KR20070102998A - 상처 치유 및 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

상처 치유 및 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 환자에게서 조직 손상 후에 상처 치유 및 조직 재생을 촉진하기 위해 사용되는 조성물 및 방법이 제공된다.
조직 손상, 상처 치유, 조직 재생, 알파 코넥신 카르복시 말단 펩티드, ACT 펩티드, 반흔 조직 형성.

Description

상처 치유 및 조직 재생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROMOTING WOUND HEALING AND TISSUE REGENERATION}
본 발명은 상처 치유 및 재생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
평균적인 아이들이라면 도마뱀이 꼬리를 잃어도 결국엔 다른 꼬리가 자랄 것이라는 것을 알고 있다. 더욱이, 많은 하등 동물들이 꽤 복잡한 구조, 이를테면 사지와 기관 전체가 손상 후에도 재생할 수 있다는 것은 그런 사실을 연구하는 습관이 있는 아이들과 성인들 사이에서는 잘 알려져 있는 일이다. 예를 들어 물고기는 이전의 물고기 심장의 상당 부분이 잘려나간 후에도 이전 크기로 자라날 수 있다 (Poss et al., 2002). 이것은 심장이 대부분의 동물들이 시시각각 생존하는 데 얼마나 중요한 것인지를 생각한다면 아주 놀라운 일이다.
그러나 사람에게서 조직, 사지, 및 기관이 손상 후에 재생하는 것은 물고기처럼 그렇게 간단하지 않다. 사람 조직이 기계에 의한 상처로 손상되는 경우라면 질병 진행이나 다른 원인은 치유될 수 있지만, 복잡한 조직 구조와 기능은 전체적으로 복원된다 할지라도 흔한 일은 아니다. 그 대신 사람 및 다른 고등 척추동물에서 손상으로부터 거의 모든 조직의 회복은 반흔 조직이 형성되는 것이 특징이다. 그것의 가장 친숙한 실례는 피부가 베이거나 찰과상이 치유된 후에 남아 있는 변색되고 섬유가 형성된 반흔이다. 그보다 덜 알려져 있긴 하지만 뇌나 척수의 손상 후에 교질성 반흔 조직의 형성이 중추신경계에 대한 손상 후 신경 기능의 복원의 주요 장애물 중 하나라는 것이다 (Silver and Miller JH, 2004). 현재 손상 후의 그러한 반흔을 치료 또는 방지하고 복잡한 조직 구조와 기능의 재생을 촉진하는 방법은 없다.
본원에는 알파 코넥신(Connexin) (또는 본원에서 알파 코넥신 카르복시-말단 (ACT) 폴리펩티드로도 언급된다), 또는 그것의 보존성 변이체의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
본원에는 또한 환자에게서 조직 손상 후에 상처 치유를 촉진하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 환자에게 하나 또는 그 이상의 본원에서 제공되는 조성물 (예컨대 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터)을 약제학적으로 허용되는 담체에 넣어 투여하는 것으로 이루어진다.
개시된 방법 및 조성물의 추가의 장점은 아래의 설명의 일부에서 설명될 것이고, 부분적으로는 설명으로부터 이해될 것이며, 또는 개시된 방법 및 조성물의 실시에 의해 교시될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 장점은 첨부된 청구범위에서 특별하게 지적되는 요소 및 조합에 의해 이루어지고 얻어질 것이다. 전술한 일반적인 설명과 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이며 설명을 위한 것이고 청구되는 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는다는 것이 인지되어야 한다.
본 명세서에 포함되고 그것의 일부를 구성하는 첨부되는 도면은 개시된 방법 및 조성물의 여러 구체예를 설명하며, 상세한 설명과 함께 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하기 위해 제공된다.
도 1은 알파 코넥신 카르복시-말단 (ACT) 폴리펩티드가 배양된 신생 미오사이트에서 Cx43 갭 접합 형성의 정도를 증가시키는 것을 도시한다. 신생 쥐 심장으로부터의 미오사이트는 표준 프로토콜에 따라 조직 배양 접시 위에서 집밀도에 가까운 단층을 형성할 때까지 성장하였다. 배양물은 계속해서 추가로 5일 동안 (a) 30μM의 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2), (b) 30μM의 비-활성 대조 펩티드 (SEQ ID NO:55), 또는 (c) ACT 펩티드나 대조표준을 함유하지 않은 인산염 완충된 식염수 (PBS)를 함유한 배양 배지에서 배양이 계속되었다. 펩티드 또는 비히클 대조표준이 첨가된 배양 배지는 실험기간 동안 매 24시간 마다 교체하였다. (a)는 ACT 펩티드가 대조 조건 (b) 및 (c)와 비교하여 미오사이트들 간에 Cx43 갭 접합 형성의 정도를 크게 증가시켰음을 나타낸다. ACT 펩티드에 대한 반응으로 나타난 Cx43 갭 접합 형성의 이런 증가는 Cx43을 발현하는 많은 세포 유형과 공유된다.
도 2는 긁힘에 의해 손상된 형질전환된 섬유아세포 (NIH-3T3 세포)의 증식 및 이동을 ACT 펩티드가 억제하는 것을 도시한다. NIH-3T3 단층을 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)로 24시간 동안 사전-처리하고, p200 피펫 팁으로 "긁힘-손상"하였다. "긁힘 손상"을 계속해서 24시간 동안 (a, b) 30μM의 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2), (c, d) 30μM의 비-활성 대조 펩티드 (SEQ ID NO:55), 또는 (e, f) ACT 펩티드 또는 대조 펩티드가 함유되지 않은 비히클 대조 용액의 존재하에 "치유"를 계 속하였다. ACT 펩티드-처리된 세포의 "긁힘 손상"은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아있었고 (a), 소수의 세포 (큰 화살표)만이 초기 "긁힘 손상" 가장자리 내의 영역에서 (즉 작은 검은색 화살표로 표시된 영역 내에서) 재군집하였다. 대조적으로, (c)와 (e)의 제어 조건에서는, 대다수의 세포 (큰 화살표)가 초기 "긁힘 손상" 내에 있는 영역에서 재군집을 이루었다. "긁힘 손상"의 재군집은 부분적으로는 형질전환된 세포가 "긁힘 손상" 영역 안으로 서서히 이동하는 것을 통해 일어난다. 도 (b), (d), 및 (f)는 "긁힘 손상"에서 또는 손상 가장자리에서 세포의 증식하는 세포 핵 항원 (PCNA) 면역표지화를 보여준다. ACT 펩티드 처리된 세포 (b)는 바탕 및 비-증식과 일치하는 낮은 발광만을 보여준다. (d)와 (f)에 도시된 두 개의 제어된 조건에서만, 밝게 표지된 증식하는 세포를 볼 수 있다 (흰색 화살표). 이것은 ACT 펩티드가 또한 형질전환된 세포의 증식을 감소시켰음을 나타낸다.
도 3은 실험 세포 모델에서 손상 후에 ACT 펩티드에 의한 이동의 억제의 정량화를 도시한다. NIH-3T3 섬유아세포를 "긁힘 손상"시켰고, 도 2에서 설명한 바와 같이 30μM의 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)에 24시간 동안 또는 대조 조건에 노출시켰다. 도 (a)는 24-시간 기간의 마지막에 ACT 펩티드 및 비-활성 펩티드-처리된 대조 세포의 손상 가장자리를 도시한다. 세포를 형광 팔로이딘으로 표지하여 볼 수 있도록 하였다. ACT 펩티드-처리된 세포는 긁힘 손상 영역의 저 수준의 재군집을 나타낸다 (하얀색 이중 화살표). 도 (b)는 24시간 후에 긁힘 손상을 재군집하는 세포의 % 영역을 막대 그래프로 도시한 것이다. ACT 펩티드가 존재할 때 손상 영역의 세포의 감소는 극적이며, 이때 p < 0.000001이다.
도 4는 실험 세포 모델에서 상피 세포 WB-F344의 프로모터에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드의 발현이 긁힘 손상 후에 이동을 억제하는 것을 도시한다. WB-F344 세포는 암-유발 병원체로 분리된 쥐 간 세포를 처리함으로써 유도된 형질전환된 쥐 상피 셀라인이다 (Tsao et al., 1984; Hayashi et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al., 2001). WB-F344 세포를 cDNA 발현 플라스미드 구성물로 형질전환하고 표준 프로토콜을 사용하여 항생물질 하에서 선택하여, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:6) 또는 대조표준으로서 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 녹형광 단백질 (GFP) 폴리뉴클레오티드를 안전하게 발현한 셀라인을 생성하였다. ACT 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 GFP를 코드화하였다. ACT 펩티드의 발현은 그 자체로서 광현미경 상에서 표준 GFP 형광 광학에 의해 분석할 수 있었다. (a)와 (b)는 GFP와 ACT 펩티드 서열의 카르복시 말단을 함께 (a) 또는 GFP를 단독으로 (b) 발현하는 WB-F344 셀라인에서의 GFP 형광의 고배율 영상을 도시한다. WB-F344 셀라인의 집밀도에 가까운 단층을 "긁힘 손상"하였고, 24시간 동안 "치유"되도록 놓아두었다. 비히클 또는 비-활성 대조 펩티드로 처리된 NIH-3T3 세포의 대조표준 경우와 유사하게, GFP를 발현하는 대조 상피 셀라인이 긁힘 손상을 재군집하였다 (d). 그러나 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현한 상피 셀라인에서는 긁힘 손상의 재군집이 억제되었다 (도 4d).
도 5는 신생 마우스에서 ACT 펩티드가 절개로 인한 피부 손상 후에 염증을 감소시키고, 치유를 개선하며 반흔 형성을 감소시키는 것을 도시한다. 신생 마우스 새끼들을 히포테르미아를 사용하여 둔감하게 만들었다. 어깨뼈 사이의 등쪽 중앙선의 피부의 전 두께를 통하여 (바로 밑에 놓여있는 근육까지 내려감) 외과용 메스를 사용하여 길이가 4mm 되는 절개로 인한 피부 손상을 만들었다. 그 절개 손상부에 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)가 60μM 농도로 녹아있거나 없는 (대조표준) 20% 플루로닉 (F-127) 겔 용액 30㎕를 적용하였다. 대조표준 또는 ACT 펩티드 함유 겔을 초기 적용 후 계속해서 24시간 후에 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드 함유 겔을 적용하지 않았다. 48시간이 되었을 때 ACT 펩티드로 처리된 손상 (a)이 ACT 펩티드를 받지 않은 대조표준 (b)보다 상당히 더 닫혔고, 염증이 덜 생겼으며, 덜 팽창되었고 (상처 가장자리의 불룩한 곳을 보라), 대체로 외관상으로는 더 치유되었음이 주지되었다. 대조표준과 ACT 펩티드 및 대조표준으로 처리된 손상 사이의 이들 염증, 팽창 및 치유의 차이는 72시간 (c, d)과 96시간점 (e, f)에도 지속되었다. 7일째에는 ACT 펩티드 상처 (g)는 대조 펩티드-처리된 손상 (h)보다 더 외관상 매끄러웠고 반흔도 덜했다. 동일한 동물에 나타나는 동일한 손상의 영상은 치유 시간이 경과하는 동안 상이한 시간 점에서 나타남을 주지하여야 한다.
도 6은 ACT 펩티드가 성인 쥐에서 큰 절개로 인한 피부 손상 후에 염증을 감소시키고, 치유를 개선하며 반흔 형성을 감소시키는 것을 도시한다. 성인 쥐를 마취시키고, 어깨뼈 사이의 등쪽 중앙선 바로 아래에 있는 근육에 미세한 수술용 가 위로 8mm 폭의 원형 절개로 인한 피부 손상 부위를 만들었다 (즉 (a)와 (b)에 도시된 바와 같이). 손상의 경계선을 플라스틱 시트에서 8mm 폭의 원형 주형을 잘라 정하였다. 그런 다음 그 절개 손상부에 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)가 100μM 농도로 녹아있거나 없는 (대조표준) 30% 플루로닉 겔 용액 100㎕를 적용하였다. 대조표준 또는 ACT 펩티드 함유 겔을 계속해서 초기 적용 후 24시간 후에 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드 함유 겔을 적용하지 않았다. 14일의 시간이 경과할 동안 ACT 펩티드-처리된 큰 절개 손상 (a, c, e, g, i)은 ACT 펩티드를 받지 않은 대조 손상 (b, d, f, h, j)보다 더 빠르게 절개부가 닫혔고, 외관상 염증이 덜했으며, 더 빠르게 치유되었고, 반흔도 적었다. 실제로 14일째에도 대조 손상은 부분적으로 딱지를 나타냈고, 그것은 손상의 급성 치유가 불완전했음을 나타낸다 (j). 동일한 동물에 나타나는 동일한 손상의 영상은 치유 시간이 경과하는 동안 상이한 시간 점에서 나타남을 주지하여야 한다.
도 7은 ACT 펩티드가 성인 마우스에서 절개로 인한 피부 손상 후에 염증성 세포의 밀도를 감소시키는 것을 도시한다. 전체 상처 부위의 피부 생검을 도 6에서 설명한 실험에서 절개 손상 후에 24시간 정도가 지난 후 취하였다. 도 (a)와 (b)는 각각 대조표준과 ACT 펩티드로 처리된 손상의 상처 중심 가까이의 단면을 저배율로 도시한다. 정상적인 조직학적 외관의 피부로 경계가 정해진 상처 가장자리 (작은 화살표로 표시됨)를 두 경우에 모두 볼 수 있다. 검은색 사각형은 (a)와 (b)에서 좌측 상처 가장자리의 영상에 놓여 있다. 이들 두 사각형 안에 있는 조직학적 구조는 각각 대조표준 및 ACR 펩티드 처리된 조직에 대해 (c)와 (d)에서 좀 더 고배율 로 도시된다. 그 중에서 관심을 끄는 것은 손상의 기저부분으로부터 상처 가장자리와 손상 외면으로 돌출한 일렬배열된 섬유상 물질의 "칼라-형"조직이다 (화살표). 정렬된 섬유상 기판은 대조표준 손상 (d)에서 ACT 펩티드 처리된 손상 (c)보다 더 조직화된 외관을 가진다. 또한 ACT 펩티드-처리된 조직에서 섬유상 기판으로 뻗어가는 염증성 세포는 상당히 저밀도이다. 이것은 (c)와 (d)에 도시된 검은색 사각형 안ㅇ듸 조직학적 단면의 영역이 각각 고배율로 도시되는 (e)와 (f)에서 확인된다. 정렬된 섬유상 기판으로 뻗어가는 염증 세포로는 비만 세포, 호중구 및 대식세포가 있다. 이들 염증성 세포는 ACT 펩티드로 처리된 손상보다 대조표준 손상에서 훨씬 더 높은 밀도로 발생한다.
도 8은 ACT 펩티드가 성인 마우스에서 절개로 인한 피부 손상 후에 치유를 촉진하고, 반흔 형성을 감소시키며, 복잡한 조직 구조의 재생을 촉진하는 것을 도시한다. 도 6에서 설명한 실험에서 14일의 기간이 끝날 때, 전체 절개 손상의 피부 생검을 취하여 이들 피부 샘플로부터의 조직학적 단편을 H&E로 조직화학적으로 염색하였다. 도 (a)와 (b)는 각각 ACT 펩티드와 대조표준의 손상의 중심 가까이에 있는 단면을 저배율로 본 것이다. 정상적인 조직학적 외관을 가지는 피부로 경계가 정해진 상처 가장자리 (작은 화살표로 표시됨)를 두 경우에 모두 볼 수 있다. 검은색 사각형은 (a)와 (b)에서 각 손상의 중심 가까이에 있는 영상에 놓여 있다. 이들 두 사각형 안에 있는 조직학적 구조는 각각 ACR 펩티드 및 대조표준 처리된 조직에 대해 (c)와 (d)에서 좀 더 고배율로 도시된다. ACT 펩티드 처리된 손상 위치 내에 있는 조직이 상당히 더 큰 복잡성을 가지는 것이 명백하다. ACT 처리된 상처의 외 면에는, 비록 아직은 상처 중심 가까이에서는 상피세포가 상대적으로 얇지만 손상된 표면의 재-상피 형성이 완료됨을 나타내는 상피세포의 연속 층이 있다 (c). 모낭을 재생하는 것은 이미 치유된 손상을 덮고 있는 새로운 상피의 줄기 세포로부터 새롭게 분화하는 것에서 이미 알 수 있었다 (c, 작은 화살표). 비교하자면, 손상 표면의 재-상피형성은 불완전하고, 대조 손상 (d)의 상피에는 모낭이 재생된다는 신호가 없다. ACT 펩티드 처리된 손상된 피부의 재형성된 상피의 바로 아래에는 상당한 정상 구조적 복잡성이 회복된 것을 볼 수 있는데, 선과 같은 구조, 섬유상 및 연결 조직, 맥관 조직, 근육 및 비만 세포가 모두 그 증거이다 (a, c). 모낭을 보면 이 조직의 복잡성은 줄기 세포의 분화에 의해 재생되었다. 대조적으로 대조 손상에서는 균일하고 큰 플러그의 섬유상 반흔 조직을 보이는 상처 조직이 완전히 우세하고 (b, d), 이때 다른 조직 구조의 복잡성은 특별 이 반흔 조직에서는 나타나지 않았다.
도 9는 ACT 펩티드가 성인 마우스에서 절개로 인한 피부 손상 후에 염증을 감소시키고, 치유를 개선하며 반흔 형성을 감소시키는 것을 도시한다. 마취된 성인 마우스에 목과 (위쪽) 등에 미세한 수술용 가위로 2개의 작은 (5mm 직경) 절개로 인한 피부 상처를 만들었다. 손상의 경계는 플라스틱 시트에서 5mm 폭의 원형 주형을 잘라 경계를 정하였다. 100μM 농도로 용해된 ACT 펩티드 (ACT 2 - SQE ID NO:1; ACT 1 - SEQ ID NO:2; ACT 3 - SEQ ID NO:3; ACT 4 - SEQ ID NO:4; ACT 5 - SEQ ID NO:5)중 하나를 함유하였거나 함유하지 않은 (대조표준) 20% 플루로닉 겔의 용액 50-60㎕를 절개 손상부에 적용하였다. 대조표준 또는 ACT 펩티드-함유 겔을 초기 적용 후 24시간 후에 계속해서 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드-함유 겔을 적용하지 않았다. ACT 1 (e-h), ACT 2 (i-l), ACT 3 (m-p), 및 ACT 5 (u-x) 펩티드의 경우에 240 시간이 경과하는 동안 (10일) ACT를 받지 않은 대조 손상에 비해 (a-d) 절개로 인한 손상이 더 빠르게 닫혔고, 외관상 염증이 덜했으며, 더 빠르게 치유되었고, 반흔도 더 적었다. ACT 4 펩티드 (q-t)는 또한 시간이 경과하는 동안 가장 적절한 치유의 개선을 나타냈다. 동일한 동물의 동일한 상처는 치유 시간이 경과하는 동안 상이한 시간 지점에서 나타난다는 것이 주지되어야 한다.
도 10은 ACT 펩티드가 성인 쥐에서 침투로 인한 뇌의 손상 후에 교질성 반흔을 형성하는 성상세포의 수와 밀도를 감소시키는 것을 도시한다. (b)와 (c)는 ACT 펩티드 (100μM)와 비히클 겔 (b) 또는 대조표준으로서 콜라겐 비히클 겔 단독으로 채워진 중공 섬유막 (HFM) 이식편을 둘러싸고 있는 뇌조직 (피질)의 단면을 저배율로 도시한 것이다. 대조 조직에서 (c), HFM에 의해 유발된 손상 부위 가까이에서 고밀도의 면역표지된 GFAP-포지티브 성상세포가 관찰된다. 이들 세포의 밀도는 손상으로부터 약간 멀어지면 감소하는 것으로 나타난다. 대조적으로 훨씬 더 낮은 밀도의 GFAP-포지티브 성상세포가 ACT 펩티드로 채워진 HFM에 인접하여 관찰된다 (b). 실제로 GFAP 포지티브 세포의 수준은 정상적인 손상되지 않은 뇌 조직에서 볼 수 있는 것들과 다르지 않다. 도 (b)와 (c)에서 백색 사각형 안의 조직 영역은 도 (d)와 (e)에서 각각 고배율로 도시된다. ACT 펩티드에 의해 처리된 뇌 손상에서 (d), GFAP-포지티브 성상세포는 더 적을뿐 아니라 대조 손상에서 볼 수 있는 것들 보다 (e) 더 작기까지 하다.
도 11은 ACT 펩티드가 성인 쥐에서 침투로 인한 뇌 손상 후에 뉴런 유지 및 뉴런 재생을 촉진하는 것을 도시한다. (a)와 (b)는 뇌를 침투한 손상 후 1주일에 대조표준 콜라겐 비히클 겔 또는 ACT 펩티드와 비히클 겔로 채워진 HFM 이식편을 둘러싸고 있는 뇌조직 (피질)의 단면을 저배율로 도시한 것이다 (이식편 또는 손상 경계는 화살표로 표시된다). 대조 조직에서 (b), 고밀도의 면역표지된 GFAP-포지티브 성상세포 및 저밀도의 NeuN 면역표지된 뉴런이 HFM에 의해 유발된 손상 부위 가까이에서 관찰된다. 이들 세포의 밀도는 HFM으로부터 멀어질수록 각각 감소하고 증가하는 것으로 나타난다. 대조적으로 훨씬 더 낮은 밀도의 GFAP-포지티브 성상세포와 더 많은 수의 NeuN 면역표지된 뉴런이 ACT 펩티드로 채워진 HFM에 가까운 곳에서 (먼 곳에서) 관찰된다 (a). (a) 및 (b)에서 HFM에 가까운 영역은 각각 (c)와 (d)에서 고배율로 도시된다. 다시 말하면, 대조 조직 (d)은 GFAP-포지티브 성상세포의 밀도에서 현저한 증가를 보이고, NeuN-포지티브 뉴런의 감소된 밀도는 ACT 펩티드 처리된 조직에 비교할 때 관찰된다 (c). 상보하는 패턴은 ACT 펩티드를 함유한 HFM 가까이에서 관찰되는데, NeuN 포지티브 뉴런은 성상세포보다 우세한 것으로 나타난다 (c). 흥미롭게도, (c)에서 고배율로 도시된 것은 대조표준 (c)에 관련하여 분열 과정에서 고빈도의 뉴런을 드러낸다. 이것은 ACT 펩티드와 관련된 고밀도의 뉴런이 새로운 뉴런의 재생으로부터 온 것임을 시사한다.
개시된 방법 및 조성물은 본원에 포함되는 특정 구체예 및 실시예 및 도면에 대한 아래의 상세한 설명과 그것들의 전술한 설명 및 아래의 설명에 의해 더욱 쉽게 이해될 수 있다.
본원에는 알파 코넥신(Connexin) (또는 본원에서 알파 코넥신 카르복시-말단 (ACT) 폴리펩티드로도 언급된다), 또는 그것의 보존성 변이체의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드가 제공된다. 한 측면으로 조직 손상 후에 제공된 ACT 폴리펩티드는 염증을 감소하고, 치유를 촉진하며, 반흔을 감소시키고, 인장 강도를 증가시키며, 복잡한 조직 재생을 촉진한다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 코넥신으로부터 형성된 갭 접합 채널 응집체의 크기를 증가시킨다.
개시된 조성물 및 방법은 다른 언급이 없는 한 특정한 합성 방법, 특정한 분석 기법, 또는 특정한 시약에 제한되지 않으며, 그 자체도 변화될 수 있음이 인지되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구체예만을 설명할 목적으로 사용되며 제한하려는 의도는 없다는 것이 인지되어야 한다.
본원에는 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있고, 그것들과 함께 사용될 수 있으며, 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 또는 개시된 방법의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분들이 개시된다. 이들 및 다른 물질들은 본원에 개시되며, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 각각의 다양한 이들 화합물의 개별적이고 포괄적인 조합 및 교환에 대한 구체적인 참조가 명백하게 개시될 수 없어도, 각각이 본원에 구체적으로 포함되고 설명되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 만약 벡터가 개시되고 논의되며 프로모터를 포함한 많은 벡터 성분이 논의된다면, 각각의 이들 화합물의 프로모터와 다른 벡터 성분들 및 모든 조합 및 교환과 가능한 변형이, 그와는 반대로 구체적으로 언급되지 않는 한, 구체적으로 포함된다. 그러므로 만약 분자 A, B, 및 C 부류가 개시될 뿐 아니라 분자 D, E, 및 F 부류 및 조합 분자, 예컨대 A-D의 실례가 개시된다면, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라도, 각각이 개별적으로 및 포괄적으로 포함된다. 그러므로 본 실례에서 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F의 각각이 구체적으로 고려되며, A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 실례 조합 A-D의 개시 내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로 이들의 어떠한 하위세트나 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 그러므로 예를 들어 A-E, B-F, 및 C-E의 하위-그룹도 구체적으로 고려되며, A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 실례 조합 A-D의 개시 내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 이 개념은 본 출원의 모든 측면, 이를테면, 그것에 한정하는 것은 아니지만, 개시된 조성물의 제조 및 사용 방법의 각 단계들에도 적용된다. 그러므로 만약 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계들이 있다면, 이들 추가 단계의각각은 개시된 방법의 어떠한 구체적인 구체예 또는 구체예들의 조합에 의해 수행될 수 있으며, 각각의 그러한 조합은 구체적으로 고려되며 개시되는 것으로 간주되어야 한다는 것이 인지된다.
다양한 서열이 본원에 제공되는데, 이들 및 다른 서열들은 www.pubmed.gov의 Genbank에서 찾을 수 있다. 당업자들은 이들 서열의 불일치와 차이를 해결하는 방법과 다른 관련 서열에 대하여 특정 서열을 관련시키는 조성물 및 방법을 조정하는 방법을 알고 있다. 프라이머 및/또는 프로브가 본원에 개시된 정보가 제공되고 당해 기술분야에서 공지되어 있는 어떠한 서열에 대하여 디자인될 수 있다.
본원에 제공되는 폴리펩티드는 알파 코넥신의 카르복시-말단 대다수 아미노산을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있는데, 이 폴리펩티드는 전체-길이의 알파 코넥신 단백질을 포함하지는 않는다. 그러므로 한 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 세포질 N-말단 도메인을 포함하지 않는다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 두 개의 세포외재성 도메인을 포함하지 않는다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 네 개의 경막 도메인을 포함하지 않는다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 세포질 루프 도메인을 포함하지 않는다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 네 개의 경막 도메인에 근접한 알파 코넥신의 세포질 카르복실 말단 도메인의 서열의 일부를 포함하지 않는다. 카르복실 말단-대다수 아미노산으로부터 알파 코넥신의 일관되게 위치한 17에서 30까지의 일부 아미노산에는 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기가 있다 (표 2 참조). 예를 들어 사람 Cx43에 대해 아미노산 363에 있는 프롤린 잔기가 카르복실 말단 대다수 이소로이신으로부터 뒤로 19 아미노산만큼 뒤에 위치한다. 다른 실례에서는 병아리 Cx43에 대해 아미노산 362에 있는 프롤린 잔기가 카르복실 말단 대다수 이소로이신으로부터 뒤로 19 아미노산만큼 뒤에 위치한다. 다른 실례에서는 사람 Cx45에 대해 아미노산 377에 있는 글리신 잔기가 카르복실 말단 대다수 이소로이신으로부터 뒤로 19 아미노산만큼 뒤에 위치한다. 또 다른 실례에서는 쥐 Cx33에 대해 아미노산 258에 있는 프롤린 잔기가 카르복실 말단 대다수 메티오닌으로부터 뒤로 28 아미노산만큼 뒤에 위치한다. 그러므로 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 상기 보존된 프롤린 또는 글리신 잔기에 근접한 아미노산을 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 c-말단-대다수 4 내지 30 아미노산, 이를테면 알파 코넥신의 c-말단 대다수 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 아미노산을 포함할 수 있다.
제공된 펩티드의 알파 코넥신의 카르복시-말단 대다수 아미노산의 양 옆에는 비-알파 코넥신 또는 비-ACT 펩티드 코넥신 아미노산이 있을 수 있다. 플랭킹(양 옆의) 비-알파 코넥신 및 비-ACT 펩티드 코넥신 아미노산의 실례가 본원에 제공된다. 비-ACT 코넥신 아미노산의 실례는 사람 Cx43 (SEQ ID NO:72)의 카르복시-말단 20 내지 120 아미노산이다. 다른 실례는 병아리 Cx43 (SEQ ID NO:73)의 카르복시 말단 20 내지 120 아미노산일 것이다. 다른 실례는 사람 Cx45 (SEQ ID NO:74)의 카르복시 말단 20 내지 120 아미노산일 것이다. 다른 실례는 병아리 Cx45 (SEQ ID NO:75)의 카르복시 말단 20 내지 120 아미노산일 것이다. 다른 실례는 사람 Cx37 (SEQ ID NO:76)의 카르복시 말단 20 내지 120 아미노산일 것이다. 다른 실례는 쥐 Cx33 (SEQ ID NO:77)의 카르복시 말단 20 내지 120 아미노산일 것이다.
비-알파 코넥신의 실례는 증강된 녹형광 단백질의 239 아미노산 서열이다 (ACT1은 도 4에서 GFP에 기능적으로 융합된 것으로 도시된다; SEQ ID NO:78). 다른 측면으로, ACT1이 GFP의 239 아미노산 서열의 카르복시 말단에 융합될 때 기능적인 것으로 도시된다면 (예컨대 도 4), ACT 펩티드는 최소한 239 아미노산 까지의 비-코넥신 폴리펩티드로 플랭킹될 때 기능을 보유할 것으로 예상된다. 실제로 ACT 서열이 주어진 폴리펩티드의 유리 카르복시 말단으로서 유지되는 한, ACT 펩티드는 RRJT의 표적에 가까이 접근할 수 있다. 그러므로 ACT 펩티드 외에 239 아미노산을 초과하는 폴리펩티드는 손상 후에 염증의 감소, 치유의 촉진, 인장 강도의 증가, 반흔 형성의 감소 및 조직 재생의 촉진에 작용할 수 있다.
코넥신은 세포간 소통의 원인이 되는 갭 접합 채널의 하위-단위 단백질이다 (Goodenough and Paul, 2003). 뉴클레오티드 서열의 보존의 패턴을 기초로 하여, 코넥신 단백질을 코드화하는 유전자는 알파와 베타 코넥신 유전자로 불리는 두 부류로 나누어진다. 알파 코넥신의 카르복시-말단-대다수 아미노산 서열은 다수의 구별되고 보존된 외형을 특징으로 한다 (표 2 참조). 이런 조직화의 보존은 구별되는 3D 구조를 형성하고, 다수의 짝이 되는 단백질과 상호작용하고, 지질 및 막과의 상호작용을 중재하고, DNA를 포함한 핵산과 상호작용하고, 막 채널을 통과 및/또는 차단하고, 단백질 가수분해성 절단, 단백질 교차 결합, ADP-리보실화, 글리코실화 및 인산화에 대한 일치 모티프를 제공하는 ACT 펩티드의 능력과 양립한다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 카르복시-말단에 대한 상기 단백질의 결합을 정상적으로 중재하는 단백질의 도메인과 상호작용한다. 예를 들어 신장아세포종 과잉발현된 단백질 (NOV)은 Cx43 c-말단 도메인과 상호작용한다 (Fu et al, J Biol Chem. 2004 279(35):36943-50). 이 단백질 및 다른 단백질은 알파 코넥신의 카르복시-말단과 상호작용하며 나아가 다른 단백질과도 상호작용하여 거대분자 복합체를 형성하는 것으로 여겨진다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 분자 기계, 예컨대 Cx43 갭 접합 채널의 응집을 조절하는 데 포함된 것의 작동을 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 "억제하다", "억제하는 것", 및 "억제"는 활성, 반응, 조건, 질병, 또는 다른 생물학적 매개변수를 감소시키는 것을 의미한다. 이것은 다음과 같은 것들: 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 활성, 반응, 조건, 또는 질병의 완전한 상실을 포함할 수 있다. 그것은 또한 예를 들면 활성, 반응, 조건, 또는 질병이 천연 또는 대조 수준에 비교하여 10% 감소하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로 감소는 천연 또는 대조 수준에 비교하여 둘 사이의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 어떠한 양의 감소일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 ACT 서열은 어떠한 알파 코넥신으로부터 유래할 수 있다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드의 알파 코넥신 성분은 사람, 쥐, 개, 단공류, 유대류의 포유 동물, 영장류, 설치류, 고래류, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 척색동물, 원색동물의 코넥신 또는 다른 알파 코넥신으로부터 유래할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 코넥신의 ACT를 포함할 수 있다: 마우스 코넥신 47, 사람 코넥신 47, 사람 코넥신 46.6, 소 코넥신 46.6, 마우스 코넥신 30.2, 쥐 코넥신 30.2, 사람 코넥신 31.9, 개 코넥신 31.9, 양 코넥신 44, 소 코넥신 44, 쥐 코넥신 33, 마우스 코넥신 33, 사람 코넥신 36, 마우스 코넥신 36, 쥐 코넥신 36, 개 코넥신 36, 병아리 코넥신 36, 제브라피쉬(zebrafish) 코넥신 36, 모론(morone) 코넥신 35, 모론 코넥신 35, 시놉스(cynops) 코넥신 35, 테트라오돈(tetraodon) 코넥신 36, 사람 코넥신 37, 침팬지 코넥신 37, 개 코넥신 37, 크라이스툴루스(cricetulus) 코넥신 37, 마우스 코넥신 37, 메조크라이스투스 코넥신 37, 쥐 코넥신 37, 마우스 코넥신 39, 쥐 코넥신 39, 사람 코넥신 40.1, 제노푸스(Zenopus) 코넥신 38, 제브라피쉬 코넥신 39.9, 사람 코넥신 40, 침팬지 코넥신 40, 개 코넥신 40, 소 코넥신 40, 마우스 코넥신 40, 쥐 코넥신 40, 크라이스툴루스 코넥신 40, 병아리 코넥신 40, 사람 코넥신 43, 세르코피테쿠스(Cercopitecus) 코넥신 43, 오릭토라구스(Oryctolagus) 코넥신 43, 스퍼모필루스(Spermophilus) 코넥신 43, 크라이스툴루스 코넥신 43, 포도푸스(Phodopus) 코넥신 43, 쥐 코넥신 43, 수스(Sus) 코넥신 43, 메조크라이스투스 코넥신 43, 마우스 코넥신 43, 카비아(Cavia) 코넥신 43, 소 코넥신 43, 에리나세우스 코넥신 43, 병아리 코넥신 43, 제노푸스 코넥신 43, 오릭토라구스 코넥신 43, 사이프리누스(Cyprinus) 코넥신 43, 제브라피쉬 코넥신 43, 다니오 아에퀴핀나투스(Danio aequipinnatus) 코넥신 43, 제브라피쉬 코넥신 43.4, 제브라피쉬 코넥신 44.2, 제브라피쉬 코넥신 44.1, 사람 코넥신 45, 침팬지 코넥신 45, 개 코넥신 45, 마우스 코넥신 45, 소 코넥신 45, 쥐 코넥신 45, 병아리 코넥신 45, 테트라오돈 코넥신 45, 병아리 코넥신 45.6, 사람 코넥신 46, 침팬지 코넥신 46, 마우스 코넥신 46, 개 코넥신 46, 쥐 코넥신 46, 메조크라이스투스 코넥신 46, 크라이스툴루스 코넥신 46, 병아리 코넥신 56, 제브라피쉬 코넥신 39.9, 소 코넥신 49, 사람 코넥신 50, 침팬지 코넥신 50, 쥐 코넥신 50, 마우스 코넥신 50, 개 코넥신 50, 양 코넥신 50, 메조크라이스투스 코넥신 50, 크라이스툴루스 코넥신 50, 병아리 코넥신 50, 사람 코넥신 59, 또는 다른 알파 코넥신. 알파 코넥신에 대한 아미노산 서열은 당업계에 알려져 있으며, 하기 표 1에 승인 번호에 의해 확인된 것들을 포함한다.
표 1: 알파 코넥신
단백질 승인 번호 단백질 승인 번호
마우스 코넥신 47 NP_536702 포도푸스 코넥신 43 AAR33085
사람 코넥신 47 AAH89439 쥐 코넥신 43 AAH81842
사람 코넥신 46.6 AAB94511 수스 코넥신 43 AAR33087
소 코넥신 46.6 XP_582393 메조크라이스투스 코넥신 43 AAO61857
마우스 코넥신 30.2 NP_848711 마우스 코넥신 43 AAH55375
쥐 코넥신 30.2 XP_343966 카비아(Cavia) 코넥신 43 AAU06305
사람 코넥신 31.9 AAM18801 소 코넥신 43 NP_776493
개 코넥신 31.9 XP_548134 에리나세우스 코넥신 43 AAR33083
양 코넥신 44 AAD56220 병아리 코넥신 43 AAA53027
소 코넥신 44 I46053 제노푸스 코넥신 43 NP_988856
쥐 코넥신 33 P28233 오릭토라구스 코넥신 43 AAS89649
마우스 코넥신 33 AAR28037 사이프리누스 코넥신 43 AAG17938
사람 코넥신 36 Q9UKL4 제브라피쉬 코넥신 43 CAH69066
마우스 코넥신 36 NP_034420 다니오 아에퀴핀나투스 코넥신 43 AAC19098
쥐 코넥신 36 NP_062154 제브라피쉬 코넥신 43.4 NP_571144
개 코넥신 36 XP_544602 제브라피쉬 코넥신 44.2 AAH45279
병아리 코넥신 36 NP_989913 제브라피쉬 코넥신 44.1 NP_571884
제브라피쉬 코넥신 36 NP_919401 사람 코넥신 45 I38430
모론 코넥신 35 AAC31884 침팬지 코넥신 45 XP_511557
모론 코넥신 35 AAC31885 개 코넥신 45 XP_548059
시놉스 코넥신 35 BAC22077 마우스 코넥신 45 AAH71230
테트라오돈 코넥신 36 CAG06428 소 코넥신 45 XP_588395
사람 코넥신 37 I55593 쥐 코넥신 45 AAN17802
침팬지 코넥신 37 XP_524658 병아리 코넥신 45 NP_990834
개 코넥신 37 XP_539602 테트라오돈 코넥신 45 CAF93872
크라이스툴루스 코넥신 37 AAR98615 병아리 코넥신 45.6 I50219
마우스 코넥신 37 AAH56613 사람 코넥신 46 NP_068773
메조크라이스투스 코넥신 37 AAS83433 침팬지 코넥신 46 XP_522616
쥐 코넥신 37 AAH86576 마우스 코넥신 46 NP_058671
마우스 코넥신 39 NP_694726 개 코넥신 46 XP_543178
쥐 코넥신 39 AAN17801 쥐 코넥신 46 NP_077352
사람 코넥신 40.1 NP_699199 메조크라이스투스 코넥신 46 AAS83437
제노푸스 코넥신 38 AAH73347 크라이스툴루스 코넥신 46 AAS77618
제브라피쉬 코넥신 39.9 NP_997991 병아리 코넥신 56 A45338
사람 코넥신 40 NP_859054 제브라피쉬 코넥신 39.9 NP_997991
침팬지 코넥신 40 XP_513754 소 코넥신 49 XP_602360
개 코넥신 40 XP_540273 사람 코넥신 50 P48165
소 코넥신 40 XP_587676 침팬지 코넥신 50 XP_524857
마우스 코넥신 40 AAH53054 쥐 코넥신 50 NP_703195
쥐 코넥신 40 AAH70935 마우스 코넥신 50 AAG59880
크라이스툴루스 코넥신 40 AAP37454 개 코넥신 50 XP_540274
병아리 코넥신 40 NP_990835 양 코넥신 50 AAF01367
사람 코넥신 43 P17302 메조크라이스투스 코넥신 50 AAS83438
세르코피테쿠스 코넥신 43 AAR33082 크라이스툴루스 코넥신 50 AAR98618
오릭토라구스 코넥신 43 AAR33084 병아리 코넥신 50 BAA05381
스퍼모필루스 코넥신 43 AAR33086 사람 코넥신 59 AAG09406
크라이스툴루스 코넥신 43 AAO61858
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:90 또는 ID NO:91 또는 그것들의 보존성 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
알파 코넥신의 20-30 카르복시-말단-대다수 아미노산 서열은 구별되고 보존된 조직화를 특징으로 한다. 이런 구별되고 보존된 조직화는 타입 II PDZ 결합 모티프 (Φ-x-Φ; 식에서 x=어떠한 아미노산이고 Φ=소수성 아미노산; 예컨대 표 2, 굵은 활자) 및 이 모티프에 근접한 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 고빈도의 인-세린(S) 및/또는 인-트레오닌(T) 잔기; 및 고빈도의 포지티브 전하의 아르기닌(R), 라이신(K) 및 네거티브 전하의 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E) 아미노산을 포함할 것이다. 많은 알파 코넥신에 대해 P와 G 잔기는 카르복시-말단 타입 II PDZ 결합 모티프에 근접한 클러스터를 형성한 모티프 (예컨대 표 2의 이탤릭체)에서 일어난다. 대다수 알파 코넥신의 S와 T 인-아미노산은 또한 전형적으로 클러스터를 형성하고 반복적인 것으로 보이는 모티프 (예컨대 표 2의 밑줄)에서 조직화된다. 이런 조직화는 특히 Cx43에 대해 그러한데, Cx43에서 20 카르복실 말단-대다수 아미노산의 90%가 후자의 7개의 아미노산으로 구성된다. 서열이 고도로 보존된 추가의 실례로서 Cx43의 ACT 펩티드 조직화는 사람으로부터 어류에 이르기까지 고도로 보존된다 (예컨대 표 2에서 사람과 제브라피쉬에 대한 Cx43 ACT 서열 비교). 다른 실례로서, Cx45의 ACT 펩티드 조직화는 사람으로부터 조류에 이르기까지 고도로 보존된다 (예컨대 표 2에서 사람과 병아리에 대한 Cx45 ACT 서열 비교). 또 다른 실례로서, Cx36의 ACT 펩티드 조직화는 영장류로부터 어류에 이르기까지 고도로 보존된다 (예컨대 표 2에서 침팬지와 제브라피쉬에 대한 Cx36 ACT 서열 비교).
표 2. 알파 코넥신 카르복시-말단 (ACT) 아미노산 서열
유전자 서열 SEQ ID NO
사람 알파 Cx43 P SSRA SSRA SSR PRP D DLEI SEQ ID NO:1
병아리 알파 Cx43 P S RA SSRA SSR PRP D DLEI SEQ ID NO:29
제브라피쉬 알파 Cx43 P CSRA SSRM SSRA R P D DLDV SEQ ID NO:90
사람 알파 Cx45 G SNKS TA SSKS GDG KN SVWI SEQ ID NO:30
병아리 알파 Cx45 G SNKSS A SSKS GDG KN SVWI SEQ ID NO:31
사람 알파 Cx46 G RA SKAS RASS G RAR P E DLAI SEQ ID NO:32
사람 알파 Cx46.6 G SASS RD G K TVWI SEQ ID NO:33
침팬지 알파 Cx36 P RVSV PNFG R TQ SSD S AYV SEQ ID NO:34
병아리 알파 Cx36 P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV SEQ ID NO:35
제브라피쉬 알파 Cx36 P RMSM PNFG R TQ SSD S AYV SEQ ID NO:91
사람 알파 Cx47 P RAGSEK G SASS R DG KT TVWI SEQ ID NO:36
사람 알파 Cx40 G HRL P H G YHSDKRRL SKASS KARSD DLSV SEQ ID NO:37
사람 알파 Cx50 P ELTTDDAR P LSRL SKASS RARSD DLTV SEQ ID NO:38
사람 알파 Cx59 P NHVV SLTNNLI GRRFP T DLQI SEQ ID NO:39
쥐 알파 Cx33 P S CV SSS A VLTTIC SS DQVV PVG L SS FYM SEQ ID NO:40
양 알파 Cx44 G R SSKA SKSS GG RARAA DLAI SEQ ID NO:41
사람 알파 Cx26 LC YLLIR YCSGK SKKPV SEQ ID NO:42
그러므로 한 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 1) 타입 II PDZ 결합 모티프; 2) 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기; 3) 인-세린(S) 및/또는 인-트레오닌(T) 잔기의 클러스터; 및 4) 고빈도의 포지티브 전하의 아르기닌(R) 및 라이신(K) 및 네거티브 전하의 아스파르트산(D) 및/또는 글루탐산(E) 아미노산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나, 둘, 셋 또는 모두의 아미노산 모티프를 포함한다. 다른 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 타입 II PDZ 결합 모티프를 PDZ 결합 모티프에 근접한 카르복시-말단, 프롤린(P) 및/또는 글리신(G) 힌지 잔기에서 및 힌지 잔기에 근접한 포지티브 전하의 잔기 (K, R, D, E)를 포함한다.
PDZ 도메인은 원래 후시냅스 밀도 단백질 PSD95/SAP90, 드로조필라 종양 억제제 dlg-A, 및 밀접한 접합 단백질 ZO-1 내에 있는 보존된 서열 요소로서 확인되었다. 비록 처음에는 GLGF 또는 DHR 모티프로서 언급되었지만, 그것들은 현재 이들 세 개의 PDZ-함유 단백질을 나타내는 두문자어에 의해 알려져 있다 (PSD95/DLG/ZO-1). 이들 80-90 아미노산 서열은 현재 75개의 단백질에 걸쳐 잘 확인되었고, 단일 단백질 내에서 다수의 복사물로 특징적으로 발현된다. 그러므로 한 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신이 PDZ 도메인을 포함하는 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있다. PDZ 도메인은 본원에서 "PDZ 모티프"로 언급되는, PDZ-결합 모티프에 의해 채워질 수 있는 구조적으로 잘-규정된 상호작용 '포켓'을 가지는 단백질-상호작용 모듈의 특이한 타입이다. PDZ 모티프는 언제나 그런 것은 아니지만, 정상적으로는 맨 끝의 세포내 카르복실 말단에 위치한 일치 서열이다. 네 가지 타입의 PDZ 모티프가 분류되어 있다: 타입 I (S/T-x-Φ), 타입 II (Φ-x-Φ), 타입 III (Ψ-x-Φ), 및 타입 IV (D-x-V), 이때 x는 어떠한 아미노산이고, Φ는 소수성 잔기 (V, I, L, A, G, W, C, M, F)이며, Ψ는 염기성의 친수성 잔기 (H, R, K)이다 (Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73-77). 그러므로 한 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 타입 II PDZ 결합 모티프를 포함한다.
알파 Cx37의 18 카르복시-말단-대다수 아미노산 서열은 ACT 펩티드 주제에 대해 예외적인 변화를 나타내는 것이 주지된다. Cx37 ACT-유사 서열은 GQKPPSRPSSSASKKQ*YV (SEQ ID NO: 43)이다. 그러므로 Cx37의 카르복시 말단의 4개의 아미노산은 단지 부분적으로 타입 II PDZ 결합 모티프를 형성한다. 고전적인 타입 II PDZ 결합 도메인 대신에 Cx37은 중성 Q*를 소수성 아미노산이 예상되는 위치 2에 가진다. 그 자체로서 Cx37은 타입 II PDZ 결합 도메인-유사 서열로 언급될 수 밖에 없는 것을 포함한다. 그럼에도 불구하고, Cx37은 PDZ 결합 도메인-유사 서열에 근접한 클러스터를 형성한 세린 잔기, 빈번한 R 및 K 잔기 및 P-풍부 서열을 포함하여 ACT 펩티드 조직화의 모든 다른 측면을 엄격하게 유지한다. 이런 전체 수준의 ACT-유사 조직화의 보존이 상기에서 열거된 다른 70개 이상의 알파 코넥신에 공통적으로 존재한다면, Cx37 ACT-유사 카르복시 말단은 제공된 용량으로 작용한다는 것이 인정된다.
비교를 위해 베타 코넥신 Cx26이 표 2에 표시된다. Cx26은 카르복시 말단 타입 II PDZ 결합 모티프가 없으며, 카르복실 말단 대다수 아미노산의 30% 이하가 S, T, R, D, 또는 E 잔기를 포함하며, 타입 II PDZ 결합 모티프 또는 P와 G 힌지 잔기의 클러스터를 포함하는 PDZ 결합 유사 모티프의 증거가 없고, 클러스터를 형성하는 반복되는 것으로 보이는 세린과 트레오닌 인-아미노산의 모티프의 증거가 없다. Cx26은 서열의 카르복시 말단 가까이에 다른 것 뒤에 하나 식으로 클러스터를 형성한 세 개의 라이신 (K) 잔기를 가진다. 그러나 70개 이상의 상기에서 열거된 알파 코넥신에서 조사된 알파 코넥신은 카르복시 말단에 이러한 특징적인 세 개의 반복된 K 잔기 도메인을 나타내지 않는 것으로 발견되었다 (Cx26은 베타 코넥신이므로, 정의에 의하면 ACT 도메인을 갖지 않는다).
본원에 제공되는 바와 같이, 이런 상대적으로 짧은 아미노산 스트레치의 독특한 기능적 특징은 피부 및 뇌와 같이 다양한 조직의 손상 후에 염증의 감소, 치유의 촉진, 반흔 형성의 감소, 인장 강도의 증가, 및 복잡한 조직 구조 및 기능의 재생의 촉진에 예상외의 역할을 한다. 그러므로 한 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 타입 II PDZ 결합 모티프 (Φ-x-Φ; 식에서 x=어떠한 아미노산이고 Φ=소수성 아미노산)를 포함한다. 다른 측면으로, 본 발명의 ACT 폴리펩티드의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 하나 또는 그 이상의 프롤린(P), 글리신(G), 인-세린(S), 인-트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E) 아미노산 잔기로 구성된다.
아미노산 프롤린(P), 글리신(G), 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 및 글루탐산(E)은 단백질 구조 및 기능의 필수적인 결정요인이다. 프롤린과 글리신 잔기는 단백질의 3D 구조에서 엄격한 회전을 제공함으로써, 기능에 필요한 폴리펩티드의 접혀진 형태의 생성이 가능하게 된다. 전하를 띈 아미노산 서열은 때로 접혀진 단백질의 표면에 위치하고, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-지질 상호작용, 효소-기질 상호작용 및 단백질-핵산 상호작용을 포함한 폴리펩티드에 의해 중재되는 화학적 상호작용에 필요하다. 그러므로 다른 측면으로, 타입 II PDZ 결합 모티프에 근접한 프롤린(P), 글리신(G), 라이신(K), 아스파르트산(D), 및 글루탐산(E) 풍부 영역은 ACT 펩티드의 제공된 작용에 필요한 특성을 제공한다. 다른 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 타입 II PDZ 결합 모티프에 근접한 프롤린(P), 글리신(G), 라이신(K), 아스파르트산(D), 및/또는 글루탐산(E) 풍부 영역을 포함한다.
인산화는 단백질의 가장 공통적인 번역 후 변형이고, 단백질 구조 및 기능을 조절하고 변형하는 데 중요하다. 인산화에 의해 변형된 단백질 구조 및 기능의 측면은 단백질 형태, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-지질 상호작용, 단백질-핵산 상호작용, 채널 게이팅(gating), 단백질 왕래 및 단백질 전도(turnover)를 포함한다. 그러므로 한 측면으로 인-세린(S) 및/또는 인-트레오닌(T) 풍부 서열은 ACT 펩티드의 기능의 변형, 그것들의 제공된 작용에서 폴리펩티드의 효능을 증가하거나 감소시키는 데 필요하다. 다른 측면으로, 본 발명의 폴리펩티드는 세린(S) 및/또는 인-트레오닌(T) 풍부 서열 또는 모티프를 포함한다.
ACT 펩티드의 정의와 관련된 다른 실례에서, 어류와 같은 하등 동물의 고도의 조직/기관 재생 가능성의 관점에서 볼 때, 메티오닌이 제브라피쉬 Cx43의 ACT 서열 (표 2)의 아미노 말단 가까이에서 존재한다는 것은 매우 다행스러운 일이다. 메티오닌을 코드화하는 것 외에, 메티오닌 염기쌍 트리플릿은 대체 번역 출발 부위이다. 만약 이 메티오닌으로부터 번역이 개시되면, 서열 SSRARPDDLDV (SEQ ID NO:90)이 생성될 것이다. 이 번역 생성물은 규범적인 ACT 펩티드의 모든 보존되고 구별되는 특징을 유지한다. 구체적으로 이 펩티드는 카르복시 말단 타입 II PDZ 결합 도메인을 포함하고, PDZ 결합 도메인에 근접한 P, R 및 D 잔기가 풍부한 도메인을 가진다. 또한 서열은 그것의 아미노 말단에 ACT 펩티드 기능을 조절할 수 있는 가능성과 함께, 클러스터를 형성한 S 모티프를 포함한다. 이것은 어류와 같은 높은 조직/기관 재생 능력을 가지는 동물이 ACT 펩티드 서열을 직접 번역할 수 있다는 흥미로운 가능성을 제기한다.
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 사람 Cx43의 c-말단 서열을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 사람 Cx40의 카르복시 말단의 9개 아미노산을 포함할 수 있다. 그러므로 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 포함할 수 있다.
특정 단백질이 본원에서 언급될 때, 그것의 변이체, 유도체, 및 단편도 포함된다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 아미노산 서열 변형은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 다음 세 부류에 속한다: 치환, 삽입 또는 결실 변이체. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐 아니라 서열내에 하나 또는 다수의 아미노산 잔기가 삽입되는 것을 포함한다. 삽입은 통상 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 삽입보다 작을 것인데, 예를 들면 하나 내지 4개의 잔기 정도이다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 제거되는 것이 특징이다. 이들 변이체는 통상 단백질을 코드화하는 DNA에 있는 뉴클레오티드가 부위 특정 돌연변이생성됨으로써, 변이체를 코드화하는 DNA가 생성되고, 그런 다음 재조합 세포 배양물 중에 DNA를 발현함으로써 제조된다. 공지된 서열을 가지는 DNA에서 예정된 부위에 치환 돌연변이를 생성하는 기법들은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이생성 및 PCR 돌연변이 생성이 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 하나의 잔기에서 일어나지만, 상이한 많은 위치에서 한 번에 일어날 수 있으며; 삽입은 보통 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 정도에서 일어날 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍에서 일어난다. 즉 2개의 잔기가 결실되거나 2개의 잔기가 삽입된다. 치환, 결실, 삽입 또는 그것들의 어떠한 조합이든지 최종 구성물을 얻기 위해 조합될 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임 밖의 서열에서 일어나서는 안 되며, 바람직하게는 mRNA의 이차 구조에서 그러한 변화가 바람직하지 않은 한 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보 영역을 생성하지 않을 것이다. 치환 변이체는 최소한 하나의 잔기가 제거되었거나 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것들이다. 그러한 치환은 일반적으로 하기 표 3에 따라 만들어지며, 보존성 치환으로 언급된다.
표 3: 아미노산 치환
원래의 잔기 예시적인 치환
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Pro Gly
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
예를 들어 한 아미노산 잔기가 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 다른 아미노산으로 대체되는 것은 당업계에 보존성 치환으로서 알려져 있다. 예를 들면 보존성 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 대체하는 것이다. 치환은 표 3에 제시된 조합을 포함한다. 명백하게 개시된 서열 각각의 보존적으로 치환된 변이는 본원에 제공된 폴리펩티드에 포함된다.
전형적으로, 보존성 치환은 결과적으로 생성되는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 거의 아무런 충격을 주지 않는다. 특정 실례로서, 보존성 치환은 펩티드의 생물학적 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는 펩티드의 아미노산 치환이다. 펩티드는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예컨대 2 내지 10개의 보존성 치환, 2 내지 5개의 보존성 치환, 4 내지 9개의 보존성 치환, 예컨대 2, 5, 또는 10개의 보존성 치환을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 예를 들면 부위-특정 돌연변이생성 또는 PCR과 같은 표준 과정을 사용하여 그 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써 하나 또는 그 이상의 보존성 치환을 함유하도록 제조될 수 있다. 또는 달리 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성 방법을 사용함으로써 하나 또는 그 이상의 보존성 치환을 함유하도록 생성될 수 있다. 알라닌 스캔이 단백질의 어떤 아미노산 잔기가 아미노산 치환을 견딜 수 있는지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 한 실례에서, 알라닌, 또는 다른 보존성 아미노산 (예컨대 아래에 열거되는 것들)이 하나 또는 그 이상의 천연 아미노산에 대해 치환될 때 단백질의 생물학적 활성은 25% 이상 감소하지 않으며, 예컨대 20% 이하, 10% 이하로 감소한다.
보존성 치환에 대한 추가의 정보는 다른 것들 중에서도 아래의 문헌들에서 찾아볼 수 있다: Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol . 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988) 및 유전학과 분자 생물학의 표준 텍스트북.
치환 또는 결실 돌연변이생성은 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)를 위한 부위를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 가변성 잔기의 결실이 또한 바람직할 수 있다. 잠재적인 단백질 가수분해 부위, 예컨대 Arg의 결실 또는 치환은 예를 들면 염기성 잔기를 하나 결실시키거나 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기에 의해 염기성 잔기를 치환함으로써 이루어진다.
특정 번역 후 유도체화는 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 빈번하게 번역 후 탈아민화된다. 또는 달리 이들 잔기는 중간 정도의 산성 조건하에서 탈아민된다. 다른 번역 후 변형으로는 프롤린과 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화 및, 어떤 경우에는 C-말단 카르복실의 아미드화가 있다.
개시된 조성물에 삽입될 수 있는 아미노산 및 펩티드 유사체가 많이 있다는 것이 인지된다. 예를 들어 상기 표 3에 제시된 아미노산과는 다른 기능적 치환체를 가지는 D 아미노산 또는 아미노산들이 많이 있다. 천연 발생 펩티드의 반대되는 입체 이성질체들뿐 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체들이 개시된다. 이들 아미노산은 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 채우고 예를 들어 앰버 코돈을 활용하는 유전자 구성물을 공학처리하여 유사한 아미노산을 펩티드 사슬에 부위 특정 방식으로 삽입함으로써 폴리펩티드 사슬에 쉽게 통합될 수 있다 (Thorson et al., Methods in Molec . Biol . 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al, TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)).
폴리펩티드를 닮았지만, 천연 펩티드 연쇄를 통해 연결되지 않은 분자들이 생성될 수 있다. 예를 들어 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 연쇄는 CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2-- , --CH=CH-- (시스 및 트란스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CHH2SO-- (이것들 및 다른 것들은 다음의 문헌에서 찾아볼 수 있다: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2-- S); Hann J. Chem . Soc Perkin Trans. I 1307-314 (1982) (--CH--CH-, 시스 및 트란스); Almquist et al. J. Med . Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. European Appln , EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); and Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S--)). 펩티드 유사체는 결합 원자들, 예컨대 b-알라닌, g-아미노부티르산 사이에 하나 이상의 원자를 가질 수 있다는 것이 인지된다.
아미노산 유사체 및 펩티드 유사체는 때로 풍부해진 또는 바람직한 성질, 예컨대 더욱 경제적인 생산, 보다 커진 화학적 안정성, 증강된 약리학적 특성 (반감기, 흡수력, 능력, 효능 등), 변경된 특이성 (예컨대 생물학적 활성의 광범위한 스펙트럼), 감소된 항원성, 더욱 커진 생물학적 장벽 (예컨대 소화관, 혈관, 혈액-뇌-장벽)을 가로지르는 능력, 등을 가질 수 있다.
D-아미노산은 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는데, 왜냐하면 D 아미노산이 펩티다제 및 그러한 것들에 의해 인지되지 않기 때문이다. 일치 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 전체적으로 치환하는 것 (예컨대 L-라이신 대신 D-라이신)은 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 둘 또는 그 이상의 펩티드를 함께 고리화하거나 부착하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정 형태로 유지하기에 유익하다. (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992)).
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 c-말단 (ACT)의 보존성 변이체를 포함할 수 있다. 하기 표 4에 제시되는 것처럼, 서열 SEQ ID NO:2 내에서 단일 보존성 치환의 실례는 서열 SEQ ID NO:3에 제공된다. 서열 SEQ ID NO:2 내에서 3개의 보존성 치환의 실례는 서열 SEQ ID NO:4에 제공된다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함한다.
표 4. ACT 폴리펩티드 변이체
서열 SEQ ID NO
RPRPDDLEI SEQ ID NO:2
RPRPDDLEV SEQ ID NO:3
RPRPDDVPV SEQ ID NO:4
SSRASSRASSRPRPDDLEV SEQ ID NO:44
RPKPDDLEI SEQ ID NO:45
SSRASSRASSRPKPDDLEI SEQ ID NO:46
RPKPDDLDI SEQ ID NO:47
SSRASSRASSRPRPDDLDI SEQ ID NO:48
SSRASTRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO:49
RPRPEDLEI SEQ ID NO:50
SSRASSRASSRPRPEDLEI SEQ ID NO:51
GDGKNSVWV SEQ ID NO:52
SKAGSNKSTASSKSGDGKNSVWV SEQ ID NO:53
GOKPPSRPSSSASKKLYV SEQ ID NO:54
본원에 개시된 유전자 및 단백질의 어떠한 변이체, 변형, 또는 유도체를 규정하는 한 가지 방법은 변이체, 변형, 및 유도체를 구체적으로 공지된 서열에 대한 서열 동일성 (또는 본원에서 상동성으로도 언급됨)의 관점에서 규정하는 것을 통해서임이 인지된다. 구체적으로 개시되는 것은 진술된 또는 공지된 서열에 대하여 최소한 65, 66, 61, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가지는 본원에 개시된 핵산 및 폴리펩티드의 변이체들이다. 당업자들은 두 개의 단백질 또는 핵산의 서열 동일성을 측정하는 방법을 쉽게 알게 된다. 예를 들어 서열 동일성은 두 개의 서열을 일렬로 배열한 후에 서열 동일성을 그것의 가장 높은 수준에서 계산할 수 있다.
서열 동일성을 계산하는 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위해 최적으로 서열을 일렬 배열하는 것은 스미스와 워터만의 국소 서열 동일성 알고리즘에 의해 (Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 니들만과 분쉬의 서열 동일성 일렬 배열 알고리즘에 의해 (Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)), 피어슨과 리프만의 유사성 방법에 대한 연구에 의해 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 정밀 검사에 의해 수행될 수 있다. 이들 참고문헌은 서열 동일성의 계산 방법에 대해 전체가 참조됨으로써 본원에 삽입된다.
동일 유형의 서열 동일성은 핵산에 대해서는 예를 들면 문헌에 개시된 알고리즘들에 의해 얻어질 수 있다 (Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281- 306, 1989).
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 알파 코넥신의 c-말단 (ACT)에 대해 최소한 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 한 측면으로 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:90 또는 SEQ ID NO:91에 대하여 최소한 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 실례로서, 사람 Cx43 (SEQ ID NO:2)의 카르복시-말단에 발생하는 9개의 아미노산의 동일한 스트레치에 대해 66%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 (SEQ ID NO:4)가 제공된다.
본 발명의 폴리펩티드는 직접 환자의 손상된 조직에 첨가될 수 있다. 그러나 본 발명의 폴리펩티드의 세포질 정위의 효율은 폴리펩티드와 시스 또는 트란스로 화학적으로 결합된 세포 내재화 수송자에 의해 증강된다. 세포 내재화 수송자의 효율은 추가로 빛에 의해 또는 Tat-HA 펩티드로 세포를 공-형질도입함으로써 증강된다.
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 세포 내재화 수송자 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 당업계에 공지되었거나 새롭게 발견된 어떠한 내재화 서열이거나, 그것들의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송자 및 서열의 비-제한적 실례로는 안테나페디아 서열, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A (Antp 돌연변이체), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP (모델 양친매성 펩티드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC (비스-구아니디늄-스퍼미딘-콜레스테롤), 및 BGTC (비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)이 있다 (표 5 참조).
표 5: 세포 내재화 수송자
명칭 서열 SEQ ID NO
Antp RQPKIWFPNRRKPWKK SEQ ID NO:7
HIV-Tat GRKKRRORPPQ SEQ ID NO:14
페네트라틴 RQIKIWFQNRRMKWKK SEQ ID NO:15
Antp-3A RQIAIWFQNRRMKWAA SEQ ID NO:16
Tat RKKRRQRRR SEQ ID NO:17
부포린 II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO:18
트랜스포탄 GWTLNSAGYLLGKNKALAALAKKIL SEQ ID NO:19
모델 양친매성 펩티드 (MAP) KLALKLALKALKAALKLA SEQ ID NO:20
K-FGF AAVALLPAVLLALLAP SEQ ID NO:21
Ku70 VPMLK- PMLKE SEQ ID NO:22
프리온 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP SEQ ID NO:23
pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK SEQ ID NO:24
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV SEQ ID NO:25
SynB1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR SEQ ID NO:26
Pep-7 SDLWEMMMVSLACQY SEQ ID NO:27
HN-1 TSPLNIHNGQKL SEQ ID NO:28
BGSC(비스-구아니디늄-스퍼미딘-콜레스테롤)
Figure 112007048584303-PCT00001
BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)
Figure 112007048584303-PCT00002
그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 추가로 아미노산 서열 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14 (Bucci, M. et al 2000. Nat . Med . 6, 1362-1367), SEQ ID NO:15 (Derossi, D., et al. 1994. Biol . Chem . 269, 10444-10450), SEQ ID NO:16 (Fischer, P.M. et al. 2000. J. Pept . Res. 55, 163-172), SEQ ID NO:17 (Frankel, A. D. & Pabo, C. O. 1988. Cell 55,1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179-1188), SEQ ID NO: 18 (Park, C. B., et al. 2000. Proc . Natl Acad . Sci . USA 97, 8245-8250), SEQ ID NO:19 (Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77), SEQ ID NO:20 (Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys . Acta . 1414, 127-139), SEQ ID NO:21 (Lin, Y. Z., et al. 1995. J. Biol . Chem . 270, 14255-14258), SEQ ID NO:22 (Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol . 5, 352-357), SEQ ID NO:23 (Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys . Res. Commun . 299, 85-90), SEQ ID NO:24 (Elmquist, A., et al. 2001. Exp . Cell Res. 269, 237- 244), SEQ ID NO:25 (Morris, M. C, et al. 2001. Nature Biotechnol . 19, 1173-1176), SEQ ID NO:26 (Rousselle, C. et al. 2000. Mol . Pharmacol . 57,679-686), SEQ ID NO:27 (Gao, C. et al. 2002. Bioorg . Med. Chem . 10, 4057-4065), 또는 SEQ ID NO:28 (Hong, F. D. & Clayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556)을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 BGSC (비스-구아니디늄-스퍼미딘-콜레스테롤) 또는 BGTC (비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤) (Vigneron, J.P. et al. 1998. Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 93, 9682-9686)을 포함한다. 전술한 참조문헌들은 본원에 세포 내재화 벡터 및 서열에 대하여 참조로 본원에 삽입된다. 현재 공지되었거나 후에 확인된 다른 어떠한 내재화 서열도 본 발명의 펩티드와 조합될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 본원에 제공되는 세포 내재화 서열 중 어떠한 것과도 조합된 어떠한 ACT 서열 (예컨대 본원에 개시된 ACT 펩티드 중 어떠한 것)을 포함한다. 상기 조합의 예를 하기 표 6에 제시한다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 포함하는 안테나페디아 서열을 포함한다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:12를 포함할 수 있다.
표 6: 세포 내재화 서열 (CIS)를 가지는 ACT 폴리펩티드
CIS/ACT 서열 SEQ ID NO
Antp/ACT 2 RQPKIWFPNRRKPWKK PSSRASSRASSRPRPDDLEI SEQ ID NO:8
Antp/ACT 1 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO:9
Antp/ACT 3 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDLEV SEQ ID NO:10
Antp/ACT 4 RQPKIWFPNRRKPWKK RPRPDDVPV SEQ ID NO:11
Antp/ACT 5 RQPKIWFPNRRKPWKK KARSDDLSV SEQ ID NO:12
HIV-Tat/ACT 1 GRKKRRQRPPQ RPRPDDLEI SEQ ID NO:56
페네트라틴/ACT 1 RQIKIWFQNRRMKWKK RPRPDDLEI SEQ ID NO:57
Antp-3A/ACT 1 RQIAIWFQNRRMKWAA RPRPDDLEI SEQ ID NO:58
Tat/ACT 1 RKKRRQRRR RPRPDDLEI SEQ ID NO:59
부포린II/ACT 1 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK RPRPDDLEI SEQ ID NO:60
트랜스포탄/ACT 1 GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL SEQ ID NO:61
MAP/ACT 1 KLALKLALKALKAALKLA RPRPDDLEI SEQ ID NO:62
K-FGF/ACT 1 AAVALLPAVLLALLAP RPRPDDLEI SEQ ID NO:63
Ku70/ACT 1 VPMLKPMLKE RPRPDDLEI SEQ ID NO:64
프리온/ACT 1 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKPRPRPDDLEI SEQ ID NO:65
pVEC/ACT 1 LLIILRRRIRKQAHAHSK RPRPDDLEI SEQ ID NO:66
Pep-1/ACT 1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV RPRPDDLEI SEQ ID NO:67
SynB1/ACT 1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR RPRPDDLEI SEQ ID NO:68
Pep-7/ACT 1 SDLWEMMMVSLACQY RPRPDDLEI SEQ ID NO:69
HN-1/ACT 1 TSPLNIHNGQKL RPRPDDLEI SEQ ID NO:70
또한 본원에는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산이 제공된다. 개시된 핵산은 예를 들면 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체로 구성된다. 이들 및 다른 분자의 비-제한적인 실례가 본원에서 논의된다. 예를 들어 벡터가 세포에서 발현될 때, 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 구성될 것이다.
"분리된 핵산" 또는 "정제된 핵산"은 그것으로부터 본 발명의 DNA가 유도되는 유기체의 천연-발생 게놈에서 유전자 양 옆에 있는 유전자들이 없는 DNA를 의미한다. 그러므로 이 용어는 예를 들면 벡터, 예컨대 자가 복제하는 플라스미드 또는 바이러스에 통합된; 또는 원핵세포 또는 진핵세포 (예컨대 트랜스유전자)의 게놈 DNA에 통합된; 또는 별도의 분자 (예컨대 cDNA 또는 PCR, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 또는 화학적 또는 시험관내 합성에 의해 생성된 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 그것은 추가의 폴리펩티드 서열을 코드화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다. 용어 "분리된 핵산"은 또한 RNA, 예컨대 분리된 DNA에 의해 코드화되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 최소한 일부의 세포 성분, 예컨대 다른 유형의 RNA 분자 또는 폴리펩티드 분자로부터 분리되거나 실질적으로 자유로운 RNA를 말한다.
그러므로 본원에는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:12를 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산이 제공된다.
따라서 본 발명의 핵산은 핵산 서열 SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, 또는 SEQ ID NO:89를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 또한 본원에는 본원에 제공된 핵산을 하나 또는 그 이상 포함하는 벡터가 제공되는데, 그 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 시험관 내에서나 생체 내에서 세포에 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 많이 있다. 이들 방법 및 조성물은 크게는 두 부류: 바이러스 기초 전달 시스템과 비-바이러스 기초 전달 시스템으로 나누어질 수 있다. 예를 들어 핵산은 많은 직접 전달 시스템, 예컨대 일렉트로포레이션, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드를 통하여, 또는 세포 또는 담체, 예컨대 양이온성 리포좀에서 유전자 물질의 전달을 통하여 전달될 수 있다. 트랜스펙션에 대한 적절한 수단, 이를테면 바이러스 벡터, 화학적 형질전환제, 또는 물리-기계적 방법, 예컨대 일렉트로포레이션 및 DNA의 적접 확산은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)). 그러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에서 설명되는 조성물 및 방법에도 쉽게 적용될 수 있다. 어떤 경우에 방법은 큰 DNA 분자를 사용하여 특이하게 기능하도록 변형될 것이다. 나아가 이들 방법은 담체의 표적화 특징을 사용함으로써 특정 질병 및 세포 집단을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
전달 벡터는 세포 (예컨대 플라스미드)에 유전자를 전달하기 위해 사용되는 어떠한 뉴클레오티드 구성물이거나, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 스트래티지의 일부, 예컨대 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부일 수 있다 (Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)).
본원에서 사용되는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 개시된 핵산, 예컨대 SEQ ID NO:6을 분해 없이 세포에 수송하는 제제로서, 그것이 전달되는 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하고 있다. 어떤 구체예에서 프로모터는 바이러스나 레트로바이러스 중 하나로부터 유도된다. 바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 뉴런에 영향을 주는 바이러스, 신드비스 및 다른 RNA 바이러스, 및 HIV 골격을 가지고 있는 이들 바이러스들이다. 또한 벡터로서 사용하기에 적당하게 만드는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 어떠한 바이러스 패밀리도 개시된다. 레트로바이러스로는 쥐과의 말로니 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스들이 있다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 하중의 유전자, 즉 트랜스유전자 또는 마커 유전자를 운반할 수 있고, 이러한 이유로 통상적으로 사용되는 벡터이다. 그러나 그것들은 비-증식성 세포에서는 유용하지 못하다. 아데노바이러스 벡터는 상대적으로 안정하며 활용하기가 쉬우며, 고역가를 가지고 있고, 에어로졸 제형으로 전달될 수 있으며, 비-분할성 세포를 형질전환시킬 수 있다. 수두 바이러스 벡터는 크고 유전자를 삽입하기 위한 여러 개의 부위를 가지며, 열에 안정하고 실온에서도 저장할 수 있다. 또한 본원에는 바이러스 항원에 의해 유도된, 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하도록 공학제조된 바이러스 벡터가 개시된다. 이런 유형의 벡터는 인터류킨 8 또는 10에 대한 코딩 영역을 운반할 수 있다.
바이러스 벡터는 유전자를 세포에 도입하기 위한 화학적 또는 물리적 방법들보다 더 큰 처리 (유전자를 도입하는 능력) 능력을 가질 수 있다. 전형적으로 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사물, 복제 및 캡시드화에 필요한 역 말단 반복부위, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 제어하기 위한 프로모터를 함유한다. 바이러스가 벡터로서 공학제조될 때, 전형적으로 제거된 하나 또는 그 이상의 초기 유전자를 가지고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈에 삽입된다. 이 유형의 구성물은 약 8kb의 외래 유전자 물질을 운반할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필요한 기능들은 전형적으로 초기 유전자의 유전자 산물을 다른 곳에서 발현하도록 공학제조된 셀라인에 의해 공급된다.
레트로바이러스는 레트로바리다에의 바이러스 패밀리, 이를테면 어떠한 유형, 하위패밀리, 과, 또는 친화성에 속하는 동물 바이러스이다. 레트로바이러스는 일반적으로 Verma, I.M.에 의해 설명되었다 (Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)). 레트로바이러스 벡터를 유전자 요법에 사용하기 위한 방법의 실례는 미국 특허 4,868,116호 및 4,980,286호; PCT 출원 WO 90/02806 및 WO 89/07136; 및 Mulligan (Science 260:926-932 (1993))에 설명되어 있다.
레트로바이러스는 본질적으로 그 안에 핵산 화물을 팩킹하는 패키지이다. 핵산 화물은 그것과 함께 복제된 딸 분자가 패키지 코트 내에 효과적으로 패키지될 것을 보장하는 패키징 신호를 운반한다. 패키지 신호 외에 레트로바이러스에는 복제의 경우 시스, 및 복제된 바이러스의 패키징에 필요한 많은 분자가 있다. 전형적으로 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트의 제조에 포함된 gag, pol, 및 env 유전자를 함유한다. 전형적으로 표적 세포에 전달되어야 하는 외래 DNA에 의해 대체되는 것은 바로 gag, pol, 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 패키지 코트 안에 통합하기 위한 패키징 신호, gag 전사 유닛의 시작을 알려주는 서열, 역전사에 필요한 요소, 이를테면 역전사의 tRNA 프라이머에 결합하기 위한 프라이머 결합 부위, DNA 합성 중에 RNA 가닥의 스위치를 안내하는 말단 반봅 서열, DNA 합성의 제 2 가닥의 합성을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 5'에서 3' 방향의 퓨린 풍부 서열 LTR, 및 숙주 게놈에 삽입하기 위하여 레트로바이러스의 DNA 상태의 삽입을 가능하게 하는 LTR의 단부들 가까이에 있는 특정 서열을 함유한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거로 약 8kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 안에 삽입되고, 역전사가 이루어지며, 복제시 새로운 레트로바이러스 입자 안에 패키지 되는 것이 가능해진다. 이러한 핵산 양은 각 전사물의 크기에 따라 많은 유전자에 하나를 전달하기에 충분하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터에서 복제 기계 및 패키징 단백질이 제거되었기 때문에 (gag, pol 및 env), 벡터는 전형적으로 그것들을 패키징 셀라인에 놓음으로써 생성된다. 패키징 셀라인은 복제 및 패키징 기계를 함유하지만 어떠한 패키징 신호는 없는 레트로바이러스로 형질전환된 셀라인이다. 선택된 DNA를 운반하는 벡터가 이들 셀라인으로 형질전환될 때, 관심의 유전자를 함유하는 벡터는 헬퍼 세포에 의해 시스로 제공되는 기계장치에 의해 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자 안에 패키지된다. 기계장치에 대한 게놈은 그것들이 필요한 신호를 갖고 있지 않기 때문에 패키지되지 않는다.
복제-결핍 아데노바이러스의 구성은 문헌에 설명되어 있다 (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 51:261-21 A (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)). 이들 바이러스를 벡터로서 사용하는 이점은, 그것들이 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수는 없기 때문에, 다른 세포 유형에 확산될 수 있는 정도로 제한된다는 것이다. 재조합 아데노바이러스는 생체내에서 기도 상피, 간세포, 혈관 내피, CNS 연조직 및 많은 다른 조직 부위들에 직접 전달된 후에 높은 효율의 유전자 전달을 이루는 것으로 밝혀졌다 (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 특정 세포 표면 수용체에 결합한 후, 바이러스가 야생형 또는 복제-결핍 아데노바이러스에서와 같은 방식으로 수용체-중재된 세포 이물 흡수 작용에 의해 내재화됨으로써 유전자 형질도입을 이룬다 (Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., MoI. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).
바이러스 벡터는 제거된 E1 유전자를 가졌던 아데노바이러스를 토대로 한 것이며, 이들 비리온은 사람 293 셀라인과 같은 셀라인에서 생성된다. 한 측면으로, E1과 E3 유전자는 둘 다 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.
바이러스 벡터의 다른 유형은 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 토대로 한 것이다. 이 결핍성 파르보바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 사람에게는 비병원성이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5kb를 수송할 수 있고, 야생형 AAV는 염색체 19안으로 안정되게 삽입되는 것으로 알려져 있다. 실례로서, 이 벡터는 Avigen (San Francisco, CA)에 의해 생성되는, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, HSV-tk, 및/또는 마커 유전자, 예컨대 녹형광 단백질, GFP를 코드화하는 유전자를 함유할 수 있는 P4.1 C 벡터일 수 있다.
다른 유형의 AAV 바이러스에서, AAV는 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된 세포-특이적 발현을 지시하는 프로모터를 함유하는 카세트가 최소한 하나 옆에 있는 한 쌍의 역 말단 반복 부위(ITR)를 함유한다. 이 맥락에서 이종성이라 함은 AAV 또는 B19 파르보바이러스에 고유하지 않은 어떠한 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 말한다.
전형적으로 AAV 및 B19 코딩 영역이 결실되었고, 그 결과 안전하고 비세포독성인 벡터가 얻어졌다. AAV ITR, 또는 그것의 변형물은 감염성과 부위-특정 통합을 제공하지만, 세포독성이 없으며, 프로모터는 세포-특이적 발현을 지시한다. 미국 특허 6,261,834호는 AAV 벡터에 관련된 물질에 대해 참조로 본원에 삽입된다.
그러므로 개시된 벡터는 실질적인 독성 없이 포유류 염색체 안에 통합될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 통상 원하는 유전자 산물의 발현을 제어하는 것을 보조하기 위하여 프로모터, 및/또는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 시작 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소들을 함유하며, 상류 요소 및 반응 요소들을 함유할 수 있다.
큰 사람 포진 바이러스를 사용한 B분자 유전 실험은 큰 이종성 DNA 단편을 포진 바이러스로 감염될 수 있는 세포에서 클론하고, 증식하고, 수립할 수 있는 방법을 제공하였다 (Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter and Robertson,. Curr Opin Mol. Ther 5: 633-644, 1999). 이들 큰 DNA 바이러스 (단순 포진 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바르 바이러스 (EBV))는 특이한 세포에 대하여 150kb이상의 사람 이종성 DNA의 단편을 전달할 수 있다. EBV 재조합체는 감염된 B-세포에서 에피솜성 DNA로서 DNA의 큰 조각을 유지할 수 있다. 개별적인 클론은 유전학적으로 안정하게 보이는 330kb이하의 사람 게놈 삽입물을 운반하였다. 이들 에피솜의 유지는 EBV로 감염되는 동안 구조적으로 발현되는 특이한 EBV 핵 단백질인 EBNA1을 필요로 한다. 추가로 이들 벡터는 형질전환에 사용될 수 있는데, 그때 다량의 단백질이 일시적으로 시험관 내에서 생성될 수 있다. 포진 바이러스 암플리콘 시스템은 또한 220kb 이상의 DNA 조각을 패키지하고, 에피솜으로서 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염하기 위해 사용될 수 있다.
다른 유용한 시스템으로는 예를 들면 복제 및 숙주-제한된 비-복제 백시니아 바이러스 벡터를 들 수 있다.
개시된 조성물은 다양한 방법으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 일렉트로포레이션을 통해, 또는 리포펙션을 통해, 또는 인산 칼슘 침전을 통해 전달될 수 있다. 선택되는 전달 메커니즘은 부분적으로는 표적이 되는 세포 유형과 어떤 전달이 일어날 것인가, 예컨대 생체내에서 혹은 시험관내에서 일어날 것인가에 따라 좌우될 것이다.
그러므로 본 발명의 조성물은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터 외에, 예를 들면 지질, 예컨대 리포좀, 예컨대 양이온성 리포좀 (예컨대 DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온성 리포좀을 포함할 수 있다. 리포좀은 나아가 필요에 따라 특정 세포를 표적화하는 것을 용이하게 하기 위하여 단백질을 포함할 수 있다. 화합물과 양이온성 리포좀을 포함하는 조성물의 투여는 표적 기관에 구심성인 혈액에 투여되거나 호흡관의 표적 세포에 대하여 호흡관 안에 흡입될 수 있다. 리포좀에 대해서는 문헌을 참조한다 (Brigham et al. Am. J. Resp . Cell. Mol . Biol . 1:95-100 (1989); Feigner et al. Proc . Natl . Acad . Sci USA 84:7413-7417 (1987); 미국 특허 4,897,355호). 나아가 화합물은 특이한 세포 유형, 예컨대 대식세포에 대해, 또는 화합물의 확산 또는 마이크로캡슐로부터의 화합물의 전달이 특정 비율 또는 용량으로 디자인되는 경우 표적화될 수 있는 마이크로캡슐의 성분으로서 투여될 수 있다.
환자의 세포에 외인성 DNA를 투여하고 흡수시키는 것을 포함하는 상기에서 설명된 방법 (즉 유전자 형질도입 또는 형질전환)에 있어서, 세포에 대한 조성물의 전달은 다양한 메커니즘을 통해 이루어질 수 있다. 한 실례로서, 전달은 리포좀을 경유하여, 즉 시판중인 리포좀 제제, 예컨대 LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)과, 또한 당해 기술분야의 표준 과정에 따라 개발된 다른 리포좀들을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 개시된 핵산 또는 벡터는 생체내에서 일렉트로포레이션 (그것에 대한 기술은 Genetronics사 (San Diego, CA)로부터 유용할 수 있다) 뿐만 아니라 SONOPORATION 기계 (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)에 의해 전달될 수 있다.
숙주 세포 게놈에 통합될 세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 통합 서열을 함유한다. 이들 서열은, 특히 바이러스 기초 시스템이 사용될 때 때로 바이러스 관련 서열이다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 비-핵산 기초 전달 시스템, 예컨대 리포좀을 사용하여 전달되는 핵산에 통합될 수 있어서, 전달 시스템에 함유된 핵산이 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
숙주 게놈에 통합하기 위한 다른 일반적인 기법으로는 예를 들면 숙주 게놈과의 동종성 재조합을 촉진하기 위해 디자인된 시스템을 들 수 있다. 이들 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이의 재조합이 일어나서 전달된 핵산이 숙주 게놈에 통합되는 것을 유발하는 숙주 세포 게놈 안에 있는 표적 서열과 충분히 상동성을 가지는 발현될 핵산 양 옆의 서열에 의존한다. 이들 시스템과 동종 재조합을 촉진하기 위해 필요한 방법은 당업자들에게 공지이다.
조성물은 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘 (예컨대 DNA만의 흡수, 리포좀 융합, DNA의 유전자 총을 통한 근육내 주입, 세포 이물 흡수 등)에 의해 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 환자의 세포에 전달될 수 있다.
만약 생체 외 방법이 사용된다면, 세포 또는 조직은 당업계에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜을 따라 제거되어 신체 밖에서 유지될 수 있다. 조성물은 어떠한 유전자 전달 메커니즘, 예를 들면 칼슘 포스페이트 중재된 유전자 전달, 일렉트로포레이션, 마이크로주입 또는 프로테오리포좀을 통해 세포에 도입될 수 있다. 그런 다음 형질도입된 세포는 주입되거나 (예컨대 약제학적으로 허용되는 담체를 통해) 또는 세포 또는 조직 유형에 대한 표준 방법대로 환자에게 다시 동위적으로(homotopically) 이식될 수 있다. 환자에게 다양한 세포를 이식하거나 주입하기 위한 표준 방법은 알려져 있다.
세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 발현 제어 시스템을 함유한다. 예를 들어 바이러스 및 레트로바이러스 시스템에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 원하는 유전자 산물의 발현을 조절하는 것을 보조하기 위한 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 출발 부위에 대하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 전사 인자들의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소들을 함유하고, 상류 요소와 반응 요소들을 함유할 수 있다.
포유류 숙주 세포의 벡터로부터의 전사를 조절하는 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들면 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유슈 프로모터, 예컨대 베타 악틴 프로모터로부터 얻을 수 있다. SV40의 초기 및 후기 프로모터는 편리하게도 SV40 바이러스 복제 개시점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 얻어질 수 있다 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). 사람 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 편리하게도 HindIII E 제한 단편으로서 얻어진다 (Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터도 본원에서 유용하다.
인핸서는 일반적으로 전사 출발 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능하는 DNA의 서열이며, 전사 단위에 대해 5'이거나 (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3'(Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) 일 수 있다. 나아가 인핸서는 인트론 안에 (Banerji, JX. et al., Cell 33: 729 (1983)) 있을 수 있을 뿐 아니라 코딩 서열 자체 내에도 있을 수 있다 (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). 그것들은 통상 10 내지 300bp의 길이를 가지면 시스로 기능한다. 인핸서는 가까운 프로모터로부터 전사를 증가시키기 위하여 작용한다. 인핸서는 또한 때로는 전사의 조절을 중재하는 반응 요소를 함유한다. 프로모터 또한 전사의 조절을 중재하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 때로 유전자 발현의 조절을 측정한다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유류 유전자들 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있지만, 전형적으로 유전자 발현을 위해서는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그러한 것의 실례로는 복제 개시점 후기의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 후기에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다.
프로모터 및/또는 인핸서는 특이하게 빛 또는 그것들의 기능을 야기하는 특이한 화학적 사건에 의해 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 또한 조사, 예컨대 감마선 조사, 또는 알킬화 화학요법제에 대한 노출에 의해 바이러스 벡터 유전자 발현을 증강시키는 방법도 있다.
특정 구체예에서 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 전사될 전사 단위의 영역의 발현을 최대화하기 위하여 구성성 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 어떤 구성물에서 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 그것이 특정한 시간에 특정 유형의 세포에서만 발현될지라도 모든 진핵세포 유형에서 활성이다. 이런 유형의 프로모터는 CMV 프로모터 (650 염기)이다. 그러한 다른 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (전체 길이 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.
모든 특이한 조절 요소들은 클론될 수 있으며, 흑색종 세포와 같은 특이한 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 교질 섬유성 산성 단백질 (GFAP) 프로모터가 교질 개시점의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현하기 위해 사용되어 왔다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 핵화된 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 코드화하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화된 절편으로서 전사된다. 3' 미번역 영역은 또한 전사 종결 부위를 포함한다. 전사 단위는 또한 폴리아데닐화 영역을 함유할 수 있다. 이 영역의 한 가지 유익은 그것이 전사된 단위가 mRNA처럼 프로세스되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 폴리아데닐화 신호의 발현 구성물에서의 확인 및 사용에 대해서는 잘 정립되어 있다. 동종성 폴리아데닐화 신호는 유전자도입 구성물에서 사용될 수 있다. 어떤 전사 단위에서는 폴리아데닐화 영역이 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유도되고 약 400 염기로 구성된다. 전사된 단위는 다른 표준 서열을 단독으로 또는 구성물로부터의 발현을 개선하거나, 또는 구성물의 안정성을 개선하는 상기의 서열과 조합하여 함유한다.
바이러스 벡터는 마커 산물을 코드화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 산물은 유전자가 세포에 전달되었고 일단 전달되면 발현되는 지를 측정하기 위해 사용된다. 마커 유전자의 예로는 β-갈락토시다제를 코드화하는 대장균 lacZ 유전자, 및 녹형광 단백질을 들 수 있다.
어떤 구체예에서는 마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유류 세포에 대해 적당한 선택가능한 마커의 실례로는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히드로마이신, 및 퓨로마이신이 있다. 그러한 선택가능한 마커가 성공적으로 포유류 숙주 세포에 전달될 때, 형질전환된 포유류 숙주 세포는 선택적 압력하에 놓이게 되면 생존할 수 있다. 광범위하게 사용되는 구별되는 범주의 선택성 체제가 두 가지 있다. 첫 번째 범주는 세포의 대사작용 및 보충된 배지와 무관하게 성장할 수 있는 능력이 결핍된 돌연변이 셀라인의 사용을 토대로 한다. 여기에는 두 실례가 있다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) DHFR-세포 및 마우스 LTK-세포. 이들 세포는 티미딘 또는 히포크산틴과 같은 영양성분이 참가되지 않아도 성장할 수 있는 능력이 없다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 어떤 유전자들이 없기 때문에, 그것들은 보충된 배지에 빠져있는 뉴클레오티드가 제공되지 않으면 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것을 대체하는 방법은 무상 DHFR 또는 TK 유전자를 각각의 유전자가 없는 세포에 도입함으로써, 그것들의 성장 요구조건을 변경시키는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 각 세포들은 비-보충 배지에서 생존할 수 없을 것이다.
두 번째 범주는 어떠한 세포 유형에서도 사용되고 돌연변이 셀라인을 사용할 필요가 없는 선택 계획을 언급하는 우성 선택이다. 이들 계획은 전형적으로 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 가지는 그런 세포들은 단백질 수송 약물 내성을 발현할 것이고, 선택에도 생존할 것이다. 그러한 우성 선택의 실례는 약물 네오마이신을 사용하거나 (Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), 미코페놀산을 사용하거나 (Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)), 또는 하이그로마이신을 사용한다 (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). 이 세 가지 실례는 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (미코페놀산) 또는 하이그로마이신 각각에 대한 내성을 수송하기 위해 진핵세포 제어 하에 박테리아 유전자를 사용한다. 다른 것으로는 네오마이신 유사체 G418과 퓨라마이신이 있다.
또한 본원에는 하나 또는 그 이상의 본원에 제공된 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 본원에서 사용되는 "세포", "셀라인", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그런 모든 정의는 자손도 포함한다. 개시된 세포는 그 안에 제공된 벡터를 클론하거나 증식하는 데 사용되는 모든 세포일 수 있다. 그러므로 세포는 어떠한 일차 세포 배양물 또는 수립된 셀라인으로부터 유래할 수 있다. 방법은 원핵세포 또는 진핵세포, 예컨대 박테리아, 식물, 동물 등을 포함하여 어떠한 세포에든지 적용될 수 있다. 세포 유형은 벡터의 선택 및 원하는 용도에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 어떠한 핵산 분자 또는 벡터로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시된다. 본원에는 본원에 개시된 어떠한 핵산 분자 또는 벡터로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시되며, 그때에 동물은 포유동물이다. 또한 본원에는 본원에 개시된 어떠한 핵산 분자 또는 벡터로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시되며, 그때에 포유동물은 마우스, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지 또는 영장류이다.
본원에는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체에 포함하는 조성물이 제공된다. 그러므로 본원에는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 둘 또는 그 이상의 어떠한 본원에 제공된 ACT 폴리펩티드의 조합을 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어 본원에는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:5를 포함하는 조성물이 제공된다.
"약제학적으로 허용되는"은 생물학적이 아니거나 그렇지 않으면 바람직하지 않은 물질을 의미하는데, 즉 물질은 환자에게 핵산 또는 벡터와 함께, 어떠한 바람직하지 못한 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 어떠한 다른 성분들과 해로운 방식으로 상호작용하는 일 없이 환자에게 투여될 수 있다. 담체는 천연적으로 당업자들에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 활성 성분의 어떠한 분해든지 최소화하고 환자에게서 어떠한 해로운 부작용이라도 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
본원에는 상처, 조직 손상, 염증 또는 암 부위에 투여될 수 있는 어떠한 공지의 또는 새롭게 발견된 물질을 추가로 포함할 수 있는 조성물이 제공된다. 예를 들면 본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 부류를 추가로 포함할 수 있다: 항생물질 (예컨대 아미노글리코시드, 케팔로스포린, 클로르암페니콜, 클린다마이신, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 마크로리드, 아졸리드, 메트로니다졸, 페니실린, 테트라사이클린, 트리메토프림-술파메톡사졸, 반코마이신), 스테로이드 (예컨대 안드란류 (예컨대 테스토스테론), 클레스탄류 (예컨대 콜레스테롤), 콜산류 (예컨대 콜산), 코르티코스테로이드류 (예컨대 덱사메타손), 에스트란류 (예컨대 에스트라디올), 프레그난류 (예컨대 프로게스테론), 마취성 및 비-마취성 진통제 (예컨대 몰핀, 코데인, 헤로인, 히드로몰핀, 레보르파놀, 메페리딘, 메타돈, 옥시돈, 프로폭시펜, 펜타닐, 메타돈, 날록손, 부프레노르핀, 부토르파놀, 날부핀, 펜타조신), 화학요법제 (예컨대 항암 약물, 예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만, 알트레타민, 아스파라기나제, 블레오마이신, 부술판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 디에틸스틸베스테롤, 에티닐 에스트라디올, 에토포시드, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 고세렐린, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 류프롤리드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 에드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미토크산트론, 파클리탁셀, 펜타스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 프리드니손, 프로카르바진, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 빈블라스틴, 빈크리스틴), 항-염증제 (예컨대 알클로페낙; 알클로메타손 디프로피오네이트; 알게스톤 아세토니드; 알파 아밀라제; 암시나팔; 암시나피드; 암페낙 나트륨; 아미프릴로스 염산염; 아나킨라; 아니롤락; 아니트라자펜; 아파존; 발살라지드 2나트륨; 벤다작; 베녹사프로펜; 벤지다민 염산염; 브로멜라인스; 브로페라몰; 부데소니드; 카르프로펜; 시클로프로펜; 신타존; 클리프로펜; 클로베타솔 프로피오네이트; 클로베타손 부티레이트; 클로피락; 클로티카손 프로피오네이트; 코르메타손 아세테이트; 코르토독손; 데카노에이트; 데플라자코르트; 델라세트트릴; 데포-데스토스테론; 데소니드; 데속시메타손; 덱사메타손 디프로피오네이트; 디클로페낙 칼륨; 디클로페낙 나트륨; 디플로라손 디아세테이트; 디플루미돈 나트륨; 디플루니살; 디플루프레드네이트; 디프탈론; 디메틸 술폭시드; 드로시노니드; 엔드리손; 엔리모마브; 에놀리캄 나트륨; 에피리졸; 에토돌락; 에토페나메이트; 펠비낙; 페나몰; 펜부펜; 펜클로페낙; 펜클로락; 펜도살; 펜피팔론; 펜티아작; 플라잘론; 플루아자코르트; 플루펜남산; 플루미졸; 플루니솔리드 아세테이트; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루오코르틴 부틸; 플루오로메톨론 아세테이트; 플루쿠아존; 플루르비프로펜; 플루레토펜; 플루티카손 프로피오네이트; 푸라프로펜; 푸로부펜; 할시노니드; 할로베타솔 프로피오네이트; 할로프레돈 아세네이트; 이부페낙; 이부프로펜; 이부프로펜 알루미늄; 이부프로펜 피코놀; 일로니답; 인도메타신; 인도메타신 나트륨; 인도프로펜; 인독솔; 인트라졸; 이소플루프레돈 아세테이트; 이속세팍; 이속시캄; 케노프로펜; 로페미졸 염산염; 로목시캄; 로테르페드놀 에타보네이트; 메클로페나메이트 나트륨; 메클로페남산; 메클로리손 디부티레이트; 메페남산; 메살라민; 메세클라존; 메스테롤론; 메탄드로스테놀론; 메테놀론; 메테놀론 아세테이트; 메틸프레드니솔론 술레프타네이트; 모미플루메이트; 나부메톤; 난드롤론; 나프록센; 나프록센 나트륨; 나프록솔; 니마존; 올살라진 나트륨; 오르고테인; 오르파녹신; 옥산드롤란; 옥사프로진; 옥시펜부타존; 옥시메톨론; 파라닐린 염산염; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜부타존 나트륨 글리세레이트; 피르페니돈; 피록시캄; 피록시캄 신나메이트; 피록시캄 올라민; 피르프로펜; 프레드나제이트; 프리펠론; 프로돌산; 프로쿠아존; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 리멕솔론; 로마자리트; 살코렉스; 살나세딘; 살살레이트; 상귀나리움 클로라이드; 세클라존; 세프메타신; 스타노졸롤; 수독시캄; 술린닥; 수프로펜; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 네부펠론; 테니답; 테니답 나트류미 테녹시캄; 테시캄; 테시미드; 테스토스테론; 테스토스테론 블렌드; 테트리다민; 티오피낙; 틱소코르톨 피발레이트; 톨메틴; 톨메틴 나트륨; 트리클로니드; 트리플루미데이트; 지도메타신; 조메피락 나트륨) 또는 항- 히스타민제 (예컨대 에탄올아민 (디펜히드라민 카르비녹사민), 에틸렌디아민 (트리펠렌아민 피릴라민), 알킬아민 (클로르페니라민, 덱스클로르페니라민, 브롬페니라민, 트리프롤리딘), 다른 항-히스타민, 예컨대 아스테미졸, 로라타딘, 펙소페나딘, 브로페니라민, 클레마스틴, 아세트아미노펜, 슈도에페드린, 트리프롤리딘).
조성물은 국소적으로, 경구로, 또는 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들면 조성물은 체외로, 두개골 내로, 질 내로, 항문 내로, 피하고, 피부 안으로, 심장 내로, 위 내로, 정맥 내로, 근육 내로, 복강내 주사에 의해, 경피적으로, 비강 안으로, 또는 흡입에 의하여 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "두개골 내 투여"는 물질을 키테테르 또는 주사바늘을 통해 뇌로 직접, 이를테면 예컨대 인트라테칼로(intrathecal), 인트라시스터널로(intracisternal), 심실내로, 또는 설상골을 통하여(transsphenoidal) 전달되는 것을 의미한다.
조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우 일반적으로 주사에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 주사가능한 것은 종래 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체의 현탁 용액에 적당한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 제조될 수 있다. 보다 최근에 개선된 비경구 투여를 위한 접근법은 느린 방출 또는 지속적인 방출 시스템을 사용함으로써 일정한 용량이 유지되도록 사는 것을 포함한다 (미국 특허 3,610,795호 참조).
본원에서 사용되는 "국소적 비강 내 투여"는 조성물을 한쪽 또는 양쪽 콧구멍을 통해 코 안으로 전달하여 코를 지나가게 하는 것을 의미하며, 분무 메커니즘 또는 비말(droplet) 메커니즘에 의해, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통하여전달될 수 있다. 전달은 또한 삽관법을 통하여 어떠한 호흡계 시스템 (예컨대 폐) 영역에 직접적으로 이루어질 수 있다.
필요한 조성물의 정확한 양은 환자에 따라서 종, 연령, 체중 및 일반적인 환자의 상태, 치료되고 있는 알레르기성 장애의 심각성, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 그것의 투여 방식 등에 따라 다를 것이다. 그러므로 모든 조성물에 대하여 정확한 양을 규명하는 것은 불가능하다. 그러나 적절한 양은 당업자에 의해 당업계에서 제공되는 교시에 따라 기본적인 실험만을 사용하여서도 결정될 수 있다.
물질은 용액 또는 현탁액 (예를 들어 미소입자, 리포솜, 또는 세포에 혼입된 상태)으로 존재할 수 있다. 이것들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 경유하여 특정 세포 유형에 대해 표적이 될 수 있다. 다음의 참고문헌들은 종양 조직에 특정 단백질을 표적화하기 위해 이러한 기법을 사용한 실례들이다: Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991). 비히클, 예컨대 "스텔스(stealth)" 및 다른 항체 포합된 리포솜 (결장 암종에 대한 지질 매개된 약물 포적화를 포함함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개된 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화 및 생체 내에서 쥐의 신경 교종 세포의 고도로 특이적인 치료적 레트로바이러스 표적화. 다음의 참고문헌들은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위해 이러한 기법을 사용한 실례들이다: Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992). 일반적으로 수용체는 세포 이물 흡수 경로에 구조적으로나 리간드 유도적으로 포함된다. 이들 수용체는 클라트린-코팅된 구멍에 모여 클라트린-코팅된 소포를 경유하여 세포 안으로 들어간 후, 그 안에서 수용체가 저장되는 산성화된 엔도솜(endosome)을 통과한 다음, 세포 표면으로 재순환하여 세포내에서 저장되거나, 또는 리소솜에서 분해된다. 내재화 경로는 다양한 기능을 나타내는데, 예를 들면 영양소 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스와 독소의 기회를 틈탄 유입, 리간드의 해리와 분해, 및 수용체-수준의 조절들이다. 많은 수용체들이 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 한 가지 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-중재된 세포 이물 흡수의 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 문헌에 요약되어 있다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
적당한 담체 및 그것들의 제형에 대해서 문헌에 설명되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염이 제형이 등장성이 되도록 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 용액의 pH는 약 5 내지 약 8, 약 7 내지 약 7.5일 수 있다. 나아가 담체는 지속적인 방출 제제, 예컨대 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 그러한 매트릭스는 형태를 갖춘 물품의 형태, 예컨대 필름, 리포솜 또는 미소입자들이다. 당업자들은 어떤 담체가 예를 들면 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 더 바람직할지를 명백하게 알게 될 것이다.
약제학적 담체는 당업자들에게 공지되어 있다. 대부분이 전형적인 이것들은 사람에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체, 이를테면 멸균수, 식염수, 및 생리적 pH에서의 완충 용액과 같은 용액일 것이다. 조성물은 근육 내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물들은 당업자에 의해 사용되는 표준 과정에 따라 투여될 것이다.
약제학적 조성물은 담체, 농축제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 선택된 분자 외에 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 활성 성분, 예컨대 항미생물 제제, 항염증제, 진통제 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 국소적 치료 또는 전신적 치료 중 어느 것이 바람직한지, 그리고 치료된 면적에 따라 많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적으로 (이를테면 눈에, 질에, 직장에, 비강 안에), 경구로, 흡입에 의하여, 또는 비경구로, 예를 들면 정맥내 점적(drip)에 의해, 피하, 복강내 또는 근육내 주사에 의해 이루어질 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비-수성 용매의 실례는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체로는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 이를테면 식염수 및 완충된 배지가 있다. 비경구용 비히클로는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 락테이트화된 링거액, 또는 고정된 오일이 있다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스를 기초로 한 것들), 등이다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 비활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
국소용 투여를 위한 제형으로는 연고, 로션, 크림, 겔 (예컨대 폴록사머 겔), 점적액, 좌제, 분무제, 액체 및 분말이 있을 수 있다. 종래의 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 농축제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 개시된 조성물은 예를 들면 미소섬유, 중합체 (예컨대 콜라겐), 나노스피어, 에어로졸, 로션, 크림, 직물, 플라스틱, 조직 공학처리된 스캐폴드, 매트릭스 물질, 정제, 이식된 용기, 분말, 오일, 수지, 상처용 붕대, 비드, 미소비드, 서방성 비드, 캡슐, 주사제, 정맥내 점적제, 펌프 장치, 실리콘 이식편 또는 어떠한 생체-공학적 물질일 수 있다.
한 측면으로 본 발명의 약제학적으로 허용되는 담체는 폴록사머이다. 폴록사머는 상표명 플루로닉스®로도 언급되는 것으로, 물속에서 투명한 열가역성 겔을 형성하는 비이온성 계면활성제이다. 폴록사머는 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 (PEO-PPO-PEO) 삼-블록 공중합체이다. 두 개의 폴리에틸렌 옥사이드 사슬은 친수성이지만 폴리프로필렌 사슬은 소수성이다. 이들 소수성 및 친수성 특성은 수용액에 들어있을 때 전하를 띄게 한다. PEO-PPO-PEO 사슬은 작은 가닥의 형태를 취하며, 그때 소수성 중심이 함께 미셸을 형성하게 되는 것이다. 미셸은 결과적으로, 그것들이 그룹으로, 물이 친수성 단부들 주위에서 약하게만 존재하는 고체 (겔)을 형성하게 되기 때문에 겔화되는 특성을 가지는 경향이 있다. 그것이 차가워지면 액체가 되지만, 가온하면 경화된다. 이런 특성으로 인해 미셸은 약제학적 화합물 제조에 유용하게 되는데, 왜냐하면 미셸은 그것이 저온일 때 정확한 용량으로 주사기에 넣을 수 있기 때문이다. 그것이 체온으로 가온되면 (피부에 적용될 때) 적절한 문지름과 응착을 용이하게 하기 위해 정확한 농도로 농축된다 (특히 대두 레시틴/이소프로필 팔미테이트와 조합될 때). 플루로닉®F127 (F127)은 그것이 쉽게 얻어지고, 따라서 그러한 약제학적 용도에 사용되기 때문에 널리 사용된다. F127은 100:65:100의 비율로 EO:PO:EO를 가지며, 중량 비율은 P대PPO가 2:1이다. 플루로닉 겔은 수용액이며 전형적으로 20-30%의 F127을 함유한다. 그러므로 본 발명의 조성물은 F127로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 향낭, 또는 정제를 포함한다. 농축제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 것이다.
일부 조성물은 잠재적으로 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산, 및 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과의 반응에 의해, 또는 무기 염기, 예컨대 수산화 나트륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼륨, 및 유기 염기, 예컨대 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민과 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가 염으로서 투여될 수 있다.
조성물을 투여하기에 효과적인 용량 및 스케줄은 실험적으로 결정될 수 있으며, 당업자에 의해 그러한 결정이 이루어진다. 조성물의 투여를 위한 용량 범위는 증상 장애가 영향을 받는 바람직한 효과가 산출될 정도로 충분히 크다. 용량은 해로운 부작용, 예컨대 원하지 않는 교차-반응, 과민성 반응 등을 일으킬 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지의 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 용량은 어떠한 금기 사항의 경우에는 개별적인 의사에 의해 조정될 수 있다. 용량은 달라질 수 있고, 매일 1회 또는 그 이상으로 하루 또는 여러 날 동안 용량이 투여될 수 있다. 주어진 부류의 약제학적 제품에 대한 적절한 용량에 대해서는 문헌에서 그 지침을 찾아볼 수 있다. 용량 범위는 크게는 본원에 제공되는 조성물의 용도, 질병의 심각성, 및 그것의 투여 경로에 좌우된다.
예를 들어 연구를 위한 실험실 도구로서의 용도에서는 ACT 펩티드 조성물은 0.01% w/v의 낮은 용량으로 사용될 수 있다. 용량은 국소용 피부 상처 치료시에는 최저 0.02% w/v 내지 아마도 최고 2% w/v 일 수 있다. 그 자체만으로 또는 다른 화합물과 조합시 상당히 더 높은 농도의 조성물이 암/종양 치료법 같은 용도에서 또는 급성 조직 손상 직후에 초기 농축된 거환으로서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드의 상한선은 초기 거환으로서, 예컨대 직접적으로 종양 덩어리에 전달된다면 2-5% w/v 또는 v/v일 수 있다. 예를 들어 근육내, 대뇌 안, 심장 내 및 척수 내 투여의 비경구 투여에 대한 용량에 대해 권장된 상한선은 손상의 심각성에 따라 1% w/v 또는 v/v일 수 있다. 용량의 이런 상한선은 제형에 의해, 예컨대 폴리펩티드(들)이 그것의 작용을 촉진하는 또는 폴리펩티드(들)과 어울려 작용하는 다른 제제와의 조합 방법에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 연속적인 전달을 위해서는, 예를 들면 정맥 내 점적액과의 조합시, 시간의 경과에 따라 질환의 개선을 토대로 의사에 의해 결정된 0.01g/kg 체중의 상한선이 사용될 수 있다. 다른 실례에서는, 예컨대 근육내, 대뇌 내, 심장 내 및 척수 내로 내부 전달되는 제공된 핵산의 농도의 상한선은 용액 ml당 50-100㎍일 것이다. 다시 한번 강조하자면 빈도는 개선 상태를 토대로 의사에 의해 결정될 것이다.
또한 본원에는 수술 전에 본 발명의 폴리펩티드로 한 영역을 사전-조건화하는 것이 개시된다. 폴리펩티드의 농도는 10-30%의 플루로닉 겔 또는 수술 전 최소한 3-6시간의 기간 동안 관심의 부위 내에 펩티드(들)이 침투하는 것을 가능하게 하는 어떠한 그러한 담체와 혼합된 10-200μM일 수 있다. 이 사전-수술 조건화는 수술에 대한 후속적인 치유 반응, 이를테면 감소된 염증 반응을 개선할 수 있다.
바이러스 벡터는 임상 적용에서 상당한 가능성을 보여줌에도 불구하고 매우 실험적 도구로 존재한다. 그 자체로서, 바이러스 벡터에 대한 예상된 용량 요법의 계산에는 주의가 경고되며, 사용된 벡터의 유형에 상당히 좌우될 것이다. 예를 들어 레트로바이러스 벡터는 분할하는 세포, 예컨대 암세포를 효과적으로 감염시켜서 숙주 세포 게놈 안에 끼어 들어가 코드화된 단백질의 발현을 무기한으로 지속시킨다. 동물 모델 세팅에서 레트로바이러스의 전형적인 용량은 ml당 107 내지 109 감염 단위의 범위이다. 대조적으로, 아데노바이러스는 후-유사분열 세포를 가장 효과적으로 표적화하지만, 세포들은 숙주 면역 시스템에 의해 신속하게 제거되거나 또는 바이러스는 궁극적으로 감염된 세포가 증식을 다시 시작하고 계속해서 바이러스의 에피솜성 DNA를 희석시킨다면 사라진다. 실제로 이런 일시적인 감염의 시간 경과는 어떤 임상적 상황, 예컨대 작은 손상을 개선할 때에는 본원에 설명된 조성물의 단기간 전달에 유용할 수 있다. 동물 모델에서, 아데노바이러스의 ml당 108-1011의 감염 단위의 농도는 연구에 사용하기에 전형적인 농도이다. 동물 모델로부터 유도된 데이터를 기초로 한 벡터의 용량 범위는 약제학적으로 허용되는 제형(들)을 개발하는 동안, 임상적 환경(들)에서는 궁극적으로 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.
염증을 감소시키고, 치유를 촉진하고, 반흔 형성을 감소시키고, 인장 강도를 증가시키며, 조직 재생을 촉진하기 위하여 0.02% w/v의 ACT 조성물이 두 번: 한 번은 급성으로 적용되고 두 번째는 24시간 후에 국소적으로 적용된다. 그러나 임상적 환경에서는 5% 이하의 농도로 하루에 3회까지의 증가된 빈도의 국소 적용이 상당한 개선이 이루어진 것으로 의사에 의해 측정될 때까지 권장된다. 내부 투여, 예를 들어 정맥내, 근육내, 대뇌내, 심장 내 및 척수내 투여를 위해서는 의사에 의해 상당한 개선이 이루어진 것으로 측정될 때까지 하루에 1% w/v 또는 v/v의 용량으로 3회 이하의 빈도까지 증가된다.
상처 치유를 촉진하기 위해 폴리펩티드와 같은 개시된 조성물을 투여한 후에, 치료용 조성물의 효능은 숙련된 실시자에게 잘 알려져 있는 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들어 당업자는 본원에 개시된 조성물, 예컨대 폴리펩티드가 조성물이 손상 후 환자에게서 반흔 조직 형성을 감소시키고, 섬유 조직 형성을 감소시키며, 조직 재생을 개선하거나 염증을 감소시킬 수 있다는 것을 관찰함으로써 환자에게서 상처 치유를 촉진하는 데 효력을 나타낸다는 것을 인지하게 될 것이다. 이런 기준을 측정하는 방법은 당업계에 공지이며 본원에서도 논의된다.
또한 본원에는 본 발명의 조성물 (예컨대 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터)을 포함하는 물질이 제공된다. 예를 들어 본원에는 ACT 폴리펩티드로 코팅된, 상처를 치료하기 위해 사용된 물질이 제공된다. 상처를 치료하기 위해 사용된 그런 물질의 비-제한적인 실례로는 붕대, 스테리-스트립(steri-strip), 봉합사, 스테이플, 또는 이식 조직 (예컨대 피부 이식편)을 포함한다.
예를 들어, 물질 (예컨대 붕대, 스테리-스트립, 봉합사, 스테이플, 이식편)은 본 발명의 폴리펩티드에 10-200μM의 농도 범위로 침지될 수 있다. 그런 다음 물질은 건조되고 멸균 용기 안에 밀봉된다. 물질은 또한 10-200μM 농도의 폴리펩티드를 함유하는 4℃의 액체 10-30% 플루로닉 겔에 침지될 수 있다. 그런 다음 물질은 대략 실온의 온도가 되어 겔이 중합되어, 결과적으로 폴리펩티드-침지된 겔 코팅이 물질을 둘러싸게 되고, 그것은 멸균 용기 안에 밀봉될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 교차-결합할 수 있는 하이드로겔 시스템, 예컨대 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 또는 폴리우레탄안에 통합된 후, 상처를 치료하기 위한 물질 (예컨대 붕대, 스테리-스트립, 봉합사, 스테이플, 이식편)로 형성된다.
또한 본원에는 환자에게 이식하기 전에 본 발명의 폴리펩티드로 코팅된 의료용 이식 조직 조각이 개시된다. 예를 들어 그런 이식 조직 조각의 수술에서 공통적인 문제는 관심의 조직의 원하지 않는 경화, 수축 및 궁극적으로는 기형을 유도하는 반흔 조직 형성으로부터 이식 조직 조각 주변의 수축 캡슐이 형성된다는 것이다. 본 발명의 폴리펩티드를 이식 조직 조각에 또는 그 위에 사용하는 것은 이런 기형을 감소 또는 방지할 수 있다. 의료용 이식 조직 조각의 비-제한적 실례로는 사지의 인공 보철물, 가슴 이식 조직 조각, 음경의 이식 조직 조각, 고환의 이식 조직 조각, 의안, 안면 이식 조직 조각, 인공 관절, 심장 판 인공보철물, 혈관 인공보철물, 의치, 안면 인공보철물, 명칭이 붙은 디스크 판, 케이지에 들어있는 거환 밸브 (caged ball valve), 귀 인공보철물, 코 인공보철물, 심장 박동 조절 장치, 인공귀, 및 피부 대체물 (예컨대 돼지의 이종성 이식편/돼지 피부, BIOBRANE, 배양된 케라틴 생성세포)이 있다.
A. 방법
본원에는 환자에게서 조직 손상 후에 상처 치유를 촉진하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 환자에게 약제학적으로 허용되는 담체에 들어있는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 조성물 (예컨대 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터)을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 추가로 본원에는 조직 손상을 입은 환자를 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 약제학적으로 허용되는 담체에 들어있는 하나 또는 그 이상의 본원에 제공된 조성물 (예컨대 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터)을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
"촉진한다", "촉진" 및 "촉진하는"은 활성, 반응, 상태, 질병, 또는 다른 생물학적 매개변수의 증가를 말한다. 이것은 활성, 반응, 상태, 또는 질병의 개시를 포함하지만 그것들에 제한을 받지는 않는다. 이것은 또한 예를 들면 천연 또는 대조 수준과 비교하여 활성, 반응, 상태, 또는 질병의 10% 증가를 포함한다. 그러므로 천연 또는 대조 수준과 비교하여 둘 사이에 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 어떠한 양의 증가든지 증가라 할 수 있다.
"치료하다" 또는 "치료"는 질병 또는 질환의 효과를 감소시키는 방법을 의미한다. 치료는 또한 증상 자체보다는 오히려 질병 또는 질환 자체의 근본적인 원인을 감소시키는 방법을 말한다. 치료는 천연 수준으로부터 어떠한 감소도 될 수 있고, 질병 또는 질환의 질병, 상태, 또는 증상의 완전한 제거일 수 있지만 그것에 제한은 받지는 않는다. 예를 들어 본 발명에 개시된 상처 치유를 촉진하는 방법은 동일한 환자 또는 대조 환자와 비교할 때 질병에 걸린 환자에게서 하나 또는 그 이상의 질병의 증상이 10% 감소만 되어도 치료된 것으로 간주된다. 그러므로 천연 또는 대조 수준과 비교하여 둘 사이에 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 어떠한 양의 감소든지 감소라 할 수 있다.
본원에서 "환자"는 동물, 식물, 박테리아, 바이러스, 기생충 및 핵산을 가지고 있는 어떠한 다른 유기체 또는 존재이며, 그것들에 한정되지 않는다. 환자는 척추동물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 포유류 (예컨대 사람, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 비-사람 영장류, 소, 개, 기니아 피그 또는 설치류), 어류, 새 또는 조류 또는 양서류일 수 있다. 환자는 무척추동물, 보다 구체적으로는 절지동물 (예컨대 곤충 및 갑각류)일 수 있다. 이 용어는 특정 연령 또는 성을 나타내지는 않는다. 그러므로 성인과 신생아 환자뿐 아니라 태아라도, 남성이나 여성이나 포함하는 것으로 의도된다. 환자는 질병이나 장애로 시달리는 환자를 말한다. 용어 "환자"는 사람과 가축을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 환자에게서 조직 손상 후에 반흔 조직 형성을 감소시킬 수 있다. "반흔 조직"이란 조직이 파괴된 콜라겐 및 조직의 파괴를 수선하는 기능을 하는 다른 연결 조직 단백질의 과잉생성에 의해 유발된, 신체의 어떠한 조직에서든지 손상 또는 질병의 부위에서 형성되는 섬유상 (섬유 형성) 연결 조직을 의미한다. 반흔 조직은 손상된 피부와 근원적인 근육, 손상된 심장 근육, 또는 간과 같은 내부 기관의 질병 부위를 대체할 수 있다. 조밀하고 두꺼운 반흔 조직은 주변의 조직보다 통상적으로 더 희멀건데, 왜냐하면 혈액이 빈약하게 공급되고, 구조적으로 파괴된 조직을 대체하고는 있을지라도 잃어버린 조직의 기능을 수행할 수는 없기 때문이다. 그것은 때로 포함된 조직의 정상적인 탄성을 제한할 콜라겐 섬유로 구성된다. 따라서 반흔 조직은 림프계나 순환계에 영향을 미칠 때 근육 운동의 범위를 제한하거나 적절한 유체의 순환을 방해한다. 뇌 또는 척수의 손상 후에 생겨나는 교질성 반흔 조직은 중추 신경계에 대한 손상 후에 신경 기능의 복원에 대한 주요한 장애물들 중 하나이다. 반흔 조직의 감소는 손상된 부위 내에 있는 세포 유형의 집단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어 교질성 반흔 조직의 감소는 성상 세포에 대한 뉴런 세포의 비율의 증가에 의해 추정할 수 있다. 반흔 조직 형성의 감소는 반흔 폭 또는 반흔 조직의 면적의 간단한 측정에 의해서도 측정될 수 있다 (Wilgus et al., 2003). 또한 정상 조직과 비교하여 치유된 조직 내의 구조적 복합성의 회복에 대해 조직학적 평가가 이루어질 수 있다.
환자에게서 조직 손상 후에 섬유증 조직 형성을 감소시키는 것과 더불어, 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 환자에게서 섬유증 조직 형성의 병리학적 증가와 관련된 질환들, 예를 들면 건선, 피부 및 전신성 매스토사이토시스(mastocytosis), 천식, 습진, 정맥두염, 아테롬성 동맥경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경색, 폐의 섬유증 및 포낭 섬유증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 환자에게서 섬유증 조직 형성의 감소는 환자의 주어진 조직 및/또는 기관의 정상적인 구조 및 기능으로의 복귀가 치료 다음에 발생하였는지의 여부를 평가하는 의사의 임상적 판단에 의해 측정될 수 있다. 한 실례로서, 건선에 대하여 의사는 환자의 피부가 벗겨지기 쉬운 백색 축적으로 덮인 돋아나는 적색 피부의 영역이 감소되었는지의 여부를 결정할 수 있다. 어떤 종류의 건선은 여드름같은 (농포성 건선) 또는 화상을 입은 것 같은 (적색이 드러나 보이는) 외관을 특징으로 한다. 그런 경우에 의사는 치료가 이들 증상의 감소를 초래하였는지의 여부를 측정할 것이다. 의사가 환자의 조직 또는 기관에 대한 생검이 임상적으로 활용가능하고 및/또는 사람 질병의 동물 모델에서 필요하다고 판단되는 경우에, 생검의 조직 단편이 준비될 수 있고 조직의 조직학적 구조는 임상 병리학자 및/또는 훈련된 조직학자에 의해 섬유증의 감소 및 정상 조직 구조 및 기능의 회복이 일어났음을 측정하기 위해 평가될 수 있다. 정상 조직에 대한 섬유증 영역은 또한 그러한 조직학적 제제에 대해 정량적으로 평가될 수 있다.
본 발명의 방법은 환자에게서 정상 조직의 기계적 특성, 예컨대 조직 손상 후 인장 강도를 회복시킬 수 있다. "인장 강도"란 조직 또는 상처를 파괴하기에 필요한 스트레스 또는 긴장의 양을 말한다.
치료된 상처의 인장 강또는 치료 후 3개월 이내에 손상되지 않은 조직의 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%일 수 있다. 그러므로 본원에는 환자에게서 조직의 기계적 특성을 회복시키는 방법, 이를테면 정상적인 손상되지 않은 조직의 인장 강도에 접근 또는 도달하기 위하여 치유된 손상의 인장 강도를 증가시키기 위한 방법이 제공되는데, 그 방법은 환자에게 약제학적으로 허용되는 담체에 들어있는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 조성물 (예컨대 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터)을 투여하는 것으로 이루어진다.
인장 강도/신장성과 관련하여 중요할 상처의 유형은 근골격 구조/조직에 대한 손상 및 이들 구조를 덮고 있는 피부를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 방법은 연결된 관절, 뼈, 연골 조직, 힘줄 또는 인대의 인장 강도를 개선할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 고도의 스트레스/긴장상태에 놓여있는 피부, 예컨대 팔꿈치, 무릎, 또는 발을 덮고 있는 피부의 인장 강도를 개선할 수 있다. 관절 손상의 치유와 관련하여 가장 흔한 문제는 이들 영역에서 발생하는 과도한 반흔 형성이 수축을 유도하고, 치유된 관절 부위의 비-신장성이다. 이것은 심각한 미용 및 심리적 결과를 초래한다. 펩티드의 특성은 보다 큰 관절의 이동성을 유도하는 그러한 반흔 조직의 형성을 조절하고 경감하는 것을 보조할 것이다.
본 발명의 방법은 환자에게서 조직 손상에 따르는 조직 재생을 개선할 수 있다. "재생"이라 함은 신체 또는 신체 일부, 조직, 또는 손상 후의 또는 정상적인 신체 과정으로서의 물질의 소생, 재-성장 또는 회복을 의미한다. 반흔 형성과는 대조적으로, 조직 재생은 그것의 원래 구조, 기능, 및 생리적 상태로의 조직의 회복을 포함한다. 이것은 또한 본원에서 조직 "복잡성"으로 언급된다. 회복은 부분적이거나 완전할 수 있는데, 그것은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 회복을 의미하거나, 또는 천연 또는 대조 수준과 비교하여 둘 사이의 어떠한 양의 회복을 의미한다. 실례로서, 피부 손상의 경우에, 조직 재생은 모낭, 선(glandular) 구조, 혈관, 근육, 또는 지방의 회복을 포함할 수 있다. 뇌 손상의 경우에, 조직 재생은 뉴런의 유지 또는 회복을 포함할 수 있다. 실례로서 피부의 경우, 조직 재생의 개선은 정상적인 재생된 피부에 대한 섬유상 반흔 조직의 부피를 비율로서 측정함으로써 평가될 수 있다. 다른 실례로서, 뚜렷한 재생 구조, 예컨대 상처 영역의 부피에 대해 기준화된 재생 피부 선으로 계수가 이루어질 수 있다.
한 측면으로, 조직 재생은 손상된 세포를 대체하기 위한 줄기세포의 보충 및 분화를 포함한다. 본원에서 사용되는 "줄기 세포"는 조직 또는 기관의 분화된 세포들 중에서 발견된, 또는 예컨대 조직 또는 기관의 주요한 특수화된 세포 유형을 생성하기 위해 그 자체 소생되고 분화할 수 있는 줄기 세포, 성인 골수 줄기 세포에 대한 외부 공급원으로부터 유입된 미분화 세포이다. 살아있는 유기체에서 줄기 세포의 일차 역할은 그것들이 발견되는 조직을 유지하고 수복하는 것이다. 줄기 세포 분화란 그것으로써 비특수 세포 (예컨대 줄기 세포)가 특수한 세포, 예컨대 피부, 뉴런, 심장, 간, 또는 근육 세포의 특징을 획득하게 되는 과정을 말한다. 실례로서, 피부 손상의 경우 조직 재생은 상피에 존재하는 줄기 세포가 모낭으로 분화하는 것을 포함할 수 있다 (Alonso and Fuchs, 2003). 뇌 손상의 경우에는 조직 재생은 줄기 세포가 뉴런으로 분화하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 환자에게서 조직 손상 후에 줄기 세포 분화를 증강시킬 수 있다. 증강된 줄기 세포 분화는 임상적으로 허용되는 유전적 또는 다른 내인성 또는 이식된 줄기 세포를 표지하고 표지된 줄기 세포의 정상적인 조직 구조로의 분화 및 통합의 빈도를 측정하는 방법을 제공함으로써 측정될 수 있다. 다른 실례로서, 어떤 구조, 예컨대 모낭은 조직 손상 후에 내인성 줄기 세포로부터 재생되는 것으로 알려져 있다. 그와 같이, 조직 손상에 대해 정상화된 모낭의 계수는 증강된 줄기 세포 분화의 정량적 평가로서 작용할 것이다.
본 발명의 방법은 환자에게서 염증을 감소시킬 수 있다. "염증", "염증 반응" 또는 "면역 반응"이란 살아있는 조직이 손상, 감염 또는 자극에 반응하는 것을 의미하는 것으로, 증가된 혈류와 면역 세포의 유입 및 분비의 결과로서 생성된 홍반, 온기, 팽창, 통증, 및 기능의 상실을 특징으로 한다. 염증은 감염성 미생물의 침입에 대한 신체의 반응으로, 영향을 받은 영역으로의 혈류의 증가, 백혈구를 끌어내는 화학물질의 방출, 및 파편을 제거하기 위한 단핵세포 (또는 뇌의 경우 성상 세포)의 도달을 초래한다. 염증 반응을 자극하는 것은 무엇이나 염증성이라 부른다. 그러므로 환자에게서 조직 손상에 대한 반응으로 염증을 감소시키는 것 외에, 본 발명의 조성물 및 방법은 염증성 세포의 수준의 병리학적 증가와 관련된 장애, 예를 들면, 천식, 습진, 정맥두염, 아테롬성 동맥경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질병, 피부 및 전신성 매스토사이토시스, 건선, 및 다발성 경색을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 사용한 치료는 또한 예컨대 치유하고 있는 상처의 가려움을 감소시킬 수 있다. 일반적으로 가려움은 비만 세포에 의한 히스타민 방출의 결과이다. 본 발명의 폴리펩티드는 비만 세포 탈과립화 및 히스타민 방출을 감소시킬 수 있다. 그러므로 본 발명의 폴리펩티드는 히스타민 방출을 포함하는 질환, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 가려움, 긁음, 구멍의 염증, 알레르기성 감기, 눈의 충혈, 천식, 및 습진을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
염증의 감소는 염증성 세포 유형, 예컨대 단핵 세포 또는 성상세포의 밀도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 염증의 감소는 염증성 세포 유형, 예컨대 호중구, 비만 세포, 호염기성 세포, 및 단핵 세포의 밀도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 염증의 감소는 호중구 활성의 생체 내 측정에 의해 계산될 수 있다 (Jones et al., 1994). 또한 비만 세포 탈과립화의 빈도 또는 히스타민 수준의 측정 또는 반응성 산소 종의 수준과 같은 인자들도 염증 감소의 척도로서 사용될 수 있다. 염증의 수준은 또한 qRT-PCR에 의해 어떤 유전자, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 종양 괴사 인자-알파, 인터류킨 1베타, -2, -4, -5, -6, -8, -12, -18, -23, -27, CD4, CD28, CD80, CD86, MHCII, 및 iNOS와 같은 유전자의 전사 수준을 체크함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 조직 및/또는 환자의 유체, 이를테면 혈장 내 전-염증성 사이토킨 수준의 측정은 염증 감소의 척도일 수 있다. ACT 펩티드 작용의 메커니즘은 염증성 세포 이동의 억제 및/또는 전-염증성 화학물질 (히스타민, 반응성 산소 종) 및 전-염증성 사이토킨, 예컨대 인터류킨(IL)-1, IL-6, IL-8 및 종양 괴사 인자 (TNF)의 억제에 의해서 이루어질 수 있다는 것은 주목할만하다.
본 발명의 방법은 환자에게서 형질전환된 세포의 증식을 억제할 수 있다 (도 2 참조). 형질전환된 세포란 비정상적으로 분할하고 재생되며 조절되지 않는 성장을 나타내는 신생물, 암, 또는 종양 세포를 의미한다. 그러므로 상기 형질전환된 세포의 증식의 억제 (즉 과형성)는 성장의 감소 및 따라서 암의 악성을 초래한다. 그것을 치료하기 위해 본 발명의 조성물 및 방법이 사용될 수 있는 대표적이지만 비-제한적인 암의 목록은 다음과 같다: 신경교종, 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 사상균병 균상종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계암, 머리와 목의 암, 머리와 목의 비늘모양 세포 암종, 신장암, 폐암, 예컨대 작은 세포 폐암 및 비-작은 세포 폐암, 신경아세포종, 신경교아세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 입, 인후, 후두, 및 폐의 비늘모양 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 유방암, 및 상피암, 신장암, 비뇨생식기 암, 폐암, 식도 암종, 머리와 목의 암종, 대장암, 조혈암, 고환암, 결장 및 직장암, 전립선암, 또는 췌장암. 그러므로 본 발명의 방법은 환자의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법은 환자의 신경교종을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
형질전환된 세포 증식의 억제는 다양한 세포 증식 마커 및 키트, 예컨대 Ki67/MIB-1 면역염색, 적정된 티미딘 또는 브로모데옥시우리딘 표지화 지수, DNA S-상 분획, 증식하는 세포 핵 항원 발현, 잠재적인 배가 시간 및 핵인의 조직화 영역 관련 단백질 (Agnor)에 의해 측정될 수 있다. 종양의 증식 활성이 사이클에 대해 전용된 세포의 비율 (성장 분획) 및 세포 사이클의 속도 두 가지에 모두 의존적이기 때문에, 실제 종양의 증식 활성은 식 [PA=Ki67 또는 MIB-1 scross×AgNOR](Pich et al., 2004)에 의해 잘 측정될 수 있을 것이다. 다른 실례에서는, 조직병리학자가 생검 조직 절편을 형질전환된 세포 집단에서 증식을 측정하기 위하여 유사분열의 단순한 정성적 및 정량적 지수를 사용함으로써 평가하는 데 익숙하다.
다양한 마우스 모델이 암 연구를 위해 개발되었다. 특이한 유형의 암을 위한 특이한 마우스 모델도 있다. 예를 들어 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 위장암, 비뇨생식기 암, 머리와 목의 암, 조혈암, 신장암, 폐암, 유선암, 흑색종, 골수종, 신경계암, 경구암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암이다. 이들 모델은 잘 설명되어 있고 사용되고 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터의 바람직한 효과는 이들 모델 중 어떠한 것에서도 연구될 수 있다. 예를 들어 피부암 마우스 모델은 쉽게 증명용으로 사용될 수 있다. 암은 특이한 병원체가 없는, 동종교배 마우스 (누드 마우스)를 사용하여 성장하는 사람 암 조직의 이종이식편 모덱을 적용하여 배양될 수 있다 (Yoo, 2004). 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터는 예컨대 생체공학처리된 물질, 예를 들면 중공 섬유 막 (Orlandini and Margaria, 1983; Ming Chu et al., 1998) 및 미소섬유, 서방성 비즈, 피하 주사기, 유치 도뇨관에 투여될 수 있으며, 그것들은 국소적으로 암 성장 부위에 삽입되거나, 또는 전신적으로, 예컨대 정맥내 주입, 근육내로, 복강내 주사로 그것의 표적에 도달하기 위해 투여될 수 있다. 이 치료는 그 자체로 또는 다른 치료용 화합물, 예를 들면 화학요법제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 환자에게서 형질전환된 세포의 전이를 억제할 수 있다. "전이"란 통상 혈관 또는 임파선에 의해 신체의 원래 부위로부터 하나 또는 그 이상의 다른 곳으로 암 세포가 전파되는 것을 의미한다. 전이는 일련의 사건으로 분류될 수 있다. 먼저, 암세포 이동은 그 종양 세포가 일차 성장 부위를 떠나, 때로는 기저막을 침투하여 국소 맥관구조로 향하여 이동하는 과정을 시작한다. 안으로의 유입은 맥관 구조 안으로의 암세포 유입의 과정 및 먼 부위에의 분포를 설명해준다. 분출은 암세포가 맥관구조로부터 물러나는 과정을 말한다. 마지막으로, 암세포가 먼 부위에서 증식하는 것은 명백하게 국소화된 성장 인자 활용성, 간질 세포의 영향, 및 둘러싸고 있는 세포외재성 매트릭스 환경 (소위 "토양")뿐만 아니라 결과적으로 성장하는 종양의 맥관구조화에 의해 제공되는 영양소 및 인자들의 활용성에 의해 영향을 받는다. 그러므로 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 세포의 이동 (즉 전이성 이동)을 억제함으로써 환자에게서 형질전환된 세포의 전이를 억제할 수 있다. 종양 형성은 조절되지 않은 세포 증식을 유도하는 세포 사이클 해체의 결과이다. 세포 사이클 진행 및 유사분열 사이의 단계들을 통한 체크포인트 트래버세이션(traversation)을 조절하는 특이한 세포 과정-메커니즘은 조절되지 않는다. 정상적으로 이들 사건은 보존성 메커니즘과 세포 사이클 유전자 및 그것들의 산물과 같은 분자에 의해 고도로 보존된다. 전이성 이동의 억제는 그러한 세포 사이클 유전자 및 생성물, 예컨대 사이클린, 사이클린 의존성 키나제 (Ckd), Cdk 억제제 (CKI) 및 세포 외재성 인자 (즉 성장 인자)의 수준에 의해 측정될 수 있다. 레이저 혈구계산 및 상업적 소프트웨어를 사용한 혁신적인 기법이 세포 사이클 과정과 세포 성장을 정량하고 평가하기 위해 활용될 수 있다. S-단계 분획 측정, 이를테면 배수성 값을 막대 그래프와 유사분열 지수 및 종양-배가 시간 지수와 같은 지수의 평가를 사용하여 측정하는 것은 종양 공격을 평가하기 위한 적절한 정보를 임상의에게 제공해준다.
본원에서 사용되는 조직 손상은 예를 들면, 긁힘, 칼로 베임, 찢어진 상처, 눌린 상처, 압박 상처, 스트레치 손상, 물린 상처, 찰과상, 총탄 상처, 폭발 손상, 바디 피어싱, 찔린 상처, 화상, 바람에 의한 상처, 태양 화상, 화학약품 화상, 수술 상처, 수술적 간섭, 의료용 간섭, 세포, 조직 또는 기관 이식 후 숙주 거부반응, 약제 효과, 약제학적 부작용, 욕창, 방사선 손상, 화장품으로 인한 피부 상처, 내부 기관 손상, 질병 과정 (예컨대 천식, 암), 감염, 감염성 병원체, 발생 과정, 성숙 과정 (예컨대 여드름), 유전자 비정상, 발생 비정상, 환경적 독소, 알레르기 유발 물질, 두피 손상, 안면 손상, 턱 손상, 발 손상, 발가락 손상, 손가락 손상, 뼈 손상, 생식 기관 손상, 관절 손상, 분비기관 손상, 눈 손상, 각막 손상, 근육 손상, 지방 세포 함유 조직 손상, 폐 손상, 기도 손상, 헤르니아 (특히 탈장), 항문 손상, 치질, 귀 손상, 망막 손상, 피부 손상, 복부 손상, 팔 손상, 다리 손상, 운동 손상, 등 손상, 분만시 손상, 조기 분만 손상, 독소가 있는 생물체에게 물림, 쏘임, 힘줄 손상, 인대 손상, 심장 손상, 심장관 손상, 혈관계 손상, 연골 조직 손상, 임파계 손상, 두개 대뇌 외상, 탈구, 식도 천공, 누관, 손톱 손상, 외래 물질, 골절, 동상, 손 손상, 열스트레스 장애, 찢어짐, 목 손상, 자해, 쇼크, 외상적 연 조직 손상, 척수 손상, 척주 손상, 접질림, 긴장, 힘줄 손상, 인대 손상, 연골조직 손상, 흉부 손상, 치아 손상, 외상, 신경계 손상, 노화, 동맥류, 스트로크, 소화관 손상, 경색, 또는 허혈성 손상으로부터 초래한다.
B. 조성물의 제조 방법
본 발명의 조성물 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요한 조성물은 특별히 다른 언급이 없는 한 특정 시약 또는 화합물에 대하여 당업자들에게 공지되어 있는 어떠한 방법이든지 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들어 본 발명의 핵산은 표준 화학적 합성법을 사용하여 제조되거나 효소적 방법 또는 어떠한 다른 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 방법은 표준 효소적 소화에 이어 뉴클레오티드 단편을 분리하는 방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6)으로부터 순수한 합성 방법, 예를 들면 밀리겐 또는 벡크만 시스템 1과 DNA 합성기 (예컨대 Model 8700 자동 분석기, Milligen-Biosearch, Burlington, MA 또는 ABI Model 380B)를 함께 사용하는 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 이르기까지 다양하다. 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 유용한 합성 방법 또한 문헌에 설명되어 있다 (Ikuta et al, Ann. Rev. Biochem . 53:323-356 (1984), (포스포트리에스테르 및 포스파이트-트리에스테르 방법), 및 Narang et al., Methods Enzymol, 65:610-620 (1980), (포스포트리에스테르 방법)). 단백질 핵산 분자는 닐센 등에 의해 설명된 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Nielsen et al, Bioconjug. Chem . 5:3-7 (1994)).
본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO:2를 제조하는 한 가지 방법은 둘 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 단백질 화학 기법에 의해 연결하는 것이다. 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드는 현재 활용할 수 있는 실험실 장비를 사용하여 Fmoc (9-플루오레닐메틱옥시카르보닐) 또는 Boc (tert-부틸옥시카르보닐)을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자는 본 발명에 개시된 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성되고 그것의 합성 수지로부터 절단될 수 없는 한편, 펩티드 또는 단백질의 다른 단편은 합성되고 계속해서 수지로부터 절단됨으로써, 기능적으로 차단된 말단 기가 다른 단편에 노출된다. 펩티드 축합반응에 의해, 이들 두 단편은 그것들의 카르복실 및 아미노 말단에서 각각 펩티드 결합을 통해 공유적으로 결합하여 단백질, 또는 그것의 단편을 형성한다 (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer- Verlag Inc., NY). 또는 달리 펩티드 또는 폴리펩티드는 생체 내에서 본원에 설명되는 것과는 무관하게 합성된다. 일단 분리된 후에는 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합반응을 통하여 결합되어 펩티드 또는 그것의 단편을 형성할 수 있다.
예를 들어 클론되거나 합성된 펩티드 절편의 효소적 결찰로 인하여 상대적으로 짧은 펩티드 단편이 결합하여 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성하는 것이 가능해진다 (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). 또는 달리, 합성 펩티드의 천연 화학적 결찰이 더 짧은 펩티드 단편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학 반응으로 구성된다 (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫 번째 단계는 비보호 합성 펩티드-티오에스테르와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하고 있는 다른 비보호 펩티드 절편과의 화학선택적 반응으로 그 결과 초기 공유 생성물로서 티오에스테르-결합된 중간체가 생성된다. 반응 조건을 변화하지 않은 채로, 이 중간체는 자발적이고 신속한 분자내 반응을 진행하여 결찰 부위에 천연 펩티드 결합을 형성한다 (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
또는 달리, 비보호 펩티드 절편은 화학적으로 결합되는데, 그때에 펩티드 절편들 사이에 형성된 결합은 화학적 결찰의 결과로서 비천연적인 (비-펩티드) 결합이 된다 (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 이 기법은 단백질 도메인의 유사체뿐만 아니라 온전한 생물학적 활성을 가지고 있는 다량의 상대적으로 순수한 단백질을 합성하기 위하여 사용되었다 (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).
본 발명에는 조성물의 제조 과정뿐 아니라 조성물을 유도하는 중간체도 개시되어 있다. 이들 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있는 다양한 방법들이 있는데, 예를 들면 합성 화합 방법과 표준 분자 생물학 방법이다. 이들 및 다른 개시된 조성물을 제조하는 방법들은 구체적으로 개시되어 있음이 인지되어야 한다. 본원에는 본원에 개시된 폴리펩티드를 코드화하는 핵산과 핵산의 발현을 조절하는 서열을 작동가능한 방법으로 결합시키는 것을 포함하는 과정에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다. 본원에는 또한 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나로 세포를 형질전환하는 과정에 의해 제조된 세포가 개시된다. 본원에는 또한 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나를 발현하는 과정에 의해 제조된 펩티드가 개시된다. 본원에는 또한 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 하나로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 제조된 동물이 개시된다. 본원에는 또한 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 하나로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 그 동물은 포유류이다. 본원에는 또한 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 하나로 동물의 세포를 형질전환하는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 그 포유 동물은 마우스, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 또는 영장류이다. 또한 본원에는 본원에 개시된 세포 중 어느 것을 동물에 첨가하는 과정에 의해 제조된 동물이 개시된다.
C. 키트
상기에서 설명된 물질뿐 아니라 다른 물질도 본원에 개시된 방법을 수행하거나 수행하는 것을 보조하는 데 유용한 키트로서 어떠한 적당한 조합으로 함께 패키지될 수 있다. 만약 주어진 키트 안의 키트 성분이 본 발명의 방법에 함께 사용하기 위해 디자인되고 채택된다면 그 키트는 유용하다. 예를 들어 본원에는 상처 치유를 촉진하기 위한 키트, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체에 포함하는 키트가 개시된다. 그러한 키트는 겔, 붕대, 밀리포어 테이프, 약물을 섞은 Q-팁, 스프레이, 드롭, 시럽, 액체, 일회용 튜브 또는 파우치를 포함할 수 있다. 키트는 또한 제품 또는 제형의 적절한 사용 및 안전 정보에 대한 지시사항을 포함한다. 키트에는 의사에 의해 결정된 용도 및 투여 방법에 기초한 용량 정보가 포함된다.
D. 용도
본 발명의 방법 및 조성물은 수많은 영역, 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 실험실 연구 도구에도 적용할 수 있다. 이들 제형은 예컨대 세포 증식, 세포 이동에 대한 여러 세포 과정에서 조절 역할을 수행한다. 이들 제형은 실험실에서 다양한 세포 과정, 세포 사이클 조절, 세포 행동, 시험 화합물에 대한 세포, 기관 또는 조직의 반응 등을 연구하기 위한 시험관 내 및 생체 내 모델 시스템에서 사용될 수 있다. 제형은 그 자체로 공급되거나, 또는 다른 화합물과 함께 또는 키트, 예컨대 세포 증식 분석을 위한 키트의 일부로서 공급될 수 있다. 키트는 본원에 언급된 제형을 그 자체로 또는 다른 화합물과 함께 함유할 수 있다. 그러한 키트는 실험을 용이하게 하기 위해 고안된 지시사항도 포함할 것이다. 다른 용도들도 상세한 설명으로부터 개시되고 드러날 것이며, 및/또한 당업자에게 인지될 것이다.
실시예 1: 시험관내 긁힘 손상
신생 쥐 심장으로부터 얻은 미오사이트(myocyte)를 표준 프로토콜에 따라 조 직 배양 접시 위에서 집밀도에 가까운 단층을 형성할 때까지 성장시켰다. 배양을 계속해서 추가로 5일 동안 30μM의 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2), 30μM의 비-활성 대조 펩티드 (SEQ ID NO:55)를 함유하는 배양 배지, 또는 ACT 펩티드 또는 대조 펩티드를 함유하지 않은 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 계속하였다. 비-활성 대조 펩티드는 카르복시 말단에서 ACT 펩티드 서열이 역전되어 있는 폴리펩티드를 포함한다. ACT의 아미노 말단과 대조 펩티드의 아미노 말단을 둘 다 비오티닐화하여, 표준 현미경 또는 비오틴에 대한 고친화력 스트렙트아비딘 결합을 기초로 한 생화학적 방법을 사용하여 세포 세포질에서 펩티드가 검출 (즉 분석)되는 것을 가능하게 하였다.
펩티드 또는 비히클 대조표준이 첨가된 배양 배지를 실험기간 동안 매 24시간 마다 교체하였다. 도 1a는 ACT 펩티드가 대조 조건 (도 1b 및 도 1c)과 비교하여 미오사이트들 사이에서 Cx43 갭 접합 형성 정도를 크게 증가시켰음을 나타낸다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, ACT 펩티드에 대한 반응으로 Cx43 갭 접합 형성의 이러한 증가는 CX43을 발현하는 많은 세포 유형과 공유된다.
NIH-3T3 세포를 표준 프로토콜에 따라 조직 배양 접시 위에서 집밀도에 가까운 단층을 형성할 때까지 2-3일 동안 성장시킨 후, 단층을 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)로 24시간 동안 사전-처리하고, p200 피펫 팁으로 "긁힘-손상"을 유도하였다. "긁힘 손상"된 것을 다시 배양 배지에 용해된 30μM의 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)의 존재하에 (도 2a, b), 또는 두 개의 제어 조건의 존재하에 (도 2c-f) 24시간 동안 배양을 계속하였다. 첫 번째 제어 조건에서는 "긁힘-손상" 세포를 24시간 동안 30μM의 농도로 (도 2c, d) 배양 배지에 용해된 비-활성 대조 펩티드의 존재하에 (도 1에서와 같이) 배양하였다. 두 번째 제어 조거에서는 인산염 완충된 식염수 (PBS)를 배양 배지에 첨가하고 "긁힘-손상" 세포를 ACT 펩티드나 대조 펩티드가 함유되지 않은 이 비히클 대조 용액의 존재하에 배양을 계속하였다 (도 2e, f). ACT 펩티드-처리된 세포의 "긁힘 손상"은 상대적으로 24시간 후에도 재군집이 유지되는데 (도 2a), 이때 적은 수의 세포 (큰 화살표)가 초기 "긁힘 손상" 가장자리 내에서 (즉 작은 검은색 화살표로 표시된 범위 내에서) 영역의 재군집을 이룬다. 대조적으로, 제어 조건에서는 (도 2c, e), 대다수의 세포 (큰 화살표)가 초기 "긁힘 손상" 내에 있는 영역에서 재군집을 이루었다. "긁힘 손상"의 재군집은 부분적으로는 형질전환된 세포가 "긁힘 손상" 영역 안으로 서서히 이동하는 것을 통해 일어난다. 도 2b, d, 및 f는 "긁힘 손상"에서 또는 손상 가장자리에서 세포의 증식하는 세포 핵 항원 (PCNA) 면역표지화를 보여준다. ACT 펩티드 처리된 세포 (도 2b)는 바탕 및 비-증식과 일치하는 낮은 발광만을 보여준다. 두 개의 제어된 조건에서만 (도 2d, f), 밝게 표지된 증식하는 세포를 볼 수 있다 (흰색 화살표). 이것은 ACT 펩티드가 또한 이 실험 세포 모델에서 형질전환된 세포의 증식을 감소시켰음을 나타낸다.
도 3a는 24-시간 기간의 마지막에 ACT 펩티드 및 비-활성 펩티드-처리된 대조 세포의 손상 가장자리를 도시한다. 세포를 형광 팔로이딘으로 표지하여 볼 수 있도록 하였다.ACT 펩티드-처리된 세포는 긁힘 손상 영역의 저 수준의 재군집을 나타낸다 (하얀색 이중 화살표). 도 3b는 24시간 후에 긁힘 손상을 재군집하는 세포 의 % 영역을 막대 그래프로 도시한 것이다. ACT 펩티드가 존재할 때 손상 영역의 세포의 감소는 극적이며, 이때 p 값은 0.000001 이하이다.
WB-F344 세포는 암-유발 병원체로 분리된 쥐 간 세포를 처리함으로써 유도된 형질전환된 쥐 상피 셀라인이다 (Tsao et al., 1984; Hayashi et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al., 2001). WB-F344 세포를 cDNA 발현 플라스미드 구성물로 형질전환하고 표준 프로토콜을 사용하여 항생물질 하에서 선택하여, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:6) 또는 대조표준으로서 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 녹형광 단백질 (GFP) 폴리뉴클레오티드를 안전하게 발현한 셀라인을 생성하였다. ACT 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 GFP도 코드화하였다. ACT 펩티드의 발현은 그 자체로서 광현미경 상에서 표준 GFP 형광 광학에 의해 분석할 수 있었다. 도 4a, b는 GFP를 단독으로 (도 4a) 또는 GFP와 ACT 펩티드 서열의 카르복시 말단을 함께 (도 4a) 또는 GFP를 단독으로 (도 4b) 발현하는 WB-F344 셀라인에서 GFP 형광의 고배율 영상을 도시한다. WB-F344 셀라인의 집밀도에 가까운 단층을 "긁힘 손상"하였고, 24시간 동안 재군집하도록 방치하였다. 비히클 또는 비-활성 대조 펩티드로 처리된 NIH-3T3 세포의 대조표준 경우와 유사하게, GFP를 발현하는 대조 상피 셀라인이 긁힘 손상을 재군집하였다 (도 4c). 그러나 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현한 상피 셀라인에서는 긁힘 손상의 재군집이 억제되었다 (도 4d). WB-F344 셀라인 외에, 프로모터에 작동가능하게 연결된 ACT-펩티드-코드화-폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현하는 NIH-3T3 셀라인을 제조하였다.
실시예 2: 생체 내 상처 치유
신생 마우스 새끼들을 히포테르미아를 사용하여 둔감하게 만들었다. 어깨뼈 사이의 등쪽 중앙선의 피부의 전 두께를 통하여 (바로 밑에 놓여있는 근육까지 내려감) 외과용 메스를 사용하여 길이가 4mm 되는 절개로 인한 피부 손상을 만들었다. 그 절개 손상부에 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)가 60μM 농도로 녹아있거나 없는 (대조표준) 20% 플루로닉 (F-127) 겔 용액 30㎕를 적용하였다. 플루로닉 겔은 미셸 내에서 ACT 펩티드의 균질한 분산을 보조할 수 있는 자극이 적은 계면활성 특성을 가지고 있다. 보다 중요한 것은, 20% 플루로닉 겔은 15℃ 아래의 온도에서는 액체 상태로 머물러 있지만, 체온 (37℃)에서는 중합한다는 사실이다. 이러한 플루로닉 겔의 특성은 아마도 절개 손상 부위에서 조직 안으로 펩티드가 일정하게 방출되는 것을 도울 것이며, 그로써 펩티드가 상처의 프로테아제-풍부한 환경으로부터 보호되고, 또한 펩티드가 연장된 기간 동안 활성 농도를 유지하는 것이 가능해진다. 대조표준 또는 ACT 펩티드 함유 겔을 초기 적용 후 계속해서 24시간 후에 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드 함유 겔을 적용하지 않았다. 48시간이 되었을 때 ACT 펩티드로 처리된 손상 (도 5a)이 ACT 펩티드를 받지 않은 대조표준 (도 5b)보다 상당히 더 절개부가 닫혔고, 염증이 덜 생겼으며, 덜 팽창되었고 (상처 가장자리의 불룩한 곳을 보라), 대체로 외관상으로는 더 치유되었음이 주지되었다. 대조표준과 ACT 펩티드 및 대조표준으로 처리된 손상 사이의 이들 염증, 팽창 및 치유의 차이는 72시간 (도 45c, d)과 96시간 (도 5e, f)에도 지속되었다. 7일째에는 ACT 펩티드 상처 (도 5g)는 대조 펩티드-처리된 손상 (도 5h)보다 더 외관상 매끄러웠고 반흔도 덜했다. 동일한 동물에 나타나는 동일한 손상의 영상은 치유 시간이 경과하는 동안 상이한 시간 점에서 나타남을 주지하여야 한다.
성인 쥐를 마취시키고, 어깨뼈 사이의 등쪽 중앙선 바로 아래에 있는 근육에 미세한 수술용 가위로 8mm 폭의 원형 절개로 인한 피부 손상 부위를 만들었다 (도 6a, b). 손상의 경계선을 플라스틱 시트에서 8mm 폭의 원형 주형을 잘라 정하였다. 그런 다음 그 절개 손상부에 ACT 1 펩티드 (SEQ ID NO:2)가 100μM 농도로 녹아있거나 없는 (대조표준) 30% 플루로닉 겔 용액 100㎕를 적용하였다. 대조표준 또는 ACT 펩티드 함유 겔을 계속해서 초기 적용 후 24시간 후에 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드 함유 겔을 적용하지 않았다. 14일의 시간이 경과할 동안 ACT 펩티드-처리된 큰 절개 손상 (도 6a, c, e, g, i)은 ACT 펩티드를 받지 않은 대조 손상 (도 6b, d, f, h, j)보다 더 빠르게 절개부가 닫혔고, 외관상 염증이 덜했으며, 더 빠르게 치유되었고, 반흔도 적었다. 실제로 14일째에도 대조 손상은 부분적으로 딱지가 있었고, 그것은 손상의 급성 치유가 불완전했음을 나타낸다 (도 6j).
전체 상처 부위의 피부 생검을 절개 손상 후에 24시간 정도가 지난 후 취하였다. 이들 피부 샘플을 2% 파라포름알데히드에 고정시키고, 파라핀에 담근 후, 절개하고, 표준 프로토콜을 사용하여 헤모토크실린과 에오신 (H&E)으로 조직화학적으로 염색하였다. 도 7a와 도 7b는 각각 ACT 펩티드와 대조표준으로 처리된 손상의 상처 중심 가까이의 단면을 저배율로 본 도면이다. 정상적인 조직학적 외관의 피부로 경계가 정해진 상처 가장자리 (작은 화살표로 표시됨)를 두 경우에 모두 볼 수 있다. 검은색 사각형은 도 7a와 도 7b에서 상처 가장자리의 좌측 위에 있는 영상에 놓여 있다. 도 7a와 도 7b에서 좌측 상처 가장자리에 있는 검은색 사각형 안에 있는 조직학적 구조는 각각 ACR 펩티드 및 대조표준 처리된 조직에 대해 도 7c와 도 7d에서 좀 더 고배율로 도시된다. 그 중에서 관심을 끄는 것은 손상의 기저부분으로부터 상처 가장자리와 손상 외면으로 돌출한 일렬배열된 섬유상 물질의 "칼라-형"조직이다 (화살표). 섬유상 물질은 손상 표면으로 이동하는 염증 세포의 이동에 대한 기판으로서 작용한다 (Elder et al., 1997). 흥미롭게도 정렬된 섬유상 기판은 대조표준 손상 (도 7d)에서 ACT 펩티드 처리된 손상 (도 c)보다 더 조직화된 외관을 가진다. 이것은 도 7d와 도 7c에서 도시된 검은색 사각형 안의 조직학적 단면 영역이 각각 고배율로 도시되는 경우인 도 7f와 도 7e에서 확인된다. 정렬된 섬유상 기판으로 뻗어가는 염증성 세포로는 비만 세포, 호중구 및 대식세포가 있다. 이들 염증성 세포는 ACT 펩티드로 처리된 손상보다 대조표준 손상에서 훨씬 더 높은 밀도로 발생한다.
14일의 기간이 끝날 때, 전체 절개 손상의 피부 생검을 취하여 이들 피부 샘플로부터의 조직학적 단편을 H&E로 조직화학적으로 염색하였다. 도 8a와 도 8b는 각각 ACT 펩티드와 대조표준의 손상의 중심 가까이에 있는 단면을 저배율로 본 것이다. 정상적인 조직학적 외관을 가지는 피부로 경계가 정해진 상처 가장자리 (작은 화살표로 표시됨)를 두 경우에 모두 볼 수 있다. 검은색 사각형은 도 8a와 도 8b에서 각 손상의 중심 가까이에 있는 영상에 놓여 있다. 이들 두 사각형 안에 있는 조직학적 구조는 각각 ACR 펩티드 및 대조표준 처리된 조직에 대해 도 8c와 도 8d에서 좀 더 고배율로 도시된다. ACT 펩티드 처리된 손상 위치 내에 있는 조직이 상당히 더 큰 복잡성을 가지는 것이 명백하다. ACT 처리된 상처의 외면에는, 비록 아직은 상처 중심 가까이에서는 상피세포가 상대적으로 얇지만 손상된 표면의 재-상피 형성이 완료됨을 나타내는 상피세포의 연속 층이 있다 (도 8). 예외적으로 모낭을 재생하는 것은 이미 치유된 손상을 덮고 있는 새로운 상피의 줄기 세포로부터 새롭게 분화하는 것에서 이미 알 수 있었다 (도 8c, 작은 화살표). 비교하자면, 손상 표면의 재-상피형성은 불완전하고, 대조 손상의 상피에는 모낭이 재생된다는 신호가 없다. ACT 펩티드 처리된 손상된 피부의 재형성된 상피의 바로 아래에는 상당한 정상 구조적 복잡성이 회복된 것을 볼 수 있는데, 선과 같은 구조, 섬유상 및 연결 조직, 맥관 조직, 근육 및 비만 세포가 모두 그 증거이다 (도 8a, c). 모낭을 보면 이 조직의 복잡성은 줄기 세포의 분화에 의해 재생되었다. 대조적으로 대조 손상에서는 균일하고 큰 플러그의 섬유상 반흔 조직을 보이는 상처 조직이 완전히 우세하고 (도 8b, d), 이때 다른 조직 구조의 복잡성은 특별히 이 반흔 조직에서는 나타나지 않았다.
마취된 성인 마우스에 목과 (위쪽) 등에 미세한 수술용 가위로 2개의 작은 (5mm 직경) 절개로 인한 피부 상처를 만들었다. 손상의 경계는 플라스틱 시트에서 5mm 폭의 원형 주형을 잘라 경계를 정하였다. 100μM 농도로 용해된 ACT 펩티드 (ACT 2 - SQE ID NO:1; ACT 1 - SEQ ID NO:2; ACT 3 - SEQ ID NO:3; ACT 4 - SEQ ID NO:4; ACT 5 - SEQ ID NO:5)중 하나를 함유하였거나 함유하지 않은 (대조표준) 30% 플루로닉 겔의 용액 50-60㎕를 절개 손상부에 적용하였다. 대조표준 또는 ACT 펩티드-함유 겔을 초기 적용 후 24시간 후에 계속해서 적용하였다. 두 번째 적용 후에 더 이상 대조표준이나 ACT 펩티드-함유 겔을 적용하지 않았다. ACT 1 (도 9e-h), ACT 2 (도 9i-l), ACT 3 (도 9m-p), 및 ACT 5 (도 9u-x) 펩티드의 경우에 240 시간이 경과하는 동안 (10일) ACT를 받지 않은 대조 손상에 비해 (도 9a-d) 절개로 인한 손상이 더 빠르게 닫혔고, 외관상 염증이 덜했으며, 더 빠르게 치유되었고, 반흔도 더 적었다. ACT 4 펩티드 (도 9q-t)는 또한 시간이 경과하는 동안 가장 적절한 치유의 개선을 나타냈다. 동일한 동물의 동일한 상처는 치유 시간이 경과하는 동안 상이한 시간 지점에서 나타난다는 것이 주지되어야 한다.
개방된 상처의 면적은 다중 (대조표준 또는 처리 조건당 ~5 마우스) 성인 마우스에 대한 표준 프로토콜에 따라 NIH 영상을 사용하여 시간이 지남에 따라 측정하였다. 이들 각각의 면적 측정을 그런 다음 주어진 시간점에서 대조 손상에 대해 측정된 평균 면적에 대해 표준화하고 (즉 나누어서), 곱하기 100을 하여 대조표준에 대한 닫혀지지 않은 상처의 %를 구하여 시간에 대하여 도표화하였다. Mann-Whitney U-시험을 사용하여 시간 경과에 따른 ACT 펩티드의 효과를 통계학적으로 평가하였다. ACT 1, ACT2, ACT 3, 및 ACT 5 펩티드는 절개로 인한 손상 후에 상당히 개선된 상처 폐쇄 속도를 나타냈다. 이들 처리는 상당한 p 값을 가지는 결과를 제공하였다. ACT 1과 ACT 3은 대조표준을 뛰어넘는 가장 현저한 개선을 정량적으로제공하였다. 고정적이지만 대조표준을 능가하는 보다 적절한 개선은 또한 ACT 4 펩 티드에 대해 관찰되었다.
마취된 성인 쥐들을 정위방법에 의한 장치에 넣었다. 두피의 중앙선을 절개하여 두개골이 노출되도록 하였다. 정위방법에 의한 드릴을 시상(矢狀) 봉합과 관상(冠狀) 봉합의 접합점(브레그마, bregma)보다 앞쪽으로 2mm 위치에 놓고, 하나는 브레그마의 우측과 좌측에 대하여 2.5mm 위치에 있고, 다른 하나는 뇌막 아래 3.5mm 위치에 있는 2개의 구멍을 1mm 구형 비트가 되도록 드릴로 뚫었다. 18-게이지 바늘을 삽입함으로써 대뇌에 병변을 만들었다. 환추로부터 문헌의 방법에 의해 (Paxinos and Watson, 1986) 좌표를 측정하였다. 중공 섬유 막 (HFM)을 구멍에 삽입하고, 외부 피부 봉합사를 상처를 덮기 위해 놓았다. ACT 펩티드를 100μM 농도로 HFM에 함유된 2% 콜라겐 비히클 용액에 녹였다. 분리된 HFM에 대한 연구는 이들 생체공학처리된 구성물이 검출가능한 수준의 ACT 펩티드 (비오틴-스트렙트아비딘 반응에 의해 평가함)를 최소한 7일 동안 수용액에 서서히 방출할 수 있음을 나타냈다. 염증에 관련되고 계속해서 교질 반흔 형성과 관련된 반응성 성상세포는 설치류 모델에서 뇌 손상 후에 잘 규명된 시간 경과 과정을 따른다 (Norenberg, 1994; Fawcett and Asher, 1999). 전형적으로 쥐 뇌에서 성상세포 반응은, 뉴런의 상실 및 뇌조직 복잡성의 다른 측면과 함께 일주일 후에 최고치를 나타낸다. 교질성 반흔 조직의 출현과 함께 계속해서 GFAP-포지티브 성상세포의 밀도는 감소한다. 도 10b와 도 10c는 뇌를 침투한 손상 후 일주일에 ACT 펩티드와 비히클 겔 또는 대조표준 콜라겐 비히클 겔 또는 ACT 펩티드와 비히클 겔로 채워진 HFM 이식편을 둘러싸고 있는 뇌조직의 단면을 저배율로 도시한 것이다. 대조 조직에서 (도 10c), HFM 에 의해 유발된 손상 부위 가까이에서 고밀도의 면역표지된 GFAP-포지티브 성상세포가 관찰된다. 이들 세포의 밀도는 손상으로부터 약간 멀어지면 감소하는 것으로 나타난다. 대조적으로 훨씬 더 낮은 밀도의 GFAP-포지티브 성상세포가 ACT 펩티드로 채워진 HFM에 인접하여 관찰된다 (도 10b). 실제로 GFAP 포지티브 세포의 수준은 정상적인 손상되지 않은 뇌 조직에서 볼 수 있는 것들과 다르지 않다. 도 10b와 도 10c에서 백색 사각형 안의 조직 영역은 도 10d와 도 10e에서 각각 고배율로 도시된다. ACT 펩티드에 의해 처리된 뇌 손상에서 (도 10d), GFAP-포지티브 성상세포는 더 적을뿐 아니라 대조 손상에서 볼 수 있는 것들보다 (도 10e) 더 작기까지 하다.
도 11a와 도 11b는 뇌를 통과한 손상 후 1주일에 대조표준 콜라겐 비히클 (도 11b) 또는 ACT 펩티드와 비히클 겔 (도 11a)로 채워진 HFM 이식편을 둘러싸고 있는 뇌조직의 단면을 저배율로 도시한 것이다 (이식편 또는 손상 경계는 화살표로 표시된다). 대조 조직에서 (도 11b), 고밀도의 면역표지된 GFAP-포지티브 성상세포 및 저밀도의 NeuN 면역표지된 뉴런이 HFM에 의해 유발된 손상 부위 가까이에서 관찰된다. 이들 세포의 밀도는 HFM으로부터 멀어질수록 각각 감소하고 증가하는 것으로 나타난다. 대조적으로 훨씬 더 낮은 밀도의 GFAP-포지티브 성상세포와 더 많은 수의 NeuN 면역표지된 뉴런이 ACT 펩티드로 채워진 HFM에 가까운 곳에서 (먼 곳에서) 관찰된다 (도 11a). 도 11a 및 도 11b에서 HFM에 가까운 영역은 각각 도 11c와 도 11d에서의 영역의 고배율 도면이다. 다시 말하면, 대조 조직 (도 11d)은 GFAP-포지티브 성상세포의 밀도에서 현저한 증가를 보이고, NeuN-포지티브 뉴런의 감소 된 밀도는 ACT 펩티드 처리된 조직에 비교할 때 관찰된다 (도 11c). 상보하는 패턴은 ACT 펩티드를 함유한 HFM 가까이에서 관찰되는데, NeuN 포지티브 뉴런은 성상세포보다 우세한 것으로 나타난다 (도 11c). 흥미롭게도, 도 11d에서 고배율로 도시된 것은 대조표준 (도 11c)에 비하여 분열 과정에서 고빈도의 뉴런을 드러낸다. 이것은 ACT 펩티드와 관련된 고밀도의 뉴런이 새로운 뉴런의 재생으로부터 온 것임을 시사한다. ACT 펩티드는 또한 부분적으로는 뇌 손상 후에 세포 죽음으로부터 뉴런을 절약함으로써 증가할 수 있다.
실시예 3: 급성 척수 손상의 치료
급성 척수 손상을 입은 환자는 기능의 작은 신경학적 회복이라도 후속적인 독립성에 중요한 영향을 미칠 수 있는 심각한 문제군을 나타낸다. 한 실례에서, 급성 척수 손상을 입은 환자에게 0.02% 내지 0.1% 용액의 ACT 펩티드 (예컨대 SEQ ID NO:2)를 15분에 걸쳐 8시간 이내에 직접 급성 척수 손상 부위로 거환 주입하고, 45분 후에 계속해서 23 내지 48시간 동안 ACT 펩티드의 0.015 용액을 주입하였다. 다른 실례에서는, ACT 펩티드를 급성 척수 손상 부위 또는 급성 척수 병변 지대를 가로질러 신경 재연결을 촉진하기 위해 디자인된 생체공학처리된 조직 바이오스캐폴드에 직접 8시간 이내에 부하된 서방성 나노입자를 코팅하기 위해 사용한다. 기능의 개선은 신경학적 결과에 의한 처리 후에 일정 간격 (예컨대 6, 12, 26 및 52주)에 의사에 의해 운동 신경 활성, 콕 찔렀을 때 피부의 민감성 및 감각의 회복을 측정하기 위하여 디자인된 평가를 포함하여 평가된다.
실시예 4: 절개로 인한 피부 상처의 상처 폐쇄, 조직 재생, 및 인장 강도의 정량적 평가
ACT 펩티드 (n=12)와 대조표준 (n=8)의 5mm-직경의 절개로 인한 피부 상처를 위에서 설명한 대로 성인 마우스로부터 만들었다. 상처 폐쇄 속도, 재생된 모낭의 수 및 인장 강도 측정에 대한 정량적 평가를 초기 손상 후 90일에 이르기까지 시간 점에서 상처입은 피부에 대해 수행하였다. 대조 상처에 비하여, 폐쇄는 펩티드 처리를 받은 24시간 이내에 상당히 증가하였다. 유사하게 10일째에 대부분의 상처가 거의 폐쇄될 때 ACT 펩티드-처리된 상처가 대조 상처에 비해 평균 43% 더 작을 정도로 큰 차이가 유지되었다. 10일째에 ACT 펩티드 상처는 대조 표준보다 치유된 상처의 단위면적당 재생된 모낭의 수에 있어서 3.2배의 상당한 증가를 나타냈다.
손상 후 1개월과 3개월째에 치유된 5mm 직경의 절개로 인한 상처의 기계적 특성에 대한 연구를 수행하였다. 기계적 특성의 측정을 위해서는, 피부 샘플을 동물을 희생한 후에 얻어서 5kg 무게의 셀이 장착된 MTS 858 Mini Bipnix (MTS Systems Corporation, MN, USA)를 사용하여 평가하였다. 측정하는 동안 피부 샘플을 연장하여 0.5mm/s의 속도로 파괴되도록 하였다. 파괴시의 힘과 신장률을 측정하였다. 인장 강도 (스트레스)와 파괴하기 위한 신장률 (스트레인)은 다음과 같이 계산하였다: 스트레스 (N/mm2) = 파괴시 힘 (N)/샘플의 단면적 (mm2). 스트레인 (%) = [파괴시 길이의 증가 (mm)/원래의 길이 (mm)]×100. 각각의 상처입은 피부 샘플에 대한 스트레스와 스트레인 계산은 동일한 동물로부터 수집된 가까운 영역으로부터 정상 피부 샘플로 표준화하였다.
1개월째에, 상처 피부를 파괴하는데 필요한 스트레스 (즉 표준화된 힘)는 대조 상처 피부의 그것과 유사하였다. 3개월째에 펩티드-처리된 상처 피부의 파괴를 위해 표준화된 스트레스는 대조 상처 피부의 그것보다 평균 두 배였지만, 처리 군 내에서의 큰 변화는 대조표준으로부터의 상당한 평균 분리를 배제하였다. 이 결과는 펩티드-처리된 상처의 고유의 인장 강도가 미처리된 상처의 그것만큼 좋거나 더 나았음을 증명한다. 나아가 펩티드-처리된 상처의 신장성에 있어 상당한 개선이 발견되었다. 펩티드-처리된 상처를 파괴하기 위하여 필요한 스트레인의 양 (즉 신장성)은 1개월째에 대조 상처보다 가장 적절하게 개선되었다. 3개월째에는, 펩티드-처리된 상처가 보다 더 현저한 개선을 나타냈는데, 상처입지 않은 피부의 정상의 거의 90%에 가깝게 증가하였다. 대조적으로 대조 상처는 3개월째에 정상 피부처럼 신장할 수 있는 능력이 단지 60%로 유지되었다.
본 발명의 방법 및 조성물은 특정 방법론, 프로토콜, 및 달라질 수 있는 것으로 설명된 시약에 제한되지 않음이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어들은 특정 구체예만을 설명할 목적으로 사용되고, 첨부되는 청구범위에 의해서만 본 발명이 제한될 것이라는 범주를 제한하려는 의도는 없다는 것이 인지되어야 한다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단일 형태의 명사에 대한 설명은 분명하게 다른 언급이 없는 한 다수의 참조물을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 그러므로 예를 들어 "폴리펩티드"에 대한 언급은 다수의 그러한 폴리펩티드를 포함하고, "그 폴리펩티드"는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 및 당업자 들에게 공지되어 있는 그것들의 동등물에 대한 언급인 것과 같다.
"임의의" 또는 "임의적으로"는 계속해서 설명되는 사건, 상황, 또는 물질이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있거나 존재할 수 있고, 그 설명은 사건, 상황, 또는 물질이 일어날 수 있거나 존재하는 상황과 일어나지 않거나 존재하지 않는 상황을 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값으로 표시될 수 있다. 그러한 범위가 표시될 때, 또한 구체적으로 고려되고 개시되는 것으로 간주되는 것은 문맥상 특별하게 다르게 표시되지 않는 한 한 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지의 범위이다. 유사하게 값이 앞에 "약"을 사용하여 대략적으로 표시될 때 특정 값은 문맥상 특별하게 다른 언급이 없는 한 개시된 것으로 간주되어야 하는 다른 특수하게 포함된 구체예를 형성한다는 것이 인지될 것이다. 나아가 각 범위의 종점은 다른 종점에 관련하여 둘 다 중요하며, 문맥상 다른 언급이 없는 한 다른 종점과 무관하다는 것이 인지될 것이다. 마지막으로, 명백하게 개시된 범위 내에 있는 모든 개별적인 값과 값의 하위-범위 또한 구체적으로 포함되며, 문맥상 특별하게 다른 언급이 없는 한 개시된 것으로 간주되어야 한다는 것이 인지되어야 한다. 전술한 것은 특별한 경우에 이들 구체예의 일부 또는 전부가 명백하게 개시되는 지의 여부와 관계없이 적용된다.
다른 규정이 없는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명의 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 숙련자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 어 떠한 방법 및 물질이든지 본 발명의 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치, 및 물질은 설명된 바와 같다. 본원에 인용된 공보물과 그것들이 인용하는 물질은 본원에서 참조로 하기 위해 구체적으로 삽입된다. 본원에서는 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시 내용보다 앞섰다고 주장할 수 있는 것이 없다. 어떠한 참조문헌도 선행 기술을 구성한다고 증언할 만한 것은 없다. 참조문헌의 논의는 그것들의 저자가 단언하고, 출원인이 인용된 문헌의 정확성과 적절성에 도전할 권리를 주장하는 것이 무엇인지를 나타낸다. 비록 많은 공보물이 본원에서 참조되지만, 그러한 참조는 이들 중 어떠한 문헌도 당업계의 통상적인 일반적 지식의 일부를 형성한다는 승인을 구성하지 못한다는 것이 명백하게 인지될 것이다.
본 명세서의 상세한 설명과 청구범위 전체를 통하여 단어 "포함한다"와 그 단어의 변용 형태, 예컨대 "포함하는"과 "포함"은 "포함하지만 제한되지 않는" 것을 의미하며, 예컨대 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
당업자는 기본적인 실험만을 사용하여도 본 발명에서 설명된 방법과 조성물의 특이한 구체예에 대한 많은 동등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 첨부되는 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
E. 참고문헌
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Figure 112007048584303-PCT00004
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서열
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본 발명의 조성물 및 방법에 의해 조직 손상 후 상처 치유 및 조직 재생이 촉진된다.
SEQUENCE LISTING <110> Medical University of South Carolina Robert Gourdie, et al. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROMOTING WOUND HEALING AND TISSUE REGENERATION <130> 19113/0123P1 <140> PCT US2005/046442 <141> 2005-12-21 <150> 60/638,366 <151> 2004-12-21 <150> 60/671,796 <151> 2005-04-15 <160> 90 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 1 Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ile 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 2 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 3 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 4 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 5 Lys Ala Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 6 agacctcggc ctgatgacct ggagatt 27 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 7 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 8 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp 20 25 30 Asp Leu Glu Ile 35 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 9 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 10 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Val 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 11 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Val Pro Val 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 12 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ala Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val 20 25 <210> 13 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 13 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gcccggcccg 60 acgacctgga gatc 74 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 14 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 15 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 16 Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 17 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 18 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 19 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 20 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 21 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 22 Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu 1 5 10 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 23 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 24 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 25 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 26 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 27 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 28 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 29 Pro Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 30 Gly Ser Asn Lys Ser Thr Ala Ser Ser Lys Ser Pro Asp Pro Lys Asn 1 5 10 15 Ser Val Trp Ile 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 31 Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ala Ser Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Asn 1 5 10 15 Ser Val Trp Ile 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 32 Gly Arg Ala Ser Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ser Gly Arg Ala Arg Pro 1 5 10 15 Glu Asp Leu Ala Ile 20 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 33 Gly Ser Ala Ser Ser Arg Asp Gly Lys Thr Val Trp Ile 1 5 10 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 34 Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Val <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 35 Pro Arg Met Ser Met Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Val <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 36 Pro Arg Ala Gly Ser Glu Lys Gly Ser Ala Ser Ser Arg Asp Gly Lys 1 5 10 15 Thr Thr Val Trp Ile 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 37 Gly Tyr His Ser Asp Lys Arg Arg Leu Ser Lys Ala Ser Ser Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val 20 <210> 38 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 38 Pro Leu Ser Arg Leu Ser Lys Ala Ser Ser Arg Ala Arg Ser Asp Asp 1 5 10 15 Leu Thr Val <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 39 Pro Asn His Val Val Ser Leu Thr Asn Asn Leu Ile Gly Arg Arg Val 1 5 10 15 Pro Thr Asp Leu Gln Ile 20 <210> 40 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 40 Pro Ser Cys Val Ser Ser Ser Ala Val Leu Thr Thr Ile Cys Ser Ser 1 5 10 15 Asp Gln Val Val Pro Val Gly Leu Ser Ser Phe Tyr Met 20 25 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 41 Gly Arg Ser Ser Lys Ala Ser Lys Ser Ser Gly Gly Arg Ala Arg Ala 1 5 10 15 Ala Asp Leu Ala Ile 20 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 42 Leu Cys Tyr Leu Leu Ile Arg Tyr Cys Ser Gly Lys Ser Lys Lys Pro 1 5 10 15 Val <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 43 Gly Gln Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Gln 1 5 10 15 Tyr Val <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 44 Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Val <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 45 Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Glu Ile 1 5 <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 46 Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Lys Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 47 Arg Pro Lys Pro Asp Asp Leu Asp Ile 1 5 <210> 48 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 48 Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Asp Ile <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 49 Ser Ser Arg Ala Ser Thr Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 50 Arg Pro Arg Pro Glu Asp Leu Glu Ile 1 5 <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 51 Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro Glu Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 52 Gly Asp Gly Lys Asn Ser Val Trp Val 1 5 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 53 Ser Lys Ala Gly Ser Asn Lys Ser Thr Ala Ser Ser Lys Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Lys Asn Ser Val Trp Val 20 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 54 Gly Gln Lys Pro Pro Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ala Ser Lys Lys Leu 1 5 10 15 Tyr Val <210> 55 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 55 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Ile 1 5 10 15 Glu Leu Asp Asp Pro Arg Pro Arg 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 56 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln Arg Pro Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ile 20 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 57 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 58 Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 59 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu 1 5 10 15 Glu Ile <210> 60 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 60 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 30 <210> 61 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 61 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 20 25 30 Leu Glu Ile 35 <210> 62 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 62 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 63 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 63 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 64 Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu Arg Pro Arg Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Glu Ile <210> 65 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 65 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Asp Asp Leu Glu Ile 35 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 66 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 67 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 30 <210> 68 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 68 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 25 <210> 69 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 69 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile 20 <210> 70 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 70 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu Arg Pro Arg Pro 1 5 10 15 Asp Asp Leu Glu Ile 20 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 71 Lys Gly Lys Ser Asp Pro Tyr His Ala Thr Ser Gly Ala Leu Ser Pro 1 5 10 15 Ala Lys Asp Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Tyr Phe Asn Gly Cys Ser 20 25 30 Ser Pro Thr Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu 35 40 45 Val Thr Gly Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln 50 55 60 Ala Ser Glu Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met 65 70 75 80 Gly Gln Ala Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp 85 90 95 Phe Pro Asp Asp Asn Gln Asn Ser Lys Lys Leu Ala Ala Gly His Glu 100 105 110 Leu Gln Pro Leu Ala Ile Val Asp 115 120 <210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 72 Lys Thr Asp Pro Tyr Ser His Ser Gly Thr Met Ser Pro Ser Lys Asp 1 5 10 15 Cys Gly Ser Pro Lys Tyr Ala Tyr Tyr Asn Gly Cys Ser Ser Pro Thr 20 25 30 Ala Pro Leu Ser Pro Met Ser Pro Pro Gly Tyr Lys Leu Val Thr Gly 35 40 45 Asp Arg Asn Asn Ser Ser Cys Arg Asn Tyr Asn Lys Gln Ala Ser Glu 50 55 60 Gln Asn Trp Ala Asn Tyr Ser Ala Glu Gln Asn Arg Met Gly Gln Ala 65 70 75 80 Gly Ser Thr Ile Ser Asn Ser His Ala Gln Pro Phe Asp Phe Ala Asp 85 90 95 Glu His Gln Asn Thr Lys Lys Leu Ala Ser Gly His Glu Leu Gln Pro 100 105 110 Leu Thr Ile Val Asp Gln Arg Pro 115 120 <210> 73 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 73 Leu Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Ser Leu Asn Ser Lys Arg Arg Glu 1 5 10 15 Leu Glu Asp Pro Gly Ala Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro 20 25 30 Ser Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Ile Gln 35 40 45 Tyr Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Ile Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala 50 55 60 Asn Thr Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser His Glu Glu Asn Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Leu Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Arg Met Ala Gln Glu Arg 85 90 95 Leu Asp Leu Ala Val Gln Ala Tyr Ser His Gln Asn Asn Pro His Gly 100 105 110 Pro Arg Glu Lys Lys Ala Lys Val 115 120 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 74 Gly Phe Gly Thr Ile Arg Asp Thr Leu Asn Asn Lys Arg Lys Glu Leu 1 5 10 15 Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Trp Asn Thr Pro Ser 20 25 30 Ala Pro Pro Gly Tyr Asn Ile Ala Val Lys Pro Asp Gln Met Gln Tyr 35 40 45 Thr Glu Leu Ser Asn Ala Lys Met Ala Tyr Lys Gln Asn Lys Ala Asn 50 55 60 Ile Ala Gln Glu Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Glu Glu Asn Ile Pro Ala 65 70 75 80 Asp Leu Glu Asn Leu Gln Arg Glu Ile Lys Val Ala Gln Glu Arg Leu 85 90 95 Asp Met Ala Ile Gln Ala Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Pro Gly Ser Ser 100 105 110 Ser Arg Glu Lys Lys Ser Lys Ala 115 120 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 75 Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile 1 5 10 15 Phe Ile Ile Phe Met Leu Val Val Gly Leu Ile Ser Leu Val Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Glu Leu Val His Leu Leu Cys Arg Cys Leu Ser Arg Gly Met 35 40 45 Arg Ala Arg Gln Gly Gln Asp Ala Pro Pro Thr Gln Gly Thr Ser Ser 50 55 60 Asp Pro Tyr Thr Asp Gln Val Phe Phe Tyr Leu Pro Val Gly Gln Gly 65 70 75 80 Pro Ser Ser Pro Pro Cys Pro Thr Tyr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Glu 85 90 95 Gln Asn Trp Ala Asn Leu Thr Thr Glu Glu Arg Leu Ala Ser Ser Arg 100 105 110 Pro Pro Leu Phe Leu Asp Pro Pro 115 120 <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 76 Cys Gly Ser Lys Glu His Gly Asn Arg Lys Met Arg Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Met Ala Ser Ile Phe Phe Lys Ser Val Phe Glu Val Ala 20 25 30 Phe Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Leu Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Ala Val 35 40 45 Tyr Ile Cys Glu Gln Ser Pro Cys Pro His Arg Val Asp Cys Phe Leu 50 55 60 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Leu Phe Met Leu Val Val 65 70 75 80 Ser Met Val Ser Phe Val Leu Asn Val Ile Glu Leu Phe Tyr Val Leu 85 90 95 Phe Lys Ala Ile Lys Asn His Leu Gly Asn Glu Lys Glu Glu Val Tyr 100 105 110 Cys Asn Pro Val Glu Leu Gln Lys 115 120 <210> 77 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 77 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 78 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 78 ccctcctccc gggcctcctc ccgggcctcc tcccggcccc ggcccgacga cctggagatc 60 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 79 cggccccggc ccgacgacct ggagatc 27 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 80 cggccccggc ccgacgacct ggaggtg 27 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 81 cggccccggc ccgacgacgt gcccgtg 27 <210> 82 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 82 aaggcccggt ccgacgacct gtccgtg 27 <210> 83 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 83 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaag 48 <210> 84 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 84 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcc ctcctcccgg 60 gcctcctccc gggcctcctc ccggccccgg cccgacgacc tggagatc 108 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 85 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacctgg agatc 75 <210> 86 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 86 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacctgg aggtg 75 <210> 87 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 87 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagcg gccccggccc 60 gacgacgtgc ccgtg 75 <210> 88 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 88 cggcagccca agatctggtt ccccaaccgg cggaagccct ggaagaagaa ggcccggtcc 60 gacgacctgt ccgtg 75 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 89 Pro Cys Ser Arg Ala Ser Ser Arg Met Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asp 1 5 10 15 Asp Leu Asp Val 20 <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequences; note = synthetic construct <400> 90 Pro Arg Val Ser Val Pro Asn Phe Gly Arg Thr Gln Ser Ser Asp Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Val

Claims (42)

  1. 알파 코넥신의 카르복시-말단 아미노산 서열, 또는 그것의 보존성 변이체를 포함하는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 전체 길이의 알파 코넥신 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 알파 코넥신의 카르복시-말단의 4 내지 30개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가
    (a) 카르복시 말단에 타입 II PDZ 결합 모티프;
    (b) 프롤린, 글리신, 또는 프롤린과 글리신 잔기를 포함하는 PDZ 결합 모티프에 근접한 힌지 모티프; 및
    (c) 힌지 잔기에 근접한 포지티브 전하의 잔기들 (K, R D E)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 알파 코넥신이 코넥신 39, 코넥신 40.1, 코넥신 47, 코넥신 46.6, 코넥 신 30.2, 코넥신 31.9, 코넥신 44, 코넥신 33, 코넥신 36, 코넥신 35, 코넥신 37, 코넥신 39, 코넥신 39.9, 코넥신 40, 병아리 코넥신 42, 코넥신 45.6, 코넥신 43, 코넥신 43.4, 코넥신 44.2, 코넥신 44.1, 사람 코넥신 45.6, 코넥신 46, 코넥신 56, 코넥신 49, 코넥신 50으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 조직 손상 후에 염증을 감소하고, 치유를 촉진하고, 반흔 형성을 감소시키고, 인장 강도를 증가시키며, 복잡한 조직 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 알파 코넥신의 카르복시-말단에 대한 코넥신-복합체 형성 단백질의 결합을 억제하고, 상기 코넥신-복합체 형성 단백질이 ZO-1 또는 신장아세포종 과잉발현된 단백질 (NOV)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 알파 코넥신이 Cx43인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 알파 코넥신의 카르복시-말단의 4 내지 30 아미노산 내에 있는 보존성 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1과 최소한 65%의 서열 동일성을 가지는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3과 SEQ ID NO:4로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제 4 항에 있어서,
    상기 알파 코넥신이 Cx40인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 아미노산 서열, SEQ ID NO:5를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 세포 내재화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 세포 내재화가 안테나페디아, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A (Antp 돌연변이체), 부포린 II, 트랜스포탄, MAP (모델 양친매성 펩티드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC (비스-구아니디늄-스퍼미딘-콜레스테롤) 및 BGTC (비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열이 안테나페디아로부터의 아미노산이고 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:8, EQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 코드화된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 핵산이 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  21. 제 15 항의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 코드화된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 핵산이 핵산 서열 SEQ ID NO:13을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  24. 제 19 항 또는 제 22 항에 있어서,
    상기 핵산이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  25. 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 제 19 항 또는 제 22 항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 벡터가 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. 제 19 항 또는 제 22 항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  28. 제 25 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  29. 제 19 항 또는 제 22항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유기체.
  30. 제 25 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기체.
  31. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제 1 항 또는 제 14 항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제 19 항 또는 제 22 항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 조직 손상 후에 치유를 촉진하는 방법.
  34. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 조직 손상 후에 반흔 조직 형성을 감소시키는 방법.
  35. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 조직 손상 후에 조직 재생을 촉진하는 방법.
  36. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 조직 손상 후에 인장 강도를 증가시키는 방법.
  37. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 조직 손상 후에 줄기 세포 분화를 증강시키는 방법.
  38. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 염증을 감소시키는 방법.
  39. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 섬유증 조직 형성을 감소시키는 방법.
  40. 제 31항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 형질전환된 세포의 증식을 억제하는 방법.
  41. 제 31 항 또는 제 32 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는, 환자에게서 형질전환된 세포의 전이성 이동을 억제하는 방법.
  42. 제 33 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 손상이 긁힘, 칼로 베임, 찢어진 상처, 눌린 상처, 압박 상처, 스트레치 손상, 물린 상처, 찰과상, 총탄 상처, 폭발 손상, 바디 피어싱, 찔린 상처, 화상, 바람에 의한 상처, 태양 화상, 화학약품 화상, 수술 상처, 수술적 간섭, 의료용 간섭, 세포, 조직 또는 기관 이식 후 숙주 거부반응, 약제 효과, 약제학적 부작용, 욕창, 방사선 손상, 화장품으로 인한 피부 상처, 내부 기관 손상, 질병 과정 (예컨대 천식, 암), 감염, 감염성 병원체, 발생 과정, 성숙 과정 (예컨대 여드름), 유전자 비정상, 발생 비정상, 환경적 독소, 알레르기 유발 물질, 두피 손상, 안면 손상, 턱 손상, 발 손상, 발가락 손상, 손가락 손상, 뼈 손상, 생식 기관 손상, 관절 손상, 분비기관 손상, 눈 손상, 각막 손상, 근육 손상, 지방 세포 함유 조직 손상, 폐 손상, 기도 손상, 헤르니아, 항문 손상, 치질, 귀 손상, 망막 손상, 피부 손상, 복부 손상, 팔 손상, 다리 손상, 운동 손상, 등 손상, 분만시 손상, 조기 분만 손상, 독소가 있는 생물체에게 물림, 쏘임, 힘줄 손상, 인대 손상, 심장 손상, 심장관 손상, 혈관계 손상, 연골 조직 손상, 임파계 손상, 두개 대뇌 외상, 탈구, 식도 천공, 누관, 손톱 손상, 외래 물질, 골절, 동상, 손 손상, 열스트레스 장애, 찢어짐, 목 손상, 자해, 쇼크, 외상적 연 조직 손상, 척수 손상, 척주 손상, 접질림, 긴장, 힘줄 손상, 인대 손상, 연골조직 손상, 흉부 손상, 치아 손상, 외상, 신경계 손상, 노화, 동맥류, 스트로크, 소화관 손상, 경색, 및 허혈성 손상으로 이루어지는 군으로부터 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
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