ES2863278T3 - Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos - Google Patents

Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos Download PDF

Info

Publication number
ES2863278T3
ES2863278T3 ES16852701T ES16852701T ES2863278T3 ES 2863278 T3 ES2863278 T3 ES 2863278T3 ES 16852701 T ES16852701 T ES 16852701T ES 16852701 T ES16852701 T ES 16852701T ES 2863278 T3 ES2863278 T3 ES 2863278T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cases
seq
bispecific
tissue
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16852701T
Other languages
English (en)
Inventor
Laura D J Antipov
Shawdee Eshghi
Kristopher M Kuchenbecker
Bjorn L Millard
Matthew D Onsum
Andrea D Nickerson
Timothy R Stowe
Yan Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Silver Creek Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Silver Creek Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Silver Creek Pharmaceuticals Inc filed Critical Silver Creek Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2863278T3 publication Critical patent/ES2863278T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Una proteína biespecífica que comprende: a) un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una molécula diana asociada a la superficie externa de una célula de un tejido en donde el dominio de direccionamiento comprende una variante de la anexina A5 humana que comprende una o más mutaciones, en donde las una o más mutaciones consisten en una sustitución en la posición correspondiente a C316 y opcionalmente en una o más posiciones correspondientes a R63, K70, K101, E138, D139, N160 y combinaciones de las mismas; y b) un dominio activador modificado genéticamente que tiene una especificidad de unión a un receptor asociado a la superficie de una célula del tejido, en donde el dominio activador modificado genéticamente comprende una variante del factor de crecimiento similar a la insulina humana IGF-1 que comprende una o más mutaciones, en donde las una o más mutaciones consisten en una sustitución en una o más posiciones correspondientes a E3, Y24, Y31, Y60 y combinaciones de las mismas, en donde el dominio activador modificado genéticamente reduce la activación del receptor de IGF-1 en relación con el IGF-1 de tipo silvestre, en donde la proteína biespecífica muestra una activación del receptor de IGF-1 al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana medida por fosforilación de un receptor o una molécula efectora aguas abajo.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN CON FONDOS FEDERALES
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el contrato número 1R43HL124678-01A1 otorgado por el programa SBIR del Instituto Nacional de Salud (NIH). El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a proteínas que tienen usos terapéuticos, y más específicamente a proteínas biespecíficas, composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y métodos para usar tales proteínas para reparar tejido dañado.
Antecedentes
La regeneración de tejidos es una ciencia multidisciplinara en la que el objetivo es restaurar la función biológica de los tejidos enfermos o dañados. La regeneración de tejidos aborda problemas clínicos importantes tales como el infarto de miocardio. El infarto de miocardio, comúnmente conocido como ataque cardíaco, tiene lugar cuando la obstrucción de la arteria coronaria corta el suministro de sangre a una parte del corazón. La falta de oxígeno resultante provoca un daño tisular irreversible (necrosis y apoptosis), debido a la incapacidad del corazón para activar suficientemente los programas de regeneración endógena y la autorreparación. Tal daño tisular es una de las principales causas de insuficiencia cardíaca congestiva, una afección en la que el corazón ya no es capaz de bombear sangre de manera eficaz y puede provocar una lesión renal aguda. En Estados Unidos, cada año se producen más de un millón de ataques cardíacos y casi 5 millones de personas padecen insuficiencia cardíaca congestiva.
No existen tratamientos eficaces para regenerar el tejido cardíaco dañado. Las terapias actuales para la insuficiencia cardíaca congestiva se centran en prevenir la arritmia, la progresión de la arteriosclerosis y el infarto de miocardio recurrente, pero no aborda el daño tisular subyacente. Más de la mitad de los pacientes diagnosticados con insuficiencia cardíaca congestiva mueren dentro de los cinco años posteriores al diagnóstico.
Existe, por tanto, una necesidad en la técnica de métodos para reparar o regenerar tejidos dañados y para mejorar el direccionamiento de células tales como células madre para facilitar la reparación de tejidos. La presente invención satisface estas necesidades, y proporciona otras ventajas relacionadas.
Breve sumario de la invención
La presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona proteínas terapéuticas biespecíficas, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión biespecíficas y métodos terapéuticos que emplean dichas proteínas terapéuticas biespecíficas para promover la supervivencia del tejido y/o la regeneración del tejido dañado.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión biespecífica promueve la regeneración de tejidos, la supervivencia celular, la diferenciación celular, inhibe la apoptosis, induce la proliferación celular, promueve el crecimiento celular, promueve la motilidad de las células madre, promueve la diferenciación de células madre, previene el daño celular y/o promueve la angiogénesis. En algunas realizaciones, el tejido puede ser tejido cardíaco, tejido renal, hueso, cartílago, articulaciones, piel, tejido hepático, tejido pancreático, células sanguíneas, tejido pulmonar, tejido cerebral y tejido nervioso.
En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, que comprenden una proteína biespecífica en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.
Dentro de otros aspectos, los métodos para tratar el daño tisular patológico en un paciente proporcionado es una composición farmacéutica para su uso en el padecimiento de daño tisular patológico, disminuyendo así el daño tisular patológico en el paciente.
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona proteínas biespecíficas que comprenden (1) un dominio de dirección que tiene una especificidad de unión a una molécula diana asociada a la superficie externa de una célula de un tejido, y (2) un dominio activador modificado genéticamente que tiene una especificidad de unión a un receptor asociado a la superficie de una célula del tejido, en donde el dominio activador modificado genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de un dominio activador de tipo silvestre, en donde el dominio activador modificado genéticamente disminuye la activación del receptor en relación con el dominio activador de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador se modifica para disminuir la activación del receptor con respecto al dominio activador de tipo silvestre en al menos 3,5 veces. En algunos aspectos, el dominio activador cuando se asocia al dominio de direccionamiento en una proteína biespecífica presenta una activación del receptor al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana, medida por fosforilación de un receptor o una molécula efectora aguas abajo. En algunos casos, la proteína biespecífica presenta una activación del receptor al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana, tal como se mide por fosforilación de AKT.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre modificada para comprender una deleción, una sustitución, una adición, una secuencia de aminoácidos adicional en un extremo N-terminal y/o C-terminal o una combinación de los mismos. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende un dominio activador de tipo silvestre fusionado con una proteína no inmunogénica. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos del dominio activador de tipo silvestre fusionado a una proteína no inmunogénica.
En algunas realizaciones, la proteína biespecífica comprende además un modulador de la semivida, en donde el modulador de la semivida aumenta la semivida de la proteína biespecífica. El modulador de la semivida puede comprender la secuencia de albúmina de suero humano, Fc, scFc, dominio de unión a la albúmina, PASilación, alfafetoproteína humana, o variantes de la misma.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente tiene una afinidad de unión a un receptor de factor de crecimiento.
En algunos casos, el dominio activador y el dominio de direccionamiento se fusionan de forma recombinante. En otros casos más, el dominio activador y el dominio de direccionamiento están acoplados o unidos químicamente.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende un factor de crecimiento. En algunos casos, el factor de crecimiento es IGF-1, NRG o variantes del mismo.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 o variantes de la misma. En algunos casos, la anexina A5 comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende IGF-1 (LR3-Y31A). En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 18, 19, 23, 24, 28, 29 o 120.
En algunas realizaciones, el modulador de la semivida es albúmina de suero humano o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la albúmina de suero humano comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124.
En algunos casos, el modulador de semivida comprende Fc o una variante del mismo. En algunos casos, el Fc comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 53.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector que une el dominio activador modificado genéticamente con el modulador de semivida y un conector que une el modulador de semivida con el dominio de direccionamiento. En algunos casos, el conector comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente se puede unir mediante un enlace peptídico al extremo amino del dominio de direccionamiento. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente se puede unir mediante un enlace peptídico al extremo carboxilo del dominio de direccionamiento.
En algunos aspectos, la proteína biespecífica comprende: (1) un dominio activador, comprendiendo el dominio activador un factor de crecimiento, (2) un dominio de direccionamiento, comprendiendo el dominio de direccionamiento un polipéptido que se une a la fosfatidilserina en la superficie externa de una célula dañada, teniendo la proteína biespecífica una concentración semimáxima eficaz más baja en la célula dañada (CE50oañada) que una célula sana (CE50Sana). En algunos casos, la célula dañada puede ser una célula que sufre apoptosis o necrosis. En algunos casos, el factor de crecimiento es una proteína IGF-1 modificada (también denominada en el presente documento una variante de IGF-1). En algunos casos, la proteína biespecífica que comprende la variante de iGF-1 tiene una proporción CE50Sana/CE50oañada de al menos 10:1.
En algunos casos, el dominio activador comprende una variante de IGF-1. En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 humana o una variante de la misma. En algunos casos, el dominio activador comprende una variante de IGF-1 y el dominio de direccionamiento comprende la anexina A5 humana o una variante de la misma.
En algunos aspectos, la proteína biespecífica comprende (1) un dominio activador, comprendiendo el dominio una variante de IGF-1, (2) un dominio de direccionamiento, el dominio de direccionamiento que comprende anexina A5 o una variante de la misma, en donde la anexina A5 o una variante de la misma se une a la fosfatidilserina en la superficie externa de una célula dentro del tejido dañado, en donde que la proteína biespecífica y tiene una concentración semimáxima eficaz más baja en el tejido dañado (CE50Dañado) que el tejido sano (CE50Sano). En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la fosforilación de AKT. En algunos casos, la proteína biespecífica que comprende la variante de IGF-1 tiene una proporción de CE50Sana/CE50Dañada de al menos 10:1.
En algunos casos, el tejido dañado es un tejido isquémico. En algunos casos, la célula diana es una célula apoptótica o necrótica.
En algunos casos, el tejido dañado es un daño del tejido diabético causado por la diabetes. En algunos casos, el tejido dañado es un daño del tejido diabético causado por la nefropatía diabética. En algunos casos, el tejido dañado provocó un trastorno relacionado con los podocitos. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es capaz de unirse a una proteína del podocito, tal como nefrina (NPHS1), podoplanina (PDPN), podocalixina (PODXL), distroglicano (DAG1), GLEPP1 (PTPRO), NEPH1 (KIRREL), FAT cadherina atípica 1 (FAT1), regulador transmembrana BMP rico en cisteína 1 (CRIM1), integrina alfa-8/beta 1 (ITGA8). En algunas realizaciones, la variante de IGF-1 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 10-30 o 120. En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la señalización de supervivencia al unirse al receptor de IGF-1.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende una molécula capaz de unirse a fosfatidilserina. En algunos casos, el dominio de focalización comprende la anexina A5. En algunos casos, la anexina A5 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende una molécula capaz de unirse a una proteína de podocito, tal como nefrina (NPHS1), podoplanina (PDp N), podocalixina (PODXL), distroglicano (DAG1), GLEPP1 (PTPRO), NEPH1 (KIRREL), FAT cadherina atípica 1 (Fa T1), regulador transmembrana BMP rico en cisteína 1 (CRIM1), integrina alfa-8/beta 1 (ITGA8). En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende un anticuerpo capaz de unirse a una proteína de podocito, tal como nefrina (NPHS1), podoplanina (PDPN), podocalixina (PODXL), distroglicano (DAG1), GLEPP1 (PTPRO), NEPH1 (KIRREL), FAT cadherina atípica 1 (FAT1), regulador transmembrana BMP rico en cisteína 1 (CRIM1), integrina alfa-8/beta 1 (ITGA8).
En algunos casos, el dominio activador y el dominio de direccionamiento están unidos covalentemente por un enlace peptídico para formar un único polipéptido.
En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma están unidas covalentemente por un enlace peptídico para formar un único polipéptido. En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma se unen covalentemente al enlazador peptídico mediante un enlace peptídico para formar un único polipéptido.
En algunas realizaciones, la proteína biespecífica comprende además un péptido enlazador. En algunas realizaciones, el péptido enlazador es un modulador de la semivida. En algunas realizaciones, el modulador de la semivida es una albúmina de suero humano o una variante de la misma. En algunas realizaciones, el modulador de la semivida es un fragmento Fc o una variante del mismo. En algunas realizaciones, la albúmina de suero humano o una variante de la misma tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124. En algunos casos, el fragmento Fc tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 53.
En algunos casos, el dominio activador está unido al extremo amino del enlazador peptídico y el dominio de direccionamiento está unido al extremo carboxilo del enlazador peptídico. En algunos casos, el dominio activador está unido al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico y el dominio de direccionamiento del mismo está unido al extremo amino terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector peptídico entre el dominio activador y el enlazador peptídico y un conector peptídico entre el dominio de direccionamiento y el enlazador peptídico.
En algunos casos, la variante de IGF-1 está ligada al extremo amino terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está ligada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la variante de IGF-1 está enlazada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está enlazada al extremo amino terminal del enlazador peptídico.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector peptídico entre la variante de IGF-1 y el enlazador peptídico y un conector peptídico entre la anexina A5 o la variante de la misma y el enlazador peptídico.
En algunos casos, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
En algunos aspectos de la divulgación, la proteína modificada genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos indicada en el SEQ ID NO: 84. En algunos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico tiene una secuencia indicada en el SEQ ID NO: 102.
En algunos aspectos de la invención, la proteína modificada genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos indicada en el SEQ ID NO: 118. En algunos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico tiene una secuencia indicada en el SEQ ID NO: 119.
Aspectos de la divulgación, en relación con una proteína biespecífica que comprende: (1) una variante de IGF-1 que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 18, 19, 23, 24, 28, 29 o 120, y (2) Anexina A5 o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122.
En algunas realizaciones, la proteína biespecífica comprende una albúmina de suero humano o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124. En algunos casos, la albúmina de suero humano o una variante de la misma está unida a un extremo C-terminal de la anexina A5 o una variante de la misma y al extremo N-terminal de la variante de IGF-1.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un péptido conector que une un extremo N-terminal de la albúmina de suero humano o una variante del mismo al extremo C-terminal de la anexina A5 o una variante de la misma y un péptido que une un extremo C-terminal de la albúmina de suero humano o una variante de la misma. al extremo N-terminal de la variante de IGF-1. En algunos casos, el conector peptídico comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un polipéptido líder.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además una etiqueta de afinidad polipeptídica. En algunos casos, la etiqueta de afinidad está en el extremo amino terminal de la proteína de fusión, en el extremo carboxilo terminal de la proteína de fusión, o en el medio de la proteína de fusión. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende un polipéptido que comprende histidina.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende una secuencia de aminoácidos de una variante no internalizante de la anexina A5 humana y la proteína biespecífica tiene una semivida prolongada en comparación con una proteína biespecífica que comprende la secuencia de aminoácidos de la anexina 5 humana de tipo silvestre. Por ejemplo, la proteína biespecífica comprende una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 4.
Los aspectos de la divulgación se refieren a una proteína biespecífica que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 67, 70, 73, 86, 108, 110, 116 o 118.
Las proteínas biespecíficas proporcionadas en el presente documento no se limitan necesariamente a dos especificidades de unión. En determinados casos, además del dominio de direccionamiento, la proteína biespecífica comprende dos o más dominios activadores que están unidos directa o indirectamente mediante enlaces peptídicos. En determinados casos, además del dominio activador, la proteína biespecífica comprende dos o más dominios de direccionamiento que están enlazados directa o indirectamente mediante enlaces peptídicos.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica, mediante el cual el dominio de direccionamiento se une específicamente a la molécula diana asociada a una célula dañada de un tejido dañado, dirigiendo así la proteína de fusión biespecífica al tejido dañado y por lo que tras la exposición del dominio activador al receptor del factor de crecimiento, el dominio activador activa específicamente el receptor del factor de crecimiento para promover la regeneración o supervivencia del tejido dañado.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para tratar a un paciente que lo necesita, comprendiendo el método proporcionar una proteína biespecífica y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica, en donde las proteínas biespecíficas se unen a la fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática de una célula de un tejido y a un receptor del factor de crecimiento IGF-1 en la superficie de la célula del tejido. En algunos casos, la proteína biespecífica se une a moléculas asociadas a la superficie de la misma célula del tejido. En otros casos, la proteína biespecífica se une a moléculas asociadas a la superficie de diferentes células del tejido.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de dirección que tiene una especificidad de unión a una molécula diana asociada a la superficie externa de una primera célula de un tejido y un dominio activador modificado genéticamente que tiene una especificidad de unión a un receptor asociado a la superficie de una segunda célula del tejido, en donde el dominio activador modificado genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de un dominio activador de tipo silvestre, en donde el dominio activador modificado genéticamente disminuye la activación del receptor en relación con el dominio activador de tipo silvestre; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica, por lo que el dominio de direccionamiento dirige la proteína de fusión biespecífica a la primera célula del tejido y por lo que tras la exposición del dominio activador a un receptor del factor de crecimiento en la superficie de una segunda célula, el dominio activador activa específicamente el receptor del factor de crecimiento para promover la regeneración tisular, en donde la proteína biespecífica presenta una activación del receptor al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana según se mide mediante la fosforilación de un receptor o una molécula efectora aguas abajo. En algunos casos, la primera célula es una célula apoptótica o necrótica.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene (1) un dominio activador, en donde el dominio activador comprende una variante de IGF-1 y (2) un dominio de direccionamiento, en donde el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 o una variante de la misma; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica mediante la cual la anexina A5 o una variante de la misma dirige la proteína de fusión biespecífica a una primera célula del tejido, en donde la célula expresa fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática, y por lo que tras la exposición de la variante de IGF-1 a un receptor de IGF-1 en la superficie de una segunda célula, la variante de IGF-1 activa específicamente el receptor de IGF-1 para promover la regeneración tisular.
En algunos casos, la célula dirigida y la célula activada son iguales. En otras realizaciones adicionales, la célula dirigida y la célula activada son diferentes. En algunos casos, la célula dirigida es una célula dañada y la célula activada es una célula viable. En algunos casos, la célula dirigida es una célula dañada y la célula activada es una célula dañada. En determinados casos, el daño tisular patológico es el daño del tejido cardíaco asociado al infarto de miocardio. En otros casos, el daño tisular patológico es el daño del tejido renal. En otros casos, el daño tisular patológico está en el hueso, cartílago, articulaciones, piel, tejido hepático, tejido pancreático, células sanguíneas, tejido pulmonar o tejido nervioso. En determinadas realizaciones, tales métodos comprenden además la administración de células madre al paciente.
También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión biespecífica tal como se describe en el presente documento. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico es ADN, y el ADN comprende además secuencias reguladoras de la transcripción y traducción unidas operativamente a la secuencia codificante de la proteína de fusión biespecífica, de manera que la transcripción y traducción de la secuencia codificante se produzca en al menos un tipo de célula eucariota.
Estos y otros aspectos de la presente divulgación llegarán a ser evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada.
Descripción del listado de secuencias
El SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la anexina A5 humana (AnxV).
El SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la anexina A5 que tiene una sustitución de C316S (AnxV-C316S).
El SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la anexina A5 humana que tiene un péptido que comprende C316S y hexahistidina en C-terminal (AnxV-C316S-6His).
El SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la variante no internalizante de la anexina A5 humana (ni-AnxV).
El SEQ ID NO: 5 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la anexina A5 (AnxV).
El SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la AnxV C316S.
El SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la AnxV C316S-6His.
El SEQ ID NO: 8 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la ni-AnxV.
El SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos del IGF-1 humano de tipo silvestre (forma madura).
El SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano (IGF-1Des 1-3).
El SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano (IGF-1 LONG).
El SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos una variante de IGF-1 humano (IGF1 E3R).
El SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos una variante de IGF-1 humano (IGF1 R37X).
El SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de una variante humana de IGF-1 humano con deleción de los restos 68-70 (IGF1 3X).
El SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano (IGF-1 LR3).
El SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (LR3) humano que comprende R37X_3X El SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (LR3) humano que comprende Y24L. El SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (LR3) humano que comprende Y24L_Y31A.
El SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (LR3) humano que comprende Y31A. El SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (LR3) humano que comprende Y60L. El SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano que comprende R37X_3X El SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende Y24L.
El SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende Y24L_Y31A.
El SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende Y31A.
El SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende Y60L.
El SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (Des1-3) humano que comprende R37X_3X.
El SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (Desl-3) humano que comprende Y24L. El SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (Desl-3) humano que comprende Y24L_Y31A.
El SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoácidos de la variante de IGF-1 (Desl-3) humano que comprende Y31A. El SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de la variante Y60L de IGF-1 (Desl-3) humano.
El SEQ ID NO: 31 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el IGF-1.
El SEQ ID NO: 32 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el IGF-1 (Des1-3).
El SEQ ID NO: 33 es la secuencia de ácido nucleico de IGF1 LONG humano.
El SEQ ID NO: 34 es la secuencia de aminoácidos de IGF1 E3R humano.
El SEQ ID NO: 35 es la secuencia de aminoácidos de IGF1 R37X humano.
El SEQ ID NO: 36 es la secuencia de ácido nucleico de IGF1 3X humano (deleción de los restos 68-70).
El SEQ ID NO: 37 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el IGF-1 (LR3).
El SEQ ID NO: 38 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 (LR3) que comprende R37X_3X
El SEQ ID NO: 39 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 (LR3) que comprende Y24L. El SEQ ID NO: 40 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 (LR3) que comprende Y24L, El SEQ ID NO: 41 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 (LR3) que comprende Y31A. El SEQ ID NO: 42 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 (LR3) que comprende Y60L. El SEQ ID NO: 43 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 que comprende R37X_3X El SEQ ID NO: 44 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 que comprende Y24L. El SEQ ID NO: 45 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 que comprende Y24L e Y31A.
El SEQ ID NO: 46 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IGF-1 que comprende Y31A. El SEQ ID NO: 47 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante Y60L de IGF-1.
El SEQ ID NO: 48 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante R37X_3X de IGF-1(Des1-3) El SEQ ID NO: 49 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante Y24L de IGF-1(Des1-3).
El SEQ ID NO: 50 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante Y24L, Y31A de IGF-1(Des1-3). El SEQ ID NO: 51 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante Y31A de IGF-1(Des1-3).
El SEQ ID NO: 52 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante Y60L de IGF-1(Des1-3).
El SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos del péptido Fc.
El SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano (HSA).
El SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos de la variante de albúmina de suero humano mHSA.
El SEQ ID NO: 56 es la secuencia de aminoácidos de la variante mHSA7 de albúmina de suero humano.
El SEQ ID NO: 57 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la albúmina de suero humano HSA.
El SEQ ID NO: 58 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de albúmina de suero humano mHSA. El SEQ ID NO: 59 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de albúmina de suero humano mHSA7. El SEQ ID NO: 60 es la secuencia de aminoácidos del enlazador Ik7.
El SEQ ID NO: 61 es la secuencia de aminoácidos del enlazador Ik15.
El SEQ ID NO: 62 es la secuencia de aminoácidos del enlazador Ik40.
El SEQ ID NO: 63 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el enlazador Ik7.
El SEQ ID NO: 64 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el enlazador Ikl5.
El SEQ ID NO: 65 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el enlazador Ik40.
El SEQ ID NO: 66 es la secuencia de aminoácidos de SGF 602
El SEQ ID NO: 67 es la secuencia de aminoácidos de SGF 683
El SEQ ID NO: 68 es la secuencia de aminoácidos de SGF 703
El SEQ ID NO: 69 es la secuencia de aminoácidos de SGF604.
El SEQ ID NO: 70 es la secuencia de aminoácidos de SGF606.
El SEQ ID NO: 71 es la secuencia de aminoácidos de SGF649.
El SEQ ID NO: 72 es la secuencia de aminoácidos de SGF688.
El SEQ ID NO: 73 es la secuencia de aminoácidos de SGF711.
El SEQ ID NO: 74 es la secuencia de aminoácidos de SGF713.
El SEQ ID NO: 75 es la secuencia de aminoácidos de SGF716.
El SEQ ID NO: 76 es la secuencia de aminoácidos de SGF727.
El SEQ ID NO: 77 es la secuencia de aminoácidos de SGF728.
El SEQ ID NO: 78 es la secuencia de aminoácidos de SGF729.
El SEQ ID NO: 79 es la secuencia de aminoácidos de SGF730.
El SEQ ID NO: 80 es la secuencia de aminoácidos de SGF731.
El SEQ ID NO: 81 es la secuencia de aminoácidos de SGF732.
El SEQ ID NO: 82 es la secuencia de aminoácidos de SGF733.
El SEQ ID NO: 83 es la secuencia de aminoácidos de SGF739.
El SEQ ID NO: 84 es la secuencia de aminoácidos de SGF740.
El SEQ ID NO: 85 es la secuencia de aminoácidos de SGF741.
El SEQ ID NO: 86 es la secuencia de aminoácidos de SGF743.
El SEQ ID NO: 87 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF604.
El SEQ ID NO: 88 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF606.
El SEQ ID NO: 89 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF649.
El SEQ ID NO: 90 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF688.
El SEQ ID NO: 91 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF711.
El SEQ ID NO: 92 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF713.
El SEQ ID NO: 93 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF716.
El SEQ ID NO: 94 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF727.
El SEQ ID NO: 95 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF728.
El SEQ ID NO: 96 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF729.
El SEQ ID NO: 97 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF730.
El SEQ ID NO: 98 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF731.
El SEQ ID NO: 99 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF732.
El SEQ ID NO: 100 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF733.
El SEQ ID NO: 101 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF739.
El SEQ ID NO: 102 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF740
El SEQ ID NO: 103 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF741.
El SEQ ID NO: 104 es la secuencia de ácido nucleico que codifica el SGF743.
El SEQ ID NO: 105 es la secuencia de aminoácidos que codifica una secuencia líder.
El SEQ ID NO: 106 es la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia líder.
El SEQ ID NO: 107 es la secuencia de aminoácidos de SGF 704
El SEQ ID NO: 108 es la secuencia de aminoácidos de SGF 734
El SEQ ID NO: 109 es la secuencia de aminoácidos de SGF 746
El SEQ ID NO: 110 es la secuencia de aminoácidos de SGF 757.
El SEQ ID NO: 111 es la secuencia de ácido nucleico que codifica SGF 704.
El SEQ ID NO: 112 es la secuencia de ácido nucleico que codifica SGF 734.
El SEQ ID NO: 113 es la secuencia de ácido nucleico que codifica SGF 746.
El SEQ ID NO: 114 es la secuencia de ácido nucleico que codifica SGF 757.
El SEQ ID NO: 115 es la secuencia de ácido nucleico que codifica Fc.
El SEQ ID NO: 116 es la secuencia de aminoácidos de SGF 737.
El SEQ ID NO: 117 es la secuencia de ácido nucleico de SGF 737.
El SEQ ID NO: 118 es la secuencia de aminoácidos de SGF-776.
El SEQ ID NO: 119 es la secuencia de ácido nucleico de SGF-776.
El SEQ ID NO: 120 es la secuencia de aminoácidos de una variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende las sustituciones E3R e Y31A.
El SEQ ID NO: 121 es una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de IGF-1 humano de tipo silvestre que comprende las sustituciones E3R e Y31A.
El SEQ ID NO: 122 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la anexina 5 humana de tipo silvestre que comprende los aminoácidos 2-320 de la anexina 5 de tipo silvestre y las sustituciones R63A, K70A, K101A, E138a , D139G, N160A y C316A.
El SEQ ID NO: 123 es la secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de la anexina 5 humana que comprende los aminoácidos 2-320 de la anexina 5 de tipo silvestre y las sustituciones R63A, K70A, K101A, E138a , D139G, N160A y C316A.
El SEQ ID NO: 124 es la secuencia de aminoácidos de una variante de albúmina de suero humano que comprende los aminoácidos 26-609 de albúmina de suero humano de tipo silvestre y las sustituciones C58S y N527Q.
El SEQ ID NO: 125 es la secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de albúmina de suero humano que comprende los aminoácidos 26-609 de albúmina de suero humano de tipo silvestre y las sustituciones C58S y N527Q.
El SEQ ID NO: 126 es la secuencia de aminoácidos del enlazador Ik7.
El SEQ ID NO: 127 es la secuencia de aminoácidos del enlazador alifático Ik7.
El SEQ ID NO: 128 es la secuencia de aminoácidos del scFV de anti-fosfatidilserina PS4A7.
El SEQ ID NO: 129 es la secuencia de aminoácidos de scFv de anti-ADN SI-1.
El SEQ ID NO: 130 es la secuencia de aminoácidos de scFv de anti-ADN SI-22.
El SEQ ID NO: 131 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv anti-miosina B7.
El SEQ ID NO: 132 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv anti-miosina FD2.
El SEQ ID NO: 133 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv anti-miosina MCA1.
El SEQ ID NO: 134 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv anti-miosina MCB11.
El SEQ ID NO: 135 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo scFv anti-miosina S3F51.
El SEQ ID NO: 136 es la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo scFV anti-ADN.
El SEQ ID NO: 137 es la secuencia de aminoácidos de un motivo de PASilación.
El SEQ ID NO: 138 es la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano del dominio de unión a albúmina (aldudAB).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A y la Figura 1B son esquemas de proteínas terapéuticas biespecíficas representativas (también denominadas en el presente documento como Factores de Crecimiento Inteligente o SGF) y proteínas de control sin direccionamiento, de acuerdo con algunas realizaciones. La Figura 1A y la Figura 1B son esquemas representativos de (1) proteínas basadas en IGF-1 de potencia reducida, con direccionamiento, (2) proteínas basadas en Nrg1a de potencia reducida, con direccionamiento, (3) proteínas basadas en IGF-1 de potencia reducida, sin direccionamiento, (4) proteínas basadas en IGF-1 sin potencia reducida, sin direccionamiento, (5) proteínas basadas en IGF-1 sin potencia reducida, con direccionamiento, (6) brazos de señalización, (7) brazos de direccionamiento, (8) moduladores de semivida y (9) enlazadores, de acuerdo con algunas realizaciones.
Las Figuras 2A y 2B son tablas que enumeran proteínas terapéuticas biespecíficas y la potencia y las veces de reducción de potencia en células sanas en comparación con factores de crecimiento de tipo silvestre (Gf de ts) según algunas realizaciones. Las FIG. 2A y 2B muestran que los factores de crecimiento modificados genéticamente de acuerdo con las realizaciones de la invención tienen una potencia reducida (es decir, CE50 de pAKT aumentadas) en comparación con los factores de crecimiento de tipo silvestre. La CE50 se define como la concentración necesaria para alcanzar el nivel semimáximo de señalización de pAKT. Se estimularon cardiomiocitos que provienen de iPSC (CDI) con (S)GF durante 10 min y se midieron los niveles de pAKT mediante ELISA. Las FIG. 2A y 2B muestran que los GF modificados genéticamente , ya sea por adición, deleción o mutación de aminoácidos o por fusión con otros dominios de proteínas, causa una potencia reducida en comparación con los GF de ts.
La Figura 3A es un conjunto de gráficos que representan la respuesta a la dosis de pAKT (proteína quinasa B) en cardiomiocitos sanos y dañados usando diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas y proteínas de control sin direccionamiento según algunas realizaciones. Las potencias de los Factores de Crecimiento Inteligentes (SGF) candidatos se miden en cardiomiocitos que provienen de células madre pluripotentes (Cellular Dynamics International) y la señalización se cuantifica mediante la acumulación de Akt fosforilada. Para evaluar la focalización de los factores de crecimiento inteligente, las curvas de respuesta a la dosis se recogen en cardiomiocitos sanos y dañados (dañados = incubación con 12,5 pg/ml de doxorrubicina durante 24 horas para inducir la apoptosis). Las curvas de respuesta a la dosis se ajustan posteriormente a un modelo de activación de las CE50 de tres parámetros y las CE50 calculadas se comparan entre los entornos sano (círculo, color azul) y dañado (cuadrado, color rojo). En estos gráficos normalizados, se muestran las líneas de mejor ajuste y los puntos de datos individuales se representan como círculos o cuadrados rellenos.
La Figura 3B es un gráfico que representa el cambio de potencia calculado por la CE50 sana/CE50 dañada para diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas en comparación con proteínas de control sin direccionamiento en una escala logarítmica de acuerdo con algunas realizaciones. Los valores ajustados de CE50 se representan tanto para los entornos sanos (círculos rellenos) como para los dañados (incubación con 12,5 pg/ml de doxorrubicina durante 24 horas para inducir la apoptosis; triángulo relleno). Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 % para los parámetros. El cambio de potencia calculado para cada una de las proteínas modificadas genéticamente se toma como la proporción de los valores de CE50 ajustados entre las curvas de respuesta a la dosis sana y dañada (CE50Sanos/CE50Dañados). El cambio de potencia se anota y se expresa como el aumento de veces en la señalización del entorno dañado, La FIG. 3B muestra que las moléculas sin direccionamiento ni potencia reducida (por ejemplo, 688) y las moléculas sin direccionamiento y con potencia reducida (por ejemplo, 704, 602, 703) no tienen cambios de potencia apreciables. Análogamente, las moléculas sin potencia reducida, con direccionamiento (por ejemplo, 649) tampoco tienen un cambio de potencia apreciable. Solo las moléculas con potencia reducida, con direccionamiento (606, 683, 711, 713, 716, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 739, 740, 741, 743, 757) tienen un cambio de potencia apreciable (> 4 veces).
La Figura 3C es un gráfico que representa la respuesta a la dosis de pAKT (proteína quinasa B) en cardiomiocitos sanos y dañados utilizando la proteína terapéutica biespecífica 776 (sc776) y la correspondiente proteína de control sin direccionamiento 777 (sc777). Como en la Figura 3A, las potencias de los Factores de Crecimiento Inteligentes candidatos se miden a diferentes concentraciones (nM) en cardiomiocitos que provienen de células madre pluripotentes y la señalización (eje Y) se cuantifica mediante la acumulación de Akt fosforilada. Las curvas de respuesta a la dosis en los entornos sanos y dañados se ajustan a un modelo de activación de la CE50 de tres parámetros. La señalización para sc776 se representa para los entornos sano (azul, círculo relleno) y dañado (rojo, cuadrado relleno), respectivamente. Las respuestas de señalización para sc777 se representan para los entornos sano (púrpura, triángulo relleno) y dañado (verde, triángulo inverso relleno), respectivamente.
La Figura 4 es un gráfico que representa la reducción de la actividad de caspasa inducida por hipoxia usando la proteína terapéutica biespecífica SGF 740 en cardiomiocitos humanos. La Figura 4 muestra que los factores de crecimiento modificados genéticamente de acuerdo con las realizaciones de la invención reducen la apoptosis en cardiomiocitos humanos de una manera dependiente de la dosis. La apoptosis se indujo cultivando células en oxígeno al 1 % durante 48 horas. La proteína terapéutica biespecífica 740 se añadió al comienzo del período de hipoxia. La actividad de caspasa 3/7 se midió usando capsaseGlo (Promega). La proteína de fusión 740 reduce significativamente (p<0,01) la actividad de caspasa inducida por hipoxia en cardiomiocitos humanos.
La Figura 5 es un gráfico que representa la reducción de la muerte celular inducida por hipoxia usando proteínas terapéuticas biespecíficas SGF 727, 740, 734 y control sin direccionamiento (746) en células epiteliales del túbulo proximal de riñón humano. La Figura 5 muestra que los factores de crecimiento modificados genéticamente con direccionamiento de acuerdo con las realizaciones de la invención reducen la muerte celular inducida por hipoxia en las células epiteliales del túbulo proximal del riñón humano, mientras que los controles sin direccionamiento no muestran ningún efecto. La muerte celular se midió por el porcentaje de células que se tiñeron positivas para yoduro de propidio por citometría de flujo. Las células se privaron de suero durante 5 horas, luego se pretrataron con proteínas terapéuticas biespecíficas SGF 727, 740, 734 o control sin direccionamiento (746) antes de colocarlo en bolsas anaeróbicas durante 18 horas (GasPak EZ Anaerobe Pouch System con indicador BD 260683), El control de normoxia se trató de la misma manera, excepto que el control no se colocó en la bolsa anaeróbica. Todos los resultados se normalizaron al control de normoxia, Los resultados son el promedio de 2-3 experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante una prueba ANOVA de una vía, alfa=0,05.
La Figura 6 es una tabla que muestra la semivida y la tasa de descomposición después de la dosificación intravenosa de diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas. La semivida de diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas y el IGF-1 de ts en ratones se calculó utilizando un modelo de un solo compartimento, SGF 727 tiene la estructura GF1(LR-3-R37X-3X)_lk40_mHSA_lk40_AnxV, mientras que las moléculas 739-743 tienen la estructura básica IGF1*(LR3)_lk7_mHSA_lk7_AnxV(ni), donde * denota una deleción o mutación reductora de la potencia de IGF1. SGF757 tiene la estructura Nrgla_lk7_mHSA_lk7_AnxV (ni). La Figura 6 muestra que los factores de crecimiento modificados genéticamente (SGF) dirigidos según algunas realizaciones tienen semividas más largas que el factor de crecimiento de tipo silvestre (IGF1 de ts)
Las Figuras 7A y 7B son un conjunto de gráficos que representan los efectos de diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas sobre los niveles de glucosa en sangre después de la dosificación intravenosa. La Figura 7 muestra que los factores de crecimiento modificados genéticamente (SGF) de acuerdo con algunas realizaciones han reducido los efectos fuera de diana. Las proteínas de fusión de IGF1 de potencia reducida y dirigidas a Anx han reducido significativamente la hipoglucemia en comparación con las proteínas de fusión de IGF1 de alta potencia sin direccionamiento.
La Figura 7A es un gráfico que muestra la evolución temporal de los niveles de glucosa en sangre en ratones después de la dosificación con diferentes proteínas terapéuticas biespecíficas. Los datos se muestran como nivel de glucosa en mg/dl. Los SGF 727-743 son proteínas de fusión basadas en IGF1 con direccionamiento y potencia reducida, mientras que 688 es una proteína de fusión de IGF1 de alta potencia sin direccionamiento. A los ratones se les administró HSA recombinante como control negativo e IGF-1 (variante LR3) como control positivo.
La Figura 7B es un gráfico que representa la relación entre la potencia SGF (definida como la concentración requerida para alcanzar los niveles semimáximos de pAKT, es decir, la CE50 de pAKT de proteínas terapéuticas biespecíficas) frente al área bajo la curva (ABC) de glucosa en sangre de 3 horas. La FIG. 7B demuestra que una mayor reducción de la potencia (es decir, un aumento de la CE50 de pAKT) conduce a un aumento del ABC de glucosa en sangre a las 3 horas (es decir, una menor reducción de la glucosa en sangre).
La Figura 8 es un gráfico que representa los niveles relativos de pAKT en regiones cardíacas de ratas dañadas (infarto) frente a las sanas (remotas). Se empleó un modelo de isquemia/reperfusión de rata para generar lesión isquémica por ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) en ratas. Después de 1 hora de isquemia y 2 horas de reperfusión, los corazones fueron extirpados y microdiseccionados en regiones remotas (sanas) e infartadas (dañadas) documentadas por indicadores anatómicos. Se generaron homogeneizados de tejido para cada región y se analizaron para fosfo-AKT usando un ELISA de tipo sándwich de AKT/pAKT total. En este punto de tiempo, IGF-1 no da como resultado un aumento de pAKT en tejido remoto o infartado, mientras que una proteína de fusión de IGF1 altamente potente y sin direccionamiento (688) aumenta la pAKT de forma no selectiva tanto en tejido remoto como en infartado. La proteína de fusión de IGF1 de potencia reducida y dirigida, 606, aumenta selectivamente la pAKT en el tejido infartado (p <0,05), en comparación con el tejido remoto. La Figura 8 muestra factores de crecimiento modificados genéticamente (SGF) con direccionamiento que activan la señalización a favor de la supervivencia en tejido dañado in vivo. La proteína de fusión de IGF1 de potencia reducida con direccionamiento, 606, activa significativamente más señalización de pAKT en tejido infartado frente a tejido remoto (sano) in vivo. La señalización selectiva no se observa ni con IGF1 de ts ni con una proteína de fusión de alta potencia (688).
Las Figuras 9 A, 9B y 9C mostraron que los factores de crecimiento de modificados genéticamente con direccionamiento de acuerdo con algunas realizaciones son eficaces in vivo y reducen el tamaño del infarto en el modelo de isquemia/reperfusión de infarto agudo de miocardio (IAM) en rata. La proteína de fusión de IGF1 de potencia reducida con direccionamiento (SGF 606) reduce significativamente el infarto/área en riesgo (AER) después de un infarto agudo de miocardio en ratas. Se observa una reducción de infarto/AER significativamente mayor con SGF606 frente a IGF1 de ts.
La Figura 9A representa una descripción general del modelo de infarto agudo de miocardio (IAM) en rata. Descripción general del modelo de IAM en rata. La arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) se ata en el punto de ligadura durante 1 hora, luego se afloja y se reperfunde durante un período de recuperación de 72 horas. El vehículo, IGF1 o SGF 606 se inyectan por vía intravenosa en el momento de la reperfusión a través de la vena lateral de la cola. Después de 72 horas, se vuelve a ligar la LAD y se procesa el corazón para la evaluación histológica del tamaño del infarto.
La Figura 9B es un gráfico que muestra el porcentaje de área del ventrículo izquierdo que está en riesgo después de la isquemia (área de riesgo (AER)/% del VI) utilizando el modelo que se muestra en la Figura 9A. No hubo diferencia significativa en el tamaño de la lesión producida por el procedimiento quirúrgico entre ninguno de los grupos, como lo indica el tamaño comparable del área en riesgo (AER) con respecto al área del ventrículo izquierdo (VI).
La Figura 9C es un gráfico que representa el porcentaje de infarto/área en riesgo en ratas lesionadas por IAM y tratadas con vehículo, IGF1 de ts, o una proteína terapéutica biespecífica con direccionamiento (SGF 606). El SGF 606 de potencia reducida y con direccionamiento es altamente significativamente eficaz en la reducción del tamaño del infarto a las 72 horas en comparación con el control del vehículo (p <0,001). El IGF1 también puede reducir significativamente el tamaño del infarto en comparación con el vehículo (p<0,05); sin embargo, el tratamiento con SGF 606 da como resultado una mayor reducción del infarto en comparación con IGF1 (p<0,05).
La Figura 10 es un esquema de un factor de crecimiento modificado genéticamente con direccionamiento de acuerdo con algunas realizaciones.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.
A menos que defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente alguien que tiene experiencia en la materia a la que pertenece la invención.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural, salvo que el contenido indique claramente otra cosa.
El término "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para indicar un polímero de secuencia de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida (también denominado en el presente documento enlace peptídico).
El término "biespecífico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de la proteína de fusión para interactuar con dos ligandos diferentes. En algunas realizaciones, la proteína biespecífica interactúa con una molécula diana para el dominio de dirección y un receptor para el dominio activador.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "molécula diana" se refiere a cualquier molécula que está asociada a un tejido (por ejemplo, "en riesgo", tejido enfermo o dañado). Una "célula diana" pretende ser una célula a la que se puede unir específicamente una proteína biespecífica o un dominio de direccionamiento de la misma.
"Unión" o "unión específica" se usan indistintamente en el presente documento e indica que una proteína (o el dominio polipeptídico de direccionamiento de la misma o el dominio activador de la misma) presenta una afinidad sustancial por una molécula específica (por ejemplo, el dominio de direccionamiento muestra una afinidad sustancial por una molécula diana, o un dominio activador presenta una afinidad sustancial por una molécula asociada a la superficie de una célula, tal como un receptor del factor de crecimiento) o una célula o tejido que lleva la molécula y se dice que ocurre cuando la proteína (o el dominio polipeptídico de direccionamiento de la misma o el dominio activador de la misma) tiene una afinidad sustancial por una molécula específica y es selectiva porque no muestra una reactividad cruzada significativa con otras moléculas.
El término "recombinante", tal como se usa en el presente documento, significa una entidad genética distinta de la encontrada generalmente en la naturaleza. Aplicado a un polinucleótido o gen, esto significa que el polinucleótido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción y/o ligamiento, y otros procedimientos que provocan la producción de una construcción que es distinta de un polinucleótido encontrado en la naturaleza.
La expresión "unido operativamente" se refiere a una secuencia de ácido nucleico colocada en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico.
El término "vector", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, (por ejemplo, un retrovirus defectuoso en la replicación, adenovirus y virus adenoasociado) en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico para unirse operativamente a un promotor (por ejemplo, un promotor vírico) que dirigirá la expresión de una proteína codificada por el segmento de ADN. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión".
La expresión "célula hospedadora", tal como se usa en el presente documento, se emplea para hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión, cuya célula es capaz de reproducir, y preferentemente expresar proteínas codificadas por, el vector. Debe entenderse que tales términos pretenden referirse no solo a la célula concreta, sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas mutaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula huésped", como se usa en el presente documento.
"Identidad", tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o proteicas, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencia entre polipéptidos o proteínas, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante cualquier método de bioinformación conocido en la técnica.
La expresión "polipéptido original" se refiere a un polipéptido de tipo silvestre y la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos del polipéptido de tipo silvestre es parte de una base de datos de proteínas de acceso público (por ejemplo, EMBL Nucleotide Sequence Database, NCBI Entrez, ExPasy, Protein Data Bank y similares).
La expresión "polipéptido mutante" o "variante de polipéptido" se refiere a una forma de un polipéptido, en donde su secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos de su correspondiente forma de tipo silvestre (original), forma existente de manera natural o cualquier otra forma original. Un polipéptido mutante puede contener una o más mutaciones, por ejemplo, sustitución, inserción, deleción, adición, etc... que dan como resultado el polipéptido mutante.
La expresión "correspondiente con un polipéptido original" se usa para describir un polipéptido de la invención, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la secuencia de aminoácidos del polipéptido original correspondiente solo por la presencia de al menos una variación de aminoácidos. Normalmente, las secuencias de aminoácidos de la variante del polipéptido y del polipéptido original presentan un alto porcentaje de identidad. En un ejemplo, "correspondiente a un polipéptido original" significa que la secuencia de aminoácidos de la variante del polipéptido tiene al menos aproximadamente un 50 % de identidad, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente un 98 % de identidad o al menos aproximadamente un 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del polipéptido original. En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido tiene al menos aproximadamente el 50 % de identidad, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido original.
La expresión "identidad sustancial" o "similitud sustancial", tal como se usa en el presente documento, cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que cuando se alinean de forma óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 a un 99 % de la secuencia.
El término "homólogo" tal como se usa en el presente documento y en relación con los péptidos se refiere a la similitud de la secuencia de aminoácidos entre dos péptidos. Cuando una posición de aminoácido en los dos péptidos está ocupada por aminoácidos idénticos, son homólogos en esa posición. Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente homóloga" tal como se usa en el presente documento significa que una secuencia es idéntica al menos al 50 %, y preferentemente homóloga al menos al 75 % y más preferentemente homóloga al menos al 95 % al péptido de referencia y que conserva la mayor parte o toda la actividad como la secuencia a la que es homóloga.
La expresión "célula dañada" o "tejido dañado", tal como se usa en el presente documento, significa e incluye células o tejidos biológicos; por ejemplo, pero sin limitación, células o tejidos cardiovasculares dañados o lesionados por traumatismos o agresiones químicas, tejido isquémico, tejido o célula infartado o tejido dañado por cualquier medio que provoque la interrupción del flujo sanguíneo normal al tejido.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, significa la cantidad de proteína biespecífica que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que busca el investigador, veterinario, médico u otro facultativo.
La expresión "farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, significa el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el destinatario de la misma.
Los aspectos de la divulgación se refieren a proteínas terapéuticas biespecíficas, composiciones y métodos farmacológicos para reparar o regenerar tejido o células dañados o enfermos. En algunos casos, las proteínas terapéuticas biespecíficas pueden regular positivamente la supervivencia de células diana o tejido diana. En particular, las proteínas terapéuticas biespecíficas, pueden promover la señalización de supervivencia.
En algunos casos, las composiciones farmacológicas pueden incluir además uno o más agentes o componentes bioactivos adicionales para ayudar en el tratamiento de tejido o células dañados y/o facilitar el proceso de regeneración del tejido.
Los aspectos de la divulgación también abarcan polinucleótidos que codifican las proteínas terapéuticas biespecíficas y variantes de las mismas que pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. Las secuencias codificantes que codifican las variantes de la divulgación pueden variar como resultado de la redundancia o degeneración del código genético.
Los aspectos de la divulgación están dirigidos a proteínas terapéuticas biespecíficas que comprenden dos dominios de unión, cada uno específico para una molécula diana o "ligando" diferente. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende un dominio de direccionamiento o resto de direccionamiento y un dominio activador o resto terapéutico. El término "resto de direccionamiento", "dominio de orientación", o "polipéptido de direccionamiento" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a moléculas que localizan selectivamente el agente terapéutico biespecífico en un tejido o región particular del cuerpo. La localización puede estar mediada por el reconocimiento específico de determinantes moleculares, tamaño molecular del dominio de direccionamiento, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas y similares. Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "fracción terapéutica", "dominio activador", "polipéptido activador" y "brazo de señalización" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier agente útil para la terapia y que no sea tóxico, no tenga un efecto citotóxico o no sea perjudicial para las células, incluyendo, pero sin limitación, factores de crecimiento.
Tal como se usa en el presente documento, una "proteína biespecífica" se refiere a una proteína capaz de unirse específicamente a dos o más moléculas específicas diferentes. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una primera molécula diana específica y un dominio activador que tiene una especificidad de unión a una segunda molécula diana. En algunos aspectos, el dominio activador tiene una especificidad de unión a un receptor. En algunos aspectos, el dominio activador tiene una especificidad de unión a un receptor que modula/promueve la regeneración tisular. En algunos casos, el dominio de direccionamiento sirve para dirigir la proteína biespecífica a una célula o tejido diana, mientras que el dominio activador sirve para activar una célula y de ese modo promover la regeneración del tejido diana.
En algunos aspectos, las proteínas terapéuticas biespecíficas son proteínas quiméricas que tienen un polipéptido de direccionamiento conectado a un polipéptido activador. En algunos aspectos, las proteínas terapéuticas biespecíficas son proteínas quiméricas que tienen un polipéptido de direccionamiento conectado a una variante del factor de crecimiento.
El dominio de direccionamiento se usa generalmente para dirigir las proteínas biespecíficas a una célula de elección, también conocida como "célula diana". La unión del dominio de direccionamiento a su molécula diana no induce un efecto biológico significativo en la célula diana. El dominio activador se une a una segunda molécula o ligando diana en una célula. La unión del dominio activador a su ligando está destinada a modular un efecto biológico específico, tal como, aumentar esa actividad biológica. En algunos casos, la unión del dominio activador a su ligando tiene por objeto regular positivamente la supervivencia de las células o tejidos diana. En particular, el dominio activador de las proteínas biespecíficas puede promover la señalización de supervivencia.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento y el dominio activador están asociados a diferentes subunidades de una proteína multimérica. En algunos casos, el dominio activador está reticulado con el dominio de direccionamiento. En algunos casos, el dominio activador se fusiona directa o indirectamente con el dominio de direccionamiento.
Es importante señalar que la sustitución de un resto de aminoácido en el dominio activador puede afectar a las características de la proteína biespecífica en su conjunto, y que el efecto general puede ser beneficioso (o perjudicial) para la potencia farmacológica y la especificidad del direccionamiento de la proteína biespecífica.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones de la divulgación, la proteína terapéutica biespecífica tiene un dominio activador modificado genéticamente para tener una potencia reducida en comparación con el dominio activador de tipo silvestre. Se ha observado que la reducción de la potencia del dominio activador puede aumentar la selectividad de la proteína terapéutica biespecífica dando como resultado la activación preferencial de células o tejido que contienen la molécula diana (véase la Figura 3A, Figura 3B y Figura 3C). En algunos casos, el dominio activador es un agente terapéutico. En algunos casos, el dominio activador es una variante del factor de crecimiento. Esta reducción observada en la potencia en relación con el dominio activador de tipo silvestre se puede atribuir tanto al impedimento estérico del dominio de activación como a una tasa de difusión reducida en el contexto de la proteína de fusión de múltiples dominios más grande. En algunos casos, el dominio activador es una variante de IGF-1. En algunos casos, el dominio activador es una variante de NRG.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones de la divulgación, la proteína terapéutica biespecífica tiene un dominio activador que está fusionado tanto con un dominio modulador de la semivida como con un dominio de direccionamiento de manera que el dominio activador posee una potencia de activación reducida en comparación con el dominio activador de tipo silvestre. Se ha observado que la fusión del dominio activador con los dominios de modulación de la semivida y de direccionamiento disminuye la potencia del dominio activador, aumentando así la selectividad de la proteína terapéutica biespecífica dando como resultado la activación preferencial de células o tejidos que contienen la molécula diana. Esta reducción observada en la potencia en relación con el dominio activador de tipo silvestre se puede atribuir tanto al impedimento estérico del dominio de activación como a una tasa de difusión reducida en el contexto de la proteína de fusión de múltiples dominios más grande. En algunos casos, el dominio activador es un agente terapéutico. En algunos casos, el dominio activador es una variante del factor de crecimiento. En algunos casos, el dominio activador es una variante de IGF-1. En algunos casos, el dominio activador es una variante de NRG.
Algunos casos, de la divulgación proporcionan proteínas modificadas genéticamente que tienen un dominio de direccionamiento, un dominio activador y, opcionalmente, un enlazador peptídico o un modulador de la semivida. En varios casos, la divulgación proporciona variantes que tienen este nivel de identidad con una parte de la secuencia del polipéptido original, por ejemplo, Factor de crecimiento de insulina humana 1 (IGF-1), Anexina A5 (Anx A5 o AnxV), Albúmina sérica humana (HSA), como se define en el presente documento. En varios casos, la variante tiene al menos alrededor del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido original o con una parte de la secuencia polipeptídica original, por ejemplo, IGF-1, Anexina A5, Albúmina sérica humana, como se define en el presente documento.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones de la divulgación, el dominio activador (es decir, el factor de crecimiento) de la proteína biespecífica está modificado genéticamente para dar, cuando se fusiona al dominio de direccionamiento, a la proteína de fusión biespecífica una concentración semimáxima eficaz (CE50) más baja en células o tejidos dañados que en células o tejidos sanos. En algunos casos, el dominio activador (es decir, el factor de crecimiento) de la proteína biespecífica está modificado genéticamente para dar, cuando se fusiona al dominio de direccionamiento, la proteína de fusión biespecífica es al menos un orden de magnitud menor CE50 en células o tejidos dañados que en células o tejidos sanos.
En algunos aspectos de los métodos y composiciones de la divulgación, el(los) dominio(s) de direccionamiento de la proteína biespecífica se pueden seleccionar para que tengan una afinidad de unión por su ligando de al menos un orden de magnitud mayor que la afinidad que tiene el dominio activador por su ligando. Por ejemplo, el dominio de direccionamiento tiene al menos 10 veces o más afinidad por su ligando que el dominio activador por su ligando. En algunos casos, la afinidad del dominio de direccionamiento por su ligando es al menos 15 veces mayor o al menos 20 veces o más mayor, 25 veces o más mayor, que la del dominio activador. En algunos casos, la afinidad del dominio de direccionamiento por su ligando es 30, 40, 50 o incluso 100 veces mayor que la afinidad del dominio activador por su ligando.
La potencia diferencial del dominio activador y/o la afinidad de unión diferencial entre el dominio de direccionamiento y el dominio de unión del activador proporciona ventajas sorprendentes y no reconocidas previamente sobre las proteínas biespecíficas anteriores. En particular, el descubrimiento de que la alteración (adición, deleción, sustitución) de uno o más restos del dominio activador de la proteína biespecífica puede dar como resultado una mayor especificidad para las células diana junto con una potencia reducida en el dominio activador para las células no diana. Sin ceñirse a la teoría, se asumió que debido a sus bajas CE50 (es decir, alta potencia), los factores de crecimiento no pueden ser dirigidos de manera eficaz. De acuerdo con aspectos de la divulgación, se pueden preparar variantes de factores de crecimiento con una potencia significativamente reducida (es decir, CE50 aumentada). Estas variantes de factores de crecimiento, cuando se fusionan con brazos de direccionamiento de alta afinidad, pueden dar como resultado una activación selectiva de los receptores del factor de crecimiento en las células o tejidos que contienen la molécula diana y sustancialmente ninguna activación de células o tejidos que no contienen la molécula diana.
En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de direccionamiento y el dominio activador están directamente unidos. En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de direccionamiento y el dominio activador están indirectamente unidos. En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de direccionamiento y el dominio activador están unidos covalentemente. Sin embargo, en otros aspectos de la divulgación, el dominio de direccionamiento y el dominio activador están asociados de forma no covalente.
Las uniones entre el resto activador y el resto de direccionamiento, el resto activador y el modulador de la semivida (o enlazador peptídico) y el resto de direccionamiento y el modulador de la semivida (o enlazador peptídico) pueden ser enlaces covalentes o enlaces no covalentes. Los enlaces pueden ser enlaces peptídicos formados por derivatización de los componentes implicados con péptidos y la formación de un enlace peptídico entre los péptidos. Los enlaces pueden ser enlaces no covalentes, tales como enlaces de biotina/avidina o biotina/estreptavidina o enlaces antígeno/anticuerpo o hapteno/anticuerpo específicos.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende (1) un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una molécula asociada a una célula dañada de un tejido, en donde la molécula es intracelular en una célula viable y está expuesta al espacio extracelular en la célula dañada; y (2) un dominio activador que tiene una especificidad de unión a un receptor de factor de crecimiento de una célula en el tejido, en donde tras la exposición del dominio activador al receptor del factor de crecimiento, el dominio activador se une al receptor del factor de crecimiento para promover la regeneración o supervivencia del tejido. En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que está modificado genéticamente para dar, cuando se fusiona con el dominio de direccionamiento, a la proteína de fusión biespecífica una concentración semimáxima eficaz (CE50) más baja en célula o tejido dañado que en células o tejidos sanos. En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que está modificado genéticamente para dar, cuando se fusiona con el dominio de direccionamiento, la proteína de fusión biespecífica es al menos un orden de magnitud menor CE50 en células o tejidos dañados que en células o tejidos sanos.
En algunos casos, la proteína de fusión biespecífica comprende (1) un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una molécula asociada a una célula dañada de un tejido, en donde la molécula es intracelular en una célula viable y está expuesta al espacio extracelular en la célula dañada; (2) un dominio activador que tiene una especificidad de unión a una molécula asociada a la superficie de una célula en el tejido, en donde tras la exposición del dominio activador a la molécula asociada a la membrana, el dominio activador se une a la molécula asociada a la membrana para modular la regeneración del tejido y (3) un péptido enlazador. En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que está modificado genéticamente para dar a la proteína de fusión biespecífica una concentración semimáxima eficaz (CE50) más baja en células o tejidos dañados que en células o tejidos sanos. En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que está modificado genéticamente para dar a la proteína de fusión biespecífica al menos un orden de magnitud menor de CE50 en células o tejidos dañados que en células o tejidos sanos. En algunos casos, el enlazador es un péptido no inmunogénico. En algunos casos, el enlazador peptídico es un modulador de la semivida capaz de modular (por ejemplo, aumentar) la semivida de la proteína biespecífica.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas comprenden: (1) un dominio polipeptídico de direccionamiento que se une a una molécula asociada a isquemia; y (2) un polipéptido de factor de crecimiento modificado genéticamente para dar a la proteína de fusión biespecífica una concentración semimáxima eficaz (CE50) más baja en células o tejidos isquémicos que en células o tejidos sanos, mientras que tiene afinidad por un receptor en la superficie de una célula en un tejido para promover la regeneración o supervivencia del tejido.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas comprenden: (1) un dominio polipeptídico de direccionamiento que se une a una proteína asociada a podocitos; y (2) un polipéptido de factor de crecimiento modificado genéticamente para dar a la proteína de fusión biespecífica una concentración semimáxima eficaz (CE50) más baja en células o tejidos isquémicos que en células o tejidos sanos, mientras que tiene afinidad por un receptor en la superficie de una célula en un tejido para promover la regeneración o supervivencia del tejido.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas comprenden (1) al menos un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a al menos una molécula diana asociada a un tejido; (2) al menos un dominio activador que tiene una especificidad de unión a al menos una molécula asociada a la superficie de una célula en el tejido, en donde tras la exposición del dominio de unión a la molécula, el dominio de unión se une a la molécula para promover la regeneración o supervivencia del tejido; y (3) opcionalmente un enlazador peptídico. En algunos casos, la proteína de fusión comprende dos o más dominios de direccionamiento, teniendo cada dominio de direccionamiento una afinidad de unión a una molécula diana asociada a un tejido. Cada uno de los dominios de direccionamiento puede tener una misma especificidad de unión (por ejemplo, una especificidad de unión para la misma molécula diana) o una especificidad de unión diferente (por ejemplo, una especificidad de unión para una molécula diana diferente). Cada uno de los dominios de direccionamiento puede tener la misma afinidad de unión o diferentes afinidades de unión. En algunos casos, la proteína comprende dos o más dominios activadores. Cada uno de los dominios activadores puede tener la misma especificidad de unión (por ejemplo, una especificidad de unión al mismo receptor en la célula) o diferente especificidad de unión (por ejemplo, una especificidad de unión para un receptor diferente en una célula).
Cada uno de los dominios activadores puede tener la misma afinidad de unión o diferentes afinidades de unión. En algunos casos, el enlazador es un péptido. En algunos casos, el enlazador es un péptido no inmunogénico. En algunos casos, el enlazador es un modulador de semivida en donde el modulador de la semivida modula la semivida de la proteína biespecífica.
En determinados casos, la proteína biespecífica comprende un modulador de la semivida (HLM, por sus siglas en inglés). En algunos casos, el modulador de la semivida es un polipéptido. El modulador de la semivida puede tener dos extremos terminales, un N-terminal y un C-terminal, y se une en un extremo terminal mediante un enlace peptídico al dominio polipeptídico de direccionamiento y se une en el otro extremo terminal mediante un enlace peptídico al dominio activador. En otros casos, el modulador de la semivida se une en un extremo terminal (N-terminal o C-terminal) al dominio activador o al dominio de direccionamiento. Por consiguiente, el modulador de la semivida puede estar en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína biespecífica. El modulador de la semivida se puede unir al dominio de direccionamiento o al dominio activador mediante enlaces peptídicos.
Un experto en la materia apreciará que tales proteínas biespecíficas pueden encontrar uso en la regeneración de tejidos. En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas se pueden utilizar en células enfermas, después de una lesión en un tejido u órgano o después de un evento en el que las células de un tejido pueden resultar dañadas. En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas pueden activar células que expresan uno o más receptores de factores de crecimiento. En otros casos, las proteínas de fusión biespecíficas encuentran uso, por ejemplo, en el reclutamiento de células que expresan uno o más receptores de factores de crecimiento al tejido después de, por ejemplo, lesión, o un evento en el que las células de un tejido pueden dañarse o volverse disfuncionales.
En algunos aspectos, la administración de dichas proteínas biespecíficas se puede utilizar para facilitar la reparación. la supervivencia o la regeneración del tejido u órgano dañado. En algunos casos, las proteínas biespecíficas desveladas en el presente documento pueden encontrar su uso para modular la supervivencia del tejido. Por ejemplo, las proteínas biespecíficas pueden mejorar o mantener la viabilidad de una célula o tejido. En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas pueden activar la vía prosupervivencia o la vía de supervivencia celular. En algunos casos, las proteínas biespecíficas pueden reducir la apoptosis o reducir la muerte celular.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas pueden tener (1) un dominio polipeptídico de direccionamiento en el que el dominio de direccionamiento se une a una molécula diana dirigiendo así la proteína de fusión biespecífica a una primera célula de un tejido, y (2) un dominio activador que tiene una especificidad de unión a un receptor del factor de crecimiento. Tras la exposición del dominio activador al receptor del factor de crecimiento, el dominio activador puede activar el receptor de una segunda célula para promover el reclutamiento celular, la inhibición de la apoptosis, la inducción de la proliferación celular, la activación de la vía pro-supervivencia, la regeneración y/o la supervivencia del tejido. Un experto en la materia apreciará que la proteína de fusión biespecífica se puede unir a una primera población celular y actuar sobre la misma población celular (por ejemplo, de forma autocrina) o sobre una población celular diferente (por ejemplo, de forma paracrina). En algunos casos, el dominio de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana asociada a una primera población celular dañada y el dominio activador se une específicamente a un receptor de una segunda población celular de células viables. En algunos casos, el dominio de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana asociada a una población celular dañada y el dominio activador se une específicamente a un receptor de la misma población celular. En algunos casos, el dominio de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana específica de tejido en la superficie de una primera población celular y el dominio activador actúa específicamente sobre una segunda población celular. En algunos casos, el dominio de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana específica de tejido en la superficie de una población celular y el dominio activador actúa específicamente sobre la misma población celular. La primera célula puede ser una célula viable o una célula "en riesgo". Tal como se usa en el presente documento, célula "en riesgo" se refiere a una célula viable que aún no ha sufrido apoptosis o que no está dañada pero que corre el riesgo de dañarse.
En algunos casos, la proteína biespecífica tiene dos dominios de unión diferentes (como el dominio de direccionamiento y el dominio activador) que se unen a diferentes moléculas en diferentes células de un tejido u órgano. Sin embargo, en algunos casos, la proteína biespecífica tiene dos dominios de unión diferentes que se unen a diferentes moléculas en la misma célula diana en un tejido, estando seleccionado el dominio de direccionamiento para unirse específicamente a una célula diana y el dominio activador se selecciona para unirse a un receptor (por ejemplo, receptor de factor de crecimiento) en la superficie de la célula para promover la regeneración de tejido, el reclutamiento celular, la inhibición de la apoptosis, la inducción de la proliferación celular, la activación de la vía pro­ supervivencia, la regeneración y/o la supervivencia del tejido.
Moléculas diana
En algunos aspectos, las moléculas diana están expuestas o enriquecidas en el exterior de una célula diana. En algunos casos, la molécula diana está asociada a una célula dañada, siendo la molécula diana intracelular en una célula viable o no dañada y expuesta al espacio extracelular en una célula dañada. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, moléculas que están expuestas en células que experimentan necrosis (como el ADN) o apoptosis (por ejemplo, fosfatidilserina), miosina (incluidos los subtipos específicos del tipo de tejido de la misma), ICAM-1 o P-selectina. En otros casos más, la molécula diana es una molécula que está presente o enriquecida en la superficie de una célula o tejido enfermo o disfuncional en comparación con el nivel detectado en una célula o tejido sano o funcional. En algunos casos, la célula diana no es un tumor ni una célula cancerosa.
Las células están delimitadas por una membrana plasmática (o membrana celular) que comprende una bicapa lipídica. Se puede considerar que la membrana celular tiene una superficie orientada hacia el citosol (lado citosólico o interior de la célula) y una superficie orientada hacia el exterior de la célula o el espacio extracelular. El movimiento a través de la bicapa de fosfolípidos aniónicos desde el interior al exterior de la capa de la membrana plasmática tiene lugar durante la apoptosis. La proteína de unión a fosfolípidos aniónicos, tal como la anexina A5, se puede usar sinaptotagmina I o lactadherina para detectar la presencia de fosfatidilserina en la capa externa de la membrana celular. La fosfatidilserina es un fosfolípido, que generalmente está restringido al lado citosólico de la membrana en células viables o no dañadas, y que queda expuesta en la superficie celular externa o al espacio extracelular en células dañadas o apoptosis.
En algunos casos, la molécula diana es una "molécula asociada a isquemia". Una "molécula asociada a isquemia" es cualquier molécula que se detecta a un nivel que es significativamente más alto (por ejemplo, al menos 1,5 más alto, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor) después de isquemia (que da como resultado hipoxia) o hipoxia. La isquemia tiene lugar cuando hay un flujo sanguíneo insuficiente para proporcionar una oxigenación adecuada, que da como resultado hipoxia tisular (oxígeno reducido) o anoxia (ausencia de oxígeno) como la forma más grave de hipoxia y, en última instancia, necrosis tisular y apoptosis. Se puede usar cualquier ensayo de unión adecuado para identificar moléculas asociadas a isquemia, incluidos los proporcionados en el presente documento. El aumento del nivel de molécula que se detecta puede ser el resultado de una regulación positiva o una reducción del recambio, o se puede deber a una mayor accesibilidad (por ejemplo, como resultado del daño celular) o una mayor exposición extracelular (por ejemplo, movimiento a través de la bicapa desde la capa interna a la capa externa de la membrana plasmática). En determinados casos, la molécula asociada a isquemia se detecta en una célula de tejido posisquémico a un nivel significativamente mayor (por ejemplo, al menos 1,5 veces mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces más alto) que en una célula del mismo tejido que no ha sufrido un evento isquémico (es decir, la molécula es específica o está enriquecida en el tejido posisquémico). En casos adicionales, la molécula asociada a isquemia está asociada a daño celular (es decir, la molécula se detecta a un nivel significativamente mayor en células dañadas que en células no dañadas del mismo tipo). Ciertas moléculas asociadas a la isquemia están enriquecidas (por ejemplo, al menos 1,5 mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor) en el corazón después de un evento isquémico (o en un sistema modelo que se usa para imitar la isquemia en el corazón). En algunos casos, las moléculas asociadas a la isquemia están enriquecidas aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces enriquecido, aproximadamente 3 veces enriquecido, aproximadamente 4 veces enriquecido, aproximadamente 5 veces enriquecido en el corazón después de un evento isquémico (o en un sistema modelo que se usa para imitar la isquemia en el corazón). En algunos casos, las moléculas asociadas a la isquemia se enriquecen desde aproximadamente 1,5 veces hasta aproximadamente 5 veces o más en el corazón después de un evento isquémico (o en un sistema modelo que se usa para imitar la isquemia en el corazón). En algunos casos, las moléculas asociadas a la isquemia son de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 2 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 2,5 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces, de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 3,5 veces, de aproximadamente 3,5 veces a aproximadamente 4 veces, de aproximadamente 4 veces a aproximadamente 4,5 veces, de aproximadamente 4,5 veces a aproximadamente 5 veces, o más enriquecido en el corazón después de un evento isquémico (o en un sistema modelo que se usa para imitar la isquemia en el corazón). En algunos casos, tales moléculas incluyen moléculas que están expuestas en miocitos u otras células cardíacas que sufren necrosis (por ejemplo, pero no limitado a, ADN) o apoptosis (por ejemplo, pero no limitado a, fosfatidilserina). En algunos casos, tales moléculas incluyen moléculas que están enriquecidas en tejido cardíaco cicatrizado, tal como el colágeno (colágeno I, III), miosina (incluidos los subtipos específicos del tipo celular de la misma) u otras proteínas de la matriz extracelular que están enriquecidas en corazones posisquémicos. Dichas moléculas se pueden identificar basándose en el enriquecimiento después de la isquemia-reperfusión in vivo o en isquemia-reperfusión simulada in vitro, o después de la exposición a condiciones tales como hipoxia, reducción de ATP, aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o de óxido nítrico sintasa (NOS), o inanición de suero de las células cultivadas in vitro.
En algunos casos, la molécula diana es una molécula asociada a podocitos. En algunas realizaciones, la molécula diana es una de nefrina (NPHS1), podoplanina (PDPN), podocalixina (PODXL), distroglicano (DAG1), GLEPP1 (PT-PRO), NEPH1 (KIRREL), FAT cadherina atípica 1 (FAT1), regulador transmembrana BMP rico en cisteína 1 (CRIM1), Integrina alfa-8 /beta 1 (ITGA8).
Dominio activador
El dominio activador puede ser cualquier polipéptido que modula de forma detectable la actividad de una red celular o recluta células de un lugar a otro. En algunos casos, el dominio activador es capaz de activar las vías de transducción de señales uniéndose a un receptor en la superficie de una célula. En algunos casos, ciertos dominios activadores son polipéptidos del factor de crecimiento o cualquier agonista del receptor. Será evidente que dicha modulación puede ser un aumento en la actividad de la red celular, tal como la inducción de la proliferación de células, la inducción del crecimiento celular, la promoción de la supervivencia celular y/o la inhibición de la apoptosis. En algunos casos, el dominio activador puede reclutar otros factores o células (por ejemplo, células madre).
Se puede seleccionar un dominio activador para una aplicación particular basándose en el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para aumentar la supervivencia y/o con fines de diferenciación de células madre (regenerativas), se pueden usar dominios activadores que comprenden IGF, HGF, G-CSF, GLP-1, PDGF, SDF1, TB4 o NRG1 (o una porción o derivado de los mismos). Para aumentar la proliferación celular (regenerativa), se pueden usar dominios activadores que comprenden IGF, FGF2, G-CSF, GH, HGF, PDGF, TB4 o NRG1 (o una porción o derivado de los mismos). Para aumentar la angiogénesis, generalmente se puede usar un dominio activador que comprende FGF2, G-CSF, GH, HGF, SGF1, TB4, VEGF alfa, o una porción o derivado del mismo, que conserva sustancialmente la capacidad de unirse al receptor afín.
En algunos casos, el dominio activador comprende un cambio en la secuencia de aminoácidos, la estructura tridimensional de la proteína y/o la actividad de la proteína, en relación con la forma de tipo silvestre de la proteína. Se entenderá que la selección de una modificación adecuada en el dominio activador para la creación de proteínas biespecíficas que tengan el efecto terapéutico deseado puede depender de múltiples factores.
En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que tiene una modificación de la secuencia de aminoácidos relacionada con el factor de crecimiento de tipo silvestre (por ejemplo, IGF-1) para reducir su unión a su receptor natural (por ejemplo, receptor de IGF-1), para reducir su unión a proteínas de unión (proteínas de unión de IGF) y/o reducir su activación de su receptor natural (por ejemplo, receptor de IGF-1). En algunos casos, el dominio activador es un factor de crecimiento que tiene una modificación de la secuencia de aminoácidos que reduce (por ejemplo, aproximadamente del 1-5 %, el 5-10 %, 10 %-20 %, aproximadamente 20 %-40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %-60 %, aproximadamente 60 %-80 %, aproximadamente 80 %-90 %, 90-95%) su unión a su receptor natural (por ejemplo, receptor de IGF-1).
Un polipéptido del factor de crecimiento modula de forma detectable la activación de un receptor del factor de crecimiento. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, variante o derivado de la misma que conserva al menos aproximadamente el 0,01 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, variante o derivados de la misma que conservan al menos aproximadamente el 0,1 %, al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 10%, de actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 0,01 % y aproximadamente el 0,1 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 0,01 % y aproximadamente el 1 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 0,01 % y aproximadamente el 10 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 1 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 10 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, el dominio activador de la proteína biespecífica es un factor de crecimiento, la variante o derivado de la misma que conserva entre aproximadamente el 01 % y aproximadamente el 10 % de la actividad biológica de tipo silvestre. En algunos casos, la actividad biológica se puede determinar midiendo la activación del receptor del factor de crecimiento correspondiente en las células apropiadas. En algunos casos, se puede evaluar la activación, por ejemplo, midiendo la fosforilación de la quinasa receptora o de las proteínas efectoras aguas abajo, tal como, pero sin limitación, AKT, S6, ERK, JNK, mTOR, etc.
Factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) y derivados de los mismos
Los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) constituyen una familia de proteínas que tienen propiedades estimulantes del crecimiento y similares a la insulina. El IGF humano IGF1 es un péptido básico de 70 aminoácidos que tiene las secuencias de proteína y ADN que se muestran en los SEQ ID NO: 9 y 31, respectivamente. El receptor de IGF-1 e IGF-1 es importante para procesos celulares tales como la proliferación y la supervivencia celular. La unión de IGF-1 o una variante del mismo al receptor de IGF-1 estimula la actividad quinasa, que conduce a la fosforilación de múltiples sustratos, iniciando así cascadas de señalización. IGF-1 estimula la proliferación y supervivencia celular mediante la activación de la vía AKT. Tras la unión de IGF-I al receptor de IGF-1, una tirosina quinasa, fosforila los restos de tirosina en dos sustratos principales, IRS-1 y Shc, que posteriormente señalizan a través de las vías Ras/Raf y PI 3-quinasa/AKT.
La interacción de IGF-1 (e IGF-2) con el receptor de IGF-1 está regulada por proteínas de unión a IGF (IGFBP). Se ha demostrado que las seis IGFBP (particularmente IGFBP5) inhiben la acción de IGF, pero en algunos casos se ha observado un efecto estimulante. Al menos el 99 % del IGF en circulación normalmente se une a los IGFBP.
Según algunos casos, las proteínas biespecíficas pueden mantener la capacidad de señalización a través del receptor de IGF-1. La capacidad de señalización se puede determinar evaluando si una diana intracelular aguas abajo, por ejemplo, AKT (serina/treonina proteína quinasa B), se fosforila en respuesta a la unión del dominio activador de la proteína biespecífica al receptor en la superficie celular.
En algunos casos, el dominio activador (también denominado en el presente documento brazo de señalización) es IGF-1 humano o un derivado del IGF-1 humano. En algunos casos, el dominio activador tiene una secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de los SEQ ID NO: 9-30 o 120.
En algunos casos, el dominio activador es una variante de IGF-1 que es capaz de conservar la selectividad para el receptor de IGF-1 analizando la fosforilación del receptor o la fosforilación de la proteína de señalización aguas abajo en respuesta a la unión de la variante de IGF-1 al receptor de IGF-1.
En algunos casos, el dominio activador es una variante de IGF-1 que se modifica para reducir la unión a proteínas de unión de IGF-1 (IGFBP) en relación con el IGF-1 de tipo silvestre mientras conserva su capacidad para activar la vía AKT. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede activar el receptor de IGF-1 con una potencia disminuida para las células no diana, según lo evaluado por la c E50 de pAKT. La CE50 se define como la concentración necesaria para alcanzar el nivel semimáximo de señalización de pAKT.
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano y está modificado genéticamente para reducir la unión del dominio activador a las proteínas de unión al IGF que están presentes en el suero y otros fluidos corporales.
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano y comprende una prolongación de 13 restos en N-terminal (también denominada IGF-1 LONG, SEQ ID NO: 11), una mutación E3R (SEQ ID NO: 12) o una combinación de los mismos (LONG E3R, también conocido como LR3, SEQ ID NO: 15). En algunos casos, la variante de IGF-1 comprende la sustitución E3R, una prolongación en N-terminal de 13 restos, deleción de los aminoácidos 1­ 3 ((Des1-3), SEQ ID NO: 10) o una combinación de los mismos para reducir la unión del dominio activador a las proteínas de unión a IGF que están presentes en el suero y otros fluidos corporales.
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano y comprende una o más de las siguientes modificaciones: una prolongación en N-terminal de 13 restos (denominada iGF-1 LONG, SEQ ID NO: 11), una deleción de los aminoácidos 1-3 (Des-1-3, SEQ ID NO: 10), una sustitución que sustituye Arg por Glu en la posición 3 del polipéptido (E3R, SEQ ID NO: 12), sin arginina en la posición 37 (R37X, SEQ ID NO: 13), una deleción de aminoácidos 68-70 (3X, SEQ ID NO: 14), o una prolongación de 13 restos en N-terminal y una sustitución que sustituye Arg por una Glu en la posición 3 del polipéptido de tipo silvestre (LR3, SEQ ID NO: 15).
En algunos casos, el IGF-1 o la variante de IGF-1 puede comprender una sustitución en uno o más de los restos de tirosina. Por ejemplo, la variante de IGF-1 o IGF-1 (por ejemplo, LR3, Des 1-3) puede comprender una o más de las siguientes sustituciones, Y24L (los SEQ ID NO: 17, 22 y 27), Y31A (los SEQ ID NO: 19, 24 y 29) e Y60L (SEQ ID NO: 20, 25 y 30). Por ejemplo, la variante de IGF-1 puede comprender una sustitución Y24L y una sustitución Y31A (SEQ ID NO: 18, 23 y 28). En algunos casos, uno o más restos de tirosina (Y24, Y31, Y60 o combinaciones de los mismos) se puede sustituir por un aminoácido alifático corto. En algunos casos, uno o más restos de tirosina (Y24, Y31, Y60 o combinaciones de los mismos) se puede sustituir por un aminoácido polar. En algunos casos, uno o más restos de tirosina (Y24, Y31, Y60 o combinaciones de los mismos) se puede sustituir por leucina, alanina, isoleucina, serina, treonina o cualquier otro aminoácido.
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano que comprende una o más de las siguientes modificaciones: una prolongación en N-terminal de 13 restos (IGF-1 LONG), una deleción de los aminoácidos 1-3 (Des-1-3), una sustitución que sustituye Arg por un Glu en la posición 3 del polipéptido (E3R), no Arginina en la posición 37 (R37X), una deleción de los aminoácidos 68-70 (3X), una prolongación en N-terminal de 13 restos y una sustitución que sustituye Arg por una Glu en la posición 3 del polipéptido de tipo silvestre (LR3), sustituciones de uno o más restos de tirosina (Y24, Y31, Y60 o combinaciones de los mismos (por ejemplo, sustituciones de Y24L, Y31A, Y60L o combinaciones de los mismos).
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano que comprende una sustitución en la posición 3 y 31. Por ejemplo, el dominio activador puede provenir del IGF-1 humano que comprende las sustituciones E3R e Y31A. En algunos casos, el dominio activador tiene una secuencia de aminoácidos que tiene el SEQ ID NO: 120. En algunos casos, el dominio activador está codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene el SEQ ID NO: 121.
En algunos casos, el dominio activador es un derivado del IGF-1 humano que comprende una mutación (por ejemplo, sustitución, deleción) en uno o más restos 24 a 37.
En algunos casos, la variante de IGF-1 se puede modificar mediante glucosilación de uno o más sitios de glucosilación presentes en la variante de IGF-1.
Se cree que las proteínas biespecíficas que contienen IGF-1 LONG, IGF-1 LONG E3R (denominado IGF-1 (LR3)) o IGF1 Des1-3, tienen una afinidad reducida por las proteínas de unión de IGF en relación con el IGF-1 de tipo silvestre. En algunos casos, las variantes de IGF-1 de las proteínas biespecíficas descritas en el presente documento pueden activar la vía de señalización mientras tienen una interacción sustancialmente reducida con las proteínas de unión de IGF-1 en relación con el IGF-1 de tipo silvestre.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas que contienen las variantes de IGF-1 descritas en el presente documento tienen una potencia para las células no diana que es menor que el IGF-1 de tipo silvestre para las células no diana.
Ciertos dominios activadores que se unen a los receptores del factor de crecimiento se proporcionan en el presente documento en los SEQ ID NO: 9-30 y 120.
Se pueden incluir modificaciones adicionales de la secuencia de péptidos, tales como variaciones, deleciones, sustituciones o derivatizaciones menores de la secuencia de aminoácidos de las secuencias divulgadas en este documento, siempre que el péptido tenga sustancialmente la misma actividad o función que los péptidos sin modificar. Particularmente, un péptido modificado retendrá la actividad o función asociada al péptido sin modificar, el péptido modificado generalmente tendrá una secuencia de aminoácidos "sustancialmente homóloga" a la secuencia de aminoácidos de la secuencia sin modificar.
En algunos casos, la variante de IGF-1 puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos proporcionada en los SEQ ID NO: 9-30 y 120. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 98 %, desde aproximadamente un 98 % de identidad hasta aproximadamente un 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos proporcionada en los SEQ ID NO: 9-30 y 120. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede comprender 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más aminoácidos consecutivos de cualquiera de los aminoácidos en los SEQ ID NO: 9-30 o 120. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede tener una secuencia de aminoácidos enumerada en cualquiera de los SEQ ID NO: 15-20. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede tener una secuencia de aminoácidos enumerada en cualquiera de los SEQ ID NO: 10 o 26-30. En algunos casos, la variante de IGF-1 puede tener una secuencia de aminoácidos enumerada en cualquiera de los SEQ ID NO: 11-14, o 21-25 y 120.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende un dominio activador que tiene una variante del factor de crecimiento que se selecciona para dar a la proteína biespecífica al menos un orden de magnitud menor de CE50 en tejido dañado que en tejido sano. Por ejemplo, el dominio proteico biespecífico comprende una variante del factor de crecimiento y tiene una CE50 en el tejido dañado que es al menos 10 veces menor, al menos 15 veces menor, al menos 20 veces menor, al menos 25 veces menor, al menos 30 veces menor, al menos 35 veces menor, al menos 40 veces menor, al menos 45 veces menor, al menos 50 veces menor, al menos 55 veces menor, al menos 60 veces menor, al menos 65 veces menor, al menos 70 veces menor, al menos 75 veces menor, al menos 80 veces menor, al menos 85 veces menor, al menos 90 veces menor, al menos 95 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 110 veces menor que la CE50 en tejido sano.
En algunos casos, las proteínas biespecíficas que contienen las variantes de IGF-1 tienen una concentración semimáxima eficaz (CE50) que es menor en el tejido dañado que en el tejido sano. En algunos casos, las proteínas biespecíficas que contienen las variantes de IGF-1 tienen una concentración semimáxima eficaz (CE50) que es al menos 10 veces menor, al menos 15 veces menor, al menos 20 veces menor, al menos 25 veces menor, al menos 30 veces menor, al menos 35 veces menor, al menos 40 veces menor, al menos 45 veces menor, al menos 50 veces menor, al menos 55 veces menor, al menos 60 veces menor, al menos 65 veces menor, al menos 70 veces menor, al menos 75 veces menor, al menos 80 veces menor, al menos 85 veces menor, al menos 90 veces menor, al menos 95 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 110 veces menor en tejido dañado que en tejido sano.
La afinidad de unión y las velocidades cinéticas de activación y desactivación para la unión de la proteína de fusión biespecífica al receptor o receptores se pueden medir utilizando técnicas estándar y compararse con otras moléculas de control negativo (proteína de fusión con dominio activador de control irrelevante, proteína de fusión que carece de un dominio activador) y moléculas de control positivo (ligando del receptor de tipo silvestre recombinante, tal como un factor de crecimiento). Los parámetros de unión cinética y de equilibrio de la proteína de fusión biespecífica también se pueden comparar con los mismos parámetros medidos para el ligando de tipo silvestre no fusionado para determinar si la fusión del ligando con otras moléculas afecta la unión normal del ligando a su receptor correspondiente. Tal información se puede usar para determinar la dosis eficaz de la proteína de fusión biespecífica.
Una proteína de fusión biespecífica se une al receptor del factor de crecimiento inmovilizado con una afinidad significativamente mayor (por ejemplo, al menos 100 veces) que la observada para los controles negativos. Una proteína de fusión biespecífica se une al receptor del factor de crecimiento inmovilizado con una afinidad significativamente mayor (por ejemplo, al menos 100 veces) que la observada para los controles negativos, pero con una afinidad menor (por ejemplo, al menos 5 veces) que la observada para controles positivos.
Adicionalmente, la unión al receptor inmovilizado puede competir utilizando un exceso de polipéptido soluble, receptor soluble o anticuerpos que se unen al polipéptido o receptor y bloquean su interacción. En algunos casos, la proteína de fusión biespecífica se une al receptor del factor de crecimiento con una afinidad dentro de 1000 veces de la unión del ligando natural a su receptor.
Se pueden usar factores de crecimiento naturales como dominios activadores. Sin embargo, se ha observado que se pueden usar las proteínas de fusión biespecíficas que tienen factores de crecimiento que tienen secuencias alteradas modificadas genéticamente para reducir la potencia pero que conservan la capacidad de activar el receptor del factor de crecimiento afín. En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas tienen un brazo de señalización de IGF-1 modificado que tiene secuencias alteradas modificadas genéticamente para reducir la unión o interacción con la proteína de unión de IGF-1 y/o el receptor de IGF-1. Sorprendentemente, se ha demostrado que las proteínas biespecíficas que tienen tales factores de crecimiento modificados tienen una mayor especificidad para el tejido dañado diana.
Una proteína de fusión biespecífica (y su dominio activador) tiene además la capacidad de mediar en la activación del receptor afín. Dicha actividad se puede evaluar, por ejemplo, por modelos celulares. Para la isquemia, se puede usar un modelo celular de isquemia reperfusión, que usa cardiomiocitos cultivados tales como miocitos ventriculares de rata neonatal (NRVM) o cardiomiocitos o líneas celulares derivados de células madre pluripotentes inducidas. La isquemia simulada (IS) puede ser iniciada por inhibidores metabólicos (desoxiglucosa y ditionito) y metabolitos (potasio alto, lactato, pH bajo) o por hipoxia en una cámara anaeróbica o bolsas hipóxicas. La reperfusión se puede simular mediante resuspensión en un tampón oxigenado. Se ha desarrollado un modelo in vitro de isquemia de gránulos de cardiomiocitos adultos que proporciona los dos componentes principales de isquemiahipoxia y acumulación de metabolitos, en ausencia de inhibidores metabólicos o metabolitos exógenos. La Tabla 1 a continuación muestra métodos representativos para demostrar la capacidad de una proteína de fusión biespecífica para prevenir el daño de los cardiomiocitos, promover el crecimiento, la motilidad o la diferenciación de células madre cardíacas y/o promover la reparación del tejido dañado.
T l 1: M v l i n l ivi
Figure imgf000023_0001
continuación
Figure imgf000024_0001
En algunos casos, puede ser deseable evaluar la actividad tanto del dominio activador como del polipéptido diana simultáneamente. Se puede usar convenientemente un ELISA para este propósito.
El sustrato del polipéptido dirigido (por ejemplo, Anexina A5) se puede adsorber en la placa ELISA, que luego se bloquea con tampones que contienen b Sa apropiados. Luego se puede añadir la proteína de fusión biespecífica, seguido de la adición de sustrato recombinante para el dominio activador (por ejemplo, si el activador es un factor de crecimiento, entonces el sustrato es un receptor afín recombinante o un fragmento del receptor (ectodominio)). Este sustrato se puede marcar con fluorescencia para su detección o se puede detectar usando un anticuerpo marcado para una región del receptor que no afecta significativamente a la unión del ligando.
La actividad in vivo de la proteína de fusión biespecífica modificada genéticamente generalmente se evalúa detectando cambios de señalización en moléculas que están reguladas por el dominio activador de la proteína de fusión biespecífica. Esto puede implicar cambios en el estado de fosforilación del receptor de la superficie celular o mediadores posteriores tales como fosfo-AKT o fosfo-ERK detectados por citometría de flujo, inmunofluorescencia, ELISA, fosfo-marcaje, o análisis por transferencia de Western de tejidos tratados. Otras evaluaciones funcionales incluyen pruebas para determinar el número de células viables mediante tinción e identificación morfológica, nivel de apoptosis por la unión de anexina A5 (mediante inmunofluorescencia) o citometría de flujo, detección de la actividad de la caspasa, ensayo TUNEL (número reducido de células TUNEL positivas) o marcaje de ADN. En algunos casos, una proteína de fusión biespecífica funciona in vivo si induce un cambio significativo (por ejemplo, al menos un 20 %) en el nivel, la actividad funcional o la fosforilación de la molécula regulada detectada por el ensayo.
La reparación del tejido dañado en un paciente se puede evaluar utilizando cualquier estándar clínicamente relevante. Por ejemplo, la reparación del tejido infartado se puede medir mediante la cuantificación del número de células, tal como el número de miocitos, fibroblastos, o la cantidad de cicatrización, o con ensayos funcionales para la producción o aspectos estructurales de la función cardíaca, que incluyen, LVEDP, LVDP, dp/dT, Peso del VI, Volumen de la cámara y tensión diastólica de la pared. Los métodos para tales evaluaciones son bien conocidos y están ampliamente descritos en la bibliografía. En general, se dice que una proteína de fusión biespecífica repara el tejido dañado si da como resultado un cambio significativo (por ejemplo, al menos un 10 %) en dicha evaluación clínica.
Dominio de direccionamiento
En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de direccionamiento es específico de una molécula diana asociada a un tejido (por ejemplo, una molécula asociada a isquemia). En algunos aspectos de la divulgación, el dominio de dirección de la proteína biespecífica dirige la proteína biespecífica a una célula o tejido no canceroso o no tumoral. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es específico para moléculas asociadas a podocitos.
El dominio de direccionamiento puede ser cualquier secuencia polipeptídica que cumpla esta función. En algunas realizaciones, la unión del dominio de direccionamiento a la molécula diana no tiene o no modula una actividad biológica. Tal como se usa en el presente documento, "actividad biológica" se refiere a una actividad conocida definida realizada por exposición de una molécula a un dominio de la proteína.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento es un polipéptido que no es un anticuerpo, un fragmento del mismo o una variante del mismo que tiene una afinidad de unión a la molécula diana, un fragmento de la misma o una variante de la misma. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es un polipéptido que no es un anticuerpo que tiene una secuencia de péptido que tiene una afinidad de unión a la molécula diana, un fragmento de la misma o una variante de la misma.
En otros casos más, el dominio polipeptídico de direccionamiento comprende una o más regiones variables de anticuerpo. Un experto en la técnica apreciará que se contempla cualquier dominio de direccionamiento capaz de unirse directa o indirectamente a la molécula diana.
Anexina A5 y variantes de la misma
En algunos aspectos, el dominio de direccionamiento es una anexina. El término "anexina" se refiere a cualquier proteína capaz de unirse a fosfolípidos, especialmente fosfatidilserina (PS) y miembro de la familia de las anexinas. En algunos casos, la anexina es la anexina A5, pero también se pueden utilizar otras anexinas para producir y utilizar las variantes de anexina de la invención. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es la anexina A5 humana (AnxV, SEQ ID NO: 1), un fragmento funcional de la misma o una variante de la misma. Una variante de Anexina A5 tiene al menos un aminoácido en al menos una posición en la que este aminoácido no se encuentra en el polipéptido original de Anexina A5 (de tipo silvestre, SEQ ID NO: 1). En algunos casos, el dominio de direccionamiento es una variante de la anexina A5 (SEQ ID NO: 2-4, 122). Las variantes de anexina según pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones, en donde las sustituciones de aminoácidos, las deleciones o las adiciones no afectan sustancialmente a la capacidad de la variante de Anexina A5 de la proteína biespecífica para unirse al menos a un fosfolípido, tal como PS. En algunos casos, la variante de anexina A5 puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos proporcionada en los SEQ ID NO: 1-4, 122. En algunos casos, la variante de anexina A5 puede comprender 50, 110, 200, 300 o más aminoácidos consecutivos de cualquiera de los aminoácidos en los SEQ ID NO: 1-4, 122. En algunos casos, la anexina A5 se modifica para reducir la internalización de la anexina A5 mientras se mantiene la afinidad de unión a la fosfatidilserina. En algunos casos, la variante de anexina se puede unir a al menos un fosfolípido, en particular a la fosfatidilserina (PS), y no se internaliza en una célula o se internaliza a una velocidad más lenta que la anexina de tipo silvestre.
En algunos casos, uno o más restos de Anexina A5 se pueden alterar para modificar la unión para lograr una asociación más favorecida de unión a la molécula diana, o una disociación más favorecida de unión a la molécula diana. Algunas variantes de anexina según la invención tienen secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, que se modifica para inhibir la internalización en una célula. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es una variante no internalizante de Anexina A5, (también conocida como ni-Anexina A5 o ni-AnxV, SEQ ID NO: 4). En algunos casos, el mutante no internalizante de la anexina A5 puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos proporcionada en los casos del SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el mutante no internalizante de la anexina A5 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 98 %, de aproximadamente un 98 % a aproximadamente un 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos proporcionada en el SEQ ID NO: 4. En algunos casos, la variante de Anexina A5 puede comprender 50, 110, 200, 300 o más aminoácidos consecutivos de cualquiera de los aminoácidos en el SEQ ID NO: 4.
Se prevé cualquier variación de Anexina A5 que sustancialmente dé como resultado ninguna internalización. Debe apreciarse que la variante no internalizante de la anexina A5 puede conferir una semivida prolongada a la proteína biespecífica en comparación con una proteína biespecífica que contiene A5 de tipo silvestre.
En algunos casos, las variantes de la anexina A5 que dan lugar a una internalización sustancialmente nula se pueden usar para prolongar la semivida de la variante de anexina o la proteína asociada a la variante de anexina. En algunos casos, las variantes de la anexina A5 que sustancialmente dan como resultado ninguna internalización, o las proteínas de fusión que contienen variantes de la anexina A5 que sustancialmente dan como resultado ninguna internalización, pueden tener una semivida prolongada de 1,1 a 1,2, 1,1 a 1,3, 1,1 a 1,4, 1,1 a 1,5, 1,1 a 1,6, 1,1 a 1,7, 1,1 a 1,8, 1,1 a 1,9, 1,1 a 2 o más en comparación con la anexina A5 de tipo silvestre, o proteínas de fusión que contienen anexina A5 de tipo silvestre. Por ejemplo, la prolongación de la semivida de una proteína de fusión biespecífica que contiene ni-anexina A5 (SGF 740, SEQ ID NO: 84) es aproximadamente 1,15 veces mayor en comparación con una variante de esta proteína de fusión biespecífica que contiene anexina A5 de ts (SGF 737). Adicionalmente, las variantes de la anexina A5 que no produzcan una internalización sustancial deberían ser útiles para prolongar la semivida de otras proteínas o moléculas de fusión que contienen anexina A5, tales como las que se utilizan en estudios de obtención de imágenes o estudios de predireccionamiento.
Las expresiones "no internalización" y "sustancialmente no internalización", tal como se usan en el presente documento, se refieren a la falta de internalización de una cantidad sustancial de las proteínas biespecíficas de la presente invención. Por ejemplo, la expresión "sustancialmente sin internalización" se entenderá que menos del 50 % de las proteínas biespecíficas de la presente divulgación están internalizadas por una célula a la que se une la proteína biespecífica, o menos del 25 % de las proteínas biespecíficas proteínas de la presente invención internalizadas por una célula a la que se une la proteína biespecífica, o menos del 10 % de las proteínas biespecíficas de la presente divulgación internalizadas por una célula a la que se une la proteína biespecífica, o menos del 5 % de las proteínas biespecíficas de la presente divulgación internalizadas por una célula a la que se une la proteína biespecífica, o menos del 3 % de la proteína biespecífica de la presente divulgación internalizada por una célula a la que la proteína biespecífica está unida, o menos del 1 % de las proteínas biespecíficas de la presente divulgación están internalizadas por una célula a la que se une la proteína biespecífica.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "correspondiente a" se usa a menudo para designar la posición/identidad de un resto de aminoácido en un polipéptido (por ejemplo, Anexina A5). Los expertos en la materia apreciarán que, por motivos de simplicidad, en el presente documento se utiliza un sistema de numeración canónico (basado en la Anexina A5 de tipo silvestre, de modo que un aminoácido "correspondiente a" un resto en la posición 316, por ejemplo, no es necesario que sea realmente el aminoácido 316 en una cadena de aminoácidos particular, sino que se corresponde con el resto encontrado en la posición 316 en, por ejemplo, anexina A5 antes de la eliminación postraduccional de la metionina N-terminal; los expertos en la técnica apreciarán fácilmente cómo identificar los aminoácidos correspondientes. En particular, se observa que la secuencia de aminoácidos de la anexina A5 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) no comienza con una metionina ya que el resto de metionina se escinde durante el procesamiento.
En algunos casos, la anexina A5 se modifica para sustituir la cisteína en la posición 315 (correspondiente a C316) con serina o alanina para reducir la formación de dímeros. En algunos casos, la variante de Anexina A5 que tiene la sustitución de cisteína en la posición 315 por una serina tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. En algunos casos, la variante de anexina A5 que tiene la sustitución de cisteína en la posición 315 por una alanina. En algunos casos, el mutante no internalizante de la anexina A5 puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con la anexina A5 modificada para sustituir la cisteína en la posición 315 (correspondiente a C316) con serina o alanina.
En algunos casos, se pueden utilizar variantes de la anexina A5 en las que D143 se sustituyó por N y/o E227 se sustituyó por A (véase Mira, 1997; Kenis, 2004; Kenis 2010 y Ungethum, 2010). Por ejemplo, la variante de anexina A5 que tiene la sustitución de cisteína en la posición 315 se puede modificar para tener una sustitución en D143 y/o E227.
En algunos casos, la anexina A5 o la variante de anexina A5 (por ejemplo, con una sustitución en C316, D143 y/o E227) se modifican para comprender una o más de las siguientes sustituciones R62A, K69A, K100A, E137A, D138G, N159A, L313E (correspondiente a R63A, K70A, K101A, E138A, D139G, N160A, L314E). Por ejemplo, la anexina A5 que tiene el SEQ ID NO: 1 se puede modificar para tener una sustitución C315A o C315S (correspondiente a C316A o C316S con respecto a la anexina A5 de tipo silvestre) y una o más de las siguientes sustituciones R62A, K69A, K100A, E137A, D138G, N159A, L313E (correspondiente a R63A, K70A, K101A, E138A, D139G, N160A, L314E en relación con la anexina A5 de tipo silvestre).
En algunos casos, la Anexina A5 (SEQ ID NO: 1) o las variantes de Anexina A5 (por ejemplo, que tiene una sustitución en C316, D143 y/o E227) se modifican para comprender una o más de las siguientes sustituciones R62A, K69A, K100A, E137A, D138G, N159A, D143N, E227A, C315S o C315A (correspondiente a R63A, K70A, K101A, E138A, D139G, D144N, N160A, E228A, C316S o C316A en relación con la anexina A5 de tipo silvestre).
En algunos casos, el dominio de direccionamiento es la anexina A5, que ha sido modificada genéticamente para tener las sustituciones R63A, K70A, K101A, E138A, D139G, N160A y C316A o C316S en relación con la anexina A5 de tipo silvestre. Por ejemplo, el dominio de direccionamiento puede tener la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 122.
En algunos casos, la variante de anexina A5 comprende una o más, dos, o dos o más sustituciones en diferentes regiones, para reducir aún más la internalización de la anexina en una célula. Por ejemplo, las variantes de anexina A5 pueden comprender R62A y K69A, R62A y K100A, R62A y E137A, R62A y D138G, R62A y N159A, R62A y K69A y K100A, R62A y K69A y E137A, etc.
Las variantes de anexina según pueden comprender además una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones, en donde las sustituciones de aminoácidos, las deleciones o adiciones no afectan sustancialmente a la capacidad de la variante de anexina A5 de la proteína biespecífica para unirse al menos a un fosfolípido, tal como PS.
Otros dominios de direccionamiento no de anticuerpos:
En otros casos, el dominio de direccionamiento es sinaptotagmina I, un fragmento de la misma o una variante de la misma. Se ha demostrado que la sinaptotagmina I (Sytl) se une a la fosfatidilserina de una manera dependiente de Ca++ con una afinidad de unión de aproximadamente 5 a 40 nM. En algunos casos, uno de los dos dominios C2 de la sinaptotagmina (por ejemplo, C2B) se puede usar como dominio de direccionamiento. En algunos casos, el dominio de direccionamiento es un dominio C2 de proteínas de direccionamiento de membrana dependientes de Ca++ implicado en la transducción de señales o el tráfico de membrana (por ejemplo, proteína quinasa C, factor de coagulación sanguínea V y VIII). En algunos casos, el dominio de direccionamiento tiene la secuencia indicada en el SEQ ID. NO: 114 tal como se proporciona en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 13/068.808. La lactadherina, también conocida como glóbulo de grasa de la leche-EGF 8, es una glucoproteína de unión a fosfatidilserina de 45 kDa secretada por macrófagos. La lactadherina contiene dominios similares a EGF en el extremo amino terminal y dos dominios C en el extremo carboxilo terminal. Por consiguiente, en algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende el dominio C de lactadherina, un fragmento de la misma o una variante de la misma. En algunos casos, se pueden alterar uno o más restos del dominio C2 para modificar la unión para lograr una tasa de asociación más favorecida de unión a la molécula diana, o para lograr una tasa de disociación más favorecida de unión a la molécula diana. En algunos casos, el dominio de direccionamiento tiene la secuencia indicada en el SEQ ID. NO: 115 o 116 tal como se proporciona en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 13/068.808. En algunos casos, el dominio polipeptídico de direccionamiento comprende una mucina 1 y 4 de inmunoglobulina de linfocitos T (proteína TIM). En otros casos, el dominio polipeptídico de direccionamiento comprende un anticuerpo 3G4 o un dominio de anticuerpo capaz de unirse indirectamente a la fosfatidilserina a través de la 2-glucoproteína plasmática 1. En otros casos más, el dominio polipeptídico de direccionamiento comprende un anticuerpo anti-fosfatidilserina (por ejemplo, PS4A7, SEQ ID NO: 128) o un dominio de anticuerpo capaz de unirse a la fosfatidilserina tal como se proporciona en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 13/068.808.
En algunos casos, el dominio polipeptídico de direccionamiento comprende un polipéptido que se une a la molécula diana. Tales polipéptidos representativos comprenden o tienen las secuencias proporcionadas en el presente documento tales como los SEQ ID NO: 1-4 y 122. Los polipéptidos representativos comprenden o tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con las secuencias proporcionadas tales como los SEQ ID NO: 1-4 y 122. Las secuencias de ácido nucleico de dichos polipéptidos representativas comprenden o tienen las secuencias proporcionadas en el presente documento como los SEQ ID NO: 5-8 y 123. Las secuencias de ácido nucleico de polipéptidos representativos pueden comprender o tener una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % de identidad o al menos aproximadamente el 99 % de identidad con las secuencias proporcionadas tales como los SEQ ID NO: 5-8 y 123.
El polipéptido natural se puede utilizar como dominios de direccionamiento. Será evidente, sin embargo, que también se pueden usar porciones de tales secuencias naturales y polipéptidos que tienen secuencias alteradas, siempre que dichos polipéptidos conserven la capacidad de unirse a la molécula diana con una afinidad de unión apropiada (Kd) tal como se describe con más detalles a continuación.
Dominio de direccionamiento de anticuerpos:
Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" es una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Un anticuerpo típico es un tetrámero que se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). "VL" y "VH" se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Una "región variable de anticuerpo" es una región N-terminal de una cadena variable de anticuerpo (VL o VH) que comprende restos de aminoácidos que son principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente una región variable de anticuerpo y determinar el tamaño mínimo necesario para conferir reconocimiento de antígeno. Normalmente, una región variable de anticuerpo comprende al menos 70 restos de aminoácidos y, más comúnmente, al menos 100 restos de aminoácidos. Un polipéptido que comprende una región variable de anticuerpo puede (pero no es necesario) comprender además otras secuencias de cadena ligera y/o pesada, y puede (pero no es necesario) comprender además secuencias que no provienen de anticuerpos. Será evidente que la secuencia de una región variable de anticuerpo puede ser de origen natural o se puede modificar usando técnicas convencionales, siempre que se conserve la función (reconocimiento de antígeno). Ciertos polipéptidos que comprenden una región variable de anticuerpo son anticuerpos monocatenarios (anticuerpos que existen como una única cadena polipeptídica), más preferentemente, anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) en los cuales una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera se unen (directamente o mediante un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El anticuerpo scFv se puede sintetizar químicamente o se puede expresar a partir de un ácido nucleico que incluye las secuencias codificantes de Vh y Vl unidas directamente o unidas por un enlazador que codifica un péptido.
También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén incluidos en el término "anticuerpo".
Los diacuerpos también se incluyen dentro del término "anticuerpo". Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se pueden sintetizar químicamente o se pueden expresar a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican VH y VL unidos por un enlazador que codifica péptidos.
La "región Fab"/"dominio Fab"/"fragmento Fab", contiene regiones variables que definen la diana específica a la que se puede unir el anticuerpo. Los fragmentos Fab se pueden producir a partir de anticuerpos intactos usando métodos conocidos en la materia, tal como por escisión proteolítica con enzimas o se pueden producir de manera recombinante, utilizando tecnologías convencionales de expresión de proteínas y ADN recombinante.
Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "anticuerpo" incluyen, por tanto, pero sin limitación: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1;
(ii) fragmentos F(ab)2 y F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento scFv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (c Dr ) aislada. Tales anticuerpos se pueden producir a partir de anticuerpos intactos usando métodos conocidos en la técnica, o pueden producirse de manera recombinante, utilizando tecnologías convencionales de expresión de proteínas y ADN recombinante.
En algunos casos, un anticuerpo anti-fosfatidilserina, tal como el anticuerpo quimérico Bavituximab que se une a la fosfatidilserina se puede utilizar como dominio de direccionamiento.
En algunos casos, los anticuerpos que se unen a proteínas asociadas a podocitos se pueden utilizar como dominio de direccionamiento. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos capaces de unirse a la nefrina (NPHS1), podoplanina (PDPN), podocalixina (PODXL), distroglicano (DAG1), GLEPP1 (PTPRO), NEPH1 (KIRREL), cadherina 1 atípica FAT (FAT1), regulador 1 de BMP transmembrana rico en cisteína (CRIM1), integrina alfa-8/beta 1 (ITGA8).
La nefrina, un receptor de señalización de la superficie celular, regula la función de los podocitos. Es una molécula de podocito crucial en la barrera de filtración glomerular del riñón. La nefrina es una proteína transmembrana similar a la Ig. Es un componente principal del diafragma de hendidura de podocitos y es esencial para mantener la permeabilidad glomerular normal.
La podoplanina es una mucoproteína de la membrana de los podocitos glomerulares. La podoplanina desempeña un papel en el mantenimiento de la forma única de los procesos podocitarios del pie y la permeabilidad glomerular. En ratas, la proteína de membrana integral de 43 kD podoplanina se localiza en la superficie de los podocitos y la nefrosis de puromicina se regula transcripcionalmente de forma negativa.
La podocalixina es la principal sialoglicoproteína expresada en la membrana apical del podocito. Participa en la regulación tanto de la adhesión como de la morfología celular y la progresión del cáncer. Funciona como una molécula anti-adhesiva que puede mantener una vía de filtración abierta entre los procesos vecinos del pie en el podocito por repulsión de carga. Actúa como molécula proadhesiva, mejorando la adherencia de las células a los ligandos inmovilizados, aumentando la tasa de migración y los contactos célula-célula de una manera dependiente de la integrina. La proteína induce la formación de microvellosidades apicales dependientes de actina. Está implicada en la formación de un subdominio de la membrana plasmática preapical para establecer la polarización epitelial inicial y la formación de la luz apical durante la tubulogénesis renal. Desempeña un papel en el desarrollo y la agresividad del cáncer al inducir la migración e invasión celular a través de su interacción con la proteína de unión a actina EZR. Afecta a los eventos de señalización dependientes de EZR, lo que lleva a un aumento de las actividades de las vías MAPK y PI3K en las células cancerosas.
En riñón, se ha demostrado que el distroglicano (DG) cubre las membranas basolateral y apical del podocito. El alfa-DG está muy glucosilado, lo que es importante por su unión a laminina y agrina en la membrana basal glomerular. El alfa-DG cubre toda la membrana celular de los podocitos en la rata y se expresa tanto en el lado basolateral como en el apical del podocito. Esta localización sugiere que el alfa-DG juega un papel doble en el mantenimiento de la arquitectura única de los podocitos por su unión a la membrana basal glomerular y en el mantenimiento de la integridad de la hendidura de filtración, respectivamente. Se descubrió distroglucano de forma difusa en toda la superficie celular de los podocitos.
GLEPP1 (PTPRO) es una proteína tirosina fosfatasa de membrana receptora de podocitos ubicada en la membrana celular apical de las células epiteliales glomerulares viscerales y los procesos del pie, se ha utilizado como marcador de lesión aguda de podocitos.
NEPH1 (KIRREL) es una proteína de membrana de podocitos de la superfamilia Ig. Los dominios citoplasmáticos de estas proteínas interactúan con el extremo C-terminal de la podocina. Se expresa en podocitos renales, células implicadas en asegurar la ultrafiltración selectiva por tamaño y carga.
La cadherina 1 atípica FAT (FAT1) es una proteína esencial para la polarización celular, la migración celular dirigida y modulación del contacto célula-célula y expresada en el tipo de célula de podocito altamente polarizada.
El regulador 1 de BMP transmembrana rico en cisteína (CRIM1) tiene una expresión de enriquecimiento tisular en los glomérulos renales y se cree que desempeña un papel en el desarrollo de los tejidos a través de interacciones con miembros de la familia beta del factor de crecimiento transformante, tal como las proteínas morfogenéticas óseas.
La integrina alfa-8/beta 1 (ITGA8) funciona en la génesis del riñón y probablemente de otros órganos regulando el reclutamiento de células mesenquimales en estructuras epiteliales. Reconoce la secuencia RGD en una amplia gama de ligandos, incluido TNC, FN1, SPP1, TGFB1, TGFB3 y VTN. NPNT es probablemente su ligando funcional en la génesis del riñón. Se ha demostrado que ITGA8 se acumula en los glomérulos renales en respuesta a una lesión renal, tal como la nefropatía diabética.
Unión de dominio de direccionamiento
La unión sustancial preferida incluye la unión con una constante de disociación (Kd) de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10­ 11, 10-12 M o mejor. Por ejemplo, la Kd de una interacción anticuerpo-antígeno indica la concentración de anticuerpo (expresada como molaridad) a la que el 50 % de las moléculas de anticuerpo y antígeno se unen en equilibrio termodinámico. Por tanto, a una concentración fija adecuada de antígeno, el 50 % de un anticuerpo de mayor afinidad (es decir, más fuerte) se unirá a moléculas de antígeno a una concentración de anticuerpo menor que la que se requeriría para lograr el mismo porcentaje de unión con un anticuerpo de menor afinidad. La Kd es también la proporción de las tasas cinéticas de activación y desactivación (kon y koff); es decir, Kd = koff/kon. Por tanto, un valor menor de Kd indica una afinidad más alta (más fuerte). Tal como se usa en el presente documento, las "mejores" afinidades son afinidades más fuertes y se identifican por constantes de disociación de valor numérico más bajo que sus comparadores, siendo una Kd de 10-10M de menor valor numérico y, por lo tanto, representa una mejor afinidad que Kd de 10-9 M. Generalmente, se prefieren afinidades mejores (es decir, con un menor valor de Kd y por lo tanto más fuerte) que 10-7M, preferentemente mejor que 10-8 M. También se contemplan valores intermedios a los expuestos en el presente documento, y la afinidad de unión preferida se puede indicar como un intervalo de constantes de disociación, por ejemplo, las afinidades de unión preferidas para los anticuerpos desvelados en el presente documento están representadas por valores de Kd que van desde 10-6 a 10-12 M (es decir, de micromolar a picomolar), preferentemente de 10-7 a 10-12 M, más preferentemente de 10-8 a 10-12 M o mejor. Un anticuerpo que "no presenta una reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá de manera apreciable a un antígeno fuera de diana. Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo que se une específica y selectivamente a la miosina cardíaca presentará al menos dos, y preferentemente tres, o cuatro o más órdenes de magnitud de mejor afinidad de unión (es decir, unión que presenta un valor Kd de dos, tres o cuatro o más órdenes de magnitud menores) para la miosina cardíaca que para las moléculas de miosina distintas de la miosina cardíaca o para las proteínas o péptidos no de miosina. La afinidad y la selectividad de unión se pueden determinar utilizando cualquier método reconocido en la técnica para determinar tales características, incluyendo, por ejemplo, el uso de análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (competencia).
Se puede evaluar la unión y se pueden determinar los valores Kd, utilizando cualquiera de varias técnicas que son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la unión a una molécula de ADN asociada a isquemia se evalúa comúnmente revistiendo un soporte sólido apropiado (por ejemplo, perlas, placa de ELISA o microplaca BIACORE) con fragmentos de ADN diana. Para un dominio de polipéptido de direccionamiento que se une a cualquier secuencia de ADN, los fragmentos de ADN (monocatenarios o bicatenarios) de 10 pares de bases o más se inmovilizan sobre el sustrato sólido. Para un dominio de polipéptido de direccionamiento que se une a una secuencia específica o complejo de ADN (por ejemplo, complejo de ADN-histona) se inmoviliza la diana correspondiente apropiada. Antes de añadir la molécula asociada a isquemia, los sitios de unión no específicos para las proteínas se bloquean con BSA, leche, o cualquier otro bloqueador apropiado. Los pocillos no recubiertos o los pocillos recubiertos con una molécula no diana sirven como controles de especificidad. Se incuban concentraciones crecientes de la proteína de fusión biespecífica (o dominio polipeptídico dirigido) con sustrato recubierto de diana o sustrato de control. Una proteína de fusión o dominio que no se une a la diana también se prueba como control de especificidad. A continuación, se evalúa la unión dependiente de la dosis específica de la diana de la proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) midiendo la cantidad de unión de la proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) a la diana frente a los controles en función del aumento de la dosis utilizando protocolos estándar correspondientes al soporte sólido y la tecnología de unión que se esté utilizando. Tales protocolos representativos incluyen los descritos en Wassaf et al., Anal. Biochem. 351(2):241-53 (2006); Epub 10 de Feb de 2006 (BIACORE); y Murray y Brown, J. Immunol. Methods. 127(1):25-8 (1990) (ELISA). Adicionalmente, también se pueden realizar estudios que varíen la cantidad de molécula diana inmovilizada o que incluyan niveles crecientes de molécula diana soluble como competidor para controlar la unión y la especificidad.
La afinidad de unión y tasas de asociación y disociación para la unión a la molécula diana se miden usando técnicas estándar y se comparan con otras moléculas de control negativo (por ejemplo, proteína de fusión con polipéptido de direccionamiento irrelevante o proteína de fusión que carece de un polipéptido de direccionamiento o proteínas de fusión sin unión de polipéptido de direccionamiento) y moléculas de control positivo (por ejemplo, anticuerpo original que se dirige a la molécula diana u otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se sabe que se unen a la molécula diana). Por ejemplo, el polipéptido de direccionamiento sin unión puede ser una variante de anexina A5 sin unión, una variante de sinaptotagmina sin unión o un scFv sin unión.
En determinados casos, la Kd se determina usando un biosensor (por ejemplo, mediante resonancia de plasmón de superficie (por ejemplo, BIAcore) o análisis de espejo resonante (lAsys)). Dichas determinaciones se pueden realizar según lo descrito por Hefta. et al., Measuring Affinity Using Biosensors, en "Antibody Engineering: A Practical Approach," McCafferty et al. (eds), pág. 99-116 (Oxford University Press, 1996), y referencias citadas en el mismo. En resumen, las tasas de asociación y disociación (kon y koff) se determinan utilizando una microplaca de sensor a la que se ha acoplado la molécula asociada a la isquemia. Para evaluar la asociación (kon), las soluciones de diferentes concentraciones de proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) fluyen a través de la microplaca mientras se controla la unión usando detección sensible a masas. Usando el sistema BIAcore (GE Healthcare; Piscataway, NJ), kon es la pendiente de la gráfica de dR/dt frente a R, en donde R es la señal observada. Tras la unión, la disociación se observa pasando una solución de tampón a través de la microplaca y se determina la koff de forma análoga. La Kd luego se calcula usando la ecuación:
Kd _ koff/kon
En el contexto de la divulgación, una proteína de fusión biespecífica se une a la molécula diana si se une con una Kd de menos de 10-6 M, preferentemente menos de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M. Además, la unión de la proteína de fusión biespecífica a la molécula diana en este ensayo es significativamente mayor (por ejemplo, al menos 2, 10 o 100 veces mayor) que la unión de la proteína de fusión biespecífica a los controles negativos. Preferentemente, la unión a la diana inmovilizada también se puede competir usando un exceso de diana soluble.
Como se ha indicado anteriormente, ciertas moléculas diana son específicas para (o están enriquecidas en) las células dañadas. Las moléculas diana representativas incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilserina, ADN, miosina, miosina cardíaca, c-Met (receptor de HGF), fosfatidilserina, P-selectina e ICAM-1. Se demuestra convenientemente la unión a las células dañadas in vitro utilizando células cultivadas que están expuestas a condiciones que inducen necrosis o apoptosis. Por ejemplo, la necrosis se puede inducir en cardiomiocitos cultivados mediante isquemia/reperfusión simulada y monitorizarse mediante un ensayo de liberación de LDH o ensayo con azul tripán seguido de la resta del número de células que experimentan apoptosis, esencialmente tal como se describe en Shan et al., Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 294:833-841 (2008). Este ensayo cuantifica el total de células muertas y la diferencia entre el total y el número de células apoptóticas se atribuye a la necrosis, como se analiza con mayor detalle posteriormente. Las condiciones que inducen la apoptosis incluyen la exposición a H2O2 o hipoxia, y la apoptosis se puede controlar usando cualquiera de varias técnicas conocidas en la materia que incluyen, por ejemplo, unión anexina A5, escisión de secuencias de péptidos diana por caspasas conocidas que se activan por apoptosis o marcaje de ADN (medida por ensayo TUNEL, esencialmente como se describe en Kuramochi, J. Biol. Chem. 279(49): 51141-47 (2004)). La unión a las células que experimentan necrosis o apoptosis se puede evaluar añadiendo proteína de fusión biespecífica marcada con fluorescencia (o dominio de polipéptido de direccionamiento) o proteínas de control apropiadas para las células después de la inducción de apoptosis o necrosis. Después de la incubación de las proteínas con las células durante tiempos que van desde unos pocos minutos hasta un día, las células se lavan y luego se mide la fluorescencia unida a las células usando inmunofluorescencia, citometría de flujo o técnicas similares. Como alternativa, se pueden usar otros métodos para detectar la proteína de fusión biespecífica unida (o el dominio de polipéptido de direccionamiento), incluyendo el radiomarcaje o el uso de enzimas conjugadas con la proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) o con anticuerpos que se unen a la proteína de fusión (o dominio de polipéptido de direccionamiento), que es una práctica común en los protocolos ELISA. La proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) se une a las células diana si se detecta una unión significativamente mayor (por ejemplo, 2 veces mayor) a las células después de la isquemia (por ejemplo, células que experimentan necrosis o apoptosis), en comparación con las células que no han sufrido lesiones (por ejemplo, células que no sufren apoptosis o necrosis).
El direccionamiento in vivo puede demostrarse induciendo, por ejemplo, isquemia en un modelo animal y comparando el nivel de proteína de fusión biespecífica administrada (o dominio de polipéptido de direccionamiento) en un tejido diana antes y después de la isquemia. El direccionamiento in vivo a células dañadas se puede demostrar induciendo daño tisular en un modelo animal, administrar la proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento), y comparando el nivel de proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) en células dañadas frente a las no dañadas. En una realización, las proteínas de fusión biespecíficas están modificadas genéticamente para el direccionamiento a áreas de daño tisular después de una lesión por isquemia-reperfusión. En tal caso, la demostración del direccionamiento in vivo se puede lograr induciendo el daño tisular, preferentemente mediante un método que cause isquemia seguido de restablecimiento del suministro de sangre. Hay numerosos métodos disponibles para hacer esto en diferentes tejidos. Por ejemplo, el flujo de sangre a la pata trasera del ratón puede bloquearse transitoriamente con un simple torniquete. Como alternativa, se puede emplear una pinza temporal en la arteria que conduce al riñón. La lesión por isquemia-reperfusión se puede inducir en el corazón a través del bloqueo temporal de la arteria coronaria, tal como se demostró en ratones, ratas, perros y cerdos. Los métodos representativos para inducir daño tisular en un modelo animal se resumen en la Tabla 2 a continuación.
T l 2: M r r n iv iliz r in ir ñ r i mi -r rf i n
Figure imgf000030_0001
Los modelos animales para la lesión por isquemia-reperfusión se detallan más en las siguientes referencias:
Greenberg et al., Capítulo 7. Mouse models of ischemic angiogenesis and Ischemla-reperfuslon Injury. Methods Enzymol. 444:159-74 (2008).
Chimenti et al., Myocardial Infarction: animal models. Methods Mol. Med. 98:217-26 (2004).
Black SC, In vivo models of myocardial ischemia and reperfusion injury: application to drug discovery and evaluation. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 43(2):153-67 (2000).
La especificidad del direccionamiento se puede establecer comparando la deposición de la proteína de fusión biespecífica (o el dominio de polipéptido de direccionamiento) en el riñón pinzado frente al no pinzado tal como se muestra en Chen et al., FASEB J. 4(12): 3033-39 (1990), o en la pata trasera tratada frente a la no tratada tal como se muestra en Zbinden et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292: H1891-H1897 (2007), usando proteína de fusión biespecífica radiomarcada (o dominio de polipéptido de direccionamiento).
Como alternativa, la proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) se puede detectar en tejido homogeneizado usando ELISA, o se puede obtener una imagen en tiempo real usando proteína de fusión biespecífica (o dominio de polipéptido de direccionamiento) marcado con el metal apropiado para la obtención de imágenes (por ejemplo, Tc99, Y o Gd). La deposición específica en el área dañada del corazón se puede medir tal como se describe en Dumont et al., Circulation 102(13):1564-8 (2000). Los métodos representativos para demostrar el direccionamiento de proteínas al tejido dañado se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Figure imgf000031_0001
Como se ha indicado anteriormente, ciertos dominios de polipéptidos de direccionamiento comprenden un anticuerpo que se une a la molécula diana (por ejemplo, ADN, miosina, miosina cardíaca, c-Met, P-selectina, ICAM-1, fosfatidilserina). En algunos casos, el dominio de direccionamiento es un anticuerpo anti-miosina (por ejemplo, R11D-10 contra la miosina cardíaca humana, 2G4-sD7 contra la cadena pesada de la miosina cardíaca, 1B2 y 5C2 contra la cadena pesada de la miosina cardíaca humana, 2F4 contra la miosina cardíaca humana, anticuerpos monoclonales contra la miosina, anticuerpo de B7, scFv de B7 u otros anticuerpos conocidos en la técnica). En algunos casos, los determinados dominios de polipéptido de direccionamiento comprenden un anticuerpo scFv que se une a la molécula diana. Por ejemplo, el dominio de direccionamiento puede ser un scFv anti-ADN S1-1 y un scFv anti-ADN SI-22. Tales anticuerpos y anticuerpos scFv representativos comprenden o tienen las secuencias proporcionadas como los SEQ ID NO: 128-136. En algunos casos, Las secuencias de ácido nucleico representativas de tales anticuerpos y anticuerpos scFv comprenden o tienen las secuencias proporcionadas como los SEQ ID NO 220-224 en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 13/068.808.
Será evidente que los anticuerpos funcionalmente relacionados también pueden, o como alternativa, se usan como un dominio de polipéptido de direccionamiento. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana de manera predominante a través de los restos de aminoácidos que están localizados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible generar anticuerpos modificados que imitan las propiedades de un anticuerpo original combinando secuencias CDR de un anticuerpo con secuencias marco de un anticuerpo diferente. Tales secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal.
Por tanto, una o más CDR de una secuencia de dominio de polipéptido de direccionamiento proporcionada en el presente documento se pueden usar para crear anticuerpos funcionalmente relacionados que conservan las características de unión del dominio de polipéptido de direccionamiento original. Las regiones marco variables de cadena pesada y ligera pueden provenir de la misma secuencia de anticuerpos o de secuencias de anticuerpos diferentes. Las regiones CDR se identifican fácilmente usando alineaciones con secuencias conocidas en bases de datos tales como Vbase e IMGT.
Es bien conocido en la técnica que los dominios CDR3 de cadena ligera y pesada del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se generan anticuerpos que incluyen las CDR3 de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos particulares descritos en el presente documento. Los anticuerpos pueden incluir además las CDR1 y/o CDR2 de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos desvelados en el presente documento.
Las regiones CDR 1, 2 y/o 3 de los anticuerpos modificados genéticamente descritos anteriormente pueden comprender la secuencia o secuencias de aminoácidos exactas como las desveladas en el presente documento. Sin embargo, el experto en la materia apreciará que puede ser posible alguna desviación de las secuencias CDR exactas, particularmente para secuencias CDR1 y c DR2, que pueden tolerar más variación que las secuencias de CDR3 sin alterar la especificidad del epítopo (tales desviaciones son, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas). Por consiguiente, en otro caso, el anticuerpo modificado genéticamente puede estar compuesto por una o más CDR1 y CDR2 que son, por ejemplo, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,5 % idénticas a las CDR correspondientes de un anticuerpo mencionado en el presente documento.
En otro caso, uno o más restos de una CDR se pueden alterar para modificar la unión para lograr una tasa de asociación de unión más favorecida, o una tasa de disociación de unión más favorecida. Usando esta estrategia, se puede conseguir un anticuerpo que tenga una afinidad de unión ultra alta (por ejemplo, Kd = 10-10 o menos). Las técnicas de maduración por afinidad, bien conocidas en la técnica, se pueden usar para alterar la(s) región(es) CDR seguidas de la selección de las moléculas de unión resultantes para el cambio deseado en la unión. Por consiguiente, a medida que se modifican las CDR, los cambios en la afinidad de unión, así como en la inmunogenicidad, se pueden monitorizar y puntuar de manera que se logre un anticuerpo optimizado para la mejor unión combinada y baja inmunogenicidad.
También se pueden realizar modificaciones dentro de una o más de las regiones marco o de unión (es decir, restos que no son CDR) de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, siempre que la afinidad de unión al antígeno posterior a estas modificaciones no disminuya sustancialmente.
Enlazadores de péptidos y modulador de semivida
Un experto en la técnica apreciaría que las proteínas biespecíficas utilizadas en aplicaciones terapéuticas pueden no presentar semividas en suero óptimas debido a su peso molecular relativamente bajo. En algunas aplicaciones terapéuticas, por lo tanto, puede ser deseable modular la semivida de las proteínas biespecíficas. En algunos casos, para lograr la acumulación de la proteína biespecífica en el área enferma lesionada o dañada de un órgano, la proteína biespecífica está conjugada, asociada operativamente o fusionada con un péptido enlazador. En algunos casos, para lograr la acumulación de la proteína biespecífica en el área lesionada o dañada de un órgano, la proteína biespecífica está conjugada, operativamente asociada o fusionada con un modulador de la semivida. Preferentemente, el enlazador peptídico o el modulador de la semivida no es inmunogénico en humanos.
En algunos casos, los moduladores de semivida pueden aumentar la semivida in vivo de las proteínas de fusión. Por ejemplo, la semivida de las proteínas biespecíficas que comprenden el modulador de la semivida es de aproximadamente 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas o más. En algunas realizaciones, la semivida de las proteínas biespecíficas que comprenden el modulador de la semivida es de aproximadamente 24 horas o más. En algunos casos, la semivida de las proteínas biespecíficas que comprenden el modulador de la semivida es de aproximadamente una semana o más.
El dominio de polipéptido de direccionamiento y el dominio activador se pueden unir directamente mediante un enlace peptídico. En algunos casos, se pueden unir mediante un modulador de la semivida. En casos preferidos, el modulador de la semivida es un polipéptido. Por consiguiente, el modulador de la semivida puede tener dos extremos terminales, un extremo N-terminal y un C-terminal. En algunos casos, el modulador de la semivida se une en un extremo mediante un enlace peptídico al dominio de polipéptido de direccionamiento y se une en el otro extremo mediante un enlace peptídico al dominio activador. En determinados casos, el enlazador se une en el N-terminal al C-terminal del dominio de polipéptido de direccionamiento y en el C-terminal al N-terminal del dominio activador. En otros casos, el enlazador se une en el extremo C-terminal al dominio de polipéptido de direccionamiento y en el extremo N-terminal al dominio activador. Sin embargo, en otros casos, el modulador de la semivida se une en uno de los extremos de la proteína biespecífica. Por ejemplo, en algunos casos, el modulador de la semivida se une en el extremo C-terminal al extremo N-terminal del dominio activador. En otros casos, el modulador de la semivida se une en el extremo C-terminal del dominio de direccionamiento. En otros casos, el modulador de la semivida se puede unir en el extremo N-terminal al extremo C-terminal del dominio activador. En otros casos más, el modulador de la vida media se puede unir en el N-terminal al C-terminal del dominio de direccionamiento.
En algunos casos, el modulador de la semivida está modificado genéticamente para promover el tamaño de la proteína de fusión biespecífica más allá de aproximadamente 70 kDa o un radio equivalente para minimizar la excreción renal. En algunos casos, el modulador de la semivida está modificado genéticamente para prolongar la semivida de la proteína de fusión biespecífica a través del reciclaje mediado por el receptor de FcRn o mediante la unión a componentes del suero como la albúmina de suero humano (HSA).
En algunos casos, el enlazador peptídico o el modulador de la semivida no es inmunogénico en humanos. El modulador de la semivida puede ser una proteína de suero humano o un derivado de la misma que conserva al menos el 50 % de identidad de secuencia en una región que consta de al menos 100 aminoácidos consecutivos. Tal como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" significa, en el contexto de comparar un polinucleótido o una secuencia polipeptídica con una secuencia de referencia, que la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos es la misma o tiene un porcentaje especificado de nucleótidos o restos que son iguales en las ubicaciones correspondientes dentro de la secuencia de referencia cuando las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos están alineadas de manera óptima.
En algunos casos, el modulador de la semivida se puede modificar mediante la glucosilación de uno o más sitios de glucosilación presentes en el modulador de la semivida. Por ejemplo, los siguientes aminoácidos: asparagina, serina, treonina se pueden añadir o eliminar para alterar la glucosilación del modulador de la semivida. En algunos casos, la glucosilación del modulador de la semivida en la proteína biespecífica puede modular la semivida de la proteína biespecífica. En algunos casos, la secuencia del modulador de la semivida se modifica para reducir la glucosilación. Dicha modificación comprende la sustitución de Asn (N) por Gln (Q) o Ala (A), y/o la sustitución de Ser (S) o Thr (T) por Ala (A).
La albúmina de suero humano (HSA, SEQ ID NO: 54) tiene una semivida en suero naturalmente larga, en parte debido a su unión a FcRN y al reciclaje. HSA es la proteína más abundante en la sangre y tiene una seguridad demostrada en humanos.
En algunos casos, el modulador de la semivida es una variante de HSA. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 200 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 300 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 400 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 500 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano de tipo silvestre.
En algunos casos, el modulador de la semivida puede comprender una secuencia de albúmina de suero humano o una variante de la misma. En algunos casos, la secuencia de albúmina de suero humano puede tener una deleción de 3 aa, una de 4aa, una de 5aa, una de 6aa o más en el extremo C-terminal de la HSA.
En algunos casos, la variante HSA puede tener una o más de las siguientes sustituciones:
la cisteína C58 puede sustituirse, por ejemplo, con una serina (C58S),
la lisina K420 se puede sustituir, por ejemplo, con un ácido glutámico (K420E),
la asparagina N527 se puede sustituir, por ejemplo, con una glutamina (N527Q),
el ácido glutámico E505 se puede sustituir, por ejemplo, con una glicina G (E505G),
la valina V547 se puede sustituir, por ejemplo, con una alanina (V547A),
la asparagina N527 se puede sustituir, por ejemplo, con una glutamina (N527Q).
En algunos casos, la variante HSA puede tener los aminoácidos 26-609 y tener una o más de las siguientes sustituciones:
la cisteína C58 puede sustituirse, por ejemplo, con una serina (C58S),
la lisina K420 se puede sustituir, por ejemplo, con un ácido glutámico (K420E),
la asparagina N527 se puede sustituir, por ejemplo, con una glutamina (N527Q),
el ácido glutámico E505 se puede sustituir, por ejemplo, con una glicina G (E505G),
la valina V547 se puede sustituir, por ejemplo, con una alanina (V547A),
la asparagina N503 y/o N527 se pueden sustituir, por ejemplo, con una glutamina (N503Q y/o N527Q).
En algunos casos, la variante HSA (denominada en el presente documento mHSA) tiene las siguientes sustituciones: C34S, N503Q (SEQ ID NO: 55). En algunos casos, la variante HSA (referida en el presente documento como mHSA7) tiene las siguientes sustituciones C34S, N503Q, E505G y V547A (SEQ ID NO: 56). En algunos casos, la variante de HSA tiene los aminoácidos 26-609 y las siguientes sustituciones C58S y N527Q (SEQ ID NO: 124).
En algunos casos, la asparagina en la posición 503 y/o 527 de HSA, que puede desamidarse y disminuir la semivida, se puede eliminar mediante la sustitución N503Q y/o la N527Q. En algunos casos, la cisteína C34 de HSA se puede sustituir por serina o alanina (S o A) para eliminar la cisteína libre y minimizar la formación de enlaces disulfuro alternativos. En algunos casos, el modulador de la semivida es una versión modificada del dominio III (mHSA_dIII) de una HSA modificada con la sustitución N503Q y una glicina terminal adicional. Tal versión modificada conserva la propiedad de HSA de unirse a FcRn y aumenta la semivida en suero.
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de Fc humana (SEQ ID NO: 21 proporcionada en la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 13/068.808). En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % idénticos a una secuencia de aminoácidos de Fc humana de tipo silvestre. El dominio Fc de un anticuerpo tiene una capacidad natural para unirse a FcRn, dando como resultado una semivida prolongada. En algunos casos, el dominio Fc de un anticuerpo está modificado genéticamente para que no se una a Fc(gamma)R. En un caso ilustrativo, el dominio Fc está modificado genéticamente para sustituir N297 con Q (variante de N297Q). En algunos casos, el modulador de la semivida es una variante monomérica de Fc, llamada scFc. Por ejemplo, el subconjunto de la cadena pesada de IgG que naturalmente se dimeriza para formar Fc es bisagra-CH2-CH3. En algunos casos, el dominio Fc está modificado genéticamente para formar una sola cadena uniendo la bisagra-CH2-CH3 con un enlazador flexible como GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS para crear una cadena bisagra-CH2-CH3-enlazador-bisagra-CH2-CH3. En un caso ilustrativo, el Fc de cadena sencilla (scFc) está modificado genéticamente para sustituir N297 con Q y C220 con S (N297Q, C220S).
En algunos casos, las proteínas pueden comprender las regiones Fc de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) como modulador de la semivida. El uso de tal marco da como resultado una proteína constitutivamente dimérica. El producto de traducción principal del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión Fc es una molécula única que comprende el brazo de señalización y/o de direccionamiento unido a una cadena sencilla de Fc que proviene de, por ejemplo, IgG1 humana. Después de la traducción, pero antes de la secreción, esta molécula de fusión se dimeriza a través de 3 restos de cisteína en la región Fc para formar una proteína de fusión dimérica. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión Fc pueden ser homodímeros que tienen dos brazos de señalización, dos brazos de direccionamiento o dos brazos de señalización y dos brazos de direccionamiento (véase la FIG. 1A)
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de alfa-fetoproteína (AFP) humana de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de alfafetoproteína (AFP) humana de tipo silvestre. En algunos casos, el sitio de glucosilación N-ligado de la AFP se elimina mediante la sustitución N251Q.
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a la vitamina D (VDBP) de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a la vitamina D (VDBP) de tipo silvestre. En algún caso, el sitio de glucosilación N-ligado de la VDBP puede eliminarse mediante la sustitución N288Q o N288T.
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana (TTR) de tipo silvestre. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana (TTR) de tipo silvestre. En algunos casos, la transtiretina se modifica para eliminar el sitio de N-glucosilación N118. En algunos casos, el modulador de la semivida es una forma monomérica de TTR.
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de PASilación. PASilación son secuencias enriquecidas en prolina, alanina y/o serina que imitan la PEGilación (véase el documento WO/2008/155134). En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de PASilación. PASilación son secuencias enriquecidas en prolina, alanina y/o serina que imitan la PEGilación (véase el documento WO/2008/155134). Los tramos polipeptídicos de prolina, alanina y/o serina forman dominios tridimensionales semiestructurados con un gran radio hidrodinámico, reduciendo así la eliminación de proteínas de fusión. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de PASilación tiene una longitud de aproximadamente 200, 300, 400, 500 o 600 aminoácidos. Por ejemplo, la PASilación es una repetición 20 veces mayor de la secuencia de aminoácidos ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 137).
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende la unión de la cadena o cadenas de polietilenglicol (PEG) a las proteínas de fusión a través de la unión química al extremo N-terminal y/o C-terminal y/o a una cadena lateral de aminoácidos (por ejemplo, anclaje de PEG-maleimida a las cisteínas). Las cadenas de PEG forman dominios tridimensionales semiestructurados con un gran radio hidrodinámico, reduciendo así la eliminación de proteínas de fusión.
En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90% o 95% idénticos a una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano de dominio de unión a albúmina (albudAb) (SEQ ID NO: 138). En algunos casos, el modulador de la semivida comprende al menos 100 aminoácidos consecutivos que son aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90% o 95% idénticos a una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano de dominio de unión a albúmina (albudAb). Los anticuerpos del dominio de unión a la albúmina pueden aumentar la semivida de la proteína de fusión al unirse de forma no covalente a la albúmina sérica (véase el documento WO2008/096158). En algunos casos, el anticuerpo humano del dominio de unión a la albúmina está modificado genéticamente para eliminar la arginina de C-terminal para eliminar el sitio de la proteasa Lys-Arg Kex2.
Los moduladores de semivida representativos de este tipo incluyen los enumerados en cualquiera de los SEQ ID NO: 57-59.
En algunos casos, los moduladores de la semivida se pueden modificar para sustituir los restos de cisteína por restos de serina o alanina para reducir la capacidad de formar enlaces disulfuro.
En algunos casos, los moduladores de la semivida proporcionan una semivida prolongada de la proteína de fusión biespecífica, en comparación con la proteína de fusión sin modulador de la semivida. El efecto de un modulador de la semivida se puede evaluar usando un ensayo que determina la estabilidad en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la proteína de fusión biespecífica se puede incubar a 37 °C en suero (por ejemplo, suero humano) durante 120 horas, con muestras extraídas al inicio de la incubación y cada 24 horas a partir de entonces. A continuación, se realizan ensayos de unión como se describió anteriormente para detectar el nivel de proteína de fusión biespecífica funcional en cada punto de tiempo. Este nivel se compara luego con el nivel de proteína de fusión biespecífica construida sin modulador de semivida (o usando un modulador de la semivida diferente) para proporcionar una comparación de la estabilidad del suero.
Elementos opcionales
El modulador de la semivida se puede incorporar o conjugar en una proteína de fusión biespecífica sola o usando un péptido conector corto (por ejemplo, de 2 a 40, 2-50, 2-100 restos de aminoácidos). En algunos casos, el polipéptido conector está presente en el extremo N-terminal, en el C-terminal o tanto en el N-terminal como en el C-terminal del modulador de la semivida en uno o ambos extremos. Los polipéptidos de conector corto adecuados para su uso en el extremo N-terminal del enlazador incluyen, por ejemplo, dipéptidos tales como -Gly-Ser-(GS), -Gly-Ala-(GA) y -Ala-Ser-(AS). Los polipéptidos de conector corto adecuados para su uso en el extremo C-terminal del enlazador incluyen, por ejemplo, dipéptidos tales como -Leu-Gln-(LQ) y -Thr-Gly-(TG). En algunos casos, los conectores tienen más de 2 aminoácidos. Por ejemplo, los conectores tienen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud o más. En algunos casos, los conectores son 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más aminoácidos de longitud. Preferentemente, tales conectores son flexibles (por ejemplo, ricos en glicina) o estructurados (por ejemplo, ricos en hélice alfa). En algunos casos, los enlazadores de conector tienen una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62. En algunos casos, los enlazadores de conector pueden tener una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62 en las que las serinas se sustituyen por glutamato. Por ejemplo, el enlazador puede tener una secuencia indicada en el SEQ ID NO: 126. En algunos casos, los enlazadores de conector tienen una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 28-30 proporcionadas en la Solicitud de Patente de EE. UU. N.°: 13/068.808. Tales polipéptidos de conector corto y conector enumerados en los SEQ ID NO: 28-30, si están presentes, pueden estar ubicados en uno o ambos extremos terminales del modulador de semivida.
En algunos casos, los polipéptidos conectores pueden ser enlazadores alifáticos, es decir, enlazadores que tienen grupos alifáticos tales como alanina, leucina, valina, isoleucina, prolina o glicina. Por ejemplo, el conector puede tener las siguientes secuencias AAALAAA (SEQ ID NO: 127).
En algunos casos, los conectores se basan en proteínas humanas como la transtiretina.
Resultará evidente que elementos además de los descritos anteriormente pueden incluirse opcionalmente en las proteínas de fusión biespecíficas proporcionadas en el presente documento. Dichos elementos pueden estar presentes para varios propósitos, incluidos facilitar la expresión, preparación o purificación de la proteína de fusión biespecífica, o realizar funciones de direccionamiento.
En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas tienen una señal de secreción en N-terminal que se puede escindir durante la expresión. Por ejemplo, puede estar presente un polipéptido líder en N-terminal. En algunas realizaciones, el polipéptido líder en N-terminal tiene una secuencia indicada en el SEQ ID NO: 105.
Una proteína de fusión biespecífica también puede, o como alternativa, comprende un marcador de polihistidina (por ejemplo, hexahistidina) para facilitar la purificación. Un marcador de este tipo comprende al menos seis restos de aminoácidos consecutivos de histidina y puede estar ubicada en el extremo C-terminal o N-terminal. En determinados casos, se incluye un marcador de hexahistidina en el extremo C-terminal de la proteína biespecífica. También pueden estar presentes restos de aminoácidos adicionales en la unión de la polihistidina con el resto de la proteína biespecífica.
Proteínas biespecíficas representativas
De acuerdo con algunos aspectos de la divulgación, las proteínas biespecíficas tienen un activador en N-terminal (también denominado en el presente documento brazo de señalización), un brazo de direccionamiento en C-terminal y un enlazador peptídico central o modulador de la semivida. Sin embargo, en algunos aspectos de la divulgación, las proteínas biespecíficas tienen un activador en N-terminal (también denominado en el presente documento brazo de señalización) y un brazo de direccionamiento en C-terminal. Sin embargo, en otros aspectos de la divulgación, las proteínas biespecíficas tienen un activador en C-terminal (también denominado en el presente documento brazo de señalización) y un brazo de direccionamiento en N-terminal. En otros aspectos más de la divulgación, las proteínas biespecíficas tienen un activador en C-terminal (también denominado en el presente documento brazo de señalización), un brazo de direccionamiento en N-terminal y un enlazador peptídico central o modulador de la semivida.
En algunos aspectos de la divulgación, las proteínas biespecíficas pueden tener además un enlazador o conector que une el brazo de direccionamiento al modulador de la semivida y/o el dominio activador al modulador de la semivida.
Las proteínas de fusión biespecíficas representativas comprenden (de N-terminal a C-terminal):
(a) Un polipéptido líder opcional;
(b) un dominio de polipéptido de direccionamiento (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 1-4 y 122);
(c) un péptido conector opcional (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62, 126-127);
(d) un enlazador peptídico o un modulador de la semivida (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia enumerada en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 y 124);
(e) un péptido conector opcional (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62, 126-127);
(f) un dominio activador (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en cualquiera de los SEQ ID NO: 10-30 o 120); y
(g) un péptido de polihistidina opcional.
Las proteínas de fusión biespecíficas representativas comprenden (de N-terminal a C-terminal):
(a) un polipéptido líder opcional;
(b) un dominio activador (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en cualquiera de los SEQ ID NO: 10-30 y 120);
(c) un péptido conector opcional (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62, 126-127);
(d) un enlazador peptídico o un modulador de la semivida (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia enumerada en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124);
(e) un péptido conector opcional (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 60-62, 126-127);
(f) un dominio polipeptídico de direccionamiento (por ejemplo, que comprende o tiene una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 1-4 y 124); y
(g) un péptido de polihistidina opcional.
Las proteínas biespecíficas representativas incluyen, pero sin limitación,
SGF basados en IGF1 dirigidos, de potencia reducida:
Figure imgf000037_0001
SGF basados en NrgIa dirigidos, de potencia reducida
| 757 | Nrg1a Ik7 mHSA Ik7 AnxV(ni)
Los controles representativos incluyen, pero no se limitan a:
SGF basados en IGF1 no dirigidos, de potencia reducida
Figure imgf000037_0002
SGF basados en IGF1 no dirigidos, sin potencia reducida
Figure imgf000037_0004
SGF basados en IGF1 dirigidos, sin potencia reducida
Figure imgf000037_0003
Las proteínas biespecíficas representativas incluyen, pero sin limitación, las proteínas SGF 606 (SEQ ID NO: 70), SGF 683 (SEQ ID NO: 67), SGF 711 (SEQ ID NO: 73), SGF 713 (SEQ ID NO: 74), SGF 716 (SEQ ID NO: 75), SGF 727 (SEQ ID NO: 76), SGF 728 (SEQ ID NO: 77), SGF 729 (SEQ ID NO: 78), SGF 730 (SEQ ID NO: 79), SGF 731 (SEQ ID NO: 80), SGF 732 (SEQ ID NO: 81), SGF 733 (SEQ ID NO: 82), SGF 739 (SEQ ID NO: 83), SGF 740 (SEQ ID NO: 84), SGF 741 (SEQ ID NO: 85), SGF 743 (SEQ ID NO: 86), SGF 734 (SEQ ID NO: 108), SGF 737 (SEQ ID NO: 116), SGF 757 (Se Q ID NO: 110), SGF 776 (s Eq ID NO: 118). Las proteínas biespecíficas representativas incluyen, pero sin limitación, las proteínas SGF ilustradas en las FIG. 1A-1B y FIG. 10.
En algunos casos, la proteína biespecífica es una proteína modificada que tiene desde el extremo C-terminal al N-terminal, un dominio activador que tiene el SEQ ID NO: 120, un conector que tiene los SEQ ID NO: 60-62, 126-127, un enlazador que tiene el SEQ ID NO: 124, un conector que tiene los SeQ ID NO: 60-62, 126-127 y un dominio de direccionamiento que tiene el SEQ ID NO: 122. En algunos casos, la proteína biespecífica es IGF1(E2R/Y31A)_Ik7_HSA 26-609(C58S/N527Q)_lk7_AnxV 2-320 (R63A/K70A/K101A/E138A/D139G/N160A/C316A). En algunos casos, la proteína biespecífica tiene el SEQ ID NO: 118.
Las proteínas de fusión biespecíficas representativas pueden tener una secuencia indicada en los SEQ ID NO: 67, 70, 73-86, 108, 110 o 116. En algunos casos, las proteínas no tienen un brazo de direccionamiento y sirven como controles negativos. En algunos casos, las proteínas de control no dirigidas incluyen, pero sin limitación, las proteínas SGF 604 (SEQ ID NO: 69), SGF 688 (SEQ ID NO: 72), SGF 703 (SEQ ID NO: 68), SGF 704 (SEQ ID NO: 107), SGF 602 (SEQ ID NO: 66), s Gf 746 (SEQ ID NO; 109), tal como se ilustra en la FIG. 1A-1b , o las proteínas biespecíficas representativas SGF 606, SGF 711, SGF 713, SGF 727, SGF 728, SGF 729, SGF 730, SGF 731, SGF 732, SGF 733, s Gf 734, SGF 737, SGF 739, SGF 740, SGF 741, SGF 743, SGF 649 sin el brazo de direccionamiento se pueden utilizar. En algunos casos, las proteínas sin el brazo de direccionamiento se pueden utilizar como control negativo, por ejemplo, en el ensayo de cambio de potencia. En algunos casos, las proteínas pueden comprender las regiones Fc de la IgG como modulador de la semivida. El uso de tal marco da como resultado una proteína constitutivamente dimérica.
Preparación de proteínas biespecíficas
Las proteínas modificadas genéticamente de la divulgación se pueden sintetizar mediante técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, por síntesis química tal como la síntesis de péptidos en fase sólida. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. En general, estos métodos emplean métodos de síntesis en fase sólida o en solución, bien conocidos en la técnica. Específicamente, los métodos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o aminoácidos adecuadamente protegidos a una cadena de péptidos en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado puede entonces unirse a un soporte sólido inerte o se puede utilizar en solución añadiendo el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, en condiciones adecuadas para formar el enlace amida. A continuación, se elimina el grupo protector de este resto de aminoácido recién añadido y luego se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se hayan enlazado en la secuencia adecuada, cualquier grupo protector restante y cualquier soporte sólido se eliminan de forma secuencial o simultánea para producir el polipéptido final. Por simple modificación de este procedimiento general, es posible agregar más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, mediante el acoplamiento (bajo la condición de que no racemicen los centros quirales) de un tripéptido protegido con un dipéptido adecuadamente protegido para formar, después de la desprotección, un pentapéptido.
Las proteínas biespecíficas se pueden sintetizar utilizando técnicas convencionales, que incluyen la síntesis de péptidos en fase líquida y sólida y técnicas de ADN recombinante. Para la síntesis en fase sólida, el aminoácido de C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble y los aminoácidos restantes se añaden en secuencia. Para polipéptidos de más de 50 aminoácidos, las regiones más cortas se pueden sintetizar de esta manera y luego condensarse para formar el polipéptido más largo. Se conocen bien en la técnica procedimientos para formar enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo carboxilo terminal (por ejemplo, mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-diciclohexilcarbodiimida). En algunos aspectos de la invención, los polipéptidos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante sintetizando ADN que codifica el polipéptido deseado. Una vez que se han sintetizado o aislado las secuencias codificantes de los polipéptidos deseados, se pueden clonar en cualquier vector adecuado para la expresión. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de elección. El gen se puede colocar bajo el control de un promotor, un sitio de unión al ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (denominado colectivamente en el presente documento como elementos de "control"), de modo que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado se transcribe en ARN en la célula hospedadora transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder. Pueden añadirse secuencias líder heterólogas a la secuencia codificante que provoca la secreción del polipéptido expresado del organismo hospedador. También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de proteínas en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Tales secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellas que provocan que la expresión de un gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.
Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden unir a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Como alternativa, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.
La presente invención también abarca polinucleótidos que codifican las proteínas y variantes de proteínas descritas anteriormente que pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. Las secuencias codificantes que codifican las variantes de la presente invención pueden variar como resultado de la redundancia o degeneración del código genético.
Para técnicas de ADN recombinante, el ADN que codifica la proteína de fusión biespecífica se prepara químicamente o aislando y uniendo el ADN que codifica cada porción de la proteína de fusión. El ADN que codifica cada segmento de la proteína de fusión biespecífica se puede aislar de genes conocidos o se puede sintetizar desde cero. Los métodos para la síntesis química directa de ADN son bien conocidos en la técnica, y tales síntesis se realizan de forma rutinaria usando un sintetizador automático. La síntesis química produce un polipéptido monocatenario, que se convierte en ADN bicatenario mediante hibridación con una secuencia complementaria o usando ADN polimerasa. Si bien la síntesis química de ADN generalmente se limita a secuencias que son más cortas que la proteína de fusión biespecífica, resultará evidente que la proteína de fusión biespecífica completa se puede obtener mediante ligación de secuencias más cortas en marco. Como alternativa, las secuencias de ADN que codifican la proteína de fusión biespecífica se preparan mediante clonación. Las técnicas de clonación son bien conocidas en la materia y se describen ampliamente, por ejemplo, por referencias estándar tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Las porciones del ADN se pueden ligar juntas en marco para generar la secuencia codificante de longitud completa.
Una vez que se obtiene el ADN que codifica la proteína de fusión biespecífica, el ADN se puede clonar en un vector para su expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota. Las técnicas para incorporar ADN en dichos vectores son bien conocidas por los expertos en la materia. Dentro de tal vector de expresión, el ADN que codifica la proteína de fusión biespecífica está operativamente unido a las secuencias de nucleótidos necesarias para la expresión (por ejemplo, un promotor adecuado y, si es necesario, una señal de terminación). Un promotor es una secuencia de nucleótidos (normalmente ubicada en 5' de la secuencia codificante) que dirige la transcripción de secuencias codificantes unidas de forma adyacente. Una señal de terminación puede ser un codón de terminación para finalizar la traducción y/o una señal de terminación de la transcripción. También pueden estar presentes elementos reguladores adicionales (por ejemplo, elementos potenciadores) dentro de un vector de expresión. Tal vector es preferentemente un vector plásmido o vírico. Preferentemente, un vector de expresión comprende además un marcador seleccionable, lo que confiere resistencia a una selección. Esto permite que las células integren de manera estable el vector en sus cromosomas y crezcan para formar focos, que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Se conocen en la técnica varios marcadores seleccionables, incluyendo, por ejemplo, genes que proporcionan resistencia a la ampicilina, metotrexato, ácido micofenólico, el aminoglucósido G-418, higromicina y puromicina. Los expertos en la materia conocen los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de proteínas incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO, HEK293, HeLa y de mieloma.
Las células hospedadoras se transforman o transfectan con el vector que comprende el ADN que codifica la proteína de fusión biespecífica usando métodos convencionales. La expresión en la célula hospedadora da como resultado la transcripción del ADN en el ARNm correspondiente, seguido de la traducción del ARNm para generar la proteína de fusión biespecífica.
Una vez expresados, la proteína de fusión biespecífica se puede purificar de acuerdo con procedimientos estándar, incluyendo, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en columna de afinidad. Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 al 95 % de homogeneidad, y del 98 al 99 % o más de homogeneidad es lo más preferido para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o a la homogeneidad que se desee, si han de usarse terapéuticamente, los polipéptidos deberían estar sustancialmente libres de endotoxina.
Composiciones farmacéuticas
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una proteína de fusión biespecífica tal como se describe en el presente documento, junto con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable. Dichas composiciones se pueden usar para tratar pacientes que padecen o están en riesgo de padecer, daño al tejido, para prevenir daño tisular, o para reparar o regenerar tejido dañado. Dichos pacientes incluyen, por ejemplo, pacientes que han sufrido un infarto de miocardio, daño renal y/o accidente cerebrovascular isquémico. Si se desea, también se pueden incluir otros ingredientes activos dentro de la composición farmacéutica, tal como las células madre u otros agentes que facilitan la reparación del tejido dañado.
Un "paciente" es un mamífero, preferentemente un ser humano. El término "tratando" (o "tratar" o "tratamiento") significa ralentizar, reducir o revertir el avance o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad o dosis de proteínas biespecíficas de la presente invención que, tras la administración de una dosis única o múltiple a un paciente, proporciona el tratamiento deseado.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "fisiológicamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la proteína de fusión biespecífica. Los vehículos fisiológicamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, origen vegetal o sintético (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo). El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, parenteral, intranasal, tópica, administración oral o local, tal como por un medio transdérmico, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Estas composiciones pueden tomar cualquiera de varias formas bien conocidas que se adapten al modo de administración, tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, aerosoles y formulaciones de liberación sostenida. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos convencionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir transportadores convencionales, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de modos de administración y vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", A.R. Gennaro, ed. Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA (21a ed., 2005)).
Habitualmente, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se administran por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea), o por ingestión oral o aplicación tópica.
El término "administrar", tal como se usa en el presente documento, se define como la introducción física real de la composición en o sobre (según sea apropiado) el sujeto hospedador. Todos y cada uno de los métodos para introducir la composición en el sujeto se contemplan de acuerdo con la presente invención; el método no depende de ningún medio particular de introducción y no debe interpretarse así. Los medios de introducción son bien conocidos por los expertos en la técnica, y preferentemente, la composición se administra por vía subcutánea o intratumoral. Un experto en la materia reconocerá que, aunque se puede utilizar más de una vía para la administración, una vía particular a menudo puede proporcionar una vía más inmediata y más eficaz que otra vía. La administración local o sistémica se puede lograr mediante la administración que comprende la aplicación o instilación en las cavidades corporales, inhalación o insuflación de un aerosol, o por introducción parenteral, que comprende la administración intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea o intradérmica.
Para la administración parenteral, la proteína de fusión biespecífica puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Generalmente se prefiere un vehículo acuoso estéril, tal como agua, agua tamponada, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Adicionalmente, pueden emplearse aceites fijos, estériles como disolvente o un medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, los ácidos grasos tales como ácido oleico, son útiles en la preparación de composiciones inyectables. También se pueden incluir sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes humectantes, detergentes, conservantes, anestésicos locales y agentes tamponadores.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para la administración intravenosa a un paciente (por ejemplo, un ser humano). Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente sellado (por ejemplo (herméticamente sellado) tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de principio activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede distribuirse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
Las composiciones destinadas a uso oral pueden presentarse como, por ejemplo, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleaginosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas o jarabes o elixires. Dichas composiciones pueden comprender además uno o más componentes tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Los comprimidos contienen el principio activo en mezcla con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes, agentes granulantes y disgregantes, agentes aglutinantes y agentes lubricantes. Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso. Las suspensiones acuosas comprenden los principios activos mezclados con uno o más excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen agentes de suspensión y agentes humectantes o dispersantes. Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes.
Pueden formularse suspensiones oleosas suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las composiciones farmacéuticas también se pueden encontrar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen, por ejemplo, gomas de origen natural, fosfátidos y anhídridos de origen natural.
Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales o se pueden esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas se pueden envasar para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de una composición farmacéutica acuosa normalmente estará entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como de 7 a 7,5.
Las proteínas de fusión biespecíficas proporcionadas en el presente documento generalmente están presentes dentro de una composición farmacéutica a una concentración tal que la administración de una dosis única a un paciente libera una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que da como resultado un beneficio discernible para el paciente, tal como la reparación o la regeneración detectable de tejido dañado o la reducción de síntomas de daño tisular. Las cantidades terapéuticamente eficaces se pueden aproximar a partir de las cantidades suficientes para lograr una reparación o regeneración tisular detectable en uno o más modelos animales ejemplificados en la Tabla 3. Sin embargo, será evidente que varios factores afectará a la cantidad terapéuticamente eficaz, incluyendo la actividad de la proteína de fusión biespecífica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el género y la dieta del paciente; el tiempo y la vía de administración; la tasa de excreción; cualquier tratamiento simultáneo, tal como una combinación de fármacos; y el tipo y la gravedad del daño tisular en el paciente que se somete a tratamiento. Las dosificaciones óptimas se pueden establecer usando un ensayo y procedimientos habituales que se conocen bien en la técnica. Las dosis generalmente varían entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 400 mg de proteína de fusión biespecífica por dosis (por ejemplo, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg o 400 mg por dosis). En general, se prefieren las composiciones que proporcionan niveles de dosificación que varían de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. En determinadas realizaciones, las formas unitarias de dosificación contienen entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 100 mg de proteína de fusión biespecífica.
Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar para tratar o prevenir el daño tisular (por ejemplo, para el tratamiento del infarto de miocardio o daño renal). Las preparaciones farmacéuticas envasadas incluyen un recipiente que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento e instrucciones (por ejemplo, etiquetado) que indican que la composición contenida se utilizará para tratar daño tisular (como infarto de miocardio o daño renal) en un paciente. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar en múltiples unidades de dosis unitaria, conteniendo, cada uno, una cantidad fija de proteína de fusión biespecífica en un paquete sellado. Como alternativa, el recipiente puede contener múltiples dosis de la composición farmacéutica.
Los kits que comprenden una o más de las proteínas biespecíficas descritas en el presente documento, así como las instrucciones de uso de dichos agentes para tratar el daño tisular, también se incluyen.
Métodos de tratamiento
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un paciente (preferentemente un mamífero tal como una vaca, un cerdo, un caballo, un pollo, un gato, un perro, o más preferentemente, un ser humano) para tratar el daño tisular patológico en el paciente. Dentro del contexto de la presente invención, el término "tratamiento" abarca tanto la administración profiláctica como la terapéutica. En aplicaciones profilácticas, una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento se administra a un paciente susceptible o en riesgo de desarrollar daño tisular patológico, para evitar, retrasar o reducir la gravedad del daño tisular. En aplicaciones terapéuticas, el tratamiento se realiza para reducir la gravedad del daño tisular patológico o regenerar tejido después del daño. En algunos casos, la composición farmacéutica se puede administrar en combinación con otras composiciones terapéuticas.
El daño tisular patológico representativo incluye daño al tejido cardíaco (por ejemplo, daño asociado a infarto de miocardio), daño al tejido renal y daño tisular después de un accidente cerebrovascular isquémico (por ejemplo, isquemia cerebral, también conocida como isquemia del cerebro, isquemia crítica de la extremidad u otra isquemia). En algunos casos, la composición farmacéutica se puede usar para proteger al tejido de daños y/o para regenerar tejido y/o suministro de sangre después de daño de tejido u órgano.
Entre los pacientes hospitalizados con un infarto agudo de miocardio (IAM), aproximadamente el 20 % desarrolla una lesión renal aguda (LRA), que está vinculada a resultados adversos a largo plazo, incluyendo insuficiencia renal permanente y enfermedad renal en etapa terminal. En algunos casos, la composición farmacéutica se puede usar para prevenir o proteger el tejido renal del daño y/o para regenerar tejido y/o suministro de sangre después de daño renal o daño tisular después de un infarto agudo de miocardio (IAM).
En algunos casos, la composición farmacéutica se puede administrar para prevenir, retrasar, reducir o tratar enfermedades autoinmunes, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (LES), también conocido como lupus. El LES es una enfermedad autoinmune en la que muchos tejidos o sistemas son atacados y se inflaman, por ejemplo, articulaciones, piel, hígado, riñones, células sanguíneas, corazón, pulmones, sistema nervioso, vasos sanguíneos. El sistema inmunológico produce anticuerpos contra uno mismo, en particular contra las proteínas nucleares y el ADN. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que las necesite para proteger el tejido del daño y regenerarlo después del daño. En algunos casos, la composición farmacéutica se puede administrar en combinación con la inmunosupresión existente u otros tratamientos.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que las necesite para prevenir, retrasar, reducir o tratar la diabetes tipo I. En la diabetes tipo I, el propio sistema inmunológico del cuerpo destruye las células beta productoras de insulina en el páncreas. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para regenerar células beta. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con tratamientos para la diabetes de tipo I conocidos en la técnica.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para prevenir, retrasar, reducir o tratar la nefropatía diabética o los trastornos relacionados con los podocitos. La nefropatía diabética (también conocida como síndrome de Kimmelstiel-Wilson o glomeruloesclerosis diabética nodular o glomerulonefritis intercapilar) es una de las tres principales complicaciones de la diabetes, y ha sido la principal causa de inicio de la hemodiálisis y es la causa más común de insuficiencia renal crónica y enfermedad renal en etapa terminal en el mundo occidental. La enfermedad o trastorno relacionado con los podocitos puede deberse a una lesión de podocitos (debido a estrés mecánico, isquemia, falta de suministro de oxígeno, una sustancia tóxica, un trastorno endocrino, una infección, un agente de contraste, un traumatismo mecánico, un agente citotóxico, un medicamento, una inflamación, radiación, una infección, una disfunción del sistema inmunológico, un trastorno genético, una insuficiencia orgánica, un trasplante de órgano o uropatía). En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para tratar la nefropatía diabética o los trastornos relacionados con los podocitos. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con tratamientos de nefropatía diabética conocidos en la técnica.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para prevenir, retrasar, reducir o tratar la degeneración de tejidos u órganos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para tratar la degeneración del cerebro, de la médula espinal o de los nervios, como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple o esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también conocida como "enfermedad de Lou Gehrig". En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con tratamientos existentes conocidos en la técnica.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para prevenir, retrasar, reducir o tratar enfermedades asociadas a huesos y/o cartílagos. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para regenerar tejidos óseos y/o cartilaginosos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con tratamientos existentes conocidos en la técnica.
Se puede usar cualquiera de varios sistemas de administración conocidos para administrar una proteína de fusión biespecífica que incluye, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la proteína de fusión biespecífica, mediada por receptor, o un vector retrovírico u otro vector de ácido nucleico. La proteína de fusión biespecífica se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Adicionalmente, puede ser deseable introducir la proteína de fusión biespecífica en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. Se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de formación de aerosol.
En algunos casos, puede ser deseable administrar la proteína de fusión biespecífica de la invención localmente en la zona que necesite tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, por infusión local durante una cirugía, aplicación tópica (por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de la cirugía), por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. En otro caso una vesícula, tal como un liposoma, se puede utilizar para administrar la proteína de fusión biespecífica. En otro caso más, la proteína de fusión biespecífica se administra en un sistema de liberación controlada; por ejemplo, tal sistema de liberación controlada se puede colocar en o cerca de la diana terapéutica (por ejemplo, un órgano del cuerpo que ha experimentado o está en riesgo de daño tisular). El uso de tales sistemas de administración es bien conocido por los expertos en la técnica.
En algunos casos, las proteínas de fusión biespecíficas proporcionadas en el presente documento son eficaces para tratar el daño tisular patológico al menos en parte debido a su capacidad para reclutar células madre en el tejido dañado. En determinados casos, suficientes células madre pueden residir dentro del paciente (por ejemplo, células madre cardíacas residentes). En determinados casos, sin embargo, puede ser beneficioso coadministrar células madre (por ejemplo, células madre autólogas derivadas de la médula ósea). Dichas células madre se pueden administrar antes o después de la proteína de fusión biespecífica, o se pueden administrarse de manera simultánea (ya sea en la misma composición farmacéutica o en composiciones separadas).
En algunos casos, las proteínas biespecíficas proporcionadas en el presente documento son eficaces para mejorar la supervivencia del tejido. En algunos casos, las proteínas biespecíficas se pueden administrar y dirigir a un tejido u órgano específico (por ejemplo, corazón). Las proteínas biespecíficas se pueden luego acumular en el tejido u órgano específico (por ejemplo, corazón en oposición a otro órgano) mediante la unión del dominio de direccionamiento a la molécula diana asociada al tejido. Una vez unida a la molécula diana, la proteína de fusión biespecífica se puede disociar de la molécula diana, alejarse y volver a asociarse a una molécula diana, un receptor de factor de crecimiento de una célula diferente del tejido de una manera de tipo paracrina (por ejemplo, una célula dañada o una célula "en riesgo").
Como se ha indicado anteriormente, la dosis óptima depende de ciertos factores conocidos en la técnica, pero generalmente varía de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 400 mg de proteína de fusión biespecífica por dosis (por ejemplo, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg o 400 mg por dosis). Una dosis de proteína de fusión biespecífica (dentro de una composición farmacéutica tal como se describe anteriormente) se puede administrar terapéuticamente a un paciente una o más veces por hora, día, semana, mes o año (por ejemplo, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 veces por hora, día, semana, mes o año). Más habitualmente, se administra una dosis única por día o por semana que comprende una cantidad de proteína de fusión biespecífica que varía de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal.
En otros casos, una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión biespecífica se puede administrar a un paciente en una dosis que varía de aproximadamente 0,1 mg por semana a aproximadamente 2500 mg por semana, aproximadamente 0,1 mg por semana a aproximadamente 10 mg por semana, aproximadamente 1 mg por semana a aproximadamente 100 mg por semana, aproximadamente 10 mg por semana a aproximadamente 500 mg por semana, aproximadamente 100 mg por semana a aproximadamente 2500 mg por semana, aproximadamente 10 mg por semana a aproximadamente 100 mg por semana, o aproximadamente 100 mg por semana a aproximadamente 1000 mg por semana. Como alternativa, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión biespecífica en una dosis que varía de aproximadamente 0,1 mg en días alternos a aproximadamente 500 mg en días alternos, aproximadamente 1 mg en días alternos a aproximadamente 75 mg en días alternos, aproximadamente 10 mg en días alternos a aproximadamente 50 mg en días alternos, o aproximadamente 20 mg en días alternos a aproximadamente 40 mg en días alternos. Como alternativa, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión biespecífica en una dosis que varía desde aproximadamente 0,1 mg tres veces por semana hasta aproximadamente 100 mg tres veces por semana, aproximadamente 1 mg tres veces por semana hasta aproximadamente 75 mg tres veces por semana, aproximadamente 10 mg tres veces por semana hasta aproximadamente 50 mg tres veces por semana, o aproximadamente 20 mg tres veces por semana hasta aproximadamente 40 mg tres veces por semana.
En algunos casos, una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión biespecífica se administra a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) de forma continua durante 1, 2, 3 o 4 horas; 1, 2, 3 o 4 veces al día; cada dos días o cada tres, cuatro, cinco o seis días; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces por semana; quincenalmente; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 veces al mes; bimensualmente; 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces cada seis meses; 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces al año; o semestralmente. Será evidente que una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión biespecífica puede, pero no necesariamente, administrarse con diferentes frecuencias durante un régimen terapéutico.
Terapias de combinación
En algunos casos, las proteínas de la presente divulgación se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos o terapias adicionales. Por ejemplo, la una o más proteínas de la presente divulgación pueden coadministrarse junto con uno o más compuestos terapéuticos. El tratamiento de combinación puede abarcar la administración simultánea o alterna.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. A menos que se especifique otra cosa, todos los reactivos y disolventes son de calidad comercial estándar y se utilizan sin purificación adicional. Usando modificaciones de rutina, los procedimientos proporcionados en los siguientes Ejemplos pueden ser modificados por los expertos en la técnica para fabricar y usar otras proteínas de fusión biespecíficas y composiciones farmacéuticas dentro del alcance de la presente divulgación.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a una proteína biespecífica que comprende (a) un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una molécula diana asociada a la superficie exterior de una célula de un tejido; y (b) un dominio activador modificado genéticamente que tiene una especificidad de unión a un receptor asociado a la superficie de una célula del tejido, en donde el dominio activador modificado genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de un dominio activador de tipo silvestre, en donde el dominio activador modificado genéticamente disminuye la activación del receptor en relación con el dominio activador de tipo silvestre, y en donde la proteína biespecífica presenta una activación del receptor al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana medido por fosforilación de un receptor o una molécula efectora aguas abajo.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre modificada para comprender una deleción, una sustitución, una adición, una secuencia de aminoácidos adicional en un extremo N-terminal y/o C-terminal o una combinación de los mismos. El dominio activador modificado genéticamente puede comprender un dominio activador de tipo silvestre fusionado con una proteína no inmunogénica. El dominio activador modificado genéticamente puede comprender una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos del dominio activador de tipo silvestre fusionado a una proteína no inmunogénica.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente reduce la activación del receptor en relación con el dominio activador de tipo silvestre en al menos 3,5 veces. En algunos casos, la proteína biespecífica presenta una activación del receptor al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana, medida por fosforilación de AKT.
En algunos casos, la proteína biespecífica puede comprender además un modulador de la semivida en donde el modulador de la semivida aumenta la semivida de la proteína biespecífica. En algunos casos, el modulador de la semivida comprende la secuencia de albúmina de suero humano, Fc, scFc, dominio de unión a la albúmina, PASilación, alfa-fetoproteína humana, o variantes de la misma.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente tiene una afinidad de unión a un receptor de factor de crecimiento. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente y el dominio de direccionamiento se fusionan de forma recombinante. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente y el dominio de direccionamiento están acoplados químicamente.
En algunos casos, la proteína de fusión biespecífica promueve la regeneración de tejidos, la supervivencia celular, la diferenciación celular, inhibe la apoptosis, induce la proliferación celular, promueve el crecimiento celular, promueve la motilidad de las células madre, promueve la diferenciación de células madre, previene el daño celular y/o promueve la angiogénesis. En algunos casos, el tejido es tejido cardíaco, tejido renal, hueso, cartílago, articulaciones, piel, tejido hepático, tejido pancreático, células sanguíneas, tejido pulmonar, tejido cerebral y tejido nervioso.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende un factor de crecimiento. En algunos casos, el factor de crecimiento comprende IGF-1, NRG o variantes del mismo. En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 o variantes de la misma. En algunos casos, la anexina A5 comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122. En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende IGF-1 (LR3-Y31A). En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 18, 19, 23, 24, 28, 29 o 120.
En algunos casos, el modulador de la semivida es albúmina de suero humano o variantes de la misma. En algunos casos, la albúmina de suero humano comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124. En algunos casos, el modulador de semivida comprende Fc o una variante del mismo. En algunos casos, el Fc o una variante del mismo comprende una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 53.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector que une el dominio activador modificado genéticamente con el modulador de la semivida y un conector que une el modulador de la semivida con el dominio de direccionamiento. En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
En algunos casos, el dominio activador modificado genéticamente se une mediante un enlace peptídico al extremo amino del dominio de direccionamiento o el dominio activador se une mediante un enlace peptídico al extremo carboxilo terminal del dominio de direccionamiento.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento tiene una especificidad de unión a la fosfatidilserina. En algunos casos, el dominio de direccionamiento tiene una especificidad de unión a una molécula asociada a podocitos.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con una proteína biespecífica que comprende: (1) un dominio activador, en donde el dominio activador comprende un factor de crecimiento, (2) un dominio de direccionamiento, en donde el dominio de direccionamiento comprende un polipéptido que se une a la fosfatidilserina en la superficie externa de una célula dañada, en donde la proteína biespecífica tiene una concentración semimáxima eficaz más baja en la célula dañada (CE50Dañada) que una célula sana (CE50Sana). En algunos casos, la célula dañada es una célula que experimenta apoptosis o necrosis. En algunos casos, el dominio activador comprende una variante de IGF-1. En algunos casos, el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 humana o una variante de la misma. En algunos casos, el dominio activador comprende una variante de IGF-1 y el dominio de direccionamiento comprende la anexina A5 humana o una variante de la misma. En algunos casos, la variante de IGF-1 tiene una proporción de CE50Sana/CE50Dañada de al menos 10:1. En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la señalización de supervivencia al unirse al receptor de IGF-1. En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la fosforilación de AKT. En algunos casos, la anexina A5 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122. En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma se unen covalentemente mediante un enlace peptídico para formar un único polipéptido. En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma se unen covalentemente al enlazador peptídico mediante un enlace peptídico para formar un único polipéptido. En algunos casos, la variante de IGF-1 está ligada al extremo amino terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está ligada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la variante de IGF-1 está enlazada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está enlazada al extremo amino terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector peptídico entre la variante de IGF-1 y el enlazador peptídico y un conector peptídico entre la anexina A5 o una variante de la misma y el enlazador peptídico.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con una proteína biespecífica que comprende: (1) un dominio activador, en donde el dominio activador comprende una variante de IGF-1; y (2) un dominio de direccionamiento, en donde el dominio de direccionamiento comprende anexina A5 o una variante de la misma, en donde la anexina A5 o una variante de la misma se une a la fosfatidilserina en la superficie externa de una célula dentro del tejido dañado, en donde que la proteína biespecífica y tiene una concentración semimáxima eficaz más baja en el tejido dañado (CE50oañado) que el tejido sano (CE50Sano). En algunos casos, el tejido dañado es un tejido isquémico. En algunos casos, la variante de IGF-1 tiene una proporción de CE50sana/CE50Dañada de al menos 10:1. En algunos casos, la variante de IGF-1 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 10-30 o 120. En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la señalización de supervivencia al unirse al receptor de IGF-1. En algunos casos, la variante de IGF-1 induce la fosforilación de AKT. En algunos casos, la anexina A5 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122. En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma están unidas covalentemente por un enlace peptídico para formar un único polipéptido. En algunos casos, la variante de IGF-1 y la anexina A5 o una variante de la misma se unen covalentemente al enlazador peptídico mediante un enlace peptídico para formar un único polipéptido. En algunos casos, la variante de IGF-1 está ligada al extremo amino terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está ligada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la variante de IGF-1 está enlazada al extremo carboxilo terminal del enlazador peptídico y la anexina A5 o la variante de la misma está enlazada al extremo amino terminal del enlazador peptídico. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector peptídico entre la variante de iGF-1 y el enlazador peptídico y un conector peptídico entre la anexina A5 o la variante de la misma y el enlazador peptídico.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un péptido enlazador. En algunos casos, el péptido enlazador es un modulador de la semivida. En algunos casos, el modulador de la semivida es una albúmina de suero humano o una variante de la misma. En algunos casos, el modulador de la semivida es un fragmento Fc o una variante del mismo.
En algunos casos, la albúmina de suero humano o una variante de la misma tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124. En algunos casos, el fragmento Fc tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 53. En algunos casos, el conector peptídico tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con una proteína biespecífica que comprende: (1) una variante de IGF-1 que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los s Eq ID NO: 18, 19, 23, 24, 28, 29 o 120; y (2) Anexina A5 o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 1-4 o 122. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además una albúmina de suero humano o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124. En algunos casos, la albúmina de suero humano o una variante de la misma está unida a un extremo C-terminal de la anexina A5 o una variante de la misma y a un extremo N-terminal de la variante de IGF-1. En algunos casos, la proteína biespecífica comprende además un conector peptídico que une un extremo N-terminal de la albúmina de suero humano o una variante del mismo al extremo C-terminal de la anexina A5 o una variante de la misma y un conector peptídico que une un extremo C-terminal de la albúmina de suero humano o una variante del mismo al extremo N-terminal de la variante de IGF-1. En algunos casos, el conector peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 60-62 o 126-127.
Los aspectos de la divulgación se refieren a una composición farmacéutica que comprende la proteína biespecífica descrita en el presente documento.
Los aspectos de la divulgación se refieren a una secuencia de ácido nucleico recombinante aislada que codifica la proteína biespecífica descrita en el presente documento.
Los aspectos de la divulgación se refieren a una proteína modificada genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 84. Los aspectos de la divulgación se refieren a un ácido nucleico recombinante aislado que tiene SEQ ID NO: 102. Los aspectos de la divulgación se refieren a una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión biespecífica que tiene el SEQ ID NO: 84.
Los aspectos de la divulgación se refieren a una proteína modificada genéticamente que tiene el SEQ ID NO: 118. Los aspectos de la divulgación se refieren a un ácido nucleico recombinante aislado que tiene SEQ ID NO: 119. Los aspectos de la divulgación se refieren a una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión biespecífica que tiene el SEQ ID NO: 118.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método: (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento tal como se describe en el presente documento; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica, por lo que el dominio de direccionamiento dirige la proteína de fusión biespecífica a una célula del tejido y por lo que tras la exposición del dominio activador a un receptor del factor de crecimiento en la superficie de la célula, el dominio activador activa específicamente el receptor del factor de crecimiento para promover la regeneración tisular.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método: (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento descrito en el presente documento; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica, por lo que el dominio de direccionamiento dirige la proteína de fusión biespecífica a una primera célula del tejido y por lo que tras la exposición del dominio activador a un receptor del factor de crecimiento en la superficie de una segunda célula, el dominio activador activa específicamente el receptor del factor de crecimiento para promover la regeneración tisular.
En algunos casos, el dominio de direccionamiento y el dominio activador se unen a moléculas asociadas a la superficie de la misma célula del tejido. En otros casos, el dominio de direccionamiento y el dominio activador se unen a moléculas asociadas a la superficie de diferentes células del tejido. En algunos casos, el tejido es tejido cardíaco, tejido renal, hueso, cartílago, articulaciones, piel, tejido hepático, tejido pancreático, células sanguíneas, tejido pulmonar, tejido cerebral o tejido nervioso.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método: (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento tal como se describe en el presente documento; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica mediante la cual la anexina A5 o una variante de la misma dirige la proteína de fusión biespecífica a una célula del tejido, en donde la célula expresa fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática, y por lo que tras la exposición de la variante de IGF-1 a un receptor de IGF-1 en la superficie de la célula, la variante de IGF-1 activa específicamente el receptor de IGF-1 para promover la regeneración tisular.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento tal como se describe en el presente documento; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica mediante la cual la anexina A5 o una variante de la misma dirige la proteína de fusión biespecífica a una primera célula del tejido, en donde la célula expresa fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática, y por lo que tras la exposición de la variante de IGF-1 a un receptor de IGF-1 en la superficie de una segunda célula, la variante de IGF-1 activa específicamente el receptor de IGF-1 para promover la regeneración tisular.
En algunos casos, la anexina A5 o la variante de la misma y la variante de IGF-1 se unen a diferentes moléculas asociadas a la superficie de la misma célula del tejido. En otros casos, la anexina A5 o la variante de la misma y la variante de IGF-1 se unen a diferentes moléculas asociadas a la superficie de diferentes células del tejido.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método: (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento tal como se describe en el presente documento; y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica en la que las proteínas biespecíficas se unen a la fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática de una célula de un tejido y a un receptor del factor de crecimiento IGF-1 en la superficie de la célula del tejido.
Los aspectos de la divulgación se relacionan con un método para promover la regeneración de tejidos o la supervivencia en un sujeto, comprendiendo el método (a) proporcionar una proteína biespecífica que tiene un dominio de direccionamiento tal como se describe en el presente documento. Y (b) administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica en la que las proteínas biespecíficas se unen a la fosfatidilserina en la capa externa de la membrana plasmática de una primera célula de un tejido y a un receptor del factor de crecimiento iGF-1 en la superficie de una segunda célula del tejido.
En algunos casos, la proteína biespecífica se une a moléculas asociadas a la superficie de la misma célula del tejido. En otros casos, la proteína biespecífica se une a moléculas asociadas a la superficie de diferentes células del tejido.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende una secuencia de aminoácidos de una variante no internalizante de la anexina A5 humana y en donde la proteína biespecífica tiene una semivida prolongada en comparación con una proteína biespecífica que comprende la secuencia de aminoácidos de la anexina 5 humana de tipo silvestre.
En algunos casos, la proteína biespecífica comprende un dominio de direccionamiento que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 4.
En algunos casos, la proteína biespecífica que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 67, 70, 73, 86, 108, 110, 116 o 118.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente divulgación.
Ejemplo 1. Las proteínas de fusión biespecíficas se pueden modificar genéticamente para que tengan una potencia reducida en las células sanas.
Para permitir el direccionamiento/la selectividad para las células dañadas, Se diseñó genéticamente IGF1 para que tuviera una potencia reducida en células sanas en comparación con IGF-1 de ts (FIG. 2A-2B). La potencia se define como la concentración necesaria para alcanzar el nivel semimáximo de señalización de pAKT (CE50 de pAKT). En algunas realizaciones, las variantes modificadas genéticamente de IGF1 se modificaron genéticamente usando la variante de IGF-1 (LR3) que contiene una extensión en N-terminal de 13 aminoácidos y una sustitución de glutamato por arginina en la posición 3. La sustitución de arginina por glutamato se añadió para evitar la unión de la proteína de fusión que comprende la variante de IGF-1 a proteínas de unión de IGF (IGFBP) y no afecta significativamente a la potencia (véase las FIG. 2A-2B, la CE50 de IGFlis de ts 1,22 ± 0,74 frente a la CE50 de IGF-1 (LR3) es 0,73 ± 0,35).
Se logró una reducción de potencia de 6 veces o más mediante:
1. Sustitución de aminoácidos. En algunas realizaciones, los restos de tirosina se pueden sustituir. En algunas realizaciones, los aminoácidos 24 y/o 31 pueden estar sustituidos (por ejemplo, SGF 740 y 733 que contienen la sustitución Y31A, los SGF 739 (s Eq ID NO: 83) y 732 (SEQ ID NO: 81) que contienen la sustitución Y24L, los SGF 728 (SEQ ID NO: 77) y 741 (SEQ ID NO: 85) que contienen la sustitución Y60L, o SGF 731 que contiene las sustituciones Y24L y Y31A).
2. Deleción de aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácidos correspondientes a los sitios de proteólisis (por ejemplo, KR, RR) o los restos K y/o R pueden delecionarse. En algunas realizaciones, los aminoácidos en C-terminal, tales como el K68, S69, A70 se pueden delecionar. En algunas realizaciones, el aminoácido R37 se puede delecionar. En algunas realizaciones, los aminoácidos del extremo C-terminal, tales como el K68, S69, A70 y el aminoácido R37 se pueden delecionar (por ejemplo, SGF 602 que contiene una deleción del resto R37 y SGF 683, 727, 606, 743 y 730 que contienen una deleción del resto R37 y una deleción de 3 restos de IGF-1 en C-terminal (K68, S69, A70)). En algunas realizaciones, se pueden delecionar hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10 aminoácidos en el extremo C-terminal.
3. Adición (o fusión) de un péptido (también denominado en el presente documento conector) a un dominio de proteína de la proteína de fusión (por ejemplo, los SGF 703, 711, 713, 729, 716, 704 que fusionan IGF-1 (LR3) a una variante de albúmina de suero humano (mHSA) a través de un enlazador de 7 o 15 aminoácidos). En algunas realizaciones, el enlazador puede ser de 2 aminoácidos de longitud, 3 aminoácidos de longitud, 4 aminoácidos de longitud, 5 aminoácidos de longitud, 6 aminoácidos de longitud, 7 aminoácidos de longitud, 8 aminoácidos de longitud, 9 aminoácidos de longitud, 10 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener al menos 2 aminoácidos de longitud, al menos 5 aminoácidos de longitud, al menos 10 aminoácidos de longitud, al menos 15 aminoácidos de longitud, al menos 20 aminoácidos de longitud, al menos 25 aminoácidos de longitud, al menos 30 aminoácidos de longitud, al menos 35 aminoácidos de longitud, al menos 40 aminoácidos de longitud.
Las proteínas biespecíficas se midieron en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (cardiomiocitos derivados de iPSC de Cellular Dynamics International (CDI)) y la señalización se cuantificó mediante la acumulación de AKT fosforilada (pAKT).
El día 0, los cardiomiocitos se descongelaron de acuerdo con el protocolo estándar y se sembraron a 1,5e4 células/pocillo en Plating Media (n.° de catálogo CDI CMM-100-110-005).
El día 2, el medio se pipeteó hacia arriba y hacia abajo varias veces para desalojar las células muertas y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de mantenimiento tibio (n.° de catálogo cD l CMM-100-120-001). El medio de mantenimiento se reemplazó cada dos días.
El día 14, se preparó medio de suero bajo (DMEM sin glucosa (Invitrogen 11966-025), piruvato sódico 1 mM, galactosa 10 mM, suero al 0,5 % (suministrado por CDI), CaCl20,7 mM). El medio de mantenimiento se aspiró y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de suero bajo.
El día 15, se preparó una solución de lisis [tampón de lisis completo M-PER: tampón de lisis M-PER (Pierce/Thermo-Scientific n.° de Cat. 78501) NaCl 150 mM proteasa (Roche Complete) e inhibidores de fosfatasa (Roche PhosSTOP)] y las proteínas biespecíficas se prepararon en medio de suero bajo con CaCl2 0,7 mM. Se prepararon diferentes diluciones en serie (diluciones a 1:7). Las células se estimularon con soluciones diluidas de proteínas biespecíficas añadiendo 25 pl/pocillo de proteínas biespecíficas diluidas a los 100 pl existentes en cada pocillo y golpeando ligeramente la placa para mezclar durante 10 segundos. Las células se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. La estimulación se detuvo retirando el medio de los pocillos. Las células se lavaron con 200 pl/pocillo de PBS frío y se golpeó la placa boca abajo para eliminar el exceso de PBS. Las células se lisaron en 25 pl/pocillo de tampón de lisis completo M-PER. La placa se selló con un sello de placa de aluminio y se colocó en un agitador orbital durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, la placa se almacenó a -80 °C hasta que estuvo lista para ELISA.
Para el ELISA de pAKT, el día 0, se recubrieron placas blancas planas de 384 pocillos (LIA High Binding, Greiner Bio-One, 781074) con anticuerpo de captura anti-Akt (clon SKB1, Millipore 05-591). El Ab de captura anti-Akt se diluyó a 1:250 en PBS, se añadieron 20 pl/pocillo y las placas se sellaron a temperatura ambiente durante la noche.
El día 1, las muestras de lisado celular se descongelaron a 4 °C. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05%/PBS usando lavador de placas y las placas de ELISA se bloquearon con 50 pl/pocillo de BSA al 2 %/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. La curva estándar de Akt activa humana recombinante se preparó en tampón MPER en una placa de 96 pocillos (placa de superficie sin unión, Coming 3641). Se preparó la concentración máxima de reservorio de Akt1 rh activo/PKBa (Millipore 14-276) (9165 ng/ml) haciendo una dilución a 1:200 (9 diluciones en serie a 1:2. Después del bloqueo, las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de muestras y estándares a la placa ELISA y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de anticuerpo de detección (CST 4060 diluido a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween20 al 0,1 %/PBS) y se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo del anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo con h Rp , CST 7074, diluido a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween 20 al 0,1 %/PBS) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador (protegido de la luz). Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Pierce/Thermo-Scientific) mezclado en partes iguales con sustrato potenciador y peróxido y se agitó la placa durante 1 min y se leyó la luminiscencia.
Las curvas de respuesta a la dosis se ajustaron a un modelo de activación de CE50 de tres parámetros y las CE50 calculadas se compararon entre el IGF-1 de ts y las proteínas biespecíficas (SGF 649, 711, 683, 713, 729, 716, 727, 606, 743, 730, 740, 733, 739, 732, 728, 741, 731, 757) y las proteínas de control no direccionadas (688, 703, 704, 602, FIG. 2A-2B). La reducción de la potencia calculada para cada una de las proteínas de fusión se toma como la proporción de los valores de CE50 ajustados entre la proteína de fusión y las curvas de respuesta a la dosis de IGF-1 de ts (CE50fusión/CE50IGF1 de ts).
Ejemplo 2: Las proteínas de fusión biespecíficas de potencia reducida direccionadas señalan selectivamente (es decir, presentan un cambio de potencia) en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células sin la molécula diana
La capacidad de las proteínas biespecíficas de potencia reducida y dirigidas a fosfatidilserina (PS) para señalizar selectivamente en las células que contienen la molécula diana PS se midió en cardiomiocitos que provienen de células madre pluripotentes sanos (que no muestran PS en la superficie celular) frente a dañados (que muestran PS en la superficie celular) (Cellular Dynamics International) y la señalización se cuantificó mediante la acumulación de AKT fosforilada (FIG. 3A, 3B y 3C).
Las proteínas biespecíficas de potencia reducida dirigidas a la fosfatidilserina (PS) (que tienen una reducción de la potencia de 6 veces o más en comparación con el IGF-1 de ts, (por ejemplo, los SGF 743, 741, 740, 739, 733, 732, 731, 730, 729, 728, 727, 716, 713, 711,606, los SEQ ID NO: 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73 y 70, respectivamente) se compararon con proteínas de fusión de potencia reducida no direccionadas (que tienen una reducción de potencia de 6 veces o más en comparación con el IGF-1 de ts, por ejemplo, 704, 602, 703, los SEQ ID NO: 107, 66 y 68, respectivamente). la proteína de fusión sin potencia reducida y no direccionada (reducción de 2 veces o menos en comparación con el IGF-1 de ts, por ejemplo, SGF 688, SEQ ID NO: 72), y la proteína sin potencia reducida, con direccionamiento reducida 2 veces o menos reducción en comparación con la IGF-1 de ts (por ejemplo, SGF 649, SEQ ID NO: 71). Véase, por ejemplo, la FIG. 1B para identidades de proteínas y las FIGS. 2A-2B para la tabla que muestra la reducción de la potencia frente al peso de IGF-1.
El día 0, los cardiomiocitos se descongelaron de acuerdo con el protocolo estándar y se sembraron a 1,5e4 células/pocillo en Plating Media (n.° de catálogo CDI CMM-100-110-005).
El día 2, el medio se pipeteó hacia arriba y hacia abajo varias veces para desalojar las células muertas y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de mantenimiento tibio (n.° de catálogo c Di CMM-100-120-001). El medio de mantenimiento se reemplazó cada dos días.
El día 14, se preparó medio de suero bajo (DMEM sin glucosa (Invitrogen 11966-025), piruvato sódico 1 mM, galactosa 10 mM, suero al 0,5 % (suministrado por CDI), CaCI2 0,7 mM). Se preparó medio de suero bajo con 12,5 pg/ml de doxorrubicina. Para las células dañadas/tratadas, el medio de mantenimiento se aspiró y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de suero bajo 12,5 pg/ml de doxorrubicina. Para células sanas/no tratadas, el medio de mantenimiento se aspiró y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de suero bajo.
El día 15, se preparó una solución de lisis [tampón de lisis completo M-PER: tampón de lisis M-PER (Pierce/Thermo-Scientific n.° de Cat. 78501) NaCl 150 mM proteasa (Roche Complete) e inhibidores de fosfatasa (Roche PhosSTOP)] y las proteínas biespecíficas se prepararon en medio de suero bajo con CaCl2 0,7 mM. Se prepararon diferentes diluciones en serie (diluciones a 1:7). Las células se estimularon con soluciones diluidas de proteínas biespecíficas añadiendo 25 pl/pocillo de proteínas biespecíficas diluidas a los 100 pl existentes en cada pocillo y golpeando ligeramente la placa para mezclar durante 10 segundos. Las células se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. La estimulación se detuvo retirando el medio de los pocillos. Las células se lavaron con 200 pl/pocillo de PBS frío y se golpeó la placa boca abajo para eliminar el exceso de PBS. Las células se lisaron en 25 pl/pocillo de tampón de lisis completo M-PER. La placa se selló con un sello de placa de aluminio y se colocó en un agitador orbital durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, la placa se almacenó a -80 °C hasta que estuvo lista para ELISA.
Para el ELISA de pAKT, el día 0, se recubrieron placas blancas planas de 384 pocillos (LIA High Binding, Greiner Bio-One, 781074) con anticuerpo de captura anti-Akt (clon SKB1, Millipore 05-591). El Ab de captura anti-Akt se diluyó a 1:250 en PBS, se añadieron 20 pl/pocillo y las placas se sellaron a temperatura ambiente durante la noche.
El día 1, las muestras de lisado celular se descongelaron a 4 °C. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05%/PBS usando solución de lavado de placas (Plate Washer) y las placas de ELISA se bloquearon con 50 pl/pocillo de BSA al 2 %/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. La curva estándar de Akt activa humana recombinante se preparó en tampón MPER en placas de 96 pocillos (placa de superficie sin unión, Corning 3641). Se preparó la concentración máxima de reservorio de Akt1 rh activo/PKBa (Millipore 14-276) (9165 ng/ml) haciendo una dilución a 1:200 (9 diluciones en serie a 1:2. Después del bloqueo, las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de muestras y estándares a la placa ELISA y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de anticuerpo de detección (CST 4060 diluido a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween20 al 0,1 %/PBS) y se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20ul/pocillo del anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo con Hr P, CST 7074, diluido a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween 20 al 1 %/PBS) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador (protegido de la luz). Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 pl/pocillo de sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Pierce/Thermo-Scientific) mezclado en partes iguales con sustrato potenciador y peróxido y se agitó la placa durante 1 min y se leyó la luminiscencia.
Las curvas de respuesta a la dosis se compararon en cardiomiocitos sanos y dañados (FIG 3A). Las curvas de respuesta a la dosis se ajustaron posteriormente a un modelo de activación de CE50 de tres parámetros y las CE50 calculadas se compararon entre los cardiomiocitos sanos (círculos, color azul) y dañados (cuadrado, color rojo).
La FIG. 3B muestra el cambio de potencia de veintidós proteínas biespecíficas en una escala logarítmica. Los valores de CE50 ajustados se representan tanto para cardiomiocitos sanos (círculos rellenos) como dañados (triángulos rellenos). Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 % para los parámetros. El cambio de potencia calculado para cada una de las proteínas biespecíficas se toma como la proporción de los valores de CE50 ajustados entre las curvas de respuesta a la dosis sana y dañada (CE50Sanos/CE50Dañados). El cambio de potencia se anota y se expresa como el aumento de veces en la señalización de un entorno dañado.
La Figura 3C es un gráfico (señalización en función de la concentración logarítmica de base 10 en nM) que representa la respuesta a la dosis de pAKT (proteína quinasa B) en cardiomiocitos sanos y dañados utilizando la proteína terapéutica biespecífica 776 (sc776) y la correspondiente proteína de control no dirigida 777 (sc777).
Como en la Figura 3A, las potencias de los factores de crecimiento inteligente sc776 y el control no dirigido sc777) se miden en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes y la señalización se cuantifica mediante la acumulación de Akt fosforilada. Las curvas de respuesta a la dosis en los entornos sanos y dañados se ajustan a un modelo de activación de CE50 de tres parámetros. La señalización para sc776 se representa para los entornos sano (azul, círculo relleno) y dañado (rojo, cuadrado relleno), respectivamente. Las respuestas de señalización para sc777 se representan para los entornos sano (púrpura, triángulo relleno) y dañado (verde, triángulo inverso relleno), respectivamente. La composición de sc776 es IGF1(E3R/Y31A)_lk7_HSA(C58S/N527Q)_lk7_AnxV(R63A/K70A/KL101A/E138A/D139G /N160A/C316A). La sc777 de control sin direccionamiento está compuesta por IGF1 (E3R/Y31A) _lk7_HSA (C58S / N527Q). Como en la Figura 3B, la especificidad para la señalización en el entorno dañado se toma como la proporción de los valores de CE50 ajustados entre las curvas de respuesta a la dosis saludable y dañada (CE50Sano / CE50Dañado). La molécula de potencia reducida no dirigida sc777 no muestra un cambio de potencia, mientras que la molécula dirigida de potencia reducida sc776 tiene un cambio de potencia de 57 veces.
Estos datos muestran que las variantes de IGF-1 con potencia reducida, direccionadas a PS (reducción de potencia > 6 veces en comparación con el IGF-1 de ts ) (por ejemplo, los SGF 743, 741, 740, 739, 733, 732, 731, 730, 729, 728, 727, 716, 713, 7 l1, 606, 776) muestran una señalización preferencial (10 a 92 veces mayor) en los cardiomiocitos dañados sobre los cardiomiocitos sanos mediante la adición de un brazo de direccionamiento basado en AnxV. También, una variante de potencia reducida, direccionada a PS (reducción de potencia de ~ 4 veces en comparación con la NrgIa de ts) de Nrg1a (SGF 757) muestra una señalización preferencial (aumento de 5 veces) en los cardiomiocitos dañados sobre los cardiomiocitos sanos por la adición de un brazo de direccionamiento basado en AnxV. Las proteínas de fusión de control que carecen de un brazo de direccionamiento (por ejemplo, los SGF 704, 602, 688, 703) muestra una señalización preferencial insignificante (<2 veces) en los cardiomiocitos dañados en comparación con los cardiomiocitos sanos, lo que demuestra la importancia del brazo de direccionamiento selectivo de PS en la generación de una señalización selectiva en células dañadas. Además, una proteína biespecífica con direccionamiento, sin potencia reducida (reducción de potencia < 2 veces en comparación con el IGF-1 de ts) SGF 649 también muestra una señalización preferencial insignificante (< 2 veces) en cardiomiocitos dañados en comparación con cardiomiocitos sanos, lo que demuestra la importancia de la reducción de la potencia para provocar la señalización selectiva en las células dañadas.
Ejemplo 3: Reducción de la apoptosis inducida por hipoxia en cardiomiocitos humanos in vitro usando proteínas biespecíficas
La FIG. 4 muestra la reducción de la apoptosis usando la proteína de fusión SGF 740 en un ensayo in vitro de apoptosis inducida por hipoxia de cardiomiocitos humanos.
La proteína biespecífica SGF 740 (SEQ ID NO: 84) que comprende del extremo N-terminal al C-terminal: una variante de IGF-1 (LR3, Y31A), un enlazador de 7 aminoácidos Ik7, una variante de HSA (mHSA: C58S, K420E y N527Q), un enlazador Ik7 de 7 aminoácidos y una variante no internalizante de la anexina A5 (ni-AnxV: R63A, K40A, K101A, E138A, D139G, N160A) se utilizó in vitro para evaluar su eficacia. La apoptosis se indujo cultivando células al 1 % de oxígeno durante 48 horas. Se añadió la proteína de fusión SGF 740 al comienzo del período de hipoxia. Se midió la actividad de caspasa. Las caspasas son una familia de cisteína proteasas específicas de aspartato que sirven como mediadores primarios de la apoptosis. Las caspasas apoptóticas se activan al recibir una señal de muerte extrínseca o intrínseca.
El día 0, los cardiomiocitos iCell (Cellular Dynamics, Inc, (CDI) cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas inducidas (iPS), n.° de catálogo CMC-100-010-001) se descongelaron de acuerdo con el protocolo estándar. Se recubrieron placas de 96 pocillos con gelatina al 0,1 % 1 hora antes a 37 °C. Las células se sembraron en placas a 1,5e4 células/pocillo y se cultivaron en una incubadora a 37 °C/CO2 al 7 %.
El día 2, el medio se pipeteó arriba y abajo 5 veces y se reemplazó con 100 pl/pocillo de medio de mantenimiento caliente. En este punto, las células se trasladaron a una incubadora a 37 °C/CO2 al 5 %. Después de este cambio, las células se dejaron a 37 °C/CO2 al 5 % durante el resto del experimento.
El día 4, el medio se reemplazó con medio de mantenimiento nuevo.
El día 7, el medio de ensayo de hipoxia (HAM, DMEM sin glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol (Life Technologies, A14430-01) L-Carnitina 2 mM, Taurina 5 mM, Creatina 5 mM, aminoácidos no esenciales a 1X (Life Technologies, 11140-50), HEPES 10 mM, piruvato sódico 1 mM, GIutaMax a 1X (Life Technologies, 35050-061), D-(+) Glucosa 2,75 mM, Ácido linoleico-Ácido oleico-Albúmina a 1X (Sigma L9655)) se preparó fresco. Las células se lavaron dos veces con 80 |jl de HAM para reemplazar el medio de mantenimiento. A continuación, se añadieron 100 j l de HAM a los pocillos de las placas y las placas se colocaron en la incubadora a 37 °C/CO2 al 5 % durante 2 días.
El día 8, el medio se reemplazó con 100 j l de HAM reciente.
El día 9, la cámara de hipoxia en la incubadora de 37 °C/CO2 al 5 % se ajustó con O2 al 1 %. El medio se reemplazó con HAM reciente (90 ul). Se prepararon soluciones madre de SGF (proteína biespecífica SGF 740) concentradas a 10X en HAM (filtrado estéril antes de añadirlas a las células). Se añadieron 10 □l de SGF o HAM a los pocillos. La placa de hipoxia se colocó en la cámara de hipoxia en la incubadora de 37 °C/CO2 al 5 % y O2 al 1 % durante 48 h. La placa de normoxia se colocó en una incubadora a 37 °C/CO2 al 5 % (equilibrada con oxígeno atmosférico) durante 48 h.
El día 11, las muestras se analizaron utilizando el ensayo CaspaseGLO 3/7 (Promega) que mide las actividades de caspasa-3/7. El ensayo utiliza un sustrato proluminiscente de caspasa-3/7 DEVD-aminoluciferina y una luciferasa termoestable en un reactivo optimizado para la actividad de caspasa-3/7, actividad luciferasa y lisis celular. La adición del reactivo da como resultado la lisis celular, seguido de la escisión por caspasa del sustrato. Esto libera aminoluciferina libre, que es consumida por la luciferasa, generando una señal luminiscente que es proporcional a la actividad de caspasa-3/7.
La FIG. 4 muestra la actividad de caspasa en muestras de control [sin hipoxia (es decir, normoxia)] y en muestras de hipoxia tratadas con diferentes concentraciones de proteína biespecífica SGF 740: proteína biespecífica SGF 740330 nM, proteína biespecífica SGF 74050 nM, proteína biespecífica SGF 7407,8 nM, proteína biespecífica SGF 740 1,2 nM y proteína biespecífica SGF 740 0,18 nM. La FIG. 4 muestra que la proteína biespecífica SGF 740 reduce significativamente la actividad de caspasa y la apoptosis inducida por hipoxia (p<0,01) en cardiomiocitos humanos in vitro.
Estos resultados muestran que la proteína biespecífica SGF 740 reduce significativamente (p <= 0,01) la apoptosis inducida por hipoxia en cardiomiocitos humanos de una manera dependiente de la dosis. A varias concentraciones de proteína biespecífica SGF 740, la apoptosis inducida por hipoxia se reduce a niveles de normoxia (es decir, sin hipoxia). Este resultado muestra que los SGF son eficaces en el tratamiento de la apoptosis inducida por hipoxia en cardiomiocitos humanos.
Ejemplo 4: Reducción de la muerte celular inducida por hipoxia en las células epiteliales del túbulo proximal del riñón in vitro usando proteínas biespecíficas
Las proteínas biespecíficas SGF 740, 727 y 734 se utilizaron para evaluar la eficacia en un ensayo de muerte celular inducida por hipoxia en comparación con una SGF 746 de control sin direccionamiento (SEQ ID NO: 109) (FIG. 5). La proteína biespecífica SGF 740 (SEQ ID NO: 84) comprende del extremo N-terminal al C-terminal: una variante de IGF-1 (LR3, Y31A), un enlazador de 7 aminoácidos Ik7, una variante de HSA (mHSA: C58S, K420E y N527Q), un enlazador Ik7 de 7 aminoácidos y una variante no internalizante de la anexina A5 (ni-AnxV: R63A, K40A, K101A, E138A, D139G, N160A). La proteína biespecífica SGF 727 (SEQ ID NO: 76) comprende del extremo N-terminal al C-terminal: una variante de IGF-1 (LR3-R37X-3X), un enlazador de 40 aminoácidos Ik40, un modulador de la semivida de la variante de mHSA de la albúmina sérica humana, un enlazador Ik40 de 40 aminoácidos y anexina A5. La proteína biespecífica SGF 734 (SEQ ID NO: 108) comprende del extremo N-terminal al C-terminal: una variante de IGF-1 (LR3, Y24L/Y31A), un enlazador Ik7 de 7 aminoácidos, una variante de HSA (mHSA7: C58S, K420E y N527Q, E505G, V547A), un enlazador Ik7 de 7 aminoácidos y una variante no internalizante de Anexina A5 (AnxV (ni): R63A, K40A, K101A, E138A, D139G, N160A). El control sin direccionamiento SGF 746 comprende desde el extremo N-terminal al C-terminal: una variante de IGF-1 (LR3, Y31A), un enlazador de 7 aminoácidos Ik7 y una variante de HSA (mHSA: C58S, K420E y N527Q).
El día 0, se sembraron células epiteliales del túbulo proximal de riñón humano (ATCC, PCS-400-010) a 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos en medio completo (medio basal de células epiteliales renales, kit de crecimiento de células epiteliales renales, 10 unidades/ml de penicilina, 10 □g/ml de estreptomicina, 10 □g/ml de gentamicina, 0,25 □g/ml de anfotericina B, ATCC). Se añadió agua esterilizada a los pocillos del borde.
El día 2, los pocillos se lavaron con PBS y el medio se cambió a medio de suero bajo (medio basal de células epiteliales renales, FBS al 0,5 %, 5 jg/m l de transferrina, L-glutamina 2,4 mM, Penicilina/Estreptomicina al 1 % (10 unidades/ml de Penicilina 10 jg/m l de Estreptomicina)), a 100 jl/pocillo. Después de 5 horas, las células se trataron con las proteínas biespecíficas SGF 740, 727, 734 o la proteína de control sin direccionamiento SGF 746 a diferentes concentraciones (5 nM, 50 nM, 500 nM o 2,5 nM, 25 nM, 250 nM) en medio que contiene CaCl22,5 mM (o medio con bajo contenido de suero como control). Se añadieron 25 j l de muestra de concentración a 5X y las células se incubaron en una incubadora a 37 °C/CO2 al 5 % durante 1 hora.
Después del pretratamiento de 1 hora con SGF, las células se colocaron en bolsas anaeróbicas (GasPak EZ Anaerobe Pouch System con Indicator, BD 260683) para inducir hipoxia y se coloca en una incubadora a 37 °C/CO2 al 5 % o se deja bajo normoxia (es decir, equilibrada con oxígeno atmosférico) en la incubadora a 37 °C/CO2 al 5 % (como control). Las células se incubaron durante 18 horas.
El día 3, las células se recogieron para citometría de flujo. El medio y las células flotantes se aspiraron y se transfirieron a una placa con fondo en V. Las células se lavaron con 20 pl/pocillo de PBS. Se añadieron 30 pl/pocillo de tripsina/EDTA para las células primarias (ATCC PCS-999-003). La placa se devolvió a la incubadora a 37 °C durante 10 minutos.
Las células se desalojaron golpeando ligeramente la placa. Se añadieron 30 pl/pocillo de solución de neutralización de tripsina para recoger las células y las células se transfirieron a una placa con fondo en V. La placa se centrifugó a 700 g a 4 °C durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 100 □l/pocillo. Las células se lavaron con PBS EDTA al 0,02 % (EDTA 0,5 mM) para eliminar cualquier proteína biespecífica unida. Se preparó una solución de tinción AnxV-FITC (con yoduro de propidio (PI)); 0,3 pg/ml de AnxV-FITC (dilución a 766,6X de una solución madre de 230 pg/ml) 1 pg/ml de PI (dilución a 1000X de una solución madre de 1 mg/ml). La placa se centrifugó a 700 g a 4 °C durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 50 pl/pocillo de solución de tinción AnxV-FITC. La placa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron a las células 200 pl/pocillo de tampón de unión de AnxV. La muerte celular se midió como el porcentaje de células positivas a yoduro de propidio usando citometría de flujo.
La FIG. 5 muestra que las proteínas biespecíficas SGF 740, 727 y 734 reducen significativamente la muerte celular inducida por hipoxia en las células epiteliales del túbulo proximal del riñón humano. La proteína de control no dirigida 746 no redujo la muerte celular. Estos datos muestran que los SGF biespecíficos con direccionamiento son eficaces en el tratamiento de la muerte celular inducida por hipoxia en las células epiteliales del túbulo proximal del riñón humano, mientras que las proteínas sin direccionamiento no son eficaces.
Ejemplo 5: Comparación de las semividas de las proteínas biespecíficas después de la dosificación intravenosa
Se calcularon las semividas de proteínas biespecíficas en ratones en un modelo de un solo compartimento (FIG. 6). SGF 727 tiene la estructura IGF-1 (LR3-R37X-3X)-Ik40-mHSA-Ik40-AnxV (SEQ ID NO: 76), Las proteínas biespecíficas 739-743 tienen la estructura básica de IGF-1 *(LR3)-Ik7-mHSA-Ik7-AnxV(ni) en donde * denota una deleción o mutación reductora de la potencia de IGF-1. La proteína biespecífica 757 tiene la estructura Nrg1a_Ik7_mHSA_Ik7_ni-AnxV (SEQ ID NO: 110).
Procedimiento:
Se pesaron ratones C57BL/6J (8-12 semanas de vida) y se calentaron durante 5-10 minutos bajo una lámpara de calor para permitir la vasodilatación de la vena lateral de la cola. Los animales se colocaron en un inmovilizador, sus colas se limpiaron con toallitas con alcohol y luego se inyectaron a través de la vena de la cola con 100 □l de SGF a 40 nmol/ml formulado en PBS MSA al 0,1 %. Se recogió un pequeño volumen (5-10 pl) de sangre en tubos de recogida de suero después de cortar la vena lateral de la cola a las 1, 3, 6, 9, 12, 26,5, 28, 31,5, 33,5, 35,75 y 51 horas después de la dosis. Para cada recolección posterior, se quitó la costra que se había formado sobre la cola y se recolectó la sangre. Se dejó que la sangre se coagulara durante 10 minutos después de la recolección, luego se centrifugó a 10.000 xg durante 10-15 minutos a 4 °C.
El análisis de la concentración de SGF en muestras de sangre se llevó a cabo utilizando un ELISA modificado genéticamente para capturar y detectar HSA. Una placa de ensayo (LIA High Binding, de 384 pocillos, Greiner bioone, REF 781074) se recubrió con 20 pl/pocillo de anticuerpo anti-HSA con absorción cruzada (Bethyl Labs, A80-229A) diluido a 1:50 en PBS de Dulbecco durante la noche a 4 °C. El día siguiente, los pocillos se lavaron 3X con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %). Luego, la placa se bloqueó con 80 pl/pocillo de tampón de bloqueo libre de proteínas (Pierce, 37572) durante 1-2 h a temperatura ambiente (TA) mientras se preparaban curvas estándar para cada SGF y muestras de suero (diluido a 25x, 100x, 400x,1600x, 6400x en PBS). Los pocillos se lavaron 3X con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %) usando un lavador de placas, se añadieron 20 ul de cada muestra o estándar al pocillo de la placa correspondiente y las placas se sellaron con AluminaSeal y se incubaron 2 h a TA en un agitador. La placa se lavó 3X con p BS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %) y luego se añadieron 40 pl/pocillo de anticuerpo de detección anti-HSA-HRP de cabra con adsorción cruzada (Bethyl labs, A80-229P) diluido a 1:25000 en PBS-T. La placa se incubó 30 min a TA, en una plataforma de agitación, protegida de la luz y luego se lavó 3X con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %) usando un lavador de placas. Los anticuerpos unidos se detectaron con el producto de sustrato quimioluminiscente Super Signal ELISA Pico n.° 37069, Thermo (20ul/pocillo). Luego se analizó la luminiscencia de la placa en un Tecan Infinite 200 Pro.
Se calibró un modelo PK estándar de uno o dos compartimentos para los datos experimentales de desintegración del suero del fármaco en ratones utilizando scripts personalizados escritos para la plataforma del programa informático Simbiology MATLAB (Mathworks, Inc., Natick, MA). La calibración se realizó utilizando el algoritmo de ajuste no lineal incorporado (nlinfit) con la función de error exponencial (exp),
Resultados:
La FIG. 6 enumera las semividas calculadas y las tasas de descomposición para IGF-1 de ts, Nrg de ts y los SGF 727, 739, 740, 741, 743 y 757. Los valores se determinaron en MATLAB utilizando un modelo de un compartimento tal como se describe anteriormente. La semivida de SGF basada en IGF-1 aumentó entre 8,45 y 24,6 veces en comparación con el IGF-1 de ts. Adicionalmente, los SGF tenían tasas de descomposición reducidas que iban de 2,1 a 5,66 veces en comparación con el IGF-1 de ts.
Ejemplo 6: Efecto de las proteínas biespecíficas basadas en IGF-1 sobre los niveles de glucosa en sangre en ratones
La aplicación clínica de IGF-1 está limitada por el riesgo de hipoglucemia, por lo tanto, es importante comprender los efectos de estos SGF prolongados de semivida en los niveles de glucosa en sangre. Según algunas realizaciones, un beneficio importante de las proteínas biespecíficas es que, debido a la presencia de un brazo de señalización de IGF-1 de potencia reducida para un direccionamiento eficaz, estas moléculas tienen el potencial de ser mucho más seguras con respecto a la hipoglucemia.
Las proteínas biespecíficas que contienen un brazo de señalización compuesto por factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1), un brazo modulador de la semivida (HLM) y un brazo de direccionamiento (TA) de anexina A5 (AnxV) modificado genéticamente para unirse a la fosfatidilserina (PS) expuestos en la superficie de células apoptóticas se utilizaron para evaluar su efecto sobre los niveles de glucosa en sangre en ratones cuando se utilizaron en una dosis de 160 nmol/kg.
Procedimiento:
Inyecciones en la vena de la cola y contro l de glucosa
Se utilizaron ratones C57BL6/J1 entre 24 y 27 g (n = 2/dosis). Se les permitió de 3 a 5 días después de la llegada para aclimatarse a la instalación de alojamiento de animales antes de su uso. Los animales tuvieron acceso a comida y agua ad libitum ya que estas altas dosis posiblemente podrían dar como resultado una peligrosa hipoglucemia.
El día del experimento, se prepararon dosis de proteína en PBS con albúmina de suero de ratón (MSA) al 0,1 % como proteína de vehículo. El volumen total de inyección fue de 100 pl.
Los animales se calentaron con una lámpara de calor durante 5-10 minutos antes de la inyección para permitir la vasodilatación y facilitar la identificación de la vena de la cola.
Los animales fueron asegurados en un retenedor apropiado, se limpió la cola con una toallita con alcohol estéril y se inyectó una dosis en la vena lateral de la cola.
Para la primera recolección, la cola y la hoja de afeitar se esterilizaron con una toallita de etanol. Se aplicó una pequeña cantidad de sangre (2-3 pl) a las tiras de prueba de glucosa (Abbott, Medidor de glucosa AlphaTrak2, configuración para perros).
Para recolecciones posteriores, se quitó la costra que se había formado sobre la cola y se repitió la recolección de sangre y la medición de glucosa.
Resultados:
La FIG. 7a muestra la evolución temporal de los niveles de glucosa en sangre en ratones después de la dosificación con proteínas biespecíficas de potencia reducida dirigidas (SGF 727 (SEQ ID NO: 76), 739 (SEQ ID NO: 83), 740 (Se Q ID NO: 84), 741 (SEQ ID No : 85) y 743 (SEQ ID NO: 86)) como concentración de glucosa en sangre en mg/dl. A los ratones se les administró albúmina de suero humano recombinante, IGF1 (variante LR3), o un factor de crecimiento sin direccionamiento, sin potencia reducida, con semivida prolongada (proteína 688:IGF1 (LR3-R37X-3X)-Fc) como controles. Estos datos muestran que las proteínas biespecíficas direccionadas, de potencia reducida (SGF 727, 739, 740, 741 y 743) tienen perfiles de seguridad muy mejorados con respecto a la hipoglucemia en comparación con un factor de crecimiento sin direccionamiento, sin potencia reducida, con semivida prolongada (proteína 688) e IGF1 (LR3). Los animales que reciben moléculas biespecíficas de potencia reducida no experimentan hipoglucemia (definida como <70 mg/dl), mientras que los animales a los que se les administra IGF1 (LR3) o factor de crecimiento sin direccionamiento, sin potencia reducida, con semivida prolongada 688 y a este nivel de dosis experimentan hipoglucemia. Se observó que la caída de la glucosa en sangre causada por la administración de IGF1 (LR3) es más transitoria (es decir, recuperación observada a las 3 h) que SGF 688 debido a la semivida extremadamente corta (~ 0,2 h) de IGF1(LR3). La FIG. 7b muestra la relación entre la potencia de SGF (definida como la concentración requerida para alcanzar los niveles semimáximos de pAKT, es decir, la CE50 de pAKT) frente al área bajo la curva (ABC) de la glucosa en sangre de 3 horas. Este gráfico demuestra que una mayor reducción de la potencia (es decir, un aumento de la CE50 de pAKT) conduce a un aumento del ABC de glucosa en sangre a las 3 horas (es decir, una menor reducción de la glucosa en sangre).
Es probable que la respuesta del paciente a la hipoglucemia inducida por SGF basados en IGF-1 sea muy heterogénea y estos datos sugieren que, especialmente para indicaciones que pueden requerir tratamiento crónico, las altas dosis de IGF1 de ts o de GF sin direccionamiento, sin potencia reducida, con semivida prolongada podrían representar un riesgo grave para la seguridad. Estos resultados destacan la importancia de considerar la potencia para la generación de moléculas direccionadas. Según algunas realizaciones, es probable que las moléculas diana con potencia reducida en células no diana y potencia mejorada en células que contienen moléculas diana de interés tengan perfiles de seguridad mucho más deseables que los GF naturales o simplemente de semivida prolongada.
Ejemplo 7: Análisis de los niveles de señalización de proteínas biespecíficas en tejidos de rata sanos e isquémicos
Para analizar cómo las proteínas biespecíficas descritas en el presente documento envían señales en el corazón después de una lesión isquémica, se evaluó la señalización (fosforilación de AKT) en tejido sano y dañado en un modelo de isquemia/reperfusión (I/R) de rata de infarto agudo de miocardio (IAM) utilizando 4 compuestos de prueba: 1) vehículo (PBS albúmina de suero de ratón al 0,1 %), 2) IGF1 de ts (RnD Systems), 3) una proteína de control sin direccionamiento, sin potencia reducida (688, IGF1(LR3-R37x-3x)_lk40_Fc, SEQ ID NO: 72), y 4) una proteína biespecífica con direccionamiento, con potencia reducida (SGF 606, GF1(LR3-R37x-3x)_lk40_mHSA_lk40_AnxVC316S_lk8_His6, SEQ ID NO: 70), véase la FIG. 8.
Los compuestos de prueba se dosificaron a 16 nmol/kg mediante administración intravenosa en el momento de la reperfusión, y el tejido se recogió para análisis 2 horas después de la reperfusión. El tiempo y la dosis se eligieron basándose en la farmacodinámica de las proteínas biespecíficas descritas en el presente documento durante un período de 6 horas en los corazones de ratones sanos. Basándose en estos datos, se razonó que esta dosis y este punto de tiempo permitirían la identificación de las proteínas biespecíficas con señales farmacodinámicas favorables en el corazón dañado.
Procedimiento:
R ecolección de l tejido
Se realizó cirugía I/R de rata con 1 hora de isquemia seguida de reperfusión e inyección intravenosa inmediata (vena de la cola) de vehículo, dosis de IGF-1 o SGF. Después de 2 horas de reperfusión, el animal se anestesió con isoflurano y se mantuvo bajo anestesia profunda a través del cono nasal durante la recolección de tejido. Se abrió la cavidad torácica, la aurícula derecha se cortó con tijeras de disección y el animal se perfundió con 15-20 ml de NaCl al 0,9 % a través del vértice del ventrículo izquierdo para limpiar el sistema circulatorio y el tejido bien perfundido de sangre. Se extrajo el corazón y se seccionó transversalmente el tejido del corazón con una navaja o una hoja de microtomo, cortando en 4 secciones: ápice, media, superior y basal. La sección media tenía poco ventrículo derecho, consistiendo principalmente en el ventrículo izquierdo, y contenía la mayor cantidad de infarto que a menudo era ligeramente visible por su palidez. El tejido sano (sección remota) se diseccionó cuidadosamente de la región que contenía el infarto y la zona de borde (sección de infarto) y cada pieza de tejido se colocó en tubos separados etiquetados como remoto e infarto.
H om ogeneización de tejidos
Se añadió tampón RIPA proteasa (Roche Complete) e inhibidores de la fosfatasa (Roche PhosSTOP) en una proporción de ~ 2:1 pl de tampón:mg de tejido (por ejemplo, para 300 mg de tejido, se utilizan 600 pl de tampón) en un tubo que contenía muestras de tejido cardíaco. El tejido se trituró con microtijeras para facilitar la homogeneización de las perlas. Se añadieron perlas de acero inoxidable de 1,6 mm a 1:1 de peso de tejido:peso de las perlas. Las muestras se cargaron en un mezclador Bullet con una velocidad de 8 durante 4 minutos, luego se volvió a poner en hielo durante 1 min. Las muestras se centrifugaron a velocidad máxima durante 1 min y luego durante 15 min a 14.000 rpm a 4 °C. Se eliminó 1 pl de sobrenadante y se combinó con 59 o 119 pl de PBS para realizar el ensayo de BCA. La concentración de proteína se midió por BCA por duplicado.
Ensayo de PD (ELISA de pAK T)
Protocolo:
El día 1, la placa blanca plana de 384 pocillos (LIA High Binding (Greiner bio-one, REF 781074) se recubrió con 20 pl/pocillo de anticuerpo de captura anti-Akt (clon SKB1, Millipore), diluido a 1:250 en PBS.
El día 2, el tejido se descongeló en hielo. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 pl/pocillo de PBS-T al 0,05%. Las placas de ELISA se bloquearon con 50 pl/pocillo de BSA al 2 %/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se preparó una curva estándar de Akt activa humana recombinante en RIPA al 14,44 % en PBS en placas de 96 pocillos (placa Corning de superficie sin unión (NBS)). La Akt1 rh/PKBa activa (Millipore) se diluyó a 200X a 9165 ng/ml.
Después del bloqueo, las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T con lavador de placas. Se añadieron 20 |j|/pocillo de muestras o patrones de las placas de preparación y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se preparó el anticuerpo de detección anti-fosfo Akt: mAb anti-AKT de conejo no biotinilado, la señalización celular para lisados de tejido se diluyó a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween20 al 0,1%/PBS. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 jl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 jl/pocillo de Ab de detección de anti-fosfo Akt diluido y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección secundario: Ab anti-IgG de conejo-HRP (CST 7074) diluido a 1:1000 en BSA al 2 %/Tween 20 al 0,1 %/PBS. Lavar las placas de ELISA 3 veces con 80 jl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. Se añadieron 20 jl/pocillo de reactivo de detección secundaria diluido y las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con 80 jl/pocillo de Tween 20 al 0,05 %/PBS. La detección se realizó con 20 jl/pocillo de sustrato quimioluminiscente Super Signal ELISA Pico (Thermo). Las placas se agitaron durante 1 minuto y se leyó la luminiscencia en un lector de placas.
Resultados
Los datos se muestran en la FIG. 8. En todos los casos, los animales dosificados con vehículo de control sirven como los datos iniciales para la comparación entre los ensayos. Para todos los datos mostrados, los niveles de pAKT en homogeneizados de tejido cardíaco remoto o infarto de animales tratados con SGF se han normalizado a homogeneizados de tejido remoto o de infarto dosificado con vehículo (PBS-MSA), respectivamente. Como tal, los datos para cada SGF se muestran como un "aumento de veces" en el nivel de pAKT con respecto al animal dosificado con vehículo para cada región de tejido.
Para cada prueba, se analizaron los datos para comparar los niveles relativos de pAKT en tejido remoto o tejido de infarto dentro del mismo animal tratando el tejido remoto e infartado como muestras pareadas. Se realizó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak.
Los datos muestran que los niveles de pAKT en tejido de animales a los que se les administró IGF-1de ts no se elevaron significativamente por encima de los animales a los que se les administró vehículo en tejidos remotos o infartados 2 horas después de la dosificación, lo que sugiere que el IGF-1 de ts es incapaz de mantener niveles elevados de pAKT hasta 2 horas después de la dosificación. Un SGF de semivida prolongada, sin direccionamiento, con potencia reducida (688, SEQ ID NO: 72) aumentó los niveles de pAKT tanto en el tejido remoto como en el de infarto en comparación con el vehículo 2 horas después de la dosificación, lo que indica los Gf de semivida prolongada sin direccionamiento pueden aumentar los niveles de pAKT de manera no selectiva (es decir, tanto en tejido remoto como en tejido infartado) durante al menos 2 horas después de la dosificación. En cambio, un SGF de potencia reducida, con direccionamiento (606) provocó el aumento selectivo de pAKT solo en el tejido de infarto a las 2 horas tras la dosificación; el SGF 606 no provoca una elevación significativa de pAKT en tejido remoto en este mismo punto de tiempo (en comparación con el vehículo). Debido a que hay considerablemente más células apoptóticas que exponen la fosfatidilserina superficial en la región infartada que en la región remota, estos datos indican que los SGF de potencia reducida con direccionamiento señalan de manera selectiva en tejido que contiene la diana (por ejemplo, tejido de infarto) y, de manera importante, no señalan en tejido que no contenga la diana (por ejemplo, tejido remoto). Estos resultados muestran que la selectividad in vitro en cardiomiocitos dañados se traduce a la selectividad in vivo en tejido cardíaco dañado. (Véase la Figura 3, que muestra que SGF 606 tiene una selectividad 22 veces mayor para las células apoptóticas frente a las células no apoptóticas, y en comparación con los datos de la FIG. 8, que muestran que la misma molécula (SGF 606) señala de manera selectiva tejido cardíaco infartado).
Ejemplo 8: Eficacia de un SGF 606 basado en HSA con potencia reducida y direccionamiento en un modelo de isquemia/reperfusión en rata
Para analizar cómo las proteínas biespecíficas descritas en el presente documento previenen el daño tisular después de una lesión isquémica, se evaluó el infarto/área en riesgo (AER) en un modelo de isquemia/reperfusión (I/R) de infarto agudo de miocardio (IAM) en rata utilizando 3 compuestos de prueba: 1) vehículo (PBS albúmina de suero de ratón al 0,1 %), 2) IGF1 de ts (RnD Systems), 3) un SGF con potencia reducida, con direccionamiento (606, GF1(LR3-R37x-3x)_1k40_mHSA_1k40_AnxVC316S_1k8_His6, SEQ ID NO: 70), véase la FIG. 9A-C.
El diseño del estudio se muestra en la FIG. 9A. Después de 72 horas de reperfusión, los animales se sacrificaron y el tejido se recogió para el análisis de infarto/área en riesgo (AER) como criterio de valoración principal.
Procedimiento:
Cirugía
El infarto agudo de miocardio (IAM) se indujo en ratas ligando temporalmente la arteria coronaria izquierda en un protocolo quirúrgico de isquemia/reperfusión (I/R) de la siguiente manera: Se pidieron ratas macho CD IGS (200-300 g) para que llegaran al menos 72 horas antes del estudio para permitir la aclimatación. Todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave antes de cada sesión quirúrgica. Las puntas de los instrumentos se limpiaron por inmersión en alcohol, se limpiaron con una gasa con alcohol y se colocaron en un esterilizador de cuentas de vidrio

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína biespecífica que comprende:
a) un dominio de direccionamiento que tiene una especificidad de unión a una molécula diana asociada a la superficie externa de una célula de un tejido en donde el dominio de direccionamiento comprende una variante de la anexina A5 humana que comprende una o más mutaciones, en donde las una o más mutaciones consisten en una sustitución en la posición correspondiente a C316 y opcionalmente en una o más posiciones correspondientes a R63, K70, K101, e 138, D139, N160 y combinaciones de las mismas; y
b) un dominio activador modificado genéticamente que tiene una especificidad de unión a un receptor asociado a la superficie de una célula del tejido, en donde el dominio activador modificado genéticamente comprende una variante del factor de crecimiento similar a la insulina humana IGF-1 que comprende una o más mutaciones, en donde las una o más mutaciones consisten en una sustitución en una o más posiciones correspondientes a E3, Y24, Y31, Y60 y combinaciones de las mismas, en donde el dominio activador modificado genéticamente reduce la activación del receptor de IGF-1 en relación con el IGF-1 de tipo silvestre,
en donde la proteína biespecífica muestra una activación del receptor de IGF-1 al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana medida por fosforilación de un receptor o una molécula efectora aguas abajo.
2. La proteína biespecífica de la reivindicación 1, en donde:
(a) las una o más mutaciones en la variante de la anexina A5 humana consisten en una sustitución de C316A o c3 l6 S y, opcionalmente, una o más de R63A, K70A, K101A, E138A, D139G y N160A y combinaciones de los mismos;
(b) las una o más mutaciones en la variante de IGF-1 humano consisten en una sustitución en una o más de E3R, Y24L, Y31A, Y60L y combinaciones de las mismas.
3. La proteína biespecífica de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde la proteína biespecífica presenta activación del receptor de IGF-1 al menos dos veces más fuerte en las células que contienen la molécula diana en comparación con las células que no contienen la molécula diana medida por fosforilación de la serina/treonina proteína quinasa B (AKT).
4. La proteína biespecífica de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína de fusión biespecífica promueve la regeneración de tejidos, la supervivencia celular, la diferenciación celular, inhibe la apoptosis, induce la proliferación celular, promueve el crecimiento celular, promueve la motilidad de las células madre, promueve la diferenciación de células madre, previene el daño celular y/o promueve la angiogénesis, y en donde el tejido es opcionalmente tejido cardíaco, tejido renal, hueso, cartílago, articulaciones, piel, tejido hepático, tejido pancreático, células sanguíneas, tejido pulmonar, tejido cerebral o tejido nervioso.
5. La proteína biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante del factor de crecimiento similar a la insulina humana IGF-1 comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 12, 15, 17-20, 22-25, 27-30 o 120.
6. La proteína biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante de anexina A5 humana comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 2-4, 122.
7. La proteína biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en donde la proteína biespecífica tiene una concentración semimáxima eficaz más baja en el tejido dañado (CE50oañado) que en el tejido sano (CE50sano),
en donde opcionalmente la variante de IGF-1 tiene una proporción de CE50sano/CE50oañado de al menos 10:1.
8. La proteína biespecífica de la reivindicación 7, en donde la variante de IGF-1 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 12, 15, 17-20, 22, 25, 27, 30 o 120.
9. La proteína biespecífica de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8, en donde la anexina A5 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 2-4 o 122.
10. La proteína biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde la proteína biespecífica comprende además un enlazador peptídico, en donde el enlazador peptídico es opcionalmente un modulador de la semivida, en donde el modulador de la semivida es opcionalmente una albúmina de suero humano, un fragmento Fc o una variante del mismo, en donde el modulador de la semivida tiene opcionalmente al menos un 80 % de identidad con la albúmina de suero humano de tipo silvestre, en donde la albúmina de suero humano o una variante de la misma tiene opcionalmente una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 54-56 o 124.
11. La proteína biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde la proteína biespecífica comprende una secuencia de aminoácidos de una variante no internalizante de la anexina A5 humana y en donde la proteína biespecífica tiene una semivida prolongada en comparación con una proteína biespecífica que comprende la secuencia de aminoácidos de la anexina A5 humana de tipo silvestre.
12. La proteína biespecífica de la reivindicación 11, en donde la proteína biespecífica comprende un dominio de direccionamiento que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 4 y un dominio activador que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 120.
13. La proteína biespecífica de la reivindicación 11, en donde la proteína biespecífica comprende un dominio de direccionamiento que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 122 y un dominio activador que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 120.
14. Una proteína biespecífica que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 118.
15. Una composición farmacéutica que comprende la proteína biespecífica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
16. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de sujetos con el fin de promover la regeneración del tejido o la supervivencia del tejido, comprendiendo la composición farmacéutica una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína biespecífica según las reivindicaciones 1-14.
17. Un ácido nucleico que codifica la proteína biespecífica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
ES16852701T 2015-10-02 2016-09-30 Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos Active ES2863278T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562236169P 2015-10-02 2015-10-02
US201562237889P 2015-10-06 2015-10-06
US201662322910P 2016-04-15 2016-04-15
PCT/US2016/054744 WO2017059231A1 (en) 2015-10-02 2016-09-30 Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2863278T3 true ES2863278T3 (es) 2021-10-11

Family

ID=58427983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16852701T Active ES2863278T3 (es) 2015-10-02 2016-09-30 Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos

Country Status (7)

Country Link
US (6) US10040840B2 (es)
EP (2) EP3355907B1 (es)
JP (2) JP7005019B2 (es)
CN (2) CN115960249A (es)
CA (1) CA3000742A1 (es)
ES (1) ES2863278T3 (es)
WO (1) WO2017059231A1 (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6200806B2 (ja) * 2010-05-21 2017-09-20 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 二重特異的融合タンパク質
CN115960249A (zh) 2015-10-02 2023-04-14 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质
CN111763680A (zh) * 2019-05-22 2020-10-13 杭州杰迪生物科技有限公司 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞
JP7355326B2 (ja) * 2019-08-05 2023-10-03 デンカ株式会社 経粘膜投与薬剤
CN112584507B (zh) 2019-09-30 2022-05-17 华为技术有限公司 一种数据处理方法、装置及存储介质
CN115379850A (zh) 2019-12-24 2022-11-22 裘美娜治疗公司 再生性多肽及其用途
CN111195350A (zh) * 2020-01-15 2020-05-26 重庆大学 IGF1和IGF1Ec24联合在制备促进组织修复与再生的药物中的应用
CA3187734A1 (en) * 2020-07-30 2022-02-03 Samuel J. Pfaff Chimeric proteins and methods of use for treatment of central nervous system disorders
CN117897399A (zh) * 2021-06-14 2024-04-16 Inserm(法国国家健康医学研究院) 突变的膜联蛋白a5多肽及其在治疗目的中的用途
CN117999278A (zh) 2021-06-21 2024-05-07 裘美娜治疗公司 再生性多肽及其用途
EP4363439A4 (en) * 2021-06-30 2025-12-17 Silver Creek Pharmaceuticals Inc Chimeric proteins for the targeted release of growth factors to the glomerulus
EP4479417A4 (en) * 2022-02-15 2025-12-10 Silver Creek Pharmaceuticals Inc Chimeric proteins for the treatment of acute radiation syndrome
EP4652192A1 (en) * 2024-03-25 2025-11-26 Cavalry Biosciences, Inc. Igf-1-related compositions and uses of the same

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL269416A (es) 1960-09-21
GB8819826D0 (en) 1988-08-20 1988-09-21 Kabivitrum Ab Glycosylated igf-1
US5679771A (en) 1990-02-13 1997-10-21 Gropep Pty. Ltd. Method for treating intestinal diseases
ES2178635T3 (es) 1990-11-09 2003-01-01 Stephen D Gillies Inmunoconjugados de citoquinas.
US5632986A (en) 1991-05-09 1997-05-27 The University Of Washington Phospholipid-targeted thrombolytic agents
US5444045A (en) * 1992-09-17 1995-08-22 Gropep, Pty. Ltd. Method of administering IGF-1, IGF-2, and analogs thereof to birds
WO1995019791A1 (en) * 1994-01-24 1995-07-27 Neorx Corporation Radiolabeled annexins
EP0756494A1 (en) 1994-05-24 1997-02-05 Amgen Boulder Inc. Modified insulin-like growth factors
US5780052A (en) 1995-04-24 1998-07-14 Northeastern University Compositions and methods useful for inhibiting cell death and for delivering an agent into a cell
JPH11508608A (ja) 1996-04-17 1999-07-27 ニューロクライン バイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド インスリン様成長因子結合タンパク質のリガンドインヒビターおよびそれらの使用方法
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
EP1098665B9 (en) 1998-07-13 2003-08-13 The Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US6387663B1 (en) 1998-07-31 2002-05-14 University Of Southern California Targeting pharmaceutical agents to injured tissues
AUPP785098A0 (en) 1998-12-21 1999-01-21 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Treatment of heart disease
DE60042550D1 (de) 1999-01-06 2009-08-27 Genentech Inc Mutierte varianten des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor i (igf-i)
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
CA2378925C (en) 1999-07-21 2010-04-06 University Of Southern California Matrix-targeted fusion polypeptides for tissue regeneration and wound healing
JP2001251104A (ja) 2000-03-03 2001-09-14 Murata Mfg Co Ltd 非可逆回路素子及び通信機装置
DE60141759D1 (de) 2000-08-29 2010-05-20 Aurogen Inc Methode zur behandlung des zentralnervensystems durch applikation von strukturanaloga von igf
EP2796468A2 (en) 2001-01-05 2014-10-29 Pfizer Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US7635680B2 (en) 2001-02-21 2009-12-22 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Attenuation of reperfusion injury
AU2002256423B2 (en) 2001-04-30 2008-07-24 Zystor Therapeutics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US7049286B2 (en) 2001-08-30 2006-05-23 Diatos, S.A. Insulin conjugates and methods of use thereof
AU2008200706B2 (en) 2001-10-16 2010-05-27 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for targeting underglycosylated proteins across the blood brain barrier
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
EP1622645B1 (en) 2002-04-23 2013-10-23 Roger Williams Hospital Compositions and methods for stem cell delivery
JP4444821B2 (ja) * 2002-06-06 2010-03-31 ツェ・チェイン・ウン 遺伝子組み換えによる新しい抗凝血性蛋白質
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20040213738A1 (en) 2003-03-31 2004-10-28 Susan Croll-Kalish CIRL3-Like proteins, nucleic acids, and methods of modulating CIRL3-L-mediated activity
WO2005033134A2 (en) 2003-09-30 2005-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Secreted protein therapeutics and uses thereof
JP2007531513A (ja) * 2003-11-13 2007-11-08 ハンミ ファーム．インダストリー カンパニー リミテッド 薬物のキャリアとして有用なＩｇＧＦｃ断片およびその製造方法
JP2007536254A (ja) 2004-05-05 2007-12-13 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 生物活性を調節するための二重特異性結合剤
WO2006004910A2 (en) 2004-06-28 2006-01-12 Transtarget Inc. Improved bispecific antibodies
US7511016B2 (en) 2004-07-07 2009-03-31 Mosamedix B.V. Annexins, derivatives thereof, and annexin-cys variants, as well as therapeutic and diagnostic uses thereof
AU2005277094A1 (en) 2004-08-20 2006-03-02 Regenerx Biopharmaceuticals, Inc. Method of treating, preventing, inhibiting or reducing damage to cardiac tissue
US7531318B2 (en) 2004-08-20 2009-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Screening of agents for activity against ischemic myocardial insults
JP2008517917A (ja) * 2004-10-21 2008-05-29 アイジーエフ オンコロジー エルエルシー 癌を治療するための毒素および放射性核種結合ｉｇｆ−１受容体リガンド
ATE517120T1 (de) 2005-01-07 2011-08-15 Regeneron Pharma Igf-1 fusion polypeptide und deren therapeutische verwendung
US20090098046A1 (en) 2005-01-14 2009-04-16 Michael Becker Combination Cancer Therapy with Anti-PSMA Antibodies
SG158919A1 (en) 2005-01-24 2010-02-26 Univ Texas Constructs binding to phosphatidylserine and their use in disease treatment
EP1853309A4 (en) 2005-02-23 2008-10-22 Merrimack Pharmaceuticals Inc BISPECIFIC BINDER FOR MODULATING BIOLOGICAL ACTIVITY
US7521211B2 (en) 2005-04-05 2009-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc IGF-1 and IGF-2 chimeric polypeptides and therapeutic uses thereof
AU2006249327A1 (en) 2005-05-27 2006-11-30 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of and compositions for stimulation of glucose uptake into muscle cells and treatment of diseases
AU2006280312A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
EP1960790B1 (en) 2005-12-12 2016-12-28 MosaMedix B.V. Annexin derivatives suitable for pretargeting in therapy and diagnosis
US7776816B2 (en) 2006-01-20 2010-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Preserving hypoxic tissue
AU2007212147A1 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Llc Protein formulations
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
CL2007001614A1 (es) 2006-06-09 2008-08-08 Novartis Ag Polipeptido que comprende una proteina del precursor del factor de crecimiento tipo insulina, igf-1 humana, en la cual la escision del peptido e mediante una proteasa se reduce a traves de la modificacion de la proteina del precursor; y su uso para t
US9187517B2 (en) 2006-11-13 2015-11-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods of promoting cardiac repair using growth factors fused to heparin binding sequences
US8003761B2 (en) 2007-01-23 2011-08-23 Hoffmann-La Roche Inc. Cancerous disease modifying antibodies
SE0700218L (sv) 2007-01-23 2008-02-26 Teknikbolaget K Samuelsson Ab Sprutmunstycksanordning för brandsläckningssystem
US11535673B2 (en) 2007-04-05 2022-12-27 President and Fellows of Harvard CoHege Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
US8889140B2 (en) 2007-05-31 2014-11-18 Transtarget, Inc. Compositions and methods for tissue repair
US20110045007A1 (en) 2007-05-31 2011-02-24 Genmab A/S Fusion or linked proteins with extended half life
HRP20110368T1 (hr) 2007-06-21 2011-06-30 Technische Universitt Mnchen Biološki aktivni proteini s povećanom stabilnošću in vivo i/ili in vitro
WO2009030720A2 (en) 2007-09-06 2009-03-12 Novozymes Biopharma Dk A/S Process for producing a recombinant protein
EA022201B1 (ru) 2008-04-11 2015-11-30 Мерримак Фармасьютикалз, Инк. Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
WO2010087976A2 (en) * 2009-01-31 2010-08-05 Igf Oncology, Llc Anti-cancer protein-platinum conjugates
BR112012001363A2 (pt) 2009-07-22 2016-11-08 Ipsen Pharma Sas análogo de igf-1, composição farmacêutica,e, método para tratar condições ou doenças mediadas pela ligação do receptor de igf-1
WO2011011071A2 (en) 2009-07-22 2011-01-27 Ipsen Pharma S.A.S. Analogues of insulin-like growth factor-1 (igf-1)
CA2777242A1 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
BR112012009450A2 (pt) 2009-10-30 2017-05-23 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
JP6200806B2 (ja) 2010-05-21 2017-09-20 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 二重特異的融合タンパク質
EP2649177B1 (en) 2010-12-08 2018-09-05 ViaCyte, Inc. Agents and methods for inhibiting human pluripotent stem cell growth
EP2780364A2 (en) 2011-11-18 2014-09-24 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
CN104114575B (zh) 2011-12-15 2019-04-09 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 具有降血糖作用的化合物、组合物及其用途
CN108383902A (zh) 2012-09-26 2018-08-10 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰岛素类似物二聚体
US20160122411A1 (en) 2013-03-29 2016-05-05 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Cartilage-binding fusion proteins
EP3094339B1 (en) 2014-01-12 2019-12-11 IGF Oncology, LLC Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof
CN115960249A (zh) 2015-10-02 2023-04-14 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质

Also Published As

Publication number Publication date
EP3355907B1 (en) 2021-01-20
US20200207826A1 (en) 2020-07-02
US11879002B2 (en) 2024-01-23
US12122819B2 (en) 2024-10-22
JP2018538356A (ja) 2018-12-27
EP3355907A1 (en) 2018-08-08
CA3000742A1 (en) 2017-04-06
US11155593B2 (en) 2021-10-26
US20190169258A1 (en) 2019-06-06
JP7365715B2 (ja) 2023-10-20
EP3355907A4 (en) 2019-08-07
US20250145682A1 (en) 2025-05-08
WO2017059231A1 (en) 2017-04-06
CN108367048A (zh) 2018-08-03
US20220162283A1 (en) 2022-05-26
HK1258376A1 (en) 2019-11-08
EP3865147A1 (en) 2021-08-18
US20220009991A1 (en) 2022-01-13
CN108367048B (zh) 2022-08-12
CN115960249A (zh) 2023-04-14
JP2022002528A (ja) 2022-01-11
US10633425B2 (en) 2020-04-28
US10040840B2 (en) 2018-08-07
US20170096469A1 (en) 2017-04-06
JP7005019B2 (ja) 2022-02-04
EP3865147B1 (en) 2025-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2863278T3 (es) Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos
US11814443B2 (en) Bi-specific fusion proteins
CN105524176B (zh) 双特异性融合蛋白
HK40058660A (en) Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
HK1258376B (en) Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair