胞内シグナル伝達を開始する。融合タンパク質は、最初に、心筋梗塞後のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の損傷状態を模擬する、アポトーシスを起した心臓細胞に結合された。融合タンパク質結合細胞は、次いで、正常な心臓細胞におけるＩＧＦ１シグナル伝達を刺激するために使用され、これは梗塞域でまたは近くで、損傷または正常な細胞の近傍のシグナル伝達を活性化する融合タンパク質の傍分泌作用を模擬した。ホスホ−Ａｋｔ、ＩＧＦ１シグナルの下流標的、はＥＬＩＳＡによって測定された。細胞結合融合タンパク質は心臓細胞においてＡｋｔシグナル伝達を刺激できた。野生型ＩＧＦ１はＡｋｔシグナル伝達を誘導せず、これは、融合タンパク質のアネキシンＶ標的化ドメインが、シグナル伝達を起すために重要であることを示した。同様に、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合タンパク質はＡｋｔシグナル伝達を誘導せず、これは、標的化ドメイン自身がシグナル伝達に十分でなかったことを示した。まとめると、これらのデータは、標的損傷組織に特異的である能力があること、および傍分泌様形式で活性化ドメインを通じて細胞経路でシグナル伝達を行う能力があるという融合タンパク質の二重機能性を示す。この結果は、正常組織でなく損傷組織に特異的に蓄積され、活性化ドメインを通して生存または再生を調節するという融合タンパク質の治療的な役割を示す。
第一の工程では、融合タンパク質は、アポトーシスを受けているＨＬ１心筋細胞におけるアネキシンＶ−ホスファチジルセリン結合を通して損傷細胞で蓄積できた。アポトーシス細胞死は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）での処理からの酸化的ストレスによって誘導された。損傷細胞への融合タンパク質の結合は、Ｈ２Ｏ２処理細胞の、増殖培地に含まれる分離されたアポトーシスを起している細胞と融合タンパク質を培養することにより実施された。
第二の工程では、細胞結合融合タンパク質の活性化ドメインの生物活性は、刺激をうけた、細胞結合融合タンパク質がある血清飢餓心筋細胞、によってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価された。刺激を停止させるために洗浄した後、刺激細胞における下流のシグナル伝達は、ホスホ−Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）のＥＬＩＳＡにより測定された。融合タンパク質によって誘導されたｐＡｋｔのレベルは、市販で得られた非結合型のものの活性化ドメインならびにアネキシンＶ標的化ドメインを含む融合タンパク質のものと比較された。
融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号１３６）は、実施例５に記載の通り、発現され、洗浄された。ＨＬ−１細胞（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ． Ｃｌａｙｃｏｍｂ、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ）、成熟心筋細胞の特性をもつ心筋細胞株、はゼラチン／フィブロネクチンでプレコートされた９６ウェルのプレート（ＢＤ／Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７２）に、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、 １２１０３Ｃ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、１５０７０）および０．１ｍＭノルエピネフリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ０９３７）を含む完全培地（Ｃｌａｙｃｏｍｂ培地（Ｓｉｇｍａ、５１８００Ｃ）中に１：２で播種され、３７℃および５％のＣＯ２で培養された。翌日、細胞に、４００ｕＭ Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ、 Ｈ１００９）が補足された培地０．１ｍＬ／ウェルが再供給され、３７℃および５％のＣＯ２で１５分間培養された。次に、Ｈ２Ｏ２が補足された培地を各ウェルから吸引し、完全培地に置き換え、細胞は３７℃および５％のＣＯ２で２０〜２４時間培養された。翌日、離れた細胞を集めるため、各ウェルからの培地が９６−ｄｅｅｐｗｅｌｌ ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレート(ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８９６−１１１０）に移された。各試料に、３個のウェルからの培地が９６−ｄｅｅｐｗｅｌｌ ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレートの１個のウェルにプールされた。集められた細胞は次に、カルシウム（結合バッファー、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットの成分、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６５４７）の存在下で、融合タンパク質と、３７℃および５％のＣＯ２で１５分間培養された。融合タンパク質結合細胞は遠心分離によりペレット状にされ、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８５３７）で１回洗浄され、その後、細胞はカルシウム（結合バッファー）を含む１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに再懸濁された。ゼラチン／フィブロネクチンでプレコートされた９６ウェルのプレートに播種され、あらかじめ血清飢餓とされたＨＬ−１細胞は、次いで１００μＬ／ウェルの再懸濁された融合タンパク質結合細胞で２０分間刺激された。刺激された細胞は、次いで、実施例５に記載の通り洗浄され、ＥＬＩＳＡプロトコルに供された。Ｈ２Ｏ２にさらされなかった正常なＨＬ−１細胞も、また、４０μＬ／ウェルの０．０２５％ トリプシン−ＥＤＴＡを使用するトリプシン処理により採取され、３７℃の培養器に置かれた。細胞分離は顕微鏡で監視され、トリプシンを非活性化するために１０％ＦＢＳを加えた１００ｕＬ／ウェルのＤＭＥＭが加えられた。各々の試料について、３個のウェルからのトリプシン処理細胞が９６−ｄｅｅｐｗｅｌｌ ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレートの１個のウェルにプールされた。細胞は冷ＰＢＳで洗浄され、３００μＬのＤＭＥＭで再懸濁された。細胞は、次に、カルシウムの存在下で、播種され、あらかじめ血清飢餓とされたＨＬ−１細胞を用いて、上記の通りの処理で、融合タンパク質と培養された。細胞は実施例８Ａに記載の通り、洗浄され、ＥＬＩＳＡプロトコルに供された。
ホスホ−Ａｋｔレベルの増加は図２７に示されているように、標的（ＡｎｘＶ）および活性化（ＩＧＦ１）ドメインの両方を含むアポトーシスに（ａｐｏｐｔｏｔｉｃａｌｌｙ）捕捉された融合タンパク質によって刺激された細胞においてのみ観察された。野生型の、非融合ＩＧＦ１は、おそらく、ＩＧＦ１がアポトーシスを起こした細胞と結合せず、それゆえ捕捉されたかったため、細胞を刺激できなかった。融合タンパク質および野生型ＩＧＦ１の両方には、実施例４Ｃに示されるように同等な活性を有し、それゆえ、捕捉された融合タンパク質によるホスホ−Ａｋｔレベルの増加は、それらの効力の違いによるものではなかった。非融合ＩＧＦ１は理論上はアポトーシスを起こした細胞表面に発現したＩＧＦ１受容体と結合できたが、シグナル伝達を保持するための増殖因子が不十分のようであったか、増殖因子が、シグナル伝達に利用できない形で保有されていた。同様に、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合タンパク質は細胞を刺激できなかった。実施例６に示されているように、ＡｎｘＶ＿ｍＨＳＡ融合タンパク質はアポトーシスを起こした細胞に結合できた一方で、活性化ドメインを欠いていたので、傍分泌様の形でシグナル化はできなかった。おそらく、正常細胞は、融合タンパク質の捕捉のための、細胞表面に露出されたホスファチジルセリンを有しないため、ホスホ−Ａｋｔレベルの増加は未処理の細胞と予備混合されたいかなるタンパク質によって刺激された細胞の中に検出されなかった。同様に、正常細胞の細胞表面のＩＧＦ１受容体に結合することができるが、増殖因子の捕捉は、細胞を刺激するために十分ではなかった。まとめると、データは融合タンパク質の同時の標的化および活性化関数を示す。
実施例１０． 損傷心臓組織への融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの標的化
。
われわれは、アポトーシスを起こしたおよび壊死した細胞でＡｎｘＶ標的化ドメインを通してホスファチジルセリンに特異的に結合する、融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（配列番号：１３６）が、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（配列番号：１３８）（ホスファチジルセリンと結合しない変異体）よりも、心筋梗塞の次の損傷した心臓組織において長期間蓄積するであろうという仮説を試験した。実験的な心筋梗塞（ＭＩ）はマウスで誘導され、そして、被験物質は静脈に注入され（ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４、またはビヒクルのみの対照のいずれか）、動物は１２時間２４時間または７２時間後に殺処分され、心臓の梗塞した、境界域、および遠隔（無損傷の）領域でのタンパク質の蓄積がＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学により観察された。免疫組織化学は、投与後２４時間で、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが梗塞の縁の境界域に局在し、一方で結合性がない変異体のいずれも梗塞、境界域、または遠隔（正常な）領域で見られないことを示した。ＥＬＩＳＡのデータは、標的タンパク質、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、が、結合性がない変異タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４よりも、より大きい範囲および長期間心臓の梗塞域および境界域に蓄積することを示した。これらのデータはＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、原型的な標的融合タンパク質、の、心筋梗塞に続く、損傷心臓組織に特異的に蓄積して、持続し、融合された活性化ドメインの特異的送達を可能にする、能力を示す。
実験的な心筋梗塞（ＭＩ）は、以下で詳細に説明されるように、左冠状動脈の血管結紮でマウスに誘導された。６０分後に、血管結紮を除去し、心臓の再かん流を起こした。ＭＩの２２時間後、尾静脈における注射で被験物質またはビヒクル対照の投与を行った。１群あたり１５匹のマウスに以下を投与した：

群１：ビヒクルのみの対照

群２：１５μｇのＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ

群３：１５μｇのＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４

各々の群で、５匹のネズミがそれぞれの以下の時に殺処分された：投与後１２、２４および７２時間。それぞれの群／時点において、心臓の梗塞領域またはその境界領域におけるＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶまたはＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４に特異的な抗ＨＳＡシグナルを特定するという目標のために、３匹の動物が免疫組織化学のために、２匹がＥＬＩＳＡのために準備された。詳細なプロトコルは以下の通り。
動物の作業はＶｉｖｉＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡで賃貸された実験室で、Ｂｉｏｔｒｏｆｉｘ Ｉｎｃ.によって実施された。プロトコルがＶｉｖｉＳｏｕｒｃｅ ＩＡＣＵＣにより審査・承認されて、すべての動物福祉に関する事項が記述され、記録された。９０匹のオスのＣ５７/Ｂ６、１２週齢のマウスが研究の７〜１０日前に注文された（予備研究での１５匹を含む、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。食物と水の自由な摂取が許容された。識別番号は、尾に油性マーカーを用いることによって動物に割り当てられた。動物は研究の前日に観察され、不健康に見えるものは除かれた。動物は除菌空気が２１±２℃および５０％±２０％の相対湿度で提供された部屋に収容された。部屋はオン、そして、薄明なしの１２時間オンおよび１２時間オフの照明／闇サイクルの自動タイマー上にあった。高品質なトウモロコシの穂軸、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ’ｓ登録商標１／４、は寝床として使用され、Ｂｉｏ−Ｈｕｔｓ登録商標 ｆｏｒ Ｍｉｃｅ（ＢｉｏＳｅｒｖ Ｋ３３５２）またはＲｕｎｎｅｌ登録商標（ＢｉｏＳｅｒｖ Ｋ３３２２、Ｋ３３２３）が各々のケージに置かれた。動物はＬａｂ Ｄｉｅｔ登録商標５００１食事で給餌された。水は自由に供給された。動物はケージあたり４〜６匹収容された。
処置日に、マウスは計量され、麻酔がプレキシグラスチャンバー内で１００％Ｏ２のイソフルレンがある状態で誘導された。マウスは自己調節加温パッドの処置面に置かれた。マウスは、背面で（腹面が上にある状態で）で適所に固定され、適切な大きさのｉｎｔｒａｃａｔｈ（２２Ｇ）を使用して気管内に挿管され、１００％Ｏ２中の１．０〜２．５％のイソフルラン麻酔が維持された。麻酔の処置レベルは足指、踵、尾をつまんだ際の無反応に伴う眼瞼の反射の損失で確認された。
胸郭（背の最も低い面から真向かいの胸骨の右側まで）を剃り、真空で毛を除去し、そして、ｓｅｐｔｉｓｏｌで皮膚を前処理した。皮膚切開は、肋骨に沿って、胸骨から中間の胸郭領域までの左胸部で行われた。肋骨５および６の間の肋間筋は心臓の左側で開かれ、肋骨は戻された。心臓（左室および左心房）が特定され、心嚢が開かれた。左肺は、穏やかに下方に押され、体から除去された。７−０絹縫合糸は、左冠状動脈の周りに取り付けられ、無菌ポリエチレンＰＥ−１０管の〜２ｍｍの断片上で結紮され、心臓は血管結紮の後の蒼白（青白化、虚血に関する証拠として）で観察された。縫合糸の残りの端を切り、虚血時間の６０分後にＰＥ管および絹縫合糸を切り開くことにより、血管結紮を除去した。傷部は、滅菌加温塩水湿潤ガーゼスポンジで切開面を覆うことにより、湿潤が保たれた。いったん縫合糸が取り除かれると、心臓は虚血領域の適切な再かん流を観察された。左肺は、ＰＥＥＰ（終末呼気圧）を用いて再膨張させられ、反対側の肋骨は６−０非吸収性の単繊維ナイロン縫合糸で閉じられた。筋層は６−０吸収性の縫合糸で閉じられ、次いで皮膚が連続的に６−０絹縫合糸での閉鎖が続いた。
ブプレノルフィン（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ登録商標 Ｌｏｔ：１８６５５３０３）が鎮痛（０．０５ｍｇ/ｋｇ、皮下に）のために注入され、イソフルレンが遮断され、マウスは、自発呼吸がいったん起こると抜管され、回復のために補足の加熱のある清潔なケージに置かれた。処置の後、動物は麻酔から回復するまで加熱パッド上に残された。その後、清潔なケージに戻された。その後、処置日（０日目）およびそこから少なくとも１日１回、頻繁に観察された。動物は処置前、−１日目および０日目（処置日）およびその後殺処分まで日ごとに計量された。
適切な濃度の被験物質（上記で定義されたＩＧＦ１群１〜３；エンドトキシンなしのＰＢＳ中の、ビヒクル、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、またはＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４）の１０μＬのアリコートは、使用日まで―８０℃で保管された。エンドトキシンなしのＰＢＳは４℃で保管された。各々の被験物質アリコートは、注入の直前に解凍された。２００μＬのエンドトキシンなしのＰＢＳ（室温）は、被験物質に追加されて、上下に何回かのピペット操作により混合され、次いで、ヘッドスペースがない注射器を使用して、２００μＬが尾静脈を通してＭＩの２２（＋／−１）時間後にマウスに注入された。
指定された時点（投与後、１２、２４、または７２時間）では、マウスは以下の通り安楽死させられた：動物は深いケタミン／キシラジン麻酔に置かれた。処理群あたり３匹の動物について、開胸され、心臓が頂点で穴を開けられた。１５％の約０．１ｍｌのＫＣｌが左室に注入され、動物は標準塩、次いで亜鉛ホルマリンでかん流固定された。心臓は、採集され、２４〜４８時間の間、亜鉛ホルマリン中に保存され、次いで、７０％のエチルアルコールに移されて、４℃で保管された。そして、免疫組織学測定のためにＭａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓに試料を送付した。
処理群あたり２匹の動物について、動物は生理食塩水でかん流された。心臓は分離され、左室は塩水で洗浄された。心臓は、ちょうど左右の心室まで切り取られ、図６．１に示すように、４個の断片として解剖された。断片は集められ、計量され、凍結（液体窒素中で）され、次に、ラベルされたマイクロ遠心チューブ（１チューブあたり１個の試料、それゆえ、１心臓あたり４個の試料）の中に−８０℃で保存され、ドライアイス上で、Ｓｉｌｖｅｒ Ｃｒｅｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓに輸送された。
免疫組織化学およびＥＬＩＳＡの対照実験のための心臓組織を得るため、いくつかの追加のマウスが、上記の処置なしで安楽死させられ、心臓が上記のように切除および洗い流され、そのいくつかにおいては、１５μＬ中の２μｇの融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが直接左室壁に注入された。注入されたタンパク質のあるなしにかかわらず、心臓は免疫組織化学の調製において、上記のとおり固定された。
融合タンパク質の免疫組織学検出
免疫組織化学はＭａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃ.、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ（ＭＡ）、ＧＬＰ準拠の組織病理学実験室で実施された。処理のためのそれらの標準プロトコルおよび特異的タンパク質の検出のための固定組織の染色が使用された。簡潔に、亜鉛ホルマリンで固定された心臓は、心室まで解剖されて、標準系のアルコールおよびキシレンを通して、慣習的に処理された。各心臓がパラフィンに包埋され、、Ｌｅｉｃａミクロトーム上で各々厚さ６ミクロンの断片が作成され、顕微鏡スライドに置かれた。各心臓において、８個の連続して横断する断片が作られ、スライドに置かれ、１００μｍ開けて（ｓｋｉｐ）、他の８個の断片が作られ、１００μｍ開けて、これが心臓の長さを通して繰り返された。
各々の８セットからの２個のスライドが、１個は形態学を明らかにするためにＨ＆Ｅで、他方はＨＳＡ−局在のために抗−ＨＳＡで、細胞の核を示すためにＤＡＰI対比染色で、染色された。伝統的な過程がＨ＆Ｅ染色に使用された。具体的に、組織は、キシレンで脱パラフィン処理されて、アルコールできれいにされ、水で水和されて、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンで染色された。スライドは、洗浄され、１％の水性エオシンで染色され、一連のアルコールで脱水され、一連のキシレンできれいにされて、カバースリップされた。心臓の様々なレベルの断片を代表するスライドがその後、光学顕微鏡で観察され、梗塞領域を含む断片を探した。
心臓組織におけるＨＳＡ−局在において、Ｈ＆Ｅで染色されたものに隣接した断片は、キシレンで洗浄され、アルコールできれいにされ、水で水和されて、１：２００で希釈したヤギ抗ヒトアルブミン一次抗体と４Ｃで一晩培養され、ＰＢＳで洗浄された。そして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ロバ抗ヤギＩｇＧ、ヤギ抗−ＨＳＡ抗体に対する蛍光標識された抗体、はその後、抗−ＨＳＡ局在の検出のための二時抗体として１：４００希釈で１時間３７Ｃで使用された。スライドは、ＰＢＳで洗浄され、核視覚化のためのＤＡＰＩ染色も含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を使用することでカバースリップされた。
陽性対照において、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが直接注入された心臓からのスライドは、同様に抗−ＨＳＡプロトコルを使用することで処理された。加えて、Ｍａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓは天然のＨＳＡを含む人間の肝組織の試料を、第一の検出抗体のための陽性対照として染色した。陰性対照は、第一の抗ＨＳＡ抗体を除外しながらＨＳＡ−局在のために処理された直接注入されたマウス心臓およびをＨＳＡ−局在のために通常に処理されたナイーブな心臓（融合タンパク質露出がない）を含んだ。
融合タンパク質のＥＬＩＳＡ検出
心臓あたり４個の試料（図２８）が以下のＥＬＩＳＡのために調製された。試料は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｓａｆｅ−ｌｏｃｋ マイクロ遠心チューブに移され、氷上で解凍された。各チューブに、Ｐｉｅｒｃｅ Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（バッファーに１００倍希釈）を、１：５比の（ｍｇ組織試料）：（ｕＬバッファー）で含むＲＩＰＡバッファーが加えられた。少なくとも１００μＬのバッファーは各サンプルに使用された。ＺＲＯＢ０５およびＺＲＯＢ１０ビーズの１：２比のビーズ：バッファーの５０／５０混合物が加えられた。チューブは速度９に設定されたＢｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ組織ホモジナイザーに置かれ、３分間均質化され、均質化が完全でなかった場合、繰り返された。試料は遠心分離され、そして、各試料で総タンパク量を決定するためのＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ実施するためにアリコートを取った。
酵素免疫測定法（ＥＬIＳＡ）測定は標準方法を使用して行われた。具体的に、１日目に、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄプレートは４℃にて、５０μＬ／ウェルの、１：５０でダルベッコのＰＢＳに希釈された抗−ＨＳＡ被覆抗体で、一晩コーティングされた。２日目に、ウェルは４回、プレート洗浄機（プログラム６）を用いてＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄された。非特異的結合は２時間室温にて２００μＬ／ウェルの無タンパク質遮断バッファーで遮断され、ウェルはプレート洗浄機を用いてＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄された。５０Ｌ／ウェル（９６ウェルプレート）の各々の標準曲線試料または試験試料のいずれかはウェルに加えられた。試験試料はＲＩＰＡバッファー（＋プロテアーゼ阻害剤）で８．７４５ｍｇ/ｍＬの最終総タンパク質濃度に希釈された。プレートは密封され、４℃で一晩培養された。３日目に、ウェルはプレート洗浄機を用いてＰＢＳ−Ｔで４回洗浄され、１００ｕＬ／ウェルの、ＰＢＳ−Ｔで１：２５，０００で希釈されたヤギ抗−ＨＳＡ−ＨＲＰ検出抗体がウェルごとに加えられ、室温で３０分間２２０ｒｐｍの振盪台上で培養され、光から保護された。ウェルはプレート洗浄機を用いてＰＢＳ−Ｔで４回洗浄された。ウェルあたり１００μＬの１−ステップのＵｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ試薬が室温にて加えられ、プレートは室温にて光から保護されて２５分間培養された。１００ｕＬ ＫＬＰ ＴＭＢ停止試薬の添加により、反応は停止された。色は青から黄色に変化する。５分後に、吸光度の読み取りがプレートリーダー上でＡ４５０の波長で行われた。融合タンパク質露出のない組織からの吸光度のためのバックグラウンド値が、上記と同じ手順を用いて作成されたナイーブな心臓の試料から得られた。バックグラウンド値は、違いを得るためにすべての試験試料の吸収値から引かれた。濃度−吸収関係の標準曲線はさまざまな既知量の融合タンパク質でスパイクされた試料から生成された。そして、各試験試料におけるタンパク質濃度は標準の濃度−吸収曲線との比較で決定された。各々の心臓試験試料からの２アリコートは、測定の変動を評価するために測定、これらはＥＬＩＳＡデータ（図２９）に含まれる標準偏差を基礎とする。
使用される融合タンパク質は、実施例５に記載される通りに作成された、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（標的化タンパク質）、とＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（結合性のない変異体）を含む。ビヒクル対照はエンドトキシンなしのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）であった。動物は注文時点で１２週目の、手術の７〜１０日前に順応させられた雄Ｃ５７／Ｂ６マウスであった。免疫組織化学に使用される染料と抗体：一次抗体はアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトアルブミン（ＨＳＡ）交差吸収抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ０８０−２２９Ａロット＃３）であった；蛍光標識された二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０５８）であった；ＤＡＰＩがあるＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３６９３１）。ＥＬＩＳＡに用いられる試薬は、ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓおよび抽出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、８９９０１）；Ｐｉｅｒｃｅ Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＥＤＴＡ−なし（Ｐｉｅｒｃｅ、７８４２５）；Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイキット、２３２２７；Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、 １５０４１）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、２８３７４）；タンパク質なしの遮断バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、３７５７２）；抗−ＨＳＡ被覆抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａ８０−２２９Ａ）；ヤギ抗−ＨＳＡ−ＨＲＰ検出抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ、Ａ８０−２２９Ｐ）；１ステップＵｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３４０２８）；ＫＬＰ ＴＭＢ停止試薬（ＫＬＰ、５０−８５−０５）；タンパク質なしの遮断バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、３７５７２）；組織均質化ビーズ（ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｅａｄｓ）（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ、ＺＲＯＢ０５およびＺＲＯＢ１０）を含んだ。動物手術に用いられる材料は、ブプレノルフィン（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ登録商標 ロット：１８６５５３０３）、イソフルレン、ケタミン、キシラジン、亜鉛ホルマリン、および１５％ＫＣｌを含んだ。
標的化されたおよび非結合変異体の融合タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出は、図２９に要約される。梗塞＋境界領域で測定されたタンパク質は、投与後３種類の時間（１２、２４、および７２時間）にて、標的化（群２）および非結合変異体（群３）融合タンパク質の各々２匹のマウスにおいて心臓の非梗塞領域のタンパク質と比較された。各々の心臓で、試料ＡおよびＢ１遠隔部（図６−１で定義されるように）で測定されたタンパク質が加えられ、心臓の非梗塞領域におけるタンパク質を示す。同様に、試料Ｂ１−梗塞部およびＢ２で測定されたタンパク質が加えられ、周囲の境界領域を加えた心臓の梗塞領域におけるタンパク質を示す。
図２９に示すように、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ、標的化融合タンパク質（群２、黒い棒）は、注入後の１２および２４時間後に同じ動物の心臓の遠隔領域（群２、灰色の棒）におけるレベルと比較して、梗塞領域において高く上昇した。７２時間では梗塞および非梗塞領域の両方で検出されなかった。それに比べて、非結合性変異タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（群３、黒い棒）１２時間でわずかに上昇し、２４時間で減少し、７２時間で検出されなかった。非結合性タンパク質と標的化を比較すると、１２および２４時間の両方で、標的化ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶ（２群、黒い棒）は非結合性のＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４（群３、黒い棒）よりも梗塞＋境界領域で上昇した。これらの結果は、損傷心筋細胞へ（アポトーシスを起こしたまたは壊死した心筋細胞に関するホスファチジルセリンに能動的に結合することにより）標的化する、融合タンパク質ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが、高濃度および非結合性変異体よりも長い時間、実験的ＭＩにより損傷した心臓の領域に入り、維持することができることを示す。さらに、データは標的化融合タンパク質の心臓の損傷領域への特異的局在を示し、ＡｎｘＶ標的化ドメインを通した標的化の有効性を示した。
投与２４時間後の非結合性変異体ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４と比べて、免疫組織化学によるＨＳＡ含有融合タンパク質の局在も、梗塞および境界領域でのＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの、より大きい蓄積を示した。図３０は梗塞および周囲の組織の形態学、ならびに梗塞の周囲の、梗塞の端部および境界領域でのＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶに特異的な陽性染色を示す。左上：形態を示すＨ＆Ｅ染色。梗塞領域は、黒い曲線によって区画された縁の中央であり、生存は左上および右下である。（２００×倍率）右上：この領域の連続切片はＨＳＡ含有タンパク質のために同じ倍率で染色された。赤はＨＳＡ局在を示し；青は細胞核のＤＡＰＩ染色を示す。同じ領域の、より高い倍率の画像は、左下（４００×）および右下（６００×）に示される。損傷組織の縁（中間の厚さの矢印）での心筋細胞（細い矢印）における陽性のシグナルがある。左上および右上の白い箱は２個の隣接した６ｕｍスライドのほぼ同じ箇所であり、左下および右下これらの箱の近くの領域の拡大図である。
比較として、図３１は、非結合性変異体ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶｍ１２３４についての同じ情報を示し、それに特異的な最小の染色を示す。左上：形態を示すＨ＆Ｅ染色。梗塞領域は、黒い曲線によって区画された縁の上部中央である（２００×倍率）。右上：この領域の隣接領域はＨＳＡ含有タンパク質のために同じ倍率で染色された。赤は抗ＨＳＡ局在を示し；青は細胞核のＤＡＰＩ染色を示す。同じ領域の、より高い倍率の画像は、左下（４００×）および右下（６００×）に示される。損傷組織の縁（中間の厚さの矢印）での心筋細胞（細い矢印）および赤血球（厚い矢印）においてバックグラウンドシグナルしかない。左上および右上の白い箱は２個の隣接した６ｕｍスライドのほぼ同じ箇所であり、左下および右下これらの箱の近くの領域の拡大図である。
図３２は抗ＨＳＡ抗体のＨＳＡ含有融合タンパク質への特異性を確認するために使用される対照を例示する。左上：記載された通りにＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶが直接注入されるマウス心臓の陽性対照。濃い赤は、注入されたＨＳＡ含有融合タンパク質の強い局在を示す。右上：マウス心臓の陰性対照。左上は、ＩＧＦ１＿ｍＨＳＡ＿ＡｎｘＶの注入を含むが、染色が一次抗ＨＳＡ抗体なしで続けられた同様の調製。特異的染色は全く見られなかった。左下：マウス心臓の第二の陰性対照。タンパク質は全く心臓に注入されず左上と同様に処理された。わずかな赤いバックグラウンド染色を見ることができるのみである。右下：ヒト肝臓の陽性対照。ヒト肝臓はかなりの量のＨＳＡを生産する。抗−ＨＳＡ抗体での染色は試料のいたるところで特異的染色を示す。すべての画像において：青い染色は、細胞核を示すＤＡＰＩ染色を示す。
本明細書に記載された実施例および実施形態が例示の目的のみであり、これらを踏まえた変更の様々改変が本出願の精神および範囲内、および付属された請求項の範囲内であることが理解されるであろう。引用された、すべての公表、特許、および特許出願全体は、すべての目的のために出典明示により本明細書に組込まれる。

Claims (12)

  1. （ａ）損傷細胞の細胞外空間に露出されているホスファチジルセリンに結合特異性を有する標的化ドメイン、ここで該標的化ドメインはアネキシン、またはそれらの断片である；および
    （ｂ）組織の細胞表面に関する増殖因子受容体に結合特異性を有する活性化ドメインであって、該活性化ドメインが該増殖因子受容体にさらされると、組織の再生または生存を調節するように該活性化ドメインが該増殖因子受容体に結合する；
    を含む二重特異的融合タンパク質。
  2. 活性化ドメインが、線維芽細胞増殖因子、ニューレグリン／ヘレグリン、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、間質細胞由来因子、血小板由来増殖因子、テラトカルシノーマ由来増殖因子、マスト細胞／幹細胞増殖因子、高親和性神経成長因子、ＢＤＮＦ／Ｎ−３増殖因子、ＮＴ−３増殖因子、骨形態形成タンパク質、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 標的化ドメインが、１０ −６ Ｍから１０ −１２ Ｍの範囲の解離定数Ｋｄで、標的分子と結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. アネキシンが、ホスファチジルセリン結合親和性を維持している間、アネキシンの内在化を減少させるように改質されたものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 融合タンパク質が、細胞動員、アポトーシスの抑制、および／または、細胞増殖の誘導を促進する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 融合タンパク質が、細胞の損傷を防ぎ、細胞の成長を促進し、幹細胞の運動性を促進し、幹細胞の分化を促進する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. 組織が、心臓組織または腎組織、骨、軟骨、間接、皮膚、肝組織、膵臓組織、血球、肺組織、または神経組織である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  8. 活性化ドメインがＮＲＧ１ｂｅｔａ、ＩＧＦ１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−３３、それらの変異体、それらのアイソフォーム、それらの断片およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  9. 医薬上好適な担体および治療上有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  10. さらに幹細胞を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 組織再生を調節するように、対象の組織損傷を治療するための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
  12. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
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