ES2620363T3

ES2620363T3 - Composiciones y métodos para promover la cicatrización de heridas y la regeneración tisular

Info

Publication number: ES2620363T3
Application number: ES10185398.4T
Authority: ES
Inventors: Robert Gourdie; Gautam Ghatnekar; Jane Jourdan
Original assignee: MUSC Foundation for Research Development
Current assignee: MUSC Foundation for Research Development
Priority date: 2004-12-21
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2025-12-20
Also published as: US7786074B2; DK2377546T3; IL206497A; NO342964B1; BRPI0519737A2; US20180071363A1; EP1827480B1; NO20073654L; JP2013136595A; US10398757B2; US9855313B2; EP2377546A2; RU2582394C2; US20150140060A1; RU2438696C2; US8859733B2; RU2011139724A; US7888319B2; EP2377546B1; CA2593979C

Abstract

Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalización celular para su uso en un método de tratamiento, en el que el polipéptido se recubre sobre un implante médico o material de tratamiento de heridas.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para promover la cicatrizacion de heridas y la regeneracion tisular Antecedentes de la invencion

Un nino normal sabe que si un lagarto escinco pierde la cola al final le crecera otra. Ademas, los ninos y mayores que tienen el habito de estudiar tales cosas entienden bien que muchos animales inferiores son capaces de regenerar estructuras bastante complejas, incluyendo extremidades completas y organos tras una lesion. Por ejemplo, a los peces les puede volver a crecer un corazon despues de que una parte significativa del viejo corazon del pez se haya cortado (Poss et al., 2002). Esto es un resultado sorprendente cuando se reflexiona sobre lo esencial que es el corazon en la supervivencia minuto a minuto de la mayona de los animales.

Sin embargo, la regeneracion de tejido, extremidades y organos tras lesion en personas no es tan sencilla como en los peces. Mientras que los tejidos humanos danados por heridas mecanicas, procesos de enfermedad y otras causas son capaces de cicatrizar, la funcion y estructura de tejido complejo raras veces, por no decir nunca se restauran completamente. En su lugar, la recuperacion de casi todos los tejidos de una lesion en humanos y otros vertebrados superiores esta dominada por la formacion de tejido cicatricial. El ejemplo mas familiar de esto son las cicatrices decoloradas y fibroticas que persisten tras la cicatrizacion de un raspon o corte en la piel. Menos apreciada es la formacion de tejido cicatricial glial tras lesion en el cerebro o la medula espinal, que es uno de los principales obstaculos para la restauracion de la funcion neuronal tras el dano al sistema nervioso central (Silver y Miller JH, 2004). Actualmente no existen medios de tratamiento o prevencion de tal formacion de cicatrices y de promocion de la regeneracion de la funcion y estructura de tejido complejo tras lesion.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular para su uso en un metodo de tratamiento, en el que el polipeptido se recubre sobre un implante medico o material de tratamiento de heridas, segun la reivindicacion 1 adjunta. Se proporcionan realizaciones preferidas de la presente invencion segun las reivindicaciones dependientes.

Breve sumario de la invencion

Tambien se divulga un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos carboxilo terminal de una conexina alfa (tambien denominado en el presente documento polipeptido de conexina alfa carboxilo terminal (ACT)), o una variante conservativa del mismo.

Tambien se divulga en el presente documento un metodo de promocion de la cicatrizacion de heridas tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una o mas de las composiciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos o vectores) en un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

Las ventajas adicionales del metodo y las composiciones divulgadas se estableceran en parte en la descripcion que sigue, y en parte se entenderan de la descripcion, o pueden aprenderse mediante la practica del metodo y las composiciones divulgadas. Las diversas ventajas del metodo y las composiciones divulgadas se realizaran y lograran mediante los elementos y las combinaciones particularmente senaladas en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripcion general anterior como la descripcion detallada siguiente son solo a modo de ejemplo y explicativas y no son restrictivas de la invencion tal como se reivindica.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran varias realizaciones del metodo y las composiciones divulgadas y junto con la descripcion, sirven para explicar los principios del metodo y las composiciones divulgadas.

La figura 1 muestra que un polipeptido de conexina alfa carboxilo terminal (ACT) aumenta el grado de formacion de uniones comunicantes Cx43 en miocitos neonatales cultivados. Los miocitos de corazones de ratas neonatas se hicieron crecer hasta formar una monocapa casi confluente sobre una placa de tejido tisular segun protocolos convencionales. Posteriormente se permitio que los cultivos se cultivaran durante 5 dfas mas en medio de cultivo que comprende (a) peptido ACT 1 30 |iM (SEQ ID NO: 2), (b) peptido de control no activo 30 |iM (SEQ ID NO: 55) o (c) solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que no contiene peptido ACT o control. El medio de cultivo con peptidos o control de vetnculo anadidos se cambio cada 24 horas durante el experimento. (a) indica que el peptido ACT aumento enormemente el grado de formacion de uniones comunicantes Cx43 (puntos y lmeas indicados mediante puntas de flechas) entre los miocitos en relacion con las condiciones de control (b) y (c). Este aumento en la formacion de uniones comunicantes Cx43 en respuesta al peptido ACT es compartido por varios tipos de celulas que expresan Cx43.

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La figura 2 muestra que el peptido ACT inhibe la proliferacion y migracion de fibroblastos transformados (celulas NIH-3T3) lesionados por un aranazo. Se trato previamente una monocapa de NIH-3T3 con peptido ACT 1 (SEQ ID NO: 2) durante 24 h, y se “lesiono por aranazo” con una punta de pipeta de p200. Se permitio posteriormente que la “lesion por aranazo” “cicatrizara” durante 24 horas en presencia de (a, b) peptido ACT 1 30 |iM (SEQ ID NO: 2), (c, d) peptido de control no activo 30 |iM (SEQ ID NO: 55) o (e, f) disolucion de control de vehmulo que no contiene peptido ACT o peptido de control. La “lesion por aranazo” de las celulas tratadas con peptido ACT permanece relativamente sin cicatrizar tras 24 horas (a), repoblando algunas celulas (flecha grande) el area dentro de los bordes de la “lesion por aranazo” inicial (es decir, dentro del area marcada mediante las puntas de flecha negras pequenas). Por el contrario, en las condiciones de control en (c) y (e), grandes numeros de celulas (flecha grandes) han repoblado la zona dentro de la “lesion por aranazo” inicial. La repoblacion de la “lesion por aranazo” se produce en parte por medio de migracion de las celulas transformadas que se arrastran a la zona de la “lesion por aranazo”. Las figuras (b), (d) y (f) muestran el inmunomarcaje del antfgeno nuclear de celulas en proliferacion (PCNA) de celulas en la “lesion por aranazo” o en el borde de la lesion. Las celulas tratadas con peptido ACT (b) muestran solo baja luminosidad lo que concuerda con el fondo y ausencia de proliferacion. Solo en las dos condiciones de control mostradas en (d) y (f), se observan celulas en proliferacion marcadas de manera brillante (flechas blancas). Esto indica que el peptido ACT tambien ha reducido la proliferacion de las celulas transformadas.

La figura 3 muestra la cuantificacion de la inhibicion de la migracion mediante peptidos ACT tras lesion en un modelo celular experimental. Los fibroblastos NIH-3T3 se “lesionaron por aranazo” y se sometieron a la presencia continua de peptido ACT 1 30 |iM (SEQ ID NO: 2) durante 24 horas o las condiciones de control tal como se explican de manera resumida en la figura 2. La figura (a) muestra el borde de la lesion de celulas de control tratadas con peptido no activo y peptido ACT al final del periodo de 24 horas. Las celulas se han marcado con faloidina fluorescente para ayudar a la visualizacion. Las celulas tratadas con peptido ACT muestran bajos niveles de repoblacion del area de lesion por aranazo (flechas de doble cabeza blancas). La figura (b) muestra un grafico de barras del % de area de celulas que repueblan la lesion por aranazo tras 24 horas. La reduccion de celulas en el area de lesion en presencia de peptido ACT es drastica, con una p < 0,000001.

La figura 4 muestra que la expresion de un polinucleotido que codifica para peptido ACT operativamente unido a un promotor en la celula epitelial WB-F344 inhibe la migracion tras lesion por aranazo en un modelo celular experimental. Las celulas WB-F344 son una lmea celular epitelial de rata transformada derivada mediante tratamiento de celulas del tngado de rata aisladas con un agente que provoca cancer (Tsao et al., 1984; Hayashi et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al., 2001). Se transfectaron las celulas WB-F344 con un constructo de plasmido de expresion de ADNc y se selecciono con antibioticos usando protocolos convencionales para generar lmeas celulares que expresan de manera estable un polinucleotido que codifica para el peptido ACT (sEq ID NO: 6) operativamente unido a una secuencia de promotor o un polinucleotido de protema fluorescente verde (GFP) operativamente unido a una secuencia de promotor como control. El polinucleotido que codifica para el peptido ACT tambien codifico para GFP. Como tal, la expresion del peptido ACT podfa someterse a ensayo mediante optica de fluorescencia de GFP convencional en un microscopio optico. (a) y (b) muestran imagenes de alto aumento de fluorescencia de GFP en lmeas celulares de WB-F344 que expresan GFP mas la secuencia de peptido ACT de extremo carboxilo terminal (a) o GFP solo (b). Las monocapas casi confluentes de las lmeas celulares de WB-F344 se “lesionaron por aranazo” y se permitio que “cicatrizaran” durante 24 horas. De manera similar a los casos de control de las celulas NIH-3T3 tratadas con vehmulo o peptido de control no activo, la lmea celular epitelial de control que expresa GFP repoblo la lesion por aranazo (d). Sin embargo, en la lmea celular epitelial que expreso de manera estable el polinucleotico que codifica para el peptido ACT operativamente unido a una secuencia de promotor, se inhibio la repoblacion de la lesion por aranazo (c).

La figura 5 muestra que el peptido ACT reduce la inflamacion, mejora la cicatrizacion y reduce la formacion de cicatrices tras la lesion cutanea incisional en un raton neonato. Se desensibilizaron cnas de raton neonatos usando hipotermia. Se realizo una lesion cutanea incisional de 4 mm de largo usando un bistun a traves del grosor completo de la piel (descendiendo hasta el nivel del musculo subyacente) en la lmea dorsal media entre los omoplatos. Entonces se aplicaron a las lesiones incisionales 30 |il de una disolucion de gel pluronico (F-127) al 20% que contema o bien nada (control) o bien peptido ACT 1 disuelto (SEQ ID NO: 2) a una concentracion de 60 |iM. Posteriormente se aplico gel de control o que contema peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizo aplicacion adicional de gel de control y que contema peptido ACT tras la segunda aplicacion. A las 48 horas la lesion tratada con peptido ACT (a) esta significativamente mas cerrada, menos inflamada, menos hinchada (se observan crestas en el borde de la herida), y generalmente mas cicatrizada en apariencia que la lesion de control que no recibio peptido ACT (b). Estas diferencias en la inflamacion, hinchazon y cicatrizado entre el control y lesion tratada con peptido ACT y control persistfan en los puntos de tiempo de 72 (c, d) y 96 (e, f) horas. A los 7 dfas, la herida con peptido ACT (g), tema un aspecto mas suave y menos cicatrizado que la lesion tratada con peptido de control (h). Observese que las imagenes de la misma lesion sobre el mismo animal se muestran en puntos de tiempo diferentes durante el transcurso de tiempo de la cicatrizacion.

La figura 6 muestra que el peptido ACT reduce la inflamacion, mejora la cicatrizacion y reduce la formacion de cicatrices tras una lesion cutanea excisional grande en ratones adultos. Los ratones adultos anestesiados teman lesiones cutaneas excisionales circulares de 8 mm de ancho realizadas mediante unas tijeras quirurgicas finas

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descendiendo hasta el musculo subyacente en la lmea dorsal media entre los omoplatos (es dedr, tal como se muestra en (a) y (b). Se delimito el Kmite de la lesion mediante un corte de molde circular de 8 mm de ancho en una lamina de plastico. Entonces se aplicaron a las lesiones excisionales 100 |il de una disolucion de gel pluronico al 30% que contema o bien nada (control) o bien peptido ACT 1 disuelto (SEQ ID NO: 2) a una concentracion de 100 |iM. Posteriormente se aplico gel de control o que contema peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizaron aplicaciones adicionales de gel de control o que contema peptido ACT tras la segunda aplicacion. La lesion excisional grande tratada con peptido ACT (a, c e, g, i) se cerro mas rapidamente, estaba menos inflamada en apariencia, cicatrizo mas rapido y con menos cicatrices que la lesion de control que no recibio peptido ACT (b, d, f, h, j) a lo largo del transcurso de tiempo de 14 dfas. De hecho, la lesion de control a los 14 dfas todavfa muestra una costra parcial que indica que la cicatrizacion aguda de la lesion fue incompleta (j). Observese que las imagenes de la misma lesion sobre el mismo animal se muestran en puntos de tiempo diferentes durante el transcurso de tiempo de la cicatrizacion.

La figura 7 muestra que el peptido ACT reduce la densidad de celulas inflamatorias tras la lesion cutanea excisional en ratones adultos. Se tomaron biopsias cutaneas del sitio de la herida completa de algunos de los ratones 24 horas tras la lesion excisional en el experimento descrito en la figura 6. Las figuras (a) y (b) muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones transversales de cerca del centro de la herida de lesiones tratadas con control y peptido aCt respectivamente. El borde de la herida (marcado mediante flechas pequenas), rodeado de piel de aspecto histologico normal, puede observarse en ambos casos. Se coloca un rectangulo negro sobre las imagenes en (a) y (b) en el borde de la herida a mano izquierda. Las estructuras histologicas dentro de estos dos rectangulos se muestran a mas aumentos en (c) y (d) para tejidos tratados con control y peptido ACT, respectivamente. De mayor interes es un tejido de “tipo collar” de material fibroso alineado (con flecha) que se proyecta desde las partes basales de la lesion a o hacia la superficie exterior y borde de la herida de la lesion. El sustrato fibroso alineado tiene el aspecto de estar mucho mas organizado en la lesion de control (d) que en la lesion tratada con peptido ACT (c). Ademas, existe una densidad considerablemente mas baja de celulas inflamatorias que tachonan el sustrato fibroso en el tejido tratado con peptido ACT. Esto se confirma en (e) y (f) donde las regiones de seccion histologica dentro de los rectangulos negros mostradas en (c) y (d) se muestran respectivamente a mas aumentos. Las celulas inflamatorias que tachonan el sustrato fibroso alineado incluyen mastocitos, neutrofilos y macrofagos. Estas celulas inflamatorias aparecen a una densidad muy superior en la lesion de control que en la lesion tratada con peptido ACT.

La figura 8 muestra que el peptido ACT promueve la cicatrizacion, reduce la formacion de cicatrices y promueve la regeneracion de la estructura de tejido compleja tras la lesion cutanea excisional en ratones adultos. Al final del periodo de 14 dfas en el experimento descrito en la figura 6, se tomaron biopsias cutaneas de la lesion excisional completa y se tineron histoqmmicamente con H&E las secciones histologicas de esas muestras cutaneas. Las figuras (a) y (b) muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones transversales de cerca del centro de la lesion de peptido ACT y control respectivamente. El borde de la herida (marcado mediante flechas pequenas), rodeado de piel de aspecto histologico normal, puede observarse en ambos casos. Se coloca un rectangulo negro sobre las imagenes en (a) y (b) cerca del centro de cada lesion. Las estructuras histologicas dentro de estos dos rectangulos se muestran a mas aumentos en (c) y (d) para los tejidos de peptido ACT y control respectivamente. Es evidente que el tejido dentro del locus de la lesion tratada con peptido ACT tiene considerablemente mas complejidad. En la superficie externa de la herida tratada con ACT, existe una capa continua de celulas epiteliales que indican que la reepitelizacion de la superficie lesionada es completa, mientras que el epitelio es todavfa relativamente delgado cerca del centro de la herida (c). La regeneracion de folroulos pilosos ya puede observarse diferenciandose de novo a partir de celulas madre en el nuevo epitelio que recubre la lesion cicatrizada (c, flechas pequenas). En comparacion, la reepitelizacion de la superficie de la lesion es incompleta y no hay ningun signo de regeneracion de folroulos pilosos en el epitelio de la lesion de control (d). Bajo el epitelio reformado de la piel lesionada tratada con peptido ACT, se observa una restauracion considerable de la complejidad estructural normal, con estructuras glandulares, tejidos fibroso y conjuntivo, tejidos vasculares, miocitos y adipocitos en conjunto (a, c). Como con los folroulos pilosos, esta complejidad tisular se regenero mediante la diferenciacion de celulas madre. Por el contrario, en la lesion de control el tejido de la herida esta dominado completamente por un tapon uniforme y grande de tejido cicatricial fibroso (b, d), sin otra complejidad de estructura de tejido evidenciado particularmente dentro de este tejido cicatricial.

La figura 9 muestra que los peptidos ACT reducen la inflamacion, mejoran la cicatrizacion y reducen la formacion de cicatrices tras la lesion cutanea excisional en ratones adultos. Los ratones adultos anestesiados teman 2 heridas cutaneas excisionales pequenas (5 mm de diametro) realizadas mediante unas tijeras quirurgicas finas sobre el cuello y (parte superior) de la espalda. Los lfmites de las lesiones se delimitaron mediante un corte de molde circular de 5 mm de ancho en una lamina de plastico. Entonces se aplicaron a las lesiones excisionales.50-60 |il de una disolucion de gel pluronico al 20% que contema o bien nada (control) o bien uno de los peptidos ACT (ACT 2-SEQ ID NO: 1, ACT 1-SEQ ID NO: 2, ACT 3-SEQ ID NO: 3, ACT 4-SEQ ID NO: 4, ACT 5-SEQ ID NO: 5) disuelto en concentraciones de 100 |iM. Posteriormente se aplico gel de control o que contema peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizaron aplicaciones adicionales de gel de control y que contema peptido ACT tras la segunda aplicacion. Puede observarse en el caso de peptidos ACT 1 (e-h), ACT 2 (i-1), ACT 3 (m-p) y ACT 5 (u-x) que las lesiones excisionales se cerraron mas rapidamente, estaban significativamente menos inflamadas en apariencia, cicatrizaron mas rapido y con menos cicatrices que la lesion de control que no recibio peptido ACT (a-d)

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a lo largo del transcurso de tiempo de 240 horas (10 d^as). El peptido ACT 4 (q-t) tambien mostro una mejora modesta en la cicatrizacion con respecto al control durante el transcurso de tiempo, aunque menor que otros peptidos. Observese que la misma herida sobre el mismo animal se muestra en puntos de tiempo diferentes durante el transcurso de tiempo de la cicatrizacion.

La figura 10 muestra que el peptido ACT reduce el numero y la densidad de astrocitos que forman cicatriz glial tras la lesion de penetracion cerebral en una rata adulta. (b) y (c) muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones del tejido cerebral (corteza) que rodea a implantes de membrana de fibra hueca (MFH) llenos con peptido ACT (100 |iM) mas gel de veldculo (b) o gel de veldculo de colageno solo como control (c). En el tejido de control (c), se observa una alta densidad de astrocitos positivos para GFAP inmunomarcados cerca del sitio de la lesion producida por la MFH. La densidad de estas celulas parece disminuir ligeramente de manera distal de la lesion. Por el contrario, se observa una densidad mucho mas baja de astrocitos positivos para GFAP adyacentes a la MFH llena de peptido ACT (b). De hecho, los niveles de celulas positivas GFAP no difieren de los observados en un tejido cerebral sin dano normal. Se muestran las regiones de tejido dentro de los rectangulos blancos en las figuras (b) y (c) a mas aumentos en (d) y (e) respectivamente. En la lesion cerebral tratada mediante peptido ACT (d), puede observarse que los astrocitos positivos para GFAP no solo son menos numerosos, sino que tambien son mas pequenos que los observados en la lesion de control (e).

La figura 11 muestra que el peptido ACT promueve el mantenimiento neuronal y la regeneracion neuronal tras la lesion de penetracion cerebral en una rata adulta. (a) y (b) muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones del tejido cerebral (corteza) que rodea a implantes de MFH (el lfmite de implante o lesion se muestra mediante flechas) llenos de gel de vehfculo de colageno de control o peptido ACT mas gel de veldculo 1 semana tras la lesion de penetracion cerebral. En el tejido de control (b), se observan una alta densidad de astrocitos positivos para GFAP inmunomarcados y una baja densidad de neuronas inmunoetiquetadas con NeuN cerca del sitio de la lesion producida por la MFH. La densidad de estas celulas parece disminuir y aumentar, respectivamente, distalmente de la MFH. Por el contrario, se observaron una densidad mucho mas baja de astrocitos positivos para GFAP y un numero superior de neuronas inmunoetiquetadas con NeuN proximales (asf como distales) a la MFH llena de peptido ACT (a). Las areas en (a) y (b) proximales a las MFH se muestran en vistas de alto aumento en (c) y (b), respectivamente. De nuevo, se observa en el tejido de control (d) un aumento notable en la densidad de astrocitos positivos para GFAP y una densidad reducida de neuronas positivas para NeuN en comparacion con el tejido tratado con peptido ACT (c). Se observa un patron complementario cerca de la MFH que contiene peptido ACT, predominando neuronas positivas para NeuN con respecto a astrocitos (c). De manera interesante, la vista de alto aumento mostrada en (c) revela una alta frecuencia de neuronas en el procedimiento de fision en relacion con el control (d).

Descripcion detallada de la invencion

El metodo y las composiciones divulgadas pueden entenderse mas facilmente por referencia a la descripcion detallada siguiente de realizaciones particulares y los ejemplos incluidos en la misma y a las figuras y su descripcion anterior y siguiente. En el presente documento se divulga un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos carboxilo terminal de una conexina alfa (tambien denominado en el presente documento polipeptido de conexina alfa terminal (ACT)), o una variante conservativa del mismo. En un aspecto, tras la lesion tisular, el polipeptido ACT divulgado reduce la inflamacion, promueve la cicatrizacion, reduce la formacion de cicatrices, aumenta la resistencia a la traccion y promueve la regeneracion de tejido complejo. En otro aspecto, el polipeptido divulgado aumenta el grado de agregados de canal de union comunicante formados a partir de conexinas.

Debe entenderse que las composiciones y metodos divulgados no se limitan a metodos de smtesis espedficos, tecnicas analtticas espedficas, o a reactivos particulares a menos que se especifique otra cosa y, como tales, pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir solo realizaciones particulares y no pretende ser limitativa.

Se divulgan materiales, composiciones y componentes que pueden usarse para, pueden usarse conjuntamente con, pueden usarse en la preparacion de, o son productos del metodo y las composiciones divulgadas. Estos y otros materiales se divulgan en el presente documento, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque pueda no divulgarse espedficamente la referencia espedfica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos, se contemplan cada una de ellas y se describen espedficamente en el presente documento. Por ejemplo, si se divulga un vector y se comenta y se comentan varios componentes de vector incluyendo los promotores, se contemplan espedficamente cada uno de ellos y cada combinacion y permutacion de promotores y otros componentes de vector y las modificaciones que son posibles a menos que se indique espedficamente lo contrario. Por tanto, si se divulgan una clase de moleculas A, B y C asf como una clase de moleculas D, E y F y se divulga un ejemplo de una molecula de combinacion, A-D, entonces aunque no se mencione cada una de ellas individualmente, cada una de ellas se contempla individual y colectivamente. Por tanto, en este ejemplo, se contemplan cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F espedficamente y deben considerarse divulgadas a partir de la divulgacion de A, B y C; D, E y F; y la combinacion de los ejemplos A-D. Del mismo modo, tambien se contempla y se divulga espedficamente cualquier subconjunto o combinacion de los

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mismos. Por tanto, por ejemplo, los subgrupos de A-E, B-F y C-E se contemplan y deben considerarse divulgados espedficamente a partir de la divulgacion de A, B y C; D, E y F; y la combinacion de los ejemplos A-D. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta solicitud incluyendo, pero sin limitarse a, las etapas en los metodos de produccion y uso de las composiciones divulgadas. Por tanto, se entiende que si existe una variedad de etapas adicionales que puedan realizarse, cada una de esas etapas adicionales puede realizarse con cualquier realizacion espedfica o combinacion de realizaciones de los metodos divulgados, y que cada combinacion de este tipo se contempla y debe considerarse divulgada espedficamente.

En el presente documento, se divulgan una variedad de secuencias y estas y otras pueden encontrarse en Genbank en
www.pubmed.gov. Los expertos en la tecnica entienden como resolver diferencias y discrepancias de secuencias y como ajustar las composiciones y los metodos en relacion con una secuencia particular con respecto a otras secuencias relacionadas. Pueden disenarse cebadores y/o las sondas para cualquier secuencia dada la informacion divulgada en el presente documento y conocida en la tecnica.

El polipeptido divulgado en el presente documento puede ser cualquier peptido que comprenda los aminoacidos mas carboxilo terminales de una conexina alfa, en el que el polipeptido no comprende la protema conexina alfa de longitud completa. Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado no comprende el dominio N-terminal citoplasmatico de la conexina alfa. En otro aspecto, el polipeptido divulgado no comprende los dos dominios extracelulares de la conexina alfa. En otro aspecto, el polipeptido divulgado no comprende los cuatro dominios de transmembrana de la conexina alfa. En otro aspecto, el polipeptido divulgado no comprende el dominio de bucle citoplasmatico de la conexina alfa. En otro aspecto, el polipeptido divulgado no comprende la parte de la secuencia del dominio carboxilo terminal citoplasmatico de la conexina alfa proximal al cuarto dominio de transmembrana. Hay un residuo de prolina o glicina conservado en las conexina alfas situado de manera constante algunos de 17 a 30 aminoacidos desde el aminoacido de carboxilo terminal (tabla 2). Por ejemplo, para Cx43 humana, un residuo de prolina en el aminoacido 363 se situa 19 aminoacidos por detras de la isoleucina mas carboxilo terminal. En otro ejemplo, para Cx43 de pollo, un residuo de prolina en el aminoacido 362 se situa 18 aminoacidos por detras de la isoleucina mas carboxilo terminal. En otro ejemplo, para Cx45 humana un residuo de glicina en el aminoacido 377 se situa 19 aminoacidos por detras de la isoleucina mas carboxilo terminal. En otro ejemplo, para Cx33 de rata, un residuo de prolina en el aminoacido 258 se situa 28 aminoacidos por detras de la metionina mas carboxilo terminal. Por tanto, en otro aspecto, el polipeptido divulgado no comprende aminoacidos proximales a dicho residuo de prolina o glicina conservado de la conexina alfa. Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender los 4 a 30 aminoacidos mas c-terminales de la conexina alfa, incluyendo los 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 aminoacidos mas c-terminales de la conexina alfa. El polipeptido segun la invencion consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular. SEQ ID NO: 2 corresponde a los 9 aminoacidos mas c-terminales de Cx43 humana.

Los aminoacidos mas carboxilo terminales de una conexina alfa en los peptidos divulgados pueden estar flanqueados por aminoacidos de conexina distinta de alfa o conexina distinta de peptido ACT. Se proporcionan ejemplos de los aminoacidos de conexina no alfa y conexina no ACT de flanqueo en el presente documento. Un ejemplo de aminoacidos de conexina no ACT son los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx43 humana (SeQ ID NO: 72). Otro ejemplo senan los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx43 de pollo (SEQ ID NO: 73). Otro ejemplo senan los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx45 humana (SEQ ID NO: 74). Otro ejemplo senan los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx45 de pollo (SEQ ID NO: 75). Otro ejemplo sena los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx37 humana (SEQ ID NO: 76). Otro ejemplo senan los 20 a 120 aminoacidos carboxilo terminales de Cx33 de rata (SEQ ID NO: 77).

Un ejemplo de una conexina no alfa es la secuencia de 239 aminoacidos de protema fluorescente verde potenciada (ACT1 se muestra fusionada funcionalmente a GFP en la figura 4; SEQ ID NO: 78). En otro aspecto, dado que ACT1 se muestra que es funcional cuando se fusiona al extremo carboxilo terminal de la secuencia de 239 aminoacidos de GFP (por ejemplo, figura 4), se espera que los peptidos ACT conserven la funcion cuando estan flanqueados por polipeptidos distintos de conexina de hasta al menos 239 aminoacidos. De hecho, siempre que la secuencia de ACT se mantenga como el extremo carboxilo terminal libre de un polipeptido dado, y el peptido ACT pueda acceder a sus dianas. Por tanto, los polipeptidos que exceden de 239 aminoacidos ademas del peptido ACT pueden funcionar para reducir la inflamacion, promover la cicatrizacion, aumentar la resistencia a la traccion, reducir la formacion de cicatrices y promover la regeneracion tisular tras la lesion.

Las conexinas son las protemas de subunidad del canal de union comunicante que son responsables de la comunicacion intercelular (Goodenough y Paul, 2003). Basandose en los patrones de conservacion de la secuencia de nucleotidos, los genes que codifican para protemas conexina se dividen en dos familias denominadas genes de conexina alfa y beta. Las secuencias de aminoacidos mas carboxilo terminales de conexinas alfa se caracterizan por caractensticas distintivas y conservadas multiples (vease la tabla 2). Esta conservacion de la organizacion concuerda con la capacidad de los peptidos ACT de formar estructuras tridimensionales distintivas, interaccionar con multiples protemas asociadas, mediar en interacciones con lfpidos y membranas, interaccionar con acidos nucleicos incluyendo ADN, canales de membrana de transito y/o bloqueo y proporcionar motivos de consenso para escision proteolttica, reticulacion de protemas, ribosilacion de ADP, glicosilacion y fosforilacion. Por tanto, el polipeptido

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divulgado interacciona con un dominio de una protema que normalmente media en la union de dicha protema al extremo carboxilo terminal de una conexina alfa. Por ejemplo, la protema sobreexpresada de nefroblastoma (NOV) interacciona con un dominio c-terminal de Cx43 (Fu et al., J Biol Chem. 2004 279(35):36943-50). Se considera que estas y otras protemas interaccionan con el extremo carboxilo terminal de conexinas alfa e interaccionan adicionalmente con otras protemas formando un complejo macromolecular. Por tanto, el polipeptido divulgado puede inhibir el funcionamiento de una maquina molecular, tal como, por ejemplo, la implicada en la regulacion de la agregacion de los canales de union comunicante de Cx43.

Tal como se usa en el presente documento, “inhibir,” “que inhibe” e “inhibicion” significan disminuir una actividad, respuesta, estado, enfermedad u otro parametro biologico. Esto puede incluir, pero no se limita a, la perdida completa de actividad, respuesta, estado o enfermedad. Esto tambien puede incluir, por ejemplo, una reduccion del 10% en la actividad, respuesta, estado o enfermedad en comparacion con el nivel nativo o de control. Por tanto, la reduccion puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, o cualquier cantidad de reduccion intermedia en comparacion con niveles nativos o de control.

La secuencia de ACT del polipeptido divulgado puede ser de cualquier conexina alfa. Por tanto, el componente de conexina alfa del polipeptido divulgado puede ser de una conexina alfa humana, murina, bovina, de monotrema, marsupial, de primate, de roedor, cetacea, de mairnfero, aviar, de reptil, de anfibio, pisdcola, de cordado, protocordado u otra.

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender un ACT de una conexina seleccionada del grupo que consiste en conexina 47 de raton, conexina 47 humana, conexina 46.6 humana, conexina 46.6 de vaca, conexina 30.2 de raton, conexina 30.2 de rata, conexina 31.9 humana, conexina 31.9 de perro, conexina 44 de oveja, conexina 44 de vaca, conexina 33 de rata, conexina 33 de raton, conexina 36 humana, conexina 36 de raton, conexina 36 de rata, conexina 36 de perro, conexina 36 de pollo, conexina 36 de pez cebra, conexina 35 morona, conexina 35 morona, conexina 35 de Cynops, conexina 36 de Tetraodon, conexina 37 humana, conexina 37 de chimpance, conexina 37 de perro, Conexina 37 de Cricetulus, conexina 37 de raton, conexina 37 de Mesocricetus, conexina 37 de rata, conexina 39 de raton, conexina 39 de rata, conexina 40.1 humana, conexina 38 de Xenopus, conexina 39.9 de pez cebra, conexina 40 humana, conexina 40 de chimpance, conexina 40 de perro, conexina 40 de vaca, conexina 40 de raton, conexina 40 de rata, conexina 40 de Cricetulus, conexina 40 de pollo, conexina 43 humana, conexina 43 de Cercopithecus, conexina 43 de Oryctolagus, conexina 43 de Spermophilus, conexina 43 de Cricetulus, conexina 43 de Phodopus, conexina 43 de rata, conexina 43 de Sus, conexina 43 de Mesocricetus, conexina 43 de raton, conexina 43 de Cavia, conexina 43 de vaca, conexina 43 de Erinaceus, conexina 43 de pollo, conexina 43 de Xenopus, conexina 43 de Oryctolagus, conexina 43 de Cyprinus, conexina 43 de pez cebra, conexina 43 de Danio aequipinnatus, conexina 43.4 de pez cebra, conexina 44.2 de pez cebra, conexina 44.1 de pez cebra, conexina 45 humana, conexina 45 de chimpance, conexina 45 de perro, conexina 45 de raton, conexina 45 de vaca, conexina 45 de rata, conexina 45 de pollo, conexina 45 de Tetraodon, conexina 45 de pollo, conexina 46 humana, conexina 46 de chimpance, conexina 46 raton, conexina 46 de perro, conexina 46 de rata, conexina 46 de Mesocricetus, conexina 46 de Cricetulus, conexina 56 de pollo, conexina 39.9 de pez cebra, conexina 49 de vaca, conexina 50 humana, conexina 50 de chimpance, conexina 50 de rata, conexina 50 de raton, conexina 50 de perro, conexina 49 de oveja, conexina 50 de Mesocricetus, conexina 50 de Cricetulus, conexina 50 de pollo, conexina 59 humana, u otra conexina alfa. Las secuencias de aminoacidos para las conexinas alfa se conocen en la tecnica e incluyen las identificadas en la tabla 1 mediante el numero de registro.

Tabla 1: Conexinas alfa

Protema: N.° de registro Protema N.° de registro

Conexina 47 de raton: NP 536702 Conexina 43 de Phodopus AAR33085

Conexina 47 humana: AAH89439 Conexina 43 de rata AAH81842

Conexina 46.6 humana: AAB94511 Conexina 43 de Sus AAR33087

Conexina 46.6 de vaca: XP 582393 Conexina 43 de Mesocricetus AAO61857

Conexina 30.2 de raton: NP 848711 Conexina 43 de raton AAH55375

Conexina 30.2 de rata: XP 343966 Conexina 43 de Cavia AAU06305

Conexina 31.9 humana: AAM18801 Conexina 43 de vaca NP_776493

Conexina 31.9 de perro: XP 548134 Conexina 43 Erinaceus AAR33083

Conexina 44 de oveja: AAD56220 Conexina 43 de pollo AAA53027

Conexina 44 de vaca: I46053 Conexina 43 de Xenopus NP_988856

Conexina 33 de rata: P28233 Conexina 43 de Oryctolagus AAS89649

Conexina 33 de raton: AAR28037 Conexina 43 de Cyprinus AAG17938

Conexina 36 humana: Q9UKL4 Conexina 43 de pez cebra CAH69066

Conexina 36 de raton: NP_034420 Conexina 43 de Danio aequipinnatus AAC19098

Conexina 36 de rata: NP 062154 Conexina 43.4 de pez cebra NP 571144

Conexina 36 de perro: XP_544602 Conexina 44.2 de pez cebra AAH45279

Conexina 36 de pollo: NP 989913 Conexina 44.1 de pez cebra NP 5718,84

Conexina 36 de pez cebra: NP 919401 Conexina 45 humana I38430

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Conexina 35 morona: AAC31884 Conexina 45 de chimpance XP 511557

Conexina 35 morona: AAC31885 Conexina 45 de perro XP 548059

Conexina 35 de Cynops: BAC22077 Conexina 45 de raton AAH71230

Conexina 36 de Tetraodon: CAG06428 Conexina 45 de vaca XP 588395

Conexina 37 humana: I55593 Conexina 45 de rata AAN17802

Conexina 37: de XP 524658 Conexina 45 de pollo NP 990834

chimpance Conexina 37 de perro: XP 539602 Conexina 45 de Tetraodon CAF93782

Conexina 37 de Cricetulus: AAR98615 Conexina 45.6 de pollo I50219

Conexina 37 de raton: AAH56613 Conexina 46 humana NP 068773

Conexina 37: de AAS83433 Conexina 46 de chimpance XP 522616

Mesocricetus Conexina 37 de rata: AAH86576 Conexina 46 de raton NP 058671

Conexina 39 de raton: NP 694726 Conexina 46 de perro XP 543178

Conexina 39 de rata: AAN17801 Conexina 46 de rata NP 077352

Conexina 40.1 humana: NP 699199 Conexina 46 de Mesocricetus AAS83437

Conexina 38 de Xenopus: AAH73347 Conexina 46 de Cricetulus AAS77618

Conexina 39.9 de pez: NP 997991 Conexina 56 de pollo A45338

cebra Conexina 40 humana: NP 859054 Conexina 39.9 de pez cebra NP 997991

Conexina 40: de XP 513754 Conexina 49 de vaca XP 602360

chimpance Conexina 40 de perro: XP 540273 Conexina 50 humana P48165

Conexina 40 de vaca: XP 5587676 Conexina 50 chimpance XP 524857

Conexina 40 de raton: AAH53054 Conexina 50 de rata NP 703195

Conexina 40 de rata: AAH70935 Conexina 50 de raton AAG59880

Conexina 40 de Cricetulus: AAP37454 Conexina 50 de perro XP 540274

Conexina 40 de pollo: NP 990835 Conexina 49 de oveja AAF01367

Conexina 43 humana: P17302 Conexina 50 de Mesocricetus AAS83438

Conexina 43: de AAR33082 Conexina 50 de Cricetulus AAR98618

Cercopithecus Conexina 43: de AAR33084 Conexina 50 de pollo BAA05381

Oryctolagus Conexina 43: de AAR33086 Conexina 59 humana AAG09406

Spermophilus Conexina 43 de Cricetulus: AAO61858

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 90 o ID NO: 91 o variantes conservativas o fragmented de las mismas.

La secuencia de 20-30 aminoacidos mas carboxilo terminal de conexinas alfa se caracteriza por una organizacion distintiva y conservada. Esta organizacion distintiva y conservada incluina un motivo de union de PDZ de tipo II (O-x- O; en la que x = cualquier aminoacido y O = un aminoacido hidrofobo; por ejemplo, tabla 2, en negrita) y proximal a este motivo, residuos de bisagra de prolina (P) y/o glicina (G); una alta frecuencia de residuos de fosfo-serina (S) y/o fosfo-treonina (T); y una alta frecuencia de aminoacidos arginina (R), lisina (K) cargadas positivamente y de acido aspartico (D) o acido glutamico (E) cargados negativamente. Para muchas conexinas alfa, los residuos de P y G se aparecen en motivos agrupados (por ejemplo, tabla 2, en cursiva) proximales al motivo de union de PDZ de tipo II carboxilo terminal. Los fosfoaminoacidos de S y T de la mayona de las conexinas alfa normalmente tambien se organizan en motivos agrupados, de tipo repeticion (por ejemplo, tabla 2, subrayado). Esta organizacion es particularmente el caso de Cx43, en la que el 90% de los 20 aminoacidos mas carboxilo terminales estan compuestos por los ultimos siete aminoacidos. En un ejemplo adicional de la alta conservacion de la secuencia, la organizacion del peptido ACT de Cx43 esta altamente conservada desde humanos hasta peces (por ejemplo, comparense las secuencias de ACT de Cx43 para humanos y pez cebra en la tabla 2). En otro ejemplo, la organizacion del peptido ACT de Cx45 esta altamente conservada desde humanos hasta aves (por ejemplo, comparense las secuencias de ACT de Cx45 para humanos y pollo en la tabla 2).). En otro ejemplo, la organizacion del peptido ACT de Cx36 esta altamente conservada desde primates hasta peces (por ejemplo, comparense las secuencias de Cx36 de ACT para chimpance y pez cebra en la tabla 2).

Tabla 2. Secuencias de aminoacidos de conexina alfa carboxilo terminal (ACT)

Gen___________________________Secuencia_______________________SEQ ID NO____________

Cx43 alfa humana P SSRA SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO: 1)

Cx43 alfa de pollo P S RA SSRA SSR PRP D DLEI (SEQ ID NO: 29)

Cx43 alfa de pollo________________P CSRA SSRM SSRA R P D DLDV (SEQ ID NO: 90)________

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Cx45 alfa humana Cx45 alfa de pollo Cx46 alfa humana Cx46.6 alfa humana Cx36 alfa chimpance Cx36 alfa de pollo Cx36 alfa de pez cebra Cx47 alfa humana Cx40 alfa humana

Cx50 alfa humana

Cx59 alfa humana Cx33 alfa de rata

Cx44 alfa de oveja Cx26 beta humana

G SNKS TA SSKS GDG KN SVWI G SNKSS A SSKS GDG KN SVWI G RA SKAS RASS GRARP E DLAI G SASS RD G K TVWI P RVSV PNFG R TQ SSD SAYV P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV P RAGSEK G SASS R DG KT TVWI G HRL PHG YHSDKRRL SKASS KARSD DLSV

P ELTTDDAR P LSRL SKASS RARSD DLTV

P NHVV SLTN NLI GRRVP T DLQI P S CV SSS A VLTTIC SS DQVV PVG L SS FYM

G R SSKA SKSS GG RARAA DLAI LC ILLIR YCSGK SKKPV

(SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 37)

(SEQ ID NO: 38)

(SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 40)

(SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42)

Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado comprende uno, dos, tres o todos los motivos de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en 1) un motivo de union de PDZ de tipo II, 2) residuos de bisagra de prolina (P) y/o glicina (G); 3) residuos de agrupaciones de fosfoserina (S) y/o fosfotreonina (T); y 4) una alta frecuencia de aminoacidos arginina (R) y lisina (K) cargadas positivamente y acido aspartico (D) y/o acido glutamico (E) cargados negativamente). En otro aspecto, el polipeptido divulgado comprende un motivo de union de PDZ de tipo II al extremo carboxilo terminal, residuos de bisagra de prolina (P) y/o glicina (G) proximales al motivo de union de PDZ, y residuos cargados positivamente (K, R, D, E) proximales a los residuos de bisagra.

Los dominios de PDZ se identificaron originalmente como elementos de secuencia conservados dentro de la protema de densidad postsinaptica PSD95/SAP90, el supresor tumoral dIg-A de Drosophila y la protema ZO-1 de union estrecha. Aunque se denominaron originalmente motivos GLGF o DHR, ahora se conocen mediante un acronimo que representa estas tres primeras protemas que contienen PDZ (PSD95/DLG/ZO-1). Estas secuencias de 80-90 aminoacidos se han identificado ahora en mas de 75 protemas y se expresan caractensticamente en multiples copias dentro de una unica protema. Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado puede inhibir la union de una conexina alfa a una protema que comprende un dominio de PDZ. El dominio de PDZ es un tipo espedfico de modulo de interaccion con protema que tiene un 'bolsillo' de interaccion bien definido estructuralmente que puede llenarse mediante un motivo de union de PDZ, denominado en el presente documento “motivo de PDZ”. Los motivos de PDZ son secuencias de consenso que normalmente se localizan, pero no siempre, en el extremo carboxilo terminal intracelular extremo. Se han clasificado cuatro tipos de motivos de PDZ: tipo I (S/T-x-O), tipo II (O-x-O), tipo III (Y-x- O) y tipo IV (D-x-V), donde x es cualquier aminoacido, O es un residuo hidrofobo (V, I, L, A, G,W, C, M, F) y Y es un residuo basico, hidrofilo (H, R, K). (Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77). Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado comprende un motivo de union de PDZ de tipo II.

Se observa que la secuencia de 18 aminoacidos mas carboxilo terminal de Cx37 alfa representa una variacion excepcional en el tema de peptido ACT. La secuencia de tipo ACT de Cx37 es GQKPPSRPSSSASKKQ*YV (SEQ ID NO: 43). Por tanto, los 4 aminoacidos carboxilo terminales de Cx37 conforman solo en parte un dominio de union de PDZ de tipo II. En lugar de un dominio de union de PDZ de tipo II clasico, Cx37 tiene una Q* neutra en la posicion 2 donde se esperana un aminoacido hidrofobo. Como tal, Cx37 comprende lo que podna denominarse una secuencia de tipo dominio de union de PDZ de tipo II. No obstante, Cx37 mantiene estrictamente todos los otros aspectos de organizacion de peptido ACT incluyendo residuos de serina agrupados, residuos de R y K frecuentes y una secuencia rica en P proximal a la secuencia de tipo dominio de union de PDZ. Dado este nivel global de conservacion de la organizacion de tipo ACT en comun con las otras >70 conexinas alfa enumeradas anteriormente, se entiende que el extremo carboxilo terminal de tipo ACT de Cx37 funciona en la capacidad proporcionada.

Por comparacion, en la tabla 2 se muestra la conexina beta Cx26. Cx26 no tiene motivo de union de PDZ de tipo II carboxilo terminal; menos del 30% de los aminoacidos mas carboxilo terminales comprenden residuos de S, T, R, D o E; no existen pruebas de motivos proximales a un motivo de union de PDZ de tipo II o motivo de tipo union de PDZ que contengan agrupaciones de residuos de bisagra de P y G; y no hay pruebas de motivos agrupados, de tipo repeticion de fosfoaminoacidos de serina y treonina. Cx26 tiene tres residuos de lisina (K), agrupados uno tras otro cerca del extremo carboxilo terminal de la secuencia. Sin embargo, no se encontraron conexina alfa estudiadas en las >70 conexinas alfa enumeradas anteriormente que presentaran esta caractenstica de tres dominios de residuos de K repetidos en el extremo carboxilo terminal (Cx26 es una conexina beta, por tanto por definicion no tiene un dominio ACT).

Tal como se divulga en el presente documento, las caractensticas funcionales unicas de este tramo relativamente corto de aminoacidos abarca papeles inesperados en la reduccion de la inflamacion, la promocion de la cicatrizacion, la reduccion de la formacion de cicatrices, el aumento de la resistencia a la traccion y la promocion de la regeneracion de la funcion y la estructura de tejido complejo tras lesion en tejidos tan diversos como piel y el

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cerebro. Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado comprende un motivo de union de PDZ de tipo II (O-x-O; en el que x = cualquier aminoacido y O = un aminoacido hidrofobo). En otro aspecto, en mas del 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% de los aminoacidos del polipeptido ACT divulgado esta comprendido uno o mas de los residuos de aminoacido prolina (P), glicina (G), fosfoserina (S), fosfotreonina (T), arginina (R), lisina (K), acido aspartico (D) o acido glutamico (E).

Los aminoacidos prolina (P), glicina (G), arginina (R), lisina (K), acido aspartico (D) y acido glutamico (E) son determinates necesarios de la estructura y funcion proteica. Los residuos de prolina y glicina proporcionan giros estrechos en la estructura tridimensional de las protemas, permitiendo la generacion de conformaciones plegadas del polipeptido requerido para su funcion. Las secuencias de aminoacidos cargados se localizan a menudo en la superficie de las protemas plegadas y son necesarias para interacciones qmmicas mediadas por el polipeptido incluyendo interacciones protema-protema, interacciones protema-lfpido, interacciones enzima-sustrato e interacciones protema-acido nucleico. Por tanto, en otro aspecto las regiones ricas en prolina (P) y glicina (G) lisina (K), acido aspartico (D) y acido glutamico (E) proximales al motivo de union de PDZ de tipo II proporcionan propiedades necesarias para las acciones proporcionadas de peptidos ACT. En otro aspecto, el polipeptido divulgado comprende regiones ricas en prolina (P) y glicina (G) lisina (K), acido aspartico (D) y/o acido glutamico (E) proximales al motivo de union de PDZ de tipo II.

La fosforilacion es la modificacion postraduccional mas comun de protemas y es crucial para modular o modificar la estructura y funcion proteica. Los aspectos de estructura y funcion proteica modificados por fosforilacion incluyen conformacion de protemas, interacciones protema-protema, interacciones protema-lfpido, interacciones protema- acido nucleico, activacion de canales, trafico de protemas y recambio de protemas. Por tanto, en un aspecto son necesarias las secuencias ricas en fosfoserina (S) y/o fosfotreonina (T) para modificar la funcion de los peptidos ACT, aumentando o disminuyendo la eficacia de los polipeptidos en sus acciones proporcionadas. En otro aspecto, el polipeptido divulgado comprende secuencias o motivos ricos en serina (S) y/o fosfotreonina (T).

En otro ejemplo, respetando la definicion de un peptido ACT, es altamente prometedor, en vista del alto grado de potencial de regeneracion de tejido/organo en animales inferiores tales como peces, que una metionina aparezca cerca del extremo amino terminal de la secuencia de ACT de Cx43 de pez cebra (tabla 2). Ademas de codificar para metionina, el triplete de pares de bases de metionina es un sitio de inicio de la traduccion alternativo. Si se inicio la traduccion a partir de esta metionina, se producina la secuencia SSRARPDDLDV (SEQ ID NO: 90). Este producto de traduccion mantiene todas las caractensticas conservadas y distintivas de un peptido ACT canonico. Espedficamente este peptido comprende un dominio de union de PDZ de tipo II carboxilo terminal y tiene un dominio enriquecido en residuos de P, R y D proximales al dominio de union de PDZ. Ademas, la secuencia comprende un motivo de S agrupado, con potencial para modular la funcion del peptido ACT en su amino terminal. Esto aumenta la interesante posibilidad de que los animales con alto potencial de regeneracion de tejido/organo tales como los peces puedan traducir secuencias de peptidos ACT directamente.

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender la secuencia c-terminal de Cx43 humana. Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El polipeptido puede comprender 9 aminoacidos del extremo carboxilo terminal de Cx40 humana. Por tanto, el polipeptido puede comprender la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5.

El polipeptido segun la invencion consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular.

Cuando en el presente documento se hace referencia a protemas espedficas, se contemplan variantes, derivados y fragmentos. Los derivados y variantes de protemas los conocen bien los expertos en la tecnica y pueden implicar modificaciones en la secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, las modificaciones en la secuencia de aminoacidos normalmente se encuentran en una o mas de tres clases: variantes de sustitucion, de insercion o de delecion. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales asf como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoacidos individuales o multiples. Habitualmente las inserciones seran inserciones mas pequenas que las fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, en el orden de uno a cuatro residuos. Las deleciones se caracterizan por la eliminacion de uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia proteica. Habitualmente estas variantes se preparan mediante mutagenesis espedfica de sitio de nucleotidos en el ADN que codifica para la protema, produciendo de ese modo ADN que codifica para la variante, y expresando despues el ADN en cultivos de celulas recombinantes. Se conocen bien tecnicas para realizar las mutaciones de sustitucion en los sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida e incluyen, por ejemplo, mutagenesis de cebador M13 y mutagenesis por PCR. Las sustituciones de aminoacidos normalmente son de residuos individuales, pero pueden producirse en varias ubicaciones diferentes a la vez; las inserciones habitualmente seran del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoacido. Las deleciones o inserciones preferiblemente se realizan en pares adyacentes, es decir, una delecion de 2 residuos o una insercion de 2 residuos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas pueden combinarse para llegar a un constructo final. Las mutaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearan regiones complementarias que pudieran producir estructura de ARNm secundaria a menos que se desee un cambio de este tipo en la estructura secundaria del ARNm. Las variantes de sustitucion son aquellas en las que al menos un residuo

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se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Tales sustituciones se realizan generalmente segun la tabla 3 siguiente y se denominan sustituciones conservativas.

Tabla 3: Sustituciones de aminoacidos

Residuo original: Sustituciones a modo de ejemplo

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Gln

Ile: Leu; Val

Leu: Ile; Val

Lys: Arg; Gln

Met: Leu; Ile

Phe: Met; Leu; Tyr

Pro: Gly

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp; Phe

Val: Ile; Leu

Por ejemplo, los expertos en la tecnica conocen el reemplazo de un residuo de aminoacido por otro que es similar biologica y/o qmmicamente a una sustitucion conservativa. Por ejemplo, una sustitucion conservativa sena reemplazar un residuo hidrofobo por otro o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen las combinaciones mostradas en la tabla 3. Las variaciones sustituidas conservativamente de cada secuencia divulgada explfcitamente se incluyen dentro de los polipeptidos divulgados en el presente documento.

Normalmente, las sustituciones conservativas tienen de poco a ningun impacto sobre la actividad biologica de un polipeptido resultante. En un ejemplo particular, una sustitucion conservativa es una sustitucion de aminoacidos en un peptido que no afecta sustancialmente a la funcion biologica del peptido. Un peptido puede incluir una o mas sustituciones de aminoacidos, por ejemplo 2-10 sustituciones conservativas, 2-5 sustituciones conservativas, 4-9 sustituciones conservativas, tales como 2, 5 o 10 sustituciones conservativas.

Puede producirse un polipeptido que contiene una o mas sustituciones conservativas manipulando la secuencia de nucleotidos que codifica tal polipeptido usando, por ejemplo, procedimientos convencionales tales como mutagenesis dirigida al sitio o PcR. Alternativamente, puede producirse un polipeptido que contiene una o mas sustituciones conservativas usando metodos de smtesis de peptidos convencionales. Puede usarse un barrido de alanina para identificar que residuos de aminoacidos pueden tolerar en una protema una sustitucion de aminoacido. En un ejemplo, la actividad biologica de la protema no disminuye mas del 25%, por ejemplo no mas del 20%, por ejemplo no mas del 10%, cuando se sustituye uno o mas aminoacidos nativos por una alanina u otro aminoacido conservativo (tal como los enumerados a continuacion).

Puede encontrarse informacion adicional sobre sustituciones conservativas en, entre otras ubicaciones, Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:2407, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988) y en libros de texto convencionales de genetica y biologfa molecular.

Puede emplearse mutagenesis de sustitucion o delecion para insertar sitios para N-glicosilacion (Asn-X-Thr/Ser) u O-glicosilacion (Ser o Thr). Tambien pueden ser deseables deleciones de cistema u otros residuos labiles. Las deleciones o sustituciones de sitios de proteolisis potencial, por ejemplo Arg, se consigue por ejemplo delecionando uno de los residuos basicos o sustituyendo uno por residuos de glutaminilo o histidilo.

Determinadas derivatizaciones postraduccionales son el resultado de la accion de celulas huesped recombinantes sobre el polipeptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan a menudo postraduccionalmente para dar los correspondientes residuos de glutamilo y asparilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente acidas. Otras modificaciones postranslacionales incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilacion de los grupos o-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco paginas 79-86 [1983]), acetilacion de la amina N-terminal y, en algunos casos, amidacion del carboxilo C-terminal.

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Se entiende que hay numerosos analogos de aminoacidos y peptidos que pueden incorporarse a las composiciones divulgadas. Por ejemplo, hay numerosos aminoacidos D o aminoacidos que tienen un sustituyente funcional diferente que los aminoacidos mostrados en la tabla 3. Se divulgan los estereoisomeros opuestos de los peptidos que se producen de manera natural, asf como los estereoisomeros de analogos de peptidos. Estos aminoacidos pueden incorporarse facilmente en cadenas de polipeptidos cargando moleculas de ARNt con el aminoacido de eleccion y modificando por ingeniena genetica constructos que utilizan, por ejemplo, codones ambar, para insertar el aminoacido analogo en una cadena de peptido de una manera espedfica de sitio (Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba y Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994).

Pueden producirse moleculas que se asemejan a polipeptidos, pero que no se conectan por medio de una union peptfdica natural. Por ejemplo, las uniones para aminoacidos o analogos de aminoacidos pueden incluir CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH=CH-- (cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y --CHH2SO- (estas y otras pueden encontrarse en Spatola, A. F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pag. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), vol. 1, emision 3, Peptide Backbone Modifications (revision general); Morley, Trends Pharm Sci (1980) paginas 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2-S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis y trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. solicitud de patente europea, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); y Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S-). Se entiende que los analogos de peptidos pueden tener mas de un atomo entre los atomos unidos, tales como b-alanina, acido g- aminobutrnco y similares.

A menudo los analogos de aminoacidos y analogos de peptidos tienen propiedades potenciadas o deseables, tales como, produccion mas economica, mayor estabilidad qmmica, propiedades farmacologicas potenciadas (semivida, absorcion, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biologicas), antigenicidad reducida, mayor capacidad de cruzar barreras biologicas (por ejemplo, intestino, vasos sangumeos, barrera hematoencefalica) y otras.

Pueden usarse aminoacidos D para generar peptidos mas estables, debido a que los aminoacidos D no son reconocidos por peptidasas y demas. La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia consenso por un aminoacido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar peptidos mas estables. Pueden usarse residuos de cistema para ciclar o unir dos o mas peptidos entre sf. Esto puede ser beneficioso para constrenir los peptidos en conformaciones particulares. (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992).

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender una variante conservativa del extremo c-terminal de una conexina alfa (ACT). Tal como se muestra en la tabla 4, se proporciona un ejemplo de una unica sustitucion conservativa dentro de la secuencia SEQ ID NO: 2 en la secuencia SEQ ID NO: 3. Se proporciona un ejemplo de tres sustituciones conservativas dentro de la secuencia SEQ ID NO: 2 en la secuencia SEQ ID NO: 4. Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 de aminoacidos.

Tabla 4. Variantes de polipeptido ACT

__________Secuencia__________

RPRPDDLEI

RPRPDDLEV

RPRPDDVPV

SSRASSRASSRPRPDDLEV

RPKPDDLEI

SSRASSRASSRPKPDDLEI

RPKPDDLDI

SSRASSRASSRPRPDDLDI

SSRASTRASSRPRPDDLEI

RPRPEDLEI

SSRASSRASSRPRPEDLEI

GDGKNSVWV

SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV

GQKPPSRPSSSASKKLYV

SEQ ID NO SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54

Se entiende que una manera de definir cualquier variante, modificacion o derivado de los genes y protemas

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divulgados en el presente documento es a traves de la definicion de las variantes, la modificacion y los derivados en cuanto a la identidad de secuencia (tambien denominada en el presente documento homologfa) con secuencias conocidas espedficas. Se divulgan espedficamente variantes de los acidos nucleicos y polipeptidos en el presente documento divulgados que tienen al menos el 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia establecida o conocida. Los expertos en la tecnica entienden facilmente como determinar la identidad de secuencia de dos protemas o acidos nucleicos. Por ejemplo, la identidad de secuencia puede calcularse tras alinear las dos secuencias de modo que la identidad de secuencia este en su nivel mas alto.

Otra manera de calcular la identidad de secuencia puede realizarse mediante algoritmos publicados. Las alineaciones optimas de secuencias para su comparacion pueden realizarse mediante el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Grupo, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion.

Pueden obtenerse los mismos tipos de identidad de secuencia para acidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methdos Enzymol. 183:281-306, 1989.

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender una secuencia de aminoacidos con al menos el 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad de secuencia con el extremo c-terminal de una conexina alfa (ACT). Por tanto, en un aspecto, el polipeptido divulgado comprende una secuencia de aminoacidos con al menos el 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 91. Como un ejemplo, se divulga un polipeptido (SEQ ID NO: 4) que tiene el 66% de identidad de secuencia con el mismo tramo de 9 aminoacidos que se produce en el extremo carboxilo terminal de Cx43 humana (SEQ ID NO: 2).

El polipeptido divulgado en el presente documento puede anadirse directamente a una lesion de tejido en un sujeto. Sin embargo, se potencia la eficiencia de localizacion citoplasmatica del polipeptido divulgado mediante un transportador de internalizacion celular unido qdmicamente en cis o trans con el polipeptido. La eficiencia de transportadores de internalizacion celular se potencia ademas mediante luz o cotransduccion de celulas con peptido Tat-HA.

Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender una secuencia o transportador de internalizacion celular. La secuencia de internalizacion celular puede ser cualquier secuencia de internalizacion conocida o descubierta recientemente en la tecnica, o variantes conservativas de las mismas. Ejemplos no limitativos de secuencias y transportadores de internalizacion celular incluyen secuencias de Antennapedia, TAT, VIH-Tat, penetratina, Antp-3A (mutante de Antp), buforina II, transportano, MAP (peptido anfipatico modelo), K-FGF, Ku70, prion, pVEC, Pep-1, SynBl, Pep-7, HN-1, BGSC (bis-guanidina-espermidina-colesterol y BGTC (bis-guanidina-tren-colesterol) (vease la tabla 5).

Tabla 5: Transportadores de internalizacion celular

Nombre Secuencia SEQ ID NO

Antp: RQPKIWFPNRRKPWKK (SEQ ID NO : 7)

VIH-Tat: GRKKRRQRPPQ (SEQ ID NO 14)

Penetratina: RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO 15)

Antp-3a: RQIAIWFQNRRMKWAA (SEQ ID NO 16)

Tat: RKKRRQRRR (SEQ ID NO 17)

Buforina II: TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO 18)

Transportano: GWTLNSAGYLLGKINKAALAALAKKIL (SEQ ID NO 19)

Peptido anfipatico modelo (MAP): KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO : 20)

K-FGF: AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO 21)

Ku70: VPMLK-PMLKE (SEQ ID NO : 22)

Prion: MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (SEQ ID NO : 23)

pVEC: LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO : 24)

Pep-1: KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO : 25)

SynB1: RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO : 26)

Pep-7: SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO : 27)

HN-1: TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO : 28)

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Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender ademas la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 (Bucci, M. et al. 2000. Nat. Med. 6, 1362-1367), SEQ ID NO: 15 (Derossi, D., et al. 1994. Biol.Chem. 269, 10444-10450), SEQ ID NO: 16 (Fischer, P.M. et al. 2000. J. Pept. Res. 55, 163-172), SEQ ID NO: 17 (Frankel, A. D. & Pabo, C. O. 1988. Cell 55,1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179-1188), SEQ ID NO: 18 (Park, C. B., et al. 2000. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-8250), SEQ ID NO: 19 (Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77), SEQ ID NO: 20 (Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-139), SEQ ID NO: 21 (Lin, Y. Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270,14255-14258), SEQ ID NO: 22 (Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352-357), SEQ ID NO: 23 (Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90), SEQ ID NO: 24 (Elmquist, A., et al. 2001. Exp. Cell Res. 269, 237-244), SEQ ID NO: 25 (Morris, M. C., et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176), SEQ ID NO: 26 (Rousselle, C. et al. 2000. Mol. Pharmacol. 57,679-686), SEQ ID NO: 27 (Gao, C. et al. 2002. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065) o SEQ ID NO: 28 (Hong, F. D. & Clayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556). El polipeptido divulgado puede comprender ademas BGSC (bis-guanidina- espermidina-colesterol) o BGTC (bis-guanidina-tren-colesterol) (Vigneron, J.P. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93, 9682-9686).

Cualquier otra secuencia de internalizacion conocida ahora o identificada mas tarde puede combinarse con un peptido de la invencion.

El polipeptido divulgado puede comprender cualquier secuencia de ACT (por ejemplo, cualquiera de los peptidos ACT divulgados en el presente documento) en combination con cualquiera de las secuencias de internalizacion celular proporcionadas el presente documento. En la tabla 6 se proporcionan ejemplos de dichas combinaciones. Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender una secuencia de Antennapedia que comprende la secuencia de aminoacidos sEq ID NO: 7. Por tanto, el polipeptido divulgado puede comprender la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

Tabla 6: Polipeptidos ACT con secuencias de internalizacion celular (CIS)

CIS/ACT: Secuencia SEQ ID NO

Antp/ACT 2: RQPKIWFPNRRKPWKK PSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO: 8

Antp/ACT 1: RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 9

Antp/ACT 3: RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEV SEQ ID NO: 10

Antp/ACT 4: RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDVPV SEQ ID NO: 11

Antp/ACT 5: RQPKIWFPNRRKPWKK KARSDDLSV SEQ ID NO: 12

VIH-Tat/ACT 1: GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI SEQ ID NO: 56

Penetratina/ACT 1: RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 57

Antp-3A/ACT 1: RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI SEQ ID NO: 58

Tat/ACT 1: RKKRRQRRR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 59

Buforina II/ACT 1: TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 60

Transportano/ACT 1: GWTLNSAGILLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI SEQ ID NO: 61

MAP/ACT 1: KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI SEQ ID NO: 62

K-FGF/ACT 1: AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 63

Ku70/ACT 1: VPMLKPMLKE RPRPDDLEI SEQ ID NO: 64

Prion/ACT 1: M ANLGYWLL ALF VTMWTD V GLCKKRPKP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 65

pVEC/ACT 1: LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 66

Pep-1/ACT 1: KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI SEQ ID NO: 67

SynB1/ACT 1: RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 68

Pep-7/ ACT 1: SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI SEQ ID NO: 69

HN-1/ACT 1: TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI SEQ ID NO: 70

El polipeptido segun la invencion consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (peptido ACT1) y

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opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular.

Tambien se divulgan acidos nucleicos aislados que codifican para los polipeptidos divulgados en el presente documento. Los acidos nucleicos divulgados se componen, por ejemplo, de nucleotidos, analogos de nucleotidos, o sustitutos de nucleotidos. Ejemplos no limitativos de estas y otras moleculas se comentan en el presente documento. Se entiende que, por ejemplo, cuando se expresa un vector en una celula, el ARNm expresado se compondra normalmente de A, C, G y U.

Por “acido nucleico aislado” o “acido nucleico purificado” se entiende ADN que esta libre de los genes que, en el genoma que se produce de manera natural del organismo del que se deriva el ADN de la invencion, flanquean el gen. El termino por tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, tal como un plasmido o virus que se replica de manera autonoma; o se incorpora al ADN genomico de un procariota o eucariota (por ejemplo, un transgen); o que existe como molecula separada (por ejemplo, un fragmento de ADNc o genomico o un ADNc producidos mediante PCR, digestion de endonucleasas de restriccion, o smtesis in vitro o qmmica). Tambien incluye un ADN recombinante que es parte de un gen tubrido que codifica para una secuencia de polipeptido adicional. El termino “acido nucleico aislado” tambien se refiere a ARN, por ejemplo, una molecula de ARNm que se codifica por una molecula de ADN aislada, o que se sintetiza qmmicamente, o que se separa o esta sustancialmente libre de al menos algunos componentes celulares, por ejemplo, otros tipos de moleculas de ARN o moleculas de polipeptido.

Por tanto, se divulga un acido nucleico aislado que codifica para un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:12.

Por tanto, el acido nucleico divulgado puede comprender la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, o SEQ ID NO:89.

El acido nucleico divulgado en el presente documento puede unirse operativamente a una secuencia de control de expresion. Tambien se divulga un vector que comprende uno o mas de los acidos nucleicos divulgados en el presente documento, en el que el acido nucleico se une operativamente a una secuencia de control de expresion. Hay varias composiciones y metodos que pueden usarse para suministrar acidos nucleicos a celulas, o bien in vitro o bien in vivo. Estos metodos y composiciones pueden desglosarse en gran parte en dos clases: sistemas de suministro a base de virus y sistemas de suministro a base de no virus. Por ejemplo, los acidos nucleicos pueden suministrarse a traves de varios sistemas de suministro directos tales como, electroporacion, lipofeccion, precipitacion de fosfato de calcio, plasmidos, vectores virales, acidos nucleicos virales, acidos nucleicos de fago, fagos, cosmidos, o por medio de transferencia de material genetico en celulas o portadores tales como liposomas cationicos. Los medios apropiados para transfeccion, incluyendo vectores virales, transfectantes qmmicos o metodos fisicomecanicos tales como electroporacion y difusion directa de ADN, se describen por, por ejemplo, Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); y Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991). Tales metodos se conocen bien en la tecnica y son facilmente adaptables para su uso con las composiciones y los metodos descritos en el presente documento. En determinados casos, se modificaran los metodos para funcionar espedficamente con grandes moleculas de ADN. Ademas, estos metodos pueden usarse para seleccionar como diana determinadas enfermedades y poblaciones celulares usando las caractensticas de direccionamiento del portador.

Los vectores de transferencia pueden ser cualquier construccion de nucleotido usada para suministrar genes a celulas (por ejemplo, un plasmido), o como parte de una estrategia general para suministrar genes, por ejemplo, como parte de adenovirus o retrovirus recombinante (Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)).

Tal como se usa en el presente documento, vectores virales o plasmidos son agentes que transportan los acidos nucleicos divulgados, tales como SEQ ID NO:6, a la celula sin degradacion e incluyen un promotor que produce la expresion del gen en las celulas en las que se suministra. En algunas realizaciones los promotores se derivan de o bien un virus o bien un retrovirus. Vectores virales son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vaccinia, virus de la polio, virus del sida, virus trofico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo estos virus la estructura principal de VIH. Tambien se divulga cualquier familia viral que comparta las propiedades de estos virus que las hacen adecuadas para su uso como vectores. Los retrovirus incluyen virus de leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como vector. Los vectores retrovirales pueden portar una carga util genetica mayor, es decir, un transgen o gen marcador, que otros vectores virales, y por este motivo son vectores comunmente usados. Sin embargo, no son tan utiles en celulas que no proliferan. Los vectores adenovirales son relativamente estables y es facil trabajar con ellos, tienen tftulos altos, y pueden suministrarse en formulacion de aerosol, y pueden transfectar celulas que no se dividen. Los vectores virales pox son grandes y tienen varios sitios para insertar genes, son termostables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Tambien se divulga un vector viral que se ha modificado por ingeniena para suprimir la respuesta inmunitaria del organismo huesped, suscitada por los antfgenos virales. Los vectores de este tipo pueden portar regiones codificantes para interleucina 8 o 10.

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Los vectores virales pueden tener capacidades de transaccion (capacidad de introducir genes) mayores que los metodos qmmicos o ffsicos para introducir genes en celulas. Normalmente, los vectores virales contienen, genes tempranos no estructurales, genes tardms estructurales, un transcrito de ARN polimerasa III, repeticiones terminales invertidas necesarias para replicacion y encapsulacion, y promotores para controlar la transcripcion y replicacion del genoma viral. Cuando se modifican por ingeniena como vectores, los virus normalmente tienen uno o mas de los genes tempranos retirados y se inserta un gen o un casete de gen/promotor en el genoma viral en lugar del ADN viral retirado. Los constructos de este tipo pueden portar hasta aproximadamente 8 kb de material genetico foraneo. Las funciones necesarias de los genes tempranos retirados se suministran normalmente mediante lmeas celulares que se han modificado por ingeniena para expresar los productos genicos de los genes tempranos en trans.

Un retrovirus es un virus animal que pertenece a la familia de virus de Retroviridae, incluyendo cualquier tipo, subfamilia, genero o tropismo. Los vectores retrovirales, en general, se describen por Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. En Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pags. 229-232, Washington, (1985).

Ejemplos de metodos para usar vectores retrovirales para terapia genica se describen en las patentes estadounidenses n.os 4.868.116 y 4.980.286; solicitudes PCT de los documentos WO 90/02806 y WO 89/07136; y Mulligan, (Science 260:926-932 (1993)).

Un retrovirus es esencialmente un paquete en el que se ha empaquetado carga de acido nucleico. La carga de acido nucleico porta consigo una senal de empaquetamiento, que garantiza que las moleculas hija replicadas se empaquetaran de manera eficaz dentro de la cubierta de paquete. Ademas de la senal de paquete, hay varias moleculas que se necesitan en cis, para la replicacion y empaquetamiento del virus replicado. Normalmente un genoma retroviral, contiene los genes gag, pol y env que estan implicados en la elaboracion de la cubierta de protema. Son los genes gag, pol, y env los que se reemplazan normalmente por el ADN foraneo que va a transferirse a la celula diana. Los vectores retrovirales contienen normalmente una senal de empaquetamiento para la incorporacion en la cubierta de paquete, una secuencia que senala el inicio de la unidad de transcripcion de gag, elementos necesarios para transcripcion inversa, incluyendo un sitio de union de cebador para unir el cebador de ARNt de transcripcion inversa, secuencias de repeticiones terminales que grnan el cambio de las hebras de ARN durante la smtesis de ADN, una secuencia rica en purina de 5' a 3' de lTr que sirve como el sitio de cebado para la smtesis de la segunda hebra de smtesis de ADN, y secuencias espedficas cercanas a los extremos de las lTr que facilitan que la insercion del estado de ADN del retrovirus se inserte en el genoma huesped. La retirada de los genes gag, pol, y env permite la insercion de aproximadamente 8 kb de secuencia extrana en el genoma viral, que se transcriba de manera inversa, y que se empaquete tras la replicacion en una nueva partmula retroviral. Esta cantidad de acido nucleico es suficiente para el suministro de uno a muchos genes dependiendo del tamano de cada transcrito.

Puesto que la maquinaria de replicacion y las protemas de empaquetamiento se han retirado en la mayona de vectores retrovirales (gag, pol y env), los vectores se generan normalmente colocandolos en una lmea celular de empaquetamiento. Una lmea celular de empaquetamiento es una lmea celular que se ha transfectado o transformado con un retrovirus que contiene la maquinaria de replicacion y empaquetamiento, pero carece de cualquier senal de empaquetamiento. Cuando se transfecta el vector que porta el AdN de eleccion en estas lmeas celulares, se replica el vector que contiene el gen de interes y se empaqueta en nuevas partmulas retrovirales, mediante la maquinaria proporcionada en cis por la celula auxiliar. Los genomas para la maquinaria no se empaquetan porque carecen de las senales necesarias.

La construccion de adenovirus deficientes en replicacion se ha descrito (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang “Generation and identification of recombinant adenovirus by liposoma- mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15:868-872 (1993)). El beneficio de usar estos virus como vectores es que estan limitados en la medida en que pueden propagarse a otros tipos de celulas, ya que pueden replicarse dentro de una celula inicial infectada, pero no pueden formar nuevas partmulas virales infecciosas. Se ha mostrado que los adenovirus recombinantes logran transferencia de gen de alta eficacia despues del suministro in vivo directo a epitelio de las vfas respiratorias, hepatocitos, endotelio vascular, parenquima cNs y varios otros sitios tisulares (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gen Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); y Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). Los adenovirus recombinantes logran la transduccion del gen uniendose a receptores de la superficie celular, despues de lo cual el virus se interioriza mediante endocitosis mediada por receptor, de la misma manera que de tipo natural o adenovirus deficiente en replicacion (Chardonnet y Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown y Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson y Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

Un vector viral puede ser uno basado en un adenovirus al que se le ha retirado el gen E1, y estos virones se

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generan en una lmea celular tal como la lmea celular humana 293. En un aspecto, los genes tanto E1 como E3 se retiran del genoma de adenovirus.

Otro tipo de vector viral se basa en un virus adenoasociado (VAA). Este parvovirus defectuoso puede infectar muchos tipos de celula y no es patogeno para humanos. Los vectores de tipo VAA pueden transportar aproximadamente de 4 a 5 kb y se sabe que el VAA de tipo natural se inserta de manera estable en el cromosoma 19. Como ejemplo, este vector puede ser el vector P4.1 C producido por Avigen, San Francisco, CA, que puede contener el gen cinasa timidina del virus de herpes simple, HSV-tk, y/o un gen marcador, tal como el gen que codifica para la protema fluorescente verde, GFP.

En otro tipo de virus VAA, el VAA contiene un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean al menos un casete que contiene un promotor que dirige la expresion espedfica de celula unida operativamente a un gen heterologo. Heterologo en este contexto se refiere a cualquier secuencia de nucleotidos o gen que no es nativo con respecto al parvovirus B19 o VAA.

Normalmente las regiones codificantes de VAA y B19 se han delecionado, dando como resultado un vector no citotoxico seguro. Las ITR de VAA, o modificaciones de las mismas, confieren inefectividad e integracion espedfica para sitio, pero no citotoxicidad, y el promotor dirige la expresion espedfica para celula. La patente estadounidense n°n° 6.261.834 incluye material relacionado con el vector VAA.

Los vectores divulgados proporcionan por tanto moleculas de ADN que pueden integrarse en un cromosoma de mairnfero sin toxicidad sustancial.

Los genes insertados en viral y retroviral habitualmente contienen promotores, y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresion del producto genico deseado. Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando estan en una ubicacion relativamente fija con respecto al sitio de inicio de transcripcion. Un promotor contiene elementos de nucleo requeridos para la interaccion basica de ARN polimerasa y factores de transcripcion, y puede contener elementos en el sentido de 5' y elementos de respuesta.

Los experimentos geneticos moleculares con grandes virus de herpes humano han proporcionado medios por los que pueden clonarse, propagarse y estabilizarse grandes fragmentos de ADN heterologo en celulas permisivas para infeccion con virus de herpes (Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter y Robertson,. Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999). Estos grandes virus de ADN (virus de herpes simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), tienen el potencial de suministrar fragmentos de ADN heterologo humano > 150 kb a celulas espedficas. Los EBV recombinantes pueden mantener grandes piezas de ADN en las celulas B infectadas como ADN episomal. Clones individuales que portaban insertos genomicos humanos de hasta 330 kb paredan geneticamente estables. El mantenimiento de estos episomas requiere una protema EBV nuclear espedfica, EBNA1, expresada constitutivamente durante la infeccion con EBV. Adicionalmente, estos vectores pueden usarse para transfeccion, en la que pueden generarse grandes cantidades de protema transitoriamente in vitro. Tambien se estan usando sistemas de amplicones de virus del herpes para empaquetar piezas de ADN > 220 kb y para infectar celulas que puedan mantener de manera estable el ADN como episomas.

Otros sistemas utiles incluyen, por ejemplo, replicacion y vectores de virus vaccinia replicantes y no replicantes restringidos al huesped.

Las composiciones divulgadas pueden suministrarse a las celulas diana en una variedad de modos. Por ejemplo, las composiciones pueden suministrarse a traves de electroporacion, o a traves de lipofeccion, o a traves de precipitacion de fosfato de calcio. El mecanismo de suministro elegido dependera en parte del tipo de celula seleccionada como diana y de si el suministro se produce por ejemplo in vivo o in vitro.

Por tanto, las composiciones pueden comprender, ademas de los polipeptidos divulgados, acidos nucleicos o vectores, por ejemplo, lfpidos tales como liposomas, tales como liposomas cationicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE, DC-colesterol) o liposomas anionicos. Los liposomas pueden comprender ademas protemas para facilitar el direccionamiento a una celula particular, si se desea. La administracion de una composicion que comprende un compuesto y un liposoma cationico que puede administrarse a la sangre aferente a un organo diana o inhalarse en las vfas respiratorias hacia celulas diana de las vfas respiratorias. En cuanto a los liposomas, vease, por ejemplo, Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987); la patente estadounidense n° 4.897.355. Ademas, el compuesto puede administrarse como componente de una microcapsula que puede seleccionarse como diana a tipos de celula espedficos, tales como macrofagos, o donde se disena la difusion del compuesto o suministro del compuesto de la microcapsula para una dosificacion o tasa espedfica.

En los metodos descritos anteriormente que incluyen la administracion y captacion de ADN exogeno en las celulas de un sujeto (es decir, transfeccion o transduccion genica), el suministro de las composiciones a las celulas puede ser por medio de una variedad de mecanismos. Como un ejemplo, el suministro puede ser por medio de un liposoma, usando preparaciones de liposomas disponibles comercialmente tales como LIPOFECTIN,

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LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), asf como otros liposomas desarrollados segun procedimientos convencionales en la tecnica. Ademas, el acido nucleico o vector divulgados puede suministrarse in vivo mediante electroporacion, para lo cual esta disponible la tecnolog^a de Genetronics, Inc. (San Diego, CA) asf como por medio de una maquina de SONOPORACION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

Los acidos nucleicos que se suministran a las celulas que han de integrarse en el genoma de la celula huesped, contienen normalmente secuencias de integracion. Estas secuencias son a menudo secuencias relacionadas con virus, particularmente cuando se usan sistemas a base de virus. Estos sistemas de integracion virales pueden incorporarse tambien a acidos nucleicos que han de suministrarse usando un sistema de suministro a base de acido no nucleico, tal como un liposoma, de manera que el acido nucleico contenido en el sistema de suministro pueda venir integrado en el genoma huesped.

Otras tecnicas generales para la integracion en el genoma huesped incluyen, por ejemplo, sistemas disenados para promover la recombinacion homologa con el genoma huesped. Estos sistemas normalmente se basan en el flanqueo de secuencia del acido nucleico que va a expresarse que tiene suficiente homologfa con una secuencia diana dentro del genoma de la celula huesped en el que tiene lugar la recombinacion entre el vector de acido nucleico y la diana de acido nucleico, provocando que el acido nucleico suministrado se integre en el genoma huesped. Los expertos en la tecnica conocen estos sistemas y los metodos necesarios para promover la recombinacion homologa.

Las composiciones pueden suministrarse a las celulas del sujeto in vivo y/o ex vivo mediante una variedad de mecanismos bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, captacion de ADN desnudo, fusion de liposomas, inyeccion intramuscular de ADN por medio de una pistola genica, endocitosis y similares).

Si se emplean metodos ex vivo, pueden retirarse celulas o tejidos y mantenerse fuera del cuerpo segun protocolos convencionales bien conocidos en la tecnica. Las composiciones pueden introducirse en las celulas por medio de cualquier mecanismo de transferencia genico, tal como, por ejemplo, suministro genico mediado por fosfato de calcio, electroporacion, microinyeccion o proteoliposomas. Las celulas transducidas pueden entonces infundirse (por ejemplo, en un vehuculo farmaceuticamente aceptable) o trasplantarse de nuevo de manera homotopica en el sujeto por metodos convencionales para el tipo de tejido o celula. Se conocen metodos convencionales para el trasplante o infusion de diversas celulas en un sujeto.

Los acidos nucleicos que se suministran a las celulas normalmente contienen sistemas que controlan la expresion. Por ejemplo, los genes insertados en sistemas virales y retrovirales habitualmente contienen promotores, y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresion del producto genico deseado. Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando estan en una ubicacion relativamente fija con respecto al sitio de inicio de transcripcion. Un promotor contiene elementos de nucleo requeridos para la interaccion basica de ARN polimerasa y factores de transcripcion, y puede contener elementos en el sentido de 5' y elementos de respuesta.

Los promotores que controlan la transcripcion de los vectores en celulas huesped de marnfferos pueden obtenerse a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus del simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de hepatitis B, citomegalovirus, o a partir de promotores de mamffero heterologos, por ejemplo promotor beta actina. Los promotores tempranos y tardfos del virus SV40 se obtienen convenientemente como fragmento de restriccion de SV40 que tambien contiene el origen viral de SV40 de replicacion (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como fragmento de restriccion de HindIII E (Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). Evidentemente, los promotores de la celula huesped o especies relacionadas son tambien utiles en el presente documento.

El potenciador generalmente se refiere a una secuencia de ADN que funciona a una distancia no fija del sitio de inicio de transcripcion y puede estar o bien en 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) o bien en 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) con respecto a la unidad de transcripcion. Ademas, los potenciadores pueden estar dentro de un intron (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)) asf como dentro de la secuencia codificante en sf (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). Estan habitualmente entre 10 y 300 bp en longitud, y funcionan en cis. Los potenciadores funcionan para aumentar la transcripcion de promotores cercanos. Los potenciadores tambien contienen a menudo elementos de respuesta que median la regulacion de la transcripcion. Los promotores pueden contener tambien elementos de respuesta que median la regulacion de la transcripcion. Los potenciadores determinan a menudo la regulacion de la expresion de un gen. Aunque ahora se conocen muchas secuencias de potenciadores a partir de genes de mairnferos (globina, elastasa, albumina, a- fetoprotema e insulina), normalmente se usara un potenciador de un virus de celula eucariota para expresion general. Ejemplos son el potenciador SV40 en el lado tardfo del origen de replicacion (bp 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardfo del origen de replicacion, y potenciadores de adenovirus.

El promotor y/o potenciador puede estar espedficamente activado o bien mediante luz o bien mediante eventos

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qmmicos espedficos que activa su funcion. Los sistemas pueden regularse mediante reactivos tales como tetraciclina y dexametasona. Tambien hay modos de potenciar la expresion genica del vector viral mediante exposicion a irradiacion, tal como irradiacion gamma, o farmacos de quimioterapia alquilantes.

En determinadas realizaciones la region de promotor y/o potenciador puede actuar como un promotor y/o potenciador constitutivo para maximizar la expresion de la region de la unidad de transcripcion que va a transcribirse. En determinados constructos la region de promotor y/o potenciador es activa en todos los tipos de celula eucariota, incluso si solo se expresa en un tipo particular de celula en un momento particular. Un promotor de este tipo es el promotor CMV (650 bases). Otros promotores de este tipo son los promotores SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa), y vector retroviral LTR.

Se ha mostrado que todos los elementos regulatorios espedficos pueden clonarse y usarse para construir vectores de expresion que se expresan de manera selectiva en tipos de celula espedficos tales como celulas de melanoma. Se ha usado el promotor de la protema acida fibrilar glial (GFAP) para expresar de manera selectiva genes en celulas de origen glial.

Los vectores de expresion usados en celulas huesped eucariotas (celulas de levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano o nucleadas) pueden contener tambien secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion que puede afectar a la expresion de ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porcion sin traducir del ARNm que codifica para protema de factor tisular. Las regiones 3' sin traducir tambien incluyen sitios de terminacion de transcripcion. La unidad de transcripcion puede contener tambien una region de poliadenilacion. Un beneficio de esta region es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita se procese y transporte como ARNm. La identificacion y el uso de senales de poliadenilacion en constructos de expresion esta bien establecida. Las senales de poliadenilacion homologas pueden usarse en los constructos transgenicos. En determinadas unidades de transcripcion, la region de poliadenilacion se deriva de la senal de poliadenilacion temprana de SV40 y consiste en aproximadamente 400 bases. Las unidades transcritas pueden contener otras secuencias convencionales solas o en combinacion con las secuencias anteriores que mejoran la expresion del, o la estabilidad del, constructo.

Los vectores virales pueden incluir secuencia de acido nucleico que codifica para un producto marcador. Este producto marcador se usa para determinar si el gen se ha suministrado a la celula y una vez suministrado se esta expresando. Ejemplo de genes marcadores son el gen de E. Coli lacZ, que codifica para p-galactosidasa, y protema fluorescente verde.

En algunas realizaciones el marcador puede ser un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mairnferos son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina cinasa, neomicina, analogo de neomicina G418, hidromicina y puromicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren con exito a una celula huesped de mam^era, la celula huesped de mamffero transformada puede sobrevivir si se pone a presion selectiva. Hay dos categonas distintas ampliamente usadas de regfmenes selectivos. La primera categona se basa en el metabolismo de la celula y el uso de una lmea celular mutante que carece de la capacidad de crecer independientemente de un medio complementado. Dos ejemplos son: celulas DHFR de ovario de hamster chino (CHO) y celulas LTK de raton. Estas celulas carecen de la capacidad de crecer sin la adicion de nutrientes tales como timidina o hipoxantina. Debido a que estas celulas carecen de determinados genes necesarios para una ruta de smtesis de nucleotidos completa, no pueden sobrevivir a no ser que se proporcionen los nucleotidos que faltan en medios complementados. Una alternativa a complementar los medios es introducir un gen TK o DHFR intacto en las celulas que carecen de los genes respectivos, alterando por tanto sus requisitos de crecimiento. Las celulas individuales que no se transformaron con el gen TK o DHFR no podran sobrevivir en medios no complementados.

La segunda categona es seleccion dominante que se refiere a un esquema de seleccion usado en cualquier tipo de celula y no requiere el uso de una lmea celular mutante. Estos esquemas normalmente usan un farmaco para detener el crecimiento de una celula huesped. Aquellas celulas que tienen un nuevo gen expresanan una protema que porta resistencia al farmaco y sobrevivinan a la seleccion. Los ejemplos de tal seleccion dominante usan los farmacos neomicina, (Southern P. y Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), acido micofenolico, (Mulligan, RC. y Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) o higromicina, (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). Los tres ejemplos emplean genes bacterianos bajo control eucariota para portar resistencia al farmaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (acido micofenolico) o higromicina, respectivamente. Otros incluyen el analogo de neomicina G418 y puramicina.

Tambien se divulga una celula que comprende uno o mas de los vectores divulgados en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “celula”, “lmea celular”, y “cultivo celular” pueden usarse de manera indistinta y todas las designaciones de este tipo incluyen progenia. La celula divulgada puede ser cualquier celula usada para clonar o propagar los vectores divulgados en el presente documento. Por tanto, la celula puede ser de un cultivo celular primario o lmea celular establecida. Puede aplicarse el metodo a cualquier celula, incluyendo procariota o eucariota, tal como bacteriana, de planta, de animal, y similares. El tipo de celula puede seleccionarse por un experto en la tecnica basandose en la eleccion del vector y uso deseado.

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Se divulgan animales no humanos producidos mediante el procedimiento de transfectar una celula dentro del animal con cualquier molecula del acido nucleico o vectores divulgados en el presente documento. Se divulgan animales no humanos producidos mediante el procedimiento de transfectar una celula dentro del animal con cualquier molecula del acido nucleico o vectores divulgados en el presente documento, en el que el animal es un mairnfero. Tambien se divulgan animales producidos mediante el procedimiento de transfectar una celula dentro del animal con cualquier molecula del acido nucleico o vectores divulgados en el presente documento, en el que el mamffero es raton, rata, conejo, vaca, oveja, cerdo o primate.

Se divulga una composicion que comprende uno o mas de los polipeptidos, acidos nucleicos, o vectores divulgados en el presente documento en un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Por tanto, se divulga una composicion que comprende una combinacion de dos o mas de cualquiera de los polipeptidos ACT divulgados en el presente documento en un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, se divulga una composicion que comprende SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:5 en un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

Por “farmaceuticamente aceptable” se entiende un material que no es biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto, junto con el acido nucleico o vector, sin provocar ningun efecto biologico indeseable ni interaccionar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composicion farmaceutica en la que esta contenido. El vehfculo se seleccionana de manera natural para minimizar cualquier degradacion del principio activo y minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como sabe bien un experto en la tecnica.

La composicion divulgada en el presente documento puede comprender ademas cualquier sustancia conocida o recien descubierta que pueda administrarse a una herida, lesion de tejido, sitio de inflamacion o cancer. Por ejemplo, la composicion divulgada puede comprender ademas una o mas clases de antibioticos (por ejemplo aminoglucosidos, cefalosporinas, cloramfenicol, clindamicina, eritromicinas, fluoroquinolonas, macrolidos, azolidos, metronidazol, penicilinas, tetraciclinas, trimetoprima-sulfametoxazol, vancomicina), esteroides (por ejemplo andranos (por ejemplo testosterona), colestanos (por ejemplo colesterol), acidos colicos (por ejemplo acido colico), corticosteroides (por ejemplo dexametasona), estraenos (por ejemplo estradiol), pregnanos (por ejemplo progesterona), analgesicos narcoticos y no narcoticos (por ejemplo morfina, codema, heroma, hidromorfona, levorfanol, meperidina, metadona, oxicodona, propoxifeno, fentanilo, metadona, naloxona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina, pentazocina), quimioterapia (por ejemplo farmacos anticancengenos tales como pero sin limitarse a altretamina, asparaginasa, bleomicina, busulfano, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dietilestilbesterol, etinilestradiol, etoposido, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, flutamida, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, paclitaxel, pentostatina, pipobroman, plicamicina, prednisona, procarbazina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposido, vinblastina, vincristina), agentes antiinflamatorios (por ejemplo alclofenaco; alclometasona dipropionato; algestona acetonida; alfa amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenaco sodico; clorhidrato de amiprilosa; anakinra; anirolaco; anitrazafeno; apazona; balsalazida disodica; bendazaco; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelamas; broperamol; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cintazona; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopiraco; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; decanoato; deflazacort; delatestrilo; depo-testosterona; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco potasico; diclofenaco sodico; diacetato de diflorasona; diflumidona sodica; diflunisal; difluprednato; diftalona; dimetilsulfoxido; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam sodico; epirizol; etodolaco; etofenamato; felbinaco; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fencloraco; fendosal; fenpipalona; fentiazaco; flazalona; fluazacort; acido flufenamico; flumizol; acetato de flunisolida; flunixina; flunixina meglumina; fluocortibutilo; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina sodica; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepaco; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lomoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato sodico; acido meclofenamico; dibutirato de meclorisona; acido mefenamico; mesalamina; meseclazona; mesterolona; metandrostenolona; metenolona; acetato de metenolona; suleptanato de metilprednisolona; momiflumato; nabumetona; nandrolona; naproxeno; naproxeno sodico; naproxol; nimazona; olsalazina sodica; orgotema; orpanoxina; oxandrolona; oxaprozina; oxifenbutazona; oximetolona; clorhidrato de paranilina; polisulfato de pentosano sodico; glicerato de fenbutazona sodico; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; acido prodolico; provuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; cloruro de sanguinario; seclazona; sermetacina; estanozolol; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap sodico; tenoxicam; tesicam; tesimida; testosterona; combinaciones de testosterona; tetridamina; tiopinaco; tixocortol pivalato; tolmetina; tolmetina sodica; triclonida; triflumidato; zidometacina; zomepiraco sodico), o agentes antihistammicos (por ejemplo etanolaminas (como difenhidramina carbinoxamina), etilendiamina (como tripelenamina pirilamina), alquilamina (como clorfeniramina, dexclorfeniramina, bromfeniramina, triprolidina), otras antihistaminas como astemizol, loratadina, fexofenadina, brofeniramina, clemastina, acetaminofeno, pseudoefedrina, triprolidina).

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Las composiciones pueden administrate por v^a topica, oral o parenteral. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse por v^a extracorporea, intracraneal, intravaginal, intraanal, subcutanea, intradermica, intracardiaca, intragastrica, intravenosa, intramuscular, mediante inyeccion intraperitoneal, transdermica, intranasal o mediante inhalante. Tal como se usa en el presente documento, “administracion intracraneal” significa la administracion directa de sustancias al cerebro incluyendo, por ejemplo, intratecal, intracisternal, intraventricular o administracion transesfenoidal por medio de cateter o aguja.

La administracion parenteral de la composicion, si se usa, se caracteriza generalmente por inyeccion. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, o bien como suspensiones o disoluciones lfquidas, formas solidas adecuadas para la disolucion de la suspension en lfquido previamente a la inyeccion o bien como emulsiones. Un enfoque revisado mas recientemente para administracion parenteral implica el uso de un sistema de liberacion sostenida o de liberacion lenta de manera que se mantenga una dosificacion constante. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n° 3.610.795.

Tal como se usa en el presente documento, “administracion intranasal topica” significa el suministro de las composiciones en la nariz y conductos nasales a traves de uno o ambos orificios nasales y puede comprender la administracion mediante un mecanismo de pulverizacion o mecanismo de gotitas, o a traves de aplicacion con aerosol del acido nucleico o vector. La administracion de las composiciones mediante inhalante puede ser a traves de la nariz o boca por medio de administracion mediante un mecanismo de pulverizacion o gotitas. La administracion puede ser directamente a cualquier zona del sistema respiratorio (por ejemplo, pulmones) por medio de intubacion.

La cantidad exacta de las composiciones requerida variara de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, la gravedad del trastorno alergico que esta tratandose, el acido nucleico o vector particular usado, su modo de administracion y similares. Por tanto, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composicion. Sin embargo, puede determinarse una cantidad apropiada por un experto habitual en la tecnica usando solo experimentacion de rutina segun las ensenanzas en el presente documento.

Los materiales pueden estar en disolucion o suspension (por ejemplo, incorporados en micropartmulas, liposomas o celulas). Estos pueden dirigirse a un tipo de celula particular por medio de anticuerpos, receptores o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnologfa para dirigir protemas espedficas a tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Vehmulos tales como liposomas “furtivos” y otros conjugados con anticuerpo (incluyendo direccionamiento de farmacos mediado por lfpidos a carcinoma colonico), direccionamiento mediado por receptor de ADN a traves de ligandos espedficos de celula, direccionamiento a tumor dirigido por linfocito y direccionamiento retroviral terapeutico altamente espedfico de celulas de glioma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnologfa dirigir protemas espedficas a tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). En general, los receptores estan implicados en rutas de endocitosis, o bien constitutivas o bien inducidas por ligando. Estos receptores se agrupan en fosas recubiertas de clatrina, entran en la celula por medio de vesfculas recubiertas de clatrina, pasan a traves de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores y entonces o bien se recirculan a la superficie celular, se almacenan de manera intracelular o bien se degradan en lisosomas. Las rutas de internalizacion cumplen una variedad de funciones, tales como captacion de nutrientes, eliminacion de protemas activadas, aclaramiento de macromoleculas, entrada oportunista de virus y toxinas, disociacion y degradacion de ligandos y regulacion del nivel de receptor. Muchos receptores siguen mas de una ruta intracelular, dependiendo del tipo de celula, concentracion de receptor, tipo de ligando, valencia de ligando y concentracion de ligando. Se han revisado mecanismos moleculares y celulares de endocitosis mediada por receptor (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

Se describen vehmulos adecuados y sus formulaciones en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Normalmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmaceuticamente aceptable en la formulacion para hacer que la formulacion sea isotonica. Ejemplos de vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, solucion salina, disolucion de Ringer y disolucion de dextrosa. El pH de la disolucion puede ser de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8, de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7,5. Vehmulos adicionales incluyen preparaciones de liberacion sostenida tales como matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de artfculos conformados, por ejemplo, pelmulas, liposomas o micropartmulas. Para los expertos en la tecnica sera evidente que determinados vehuculos pueden ser mas preferibles dependiendo de, por ejemplo, la via de administracion y concentracion de la composicion que esta administrandose.

Los expertos en la tecnica conocen vehmulos farmaceuticos. Estos senan, lo mas normalmente, vehmulos convencionales para la administracion de farmacos a humanos, incluyendo disoluciones tales como agua esteril, solucion salina y disoluciones tamponadas a pH fisiologico. Las composiciones pueden administrarse por via intramuscular o subcutanea. Otros compuestos se administraran segun procedimientos convencionales usados por los expertos en la tecnica.

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Las composiciones farmaceuticas pueden incluir vehfculos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares ademas de la molecula de eleccion. Las composiciones farmaceuticas pueden incluir tambien uno o mas principios activos tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestesicos, y similares.

La composicion farmaceutica puede administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento loca o sistemico, y de la zona que va a tratarse. La administracion puede ser por via topica (incluyendo oftalmica, vaginal, rectal, intranasal), por via oral, mediante inhalacion, o por via parenteral, por ejemplo mediante goteo intravenoso, inyeccion intramuscular, intraperitoneal o subcutanea.

Las preparaciones para administracion parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehfculos acuosos incluyen agua, disoluciones alcoholicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solucion salina y medio tamponado. Los vehfculos parenterales incluyen disolucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehfculos intravenosos incluyen reponedores de nutrientes y fluidos, reponedores de electrolitos (tal como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tale como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Las formulaciones para administracion topica pueden incluir unguentos, lociones, cremas, geles (por ejemplo, gel de poloxamero), gotas, supositorios, pulverizaciones, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases oleosas, en polvo o acuosas, espesantes y similares. Las composiciones divulgadas pueden administrarse, por ejemplo, en una microfibra, polfmero (por ejemplo, colageno), nanoesfera, aerosol, locion, crema, material textil, plastico, armazon disenado por ingeniena de tejidos, material de matriz, comprimido, recipiente implantado, polvo, aceite, resina, vendaje para heridas, perla, microperla, perla de liberacion lenta, capsula, inyectables, goteos intravenosos, dispositivo de bombeo, implantes de silicona o cualquier material disenado por ingeniena genetica.

En un aspecto el vehfculo farmaceuticamente aceptable divulgado es un poloxamero. Los poloxameros, a los que se hace referencia por el nombre comercial Pluronics®, son tensioactivos no ionicos que forman geles termorreversibles transparentes en agua. Poloxameros son copolfmeros de triple bloque de poli(oxido de etileno)-poli(oxido de propileno)-poli(oxido de etileno) (OPE-OPP-OPE). Las dos cadenas de poli(oxido de etileno) son hidrofilas pero la cadena de polipropileno es hidrofoba. Estas caractensticas hidrofobas e hidrofilas predominan cuando se colocan en disoluciones acuosas. Las cadenas de OPE-OPP-OPE adoptan la forma de pequenas hebras en las que los centros hidrofobos se uninan entre sf para formar micelas. La micela, secuencialmente, tiende a tener caractensticas gelificantes porque se unen en grupos para formar solidos (geles) en los que el agua esta solo ligeramente presente cerca de los extremos hidrofilos. Cuando se enfna, se vuelve lfquido, pero se endurece cuando se calienta. Esta caractenstica lo hace util en composiciones farmaceuticas porque puede recogerse con una jeringuilla para medicion de la dosis precisa cuando esta fno. Cuando se calienta hasta temperatura corporal (cuando se aplica a la piel) se espesa hasta una consistencia perfecta (especialmente cuando se combina con lecitina de soja/palmitato de isopropilo) para facilitar una adhesion y uncion apropiadas. Pluronic® F127 (F127) se usa ampliamente porque se obtiene facilmente y por tanto se usa en tales aplicaciones farmaceuticas. F127 tiene una razon de OE:OP:Oe de 100:65:100, que en peso tiene un razon de OPE:OPP de 2:1. El gel Pluronic es una disolucion acuosa y normalmente contiene el 20-30% de F-127. Por tanto, las composiciones divulgadas pueden administrarse en F127.

Las composiciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o disoluciones en medios acuosos o no acuosos, capsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsificantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes.

Algunas de las composiciones pueden administrarse posiblemente como una sal de adicion de acido o base farmaceuticamente aceptable, formada mediante reaccion con acidos inorganicos tales como acido clorhfdrico, acido bromhndrico, acido perclorico, acido mtrico, acido tiocianico, acido sulfurico y acido fosforico, y acidos organicos tales como acido formico, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido lactico, acido piruvico, acido oxalico, acido malonico, acido succmico, acido maleico y acido fumarico, o mediante reaccion con una base inorganica tal como hidroxido de sodio, hidroxido de amonio, hidroxido de potasio y bases organicas tales como mono-, di-, trialquil y arilaminas y etanolaminas sustituidas.

Dosificaciones eficaces y calendarios para la administracion de las composiciones pueden determinarse empmcamente y la elaboracion de tales determinaciones esta dentro del conocimiento en la tecnica. Los intervalos de dosificacion para la administracion de las composiciones son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en los que se ven afectados los smtomas del trastorno. La dosificacion no debe ser tan grande como para producir efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilacticas, y similares. Generalmente, la dosificacion variara con la edad, estado, sexo y grado de la enfermedad en el paciente, via de administracion, o si se incluyen otros farmacos en el regimen, y puede determinarla un experto en la tecnica.

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La dosificacion puede ajustarla el doctor individual en el caso de cualquier contraindicacion. La dosificacion puede variar y puede administrate en una o mas administraciones de dosis al dfa, durante uno o varios dfas. Puede encontrarse una gma en la bibliograffa para dosificaciones apropiadas para clases proporcionadas de productos farmaceuticos. El intervalo de dosificacion depende en gran medida de la aplicacion de las composiciones en el presente documento, la gravedad del estado y su via de administracion.

Por ejemplo, en aplicaciones como una herramienta de laboratorio para investigacion, las composiciones de peptido ACT pueden usarse en dosis tan bajas como el 0,01% p/v. La dosificacion puede ser tan baja como el 0,02% p/v y posiblemente tan alta como el 2% p/v en tratamientos de heridas cutaneas por via topica. Pueden usarse concentraciones significativamente mayores de las composiciones por sf mismas o en combinacion con otros compuestos en aplicaciones como terapia contra el cancer/tumor o como bolo concentrado temprano inmediatamente tras una lesion de tejido aguda. Por tanto, los lfmites superiores de los polipeptidos divulgados pueden ser de hasta el 2-5% p/v o v/v si se proporcionan como un bolo inicial suministrado por ejemplo directamente en una masa tumoral. Los lfmites superiores de dosificacion recomendados para vfas de administracion parenterales por ejemplo intramuscular, intracerebral, intracardiaca e intrarraqmdea podnan ser de hasta el 1% p/v o v/v dependiendo de la gravedad de la lesion. Este lfmite de dosificacion superior puede variar segun la formulacion, dependiendo por ejemplo de como se combina(n) el/los polipeptido(s) con otros agentes que promueven su accion o que actuan en colaboracion con el/los polipeptido(s).

Para la administracion continua de los polipeptidos divulgados, por ejemplo, en combinacion con un goteo intravenoso, pueden usarse lfmites superiores de 0,01 g/kg de peso corporal en transcursos temporales determinados por el medico basandose en mejoras en el estado. En otro ejemplo, los lfmites superiores de concentracion de los acidos nucleicos divulgados administrados por via topica, por ejemplo, en heridas cutaneas senan de 5-10 |ig/cm2 de herida dependiendo por ejemplo de como se combina el acido nucleico con otros agentes que promueven su accion o que actuan en colaboracion con los acidos nucleicos. Esto se repetina a una frecuencia determinada por el medico basandose en mejoras. En otro ejemplo, los lfmites superiores de concentracion de los acidos nucleicos divulgados administrados internamente por ejemplo, por via intramuscular, intracerebral, intracardiaca e intrarraqmdea senan de 50-100 |ig/ml de disolucion. De nuevo, la frecuencia la determinana el medico basandose en mejoras.

Tambien se divulga el acondicionamiento previo de un area con los polipeptidos divulgados previamente a la cirugfa. La concentracion de los polipeptidos puede ser de 10-200 |iM mezclados con el 10-30% de gel pluronico o cualquier vehmulo de este tipo que permita la penetracion del/de los peptido(s) dentro del sitio de interes durante un periodo de al menos 3-6 horas previamente a la cirugfa. Este acondicionamiento previo al procedimiento puede mejorar la respuesta de cicatrizacion posterior a la cirugfa, incluyendo una respuesta inflamatoria reducida.

Los vectores virales siguen siendo herramientas altamente experimentales que no obstante muestran un potencial considerable en aplicaciones clmicas. Como tal, se garantiza precaucion en el calculo de regfmenes de dosificacion esperados para vectores virales y dependera considerablemente del tipo de vector usado. Por ejemplo, los vectores retrovirales infectan eficazmente a celulas en division tales como celulas cancerosas, intercalandose en el genoma de la celula huesped y continuando la expresion de las protemas codificadas indefinidamente. Las dosificaciones tfpicas de retrovirus en un entorno de modelo animal estan en el intervalo de 107 a 109 unidades infecciosas por ml. Por el contrario, los adenovirus se seleccionan como diana lo mas eficazmente celulas postmitoticas, pero las celulas se eliminan rapidamente mediante el sistema inmunitario del huesped o el virus se pierde finalmente si las celulas infectadas reanudan la proliferacion y posteriormente diluyen el ADN episomal viral. De hecho, este transcurso temporal transitorio de la infeccion puede ser util para administracion a corto plazo de la composicion descrita en el presente documento en determinadas situaciones clmicas, por ejemplo en la mejora de una pequena lesion. En modelos animales, concentraciones de 108-1011 unidades infecciosas por ml de adenovirus son tfpicas para usos en investigacion. Los intervalos de dosificacion de vectores basados en datos derivados de modelos animales estanan previstos que se usaran finalmente en entorno(s) clmico(s), a la espera del desarrollo de formulacion(es) farmaceuticamente aceptable(s).

Dos aplicaciones topicas de composiciones de ACT al 0,02% p/v; una aplicada de manera aguda y la segunda aplicada 24 horas despues son suficientes para reducir la inflamacion, promover la cicatrizacion, reducir la formacion de cicatrices, aumentar la resistencia a la traccion y promover la regeneracion tisular. Sin embargo, en un entorno clmico, se recomienda una frecuencia aumentada de hasta 3 aplicaciones al dfa por via topica a una concentracion de hasta el 5% hasta que se logre una mejora significativa tal como determina el medico. Para administracion interna, por ejemplo, por via intravenosa, intramuscular, intracerebral, intracardiaca e intrarraqmdea, se recomienda una frecuencia aumentada de hasta 3 dosificaciones del 1% p/v o v/v al dfa hasta mejora significativa tal como determina el medico.

Tras la administracion de una composicion divulgada, tal como un polipeptido, para promover la cicatrizacion de heridas, la eficacia de la composicion terapeutica puede evaluarse de diversas formas bien conocidas por el medico experto. Por ejemplo, un experto habitual en la tecnica entendera que una composicion, tal como un polipeptido, divulgado en el presente documento es eficaz en la promocion de la cicatrizacion de heridas en un sujeto observando que la composicion puede reducir la formacion de tejido cicatricial, reducir la formacion de tejido

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fibrotico, mejorar la regeneracion tisular o reducir la inflamacion en el sujeto tras la lesion tisular. Se conocen en la tecnica metodos para medir estos criterios y se comentan en el presente documento.

Tambien se divulgan materiales que comprenden las composiciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos o vectores). Por ejemplo, se divulgan materiales usados para tratar heridas, en los que los materiales estan recubiertos con un polipeptido ACT. Ejemplos no limitativos de materiales usados para tratar heridas incluyen vendajes, cinta quirurgica, suturas, grapas o injertos (por ejemplo, injertos de piel).

Por ejemplo, el material (por ejemplo, vendaje, cinta quirurgica, sutura, grapa, injerto) puede remojarse en el polipeptido divulgado a una concentracion que oscila entre 10-200 |iM. El material puede secarse entonces y sellarse en un recipiente esteril. El material tambien puede sumergirse en gel pluronico lfquido al 10-30% a 4°C que contiene polipeptido a una concentracion de 10-200 |iM. El material puede entonces llevarse hasta aproximadamente temperatura ambiente de manera que el gel polimerice, dejando un recubrimiento de gel impregnado en polipeptido que rodea el material, que puede sellarse en un recipiente esteril. El polipeptido tambien puede incorporarse en un sistema de hidrogel reticulable, tal como el poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA) o poliuretano, que puede entonces disenarse como materiales para tratar heridas (por ejemplo, vendaje, cinta quirurgica, sutura, grapa, injerto). Por tanto, se divulgan materiales compuestos de hidrogel-peptido.

Tambien se divulgan implantes medicos recubiertos con el polipeptido divulgado antes de su implantacion en un sujeto. Por ejemplo, un problema comun en tales cirugfas de implante es la formacion de una capsula de contraccion alrededor del implante a partir de la formacion de tejido cicatricial que conduce a un endurecimiento indebido, contraccion y finalmente deformacion del tejido de interes. El uso de los presentes polipeptidos en o sobre el implante puede reducir o evitar esta deformacion. Ejemplos no limitativos de implantes medicos incluyen: protesis de extremidades, implantes de mama, implantes de pene, implantes testiculares, ojos artificiales, implantes faciales, articulaciones artificiales, protesis de valvulas cardiacas, protesis vasculares, protesis dentales, protesis faciales, valvula de disco inclinado, valvula de bola enjaulada, protesis de ofdo, protesis de nariz, marcapasos, implantes cocleares y sustitutos de la piel (por ejemplo, heteroinjerto porcino/piel de cerdo, BIOBRANE, queratinocitos cultivados).

El polipeptido segun la invencion se recubre sobre un implante medico o material de tratamiento de heridas.

En el presente documento se divulga un metodo de promocion de la cicatrizacion de heridas tras la lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una o mas de las composiciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos o vectores) en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Ademas se divulga un metodo de tratamiento de un sujeto con lesion tisular, que comprende administrar al sujeto una o mas de las composiciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos o vectores) en un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

“Promover,” “promocion” y “que promueve” se refieren a un aumento en una actividad, respuesta, estado, enfermedad u otro parametro biologico. Esto puede incluir pero no se limita al inicio de la actividad, respuesta, estado o enfermedad. Esto puede incluir tambien, por ejemplo, un aumento del 10% en la actividad, respuesta, estado o enfermedad en comparacion con el nivel nativo o de control. Por tanto, el aumento puede ser del 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100%, o cualquier cantidad de aumento entre medias en comparacion con los niveles nativos o de control.

Por “tratar” o “tratamiento” se entiende un metodo de reduccion de los efectos de una enfermedad o estado. Tratamiento puede referirse tambien a un metodo de reduccion de la causa subyacente de la enfermedad o estado en sf mas que solo los smtomas. El tratamiento puede ser cualquier reduccion de los niveles nativos y puede ser pero no se limita a la supresion completa de la enfermedad, estado o los smtomas de la enfermedad o estado. Por ejemplo, un metodo divulgado para promover la cicatrizacion de heridas se considera un tratamiento si hay una reduccion del 10% en uno o mas smtomas de la enfermedad en un sujeto con la enfermedad en comparacion con niveles nativos en el mismo sujeto o sujetos de control. Por tanto, la reduccion puede ser del 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100%, o cualquier cantidad de reduccion entre medias en comparacion con niveles nativos o de control.

El polipeptido segun la invencion es para su uso en un metodo de tratamiento.

Tal como se usa en el presente documento, “sujeto” incluye, pero no se limita a, animales, plantas, bacterias, virus, parasitos y cualquier otro organismo o entidad que tiene acido nucleico. El sujeto puede ser un vertebrado, mas espedficamente un mairnfero (por ejemplo, un humano, caballo, cerdo, conejo, perro, oveja, cabra, primate no humano, vaca, gato, cobaya o roedor), un pez, un pajaro o un reptil o un anfibio. El sujeto puede ser un invertebrado, mas espedficamente un artropodo (por ejemplo, insectos y crustaceos). El termino no indica una edad o sexo particular. Por tanto, se pretende que se cubran sujetos adultos y recien nacidos, asf como fetos, tanto machos como hembras. Un paciente se refiere a un sujeto aquejado con una enfermedad o trastorno. El termino “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.

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El metodo divulgado puede reducir la formacion de tejido cicatricial en un sujeto tras la lesion tisular. Por “tejido cicatricial” se entiende el tejido conjuntivo fibroso (fibrotico) que se forma en el sitio de la lesion o enfermedad en cualquier tejido del cuerpo, producido por la sobreproduccion de colageno desorganizado y otras protemas de tejido conjuntivo, que actuan para reparar la rotura en el tejido. El tejido cicatricial puede reemplazar musculo subyacente y piel lesionados, musculo cardiaco danado, o areas enfermas de organos internos tales como el hugado. Denso y espeso, es habitualmente mas palido que el tejido circundante porque tiene un escaso suministro de sangre, y aunque reemplaza estructuralmente al tejido destruido, no puede realizar las funciones del tejido que falta. Esta compuesto de fibras de colageno, que restringiran a menudo la elasticidad normal en el tejido implicado. El tejido cicatricial puede por tanto limitar el intervalo de movimiento muscular o evitar la circulacion apropiada de los fluidos cuando afecta al sistema circulatorio o linfatico. El tejido cicatricial glial tras la lesion del cerebro o medula espinal es uno de los principales obstaculos para la restauracion de la funcion neuronal tras el dano al sistema nervioso central. Una reduccion en el tejido cicatricial puede evaluarse mediante la poblacion de tipos de celula dentro del sitio lesionado. Por ejemplo, una reduccion en el tejido cicatricial glial puede estimarse mediante una razon aumentada de celulas neuronales con respecto a astrodticas. Una reduccion en la formacion de tejido cicatricial puede medirse mediante una medicion sencilla de la anchura de la cicatriz o area de tejido cicatricial (Wilgus et al., 2003). Ademas pueden realizarse evaluaciones histologicas sobre la restauracion de la complejidad estructural dentro del tejido cicatrizado en comparacion con el tejido normal.

Ademas de reducir la formacion de tejido fibrotico en un sujeto tras la lesion tisular, los metodos y composiciones divulgados pueden usarse tambien para tratar trastornos asociados con aumentos patologicos en la formacion de tejido fibrotico en un sujeto, tal como por ejemplo, psoriasis, mastocitosis sistemica y cutanea, asma, eccema, sinusitis, aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, fibrosis pulmonar y fibrosis qmstica. Una reduccion en la formacion de tejido fibrotico en un sujeto puede medirse mediante el juicio clmico de un medico que evalua si ha resultado una recuperacion en la estructura y funcion normales de un tejido y/o organo dado en un sujeto tras un tratamiento. Como un ejemplo, para la psoriasis un medico evaluana la piel del sujeto para determinar si ha habido una reduccion en las manchas de piel roja levantada cubierta de acumulaciones escamosas blancas. Determinados tipos de psoriasis se caracterizan por una apariencia de grano (psoriasis pustulosa) o de quemadura (eritrodermica). En tales casos, el doctor determinana si el tratamiento ha dado como resultado la reduccion de estos smtomas. En el caso de un tejido u organo en el que un sujeto en el que un medico juzga que una biopsia esta clmicamente disponible y/o es necesaria o en un modelo animal de la enfermedad humana, se preparanan fragmentos de tejido de biopsias y se evaluana la estructura histologica tisular por un patologo clmico y/o histopatologo entrenado para determinar si se ha producido reduccion en la fibrosis y restauracion de la funcion y estructura tisular normales. El area de fibrosis con respecto a tejido normal tambien podna evaluarse cuantitativamente en tales preparaciones histologicas.

El metodo divulgado puede restaurar las propiedades mecanicas de tejido normal tales como resistencia a la traccion tras lesion tisular en un sujeto. “Resistencia a la traccion” se refiere a la cantidad de tension o deformacion requerida para romper el tejido o herida.

La resistencia a la traccion de las heridas tratadas puede ser el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 100% de la del tejido no lesionado en el plazo de 3 meses despues del tratamiento. Por tanto, se divulga un metodo de restauracion de las propiedades mecanicas del tejido, que incluye aumentar la resistencia a la traccion de una lesion cicatrizada para aproximarse o alcanzar la de un tejido no lesionado normal, en un sujeto que comprende administrar al sujeto una o mas de las composiciones divulgadas en el presente documento (por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos o vectores) en un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

El tipo de heridas que sena importante con respecto a la resistencia a la traccion/extensibilidad incluina lesiones en tejidos/estructuras musculoesqueleticas, y la piel que recubre estas estructuras. Por ejemplo, los metodos divulgados pueden mejorar la resistencia a la traccion de articulaciones articulantes, hueso, cartflago, tendones o ligamentos. Los metodos divulgados tambien pueden mejorar la resistencia a la traccion de la piel a menores grados de tension/deformacion, tal como la piel que recubre el codo, la rodilla o el pie. Los problemas mas comunes asociados con la cicatrizacion de lesiones articulares es que la formacion excesiva de cicatrices en estas zonas conduce a contraccion, y no extensibilidad del area articular cicatrizada. Esto tiene graves consecuencias cosmeticas y psicologicas. Las propiedades de los peptidos ayudaran a modular y reducir la formacion de tal tejido cicatricial conduciendo a mayor movilidad de la articulacion.

El metodo divulgado puede mejorar la regeneracion tisular tras la lesion tisular en un sujeto. Por “regeneracion” se entiende la renovacion, el recrecimiento o la restauracion de un cuerpo o una parte corporal, un tejido o una sustancia tras lesion o como un proceso corporal normal. En contraposicion a la formacion de cicatrices, la regeneracion tisular implica la restauracion del tejido a su estado fisiologico, funcional y estructural original. Esto tambien se denomina en el presente documento “complejidad” tisular. La restauracion puede ser parcial o completa, lo que significa el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100% de restauracion, o cualquier cantidad de restauracion entre medias en comparacion con niveles nativos o de control. Como ejemplo, en el caso de una lesion cutanea, la regeneracion tisular puede implicar la restauracion de folmulos pilosos, estructuras glandulares, vasos sangumeos, musculo o grasa. En el caso de una lesion de cerebro, la regeneracion tisular puede implicar el mantenimiento o la restauracion de las neuronas. Como ejemplo en el caso de la piel una mejora en la regeneracion

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tisular puede evaluarse mediante mediciones del volumen de tejido cicatricial fibroso con respecto a piel regenerada normal como una razon. Como otro ejemplo, pueden hacerse recuentos de estructuras de regeneracion diferenciadas tales como glandulas cutaneas en regeneracion normalizados para el volumen del area de la herida.

En un aspecto, la regeneracion tisular implica el reclutamiento y la diferenciacion de celulas madre para reemplazar a las celulas danadas. Tal como se usa en el presente documento, una “celula madre” es una celula no diferenciada que se encuentra entre las celulas diferenciadas en un tejido u organo, o se introduce desde una fuente externa como por ejemplo celulas madre embrionarias, celulas madre de medula osea de adulto, que pueden autorrenovarse y diferenciarse para producir la mayona de los tipos de celulas especializadas del tejido u organo. Los papeles primarios de las celulas madre en un organismo vivo son mantener y reparar el tejido en el que se encuentran. Por diferenciacion de celulas madre se entiende el proceso mediante el cual una celula no especializada (por ejemplo, una celula madre) adquiere las caractensticas de una celula especializada tal como una celula cutanea, neural, cardiaca, hepatica o muscular. Como ejemplo, en el caso de una lesion cutanea, la regeneracion tisular puede implicar la diferenciacion de celulas madre presentes en el epitelio para dar folfculos pilosos (Alonso y Fuchs, 2003). En el caso de una lesion de cerebro, la regeneracion tisular puede implicar la diferenciacion de celulas madre para dar neuronas. El metodo divulgado puede potenciar la diferenciacion de celulas madre tras la lesion tisular en un sujeto. La diferenciacion de celulas madre potenciada puede medirse proporcionando un medio genetico u otro clmicamente aceptable de marcaje de celulas madre endogenas o injertadas y determinando la frecuencia de diferenciacion e incorporacion de celulas madre marcadas en estructuras de tejido normales. Como otro ejemplo, se sabe que determinadas estructuras tales como folfculos pilosos van a regenerarse a partir de celulas madre endogenas tras la lesion tisular. Como tal, los recuentos de folfculos pilosos normalizados al area de lesion tisular servinan como evaluacion cuantitativa de la diferenciacion de celulas madre potenciada.

El metodo divulgado puede reducir la inflamacion en un sujeto. Por “inflamacion”, “respuesta inflamatoria” o “respuesta inmunitaria” se entiende la reaccion de tejidos vivos a la lesion, infeccion o irritacion caracterizada por enrojecimiento, calor, hinchazon, dolor y perdida de funcion, producida como resultado del aumento de flujo de sangre y un flujo de entrada de celulas inmunitarias y secreciones. La inflamacion en la reaccion del cuerpo a los microorganismos infecciosos invasores y da como resultado un aumento del flujo de sangre a la zona afectada, la liberacion de productos qrnmicos que atraen a los globulos blancos, un aumento del flujo de plasma y la llegada de monocitos (o astrocitos en el caso del cerebro) para limpiar los residuos. Cualquier cosa que estimule la respuesta inflamatoria se dice que es inflamatoria. Por tanto, ademas de reducir la inflamacion en un sujeto en respuesta a lesion tisular, las composiciones y los metodos divulgados tambien pueden usarse para tratar trastornos asociados con aumenta patologico en los niveles de celulas inflamatorias, incluyendo, por ejemplo, asma, eccema, sinusitis, aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, mastocitosis sistemica y cutanea, psoriasis y esclerosis multiple. El tratamiento con el polipeptido divulgado tambien puede reducir el picor, por ejemplo de la cicatrizacion de heridas. Generalmente, el picor resulta de la liberacion de histamina por los mastocitos. El polipeptido divulgado puede reducir la desgranulacion de mastocitos y la liberacion de histamina. Por tanto, el polipeptido divulgado puede usarse para tratar estados que implican liberacion de histamina, incluyendo, pero sin limitarse a, picor, rascado, irritacion de los senos, tos alergica, ojos rojos, asma y eccema.

Una reduccion en la inflamacion puede medirse mediante una reduccion en la densidad de tipos de celulas inflamatorias tales como, por ejemplo, monocitos o astrocitos. Una reduccion en la inflamacion puede medirse mediante una reduccion en la densidad de tipos de celulas inflamatorias tales como, por ejemplo, neutrofilos, mastocitos, basofilos y monocitos. Una reduccion en la inflamacion puede calcularse mediante una medicion in vivo de la actividad de neutrofilos (Jones et al., 1994). Ademas pueden usarse factores como la frecuencia de desgranulacion de mastocitos o la medicion de los niveles de histamina o niveles de especies reactivas de oxfgeno como mediciones de la reduccion de la inflamacion. El nivel de inflamacion tambien puede medirse indirectamente comprobando los niveles de transcripcion de determinados genes mediante qRT-PCR para por ejemplo genes como, interferon-alfa, -beta y -gamma, factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 1beta, -2, -4, -5, -6, -8, -12, -18, -23, -27, CD4, CD28, CD80, CD86, MHCII y iNOS. La medicion de los niveles de citocinas proinflamatorias en los tejidos y o fluidos corporales del sujeto incluyendo el plasma puede medir una reduccion en la inflamacion. Cabe destacar que el mecanismo de accion de peptido ACT puede ser mediante inhibicion de la migracion de celulas inflamatorias y/o inhibicion de productos qrnmicos proinflamatorios (histamina, especies reactivas de oxfgeno) y citocinas proinflamatorias tales como interleucina (IL)-1, IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral (TNF).

El metodo divulgado puede inhibir la proliferacion de una celula transformada en un sujeto (vease la figura 2). Por celula transformada se entiende una neoplasia, un cancer o una celula tumoral que se divide y reproduce anomalamente con crecimiento no controlado. Por tanto, la inhibicion de la proliferacion (es decir, hiperplasia) de dicha celula transformada da como resultado una reduccion en el crecimiento y por tanto la malignidad del cancer. Una lista representativa pero no limitativa de los canceres para los que pueden usarse las composiciones y los metodos divulgados para su tratamiento son los siguientes: glioma, linfoma, linfoma de celulas B, linfoma de celulas T, micosis fungoide, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide, cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer del sistema nervioso, cancer de cabeza y cuello, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer de rinon, canceres de pulmon tales como cancer de pulmon de celulas pequenas y cancer de pulmon de celulas no pequenas, neuroblastoma, glioblastoma, cancer de ovarios, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer de piel, cancer de hngado, melanoma, carcinomas de celulas escamosas de la boca, la garganta, la laringe y el pulmon, cancer de

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colon, cancer cervical, carcinoma cervical, cancer de mama y cancer epitelial, cancer renal, cancer genitourinario, cancer pulmonar, carcinoma esofagico, carcinoma de cabeza y cuello, cancer de intestino grueso, canceres hematopoyeticos, cancer testicular, canceres de colon y rectal, cancer prostatico o cancer pancreatico. Por tanto, el metodo divulgado puede usarse para tratar cancer en un sujeto. Por ejemplo, el metodo divulgado puede usarse para tratar glioma en un sujeto.

Puede medirse una inhibicion en la proliferacion de celulas transformadas mediante una variedad de marcadores de proliferacion celular y kits para lo mismo por ejemplo inmunotincion con Ki67/MIB-1, timidina tritiada o indices de marcaje de bromodeoxiuridina, fraccion de fase S de ADN, expresion de antigeno nuclear de celulas en proliferacion, tiempo de duplicacion potencial y analisis de las protemas asociadas a la region organizadora nucleolar (AgNOR). Puesto que la actividad proliferativa del tumor depende de tanto la proporcion de celulas destinadas al ciclo (fraccion de crecimiento) como de la velocidad del ciclo celular, la actividad proliferativa real de un tumor podna medirse bien mediante la ecuacion [PA = Ki67 o puntuaciones de MIB-1 x AgNOR] (Pich et al., 2004). En otro ejemplo, los histopatologos son expertos en evaluar secciones de tejido usando indices cualitativos y cuantitativos sencillos de mitosis para determinar la proliferacion en poblaciones de celulas transformadas.

Se han desarrollado diversos modelos de raton para la investigacion del cancer. Hay modelos de raton espedficos para tipos espedficos de canceres. Por ejemplo, cancer de vejiga, cancer cervical, cancer endometrial, cancer gastrointestinal, cancer genitourinario, cancer de cabeza y cuello, cancer hematopoyetico, cancer de rinon, cancer de pulmon, cancer de glandulas mamarias, melanoma, mieloma, cancer del sistema nervioso, cancer oral, cancer de ovarios, cancer pancreatico, cancer de prostata, sarcoma, cancer de piel. Estos modelos estan bien descritos y se usan. Los efectos favorables de los polipeptidos, acidos nucleicos o vectores divulgados en el presente documento pueden estudiarse en cualquiera de estos modelos. Por ejemplo el modelo de raton de cancer de piel puede usarse facilmente para demostracion. Los canceres pueden cultivarse aplicando el modelo de xenoinjerto de tejidos cancerosos humanos en crecimiento usando el modelo de raton cosangumeo homogeneo, libre de patogenos espedficos (un raton desnudo) (Yoo, 2004). Los polipeptidos, acidos nucleicos o vectores divulgados en el presente documento pueden administrarse localmente para por ejemplo materiales disenados por ingeniena genetica tales como membranas de fibras huecas (Orlandini y Margaria. 1983; Ming Chu et al., 1998) y microfibras, perlas de liberacion lenta, agujas hipodermicas, cateteres permanentes, que pueden insertarse localmente en el crecimiento canceroso, o administrarse de manera sistemica para alcanzar su diana para por ejemplo infusiones intravenosas, inyeccion intraperitoneal, por via intramuscular. Este tratamiento puede administrarse por sf mismo o en combinacion con otros compuestos terapeuticos para por ejemplo agentes quimioterapicos.

El metodo divulgado puede inhibir la metastasis de una celula transformada en un sujeto. Por “metastasis” se entiende la transmision de celulas cancerosas desde un sitio original hasta uno o mas sitios en otra parte en el cuerpo, habitualmente por medio de los vasos sangumeos o linfaticos. La metastasis puede descomponerse en una serie de eventos. En primer lugar, la migracion de celulas cancerosas comienza el proceso mediante el cual las celulas tumorales abandonan el sitio de crecimiento primario, penetrando a menudo en la membrana basal y moviendose hacia la vasculatura local. La intravasacion describe el proceso de entrada de celulas cancerosas en la vasculatura, y su distribucion a sitios distantes. Extravasacion se refiere al proceso de salida de celulas cancerosas desde la vasculatura. Finalmente, la proliferacion de celulas cancerosas en el sitio distante se ve profundamente influenciada por la disponibilidad de factores de crecimiento localizados, influencias de celulas estromales y el medio de matriz extracelular circundante (el denominado “suelo”) asf como la disponibilidad de nutrientes y factores proporcionados por la vascularizacion resultante del tumor en crecimiento. Por tanto, las composiciones y los metodos divulgados pueden inhibir la metastasis de una celula transformada en un sujeto inhibiendo la migracion (es decir, migracion metastasica) de dicha celula. La tumorigenesis es el resultado de la desorganizacion del ciclo celular, que conduce a una proliferacion celular no controlada. Los mecanismos de procesos celulares espedficos que controlan la progresion del ciclo celular y el paso por puntos de control a traves de las fases intermitoticas estan desregulados. Normalmente, estos eventos estan altamente conservados debido a la existencia de mecanismos y moleculas de conservacion tales como genes del ciclo celular y sus productos. Una inhibicion en la migracion metastasica puede medirse mediante los niveles de tales genes del ciclo celular y sus productos como por ejemplo ciclinas, cinasas dependientes de ciclinas (Cdk), inhibidores de Cdk (CKI) y factores extracelulares (es decir, factores de crecimiento). Estan disponibles tecnicas revolucionarias que usan citometna laser y software comercial para cuantificar y evaluar procesos del ciclo celular y el crecimiento celular. Las mediciones de fraccion de fase S, incluyendo valores de ploidfa, usando histogramas y estimacion de indices tales como el mdice mitotico y los indices de tiempo de duplicacion tumoral, proporcionan una informacion adecuada al medico para evaluar la agresividad del tumor.

Tal como se usa en el presente documento, la lesion en el tejido puede resultar de, por ejemplo, una raspadura, corte, herida de laceracion, herida de aplastamiento, herida de compresion, herida de estiramiento, herida de mordedura, raspon, herida de bala, lesion de explosion, perforacion corporal, herida de punalada, herida de quemadura, herida por viento, quemadura solar, quemadura qmmica, herida quirurgica, intervencion quirurgica, intervencion medica, rechazo del huesped tras injerto de celula, tejido u organo, efecto farmaceutico, efecto secundario farmaceutico, ulcera de decubito, lesion por radiacion, herida cutanea cosmetica, proceso de enfermedad (por ejemplo, asma, cancer), infeccion, agente infeccioso, proceso de desarrollo, proceso de maduracion (por ejemplo, acne), anomalfa genetica, anomalfa del desarrollo, toxina ambiental, alergeno, lesion en el cuero cabelludo,

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lesion facial, lesion en la mandfoula, lesion en el pie, lesion en los dedos del pie, lesion en los dedos de la mano, lesion osea, lesion en los organos sexuales, lesion articular, lesion en los organos excretorios, lesion ocular, lesion corneal, lesion muscular, lesion en el tejido adiposo, lesion pulmonar, lesion en las vfas respiratorias, hernia, lesion anal, hemorroides, lesion en el ofdo, lesion en la retina, lesion cutanea, lesion abdominal, lesion en los brazos, lesion en las piernas, lesion atletica, lesion en la espalda, lesion de nacimiento, lesion de nacimiento prematuro, mordedura toxica, picadura, lesion en los tendones, lesion en los ligamentos, lesion cardiaca, lesion en las valvulas cardiacas, lesion en el sistema vascular, lesion en el cartflago, lesion en el sistema linfatico, traumatismo craneoencefalico, dislocacion, perforacion esofagica, ffstula, lesion en las unas, cuerpo extrano, fractura, congelacion, lesion en las manos, trastorno de estres termico, laceracion, lesion en el cuello, automutilacion, choque, lesion de tejidos blandos traumatica, lesion en la medula espinal, lesion espinal, esguince, distension, lesion en los tendones, lesion en los ligamentos, lesion en el cartflago, lesion toracica, lesion en los dientes, traumatismo, lesion en el sistema nervioso, envejecimiento, aneurisma, accidente cerebrovascular, lesion en el tracto digestivo, infarto o lesion isquemica.

B. Metodos de preparacion de las composiciones

Las composiciones divulgadas en el presente documento y las composiciones necesarias para realizar los metodos divulgados pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica para ese compuesto o reactivo particular a menos que se indique espedficamente otra cosa.

Por ejemplo, los acidos nucleicos divulgados pueden prepararse usando metodos de smtesis qmmica convencionales o pueden producirse usando metodos enzimaticos o cualquier otro metodo conocido. Tales metodos pueden oscilar entre digestion enzimatica convencional seguida por aislamiento de fragmentos de nucleotidos (vease por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) capftulos 5, 6) hasta metodos puramente de smtesis, por ejemplo, el metodo de fosforamidita de cianoetilo usando un sintetizador de ADN System IPlus de Milligen o Beckman (por ejemplo, sintetizador automatizado modelo 8700 de Milligen-Biosearch, Burlington, MA o ABI modelo 380B). Tambien se describen metodos de smtesis utiles para preparar oligonucleotidos por Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (metodos de fosfotriester y fosfito-triester), y Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (metodo de fosfotriester). Pueden prepararse moleculas de acido nucleico proteico usando metodos conocidos tales como los descritos por Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994).

Un metodo de produccion de los polipeptidos divulgados, tales como SEQ ID NO: 2, es unir dos o mas peptidos o polipeptidos entre sf mediante tecnicas de qmmica de protemas. Por ejemplo, pueden sintetizarse qmmicamente peptidos o polipeptidos usando equipo de laboratorio disponible actualmente usando qmmica de o bien Fmoc (9- fluorenilmetiloxicarbonilo) o bien Boc (terc-butiloxicarbonilo). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente que un peptido o polipeptido correspondiente a las protemas divulgadas, por ejemplo, puede sintetizarse mediante reacciones qmmicas convencionales. Por ejemplo, un peptido o polipeptido puede sintetizarse y no escindirse de su resina de smtesis mientras que el otro fragmento de un peptido o protema puede sintetizarse y posteriormente escindirse de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que esta bloqueado funcionalmente sobre el otro fragmento. Mediante reacciones de condensacion de peptidos, estos dos fragmentos pueden unirse covalentemente por medio de un enlace peptfdico en sus extremos carboxilo y amino terminales, respectivamente, para formar una protema, o fragmento de la misma. (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman y Co., N.Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY

Alternativamente, el peptido o polipeptido se sintetiza independientemente in vivo tal como se describe en el presente documento. Una vez aislados, estos peptidos o polipeptidos independientes pueden unirse para formar un peptido o fragmento del mismo por medio de reacciones de condensacion de peptidos similares.

Por ejemplo, la ligacion enzimatica de segmentos de peptidos clonados o sinteticos permiten que se unan fragmentos de peptidos relativamente cortos para producir fragmentos de peptidos mas grandes, polipeptidos o dominios proteicos completos (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Alternativamente, puede utilizarse ligacion qmmica nativa de peptidos sinteticos para construir de manera sintetica peptidos o polipeptidos grandes a partir de fragmentos de peptidos mas cortos. Este metodo consiste en una reaccion qmmica de dos etapas (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). La primera etapa es la reaccion quimioselectiva de un tioester de peptido sintetico no protegido con otro segmento de peptido no protegido que contiene un residuo de Cys amino-terminal para dar un producto intermedio unido por tioester como producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reaccion, este producto intermedio experimenta reaccion intramolecular rapida, espontanea para formar un enlace peptfdico nativo en el sitio de ligacion (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

Alternativamente, segmentos de peptidos no protegidos se unen qmmicamente cuando el enlace formado entre los segmentos de peptidos como resultado de la ligacion qmmica es un enlace no natural (no peptfdico) (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). Esta tecnica se ha usado para sintetizar analogos de dominios proteicos asf como grandes cantidades de protemas relativamente puras con actividad biologica completa (deLisle Milton RC et al.,

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Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nueva York, pags. 257-267 (1992)).

Se divulgan procedimientos para preparar las composiciones as^ como los productos intermedios que conducen a las composiciones. Existe una variedad de metodos que pueden usarse para preparar estas composiciones, tales como metodos qmmicos de smtesis y metodos de biologfa molecular convencionales. Se entiende que los metodos de preparacion de estas y las otras composiciones divulgadas se divulgan espedficamente. Se divulgan moleculas de acido nucleico producidas mediante el procedimiento que comprende unir de un modo funcional un acido nucleico que codifica para un polipeptido divulgado en el presente documento y una secuencia que controla la expresion del acido nucleico. Se divulgan celulas producidas mediante el procedimiento de transformacion de la celula con cualquiera de los acidos nucleicos divulgados en el presente documento. Se divulgan cualquiera de los peptidos divulgados producidos mediante el procedimiento de expresion de cualquiera de los acidos nucleicos divulgados en el presente documento. Se divulgan animales producidos mediante el procedimiento de transfeccion de una celula dentro del animal con cualquiera de las moleculas de acido nucleico divulgadas en el presente documento. Se divulgan animales producidos mediante el procedimiento de transfeccion de una celula dentro del animal con cualquiera de las moleculas de acido nucleico divulgadas en el presente documento, en el que el animal es un mairnfero. Ademas se divulgan animales producidos mediante el procedimiento de transfeccion de una celula dentro del animal con cualquiera de las moleculas de acido nucleico divulgadas en el presente documento, en el que el mai^ero es raton, rata, conejo, vaca, oveja, cerdo o primate. Ademas se divulgan animales producidos mediante el procedimiento de anadir al animal cualquiera de las celulas divulgadas en el presente documento.

C. Kits

Los materiales descritos anteriormente asf como otros materiales pueden envasarse juntos en cualquier combinacion adecuada como un kit util para realizar, o ayudar en la realizacion de, el metodo divulgado. Es util si los componentes del kit en un kit dado estan disenados y adaptados para su uso conjunto en el metodo divulgado. Por ejemplo se divulgan kits para promover la cicatrizacion de heridas, comprendiendo el kit uno o mas de los polipeptidos, acidos nucleicos o vectores divulgados en el presente documento en un vedculo farmaceuticamente aceptable. Tales kits tambien pueden incluir geles, vendajes, cintas Millipore, Q-tip medicadas, pulverizaciones, gotas, jarabes, lfquidos, tubos o bolsas desechables. Los kits tambien pueden contener instrucciones para su uso apropiado e informacion de seguridad del producto o la formulacion. Los kits pueden contener informacion de dosificacion basandose en la aplicacion y el metodo de administracion tal como determina un medico.

D. Usos

Los metodos y las composiciones divulgados pueden aplicarse a numerosas areas incluyendo, pero sin limitarse a, herramientas de investigacion de laboratorio. Estas formulaciones desempenan papeles reguladores en varios procesos celulares como por ejemplo proliferacion celular, migracion celular. Estas formulaciones pueden usarse en el laboratorio en sistemas modelo tanto in vitro como in vivo para estudiar diversos procesos celulares, regulaciones del ciclo celular, comportamiento celular, respuestas de celulas, organos o tejidos a compuestos de prueba, etc. Las formulaciones pueden suministrarse por sf mismas o en combinacion con otros compuestos o como parte de un kit, tal como un kit para un ensayo de proliferacion celular. El kit puede contener las formulaciones mencionadas en el presente documento por sf mismas o en combinacion con otros compuestos. Un kit de este tipo incluina instrucciones disenadas para facilitar el experimento. Se divulgan otros usos, evidentes a partir de la divulgacion, y/o los entenderan los expertos en la tecnica.

Ejemplos

Ejemplo 1: Lesion por aranazo in vitro

Se hicieron crecer miocitos de corazones de ratas neonatas hasta formar una monocapa casi confluente sobre una placa de cultivo tisular segun protocolos convencionales. Posteriormente se permitio que los cultivos se cultivaran durante 5 dfas adicionales en medio de cultivo que comprendfa peptido ACT 1 30 |iM (SEQ ID NO: 2), peptido de control no activo 30 |iM (SEQ ID NO: 55) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que no contiene peptido ACT o peptido de control. El peptido de control no activo comprende un polipeptido con un extremo carboxilo terminal en el que la secuencia de peptido ACT se ha invertido. El extremo amino terminal de ACT y peptidos de control estan ambos biotinilados, permitiendo la deteccion (es decir, el ensayo) de los peptidos en el citoplasma celular usando metodos bioqmmicos o microscopicos convencionales basados en la alta afinidad de union de estreptavidina a biotina.

Se cambiaron los medios de cultivo con peptidos o control de vedculo anadidos cada 24 horas durante el experimento. La figura 1a indica que el peptido ACT aumento enormemente el grado de formacion de uniones comunicantes Cx43 entre miocitos en relacion con las condiciones de control (figura 1b y 1c). Tal como se muestra en la figura 4, este aumento en formacion de uniones comunicantes Cx43 en respuesta a peptido ACT es compartida por varios tipos de celulas que expresan CX43.

Se hicieron crecer celulas NIH-3T3 a lo largo de 2-3 dfas hasta que formaron una monocapa casi confluente sobre

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una placa de cultivo tisular segun protocolos convencionales y entonces se trato previamente la monocapa con peptido ACT 1 (SEQ ID NO: 2) durante 24 h, y “se lesiono con aranazo” con una punta de pipeta de p200. Se permitio posteriormente que la “lesion por aranazo” se repoblara durante 24 horas en presencia de peptido ACT 1 30 |iM (SEQ ID NO: 2) disuelto en los medios de cultivo (figura 2a, b) o en presencia de dos condiciones de control (figura 2c-f). En la primera condicion de control, se permitio que las celulas “lesionadas con aranazo” se repoblaran durante 24 horas en presencia de un peptido de control no activo (como en la figura 1) disuelto en los medios de cultivo a una concentracion de 30 |iM (figura 2c, d). En la segunda condicion de control, se anadio solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a los medios de cultivo y se permitio que las celulas “lesionadas con aranazo” se repoblaran en presencia de esta disolucion de control de vehmulo que no contiene peptido ACT o peptido de control (figura 2e, f). La “lesion por aranazo” de celulas tratadas con peptido ACT permanece relativamente repoblada tras 24 horas (figura 2a), repoblando algunas celulas (flecha grande) el area dentro de los bordes de la “lesion por aranazo” inicial (es decir, dentro del area marcada mediante puntas de flecha negras pequenas). Por el contrario, en las condiciones de control en (figura 2c, e), grandes numeros de celulas (flechas grandes) han repoblado el area dentro de la “lesion por aranazo” inicial. La repoblacion de la “lesion por aranazo” se produce en parte por medio de migracion de las celulas transformadas que se arrastran al area de la “lesion por aranazo”. Las figuras (figura 2b, d y f) muestran el inmunomarcaje de antfgeno nuclear de celulas en proliferacion (PCNA) de celulas en la “lesion por aranazo” o en el borde de la lesion. Las celulas tratadas con peptido ACT (figura 2b) muestran solo baja luminosidad lo que concuerda con el fondo y ausencia de proliferacion. Solo en las dos condiciones de control mostradas en la figuras (figura 2d, f), se observan celulas en proliferacion marcadas de manera brillante (flechas blancas). Esto indica que el peptido ACT tambien ha reducido la proliferacion de las celulas transformadas en este modelo celular experimental.

La figura 3a muestra el borde de la lesion de celulas de control tratadas con peptido no activo y peptido ACT al final del periodo de 24 horas. Se marcaron las celulas con faloidina fluorescente para ayudar a la visualizacion. Las celulas tratadas con peptido ACT muestran bajos niveles de repoblacion del area de lesion por aranazo (flechas de doble cabeza blancas). La figura 3b muestra un grafico de barras del % de area de celulas que repueblan la lesion por aranazo tras 24 horas. La reduccion de celulas en el area lesionada en presencia de peptido ACT es drastica, con un valor de p de menos de 0,000001.

Las celulas WB-F344 son una lmea celular epitelial de rata transformada derivada mediante tratamiento de celulas de Imgado de rata aisladas con un agente que provoca cancer (Tsao et al., 1984; Hayashi et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al., 2001). Se transfectaron las celulas WB-F344 con un constructo de plasmido de expresion de ADNc y se selecciono con antibioticos usando protocolos convencionales para generar lmeas celulares que expresan de manera estable un polinucleotido que codifica para el peptido aCt (SEQ ID NO: 6) operativamente unido a una secuencia de promotor o un polinucleotido de protema fluorescente verde (GFP) operativamente unido a una secuencia de promotor como control. El polinucleotido que codifica el peptido ACT tambien codifico GFP. Como tal, la expresion del peptido ACT podfa someterse a ensayo mediante optica de fluorescencia de GFP convencional en un microscopio optico. Las figuras 4a, b muestran imagenes de alto aumento de fluorescencia de GFP en lmeas celulares de WB-F344 que expresan GFP solo (la figura 4a) o GFP mas la secuencia de peptido ACT de extremo carboxilo terminal (figura 4a) o GFP solo (figura 4b). Se “lesionaron por aranazo” monocapas casi confluentes de las lmeas celulares de WB-F344 y se permitio que se repoblaran durante 24 horas. De manera similar a los casos de control de las celulas NIH-3T3 tratadas con vehfculo o peptido de control no activo, la lmea celular epitelial de control que expresa GFP repoblo la lesion por aranazo (figura 4c). Sin embargo, en la lmea celular epitelial que expreso de manera estable el polinucleotico que codifica para el peptido ACT operativamente unido a una secuencia de promotor, se inhibio repoblacion de la lesion por aranazo (figura 4d). Ademas de las lmeas celulares de WB-F344, se han preparado lmeas celulares de NIH-3T3 que expresan de manera estable un polinucleotido que codifica para el peptido ACT operativamente unido a un promotor.

Ejemplo 2: Cicatrizacion de heridas in vivo

Se desensibilizaron cnas de raton neonatos usando hipotermia. Se realizo una lesion cutanea incisional de 4 mm de largo se realizo usando un bistun a traves del grosor completo de la piel (descendiendo hasta el nivel del musculo subyacente) en la lmea dorsal media entre los omoplatos. Entonces se aplicaron a las lesiones incisionales 30 |il de una disolucion de gel pluronico (F-127) al 20% que contema o bien nada (control) o bien peptido ACT 1 disuelto (SEQ ID NO: 2) a una concentracion de 60 |iM. El gel pluronico tiene propiedades tensioactivas leves que pueden ayudar en la dispersion uniforme del peptido ACT en micelas. De manera mas importante, el gel pluronico al 20% permanece lfquido a temperaturas por debajo de 15°C, pero se polimeriza a la temperatura corporal (37°C). Esta propiedad del gel pluronico probablemente ayudaba en la liberacion controlada del peptido en el tejido en el sitio de la lesion incisional, protegiendo al peptido frente a la descomposicion en el entorno rico en proteasas de la herida y tambien permitiendo que se mantengan concentraciones activas del peptido a lo largo de periodos prolongados. Se aplico posteriormente el gel de control o que contema peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizo aplicacion adicional de gel de control o que contema peptido ACT tras la segunda aplicacion. A las 48 horas puede observarse que la lesion tratada con peptido ACT (figura 5a) esta significativamente mas cerrada, menos inflamada, menos hinchada (se observan crestas en el borde la herida), y generalmente mas cicatrizada en apariencia que la lesion de control que no recibio peptido ACT (figura 5b). Estas diferencias en inflamacion, hinchazon y cicatrizacion entre el control y lesion tratada con peptido ACT y control persistfan en los puntos de tiempo de 72 (figura 5c, d) y 96

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(figura 5e, f) horas. A los 7 d^as, la herida con peptido ACT (figura 5g), tema un aspecto mas suave y con menos cicatrices que la lesion tratada con peptido de control (figura 5h). Observese que las imagenes de la misma lesion sobre el mismo animal se muestran en puntos de tiempo diferentes durante el transcurso de tiempo de la cicatrizacion.

Los ratones adultos anestesiados teman lesiones cutaneas excisionales circulares de 8 mm de ancho realizadas mediante unas tijeras quirurgicas finas descendiendo hasta el musculo subyacente en la lmea dorsal media entre los omoplatos (figura 6a, b). Se delimito el lfmite de la lesion mediante un corte de molde circular de 8 mm de ancho en una lamina de plastico. Entonces se aplicaron a las lesiones excisionales 100 |il de una disolucion de gel pluronico al 30% que contema o bien nada (control) o bien peptido ACT 1 disuelto (SEQ ID NO: 2) a una concentracion de 100 |iM. Se aplico posteriormente gel de control o que contema peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizaron aplicaciones adicionales de gel de control o que contema peptido ACT tras la segunda aplicacion. La lesion excisional grande tratada con peptido ACT (figura 6a, c, e, g, i) se cerro mas rapido, estaba menos inflamada en apariencia, cicatrizo mas rapido y con menos cicatrices que la lesion de control que no recibio peptido ACT (figura 6b, d, f, h, j) a lo largo del transcurso de tiempo de 14 dfas. De hecho, la lesion de control a los 14 dfas todavfa muestra una costra parcial indicando que la cicatrizacion aguda de la lesion fue incompleta (figura 6j).

Se tomaron biopsias cutaneas del sitio de la herida completa de algunas de las 24 horas tras la lesion excisional. Se fijaron estas muestras cutaneas en paraformaldehudo al 2%, se incrustaron en parafina, se cortaron y se tineron histoqmmicamente con hematoxilina y eosina (H&E) usando protocolos convencionales. Las figuras 7a y 7b muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones transversales de cerca del centro de la herida de lesiones tratadas con ACT y de control, respectivamente. El borde de la herida (marcado mediante las flechas pequenas), rodeado de piel de aspecto histologico normal, puede observarse en ambos casos. Se coloca un rectangulo negro sobre las imagenes en la figura 7a y 7b en el borde de la herida a mano izquierda. Las estructuras histologicas dentro del rectangulo negro colocado sobre los bordes de la herida a mano izquierda en la figuras 7a y 7b se muestran a mas aumentos en la figura 7c y 7d para tejidos tratados con peptido aCt y de control, respectivamente. Es de interes un tejido de “tipo collar” de material fibroso alineado (con flecha) que se proyecta desde las partes basales de la lesion a o hacia la superficie exterior y borde de la herida de la lesion. El material fibroso sirve como un sustrato para la migracion de celulas inflamatorias que se desplazan a la superficie de la lesion (Elder et al., 1997). De manera interesante, el sustrato fibroso alineado tiene el aspecto de estar mucho mas organizado en la lesion de control (figura 7d) que en la lesion tratada con peptido ACT (figura c). Ademas, existe una densidad considerablemente mas baja de celulas inflamatorias que tachonan el sustrato fibroso en el tejido tratado con peptido ACT. Esto se confirma en (figura 7f) y (figura 7e) donde las regiones de seccion histologica dentro de los rectangulos negros mostradas en (figura 7d) y (figura 7c) se muestran respectivamente a mas aumentos. Las celulas inflamatorias que tachonan el sustrato fibroso alineado incluyen mastocitos, neutrofilos y macrofagos. Estas celulas inflamatorias aparecen a una densidad muy superior en la lesion de control que en la lesion tratada con peptido ACT.

Al final del periodo de 14 dfas, se tomaron biopsias cutaneas de la lesion excisional completa y se tineron histoqmmicamente con H&E secciones histologicas de esas muestras cutaneas. Las figuras 8a y 8b muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones transversales de cerca del centro de la lesion de peptido ACT y control, respectivamente. El borde de la herida (marcado mediante flechas pequenas), rodeado de piel de aspecto histologico normal, puede observarse en ambos casos. Se coloca un rectangulo negro sobre las imagenes en las figuras 8a y 8b cerca del centro de cada lesion. Las estructuras histologicas dentro de estos dos rectangulos se muestran a mas aumentos en las figuras 8c y 8d los tejidos de peptido ACT y control, respectivamente. Es evidente que el tejido dentro del locus de la lesion tratada con peptido ACT tiene considerablemente mas complejidad. En la superficie externa de la herida tratada con ACT, existe una capa continua de celulas epiteliales que indican que la reepitelizacion de la superficie lesionada es completa, mientras que el epitelio es aun relativamente delgado cerca del centro de la herida (figura 8c). De manera inusual, ya puede observarse regeneracion de folfculos pilosos diferenciandose de novo a partir de celulas madre en el nuevo epitelio que recubre la lesion cicatrizada (figura 8c, flechas pequenas). En comparacion, la reepitelizacion de la superficie de la lesion es incompleta y no hay ningun signo de regeneracion de folfculos pilosos en el epitelio de la lesion de control. Bajo el epitelio reformado de la piel lesionada tratada con peptido ACT, se observa una restauracion considerable de la complejidad estructural normal, con estructuras glandulares, tejidos fibroso y conjuntivo, tejidos vasculares, miocitos y adipocitos en conjunto (figura 8a, c). Como con los folfculos pilosos, esta complejidad tisular se regenero mediante la diferenciacion de celulas madre. Por el contrario, en la lesion de control el tejido de la herida esta dominado completamente por un tapon uniforme y grande de tejido cicatricial fibroso (figura 8b, d), sin otra complejidad de estructura de tejido evidenciado particularmente dentro de este tejido cicatricial.

Los ratones adultos anestesiados teman 2 heridas cutaneas excisionales pequenas realizadas mediante unas tijeras quirurgicas finas sobre el cuello y (parte superior) de la espalda. Se delimitaron los lfmites de las lesiones mediante un corte de molde circular de 5 mm de ancho en una lamina de plastico. Entonces se aplicaron a las lesiones excisionales 50-60 |il de una disolucion de gel pluronico al 30% que contema o bien nada (control) o bien uno de los peptidos ACT (ACT 2 - SEQ ID NO: 1, ACT 1 - SEQ ID NO: 2, ACT 3 - SEQ ID NO: 3, ACT 4 - SEQ ID NO: 4, ACT 5 - SEQ ID NO: 5) disuelto en concentraciones de 100 |iM. Se aplicaron posteriormente geles de control que conteman peptido ACT 24 horas tras la aplicacion inicial. No se realizaron tras la segunda aplicacion aplicaciones adicionales

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de gel de control y que contema peptido ACT. Puede observarse en el caso de peptidos ACT 1 (figura 9e-h), ACT 2 (figura 9i-1), ACT 3 (figura 9m-p) y ACT 5 (figura 9u-x) que las lesiones excisionales se cerraron mas rapidamente, estaban menos inflamadas en apariencia, cicatrizaron mas rapido y con menos cicatrices que la lesion de control que no recibio peptido ACT (figura 9a-d) a lo largo del transcurso de tiempo de 240 horas (10 dfas). El peptido ACT 4 (figura 9q-t) tambien pareda mostrar una mejora modesta en la cicatrizacion con respecto al control durante el transcurso del tiempo. Observese que la misma herida sobre el mismo animal se muestra en puntos de tiempo diferentes durante el transcurso de la cicatrizacion.

Se midio el area de herida abierta durante el transcurso del tiempo imagen de NIH segun protocolos convencionales en multiples ratones adultos (~5 ratones por condicion de control o tratamiento). Entonces se normalizaron estas mediciones de areas individuales a (es decir, se dividieron entre) el area promedio medida para las lesiones de control para un punto de tiempo dado, se multiplicaron por 100 para dar un % de herida no cerrada en relacion con el control y luego se representaron graficamente frente al tiempo. Se uso una prueba de la U de Mann-Whitney para evaluar estadfsticamente los efectos de peptidos ACT a lo largo del transcurso del tiempo. Los peptidos ACT 1, ACT 2, ACT 3 y ACT 5 mejoraron significativamente las velocidades de cierre de heridas tras la lesion excisional. Estos tratamientos proporcionaron resultados con valores de p significativos. El ACT 1 y ACT 3 proporcionaron de manera cuantificable las mejoras mas pronunciadas con respecto al control. Tambien se observo una mejora mas modesta, aunque constante, para el peptido ACT 4 con respecto al control.

Se colocaron ratas adultas anestesiadas en un aparato estereotaxico. Se realizo una incision en la lmea media con un bistun para exponer el craneo. Se ajusto un taladro estereotaxico 2 mm posterior al bregma y se perforaron 2 orificios con una broca esferica de 1 mm, cada uno a 2,5 mm a la derecha e izquierda del bregma, y 3,5 mm por debajo de la duramadre. Se realizo una lesion cerebral insertando una aguja de calibre 18. Se determinaron las coordenadas a partir del atlas de Paxinos y Watson (1986). Se inserto la membrana de fibra hueca (MFH) en el orificio y se colocaron suturas cutaneas externas para cubrir el corte. Se disolvio el peptido ACT a una concentracion de 100 |iM en una disolucion de vehnculo de colageno al 2% contenida dentro de la MFH. Estudios de MFH aisladas indicaron que estos constructos disenados por ingeniena genetica eran capaces de ralentizar la liberacion de niveles detectables de peptido ACT (tal como se somete a ensayo mediante reaccion de biotin-estreptavidina) en disoluciones acuosas durante periodos de al menos 7 dfas. La astrocitosis reactiva asociada con inflamacion y posteriormente con formacion de cicatriz glial sigue un transcurso de tiempo bien caracterizado tras la lesion de cerebro en modelos de roedor (Norenberg, 1994; Fawcett y Asher, 1999). Normalmente, la respuesta astrodtica en cerebro de rata es maxima tras una semana, junto con perdida de neuronas y otros aspectos de la complejidad del tejido cerebral. Posteriormente, con el surgimiento de tejido cicatricial glial, la densidad de astrocitos positivos para GFAP disminuye. Las figuras 10b y 10c muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones del tejido cerebral (corteza) que rodea a implantes de MFH llenos con peptido ACT mas gel de vehnculo o gel de vehnculo de colageno de control o peptido ACT mas gel de vehnculo una semana tras la lesion de penetracion cerebral. En el tejido de control (figura 10c), se observa una alta densidad de astrocitos positivos para GFAP inmunomarcados cerca del sitio de la lesion producida por la MFH. La densidad de estas celulas parece disminuir ligeramente de manera distal de la lesion. Por el contrario, se observa una densidad mucho mas baja de astrocitos positivos para GFAP adyacentes a la MFH llena de peptido ACT (figura 10b). De hecho, los niveles de celulas positivas para GFAP no son diferentes de los observados en un tejido cerebral sin danar normal. Las regiones de tejido dentro de los rectangulos blancos en las figuras 10b y 10c se muestran a mas aumentos en la figuras 10d y 10e, respectivamente. En la lesion cerebral tratada mediante peptido ACT (figura 10d) puede observarse que los astrocitos positivos para GFAP no solo son menos numerosos, sino que tambien son mas pequenos que los observados en la lesion de control (figura 10e).

Las figuras 11a y 11b muestran vistas de estudio de bajo aumento de secciones del tejido cerebral (corteza) que rodea a implantes de MFH (el lfmite de implante o lesion se muestra mediante flechas) llenos de gel de vehnculo de colageno de control (figura 11b) o peptido ACT mas gel de vehnculo (figura 11a) 1 semana tras la lesion de penetracion cerebral. En el tejido de control (figura 11b), se observan una alta densidad de astrocitos positivos para GFAP inmunomarcados y una baja densidad de neuronas inmunoetiquetadas con NeuN cerca del sitio de la lesion producida por la MFH. La densidad de estas celulas parece disminuir y aumentar distalmente de la MFH, respectivamente. Por el contrario, se observan una densidad mucho mas baja de astrocitos positivos para GFAP y numeros superiores de neuronas inmunoetiquetadas con NeuN proximalmente (asf como distalmente) a la MFH llena de peptido ACT (figura 11a). Las areas en las figuras 11a y 11b proximales a las MFH se muestran en vistas de alto aumento en las figuras 11c y 11d, respectivamente. De nuevo, en el tejido de control (figura 11d) se observan un aumento notable en la densidad de astrocitos positivos para GFAP y una densidad reducida de neuronas positivas para NeuN en comparacion con tejido tratado con peptido ACT (figura 11c). Se observa un patron complementario cerca de la MFH que contiene peptido ACT, predominando neuronas positivas para NeuN sobre los astrocitos (figura 11c). De manera interesante, la vista de alto aumento mostrada en la figura 11d revela una alta frecuencia de neuronas en el proceso de fision en relacion con el control (figura 11c). Esto sugiere que la alta densidad de neuronas asociadas con tratamiento con peptido ACT puede deberse a la generacion de nuevas neuronas. El peptido ACT tambien puede aumentar la densidad neuronal en parte impidiendo que las neuronas experimenten muerte celular tras la lesion de cerebro.

Ejemplo 3: Tratamiento de lesion de medula espinal aguda

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Los sujetos con lesiones de medula espinal agudas representan un grupo gravemente problematico para los que incluso una pequena recuperacion neurologica de la funcion puede tener una influencia importante sobre su independencia posterior. En un ejemplo, un sujeto con lesion de medula espinal aguda recibe una infusion en bolo de una disolucion de peptido ACT a del 0,02% al 0,1% (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) a lo largo de 15 min en el plazo de 8 h directamente en el sitio de lesion de medula espinal aguda, seguido 45 min mas tarde por una infusion de disolucion de peptido ACT al 0,01% durante de 23 a 48 horas posteriores. En otro ejemplo, se usa peptido ACT para recubrir nanopartfculas de liberacion lenta cargadas en el plazo de 8 h directamente en el sitio de lesion de medula espinal aguda o bioarmazones disenados por ingeniena de tejidos disenados para promover la reconexion neural a traves de la zona de lesion de medula espinal aguda. La mejora en la funcion la evalua un medico a intervalos (por ejemplo, 6, 12, 26 y 52 semanas) tras el tratamiento mediante pruebas de desenlace neurologico que incluyen evaluaciones disenadas para medir la actividad motora, la sensibilidad cutanea a los pinchazos y la recuperacion de la sensibilidad.

Ejemplo 4: Evaluacion cuantitativa del cierre de heridas, la regeneracion tisular y la resistencia a la traccion de heridas cutaneas excisionales

Se generaron heridas cutaneas excisionales de 5 mm de diametro con peptido ACT (n = 12) y control (n = 8) en ratones adultos tal como se describio anteriormente. Entonces se emprendieron evaluaciones cuantitativas de la velocidad de cierre de heridas, recuentos de folfculos pilosos regenerados y mediciones de la resistencia a la traccion sobre las heridas cutaneas a puntos de tiempo de hasta 90 dfas tras el ataque inicial. En relacion con las heridas de control, el cierre se potencio significativamente en el plazo de 24 horas del tratamiento con peptido. De manera similar, a los 10 dfas, cuando la mayona de las heridas estaban casi acabando de cerrarse, se mantema todavfa una diferencia altamente significativa de manera que las heridas tratadas con peptido ACT eran en promedio el 43% mas pequenas que las heridas de control. A los 10 dfas las heridas con peptido ACT mostraban un aumento de 3,2 veces significativo en el numero de folfculos pilosos regenerados por area unitaria de la herida cicatrizada con respecto a las heridas de control.

Se emprendieron estudios de las propiedades mecanicas de heridas excisionales de 5 mm de diametro cicatrizadas

a 1 mes y 3 meses tras la lesion. Para las mediciones de las propiedades mecanicas, se obtuvieron las muestras

cutaneas tras sacrificar el animal y se evaluaron usando un instrumento MTS 858 Mini Bionix (MTS Systems

Corporation, MN, EE.UU.) equipado con una celula de carga de 5 kg. Durante la medicion se extendio la muestra

cutanea hasta la rotura a una velocidad de 0,5 mm/s. Se midio la fuerza y extension a la rotura. Se calcularon tal

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como sigue la resistencia a la traccion (tension) y extension a la rotura (deformacion), tension (N/mm ) = fuerza a la rotura (N) / area de seccion transversal de la muestra (mm2). Deformacion (%) = [aumento en la longitud a la rotura (mm) / longitud original (mm)] x 100. Se normalizaron los calculos de tension y deformacion para cada muestra cutanea con heridas a una muestra cutanea normal de un area cercana recogida del mismo animal.

1 mes despues, la tension (es decir, la fuerza normalizada) requerida para romper la piel con heridas era similar a la de la piel con heridas control. A los 3 meses, la tension normalizada para romper la piel con heridas tratada con peptido era en promedio el doble que la de piel con heridas control, aunque la alta varianza dentro del grupo de tratamiento impidio una separacion de las medias significativa con respecto al control. Este resultado demuestra que la resistencia a la traccion intrmseca de heridas tratadas con peptido era tan buena o mejor que la de heridas no tratadas. Ademas, se encontraron mejoras significativas en la extensibilidad de heridas tratadas con peptido. La cantidad de deformacion (es decir, extensibilidad) requerida para romper heridas tratadas con peptido mejoro modestamente con respecto a las heridas de control 1 mes despues. A los 3 meses, las heridas tratadas con peptido mostraron una mejora mas notable, aumentando hasta un 90% casi normal de piel sin heridas. Por el contrario, las heridas de control a los 3 meses permanedan solo el 60% tan extensibles como la piel normal.

Se entiende que el metodo y las composiciones divulgadas no se limitan a la metodologfa, los protocolos y los reactivos particulares descritos ya que estos pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion que estara limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Debe indicarse que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un polipeptido” incluye una pluralidad de tales polipeptidos, la referencia a “el polipeptido” es una referencia a uno o mas polipeptidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.

“Opcional” u “opcionalmente” significa que el acontecimiento, circunstancia o material descrito posteriormente puede producirse o no o estar presente o no, y que la descripcion incluye casos en los que el acontecimiento, la circunstancia o el material se produce o esta presente y casos en los que no se produce o no esta presente.

Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como desde “aproximadamente” un valor particular, y/o hasta “aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, tambien se contempla espedficamente y se considera divulgado el intervalo desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular a

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menos que el contexto indique espedficamente otra cosa. De manera similar, cuando se expresan valores como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “aproximadamente”, se entendera que el valor particular forma otra realizacion espedficamente contemplada que debe considerarse divulgada a menos que el contexto indique espedficamente otra cosa. Se entendera ademas que los puntos de extremo de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el otro punto de extremo, como independientemente del otro punto de extremo a menos que el contexto indique espedficamente otra cosa. Finalmente, debe entenderse que todos los valores individuales y subintervalos de valores contenidos dentro de un intervalo divulgado explfcitamente se contemplan tambien espedficamente y deben considerarse divulgados a menos que el contexto dicte espedficamente otra cosa. Lo anterior se aplica independientemente de si en casos particulares algunas o todas de estas realizaciones se divulgan explfcitamente.

A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenecen el metodo y las composiciones divulgadas. Aunque puede usarse cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica o las pruebas del presente metodo y las composiciones, los metodos, dispositivos y materiales particularmente utiles son tal como se describe.

Nada en el presente documento debe interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a anteceder a tal divulgacion en virtud de invencion previa. No se hace ninguna admision de que cualquier referencia constituya tecnica anterior. La discusion de referencias establece lo que sus autores afirman, y los solicitantes se reservan el derecho a cuestionar la exactitud y pertinencia de los citados documentos. Se entendera claramente que, aunque se hace referencia a varias publicaciones en el presente documento, tal referencia no constituye una admision de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general comun en la tecnica.

A lo largo de toda la descripcion y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra “comprenden” y variaciones de la palabra, tales como “que comprende” y “comprende”, significa “que incluye pero no se limita a” y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, numero enteros o etapas.

Los expertos en la tecnica reconoceran, o podran determinar usando no mas que experimentacion de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas del metodo y las composiciones descritas en el presente documento. Se pretende que tales equivalentes se abarquen por las siguientes reivindicaciones.

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binding domain of Ku70. Nature Cell Biol. 5, 352-357 (2003).

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Secuencias

SEQ ID NO: 1 (ACT 2)

PSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO: 2 (ACT 1)

RPRPDDLEI

SEQ ID NO: 3 (ACT 3)

RPRPDDLEV SEQ ID NO: 4 (ACT 4)

RPRPDDVPV SEQ ID NO: 5 (ACT 5)

KARSDDLSV SEQ ID NO: 6

aga cct cgg cct gat gac ctg gag att SEQ ID NO: 7 (Antp)

RQPKIWFPNRRKPWKK SEQ ID NO: 8 (Antp/ ACT 2)

RQPKIWFPNRRKPWKKPSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO: 9 (Antp/ACT 1) RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI

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SEQ ID NO: 10 (Antp/ACT 3)

RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEV SEQ ID NO: 11 (Antp/ACT4)

RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDVPV SEQ ID NO: 12 (Antp/ACT 5)

RQPKIWFPNRRKPWKKKARSDDLSV

SEQ ID NO: 13 (codifica para el polipeptido de SEQ ID NO 9)

egg cag ccc aag ate tgg ttc ccc aac egg egg aag ccc tgg aag aag egg ccc ggc ccg aeg acc tgg aga

tc

SEQ ID NO: 14 (VIH-Tat)

GRKKRRQRPPQ

SEQ ID NO: 15 (penetratina)

RQIKIWFQNRRMKWKK SEQ ID NO: 16 (Antp-3A)

RQIAIWFQNRRMKWAA SEQ ID NO: 17 (Tat)

RKKRRQRRR

SEQ ID NO: 18 (buforina II)

TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO: 19 (transportano)

GWTLNSAGILLGKINKALAALAKKIL SEQ ID NO: 20 (peptido anfipatico modelo)

KLALKLALKALKAALKLA SEQ ID NO: 21 (K-FGF)

AAVALLPAVLLALLAP SEQ ID NO: 22 (Ku70)

VPMLK-PMLKE SEQ ID NO: 23 (prion)

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP SEQ ID NO: 24 (pVEC)

LLIILRRRIRKQAHAHSK SEQ ID NO: 25 (Pep-1)

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV

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SEQ ID NO: 26 (SynBI) RGGRLSYSRRRFSTSTGR SEQ ID NO: 27 (Pep-7) SDLWEMMMVSLACQY SEQ ID NO: 28 (HN-1)

TSPLNIHNGQKL

SEQ ID NO: 29 (ACT de Cx43 alfa de pollo)

PSRASSRASSRPRPDDLEI

SEQ ID NO: 30 (Cx45 alfa humana)

GSNKSTASSKSPDPKNSVWI

SEQ ID NO: 31 (Cx45 alfa de pollo)

GSNKSSASSKSGDGKNSVWI

SEQ ID: 32 (Cx46 alfa humana)

GRASKASRASSGRARPEDLAI

SEQ ID: 33 (Cx46.6 alfa humana)

GSASSRDGKTVWI

SEQ ID NO: 34 (Cx36 alfa de chimpance)

PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO: 35 (Cx36 alfa de pollo)

PRMSMPNFGRTQSSDSAYV

SEQ ID NO: 36 (Cx47 alfa humana)

PRAGSEKGSASSRDGKTTVWI

SEQ ID NO: 37 (Cx40 alfa humana)

GYHSDKRRLSKASSKARSDDLSV

SEQ ID NO: 38 (Cx50 alfa humana)

PLSRLSKASSRARSDDLTV

SEQ ID NO: 39 (Cx59 alfa humana)

PNHVVSLTNNLIGRRVPTDLQI

SEQ ID NO: 40 (Cx33 alfa de rata)

PSCVSSSAVLTTICSSDQWPVGLSSFYM

SEQ ID NO: 41 (Cx44 alfa de oveja)

GRSSKASKSSGGRARAADLAI

SEQ ID NO: 42 (Cx26 beta humana)

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LCILLIRYCSGKSKKPV SEQ ID: 43 (Cx37 alfa humana)

G QK PP SRPS SSAS K KQ*YV

SEQ ID 44: (variante de Cx43 conservativa)

SSRASSRASSRPRPDDLEV

SEQ ID 45: (variante de Cx43 conservativa)

RPKPDDLEI,

SEQ ID 46: (variante de Cx43 conservativa) SSRASSRASSRPKPDDLEI,

SEQ ID 47: (variante de Cx43 conservativa) RPKPDDLDI

SEQ ID 48: (variante de Cx43 conservativa)

SSRASSRASSRPRPDDLDI

SEQ ID 49: (variante de Cx43 conservativa)

SSRASTRASSRPRPDDLEI

SEQ ID 50: (variante de Cx43 conservativa)

RPRPEDLEI

SEQ ID 51: (variante de Cx43 conservativa) SSRASSRASSRPRPEDLEI,

SEQ ID 52: (variante de Cx45 conservativa) GDGKNSVWV

SEQ ID 53: (variante de Cx45 conservativa)

SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV

SEQ ID 54: (variante de Cx37 conservativa)

GQKPPSRPSSSASKKLYV

SEQ ID NO: 55 (peptido de control no activo)

RQPKIWFPNRRKPWKIELDDPRPR

SEQ ID NO: 56 (VIH-Tat/ACT 1)

GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI

SEQ ID NO: 57 (penetratina/ACT 1)

RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI

SEQ ID NO: 58 (Antp-3A/ACT 1)

RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI

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SEQ ID NO: 59 (Tat/ACT 1)

RKKRRQRRR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 60 (buforina II/ACT 1)

TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 61 (transportano/ACT 1)

GWTLNSAGILLGKINKALAALAKKIL RPRPDDLEI SEQ ID NO: 62 (MAP/ACT 1)

KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI SEQ ID NO: 63 (K-FGF/ACT 1)

AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 64 (Ku70/ACT 1)

VPMLKPMLKE RPRPDDLEI SEQ ID NO: 65 (prion/ACT 1)

MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP RPRPDDLEI SEQ ID NO: 66 (pVEC/ACT 1)

LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI SEQ ID NO: 67 (Pep-1/ACT 1)

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI SEQ ID NO: 68 (SynB1/ACT 1)

RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI SEQ ID NO: 69 (Pep-7/ACT 1)

SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI SEQ ID NO: 70 (HN-1/ACT 1)

TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI

SEQ ID NO: 72 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 363 de Cx43 humana)

KGKSDPYHATSGALSPAKDCGSQKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVT

GDRNNSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDF'PDD

NQNSKKLAAGHELQPLAIVD

SEQ ID NO: 73 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 362 de Cx43 de pollo)

KTDPYSHSGTMSPSKDCGSPKYAYYNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTGDRNNSSCRNYNKQAS

EQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAGPFDFADEHQNTKKLASGHELQPLTIVDGRP

SEQ ID NO: 74 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 377 de Cx45 humana)

LGFGTIRDSLNSKRRELEDPGAYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQIQYTELSNAKIAYKQNKANT

AQEQQYGSHEENLPADLEALQREIRMAQERLDLAVQAYSHQNNPHGPREKKAKV

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SEQ ID NO: 75 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 375 de Cx45 de pollo)

GFGTIRDTLNNKRKELEDSGTYNYPFTWNTPSAPPGYNIAVKPDQMQYTELSNAKMAYKQNKANI

AQEQQYGSNEENIPADLENLQREIKVAQERLDMA1QAYNNQNNPGSSSREKKSKA.

SEQ ID NO: 76 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 313 de Cx37 humana)

PYLVDCFVSRPTEKTIFItFMLVVGLISLVLNLLELVHLLCRCLSRGMRARGGQDAPPTQGTSSDPY

TDQVFFYLPVGQGPSSPPCPTYNGLSSSEQNWANLTTEERLASSRPPLFLDPP

SEQ ID NO: 77 (residuos 20 a 120 que flanquean al aminoacido 258 de Cx33 de rata)

imagen2

SEQ ID NO: 78 (protema fluorescente verde potenciada)

MVSKGEELFTGWPSLVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT

TGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVGERTIF

FKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKG1DFKEDGNILGHKLEYNYNSHN

VYIMADKOKNGIKVNFKtRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH

YLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

SEQ ID NO: 79 (ACT 2)

CCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCCGAC GACCTGGAGATC SEQ ID NO: 80 (ACT1)

CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGATC SEQ ID NO: 81 (ACT 3)

CGGCCCCGGCCCGACGACCTGGAGGTG SEQ ID NO: 82 (ACT 4)

CGGCCCCGGCCCGACGACGTGCCCGTG SEQ ID NO: 83 (ACT 5)

AAGGCCCGGTCCGACGACCTGTCCGTG SEQ ID NO: 84 (Antp)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAG AAG SEQ ID NO: 85 (Antp/ACT 2)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAG

AAGCCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGGCCTCCTCCCGGCCCCGGCCC

GACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO: 86 (Antp/ACT 1)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGGCCCCGGCCC

GACGACCTGGAGATC

SEQ ID NO: 87 (Antp/ ACT 3)

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CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGGCCCCGGCCC

GACGACCTGGAGGTG

SEQ ID NO: 88 (Antp/ ACT 4)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGCGGCCCCGGCCC

GACGACGTGCCCGTG

SEQ ID NO: 89 (Antp/ ACT 5)

CGGCAGCCCAAGATCTGGTTCCCCAACCGGCGGAAGCCCTGGAAGAAGAAGGCCCGGTCC

GACGACCTGTCCGTG

SEQ ID NO: 90 (Cx43 alfa de pez cebra)

PCSRASSRMSSRARPDDLDV

SEQ ID NO: 91 (Cx36 alfa de pollo)

PRVSVPNFGRTQSSDSAYV

La presente invencion se refiere a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular para su uso en un metodo de tratamiento, en el que el polipeptido se recubre sobre un implante medico o material de tratamiento de heridas.

Tambien se divulga en el presente documento la siguiente materia:

Divulgacion adicional.

1. Un polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos carboxilo terminal de una conexina alfa, o una variante conservativa del mismo, en el que el polipeptido no comprende la protema conexina alfa de longitud completa.

2. El polipeptido de la realizacion 1, en el que el polipeptido comprende 4 hasta 30 aminoacidos contiguos del extremo carboxilo terminal de la conexina alfa.

3. El polipeptido de la realizacion 1, en el que el polipeptido comprende:

(a) un motivo de union de PDZ de tipo II al extremo carboxilo terminal;

(b) un motivo de bisagra proximal al motivo de union de PDZ, que comprende residuos de prolina, glicina, o prolina y glicina; y

(c) residuos cargados positivamente (K, R, D, E) proximales a los residuos de bisagra.

4. El polipeptido de la realizacion 1, en el que la conexina alfa se selecciona de un grupo que consiste en conexina 39, conexina 40.1, conexina 47, conexina 46.6, conexina 30.2, conexina 31.9, conexina 44, conexina 33, conexina 36, conexina 35, conexina 37, conexina 39, conexina 39.9, conexina 40, conexina 42 de pollo, conexina 45.6, conexina 43, conexina 43.4, conexina 44.2, conexina 44.1, humana, conexina 45.6, conexina 46, conexina 56, conexina 49, conexina 50.

5. El polipeptido de la realizacion 1, en el que tras la lesion tisular el polipeptido reduce la inflamacion, promueve la cicatrizacion, reduce la formacion de cicatrices, aumenta la resistencia a la traccion y promueve la regeneracion tisular compleja.

6. El polipeptido de la realizacion 1, en el que el polipeptido inhibe la union de una protema complejante de conexina al extremo carboxilo terminal de una conexina alfa, en el que la protema complejante de conexina es ZO-I o protema sobreexpresada de nefroblastoma (NOV).

7. El polipeptido de la realizacion 4, en el que la conexina alfa es Cx43.

8. El polipeptido de la realizacion 7, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SeQ ID nO: 2.

9. El polipeptido de la realizacion 2, en el que el polipeptido comprende una sustitucion de aminoacido conservativa

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dentro de los aminoacidos 4 a 30 del extremo carboxilo terminal de la conexina alfa.

10. El polipeptido de la realizacion 9, en el que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 1.

11. El polipeptido de la realizacion 9, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID nO: 4.

12. El polipeptido de la realizacion 4, en el que la conexina alfa es Cx40.

13. El polipeptido de la realizacion 12, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 5.

14. El polipeptido de la realizacion 15, que comprende ademas una secuencia de internalizacion celular.

15. El polipeptido de la realizacion 14, en el que la internalizacion celular comprende una secuencia de aminoacidos de una protema seleccionada de un grupo que consiste en Antennapedia, TAT, VIH-Tat, penetratina, Antp-3A (mutante de Antp), buforina II, transportano, MAP (peptido anfipatico modelo), K-FGF, Ku70, prion, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HNI, BGSC (bis-guanidinio-espermidina-colesterol) y BGTC (bis-guanidinio-tren-colesterol).

16. El polipeptido de la realizacion 15, en el que la secuencia de aminoacidos es de Antennapedia y comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 7.

17. El polipeptido de la realizacion 16, que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

18. Un acido nucleico aislado que codifica para el polipeptido de la realizacion 1.

19. El acido nucleico aislado de la realizacion 18, en el que el polipeptido codificado comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SeQ ID NO: 1, SeQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

20. El acido nucleico aislado de la realizacion 19, que comprende la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 6.

21. Un acido nucleico aislado que codifica para el polipeptido de la realizacion 15.

22. El acido nucleico aislado de la realizacion 21, en el que el polipeptido codificado comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID nO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ iD NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.

23. El acido nucleico aislado de la realizacion 22, que comprende la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 13.

24. El acido nucleico aislado de la realizacion 19 o 22, en el que el acido nucleico esta operativamente unido a una secuencia de control de la expresion.

25. Un vector que comprende el acido nucleico de la realizacion 19 o 22 operativamente unido a una secuencia de control de la expresion.

26. El vector de la realizacion 25, en el que el vector es un virus.

27. Una celula que comprende el acido nucleico de la realizacion 19 o 22.

28. Una celula que comprende el vector de la realizacion 25.

29. Un organismo que comprende el acido nucleico de la realizacion 19 o 22.

30. Un organismo que comprende el vector de la realizacion 25.

31. Una composicion que comprende el polipeptido de la realizacion 1 o 14 en aceptable.

32. Una composicion que comprende el acido nucleico de realizacion 19 o 22 en aceptable.

33. Un metodo de promocion de la cicatrizacion tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

un vehfculo farmaceuticamente un vehfculo farmaceuticamente

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34. Un metodo de reduccion de la formacion de tejido cicatricial tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

35. Un metodo de promocion de la regeneracion tisular tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

36. Un metodo de aumento de la resistencia a la traccion tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

37. Un metodo de potenciacion de la diferenciacion de celulas madre tras lesion tisular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

38. Un metodo de reduccion de la inflamacion en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

39. Un metodo de reduccion de la formacion de tejido fibrotico en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

40. Un metodo de inhibicion de la proliferacion de una celula transformada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

41. Un metodo de inhibicion de la migracion metastasica de una celula transformada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composicion de la realizacion 31 o 32.

42. El metodo de una cualquiera de las realizaciones 33-37, en el que la lesion tisular resulta de un grupo que consiste en una raspadura, corte, herida de laceracion, herida de aplastamiento, herida de compresion, herida de estiramiento, herida de mordedura, raspon, herida de bala, lesion de explosion, perforacion corporal, herida de punalada, herida de quemadura, quemadura por viento, quemadura solar, quemadura qmmica, herida quirurgica, intervencion quirurgica, intervencion medica, rechazo del huesped tras injerto de celula, tejido u organo, efecto farmaceutico, efecto secundario farmaceutico, ulcera de decubito, lesion por radiacion, herida cutanea cosmetica, lesion de organos internos, proceso de enfermedad (por ejemplo, asma, cancer), infeccion, agente infeccioso, proceso de desarrollo, proceso de maduracion (por ejemplo, acne), anomalfa genetica, anomalfa del desarrollo, toxina ambiental, alergeno, lesion en el cuero cabelludo, lesion facial, lesion en la mandfbula, lesion en el pie, lesion en los dedos del pie, lesion en los dedos de la mano, lesion osea, lesion en los organos sexuales, lesion articular, lesion en los organos excretorios, lesion ocular, lesion corneal, lesion muscular, lesion en el tejido adiposo, lesion pulmonar, lesion en las vfas respiratorias, hernia, lesion anal, hemorroides, lesion en el ofdo, lesion en la retina, lesion cutanea, lesion abdominal, lesion en los brazos, lesion en las piernas, lesion atletica, lesion en la espalda, lesion de nacimiento, lesion de nacimiento prematuro, mordedura toxica, picadura, lesion en los tendones, lesion en los ligamentos, lesion cardiaca, lesion en las valvulas cardiacas, lesion en el sistema vascular, lesion en el cartflago, lesion en el sistema linfatico, traumatismo craneoencefalico, dislocacion, perforacion esofagica, fistula, lesion en las unas, cuerpo extrano, fractura, congelacion, lesion en las manos, trastorno de estres termico, laceracion, lesion en el cuello, automutilacion, choque, lesion de tejidos blandos traumatica, lesion en la medula espinal, lesion espinal, esguince, distension, lesion en los tendones, lesion en los ligamentos, lesion en el cartflago, lesion toracica, lesion en los dientes, traumatismo, lesion en el sistema nervioso, envejecimiento, aneurisma, accidente cerebrovascular, lesion en el tracto digestivo, infarto y lesion isquemica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Listado de secuencias

<110> MUSC Foundation for Research Development

<120> COMPOSICIONES Y METODOS PARA PROMOVER LA CICATRIZACION DE HERIDAS Y LA REGENERACION TISULAR

<130> 144 610

<150> Documento US 60/638.366 <151>

<150> Documento US 60/671.796 <151>

<160> 90

<170> FastSEQ para Windows version 4.0

<210> 1 <211> 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 1

pro ser ser 1

Asp Leu Glu

<210> 2 <211>9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 2

<210> 3 <211>9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 3

<210> 4 <211>9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

imagen3

imagen4

Arg Ala ser ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp 5 10 15

lie 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400>4

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro val 1 5

<210>5 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400>5

Lys Ala Arg ser Asp Asp Leu ser val 1 5

<210>6 <211> 27 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 6

agacctcggc ctgatgacct ggagatt

<210> 7 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400>7

Arg Gin Pro Lys lie rrp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15

<210>8 <211> 36 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400>8

Arg Gin Pro Lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 .10 15

Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp 20 25 30

Asp Leu Glu lie 35

<210> 9 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 9

27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Arg Gin Pro lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys lys 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

<210> 10 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 10

Arg Gin Pro Lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu val 20 25

<210> 11 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 11

Arg Gin Pro Lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val 20 25

<210> 12 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 12

Arg Gin Pro Lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 15 10 15

Lys Ala Arg ser Asp Asp Leu ser val 20 25

<210> 13 <211> 74 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 13

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gcccggcccg acgacctgga gate

<210> 14 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

60

74

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 14

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Pro Pro Gin 15 10

<210> 15 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 15

Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15

<210> 16 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 16

Arg Gin lie Ala lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 15 10 15

<210> 17 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 17

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5

<210> 18 <211> 21 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 18

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro val Gly Arg val His 15 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys 20

<210> 19 <211> 26 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<400> 19

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr 1 5

Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys lie 20 25

<210> 20 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 20

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 15 10 15

Leu Ala

Leu Leu Gly Lys lie Asn Lys 10 15

Leu

<210> 21 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 21

Ala Ala val Ala Leu Leu Pro Ala val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15

<210> 22 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 22

Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu 1 5 10

<210> 23 <211> 28 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 23

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 15 10 15

Thr Asp val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25

<210> 24 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 24

Leu Leu lie lie Leu Arg Arg Arg lie Arg Lys Gin Ala His Ala His 15 10 15

ser Lys

<210> 25 <211> 21 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 25

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gin Pro Lys 15 10 15

Lys Lys Arg Lys val

<210> 26 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 26

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 15 10 15

Gly Arg

<210> 27 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 27

ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met val ser Leu Ala cys Gin Tyr 15 10 15

<210> 28 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 28

Thr ser Pro Leu Asn lie His Asn Gly Gin Lys Leu

15 10

<210> 29 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 29

Pro Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Glu lie

<210> 30 <211> 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 30

Gly Ser Asn Lys ser Thr Ala Ser Ser Lys ser Pro Asp Pro Lys Asn 15 10 15

Ser val Trp lie 20

<210> 31 <211> 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 31

Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ala ser Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Asn 15 10 15

Ser Val Trp lie 20

<210> 32 <211> 21 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 32 ...

Gly Arg Ala Ser Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ser Gly Arg Ala Arg Pro 15 10 15

Glu Asp Leu Ala lie

20

<210> 33 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 33

Gly Ser Ala Ser Ser Arg Asp Gly Lys Thr val Trp lie 1 5 10

<210> 34 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 34

Pro Arg val Ser val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gin ser ser Asp Ser 15 10 15

Ala Tyr val

<210> 35 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 35

pro Arg Met ser Met Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gin Ser Ser Asp Ser 15 10 15

Ala Tyr Val

<210> 36 <211> 21 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 36

Pro Arg Ala Gly Ser Glu Lys Gly Ser Ala Ser ser Arg Asp Gly Lys 15 10 15

Thr Thr val Trp lie 20

<210> 37 <211> 23 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <4°0>37_

Gly Tyr His Ser Asp Lys Arg Arg Leu ser Lys Ala ser Ser Lys Ala 15 10 15

Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val 20

<210> 38 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 38..........

Pro Leu Ser Arg Leu Ser Lys Ala Ser Ser Arg Ala Arg Ser Asp Asp 15 10 15

Leu Thr Val

<210> 39

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<211> 22 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400j> 39 __

Pro Asn His Val val ser Leu Thr Asn Asn Leu lie Gly Arg Arg val 15 10 15

Pro Thr Asp Leu Gin lie 20

<210> 40 <211> 29 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 40

pro ser cys val 1

Asp Gin val val 20

<210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 41

Gly Arg Ser Ser Lys Ala Ser Lys ser ser Gly Gly Arg Ala Arg Ala 15 10 15

Ala Asp Leu Ala lie 20

<210> 42 <211> 17 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 42

Leu Cys Tyr Leu Leu lie Arg Tyr Cys Ser Gly Lys Ser Lys Lys Pro 15 10 15

Val

<210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

Ser Ser Ser Ala Val Leu Thr Thr lie Cys ser ser 5 10 15

Pro val Gly Leu Ser Ser Phe Tyr Met

25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Gly Gin Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Gin 15 10 15

Tyr val

<210> 44 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 44

Ser ser Arg Ala Ser ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Glu val

<210> 45 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 45

Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Glu lie 1 5

<210> 46 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 46

Ser ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Lys Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Glu lie

<210> 47 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 47

Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Asp lie 1 5

<210> 48 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 48

Ser 5er Arg Ala Ser Ser Arg Ala 5er Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Asp lie

<210> 49 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 49

Ser Ser Arg Ala Ser Thr Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Glu lie

<210> 50 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 50

Arg Pro Arg Pro Glu Asp Leu Glu lie 1 5

<210> 51 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 51

ser ser Arg Ala ser ser Arg Ala ser ser Arg Pro Arg Pro Glu Asp 15 10 15

Leu Glu lie

<210> 52 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 52

Gly Asp Gly Lys Asn Ser Val Trp Val 1 5

<210> 53 <211> 23 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ser Lys Ala Gly Ser Asn Lys ser Thr Ala ser ser Lys ser Gly Asp 15 10 15

Gly Lys Asn Ser Val Trp Val

20

<210> 54 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 54

Gly Gin Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Leu 15 10 15

Tyr val

<210> 55 <211> 24 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 55

Arg Gin Pro Lys lie Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys lie 15 10 15

Glu Leu Asp Asp Pro Arg Pro Arg 20

<210> 56 <211> 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = Constructo sintetico <400> 56

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Pro Pro Gin Arg Pro Arg Pro Asp

1 5 10 1 15

Asp Leu Glu lie 20

<210> 57 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 57

Arg Gin lie Lys lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

<210> 58 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico

<400> 58

Arg Gin lie Ala lie Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

<210> 59 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 59

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5

Glu lie

Arg pro Arg Pro Asp Asp leu 10 15

<210> 60 <211> 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 60

Thr Arg ser 1

Arg Leu Leu

<210> 61 <211> 35 <212> PRT <213> Secuencia artificial

Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro val Gly Arg val His 5 10 15

Arg Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25 30

<220>

<400> 61

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys lie Asn Lys 15 10 15

Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys lie Leu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 20 25 30

Leu Glu lie 35

<210> 62 <211> 27 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Lys 1: Leu Al a Leu Lys 5 Leu Ala Leu Lys

Leu: Ala Arg Pro 20 Arg Pro Asp Asp Leu 25

Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 10 15

Glu lie

<210> 63 <211> 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 63

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15

Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

<210> 64 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 64

val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 15 10 15

Leu Glu lie .

<210> 65 <211> 37 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 65 Met Ala 1

Thr Asp Asp Asp

Asn: Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe val


: 5 10

val: Gly Leu cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Arg

: 20 25

Leu: Glu lie

35

Thr Met Trp 15

Pro Arg Pro 30

<210> 66 <211> 27 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 66

leu leu lie lie Leu Arg Arg Arg He Arg Lys Gin Ala His Ala His

1 5 10

Ser Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

<210> 67 <211> 30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 67

lys Glu Thr Trp

Lys Lys Arg Lys 20

<210> 68 <211> 27 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp ser Gin Pro Lys 5 10 15

Val Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 25 30

<220>

<400> 68

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10

Gly Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20 25

Ser Thr

ser Thr 15

<210> 69 <211> 24 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 69

Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gin Tyr Arg 15 10 15

Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu lie 20

<210> 70 <211> 21 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 70

Thr Ser Pro Leu Asn lie His Asn Gly Gin Lys Leu Arg Pro Arg Pro 15 10 15

Asp Asp Leu Glu lie 20

<210> 71 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

Lys: Gly Lys Ser Asp Pro Tyr Hi s Ala Thr Ser Gly Al a Leu Ser Pro

1: 5 10 15

Ala: Lys Asp Cys Gly Ser Gin Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly cys Ser



: 20 25 30

Ser: Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu


: 35 40 45

val: Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gin

: 50 55 60

Al a: Ser Gl u Gin Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Gl U Gin Asn Arg Met

65: 70 75 80

Gly: Gin Ala Gly Ser Thr lie Ser Asn ser His Ala Gin Pro Phe Asp


: 85 90 95

phe: Pro Asp Asp Asn Gin Asn Ser Lys Lys Leu Ala Al a Gly His Gl U


: 100 105 110

Leu: Gin Pro Leu Ala lie val Asp


: 115 120

<210> 72 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 72

Lys: Thr Asp Pro Tyr Ser Hi s ser Gly Thr Met Ser Pro Ser Lys Asp

1: 5 10 15

Cys: Gly Ser Pro Lys Tyr Al a Tyr Tyr Asn Gly Cys Ser ser Pro Thr


: 20 25 30

Ala: Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu val Thr Gly


: 35 40 45

Asp: Arg Asn Asn ser Ser cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gin Ala Ser Glu

: 50 55 60

Gin: Asn Trp Al a Asn Tyr ser Al a Gl u Gin Asn Arg Met Gly Gl n Ala

,65: 70 75 80

Gly: ser Thr lie Ser Asn Ser Hi S Ala Gin Pro Phe Asp Phe Ala Asp




: 85 90 95

Gl U: Hi s Gin Asn Thr Lys Lys Leu Al a Ser Gly His Glu Leu Gl n Pro



: 100 105 110

Leu: Thr lie val Asp Gin Arg Pro


: 115 120

<210> 73 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 73

5

10

15

20

Leu: Gly Phe Gly Thr lie Arg Asp Ser Leu Asn Ser Lys Arg Arg Glu

1: 5 10 15

Leu: Glu Asp Pro Gly Ala Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro



: 20 25 30

Ser: Al a Pro Pro Gly Tyr Asn lie Ala val Lys Pro Asp Gin He Gin


: 35 40 45

Tyr: Thr Glu Leu Ser Asn Al a Lys lie Al a Tyr Lys Gin Asn Lys Ala

: 50 55 60

Asn: Thr Ala Gin Glu Gin Gin Tyr Gly ser His Glu Glu Asn Leu pro

65: 70 75 80

Ala: ASP Leu Glu Ala Leu Gl n Arg Glu lie Arg Met Ala Gl n Glu Arg




: 85 90 95

Leu: Asp Leu Ala Val Gin Ala Tyr Ser Hi s Gin Asn Asn Pro Hi s Gly


: 100 105 110

Pro: Arg Glu Lys Lys Ala Lys val

: 115 120

<210> 74 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 74

Gly: Phe Gly Thr lie Arg Asp Thr Leu Asn Asn Lys Arg Lys Gl U Leu

1: 5 10 15

Glu: Asp ser Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro Ser


: 20 25 30

Ala: Pro Pro Gly Tyr Asn lie Al a Val Lys Pro Asp Gin Met Gin Tyr


: 35 40 45

Thr: Glu Leu Ser Asn Ala Lys Met Ala Tyr Lys Gin Asn Lys Al a Asn

: 50 55 60

lie: Ala Gin Glu Gin Gin Tyr Gly ser Asn Glu Glu Asn lie Pro Ala

65: 70 75 80

Asp: Leu Glu Asn Leu g1 n Arg Gl U lie Lys val Al a Gl n Gl U Arg Leu



: 85 90 95

Asp: Met Ala lie Gl n Ala Tyr Asn Asn Gin Asn Asn Pro Gly Ser Ser


: 100 105 110

ser: Arg Glu Lys Lys ser Lys Ala


: 115 120

<210> 75 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 75

Pro Tyr leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr lie 15 10 15

phe lie lie Phe Met Leu Val val Gly Leu lie Ser Leu val Leu Asn 20 25 30

10

Leu Leu Glu Leu Val His Leu Leu Cys Arg Cys Leu Ser Arg Gly Met 35 40 45

Arg Ala Arg Gin Gly Gin Asp Ala Pro Pro Thr Gin Gly Thr ser ser 50 55 60

Asp Pro Tyr Thr Asp Gin val Phe Phe Tyr Leu Pro val Gly Gin Gly

65 70 75 80

Pro Ser Ser Pro Pro Cys Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Glu

85 90 95

Gin Asn Trp Ala Asn Leu Thr Thr Glu Glu Arg Leu Ala Ser ser Arg 100 105 110

Pro Pro Leu Phe Leu Asp Pro Pro 115 120

<210> 76 <211> 120 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 76

Cys: Gly Ser Lys Glu Hi s Gly Asn Arg Lys Met Arg Gly Arg Leu Leu

1: 5 10 15

Leu: Thr Tyr Met Ala ser ll e Phe Phe Lys ser val Phe Glu Val Al a


: 20 25 30

Phe: Leu Leu lie Gin Trp Tyr Leu Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Ala val


: 35 40 45

Tyr: lie cys Glu Gin Ser Pro Cys Pro Hi s Arg Val Asp Cys Phe Leu

: 50 55 60

Ser: Arg Pro Thr Glu Lys Thr lie Phe lie Leu Phe Met L€U Val val

65: 70 75 80

Ser: Met Val Ser Phe Val Leu Asn Val lie Glu Leu Phe Tyr Val Leu




: 85 90 95

Phe: Lys Ala lie Lys Asn Hi s Leu Gly Asn Glu Lys Glu Glu Val Tyr


: 100 105 110

cys: Asn pro val Glu Leu Gin Lys

: 115 120

<210> 77 15 <211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

20 <223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico

<400> 77

Met: Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly val val Pro lie Leu

1: 5 10 15

val: Gl U Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser val Ser Gly



: 20 25 30

Glu: Gly Glu Gly Asp Al a Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie


: 35 40 45

Cys: Thr Thr Gly Lys Leu Pro val Pro Trp Pro Thr Leu val Thr Thr

50: 55 60

Leu: Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Hi s Met Lys

65: 70 75 80

Gin: Hi s Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu



: 85 90 95

Arg: Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu


: 100 105 110

val: Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu val Asn Arg lie Glu Leu Lys Gly


: 115 120 125

lie: Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

: 130 135 140

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Asn: Tyr Asn Ser His Asn val Tyr He Met Ala Asp Lys Gin Lys
Asn

145: 150 155 160

Gly: He Lys Val Asn Phe Lys lie Arg Hi s Asn lie Gl U ASp Gly ser


: 165 170 175

val: Gin Leu Ala Asp Hi s Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly



: 180 185 190

Pro: Val Leu Leu Pro Asp Asn Hi s Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu


: 195 200 205

Ser: Lys Asp Pro Asn GlU Lys Arg Asp His Met val Leu Leu GlU Phe

: 210 215 220

Val: Thr Ala Al a Gly lie Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225: 230 235

<210> 78 <211> 60 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 78

ccctcctccc gggcctcctc ccgggcctcc tcccggcccc ggcccgacga cctggagatc

<210> 79 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 79

cggccccggc ccgacgacct ggagatc

<210> 80 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 80

cggccccggc ccgacgacce ggaggtg

<210> 81 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 81

cggccccggc ccgacgacgt gcccgtg

<210> 82 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

aaggcccggt ccgacgacct gtccgtg

27

<210> 83 <211> 48 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 83

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaag 48

<210> 84 <211> 108 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 84

cggcagccca gcctcctccc

agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcc ctcctcccgg 60

gggcctcctc ccggccccgg cccgacgacc tggagatc 108

<210> 85 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 85

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc gacgacctgg agate

<210> 86 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

60

75

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 86

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacctgg aggtg 75

<210> 87 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 87

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc gacgacgtgc ccgtg

<210> 88 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

60

75

5

10

15

20

25

30

60

75

<210> 89 <211> 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 89

Pro cys Ser Arg Ala Ser 5er Arg Met Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asp 15 10 15

Asp Leu Asp val 20

<210> 90 <211> 19 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencias artificiales; observacion = constructo sintetico <400> 90

Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gin Ser Ser Asp Ser 15 10 15

Ala Tyr Val

<400> 88

cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagaa ggcccggtcc gacgacctgt ccgtg

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y opcionalmente una secuencia o transportador de internalizacion celular para su uso en un metodo de tratamiento, en el que el

5

polipeptido se recubre sobre un implante medico o material de tratamiento de heridas.
2.

El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 esta unida en su extremo amino terminal a la secuencia o transportador de internalizacion celular.

10 3.

El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la secuencia o transportador de internalizacion celular es una secuencia de una protema seleccionada del grupo que consiste en antennapedia, TAT, VIH-TAT, penetratina, Antp-3A, buforina II, transportano, peptido anfipatico modelo (MAP), K-FGF, Ku70, prion, pVEC, Pep-1, SynB2, Pep-7, HN-1, bis-guanidinio-espermidina-colesterol (BGSC) y bis-guanidinio-tren-colesterol (BGTC).
15 4.

El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9.

LO o CM

El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el material se selecciona del grupo que consiste en un vendaje, una cinta quirurgica, una sutura, una grapa y un injerto.
6.

El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el implante medico se selecciona del grupo que consiste en protesis de extremidades, implantes de mama, implantes de pene, implantes testiculares, ojos artificiales, implantes faciales, articulaciones artificiales, protesis de valvulas

25

cardiacas, protesis vasculares, protesis dentales, protesis faciales, valvula de disco inclinado, valvula de bola enjaulada, protesis de ofdo, protesis de nariz, marcapasos, implantes cocleares y sustitutos de la piel.
7.

El polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el material o implante esta recubierto con un gel que contiene el polipeptido.
30 8.

El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 7, en el que el gel es un hidrogel.
9.

El polipeptido para su uso segun la reivindicacion 7, en el que el gel comprende entre 10 y 200 |iM del polipeptido.
35 10.

Un polipeptido para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento de heridas.