KR20150134417A - 연골-결합 융합 단백질 - Google Patents

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KR20150134417A
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에밀리 플로린
드미트리 비. 키르포친
폴 코페스키
알렉세이 루고브스코이
레이첼 레너드
비르기트 쇼어베를
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메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

성장인자 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되는 제1 도메인 및 연골 기질 성분에 특이적으로 결합되는 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 약제학적 조성물을 이용하는 근골격 질환의 치료방법이 또한 제공된다.

Description

연골-결합 융합 단백질{CARTILAGE-BINDING FUSION PROTEINS}
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 29일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/806,599호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다.
외상성 관절 손상(예를 들어, 인대, 힘줄 및 연골의 파열)은 조직 수선 억제의 만성 주기, 세포외 기질 이화작용의 조절, 세포사 및 관절 퇴행을 포함하는 관절 조직 내의 다인자 퇴행성 캐스케이드를 개시한다. 관절 손상의 일부 양태는 수술적 조직 이식 절차에 의해 수선될 수 있지만, 이들 접근은 관절의 생체역학적 안정성을 부분적으로만 회복시킬 수 있다. 수술적 및 고식적 요법을 포함하는 현재의 치료적 접근은 관절 운동의 영구적인 변용을 차단시키기에 충분하지 않다. 이러한 변용은 물리적 힘의 효과, 및 관절 병리생태학에 기여하는 세포 신호전달의 변용을 포함하는 세포 또는 조직 역학(즉, 기계 생물학적 효과)에서의 변화에 영향을 미친다. 이들 기계 생물학적 효과로부터 초래되는 세포 신호전달의 결과로부터 관절 조직을 보호하는 기존의 약제학적 요법은 없다. 그 결과, 퇴행성 관절 질환의 위험은 관절에 대한 외상성 손상 후에 수년간 극적으로 증가된다.
2003년에 CDC에 따르면, 관절염 및 다른 류마티스 병태는 미국에서 1천 2백 7십 8억달러(의료비 8백 8억 달러 및 일실이익 4백 7십억 달러) 또는 1.2%의 국내총생산의 비용이 들었다. 외상성 관절 손상으로부터 초래되는 퇴행성 관절 질환은 관절염의 총 부담의 10% 초과를 차지한다. 따라서, 외상성 관절 손상으로부터 초래되는 퇴행성 관절 질환에 대한 효과적인 치료에 대한 상당한 충족되지 않은 필요가 있다. 다음의 개시내용은 이런 필요를 처리하며, 다른 이점을 제공한다.
허용가능하고 효과적인 요법을 제공하는 방법에서 병에 걸린 또는 손상된 관절에 직접적으로 약물을 전달하는 것은 최근의 간행물에서 다음의 언급에 의해 예시된 바와 같이 중요한 도전으로 남아있다:
"관절강내 요법은 관절 공간으로부터의 주사 물질의 빠른 배출 때문에 도전적이며; 이 제거는 윤활 모세관을 통해 나가는 소분자와 림프계에 의해 클리어런스되는 거대분자에 적용된다. 일반적으로, 가용성 물질은 단지 수시간 내에 측정되는 관절강내 체류시간(dwell time)을 가진다".
(Evans, et al., Nat. Rev. Rheumatol. 2014 Jan;10(1):11-22)
이 도전을 충족시키기 위한 오랜 느낌 및 미충족된 필요가 있었으며, 거의 8년 전에 공개된 다른 보고에서 강조된 동일한 문제에 의해 예시된다:
"장래의 IA[관절강내] 치료에서 표적화되어야 하는 주된 개선은 더 긴 작용의 지속기간인데, 투여와 관련된 불편함/통증뿐만 아니라 가능한 감염 위험에 기인하여 연간 IA 주사 수를 제한하는 것이 바람직하기 때문이다".
(Gerwin, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2006 May 20;58(2):226-42)
따라서, 본 명세서에서 허용가능하며 유효한 요법을 제공하기 위해 병에 걸리거나 또는 손상된 곳에 직접적으로 전달될 수 있는 약제학적으로 활성인 단백질이 본 명세서에서 제공된다. 이들 약제학적으로 활성인 단백질은 성장 인자 수용체(예를 들어, IGF-1 수용체)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되는 제1 도메인 및 연골 기질 성분(예를 들어, 황산화 글라이코사미노글라이칸 및 콜라겐)에 특이적으로 결합되는 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 이들 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이다. 이들 융합 단백질 및 약제학적 조성물은 골관절염과 같은 퇴행성 관절 질환에 특히 유용하다. 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 약제학적 조성물을 이용하는 근골격 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일 양태에서, 개시내용은 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하되, 제1 도메인은 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되고, 제2 도메인은 연골 기질 성분에 특이적으로 결합되며, 융합 단백질 내에서(즉, 융합 단백질 내에 존재할 때), 각각의 결합 도메인은 특이적 결합 활성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 단일 폴리펩타이드쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질 내에서(즉, 융합 단백질 내에 존재할 때), 각각의 결합 도메인은 천연 결합 활성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 제1 도메인은 IGF-1 수용체 결합 도메인이다. 특정 실시형태에서, IGF-1 수용체 결합 도메인은 인간 IGF-1을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, IGF-1 수용체 결합 도메인은 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, 제2 도메인은 sGAG (황산화 글라이코사미노글라이칸) 결합 도메인이다. 특정 실시형태에서, sGAG 결합 도메인은 프롤린-알기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복체 단백질(proline-arginine-rich end leucine-rich repeat protein: PRELP), 콘드로어드헤린(chondroadherin: CHAD), 온코스타틴 M, 콜라겐 IX, BMP-4, 피브로넥틴, RAND1, RAND2, RAND3, RAND4, RAND5, RAND6, AKK15, RLR22, R1Q17, SEK20, ARK24, AKK24, AL1, AL2, AL3, LGT25, Pep184, Pep186, Pep185, Pep239, Pep246, ATIII 또는 피브베타(FibBeta)의 sGAG 결합 도메인의 서열을 갖거나 또는 해당 도메인에 대해 상동성이거나 또는 실질적으로 상동성인 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, sGAG 결합 도메인은 서열번호 2 내지 13, 및 54 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(표 1 참조). 일 특정 실시형태에서, sGAG 결합 도메인은 서열번호 2를 포함한다. 일 특정 실시형태에서, sGAG 결합 도메인은 서열번호 2로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 제2 도메인은 콜라겐 결합 도메인이다. 특정 실시형태에서, 콜라겐 결합 도메인은 매트릴린, 연골 올리고머 기질 단백질, PRELP, 콘드로어드헤린, 피브로모듈린, 데코린 또는 아스포린의 콜라겐 결합 도메인의 서열을 갖거나 또는 해당 도메인에 대해 상동성이거나 또는 실질적으로 상동성인 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 콜라겐 결합 도메인은 서열번호 14 내지 16 및 21 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(표 2 참조).
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 17 내지 20, 28 내지 53 및 71 내지 87로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(표 3 참조). 일 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질 내에 존재할 때, 각각의 결합 도메인은 천연 결합 활성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 40,000, 35,000 30,000, 25,000, 20,000, 15,000, 10,000, 7,500, 5,000, 2,500, 1,000, 500 또는 250개 이하의 아미노산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 포유류 관절의 관절강내 공간 내로 주사 시, 융합 단백질은 제2 결합 도메인이 연골 기질 성분에 특이적으로 결합하지 않는 돌연변이체 도메인이라는 점에서만 융합 단백질과 상이한 융합 뮤테인보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 긴 시간 기간 동안 관절의 연골 조직 내에 보유된다. 특정 실시형태에서, 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이고, 연골 조직 내에 보유된 융합 단백질의 양은 적어도 약 5, 약 10, 약 20 또는 약 50p㏖/g의 조직이다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 관절은, 1) 연골 조직으로부터의 sGAG의 손실, 2) 세포 함량의 손실, 3) 총 연골 조직의 손실, 또는 4) 골질의 손실에서, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 1), 2), 3) 또는 4)의 손실과 비교할 때, 감소를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 연골 조직은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 생성과 비교할 때, sGAG의 생성의 증가를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 연골 조직은 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 수준과 비교할 때, 연골 조직 내 sGAG 수준의 증가를 특징으로 한다.
특정 실시형태에서, 포유류의 관절의 관절강내 공간 내로 융합 단백질의 주사 시, 융합 단백질은 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10일의 기간 동안 관절의 연골 조직 내에 보유된다. 특정 실시형태에서, 관절은 손상된 관절이고, 연골 조직 내에 보유된 융합 단백질의 양은 적어도 약 5, 약 10, 약 20 또는 약 50p㏖/g의 조직이다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 병에 걸리거나 또는 손상된 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 관절은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 손실과 비교할 때, 연골 조직으로부터의 sGAG의 손실의 감소를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 손상된 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 연골 조직은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 생성과 비교할 때, 연골 조직 내 sGAG의 생성의 증가를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 포유류는 래트 또는 말이고, 관절은 손상된 관절이고, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 연골 조직은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 수준과 비교할 때, 연골 조직 내 sGAG의 수준의 증가를 특징으로 한다.
다른 양태에서, 개시내용은 본 명세서에 개시된 융합 단백질 중 하나 이상 및 글루코코티코이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 적합한 글루코코티코이드는 알클로메타손, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로로프레드니손, 시클레소니드, 코티솔, 코티스포린, 코티바졸, 데플라자코트, 덱사메타손, 플루드록시코타이드(fludroxycortide), 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루오코톨론, 플루오로메톨론, 플루티카손, 헥스아세톤하이드로코타메이트, 하이드로코티손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드닐리덴, 프레그나다이엔, 프레그나트라이엔, 프레그넨, 프록토세딜, 리멕솔론, 테트라하이드로콜티코스테론, 트라이암시놀론 및 유로베타솔, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 및 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 조성물의 1 내지 1000㎍/g의 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드에서 지방산에 컨쥬게이션되고, 지방산에 대한 컨쥬게이션은 선택적으로 에스터 결합을 통한다. 특정 실시형태에서, 지방산은 팔미트산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 극미립자 담체에 함유된다. 특정 실시형태에서, 극미립자 담체는 리포솜이다. 특정 실시형태에서, 극미립자 담체는 다층 소포이다. 특정 실시형태에서, 극미립자 담체는 고융점 지질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 또는 하이드로 소이 포스파티딜콜린(Hydro Soy phosphatidylcholine: HSPC)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 극미립자 담체 지질의 0.1 내지 20 몰%의 농도로 극미립자 담체 중에 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 및 덱사메타손 21-팔미테이트를 포함하는 조성물이 제공되되, 덱사메타손 21-팔미테이트는 HSPC-함유 다층 소포에 함유된다.
특정 실시형태에서, 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절의 관절강내 공간 내로 본 명세서에 개시된 융합 단백질/글루코코티코이드 조성물의 주사 후에, 연골 기질 합성 판독 또는 연골 분해 판독이 얻어지고, 판독은 글루코코티코이드 없이 매칭된 조성물의 매칭된 주사 후에 얻어진 대조군 판독 이상으로 개선을 나타낸다.
다른 양태에서, 개시내용은 관절 손상 또는 질환의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 관절의 관절강내 공간 내로 치료적 유효량의 융합 단백질 또는 본 명세서에 개시된 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 관절 손상 또는 질환은 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 퇴행, 급성 염증성 관절염, 감염성 관절염, 골다공증, 약물 독성-관련 연골 결함, 또는 외상성 연골 손상으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 개시내용은 생체에 적합한 하이드로겔 중에 하나 이상의 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 하이알루론산(HA), HA 유도체, 셀룰로스 유도체 및 헤파린-유사 도메인 중합체 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 메틸셀룰로스를 포함한다. 메틸셀룰로스의 임의의 분자량, 예를 들어 약 5kDa 내지 약 500kDa이 사용될 수 있다. 임의의 양의 메틸셀룰로스가 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 메틸셀룰로스의 양은 하이드로겔의 약 1 내지 약 10중량%이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 HA(예를 들어, 하이알루론산나트륨)을 포함한다. HA의 임의의 분자량, 예를 들어 약 10kDa 내지 약 1.8MDa이 사용될 수 있다. 임의의 양의 HA가 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, HA의 양은 하이드로겔의 약 1 내지 약 10중량%이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 콘드로이틴황산염, 헤파란황산염, 또는 헤파린을 포함하는 헤파린-유사 도메인 중합체를 포함한다. 임의의 양의 헤파린-유사 도메인 중합체가 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 헤파린-유사 도메인 중합체의 양은 하이드로겔의 약 0.05중량% 내지 2중량%이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 특정 온도 초과(예를 들어, 35℃ 초과)에서 열경화성이다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔은 특정 온도 미만(예를 들어,35℃ 미만)에서 유체 또는 전단박화된다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 명세서에 개시된 하이드로겔의 약 1 내지 약 1000㎍/g의 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 본 명세서에 개시된 하이드로겔의 약 100 내지 약 10,000㎍/g의 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 글루코코티코이드를 추가로 포함한다. 적합한 글루코코티코이드는 알클로메타손, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로로프레드니손, 시클레소니드, 코티솔, 코티스포린, 코티바졸, 데플라자코트, 덱사메타손, 플루드록시코타이드, 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루오코톨론, 플루오로메톨론, 플루티카손, 헥스아세톤하이드로코타메이트, 하이드로코티손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드닐리덴, 프레그나다이엔, 프레그나트라이엔, 프레그넨, 프록토세딜, 리멕솔론, 테트라하이드로콜티코스테론, 트라이암시놀론 및 유로베타솔, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 및 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형된 글루코코티코이드가 또한 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 에스터 결합을 통해 지방산(예를 들어, 팔미트산)에 컨쥬게이션된다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 극미립자 담체, 예컨대 리포솜 또는 다층 소포에 함유된다. 리포솜 극미립자는 고융점(Tm) 지질, 예를 들어, DSPC(다이스테아로일 포스파티딜콜린), DPPC(다이팔미토일 포스파티딜콜린) 또는 HSPC(수소화된 대두 포스파티딜콜린)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 리포솜 극미립자에 함유되고, 리포솜 지질의 0.1 내지 20몰%로 존재한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 리포솜 극미립자에 함유되고, 리포솜 지질은 하이드로겔의 0.01중량% 내지 10중량%이다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 약제학적 조성물(예를 들어, 하이드로겔)이 관절 내로 주사될 때, 연골 기질 합성을 자극하거나 세포 성장을 자극하거나 또는 연골 기질 분해를 방지하거나 또는 세포사를 방지하는데 충분한 농도로 하이드로겔 중에 존재한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 하이드로겔의 1 내지 1000㎍/g의 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 관절의 연골 기질 합성 또는 분해 판독은 융합 단백질 또는 융합 단백질 + 글루코코티코이드 단독의 조합물의 주사 후 판독에 대해 개선을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 글루코코티코이드는 적어도 약 8일의 반감기(예를 들어, 9, 10, 11 또는 12일)로 관절 내에 존재한다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 융합 단백질은 융합 단백질 또는 글루코코티코이드 중 하나가 단독으로 주사될 때보다 더 긴 시간 동안 관절의 관절강내 공간에 보유된다.
다른 양태에서, 개시내용은 치료적 유효량의 하나 이상의 본 명세서에 개시된 융합 단백질의 관절의 관절강내 공간 내로의 투여를 포함하는, 근골격 질환의 치료방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 근골격 질환은 골관절염, 류마티스 관절염, 손상 후 연골 퇴행, 급성 염증성 관절염, 감염성 관절염, 골다공증을 포함하거나, 또는 약물 독성의 결과이다.
도 1은 (a) 헤파란황산염, 및 (b) 콘드로이틴황산염에 대한 GF-Fus3(서열번호 18)의 결합을 나타내지만, 헤파란황산염 및 콘드로이딘 황산에 대한 F-Fus1(서열번호 1) 또는 GF-Fus4(서열번호 33)의 결합을 나타내지 않는 본 명세서에 개시된 융합 단백질의 그래프를 도시한 도면.
도 2는 콜라겐에 대한 GF-Fus6(서열번호 35)의 결합보다 콜라겐에 대해 더 큰 GF-Fus5(서열번호 34) 결합을 나타내는 본 명세서에 개시된 융합 단백질 결합의 그래프를 도시한 도면.
도 3은 모든 융합 단백질이 야생형 IGF에 의한 상향조절과 비슷한 수준으로 pAKT를 상향조절하였음을 나타내는, GF-Fus1, GF-Fus2(서열번호 32), GF-Fus3, GF-Fus4, GF-Fus5, GF-Fus6 융합 단백질 및 야생형 IGF에 의한 소 연골세포(a) 및 BXPC-3 세포(b)에서의 AKT 인산화 자극을 나타내는 두 그래프를 도시한 도면. 데이터는 평균±SEM이다.
도 4는 소 연골 외식편으로부터의 sGAG 손실을 나타내는 시간(일)에 대한 sGAG 손실 그래프가 GF-Fus1, GF-Fus2 및 GF-Fus3에 의해 그리고 야생형 IGF에 의해 감소된다는 것을 도시한 도면. 데이터는 평균±SEM이다.
도 5는 GF-Fus1, GF-Fus2, GF-Fus3 및 야생형 IGF(검정색 막대)를 연속적으로 첨가함으로써 얻어진 질환 대조군에 대한 증가를 나타내는 소 연골 외식편 내로의 35S-황산염 혼입의 두 그래프를 도시한 도면. 배양 배지(흰색 막대)로부터 제거의 4 또는 8일 후에, GF-Fus3은 프로테오글라이칸 생합성에서 가장 큰 증가를 자극하였다. 제8일(도 5a) 및 제12일(도 5b)에 대해 배양 마지막의 최종 48시간 동안 35S-황산염 혼입을 측정하였다. 데이터는 평균±SEM이다. 처리가 없는 대조군(건강함) 35S-황산염 혼입률은 제8일 및 제12일에 각각 132.2 ± 3.6 및 140.3 ± 11.0(평균 ±SEM)p㏖/hr/㎍ DNA였다.
도 6은 이들 융합 단백질이 모든 배지 변화에서 공급될 때 소 연골 외식편으로부터의 sGAG 손실%가 GF-Fus1, GF-Fus3, GF-Fus5 및 GF-Fus6만큼 감소된다는 것을 나타내는 시간(일)에 대한 sGAG 손실%의 그래프를 도시한 도면. 데이터는 평균±SEM이다.
도 7은 제0일 내지 제4일 동안만 배지에 첨가될 때에 GF-Fus1에 대해서보다 GF-Fus3에 대해 소 연골 외식편으로부터 sGAG 손실%의 더 큰 감소를 나타내는 시간(일)에 대한 sGAG 손실%의 그래프를 도시한 도면. 데이터는 평균±SEM이다.
도 8은 모든 배지 변화에 첨가될 때에 GF-Fus1, GF-Fus3, GF-Fus5 및 GF-Fus6에 의한 질환 대조군에 대한 이러한 혼입의 증가를 나타내는 소 연골 외식편 내로 35S-황산염 혼입의 두 그래프를 제시한 도면. GF-Fus3은 제0일 내지 제4일에만 첨가될 때 35S-황산염 혼입에서 가장 큰 증가를 자극하였다. 35S-황산염 혼입을 제8일(도 8a) 및 제12일(도 8b)의 배양 마지막의 최종 48시간 동안 측정하였다. 데이터는 평균±SEM이다. 처리가 없는 대조군(건강함) 35S-황산염 혼입률은 제8일 및 제12일에 각각 0.117 ± 0.0099 및 0.083 ± 0.0047(평균 ±SEM)n㏖/hr/㎍ DNA였다.
도 9는 단독으로 및 조합하여 GF-Fus3 및 항-Infl-1(덱사메타손)으로 처리한 소 외식편에 대한 (a) 시간(일)에 대한 sGAG 손실%의 그래프, 및 (b) 시간(일)에 대한 35S-황산염 혼입의 그래프를 도시한 도면. sGAG 손실%에서의 가장 큰 감소 및 35S-황산염 혼입 대 질환 대조군에서의 증가를 GF-Fus3과 항-Infl-2(덱사메타손-21-팔미테이트)의 조합에 의해 얻었다. 제8일 및 제12일에 대해 배양의 마지막의 최종 48시간 동안 35S-황산염 혼입을 측정하였다(도 9b). 데이터는 평균±SEM이다. 처리가 없는 대조군(건강함) 35S-황산염 혼입률은 제8일 및 제12일에 각각 153.5 ± 9.1 및 123.2 ± 8.8(평균 ±SEM)p㏖/hr/㎍ DNA였다.
도 10은 (a) 겔 4로부터 GF-Fus2의 누적 방출; (b) 겔 3으로부터 GF-Fus2의 누적 방출; (c) 겔 4로부터 GF-Fus2의 시점 당 방출; (d) 겔 3으로부터 GF-Fus2의 시점 당 방출; (e) 겔 4로부터 야생형 IGF의 누적 방출; (f) 겔 3으로부터 야생형 IGF의 누적 방출; (g) 겔 4로부터 야생형 IGF의 시점 당 방출; (h) 겔 3로부터 야생형 IGF의 시점 당 방출의 그래프를 제시한 도면. GF-Fus2 및 야생형 IGF를 제4일 후에 추가 방출이 없는 제0일 내지 제3일과 유사한 속도로 겔 3과 겔 4 둘 다로부터 방출되었다. 데이터는 평균±SEM이다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 나노입자 유형을 표시하기 위해 명명법 GelX-Y(여기서, X는 겔 1 및 2에 대해 각각 1 또는 2이고, Y는 1 내지 5임)를 이용하는 본 명세서에 개시된 하이드로겔 제형으로부터 시간(일)에 대한 항-Infl-2(덱사메타손-21-팔미테이트)의 누적 방출 그래프를 도시한 도면. 항-Infl-2의 방출 속도를 달리하여 가장 빠른(겔2-3) 방출 제형과 가장 느린(겔 1-1 및 1-3) 방출 제형 간의 제9일에서의 누적 방출의 4-배 차이를 달성하였다. 데이터는 평균±SEM이다.
도 12는 (a) 거골 연골 외식편의 인간 발목 돔(ankle dome); (b) 인간 발목 후방 거골 연골 외식편; (c) 거골 및 경골 및 비골 복사뼈로부터 풀링한 인간 발목 연골 외식편; 및 (d) 인간 무릎 대퇴골-슬개골 고랑 연골 외식편으로부터의 sGAG 손실%의 그래프를 제시한 도면. 외식편을 사이토카인(질환)과 함께 배양의 16일(16D) 동안 단독으로 또는 조합하여 GF-Fus3 및 항-Infl-1(덱사메트에타손)으로 처리하였다. 사이토카인이 없는 대조군(건강함). 항-Infl-1은 단독 그리고 GF-Fus3과의 조합 둘 다에서 모든 조직에 대해 sGAG 손실%을 감소시켰다. 데이터는 평균±SEM이다.
도 13은 단독 그리고 조합 둘 다에서 16일(16D) 동안 GF-Fus3 및 항-Infl-1 (덱사메타손)으로 처리를 위해 35S-황산염 혼입에 의해 결정한 바와 같은 황산화 기질 생합성의 그래프를 제시한 도면. (a) 거골 연골 외식편의 인간 발목 돔; (b) 인간 발목 후방 거골 연골 외식편; (c) 거골의 두부 및 경골 및 비골 복사뼈로부터 모은 인간 발목 연골 외식편; (d) 인간 무릎 대퇴골-슬개골 고랑 연골 외식편; 및 (e) 인간 무릎 관절구 연골 외식편에 대해 사이토카인(질병)과 함께 16일 배양의 최종 48시간 동안 혼입을 측정하였다. GF-Fus3는 단독 그리고 항-Infl-1(덱사메타손)과 조합 둘 다에서 질환 대조군에 대해 기질 생합성을 증가시켰다. 건강한 대조군 혼입 속도는 13a 내지 e에서 각각 조직에 대해 89.3 ± 13.0, 83.1 ± 9.8, 72.6 ± 8.8, 88.8 ± 13.8 및 82.2 ± 9.9p㏖/hr/㎍DNA였다. 데이터는 평균±SEM이다.
도 14는 (a) 거골 연골의 인간 발목 돔, (b) 인간 발목 후방 거골 연골, (c) 거골 및 경골 및 비골 복사뼈 연골의 인간 발목 두부, 및 (d) 인간 무릎 대퇴골-슬개골 고랑 연골에 대한 35S-황산염 혼입에 의해 결정한 바와 같이 사이토카인(질환)의 존재에서 16일 동안 항-Infl-1(덱사메타손)과 조합한 각각의 GF-Fus1 및 GF-Fus3 에 의한 8일 및 16일 처리(각각 8D 및 16D) 동안 황산화 기질 생합성의 그래프를 제시한 도면. 35S-황산염 혼입을 사이토카인(질환)과 함께 16일 배양의 최종 48시간 동안 측정하였다. 건강한 대조군 혼입 속도는 14a 내지 14d의 조직에 대해 각각 89.3 ± 13.0, 83.1 ± 9.8, 72.6 ± 8.8 및 88.8 ± 13.8p㏖/hr/㎍DNA였다. 각각 GF-Fus1 및 GF-Fus3(검정색 막대)으로 16일 처리는 질환 대조군에 대해 35S-황산염 혼입을 자극하였지만, GF-Fus3만이 8일의 처리(흰색 막대)로 35S-황산염 혼입을 자극하였고, (e) 각각 GF-Fus1 및 GF-Fus3으로 8 및 16일 처리 동안 황산화 기질 생합성을 35S-황산염 혼입에 의해 결정한 바와 같이 사이토카인이 없을 때 16일 동안 항-Infl-1과 조합한다. 16일 배양의 최종 48시간 동안 인간 무릎 관절구 연골 외식편 혼입을 측정하였다. 사이토카인 없음(건강함), 사이토카인(질환) 및 항-Infl-1은 단독으로 대조군으로서 포함된다. 각각의 GF-Fus1 및 GF-Fus3(검정색 막대)에 의한 16일 처리는 질환 대조군에 대해 그리고 항-Infl-1 단독에 대해 35S-황산염 혼입을 자극하였지만, GF-Fus3만이 처리 8일에 35S-황산염 혼입을 자극하였다(흰색 막대). 데이터는 평균±SEM이다.
도 15는 (a) 연골 용해물 중의 덱사메타손 농도; (b) 반월판 용해물 중의 덱사메타손 농도. (c) 인대 용해물 중의 덱사메타손 농도; (d) 슬개골 + 주변 활막 용해물 중의 덱사메타손 농도; (e) 혈청 중의 덱사메타손 농도; (f) 세척물 중의 덱사메타손 농도; (g) 연골 용해물 중의 IGF 농도; (h) 반월판 용해물 중의 IGF 농도; (i) 인대 용해물 중의 IGF 농도; (j) 슬개골 + 주변 활막 용해물 중의 IGF 농도; (k) 혈청 중의 IGF 농도; 및 (l) 세척물 중의 IGF 농도를 도시하는 일련의 그래프를 도시한 도면. 즉시 시점 샘플을 0.1시간에 플롯팅한다. 데이터는 평균±SEM이다. 상실점은 검출 하한 미만이었다.
도 16은 사이토카인(질환)의 존재 하에 GF-Fus1, GF-Fus3-His 또는 GF-Fus3으로 처리하고 4일 및 12일(각각 4D, 흰색 막대, 및 12D, 검정색 막대) 동안 35S-황산염 혼입에 의해 측정한 황산화 기질 생합성의 그래프이다. 사이토카인 처리 단독(질환)을 대조군으로서 포함하였다. GF-Fus3은 GF-Fus3-His에 대한 동등한 연골 기질 합성을 자극하였다. 데이터는 평균±SEM이다.
도 17은 등급 1 연골을 지니는 63세 여성(17a) 및 등급 3 연골을 지니는 76세 여성(17b)으로부터의 활액 중의 융합 단백질 안정성을 나타내는 2개의 겔 이미지를 도시한 도면. 좌측의 5개 레인은 표시한 시간 동안 37℃에서 활액 중의 인큐베이션 후 45ng의 GF-Fus3을 부하하였다. 우측의 5개 레인은 활액 중에서 인큐베이션시키지 않은 저장액 GF-Fus3 표준(ng)을 부하하였다. 7.5kDa 미만의 희미한 밴드는 1ng 이하인 최소 단백질 분해를 나타내었다(즉, 2% 미만의 부하 단백질이 분해되었다).
본 개시내용은 `성장 인자 수용체(예를 들어, IGF-1 수용체)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되는 제1 도메인 및 연골 기질 성분(예를 들어, 프로테오글라이칸 서브유닛, 예컨대 황산화 글라이코사미노글라이칸(sGAG), 콘드로이틴황산염 및 콜라겐)에 특이적으로 결합되는 제2 도메인, 및 이들 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 약제학적 조성물을 이용하여 근골격 질환, 예를 들어, 관절염(예를 들어, 골관절염), 외상성 관절 손상, 및 관련된 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "긴 [R3]-IGF-1," "LR3" "IGF(LR3)" 및"GF-Fus1"은 아미노산 서열:FPAMPLSSLFVNGPRTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRA
PQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(서열번호 1)을 갖는 IGF-1 변이체 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 동의어로 사용된다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 다량체 등은 또한 펩타이드 결합에 의해 연결된 선형으로 배열된 아미노산으로 구성되며, 생물학적으로, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는지 여부 및 자연적으로 생기는 또는 비-자연적으로 생기는 아미노산으로 구성되는지 여부는 본 정의 내에 포함된다. 전장 단백질과 이의 단편은 둘 다 정의에 의해 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 공번역 및 번역후(C-말단의 펩타이드 절단) 변형, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질 절단(예를 들어, 퓨린 또는 메탈로프로테아제에 의한 절단) 등을 포함한다. 더 나아가, 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은, 단백질이 목적으로 하는 활성을 유지한다면, 천연 서열에 대해 결실, 첨가 및 치환과 같은 변형(일반적으로 당업자에게 공지된 대로 사실상 보존적)을 지니는 변이체 및 유도체를 포함한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해 숙고될 수 있거나, 또는 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA 방법에 기인하는 오류와 같이 우연적일 수 있다.
용어 "상동성", "동일성" 및 "유사성"은 두 펩타이드 간의 또는 두 개의 최적으로 정렬된 핵산 분자 간의 서열 유사성 정도를 지칭한다. 상동성 및 동일성은 각각 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 이는 디폴트 위치에서 표준 상동성 소프트웨어, 예컨대 BLAST, 버전 2.2.14를 이용하는 것이 기반한다. 비교되는 서열 내 동등한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 해당 위치에서 분자는 동일하며; 동등한 부위가 유사한(입체 및/또는 전자 특성, 예컨대 보존적 아미노산 치환이 유사) 아미노산 잔기에 의해 점유되면, 분자는 해당 위치에서 상동성(유사)으로서 지칭될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율로서 표현은 각각 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 유사 또는 동일한 아미노산의 수의 함수를 지칭한다. "비관련" 또는 "비상동성"인 서열은 본 명세서에 개시된 바와 같은 서열과 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 비교창에 걸쳐 동일함(즉, 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 또는 잔기 대 잔기 기준)을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 서열 둘 다에서 생기는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 수득하며, 매칭 위치의 수를 비교창 내 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 특징을 의미하되, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산은 적어도 18개 뉴클레오타이드(6개 아미노산) 위치의 비교창에 걸쳐, 빈번하게는 적어도 24 내지 48개 뉴클레오타이드(8 내지 16개 아미노산) 위치의 창에 걸쳐 기준 서열과 비교하여 적어도 85% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 내지 95% 서열 동일성, 더 보통으로는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하되, 서열 동일성의 백분율은 비교창에 걸쳐 기준 서열의 총 20% 이하인 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 서열과 기준 서열을 비교함으로써 계산된다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트일 수 있다. 폴리펩타이드를 기재하기 위해 사용될 때 용어 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 보존된 아미노산 치환을 제2 폴리펩타이드 서열과 비교함으로써 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성" 또는 "동족체"는 상호호환적으로 사용되며, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 설명하기 위해 사용될 때, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이들의 지정된 서열이, 예를 들어, 정렬을 위한 디폴드 파라미터와 함께 BLAST, 버전 2.2.14를 이용하여(본 명세서 참조) 최적으로 정렬되고 비교될 때, 적어도 70%의 뉴클레오타이드, 보통 약 75% 내지 99%, 및 더 바람직하게는 적어도 약 98 내지 99%의 뉴클레오타이드에서 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실 또는 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 동일하다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상동체" 또는 "상동성"은 구조 및/또는 작용에 관한 상동성을 지칭한다. 서열 상동성에 관해, 그들이 적어도 50%, 적어도 60 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성이라면, 서열은 상동체이다. 본 발명의 유전자 또는 펩타이드의 상동체의 결정은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
용어 "실질적으로 상동성"은 적어도 90%, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일 또는 적어도 99% 동일한 서열을 지칭한다. 상동성 서열은 상이한 종 내의 동일한 기능성 유전자일 수 있다. 본 발명의 유전자 또는 펩타이드의 상동체의 결정은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터 내로 입력되고, 필요하다면 하위 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터 기준으로 기준 서열에 비교한 시험 서열(들)에 대한서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어, 스미스(Smith)와 워터만(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘에 의해(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해(J. MoI. Biol. 48:443-53 (1970)), 피어슨(Pearson) 및 리프만(Lipman)의 유사성 방법에 대한 검색에 의해 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)), 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해(예를 들어, 위스콘신주 메디슨에 소재한 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 시각적 검사에 의해 수행될 수 있다. (일반적으로 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999)] 참조).
유용한 알고리즘의 일 예는 PILEUP이다. PILEUP는 서열 동일성 백분율을 나타내기 위해 진행적, 쌍별 정렬을 이용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한 정렬을 생성하기 위해 사용되는 클러스트링 관계를 나타내는 계통수 또는 계통도를 플롯팅한다. PILEUP는 펭(Feng) 및 두리틀(Doolittle)의 진행적 정렬 방법의 단순화를 이용한다(J. MoI. Evol. 25:351-60 (1987)). 사용되는 방법은 힙긴(Higgin) 및 샤프(Sharp)에 의해 기재되는 방법과 유사하다(Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989)). 프로그램은 각각 최대 길이가 5,000개 뉴클레오타이드 또는 아미노산인 300개까지의 서열을 정렬할 수 있다. 다중 정렬 절차는 두 정렬 서열의 클러스터를 생성하는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍별 정렬을 시작한다. 이어서, 이 클러스터는 다음의 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터로 정렬된다. 서열의 두 클러스터는 두 개별 서열의 쌍별 정렬의 단순한 연장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 진행적, 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 서열 비교 영역에 대해 구체적 서열 및 그들의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 좌표를 지정하고, 프로그램 파라미터를 지정함으로써 실행된다. 예를 들어, 기준 서열은 다른 시험 서열과 비교되어 다음의 파라미터를 이용하는 서열 동일성 백분율을 결정할 수 있다: 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치(0.10), 및 가중치 부여된 말단 갭.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 다른 예는 알트슐(Altschul) 등에 의해 설명되는 BLAST 알고리즘이다(J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990)). (또한 문헌[Zhang et al., Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997)] 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information) 인터넷 웹 사이트를 통해 공공연하게 입수가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 내 동일 길이의 단어로 정렬할 때 일부 긍정적-값의 역치 스코어 T와 매칭되거나 또는 충족시키는 질의 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 동정함으로써 고 득점 서열쌍(high scoring sequence pair: HSP)을 우선 동정한다. T는 이웃 단어 스코어 역치로서 지칭된다(Altschul et al. (1990), 상기 참조). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 시작하기 위한 씨앗으로서 작용한다. 이어서, 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 단어 히트는 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각각의 방향에서 단어 히트의 연장은: 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성값으로부터 분량 X만큼 떨어져 있을 때; 누적 스코어가 하나 이상의 부정적-스코어링 잔차 정렬의 축적에 기인하여 0 이하로 진행할 때; 또는 서열 중 하나의 끝에 도달될 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992)] 참조) 정렬(B) 50, 예상치(E) 10, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 이용한다.
서열 동일성 백분율을 계산하는 것에 추가로, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 일 측정은 가장 작은 합계 확률(P(N))인데, 이는 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 매칭이 우연히 일어날 수 있는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 아미노산 서열은, 기준 서열에 대한 시험 아미노산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 0.1 미만, 더 전형적으로는 약 0.01 및 가장 전형적으로는 약 0.001 미만이라면, 기준 아미노산 서열과 유사한 것으로 고려된다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대 류신의 아이소류신 또는 발린으로의 대체, 아스파트산염의 글루탐산염으로의 대체 또는 트레오닌의 세린으로의 대체로부터 초래된다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적 치환"은 훨씬 중요한 아미노산의 치환이 펩타이드의 활성을 감소시키지 않도록(즉, BBB에 침투하는 펩타이드의 능력) 폴리펩타이드 활성 또는 아미노산의 치환에 중요하지 않은 해당 아미노산의 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양전하 또는 음전하, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 다음의 6종의 기는 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 알기닌(R), 라이신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)(또한 문헌[Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)] 참조). 일부 실시형태에서, 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변용, 첨가 또는 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 첨가는 또한, 변화가 펩타이드의 활성을 감소시키지 않는다면, "보존적 치환"으로서 고려될 수 있다. 삽입 또는 결실은 전형적으로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위에 있다. 보존적 아미노산의 선택은, 예를 들어 아미노산이 펩타이드의 외부에 있고 용매에 노출되거나 또는 내부에 있고 용매에 노출되지 않는다면, 펩타이드 내에서 치환될 아미노산의 위치에 기반하여 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 존재하는 아미노산의 위치, 즉, 용매에 대한 그것의 노출에 기반하여 존재하는(즉, 아미노산이 용매에 노출되지 않은 내부로 국소화된 아미노산에 비해 용매에 노출되거나 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 외면 상에 존재한다면) 아미노산을 치환할 아미노산을 선택할 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환의 선택은, 예를 들어 문헌[Dordo et al, J. MoI Biol, 1999, 217, 721-739 및 Taylor et al, J. Theor. Biol. 119(1986);205-218 및 S. French and B. Robson, J. MoI. Evol. 19(1983)171]에 개시된 바와 같이, 당업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 외부 상의 아미노산(즉, 용매에 노출된 아미노산)에 적합한 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어, 다음의 치환이 사용될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다: Y의 F로의 치환, T의 S 또는 K로의 치환, P의 A로의 치환, E의 D 또는 Q로의 치환, N의 D 또는 G로의 치환, R의 K로의 치환, G의 N 또는 A로의 치환, T의 S 또는 K로의 치환, D의 N 또는 E로의 치환, I의 L 또는 V로의 치환, F의 Y로의 치환, S의 T 또는 A로의 치환, R의 K로의 치환, G의 N 또는 A로의 치환, K의 R로의 치환, A의 S, K 또는 P로의 치환.
대안의 실시형태에서, 단백질 또는 펩타이드의 내부의 아미노산에 적합한 포함된 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드의 내부의 아미노산에 대한(즉, 아미노산은 용매에 노출되지 않음) 적합한 보존적 치환을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 다음의 보존적 치환을 사용할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다: Y는 F로 치환되고, T는 A 또는 S로 치환되며, I는 L 또는 V로 치환되고, W는 Y로 치환되며, M은 L로 치환되고, N은 D로 치환되며, G는 A로 치환되고, T는 A 또는 S로 치환되며, D는 N으로 치환되고, I는 L 또는 V로 치환되며, F는 Y 또는 L로 치환되고, S는 A 또는 T로 치환되며, A는 S, G, T 또는 V로 치환된다. 일부 실시형태에서, 비보존적 아미노산 치환이 또한 변이체의 용어 내에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 유비퀴틴화, 표지, 페길화(폴리에틸렌 글라이콜을 이용하는 유도체화), 지질화, 글라이코실화, 또는 다른 분자의 첨가와 같은 기법에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 지칭한다. 분자는 또한 그것이 정상적으로 분자의 부분이 아닌 추가적이 화학적 모이어티를 함유할 때 다른 분자의 "유도체"이다. 이러한 모이어티는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 모이어티는 대안적으로 분자의 독성을 감소시키고, 분자 등의 임의의 원치않는 부작용을 제거 또는 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (1990)]에 개시된다.
용어 "삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위에 있다. 허용되는 변화는 펩타이드를 합성적으로 생성하는 한편, 재조합 DNA 기법을 이용하여 서열 내에 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 조직적으로 생성함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
용어 "치환"은 펩타이드를 지칭할 때, 상이한 독립체, 예를 들어 다른 아미노산 또는 아미노산 모이어티에 대한 아미노산 내의 변화를 지칭한다. 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다.
"공유적으로 결합된"은 공유 화학 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해) 결합되는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 2 이상의 단백질의 재조합 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 의해, 그들이 모든 의도된 단백질을 보유하는 단일 폴리펩타이드 내로 세포 내에서 번역될 수 있는 단일 오픈-리딩 프레임을 구성하도록, 다른 단백질을 암호화하는 핵산에 결합되도록 생성될 수 있다. 단백질의 배열 순서는 다를 수 있다. 융합 단백질은 에피토프 태그 또는 반감기 연장제를 포함할 수 있다. 에피토프 태그는 바이오틴, FLAG 태그, c-myc, 혈구응집소, His6, 디곡시게닌, FITC, Cy3, Cy5, 녹색 형광 단백질, V5 에피토프 태그, GST, β-갈락토시다제, AU1, AU5 및 아비딘을 포함한다. 반감기 연장제는 Fc 도메인 및 혈청 알부민을 포함한다.
용어 "대상체" 및 "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물에 의해, 예방적 치료를 포함하는 치료가 제공되는 동물, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 포유류)를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 지칭한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유류"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류, 예컨대 비인간 영장류(특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 기닉픽, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소 및 비-포유류, 예컨대 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 실험 동물 또는 질환 모델로서의 동물 대체물이다.
대상체에서 질환 또는 병태를 "치료하는" 또는 질환 또는 병태를 갖는 환자를 "치료하는"은 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상이 감소, 안정화 또는 예방되도록, 개체에 약제학적 치료, 예를 들어, 약물의 투여를 실시하는 것을 지칭한다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 목적으로 하는 폴리펩타이드를 인식하고 결합하지만, 본 발명의 폴리펩타이드를 자연적으로 포함하는 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플 내 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10-6 M 이하의 해리상수를 특징으로 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 해리상수는 적어도 약 1x10-7M, 1x10-8 M 또는 1x10-9M이다. 두 분자가 특이적으로 결합되는지 여부를 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 평형투석, 플라즈몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "판독"은 임의의 정성적 또는 정량적 측정을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 판독은 정성적 측정이다. 특정 실시형태에서, 판독은 정량적 측정이다.
본 발명은 본 명세서에 기재되는 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 보통 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
II. 융합 단백질
일 양태에서, 본 개시내용은 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되는 제1 도메인 및 연골 기질 성분에 특이적으로 결합되는 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
제1 도메인은 임의의 목적으로 하는 수용체(예를 들어, 성장 인자 수용체)를 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 도메인은 근골격 질환에 연루된 성장 인자 수용체(예를 들어, IGF-1 수용체)를 표적화한다. 제1 도메인은 성장 인자 수용체를 위한 자연적 또는 인공적 리간드를 포함할 수 있다. 제1 도메인은 요망된다면, 표적화된 성장 인자 수용체의 효현제 또는 길항제일 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 도메인은 IGF-1 수용체 리간드(예를 들어, 인간 IGF-1 수용체 리간드)를 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 제1 도메인은 인간 IGF-1 서열을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 제1 도메인은 긴 [R3]-IGF-1 서열(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 인간 장(Long)[R3]-IGF-1 서열)을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 제1 도메인은 서열번호 1에 제시된 인간 장 [R3]-IGF-1 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성 (예를 들어, 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
제2 유형의 도메인은 sGAG(예를 들어, 헤파란황산염, 콘드로이틴, 더마탄황산, 및 케라탄황산) 및/또는 콜라겐 또는 하이알루론산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 연골 기질 성분을 표적화할 수 있다. 제2 도메인에 사용될 수 있는 적합한 sGAG 결합 도메인은 표피성장인자(EGF), 프롤린-알기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복체 단백질(PRELP), 콘드로어드헤린, 온코스타틴 M, 콜라겐 IX, BMP-4, 피브로넥틴, RAND1, RAND2, RAND3, RAND4, RAND5, RAND6, AKK15, RLR22, R1Q17, SEK20, ARK24, AKK24, AL1, AL2, AL3, LGT25, Pep184, Pep186, Pep185, Pep239, Pep246, ATIII 또는 피브베타의 sGAG 결합 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 제2 도메인에 사용될 수 있는 적합한 콜라겐 결합 도메인은 트롬보스폰딘, 매트릴린, 연골 올리고머 기질 단백질, PRELP, 콘드로어드헤린, 피브로모듈린, 데코린 또는 아스포린의 콜라겐 결합 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 sGAG 및 콜라겐 결합 도메인은 본 명세서의 표 1 및 표 2에 제시된다.
특정 실시형태에서, 제2 도메인은 제1 도메인의 N-말단에 융합된다. 다른 실시형태에서, 제2 도메인은 제1 도메인의 C-말단에 융합된다. 융합 단백질은 도메인 사이의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 연골 기질 성분에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 하나 이상의 연골 기질 결합 도메인은 동일한 결합 도메인을 포함할 수 있거나 또는 대안적으로 각각 상이한 유형의 연골 기질 결합(즉, 제2의) 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 2 내지 13, 및 54 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 sGAG 결합 도메인을 포함한다(표 1 참조). 특정 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 2 내지 13, 및 54 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 아미노산 동일성(예를 들어, 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 갖는 sGAG 결합 도메인을 포함한다(표 1 참조).
특정 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 14 내지 16, 및 21 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 콜라겐 결합 도메인을 포함한다(표 2 참조). 특정 실시형태에서, 제2 도메인은 서열번호 14 내지 16, 및 21 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 아미노산 동일성(예를 들어, 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 갖는 콜라겐 결합 도메인을 포함한다(표 2 참조).
특정 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 1000nM 미만(예를 들어, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.0001nM 미만)의 Kd로 수용체(예를 들어, 성장 인자 수용체)에 결합한다. 더 낮은 Kd는 더 높은 결합 친화도에 대응한다는 것을 주목한다. 특정 실시형태에서, 제2 결합 도메인은 1000nM 미만(예를 들어, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.0001nM 미만)의 Kd로 연골 기질 성분(예를 들어, sGAG 또는 콜라겐)에 결합한다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 17 내지 20, 28 내지 53, 71 내지 87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(표 3 참조). 일 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 17 내지 20, 28 내지 53, 71 내지 87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 아미노산 동일성(예를 들어, 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다(표 3 참조). 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 히스티딘 태그를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 히스티딘 태그 또는 6x 히스티딘 태그는 융합 단백질은 융합 단백질의 c-말단에 융합된 서열 GGSGGHHHHHH(서열번호 89)를 지니는 펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 단백질은 포유류의 관절의 관절강내 공간(예를 들어, 활액) 내로 주사 후에 적어도 8일(예를 들어, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 12일)의 시간 기간 동안 관절의 연골 조직 내에 보유되고, 따라서 검출가능한 수준의 융합 단백질이 상기 시간 기간에 취해진 연골 조직의 생검 내에서 발견될 수 있다. 실시형태에서, 연골 조직 내에 보유된 검출가능한 수준(양)의 융합 단백질은 적어도 약 5(예를 들어, 약 10, 20, 30, 40 또는 50p㏖/g)의 조직일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 단백질은 관절에 투여할 때, 무해한 대조군 단백질(예컨대, 혈청 알부민)로 주사한 매칭 대조군 관절의 연골 조직 내 sGAG의 손실에 비해 관절 연골 조직으로부터 sGAG 상실의 감소를 야기한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 단백질은 손상된 관절에 투여될 때, 무해한 대조군 단백질(예컨대, 혈청 알부민)로 주사한 손상된 관절의 연골 조직 내 sGAG의 생성에 비해 관절 연골 조직으로부터 sGAG 생성의 증가를 야기한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 융합 단백질은 손상된 관절에 투여될 때, 무해한 대조군 단백질(예컨대, 혈청 알부민)로 주사한 손상된 관절의 연골 조직 내 sGAG의 함량에 비해 연골 조직 내 sGAG 함량의 증가를 야기한다.
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본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "RAND"는 구체적 패턴의 양전하를 지니는 서열의 무작위 생성을 설명한다. 상기 단백질은 적어도, 예를 들어, 문헌[Martino et al., Science v343, 885 (2014); Tillgren et al., J. Biol Chem. v284 No. 42 (2009); 　Andersson et al., Eur . J. Biochem. 271, 1219-1226 (2004); Hileman et al., BioEssays 20:156-167, (1998); 및 Guo et al., PNAS v89, 3040-3044 (1992)]에 기재되어 있다.
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특정 실시형태에서, 융합 단백질은 합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비-자연적 아미노산을 포함한다. D-아미노산-함유 펩타이드는 L-아미노산-함유 형태에 비해 시험관내 또는 생체내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 혼입한 펩타이드의 구성은 더 큰 생체내 또는 세포내 안정성이 요망되거나 또는 필요로 될 때 특히 유용할 수 있다. 더 구체적으로는, D-펩타이드는 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 내성이 있으며, 이에 의해 연결된 약물 및 컨쥬게이트의 더 양호한 경구 상피 및 경피 전달, 막-영구(permanent complexe) 복합체의 개선된 생체이용가능성(추가 논의에 대해 이하를 참조) 및 이러한 특성이 바람직할 때 연장된 혈관내 및 간질성 수명을 제공한다. D-이성질체 펩타이드의 용도는 또한 연결된 약물 및 다른 화물(cargo) 분자의 경피 및 경구 상피 전달을 향상시킬 수 있다. 추가적으로, D-펩타이드는 T 헬퍼 세포에 대한 주조직 적합성 복합체 클래스 II-제한된 제시에 대해 효율적으로 처리될 수 없으며, 따라서, 전체 유기체에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적다. 따라서 펩타이드 컨쥬게이트는, 예를 들어 세포 침투 펩타이드 서열의 D-이성질체 형태, 절단 부위의 L-이성질체 형태 및 치료적 펩타이드의 D-이성질체 형태를 이용하여 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 레트로-인버소(retro-inverso) 폴리펩타이드이다. "레트로-인버소 폴리펩타이드"는 적어도 하나의 위치상에서 펩타이드 결합의 방향의 반전, 즉, 아미노산의 측쇄에 대해 아미노- 및 카복시-말단의 반전이 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 레트로-인버소 유사체는 펩타이드 결합의 반전된 말단 및 반전된 방향을 갖는 한편, 천연 펩타이드 서열에서와 같은 측쇄의 위상(topology)을 거의 유지하였다. 레트로-인버소 펩타이드는 모든 아미노산이 D-이성질체가 될 때까지, L-아미노산 또는 D-아미노산, 또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 함유할 수 있다. 부분적 레트로-인버소 펩타이드 유사체는 서열의 일부만이 반전되고 거울상체 아미노산 잔기로 대체되는 폴리펩타이드이다. 이러한 유사체의 역 반전된 부분은 아미노 및 카복실 말단을 반전시키며, 역-반전된 부분에 측접하는 아미노산 잔기가 측쇄 유사 α-치환된 같은자리(geminal)-다이아미노메탄 및 말로네이트에 의해 각각 대체된다. 세포 침투 펩타이드의 레트로-인버소 형태는 자연적 형태로서 막을 가로질러 이행함에 있어서 효율적으로 작동하는 것이 발견되었다. 레트로-인버소 펩타이드 유사체의 합성은 문헌[F. et al., Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984); Verdini, A and Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:697-701 (1985)]; 및 미국 특허 제6,261,569호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다. 부분적 레트로-인버소 펩타이드 유사체의 고체상 합성을 위한 공정이 기재되어 있으며(EP 97994-B), 이는 또한 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)을 포함한다.
III. 약제학적 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 융합 단백질, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 실행에 따라 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000, ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 및 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York]을 참조하며, 이는 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다).
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 투여 즉시 또는 임의의 사전결정된 시간 또는 투여 후 시간 기간에 활성제(예를 들어, 융합 단백질)를 방출시키도록 제형화된다. 후자 유형의 조성물은 일반적으로 제어된 방출 제형으로서 공지되어 있으며, 이는 (i) 연장된 기간의 시간에 따라 신체 내에서 본 발명의 작용제(들)의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (ii) 사전결정된 지체시간 후에 연장된 기간의 시간에 따라 신체 내에서 본 발명의 작용제(들)의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (iii) 작용제(들)의 혈장 수준에서 제형과 관련된 원치않는 부작용(톱니 역학(sawtooth kinetic) 패턴)의 동시의 최소화와 함께 신체 내에서 상대적으로 일정한, 효과적인 수준의 작용제를 유지함으로써 사전 결정된 시간 기간 동안 작용제(들) 작용을 지속시키는 제형; (iv) 작용제(들) 작용을 국소화하는 제형, 예를 들어, 병에 걸린 조직 또는 기관에 인접하여 또는 조직 또는 기관 내에서의 제어된 방출 조성물의 공간적 배치; (v) 투약의 편리함을 달성하는 제형, 예를 들어, 1주 당 1회 또는 2주마다 1회로 조성물을 투여; 및 (vi) 특정 표적 세포 유형에 치료제를 전달하는 담체 또는 화학적 유도체를 이용함으로써 작용제(들)의 작용을 표적화하는 제형을 포함한다.
방출속도가 당해 융합 단백질의 대사 속도보다 큰 제어된 방출을 얻기 위해서 임의의 다수의 전략이 추구될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제어된 방출은, 예를 들어 다양한 유형의 제어된 방출 조성물 및 코팅을 포함하는 다양한 제형 파라미터 및 성분의 적절한 선택에 의해 얻어진다. 따라서, 융합 단백질은 투여 시, 제어된 방식으로 융합 단백질을 방출하는 약제학적 조성물 내로 적절한 부형제와 함께 제형화된다. 예는 하이드로겔, 캡슐 조성물, 오일 용액, 현탁액, 에멀전, 마이크로캡슐, 분자 복합체, 마이크로스피어, 나노입자, 패치, 리포솜 또는 이들의 조합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 생체에 적합한 하이드로겔로 제형화된다. 관절 내에 투여될 수 있고 본 명세서에 개시된 융합 단백질의 목적으로 하는 방출 프로파일을 달성하는 임의의 하이드로겔이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔은 하이알루론산(HA), HA 유도체, 셀룰로스 유도체, 및 헤파린-유사 도메인 중합체 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 메틸셀룰로스를 포함한다. 메틸셀룰로스의 임의의 분자량, 예를 들어 약 5kDa 내지 약 500kDa이 사용될 수 있다. 임의의 메틸셀룰로스의 양이 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 메틸셀룰로스의 양은 약 1 내지 약 10중량%의 하이드로겔이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 HA(예를 들어, 하이알루론산나트륨)를 포함한다. HA의 임의의 분자량, 예를 들어, 약 10kDa 내지 약 1.8MDa이 사용될 수 있다. 임의의 양의 HA 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, HA의 양은 약 1 내지 약 10중량%의 하이드로겔이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 콘드로이틴황산염, 헤파란황산염 또는 헤파린을 포함하는 헤파린-유사 도메인 중합체를 포함한다. 임의의 양의 헤파린-유사 도메인 중합체가 하이드로겔 중에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 헤파린-유사 도메인 중합체의 양은 약 0.05중량% 내지 2중량%의 하이드로겔이다.
특정 실시형태에서, 하이드로겔은 특정 온도 초과(예를 들어, 35℃ 초과)에서 열경화성이다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔은 특정 온도 미만(예를 들어, 35℃ 미만)에서 유체이거나 또는 전단박화된다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 본 명세서에 개시된 하이드로겔의 약 1 내지 약 1000㎍/g의 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 본 명세서에 개시된 하이드로겔의 약 100 내지 약 10,000㎍/g의 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔은 글루코코티코이드를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 글루코코티코이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. 적합한 글루코코티코이드는 알클로메타손, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로로프레드니손, 시클레소니드, 코티솔, 코티스포린, 코티바졸, 데플라자코트, 덱사메타손, 플루드록시코타이드, 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루오코톨론, 플루오로메톨론, 플루티카손, 헥스아세톤하이드로코타메이트, 하이드로코티손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드닐리덴, 프레그나다이엔, 프레그나트라이엔, 프레그넨, 프록토세딜, 리멕솔론, 테트라하이드로콜티코스테론, 트라이암시놀론 및 유로베타솔을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 화합물은 아세트산염(이아세트산염을 포함), 아세토나이트(헥사세토나이드), 퓨로산염, 인산염 및 프로피온산염(이프로피온산염을 포함)을 포함하는 이러한 화합물의 임의의 및 모든 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 및 에스터의 형태일 수 있다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 에스터 결합을 통해 지방산(예를 들어, 팔미트산)에 컨쥬게이션된다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 리포솜 또는 다층 소포와 같은 극미립자 담체 내에 함유된다. 리포솜 극미립자는 고융점(Tm) 지질, 예를 들어, DSPC, DPPC 또는 HSPC를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 리포솜 극미립자에 함유되며, 리포솜 지질의 0.1 내지 20몰%로 존재한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 리포솜 극미립자에 함유되며, 리포솜 지질은 하이드로겔의 0.01중량% 내지 10중량%이다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 약제학적 조성물(예를 들어, 하이드로겔)이 관절 내로 주사될 때, 연골 기질 합성을 자극하거나 세포 생존을 자극하거나 또는 연골 기질 분해를 방지하거나 또는 세포사를 방지하는데 충분한 농도로 하이드로겔 중에 존재한다. 특정 실시형태에서, 글루코코티코이드는 하이드로겔의 1 내지 1000㎍/g의 농도로 존재한다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 관절의 연골 기질 합성 또는 분해 판독은 융합 단백질 또는 융합 단백질 + 글루코코티코이드 단독의 조합물의 주사 후 판독에 대해 개선을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 글루코코티코이드는 적어도 약 8일의 반감기(예를 들어, 9, 10, 11 또는 12일)로 관절 내에 존재한다.
특정 실시형태에서, 관절의 관절강내 공간 내로 조성물의 주사 후에, 융합 단백질은 융합 단백질 또는 글루코코티코이드 중 하나가 단독으로 주사될 때보다 더 긴 시간 동안 관절의 관절강내 공간에 보유된다.
IV. 치료 방법
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 근골격 병태(예를 들어, 골관절염)를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체의 관절강 내로 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 근골격 병태의 치료방법을 제공한다. 적합한 근골격 병태는 골관절염, 하나 이상의 연골 결함, 류마티스 관절염, 손상 후 연골 퇴행, 급성 염증성 관절염, 감염성 관절염, 골다공증, 또는 다른 약리학적 개입으로부터의 부작용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료방법은 근골격 병태로 고통받는 이러한 대상체의 선택을 추가로 포함한다. 이러한 선택은 다수의 이용가능한 방법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 증상의 평가에 의해 당업자에 의해 수행된다.
성공적인 치료는 근골격 병태의 하나 이상의 증상의 개선을 입증한다. 치료가 필요한 대상체에게 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 투여하는 단계는 근골격 질환의 개선을 예방 또는 지연시키는 것으로 예상된다. 용어 "예방"은 대상체가 예방 중인 구체적 병태를 아직 갖지 않는 상태를 지칭하며, 임의의 인식가능한 형태로 나타나지 않았음을 의미한다. 예방은 증상의 개시 및/또는 중증도의 예방 또는 늦춤을 포함한다(대상체가 이미 다른 병태의 하나 이상의 증상을 갖는 경우를 포함함). 예방은 일반적으로 병태 또는 신체 기능장애가 발생할 위험에 있는 대상체에서 수행된다. 이러한 대상체는 예방이 필요한 것으로 언급된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 예방 방법은 추가로 대상체에게 융합 단백질을 투여하기 전에 근골격 병태의 위험에 있는 이러한 대상체를 선택함으로써 근골격 병태를 예방하는 것을 포함한다. 이러한 선택은 다수의 이용가능한 방법에 의해 당업자에 의해 수행된다. 예를 들어, 위험 인자의 평가 또는 병태 또는 기능장애를 야기하는 것으로 알려진 질환의 진단, 또는 병태를 야기하는 것으로 알려진 치료 또는 요법. 병태에 기여하는 것으로 알려진 질환 또는 손상 또는 적절한 가족력을 갖는 대상체는 일반적으로 증가된 위험에 있는 것으로 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적(즉, 방지적) 측정을 둘 다 지칭하되, 목적은 근골격 병태의 적어도 하나의 효과 또는 증상을 감소시키는 것과 탕이 질환의 발생을 예방하거나 또는 늦추는 것이다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 본 명세서에 정의된 해당 용어로서 축소된다면, "효과적"이다. 대안적으로, 치료는 근골격 병태의 진행이 줄어들거나 중단된다면 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라 치료가 없을 때 예상되는 증상의 진행 또는 악화를 적어도 늦추는 것의 중단을 포함한다. 유리한 또는 목적으로 하는 임상적 결과는 하나 이상의 증상(들)의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 개선 또는 질환 상태의 일시적 완화 및 관해(부분적이든 전체적이든), 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는다면 예상되는 생존에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유효량"은 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 하나 이상의 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 지칭하며, 목적으로 하는 효과를 제공하기 위한 충분한 양의 약리학적 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 어구 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 유해/유익비로 장애를 치료하기 위한 충분한 양의 조성물을 의미한다. 따라서, 용어 "치료적 유효량"은 근골격 병태와 관련된 증상 또는 임상적 마커에서 치료적으로 또는 예방적으로 유의한 감소를 달성하는데 충분한 본 명세서에 개시된 조성물의 양을 지칭한다.
증상에서 치료적 또는 예방적으로 유의한 감소는 대조군 또는 비처리 대상체에 비해 측정 파라미터에서의, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150% 초과이다. 측정된 또는 측정가능한 파라미터는 질환의 임상적으로 검출가능한 마커, 예를 들어, 상승된 또는 하락된 수준의 생물학적 마커뿐만 아니라 임상적으로 허용되는 류모의 증상과 관련된 파라미터 또는 질환 또는 장애에 대한 마커를 포함한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 제형의 총 1일 용법은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 담당의사에 의해 결정된다는 것이 이해될 것이다. 필요한 정확한 양은 치료될 질환의 유형과 같은 인자에 따라 다를 것이다.
근골격 병태를 지니는 대상체의 치료에 관해, 용어 "치료적 유효량"은 환자에서 근골격 병태의 진행을 예방 또는 지연시키고, 추가로 감소시키는데 충분하고 안전한 양을 지칭한다. 따라서 양은 근골격 병태의 적어도 하나의 증상에서 질환을 치유 또는 야기할 수 있다. 질환의 치료를 위한 유효량은 질환의 유형, 치료 중인 종, 대상체의 연령 및 일반적 병태, 투여 방식 등에 의존한다. 따라서, 정확한 "유효량"을 구체화하는 것이 가능하지 않다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해, 적절한 "유효량"은 단지 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료 효능은 당업자에 의해 판단될 수 있으며, 예를 들어, 효능은 근골격 질환의 동물 모델에서 평가될 수 있다. 실험 동물 모델을 이용할 때 치료 효능은 근골격 질환의 증상 감소가 미처리 동물에 대해 나타날 때에 입증된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여하는" 및 "도입하는"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 목적으로 하는 부위에 이러한 작용제(들)의 전달을 야기하는 방법 또는 경로에 의한 대상체에 대한 하나 이상의 융합 단백질과 같은 치료제의 배정을 지칭한다. 융합 단백질은 대상체에서 효과적인 치료를 야기하는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질 또는 이의 조성물은 당업계에 공지된 또는 본 명세서에 기재된 임의의 경로, 예를 들어 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내 또는 근육내), 복강내, 직장, 경피, 비강, 질, 흡입, 피부(패치) 또는 안구에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질 또는 이의 조성물은 직접적 관절강내 주사에 의해 투여된다. 본 명세서에 개시된 융합 단백질 또는 조성물은 임의의 용량 또는 투약 요법으로 투여될 수 있다.
융합 단백질 또는 조성물은 환자에게 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 다회 용량이 투여될 때, 용량은 서로로부터, 예를 들어 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, 1일, 2일, 1주, 2주 또는 1개월만큼 분리될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 융합 단백질 또는 조성물은, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20주 이상 동안 투여될 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 치료가 필요한 개체 및 조성물을 투여하거나 또는 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 따라 조정되어야 한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 융합 단백질 또는 조성물의 투약량은, 더 낮은 용량이 충분한 치료적 활성을 제공하지 않는다면, 증가될 수 있다.
담당의사는 궁극적으로 적절한 양 및 투약 요법을 결정할 것이지만, 치료적 유효량의 융합 단백질은 0.0001, 0.01, 0.01 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500 또는 1,000㎎/㎏의 용량으로 제공될 수 있다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 생물학적 검정 또는 시스템으로부터 유도된 용량 반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
특정 환자 또는 대상체에 대한 투약량은 통상적인 고려사항(예를 들어, 적저한, 통상적인 약리학적 프로토콜에 의해)을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 의사는, 예를 들어 처음에 상대적으로 저용량을 처방하고, 후속적으로, 적절한 반응이 얻어질 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 환자에 투여되는 용량은 시간에 따라 환자에서 유리한 치료적 반응을 달성하는데, 또는 적용분야에 따라서, 예를 들어 증상 또는 다른 적절한 활성을 감소시키는데 충분하다. 용량은 특정 제형의 효능 및 융합 단백질의 활성, 안정성 또는 반감기 및 환자의 병태뿐만 아니라 치료될 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정 대상체에서 특정 벡터, 제형 등의 투여를 동반하는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정된다. 치료적 조성물은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 효능, 조직 대사를 확인하고 투약량을 추정하기 위해 선택적으로 질환의 하나 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 동물 모델, 예컨대 근골격 질환의 모델에서 선택적으로 시험된다. 특히, 투약량은 적절한 분석에서 치료 대 비처리의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 측정(예를 들어, 처리 대 비처리 세포 또는 동물 모델의 비교)에 의해 초기에 결정될 수 있다. 제형은 적절한 제형의 LD50 및/또는 융합 단백질의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 또는 분할된 용량을 통해 수행될 수 있다.
질병의 치료 또는 예방에서 투여될 유효량의 융합 단백질을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 제형 독성 및 질환의 진행을 평가한다.
화합물의 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차, 예를 들어, ED50(용량이 집단의 50%에서 유효함) 및 LD50(용량이 집단의 50%에 대해 치명적임)에 의해 결정될 수 있다. 독성 대 치료적 효과의 용량비는 치료지수이며, LD50/ED50의 비로서 표현될 수 있다. 큰 치료지수를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다.
본 개시내용의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약량 수준은 대상체에 독성이 되는 일 없이, 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적으로 하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 변화될 수 있다.
선택적 투약량 수준은 사용되는 특정 융합 단백질의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용 중인 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 다른 약물, 화합물 및/또는 사용되는 특정 화합물과 조합되어 사용되는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적 건강상태 및 사전의 의료 이력 및 의학 분야에 잘 공지된 유사한 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
V. 다른 실시형태
앞서 언급한 설명으로부터, 본 명세서에 기재된 발명을 다양한 용법 및 병태에 채택하기 위한 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것은 명확할 것이다. 이러한 실시형태는 또한 다음의 특허청구범위의 범주 내에 있다.
개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 제공하기 위한 라벨이 붙은 용기인 제조물품을 상정한다. 제조물품은 패키징 물질, 및 패키징 물질 내에 함유된 본 명세서에 개시된 융합 단백질의 약제학적 작용제를 포함한다.
제조물품 내 약제학적 작용제는 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 제공하는데 적합한 임의의 조성물이다. 따라서, 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체 또는 이러한 펩타이드를 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 포함할 수 있다.
제조물품은 단위 또는 다회 투약량으로 본 명세서에 나타낸 병태를 치료하는데 사용하기에 충분한 양의 약제학적 작용제를 함유한다. 패키징 물질은 본 명세서에 함유된 약제학적 작용제의 용도를 표시하는 라벨을 포함한다.
라벨은 추가로 시판에 필요할 수 있는 용도 및 관련 정보에 대한 설명을 포함할 수 있다. 패키징 물질은 약제학적 작용제의 저장을 위한 용기(들)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 패키징 물질은 고정된 수단 내에 약제학적 작용제를 보유할 수 있는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등과 같은 물질을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 패키징 물질은 약제학적 작용제를 함유하기 위해 사용되는 플라스틱 또는 유리 바이알, 합판 봉투 등의 용기일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 패키징 물질은 제조물품의 내용물을 설명하는 실재하는 표현인 라벨 및 그에 함유된 약제학적 작용제의 용도를 포함한다.
VI. 실시예
다음의 실시예는 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 단백질 발현 및 정제를 위한 방법
293F 세포에서 일시적으로 단백질을 생성하기 위한 방법
표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 목적으로 하는 단백질 서열을 암호화하는 핵산을 pCep4 벡터(인비트로젠(Invitrogen)) 내로 클로닝한다. 클로닝한 벡터를 37℃에서 밤새 2000 rpm에서 진탕시키면서 암피실린 선택을 지니는 1ℓ 루리아 브로스(Luria Broth) 중에서 형질전환 NEB 5-알파 적격 이콜라이(E. coli)(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 성장시킴으로써 증폭시킨다. 5000 g에서 20분 동안 스피닝함으로써 세포를 채취하고 나서, 벡터 DNA를 퀴아필터(QIA필터)(등록상표) 플라스미드 메가 키트(Plasmid Mega Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 박테리아 펠렛으로부터 추출한다. 1ℓ의 F17 배지(인비트로젠(등록상표))에 20㎖의 200mM L-글루타민(공급원?) 및 10㎖의 10% 플루로닉(Pluronic) F-68을 첨가함으로써 293F 세포 배양 배지를 제조한다. 일시적 형질감염을 위해, 1ℓ의 293F 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 1.5 내지 2.0×106/㎖의 밀도로 성장시킨다. 1㎎의 총 단백질 및 2.5㎖의 폴리에틸렌이민 용액(1㎎/㎖)을 50㎖의 세포 배양 배지에서 혼합하고 나서, 교반시키고, 15분의 인큐베이션 후에 세포에 첨가한다. 최종 농도 0.5%로 펩톤(0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균시킨 F17 배지 내 20% w/v 저장용액)과 함께 형질감염 후 24시간 및 72시간에 형질감염시킨 세포를 공급한다. 세포 생존도가 80% 미만으로 떨어진 후에(일반적으로 일 주일), 4000 g에서 20분 동안 원심분리에 의해 세포를 채취한다. 얻어진 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시킨다.
안정하게 형질감염시킨 CHO 풀로부터 단백질을 생성하기 위한 방법
표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 DNA 2.0에서 합성한 목적으로 하는 단백질 서열을 암호화하는 핵산을 pMP10K(자체연구 소유 벡터) 내로 클로닝한다. 클로닝시킨 벡터를 37℃에서 밤새 2000 rpm에서 진탕시키면서 암피실린 선택을 지니는 10㎖ 루리아 브로스 중에서 증폭시킨다. 퀴아프렙(QIAprep)(등록상표) 스핀 미니프렙 키트(Spin Miniprep Kit)(퀴아젠)를 이용하여 벡터 DNA를 박테리아로부터 추출한다. 현탁액 적합 CHO K1 세포를 37℃, 5% CO2에서 2×106개/㎖ 이하의 밀도로 칸막이 진탕 플라스크 내 엑스-셀(EX-CELL)(등록상표) CD CHO 무혈청 배지(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표))에서 성장시킨다. 형질감염일에, 세포를 80,000개 세포/㎖의 밀도로 옵티-멤(Opti-MEM)(등록상표) I 무혈청 배지(인비트로젠(등록상표)) 내에서 재현탁시키고, 500㎕의 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트(1개의 웰/형질감염) 내에 분포시킨다. 이어서, 2.75㎕의 리포펙타민(Lipofectamine)(등록상표) LTX(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)(상표명))를 이용하여 10ng의 선택가능한 pNeo 벡터(네오마이신 선택 마커를 운반함)를 포함하는 1㎍ 총 DNA로 세포를 형질감염시킨다. 형질감염의 3시간 후에, 10% FBS로 보충한 1㎖의 HAMS-F12(인비트로젠(등록상표)) 배지를 첨가하고 나서, 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 48시간 동안 회수하였다. 이어서, 세포 배지를 0.5㎎/㎖에서 HAMS-F12 + 제네티신(Geneticin)(등록상표)으로 대체하고, 세포를 선택 하에 4일 동안 인큐베이션시킨다. 배지를 EX-CELL(등록상표) CD CHO, + 제네티신(Geneticin)(등록상표)으로 대체하고 나서, 세포를 콜로니 형태 및 모든 비형질감염 세포가 사멸될 때까지 2 내지 3주 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 125㎖ 진탕 플라스크에 25㎖의 0.3 x 106개 세포/㎖로 파종하는데 충분한 세포가 있을 때까지 선택한 형질감염시킨 세포를 25㎖ 플라스크 내로 확장시킨다. 목적으로 하는 용적에 도달될 때까지 0.3 x 106개 세포/㎖에서 세포 확장을 계속한다. 세포 밀도가 5 x 106개 세포/㎖ 초과에 도달될 때, 하이클론(Hyclone)(등록상표) 세포 부스트 5(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 10% 총 용적에 첨가한다. 생존도가 60% 미만으로 떨어질 때 6000 g에서 원심분리에 의해 세포를 채취한다. 아크로팩(AcroPak)(상표명) 1000 0.8/0.2㎛ 캡슐(팔 코포레이션(Pall Corporation))을 통해 상청액을 여과시킨다.
니켈 충전 수지 상의 단백질 정제
6x-히스티딘-태그 단백질을 AKTA(상표명) FPLC(상표명)(GE 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))를 이용하여 정제한다. 5mM 이미다졸 및 500mM의 NaCl를 정제될 단백질을 함유하는 여과시킨 상청액에 첨가한다. 새로 충전한 25㎖ 칼럼(1.6㎝ 내경)의 Ni-NTA 슈퍼 플로(Superflow)(퀴아젠(등록상표)) 니켈 충전 수지를 제공한 실행 완충제(PBS, + 0.5 M NaCl, pH 7.4)를 이용하여 평형상태로 만든다. 상청액을 10 ㎖/분으로 칼럼 상에 장입한다. 6 x PBS의 칼럼 용적, 500mM NaCl을 이용하여 칼럼을 세척한다. 300mM 이미다졸을 이용하여 결합 단백질을 칼럼으로부터 용리시킨다. 단백질을 함유하는 분획을 유인하여, PBS 중에서 밤새 투석시킨다.
IGF (LR3)- PRELP의 단백질 정제
두 크로마토그래피 단계(양이온 교환 및 음이온 교환)를 이용하여 0.2μM 여과 상청액으로부터 IGF(LR3)-PRELP을 정제한다. 제1 크로마토그래피 단계에서, SPFF(상표명) 양이온 교환 칼럼(내경 1.6㎝, 층 높이 10㎝, GE 헬스케어 사이언시스)을 0.5X PBS(pH 7.4)를 이용하여 평형상태로 만든다. 여과시킨 상청액을 증류수를 이용하여 1:1로 희석시키고 나서, 양이온 교환 칼럼 상에 장입한다. 결합 물질을 0.5X PBS(pH 7.4)로 세척하고 나서, 단계 구배를 이용하여 용리시킨다(1X PBS+500mM NaCl, pH 7.4). 모든 크로마토그래피 단계를 500㎝/hr의 유속에서 수행한다. 단백질을 함유하는 용리 분획을 모아서, 10 mS/㎝의 전도도로 증류수를 이용하여 희석시키고, pH를 1M 트리스 염기(Tris Base)를 이용하여 8.0으로 조절한다.
제2 크로마토그래피 단계에서, QSFFTM 음이온 교환 칼럼(내경 1.6㎝, 층 높이 10㎝, GE 헬스케어 사이언시스)을 0.5X PBS(pH 8.0)를 이용하여 평행상태로 만든다. 양이온 교환 풀(pH 및 전도도를 조절함)을 300㎝/hr의 유속으로 음이온 교환 칼럼 상에 장입한다. 통과액을 수집하고 나서, 농축시키고, 2X PBS에 대해 투석시킨다(pH 7.4).
SDS-PAGE 분석
단백질을 환원 및 비환원 조건에서 4 내지 12% SDS-PAGE 겔 상에서 실행하고 나서, 심플리블루(SimplyBlue)(상표명) 세이프스타인(SafeStain)(인비트로젠(등록상표))으로 염색시킴으로써 시각화한다. 1분 동안 수 중에서 겔을 마이크로파 조사하고, 이어서, 2분 동안 균주 내에서 균주 처리를 신속히 처리한다. 겔을 2분 동안 수 중에서 마이크로파 조사함으로써 오물을 제거한다. 이 방법을 사용하여 정제 단백질이 정확한 크기인지 여부 및 그것이 순수한지 여부를 결정한다.
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography: SEC)를 사용하여 단백질의 순도 및 단량체 상태를 평가한다. 50㎍의 단백질을 0.35 ㎖/분에 450mM NaCl을 지니는 10mM 인산염 완충제 중에서 TSKgel(등록상표) SuperSW3000 칼럼(4.6㎜ ID x 30㎝)(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)) 상에 주사한다. 오토 샘플러, 바이너리 펌프 및 다이오드 어레이 검출기를 구비한 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상에서 모든 측정을 수행한다. 켐스테이션(ChemStation)(등록상표) 소프트웨어(애질런트 테크놀로지(Agilent Technologies))를 이용하여 데이터를 분석한다.
실시예 2: 헤파란황산염 및 콘드로이틴황산염 에 대한 융합 단백질의 결합
ELISA 플레이트 상에 코팅한 다당류와 결합하는 단백질의 능력을 측정함으로써 다당류 헤파란 황산 및 콘드로이틴황산염에 대한 융합 단백질의 특이성을 결정할 수 있다. 헤파린 결합 플레이트(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 50㎕의 2 내지 10㎍/㎖ 농도의 헤파란황산염 또는 콘드로이틴황산염(시그마-알드리치(등록상표))으로 코팅하고 나서, 실온에서 밤새 인큐베이션시킨다. 플레이트를 PBS로 세척하고 나서, PBS 중의 0.2% 젤라틴 250㎕으로 1시간 동안 37℃에서 차단시킨다. 이어서, 플레이트를 PBS로 세척하고 나서, 두드려서 건조시킨다. 연속 희석물 중의 50㎕의 단백질을 웰에 첨가하고 나서, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 단백질 연속 희석을 100nM로부터 시작하고, PBS, 0.2% 젤라틴 및 1개의 블랭크(PBS, 0.2% 젤라틴 단독) 중에서 10회 추가적인 3배 희석을 포함한다. 플레이트를 PBS 중에서 세척한 후에, PBST 중에서 1:250으로 50㎕의 항-인간 IGF-1(앱캠(Abcam))을 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 1시간 회전 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 PBST로 세척하고 나서, PBST 중에서 100㎕의 1:1000 항-토끼-HRP(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)(등록상표))를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하고 나서, 실온에서 5 내지 10분 동안 100㎕ TMB 기질과 함께 인큐베이션시키고, 100㎕ 중단 용액을 첨가함으로써 반응을 중단시킨다. 450㎚에서 흡광도를 측정하고 나서, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(등록상표)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 이용하여 얻어진 데이터를 분석한다.
상기 방법을 사용하여 두 융합 단백질, 즉, GF-Fus3(6x-히스티딘-태그) 및 GF-Fus4(6x-히스티딘-태그)의 특이성을 결정하였다. 융합된 결합 도메인이 없는 GF-Fus1(6x-히스티딘-태그)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 1에 나타내는 바와 같이, GF-Fus3은 헤파란황산염(도 1a) 및 콘드로이틴황산염(도 1b)으로 코팅한 플레이트에 결합된 반면, GF-Fus4는 결합되지 않았다.
실시예 3: 콜라겐 II에 대한 융합 단백질의 결합
ELISA 플레이트 상에 코팅된 콜라겐에 결합되는 단백질의 능력을 측정함으로써 II형 콜라겐에 대한 단백질의 특이성을 결정할 수 있다. 리액티-바인드(Reacti-Bind)(등록상표) 96 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 1x 공급 완충제와 함께 100㎕의 II형 콜라겐(워싱턴주 레드몬드에 소재한 콘드렉스 프로덕츠(Chondrex Products))으로 코팅한다. 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈-20(PBST)으로 세척하고 나서, 100㎕의 무 단백질 차단 완충제(피어스(Pierce), 써모 사이언티픽)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하고 나서, 두드려서 건조시킨다. 연속 희석물 중의 50㎕의 단백질을 웰에 첨가하고 나서, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 단백질 연속 희석을 100μM로부터 시작하고, PBS 및 1개의 블랭크(PBS) 중에서 10회 추가적인 3배 희석을 포함한다. 플레이트를 PBS 중에서 세척한 후에, PBST 중에서 1:250으로 50㎕의 항-인간 IGF-1(앱캠)을 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 1시간 회전 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하고 나서, 실온에서 1시간 동안 PBST 중의 100㎕의 1:1000 항-토끼-HRP(셀 시그널링 테크놀로지)로 세척한다. 플레이트를 PBST로 세척하고 나서, 실온에서 5 내지 10분 동안 100㎕ TMB 기질과 함께 인큐베이션시키고, 100㎕ 중단 용액을 첨가함으로써 반응을 중단시킨다. 450㎚에서 흡광도를 측정하고 나서, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(등록상표)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 이용하여 얻어진 데이터를 분석한다.
두 참여 II형 콜라겐 결합 융합 단백질, 즉, GF-Fus5(6x-히스티딘-태그) 및 GF-Fus6(6x-히스티딘-태그)의 결합을 상기 기재한 바와 같이 측정하였다. 도 2에 나타내는 바와 같이, GF-Fus5와 GF-Fus6은 둘 다 II형 콜라겐에 결합되며, GF-Fus6 결합이 더 강하였다.
실시예 4: 고밀도 배양에서 융합-단백질-자극 1차 소 연골세포에 의한 AKT 인산화의 자극
IGF-1 및 연골 기질 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 상기 기재한 바와 같이 제조하였다. 6종의 융합 단백질을 제조하였다: GF-Fus1(6x-히스티딘-태그), GF-Fus2(6x-히스티딘-태그), GF-Fus3(6x-히스티딘-태그), GF-Fus4(6x-히스티딘-태그), GF-Fus5 (6x-히스티딘-태그) 및 GF-Fus6 (6x-히스티딘-태그). 융합 단백질의 성장 인자 부분이 융합 단백질 내에서 활성이라는 것을 보장하기 위해, 각각의 작제물을 AKT 인산화를 자극하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 야생형 IGF-1(wtIGF)를 대조군으로서 포함시켰다. 소 연골세포를 각각의 융합 단백질의 용량 범위에 의해 자극시키고 나서, pAKT 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
연골세포 단리 및 리간드 자극
소 연골세포를 2 내지 4주령 송아지의 대퇴골 관절구로부터 단리시킨다. 대퇴골을 둘러싸는 모든 조직을 제거하고, 뼈톱 또는 활톱을 이용하여 대퇴골두를 제거하며, 조직 바이스 내에 클램핑함으로써 무릎 관절에 고정시킨다. 관절을 무균 개방시키고 나서, 슬개골, 경골 및 비골을 제거한다. 외과용 메스를 이용하여, 연골을 슬라이싱하고 나서, 대퇴부 관절구를 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122)을 함유하는 멸균 PBS(pH=7.4) 중에 넣는다. 후속적으로 PBS를 제거하고 나서, 고글루코스 DMEM(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 카탈로그 번호 11965-092), 소 태아 혈청(10% v/v, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호16140071), HEPES(100mM, 깁코 15630-080), 비필수 아미노산(1X, 시그마 M7145), 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122), 프롤린(400μM, 시그마P5607-256), XIV형 프로테아제(2㎎/㎖, 시그마 카탈로그 번호 P5147)로 이루어진 프로나제 용액(50㎖/5g의 조직)을 1시간 동안 교반시키면서 첨가한다. 멸균 PBS(pH=7.4)로 2회 린스한 후에, 고글루코스 DMEM (라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호 11965-092), 소 태아 혈청(10% v/v, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호16140071), HEPES(100mM, 깁코 15630-080), NEAA(1X, 시그마 M7145), 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122), 0.25㎎/㎖ 콜라게나제 P(로슈 카탈로그 번호 11 249 002 001)로 이루어진 콜라게나제 용액(50㎖/5g의 조직)을 교반시키면서 18시간 동안 첨가한다. 세포를 걸러내고, 세척하고 나서, 연골세포 배양 배지(저 글루코스 DMEM(1X 깁코 11885-084), 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122), 비필수 아미노산(1X, 시그마 M7145), 및 HEPES(100mM, 깁코 15630-080)) 중에서 소 태아 혈청(10% v/v, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호16140071)과 함께 재현탁시킨다.
리간드 자극을 위해, 소 태아 혈청(10% v/v, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호 16140071)과 함께 100㎕의 연골세포 배양 배지를 지니는 96-웰 조직 배양 플레이트 내로 연골세포를 200,000개 세포/웰에서 파종시켰다. 대안적으로, BXPC-3 세포, 즉, 100㎕의 BXPC-3 배지(RPMI-1640, 예를 들어, ATCC(등록상표) 30-2001(상표명))와 함께, L-글루타민(2mM), 페니실린-스트렙토마이신(1X, Gibco(등록상표) 15140-122), 소 태아 혈청(10% v/v, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호16140071))과 함께 96-웰 조직 배양 플레이트 내로 췌장 선암종 세포주(ATCC(등록상표) CRL-1687(상표명))를 30,000개 세포/웰로 파종시켰다. 24시간 후에, 연골세포와 BXPC-3 세포를 웰 당 100㎕의 멸균 PBS(pH=7.4)로 린스하고 나서, 100㎕의 연골세포 또는 BXPC-3 배양 배지(소 태아 혈청이 없음)를 대응되는 세포 유형에 첨가하엿다. 추가 24시간 후에, 세포를 표 4에 열거한 농도보다 5배 더 큰 농도로 25㎕의 융합 단백질을 웰 내의 100㎕의 배지에 충분히 첨가함으로써 표 4에 제시한 융합 단백질의 용량으로 자극하였다. 10분의 자극 후에, 융합 단백질을 제거하고 나서, 웰을 빙냉 PBS(pH=7.4)로 린스하였다. 50㎕/웰의 세포 추출 완충제(인비트로젠 카탈로그 번호 FNN0011)를 첨가하고 나서, 4℃에서 30분 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 이어서, 용해물을 -80℃에서 냉동시켰다.
wtIGF , GF - Fus1 , GF - Fus2 , GF - Fus3 , GF - Fus4 , GF - Fus5 및 GF - Fus6을 이용하는 연골세포 자극을 위한 리간드 용량
최종 1X 농도(M)
용량 2.67E-07 6.67E-08 1.67E-08 4.17E-09 1.04E-09 2.6E-10 6.51E-11 1.63E-11 4.07E-12 0
ELISA에 의한 pAKT의 정량화
코닝(Corning) 고결합 384 웰 블랙 ELISA 플레이트(카탈로그 번호 3577)를 PBS(pH=7.4) 중에서 30㎕의 포획 항체를 이용하여 4㎍/㎖에서(항-AKT1 총 포획 항체, 업스테이트, 카탈로그 번호 05-591MG) 16시간 동안 실온에서 코팅시키고, 1시간 동안 실온에서 PBS(pH=7.4) 중의 2% 소 혈청 알부민(시그마 카탈로그 번호 A3294) 50㎕/웰을 이용하여 차단시켰다. 20㎕의 해동 용해물 또는 재조합 pAKT 표준(50% v/v 세포 추출물 완충제(인비트로젠 카탈로그 번호FNN0011), 1% 소 혈청 알부민(시그마 카탈로그 번호 A3294), 0.05% 트윈20)을 함유하는 PBS(pH=7.4) 중에서 활성인 400ng 재조합 인간 AKT의 10회 2배 단계 희석물(업스테이트, 카탈로그 번호 14 내지 276)을 코팅 플레이트에 적용하고 나서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 100㎕/웰의 0.05%트윈-20/PBS(pH=7.4)로 3회 세척한 후에 결합 포스포-AKT를 425㎚에서 광 방출을 검출하기 위해 발광광도계(luminometer)를 이용하여 포스포-AKT(Ser473)(587F11)-바이오티닐화된(셀 시그널링(Cell Signaling), 카탈로그 번호5102), 스트렙타비딘-HRP(알앤디 시스템즈(R&D Systems) 카탈로그 번호 DY998, 파트 # 890803), 슈퍼시그널(SuperSignal) ELISA 피코케미루미네센스(PicoChemiluminescent) 기질(써모 사이언티픽 카탈로그 번호 37069)을 검출한다.
결과
도 3a에 나타낸 바와 같이, GF-Fus1, GF-Fus2 및 GF-Fus3은 야생형 IGF와 유사한 정도로 AKT의 인산화를 자극하였다. 얻어진 EC50 값(표 5A에 나타냄)은 융합 단백질이 이 분석에서 야생형 IGF와 기능적으로 동일하다는 것을 입증한다. 도 3b에서, GF-Fus1, GF-Fus3, GF-Fus4, GF-Fus5 및 GF-Fus6은 야생형 IGF와 유사한 정도로 AKT의 인산화를 자극하였다. 얻어진 EC50 값(표 5B에 나타냄)은 융합 단백질이 이 분석에서 야생형 IGF와 기능적으로 동일하다는 것을 입증한다.
Figure pct00011
실시예 5: 외식편 소 연골을 이용하여 세척한 시관내 관절 질환 모델에서 GF - Fus3 및 GF - Fus 2의 지속된 활성
PRELP로부터의 헤파린 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질의 기질 결합 암(arm)과 성장인자 암 둘 다의 활성을 이하에 기재하는 바와 같은 외식편 소 연골을 이용하는 시험관내 관절 질환 모델 세척 실험에서 평가하였다.
방법
소 연골 외식편(3㎜ 직경, 1.2㎜ 두께)을 2 내지 4주령 송아지의 대퇴부 슬개골 고랑으로부터 채취한다. 대퇴골을 둘러싸는 모든 조직을 제거하고, 뼈톱 또는 활톱을 이용하여 대퇴골두를 제거하며, 조직 바이스 내에 클램핑함으로써 무릎 관절에 고정시킨다. 관절을 무균성으로 개방하여 슬개골, 하퇴골을 제거한다. 3㎜ 직경 일회용 생검 펀치를 이용하여, 대략 80x3㎜ 직경의 전두께(full thickness) 연골 코어를 대퇴골-슬개골 고랑으로부터 펀칭시킨다. 멸균 나이프를 이용하여 연골-뼈 계면에서 코어를 슬라이싱한다. 이어서, 중심을 1.2 ㎜ 두께 멸균 스테인레스강 플레이트에서 3㎜ 직경 홀 내에 삽입하고 나서, 멸균 면도날을 이용하여 플레이트와 같은 높이로 슬라이싱하여 초과된 코어 길이를 제거하고, 표면 구역의 무결함 연골을 지니는 3㎜ 직경, 1.2㎜ 두께 연골 외식편을 생성하였다.
외식편을 저 글루코스 DMEM(1X 깁코 11885-084), 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122), 아스코브산(20㎍/㎖, 시그마 A4403), 프롤린(400μM, 시그마 P5607-256), 비필수 아미노산(1X, 시그마 M7145), 및 HEPES(100mM, 깁코 15630-080)으로 이루어진 300㎕ 배지 내 96-웰 플레이트 중에서 배양시킨다. 조건당 8 내지 9개의 총 외식편 수에 대해 각각의 처리 조건에서 3마리 동물로부터의 외식편(n = 2 내지 3마리/동물)을 이용한다. 배지를 2일마다 교체한다. 제6일 및 제10일에, 배지를 5μCi/㎖의 35S-황산나트륨(퍼킨 엘머(Perkin Elmer) NEX041H001MC, 1mCi)로 보충한다.
제8일 및 제12일에 시점을 취하고: 외식편 조직을 PBS 중의 1mM 비표지 황산나트륨 중에서 각각 30분 동안(총 2시간) 4회 세척한다. 각각의 외식편을 칭량하고 나서, 습윤화하고, 분해시까지 -20℃에서 냉동시킨다. 조직 분해를 프로테이나제 K(로슈 카탈로그 번호 3115879001)에 의해 수행하고, 각각의 외식편을 60℃에서 밤새 50mM 트리스-HCL, 1mM 염화칼슘 pH=8.0 완충제 중의 1㎖ 100㎍/㎖ 프로테이나제 중에서 분해시킨다. sGAG 함량 및 DNA 함량의 측정을 문헌[Hoemann, 2004, Methods in Molecular Medicine: Cartilage and Osteoarthritis. Totowa, NJ: Humana Press Inc.; p.127-52]에 기재된 것과 같은 표준 분석 방법을 이용하여 수행한다. 20㎕의 분해물을 250㎕의 신틸레이션 유체(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 1200-439)와 혼합하고, 왈랙 1450 마이크로베타트라이룩스(WALLAC 1450 MICROBETA TRILUX) 신틸레이션 계수기를 이용하여 계수화함으로써 분해된 연골 외식편의 35S-황산염 함량을 정량화하였다.
본 명세서의 표 6에서 실험 설계를 요약한다. 다음의 농도로 주어진 처리를 제공한다: wtIGF-1 13.3nM = 100ng/㎖(IGF-1 R&D 시스템즈 291-G1); GF-Fus1(6x-히스티딘 태그) 13.3nM = 135ng/㎖; GF-Fus2(6x-히스티딘 태그) 13.3nM = 140ng/㎖; 및 GF-Fus3(6x-히스티딘 태그)13.3nM = 181ng/㎖. 모든 처리는 IL-1을 포함하였고, 4일 또는 전체 배양 지속기간 동안 제공하였다. 측정한 결과는 종말점에서 35S-황산염 혼입, DNA 함량 및 sGAG 함량의 플러그였고, 모든 배지에 대해 배지에 방출된 sGAG는 변한다. 대조군은 처리 없음(건강함) 또는 IL-1 단독으로 1ng/㎖(질환)였다.
실험 설계
대조군 시점(일) IL- 1α wtIGF GF - Fus2 GF - Fus1 GF - Fus3 외식편 수(n)
건강함 8 - - - - - 9
질환 8 + - - - - 9
- 8 + + 4일 - - - 9
- 8 + + 8일 - - - 9
- 8 + - + 4일 - - 9
- 8 + - + 8일 - - 9
- 8 + - - + 4일 - 9
- 8 + - - + 8일 - 9
- 8 + - - - + 4일 9
- 8 + - - - + 8일 9
건강함 12 - - - - - 9
질환 12 + - - - - 9
- 12 + + 4일 - - - 8
- 12 + + 12일 - - - 9
- 12 + - + 4일 - - 9
- 12 + - + 12일 - - 9
- 12 + - - + 4일 - 9
- 12 + - - + 12일 - 9
- 12 + - - - + 4일 9
- 12 + - - - + 12일 9
도 4는 시간(일)에 대해 배양 배지에 대한 총 sGAG 손실의 누적 백분율에 의해 측정한 바와 같은 연골 기질 손실의 그래프를 도시한다. 손실 백분율을 계산한다. 배양 배지 내 누적 sGAG를 배양 기간에 따라 배지 내에 존재하는 총 sGAG + 배양의 마지막에 외식편 내에 남아있는 sGAG에 의해 나눔으로써 손실 백분율을 계산한다. 야생형 IGF와 유사한 수준에서 질환 대조군에 비하여, 연골 기질 손실은 각각의 IGF 융합 단백질에 의해 감소되었다. 제8일 및 제12일에 종결되는 최종 48시간의 배양 동안의 새로운 연골 기질 합성(즉, 황산화 프로테오글라이칸 합성을 35S-황산염 혼입에 의해 측정함)을 각각 도 5a 및 도 5b에 나타낸다. 연골 기질 합성은 모든 융합 단백질(GF-Fus1, GF-Fus2 및 GF-Fus3) 및 야생형 IGF에 의해, 8일 및 12일(검정색 막대)의 전체 배양 지속기간 동안 모든 배지 교체 시 융합 단백질이 공급될 때, 질환 대조군에 비해 증가되었다. 그러나, 융합 단백질 제거 후에 연골 기질 합성 4 또는 8일의 자극은 LR3-IGF에 대한 PRELP 헤파린 결합 도메인 융합에 대해 가장 높았다(GF-Fus3, 도 5a 및 도 5b).
실시예 6: 외식편 소 연골을 이용하는 시험관내 관절 질환 모델 세척 실험에서 콜라겐 결합 성장 인자의 활성:
II형 콜라겐(GF-Fus5, GF-Fus6)에 결합되는 융합 단백질을 제조하였다(둘 다 6x-히스티딘 태그였다). 실시예 5에 상기 기재한 방법 및 결과 측정을 이용하여 융합 단백질을 특성규명하였고, 본 명세서의 표 7에 요약한 처리에 의해 변형시켰다. 모든 조건의 사용한 외식편을 단일 동물로부터 채취하였다.
실험 설계
대조군 시점(일) IL1a GF - Fus1 GF - Fus3 GF - Fus5 GF - Fus6 외식편 수(n)
건강함 8 - - - - - 6
질환 8 + - - - - 6
- 8 + + 4일 - - - 6
- 8 + + 8일 - - - 6
- 8 + - + 4일 - - 6
- 8 + - + 8일 - - 6
- 8 + - - + 4일 - 6
- 8 + - - + 8일 - 6
- 8 + - - - + 4일 6
- 8 + - - - + 8일 6
건강함 12 - - - - - 6
질환 12 + - - - - 6
- 12 + + 4일 - - - 6
- 12 + + 12일 - - - 6
- 12 + - + 4일 - - 6
- 12 + - + 12일 - - 6
- 12 + - - + 4일 - 6
- 12 + - - + 12일 - 6
- 12 + - - - + 4일 6
- 12 + - - - + 12일 6
도 6은 질환 대조군에 비해 각각의 시험한 IGF 융합 단백질(GF-Fus 1, 3, 5 및 6)에 의해 소 외식편으로부터의 연골 기질 손실이 감소되는 시간(일)에 따른 연골 기질 손실(sGAG 손실%)을 나타낸다. 도 7은 처리가 없는 대조군에 비하여, 소 외식편으로부터의 연골 기질 손실이 각각의 시험한 IGF 융합 단백질에 의한 처리의 12일까지 감소되는 시간(일)에 대한 sGAG 손실을 나타낸다. 더 나아가, GF-Fus3에 대해, 4 일 및 12일의 처리는 동등한 양만큼 sGAG를 감소시켰다. 그러나, GF-Fus1(Prelp 헤파린 결합 도메인이 없는 융합 단백질)에 대해 4일의 처리는 12일의 처리보다 더 높은 sGAG 손실을 초래하였다. 도 8a 및 도 8b는 소 연골 외식편에서 각각 제8일 및 제12일에 연골 기질 합성(35S-황산염 혼입)을 나타낸다. 연골 기질 합성은, 질병 대조군에 비하여, 시험한 각각의 IGF 융합 단백질에 의해 처리의 8(도 8a) 및 12(도 8b)일 둘 다에(검정색 막대) 의해 증가된다. GF-Fus3에 대해, 4일 및 12일의 처리는 동등한 양만큼 프로테오글라이칸 생합성을 증가시켰는데, 이는 GF-Fus3이 없는 배지 내 8일 동안의 배양에 대해 연골 기질 합성의 지속적 자극을 입증한다(도 8b).
실시예 7: 외식된 소 외식편을 이용하는 시험관내 관절 질환 모델에서 덱사메타손(항-Infl-1)과 GF-Fus 3의 조합물의 활성
실시예 5에 기재한 바와 같은 방법을 이용하여 덱사메타손과 GF-Fus3(6x-히스티딘 태그)의 조합물을 특성규명하였다. 본 명세서의 표 8에 실험 설계를 요약한다. 모든 조건의 사용한 외식편을 단일 동물로부터 채취하였다.
실험 설계
대조군 시점 IL1a 덱사메타손 GF - Fus3 외식편 수(n)
건강함 8 - - - 6
질환 8 + - - 6
- 8 + + 4일 - 6
- 8 + + 8일 - 6
- 8 + - + 6
- 8 + + 8일 + 6
건강함 12 - - - 6
질환 12 + - - 6
- 12 + + 4일 - 6
- 12 + + 12일 - 6
- 12 + - + 6
- 12 + + 12일 + 6
도 9a는 시간(일)에 따른 연골 기질 손실(sGAG 손실%)을 나타낸다. GF-Fus3의 덱사메타손과의 조합물은 소 외식편 중의 IL-1 유도 기질 손실을 저해하는데 단독으로 투여한 GF-Fus3 또는 덱사메타손보다 더 효과적이었다. 도 9b는 8일 및 12일에 종결된 배양에 대해 최종 48시간 동안의 연골 기질 합성(35S-황산염 혼입)을 나타낸다. GF-Fus3의 덱사메타손과의 조합물은 단독으로 투여한 GF-Fus3 또는 덱사메타손보다 소 외식편에서 연골 기질 합성을 자극하는데 더 효과적이었다. 용어 항-Infl-X는 X=1가 덱사메타손이고, X=2가 덱사메타손-21-팔미에이트이며, X=3이 덱사메타손 포스페이트인 상이한 형태의 덱사메타손을 지칭한다.
실시예 8: 하이알루론산이 있는 메틸셀룰로스 하이드로겔 또는 하이알루론산이 없는 메틸셀룰로스 하이드로겔로부터의 GF - Fus2의 지속 방출
하이드로겔 제형으로부터의 GF-Fus2and wt-IGF의 시험관내 지속 방출을 평가하였다. 메틸셀룰로스 하이드로겔, 겔 3(HBS 중의 6.1%(w/w) 메틸셀룰로스 A15(시그마 M7140)) 및 하이알루로난 메틸셀룰로스 하이드로겔, 겔 4(1.8%(w/w) 하이알루론산나트륨(HBS 완충제 중의 리페코어(리페코어) HA1M) 및 6.1% 메틸셀룰로스)을 사용하였다. 구체적으로, 유세포분석기 관 내에 총 용적 50㎕로 겔을 주조하였고, 각각의 겔은 1㎍ 단백질을 함유하였다. 겔을 인공 활액(SF)(lgDMEM+페니실린-스트렙토마이신+2.5% 소 혈청 알부민, 써모사이(ThermoSci) 카탈로그 번호 37525) 중에서 14일 동안 교반시키면서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 30분 후에 그리고 그 후에 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제7일, 제9일, 제11일, 제14일에 인공 활액을 분석하였다(조건 당 6회 반복). 항-IGF ELISA(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 이용하여 단백질 방출을 결정하였다. 결과를 도 10a 내지 도 10h에 제시한다. GF-Fus2 및 야생형 IGF를 제0일 내지 제3일에 유사한 속도로 겔 3과 겔 4 둘 다로부터 방출시켰으며, 4일 후에 추가 방출이 없었는데, 이는 처음 3일에 걸쳐 겔 3 및 겔 4로부터 이들 단백질의 지속 전달을 입증한다.
실시예 9: 포매된 지질 나노입자에 의한 하이드로겔로부터의 덱사메타손-21-팔미테이트 (항- Infl - 2)의 방출
지질 나노입자를 함유하는 덱사메타손-21-팔미테이트와 함께 포매된 하이드로겔을 생성하고, 이들 나노입자로부터의 덱사메타손-21-팔미테이트의 방출을 측정하였다.
메틸셀룰로스 하이드로겔, 겔 1(HBS 완충제(5mM HEPES, 144mM NaCl, pH 6.5) 중의 9%(w/w) 메틸셀룰로스 A15(시그마 M7140)), 및 하이알루로난 메틸셀룰로스 하이드로겔, 겔 2(2%(w/w) 하이알루론산나트륨(HBS 완충제 중의 리페코어(Lifecore) HA1M) 및 7% 메틸셀룰로스)를 사용하였다. 표 9에 제시한 지질 조성물을 지니는 덱사메타손-21-팔미테이트 지질 나노입자를 생성하였다.
덱사메타손-21- 팔미테이트 지질 나노입자 조성물(㎎/㎖, HBS 중의 입자 현탁액)
지질 나노입자 유형
성분 공급원 몰 중량 1 2 3 4 5
덱사메타손-21-팔미테이트 TRC D298830 630.9 1 1 1 1 0
HSPC 리포이드 783.7 12.44 12.44 12.44 12.44 12.44
콜레스테롤 알파 에이사(AlfaAesar)* 386.7 0 3.07 0 3.07 3.07
PEG(2000)-DSPE 리포이드 2788 0 4.43 4.43 0 4.43
HPLC에 의한 실제 덱사메타손-21-팔미테이트 농도: 1.028 1.035 1.013 0.972 0
*에탄올로부터 재결정화됨
구체적으로, 120㎜ Hg에서 밤새 건조시키면서 65℃에서 클로로폼 용액으로부터 회전증발에 의해 지질막이 형성되었다. 65℃에서 손으로 휘젓고 30초 동안 최대 속도로 와동시키면서 멸균 HBS 완충제(5mM HEPES, 144mM NaCl, pH 6.5) 중에서 막을 수화시켰다. 97.2㎍/g 겔을 함유하는 10512-4를 지니는 MC 겔을 제외하고, 얻어진 다층 소포(MLV)를 겔의 100㎍/g의 덱사메타손-21-팔미테이트 농도를 달성하기 위해 빙냉시킨 1.1x 겔 저장액과 혼합시킴으로써 덱사메타손-21-팔미테이트 겔이 형성되었다.
에탄올-처리한 폴리에틸렌 뚜껑을 지니는 사전 칭량한 오토클레이빙한 2-㎖ 폴리프로필렌 원통형 외피 바이알(내셔널 사이언티픽(National Scientific) C4011-77P) 내로 겔을 분산시키고 나서, 바닥면 상에 "노브(knob)"를 형성시키고, 이어서, 37℃에서 24시간 초과 동안 경화시켰다. 5 x ~300㎎겔을 총 50종의 겔에 대해 겔마다 지질 나노입자 유형마다 분산시켰다. 다음의 성분으로 이루어진 700㎕의 인공 활액을 각각 50개의 바이알에 첨가하였다: 1X 페니실린-스트렙토마이신, 깁코, 카탈로그 번호 15140-122; 2.5% BSA(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 37525); 및 lg-DMEM(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 11885) 및 겔을 37℃에서 부드럽게 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 인공 활액상청액을 제거하고 나서, -80℃에서 냉동시키고, 700㎕의 새로운 인공 활액을 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제7일, 제9일에 첨가하였다.
리파제를 이용하여 해동, 초음파처리 및 분해에 의해 상청액을 분석하였다. 간단하게, 320nM 내지 5nM의 범위에 있고, 0점을 포함하는 덱사메타손 및 덱사메타손-21-팔미테이트 표준 곡선을 상청액과 병행하여 처리할 인공 활액에서 만들었다. 각각의 겔로부터 100㎕의 이들 표준 및 상청액을 0.5% 트리톤-X-100로 처리하였다. 처리한 샘플 및 표준을 50℃ 오븐에서 30분 동안 두었고, 이어서, 실온에서 5분 동안 초음파분쇄기 내에 두었다. 샘플 및 표준을 리파제, 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum)(이엠디 케미칼(EMD Chemical) 카탈로그 번호 437707) 4㎍/㎖로 처리하였다. 플레이트를 밀봉시키고 나서, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음과 같은 네오겐(Neogen)제의 덱사메타손 ELISA 키트(카탈로그 번호 101519)를 이용하여 분해를 분석하였다: 효소 컨주게이트, 세척 완충제 및 K-블루(Blue) 기질을 설명서에 따라 사용하였다. 덱사메타손의 새로운 표준 곡선을 상기와 동일한 범위로 인광 활액에서 만들었고, 대조군으로서 비처리로 남겨두었다. 처리 및 비처리 표준의 총 용적이 동일하게 되도록 표준에 추가 인공 활액을 첨가하였다. 샘플 및 표준을 EIA 완충제(네오겐 카탈로그 번호 301277) 중에서 1:20으로 희석시켰고, 또는 제1 샘플을 인공 활액 중에서 1:100으로 희석시켰으며, 이어서, 샘플 및 표준을 EIA 완충제 중에서 1:20으로 희석시켰다. 샘플 및 표준을 효소 컨주게이트를 지니는 ELISA 플레이트에 실온에서 45분 동안 두었다. 웰 당 300㎕ 세척 완충제를 이용하여 플레이트를 3회 세척하고 나서, 각각을 세척한 후에 뒤집고 두드려서 건조시켰다. 100㎕ K-블루 기질을 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 100㎕ TMB 중단 용액(커크가드 앤드 페리 래버러토리즈 인코포레이티드(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc), 카탈로그 번호 50-85-06)을 각각의 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 퍼킨 엘머 엔비전(퍼킨 엘머 Envision) 플레이트 판독기 상에서 450㎚에서 판독하였다. 1:100 및 1:20으로 희석시킨 샘플 둘 다로부터의 데이터 및 1:20 단독에 대한 데이터를 표준 곡선에 회귀시켰다. 판독이 1ng/㎖ 미만이 아니라면 1:100 희석으로부터의 데이터를 사용하였다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 나노입자 유형을 나타내기 위해 명명법 GelX-Y(여기서, X는 겔 1 및 2에 대해 각각 1 또는 2이고, Y는 1 내지 5임)를 이용하는 본 명세서에 개시된 지질 나노입자 유형 1, 2, 3, 4 또는 5를 포함하는 하이드로겔 제형 겔 1 또는 겔 2로부터 시간(일)에 대한 항-Infl-2(덱사메타손-21-팔미테이트)의 누적 방출 그래프를 도시한다. 이들 하이드로겔로부터 항-Infl-2의 방출 속도를 본 명세서의 표 10에 제시한다.
가장 느린 방출 제형(겔1-1 및 겔1-3)에 대한 항-Infl-2의 제9일의 누적 방출은 가장 빠른 방출 제형에 대해 대략 4배였다(겔2 내지 3). 따라서, 겔 및 나노입자 유형의 조성물을 변화시킴으로써, 항-Infl-2의 방출 속도를 조절할 수 있다.
하이드로겔로부터의 덱사메타손-21-팔미테이트의 방출속도
　 방출 속도(ng/일)
나노입자 유형 겔 1 겔 2
1 582 797
2 356 659
3 834 1349
4 370 763
실시예 10: 125 I -표지 GF - Fus3 , GF - Fus1 및 야생형 IGF의 소 관절 연골 내로의 흡수 방법이 결정될 것이다
소 및 인간 관절 연골 내 GF-Fus3, GF-Fus1 및 야생형 IGF에 대한 분배계수, 결합 친화도 및 결합 부위의 수를 문헌[Garcia et al., Arch Biochem and Biophys 415 (2003) 69-79; Bhakta et al., J Biol Chem 275:8 (2000) 5860-5866; Byun et al., Arch of Biochem and Biophys 499 (2010) 32-39]에서 앞서 기재한 방법을 이용하여 평가한다.
간단하게, 3㎜ 직경, 400 내지 2000㎜ 두께의 소 또는 인간 연골 원판을 진피 펀치를 이용하여 연골 슬라이스로부터 가운데를 파낸다. 이들 원판을 후속적으로 관절 상의 상이한 채취 부위의 가운데로부터 그룹 내로 균일하게 분포시키고, 새로운 PBS(pH=7.4, 프로테아제 저해제를 함유, 로슈 카탈로그 번호04 693 124 001) 중에 넣는다. 사용 직전에, 125I-IGF-I(또는 125I-표지 GF-Fus3 또는 GF-Fus1)를 정제하여 분해된 단편을 제거하도록 또는 다음과 같이 방사능을 없애도록 정제한다. 125I-단백질을 0.6 x 30-㎝ 세파덱스(Sephadex) G50 칼럼 상에 장입시키고 나서, 0.01 M 아세트산 1 0.1% BSA와 함께 PBS(pH=7.4)로 이루어진 완충제로 용리시켜 임의의 소분자량 방사성 표지의 제거를 보장하였다. 진정한 표지된 IGF-I 또는 융합 단백질에 대응하는 보이드 용적 분획을 모은다.
이어서, 일정한 양의 125I-표지 단백질(평균 33pM, 구체적 활성 2000 Ci/m㏖) 및 단계적인 양의 대응하는 비표지 단백질(0 내지 200nM)을 원판의 각각의 그룹에 첨가한다. 37℃에서 48시간의 인큐베이션 기간 후에, 샘플을 간단히 린스하고 나서, 남아있는 완충제와 함께 감마 계수기 내에서 개별적으로 계수화한다. 각각의 원판의 습식 중량 및 건식 중량을 측정하여 수분 함량을 결정한다. 실시예 5에 기재한 바와 같은 글라이코사미노글라이칸 함량을 평가하기 위한 건조시킨 샘플은 분해된 프로테이나제-K이다.
실시예 11: 말 골관절염 모델
본 명세서에 개시된 융합 단백질의 질환 변형 활성을 골관절염의 말 모델에서 특성규명할 것이다. 적합한 모델 시스템은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[McIlwraith et al. Bone Joint Res 2012;1:297-309]에 제시되는 모델을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 대상체는 관절 내 지속 체류 또는 즉시 방출을 위해 제형화된 글루코코티코이드 주사와 함께 또는 주사 없이 IGF-융합 단백질의 관절강내 주사에 의해 처리할 것이다. 주사 용적은 0.1 내지 15㎖일 것이며, 주사 용적 내 덱사메타손 팔미테이트의 농도는 약 10nM 내지 10mM이다. IGF-융합 단백질의 농도는 1nM 내지 1mM일 것이다. 1 내지 10회 주사를 제공할 것이다. 다회 주사가 제공된다면, 주사 간의 시간은 3일 내지 6개월일 것이다.
임상 결과를 결정하기 위해, 다음을 포함하는 앞다리 둘 다의 임상 시험을 2주마다 수행할 것이다: 파행(lameness)을 0 내지 5의 척도로 등급화함(0은 파행 없음이며 5는 체중 지지가 없는 파행임); 및 관절 삼출을 0 내지 4의 척도로 등급화함(0은 삼출 없음 및 4는 가장 중증 수준임).
영상화는 하기를 포함할 수 있다: 방사성 용해, 관절 내 뼈 증식, 및 골증식증을 포함할 수 있는 특징을 관찰하기 위한 방사선사진; 요완골의 섬유주 영역 내 경화성 골전이 용적을 포함할 수 있는 변화를 관찰하기 위한 CT 영상화; 및 활액 용적, 활막 증식, 고등 관절 캡슐 비후화, 관절 캡슐 부종, 요완골 부종 및 요골 수근 경화증을 포함할 수 있는 변화를 관찰하기 위한 MR 영상화.
다음의 결과를 평가하기 위해 3개월마다 내지 1개월마다의 범위의 빈도로 활액을 수집할 것이다: 활액단백질, PGE2, CS846, CPII, sGAG, ColCEQ, C1,2C, 오스테오칼신 및 Col-1의 수준. CS846, CPII, sGAG, 오스테오칼신, C1,2C 및 Col-1의 혈청 수준을 또한 평가할 것이다.
실시예 12: 외식편 인간 연골을 이용하는 시험관내 관절 질환 모델 세척 실험에서 지속된 GF-Fus3의 활성 및 덱사메타손(항-Infl-1)의 항-이화작용 활성
연골 결합 암과 GF-Fus3(6x-히스티딘 태그)의 성장 인자 암 둘 다의 활성을 이하에 기재하는 바와 같은 외식편 인간 연골을 이용하는 시험관내 관절 지로한 모델 세척 실험에서 평가하였다. 추가로, 덱사메타손의 항-이화작용 활성을 단독으로 그리고 조합하여 GF-Fus3과 GF-Fus1(6x-히스티딘 태그) 둘 다(이들은 연골 결합 암을 갖지 않음)와 조합하여 결정하였다. 이 인간 연골 관절 질환 모델은 손상 후에 또는 만성 질환에서 생기는 염증 사이토카인에 의해 구동되는 관절 손상의 이화작용 단계를 모방한다. 치료는 또한 염증이 감소되거나 제거될 때의 연골 조직에 대한 염증 사이토카인의 효과를 평가하기 위해 염증 사이토카인 없이 시험하였다.
방법
인간 연골 외식편을 사후 24시간 내에 인간 시신제공자의 무릎 및 발목으로부터 채취한다. 병리학자에 의해 관절을 무균성으로 절개하여 변형된 콜린스 척도(Collins scale)에 의해 연골 형태를 평가하고(Kuettner, et al., Cartilage degeneration in different human joints. Osteoarthritis Cartilage. 2005;13(2):93-103), 등급 0 또는 1의 관절만을 사용한다. 전층 무릎 연골 표면을 외과용 메스를 이용하여 대퇴골-슬개골 고랑 및 관절구로부터 채취한다. 전층 발목 연골을 거골의 돔, 거골 돔 아래의 근위 면적, 거골의 두부, 경골 복사뼈 및 비골 복사뼈로부터 외과용 메스를 이용하여 채취한다. 4㎜ 직경 일회용 생검 펀치를 이용하여, 전층 연골 중심을 표면 구역의 무결함을 유지하는 연골 표면으로부터 펀칭하고, 배양 시 외식편으로서 사용한다.
외식편을 페니실린-스트렙토마이신(1X, 깁코 15140-122), 아스코브산(20㎍/㎖, 시그마 A4403), 프롤린(400μM, 시그마 P5607-256), 비필수 아미노산(1X, 시그마 M7145), 및 HEPES(100mM, 깁코 15630-080)를 첨가한 300㎕의 저글루코스 DMEM(1X 깁코 11885-084) 중에서 96-웰 플레이트에 배양시킨다. 2 내지 3명의 공여체로부터의 외식편(공여체 당 4 내지 6개 외식편)을 각각의 처리 질환에 대해 조건 당 12 내지 18개의 총 외식편 수에 대해 사용한다. 공여체 연령은: 67세 남성 발목, 71세 남성 발목, 76세 여성 발목, 59세 남성 무릎, 34세 남성 무릎 및 63세 여성 무릎이었다. 배지를 2일마다 바꾼다. 제14일에, 배지를 5μCi/㎖의 35S-황산나트륨(퍼킨 엘머 NEX041H005MC, 5mCi)으로 보충한다.
다음과 같이 제16일에 시점을 취한다. 외식편 조직을 PBS 중의 1mM 비표지 황산나트륨 중에서 각각 30분 동안 4회(총 2시간) 세척한다. 각각의 외식편을 습식 칭량하고 나서, 분해될 때까지 -20℃에서 냉동시킨다. 프로테이나제 K(로슈 카탈로그 번호 3115879001)를 이용하여 조직 분해를 수행하고 나서, 각각의 외식편을 50mM 트리스-HCL, 1mM 염화칼슘 pH=8.0 완충제 중의 1㎖ 500㎍/㎖ 프로테이나제 K로 60℃에서 밤새 분해시킨다. sGAG 함량 및 DNA 함량의 측정을 문헌[Hoemann, 2004, Methods in Molecular Medicine: Cartilage and Osteoarthritis. Totowa, NJ: Humana Press Inc.; p.127-52]에 기재된 것과 같은 표준 분석 방법을 이용하여 수행한다. 20㎕의 분해물을 250㎕의 신틸레이션 유체(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 1200-439)와 혼합하고, 왈랙 1450 마이크로베타트라이룩스 신틸레이션 계수기를 이용하여 계수화함으로써 분해된 연골 외식편의 35S-황산염 함량을 정량화한다.
결과
처리를 다음의 농도에서 제공하였다: GF-Fus1 13.3nM = 135ng/㎖; 및 GF-Fus3 13.3nM = 181ng/㎖; 덱사메타손 100nM = 39.2ng/㎖. 성장 인자 및 스테로이드 처리 조건은 사이토카인 TNF-알파(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 210-TA, 25ng/㎖), IL-6(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호206-IL, 50ng/㎖) 및 IL-6R 알파(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호227-SR, 250ng/㎖)를 포함하였는데, 이들을 각각의 배지를 교체할 때 공급하였다. GF-Fus1 및 GF-Fus3을 처음 8일(8D) 또는 전체 16일 배양 지속기간(16D) 동안 새로운 배지에 첨가한 반면, 덱사메타손을 모든 경우에 전체 16일 동안 첨가하였다. 대조군은 사이토카인 없음(건강함) 또는 사이토카인 단독(질환)이었다. 제16일에 연골 외식편으로부터 측정한 결과는 35S-황산염 혼입, DNA 및 sGAG 함량이었고, sGAG는 모든 배지를 바꾸는 동안 배지에 방출되었다.
도 12a 내지 도 12d는 덱사메타손(항-Infl-1)이 GF-Fus3의 첨가가 있는 질환 조건과 GF-Fus3의 첨가 없는 질환 조건 둘 다에 비해 인간 발목 및 무릎 연골의 기질 이화작용을 감소시키는 것을 나타내는데, 이는 인간 연골 퇴행의 고도 병진 모델에서 사이토카인 구동 질환 동안 연골을 손상으로부터 보호하는 가능성을 시사한다. 추가로, 기질 손실에서 이 감소의 항내성(robustness)은 발목 및 무릎 내 해부학적 부위의 범위로부터 채취한 연골 외식편에 대한 일정한 결과에 의해 입증된다(거골의 돔, 도 12a, 후측 거골, 도 12b, 거골의 두부 및 경골 및 비골 복사뼈, 도 12c, 및 대퇴골-슬개골 고랑, 도 12d). 도 13a 내지 도 13e는 GF-Fus3이 덱사메타손의 첨가가 있는 질환 조건과 덱사메타손의 첨가가 없는 질환 조건 둘 다에 비해 새로운 황산화 발목 및 무릎 연골 기질의 합성을 상향조절한다는 것을 나타내는데, 이는 기능적 하중 지지 기질 분자에 의한 연골 수선에 대한 가능성을 시사한다. 이 효과는 발목 및 무릎에서도 해부학적 부위의 범위로부터 채취한 연골에 걸쳐 강하다(거골의 돔, 도 13a, 후측 거골, 도 13b, 거골의 두부 및 경골 및 비골 복사뼈, 도 13c, 대퇴골-슬개골 고랑, 도 13d, 및 대퇴부 관절구, 도 13e). 도 14a 내지 도 14d는 GF-Fus3만이(GF-Fus1은 아님) 각각의 단백질이 없는 배지에서 8일 동안 인간 발목 및 무릎 연골 외식편의 가능한 연골 수선 활성을 지속한다는 것을 나타낸다(즉, GF-Fus 3 조건에 대한 흰색 및 검정색 막대는 동일하지만, GF-Fus 1에 대해서는 동일하지 않음). 이 효과는 거골의 돔(도 14a), 후측 거골(도 14b), 거골의 두부 및 경골 및 비골 복사뼈(도 14c) 및 대퇴골-슬개골 고랑(도 14d)에 걸쳐 강한데, 모든 경우에 질환 +항-Infl1+GF-Fus1 8D는 질환 조건과 유사하지만, 질환+항-Infl1+GF-Fus3 8D는 연속적으로 전달된 단백질에 대해 동일하거나 또는 우수한 효능을 나타내었다(즉, 질환+항-Infl1+GF-Fus1 16D 및 질환+항-Infl1+GF-Fus3 16D).
활성 질환 또는 최근의 급성 손상 없이, 관절강내 사이토카인 수준은 감소될 수 있다. 따라서, 인간 무릎 관절구 연골 외식편을 이용하는 무 사이토카인 상황에서 덱사메타손 단독 및 GF-Fus1 및 GF-Fus3과 조합된 활성을 평가하였다. 도 14e는 사이토카인이 없을 때 덱사메타손이 황산화 기질 생합성을 감소시키지만, 전체 16일 배양 동안 GF-Fus1 또는 GF-Fus3과 덱사메타손의 조합(검정색 막대)이 건강한 대조군 수준 이상에 대해 황산화 기질 생합성을 회복시킨다는 것을 나타낸다. 더 나아가, GF-Fus1(연골 결합 도메인 없음) 및 GF-Fus3(연골 결합 도메인 융합)이 최종 8일의 배양 동안 제거될 때(흰색 막대), GF-Fus3만이 연속 16일 처리와 동일한 수준으로 황산화 기질 생합성을 지속하였는데(GF-Fus1과 다름), 이는 인간 연골 외식편 내에서 그의 증가된 결합, 체류 및 활성에 기인할 가능성이 있다.
실시예 13: 래트 무릎 내로 관절강내 주사 후에 GF - Fus3 또는 wtIGF 중 하나와 혼합된 지질 입자 캡슐화된 덱사메타손, 지질 입자 캡슐화된 덱사메타손-21-팔미테이트, 및 속방출 덱사메타손 포스페이트의 지속 체류
3종의 덱사메타손 유도체의 래트 무릎 내로 관절강내 주사 후 체류(방법 참조)를 측정하였다. 덱사메타손 및 덱사메타손-21-팔미테이트를 지질 입자 중에 캡슐화하고 나서, 현재 시판되는 주사용 덱사메타손의 분자 구조인 비-캡슐화, 가용성 덱사메타손 포스페이트 제형과 비교하였다. 유전자 조작된, 연골-결합 IGF 융합 단백질(His 태그 없음)인 GF-Fus3을 덱사메타손-21-팔미테이트 입자 현탁액 및 덱사메타손 포스페이트 용액과 혼합하여 지질 입자의 존재가 래트 무릎 내 GF-Fus3의 체류를 변화시키는지 여부를 결정하였다. 야생형 IGF를 대조군으로서 덱사메타손 입자 현탁액과 혼합하여 GF-Fus3의 체류를 비교하였다(표 12).
방법
모든 물질의 공급원을 표 11에 열거한다. 표 12에서 그룹 1, 2 및 4에 대한 제형을 60℃에서 밤새 110㎛ Hg에서 건조시키면서 클로로폼 용액으로부터의 회전증발에 의해 제조하였다. 68℃에서 손으로 휘젓는 것에 더하여 45 내지 60초 동안 최대 속도로 와동시키면서 멸균 HBS-6.5 완충제(5mM HEPES, 144mM NaCl, pH 6.5) 중에서 막을 수화시켰다. 얻어진 지질 입자 현탁액을 표 12에 열거한 최종 농도의 2x에서 2x PBS 중의 적절한 단백질 용액과 1:1로 혼합하였다. 표 12의 10x 농도에서 증류수 중의 덱사메타손 포스페이트의 멸균 용액을 제조함으로써 그룹 3에 대한 제형을 제조하였다. 이를 HBS-6.5와 1:4로 혼합하고 나서, 후속적으로 2x PBS 중의 단백질의 적절한 2x 용액과 1:1로 혼합하였다.
물질
물질 공급원 카탈로그 번호
야생형 IGF-1 알앤디 시스템즈 291-G1
LR3-IGF-PRELP (GF-Fus3) 메리맥(Merrimack)(자체연구)
HSPC 리포이드
덱사메타손(항-Infl-1) 시그마 D9184
덱사메타손 21-팔미테이트(항-Infl-2) 토론토 리서치 케미칼스(ozronto Research Chemicals) D298830
덱사메타손 포스페이트(항-Infl-3) 시그마 D1159
PBS 라이프 테크놀로지즈 10010-031
클로로폼 HPLC-등급 알코올 안정화 EMD CX1058-1
주사 제형
그룹 약물/전구약물 단백질 HSPC
그룹 1 덱사메타손-21-팔미테이트(1.94mM) GF-Fus3(63.9μM) 4.78㎎/㎖
그룹 2 덱사메타손(1.94mM) 야생형 IGF(77.1μM) 4.78㎎/㎖
그룹 3 덱사메타손 포스페이트(1.94mM)) GF-Fus3(63.9μM) 없음
그룹 4 없음 없음 4.78㎎/㎖
루이스 래트(275 그램 초과)에 오른쪽 무릎 내로 관절강내 주사에 의해 표 12의 50㎕의 약물 제형을 투여하였다. 총 96마리의 래트에 대해 시점마다의 조건마다 6마리 래트에 주사하였다. 그룹 1 내지 3에 대해, 동물을 주사 직후 및 주사 후 1시간, 4시간, 24시간 및 96시간에 희생시켰다. 그룹 4에 대해, 동물을 주사 후 1시간에만 희생시켰다. 동물을 아이소플루오란으로 마취시키고 나서, 하행대동맥을 통해 정맥채혈기 내로 출혈시켜 혈청을 수집하였다. 오른쪽 무릎을 100㎕의 식염수로 세척하였다. 연골, 반월판, 십자형 인대, 및 슬개골을 주변 활막과 함께 수집하고 나서, 순간 냉동시키고, -80℃에 저장하였다. 연골, 반월판, 인대 및 슬개골을 주변 활막 샘플과 함께 액체 질소에서 냉각시킨 후에 코바리스 동결분취(Covaris CryoPrep) 기기를 이용하여 코바리스 조직 관(Covaris Tissue Tubes)(카탈로그 번호 520001) 내에서 분쇄하였다. 분쇄 샘플을 조직 추출 시약(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 FNN0071)(연골 50㎕, 인대 100㎕, 반월판 200㎕ 및 슬개골 400㎕) 중에서 현탁시키고 나서, 4℃에서 12 내지 18시간 동안 회전 진탕기 상에서 혼합하였다. 용해액을 4000g에서 원심분리시키고 나서, 정화된 상청액을 제거하였다.
각각의 조직 유형, 세척물 및 혈청 샘플에 대해 정화된 용해물의 알리쿼트를알칼리 포스파타제를 이용하여 실시예 9에 기재한 바와 같은 트리톤-X-100 및 리파제(시그마-알드리치 카탈로그 번호 P0114)로 처리하여 제조업자의 설명서에 따라 리파제와 동시에 첨가하였다. 처리한 용해물을 조직 추출 시약에서 1x, 10x, 100x, 1000x 및 10,000x로 희석시켰다. 처리한 세척물 및 혈청을 인공 활액 중에서 1x, 10x, 100x, 1000x 및 10,000x로 희석시켰다. 모든 희석물을 실시예 9에 기재한 바와 같은 덱사메타손(네오겐 카탈로그 번호 101519)에 의해 분석하였다.
정화한 용해물 샘플의 알리쿼트를 트윈 20(시그마-알드리치 카탈로그 번호 274348, 최종 농도 5% v/v 트윈 20, 모든 희석물에서 10% 조직 추출 시약)을 이용하여 PBS 내로 10x, 100x, 1000x, 10,000x 및 100,000x(즉시 시점의 세척물만)로 희석시켰다. 세척물 및 혈청 샘플 알리쿼트를 트윈 20(최종 농도 5% v/v 트윈 20, 모든 희석물 중에서 10% 인공 활액)을 이용하여 PBS 내로 10x, 100x, 1000x, 10,000x 및 100,000x(즉시 시점의 세척물만) 희석시켰다. 모든 희석물을 인간 IGF-1 ELISA(알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 DY291)에 의해 분석하였다. 키트 프로토콜은 다음의 예외에 따랐다: 384-웰 블랙 마이크로플레이트 및 슈퍼시그널(SuperSignal) ELISA 피코 화학발광 기질(써모 사이언티픽 카탈로그 번호 37069)을 사용하고, 플레이트를 450㎚에서 루미노미터 상에서 판독하였다.
결과
그룹 1 제형에 대한 덱사메타손 체류는 즉시 시점에 적어도 10배 더 낮았지만, 연골, 반월판, 인대 및 슬개골 + 활막 용해물(도 15a 내지 도 15d, 반월판 내 4시간 시점 제외, 도 15b)에 대한 모든 후속 시점에서 그룹 3보다 10배 더 컸다. 그룹 2는 이들 조직에서 1시간 및 이후 시점에 그룹 3보다 적어도 10배 더 높았다(반월판 내 4시간 시점을 제외, 도 15b). 그룹 1은 또한 즉시 시점에서 그룹 2보다 대략 10배 더 낮았지만, 이들 조직 내 모든 후속 시점에서 그룹 2보다 동일하거나 또는 더 높았다(도 15a 내지 도 15d).
그룹 1 제형은 즉시 시점에 혈청 내에서 검출가능하지 않았고, 1 내지 24시간에 그룹 2 또는 그룹 3보다 대략 10배 더 낮았다(도 15e). 활막 세척물에서, 그룹 1은 1시간 및 4시간에 그룹 2보다 10배 더 높았고, 활막 세척물에서 4시간에 그룹 3보다 1000배 더 높았다(도 15f).
이들 결과는 그룹 3에서의 즉시 방출 주사용 제형에 비해 그룹 1 및 2에서 지질 입자에 의해 전달될 때 연골, 반월판, 인대 및 슬개골 + 활막에서 덱사메타손의 증가된 체류를 나타낸다. 추가로, 즉시 시점에 연골, 반월판, 인대 및 슬개골 + 활막에서 그룹 1의 더 낮은 수준 및 그룹 2 및 3에 대해서보다 혈청 중에 그룹 1에 대해 검출가능하지 않거나 또는 더 낮은 수준에 의해 그룹 1에서 팔미테이트 기능화된 덱사메타손 전구약물(덱사메타손-21-팔미테이트)은 비기능화된 덱사메타손 그룹 2 입자(덱사메타손)와 그룹 3 즉시 방출 제형(덱사메타손 포스페이트, 항-Infl-3) 둘 다에 비해 즉시 시점에서 버스트 방출을 감소시켰다. 이 더 낮은 버스트는 1시간 및 4시간에 활막 세척물 중의 그룹 1 덱사메타손 수준의 지속 체류에 기여할 가능성이 있다.
IGF는 그룹 1 및 3에 대해서만 24 및 96시간에 연골 조직 내에서 검출된 반면, IGF는 6마리 동물 중 1마리에서 24시간에 그룹 2에 대해 검출되었다(도 15g). 연골 내에서 1시간 및 4시간에, 그룹 1 및 그룹 3은 각각 그룹 2보다 대략 4 및 100배 더 높았다. 반월판, 인대, 슬개골 + 활막 및 활막 세척물에서, IGF가 24시간에 그룹 1 및 그룹 3에 대해 검출되었지만, 그룹 2는 검출되지 않았다(도 15h 내지 도 15j 및 도 15l). 1시간 및 4시간에, 그룹 1 및 3에 대한 IGF 수준은 이들 조직에서 그룹 2에 대해 2 내지 100배 더 높았다. 혈청 IGF 수준은 즉시 시점에 그룹 1 및 그룹 3에 대해서보다 그룹 2에 대해 대략 10배였으며, 그룹 2 수준은 1시간 및 4시간에 검출가능하게 남아있는 반면, 그룹 1 및 그룹 3은 검출 한계 미만이었다(도 15k). 유사한 IGF 체류 수준을 모든 시점에 모든 조직에서 그룹 1 및 3에 대해 관찰하였다.
이들 결과는 야생형, 비결합 IGF를 함유하는 그룹 2에 비해 연골-결합 유전자 조작된 IGF 융합 단백질인 GF-Fus3을 함유하는 그룹 1 및 그룹 3에 대해 래트의 무릎 관절 내에서 IGF의 우선적인 체류를 나타낸다. IGF는 반월판, 인대 및 슬개골 + 활막에서보다 그룹 1 및 3에 대해 연골 내에서 더 길게 보유되는데, 이는 GF-Fus3에서 헤파린 결합 도메인을 우선적으로 보유하는 다른 조직에 비해 연골의 극적으로 더 높은 GAG 함량에 기인할 가능성이 있다. 그룹 1과 그룹 3간에 차이가 보이지 않았는데, 이는 지질 입자의 존재가 GF-Fus3의 체류에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 14: 외식편 소 연골을 이용하는 시험관내 관절 질환 모델 세척 실험에서 정제 태그가 있는 GF - Fus3과 정제 태그가 없는 GF - Fus3에 대해 동등한 연골 체류 및 동화작용 자극
6x-히스티딘 태그가 있는 GF-Fus3과 히스티딘 태그가 없는 GF-Fus3을 둘 다 제조하였다(각각 GF-Fus3-His 및 GF-Fus3). 소 연골 외식편을 준비하고 나서, 실시예 5에 상기 기재한 바와 같이 배양시키고, 융합 단백질 처리를 표 13에 기재한 바와 같은 배지 내에 포함시켰다. 모든 외식편은 동일한 동물로부터 유래된다.
실시예 14에 대한 실험 설계
치료 조건 시점(일) IL1α GF - Fus1 GF - Fus3 -His GF - Fus3 외식편 수 (n)
건강함 12 - - - - 6
질환 12 + - - - 6
GF-Fus1 4D 12 + + 4일 - - 6
GF-Fus1 12D 12 + + 12일 - - 6
GF-Fus3-His 4D 12 + - + 4일 - 6
GF-Fus3-His 12D 12 + - + 12일 - 6
GF-Fus3 4D 12 + - - + 4일 6
GF-Fus3 12D 12 + - - + 12일 6
결과
도 16은 GF-Fus3-His로부터 6x-히스티딘 태그의 제거가 연골 기질 생합성의 자극을 변화시키지 않았음을 나타낸다. 추가로, 이전의 실시예와 일치되게, GF-Fus1, GF-Fus3-His 및 GF-Fus3에 의한 12일 연속 처리는 질환 대조군에 비해 연골 기질 생합성을 자극하였다. GF-Fus3-His 및 GF-Fus3은 비연골 결합 GF-Fus1보다 2배 초과로 더 큰 4일의 처리에 의한 질환 대조군에 비해 기질 생합성을 자극하였다.
실시예 15: GF - Fus3은 최소 및 중증의 연골 퇴행을 지니는 공여체로부터 인간 활액 중에서 안정하다
손상된 연골의 지속 처리 활성은 손상된 관절의 활막강 내에서 연골 표적화된 융합 단백질의 안정성을 필요로 할 것이다. 따라서, 연골 퇴행을 지니는 공여체로부터의 인간 활액 중의 인큐베이션을 이용하여 GF-Fus3의 안정성을 결정하였다.
방법
활액을 2명의 인간 공여체로부터 사망 24시간 내에 채취하고 나서(표 14 참조), 새로 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다. 2㎕의 GF-Fus3(PBS 중의 0.45㎎/㎖, 라이프 테크놀로지즈 카탈로그 번호10010-031)를 밀봉 200㎕ PCR관 내 18㎕의 활액에 첨가하고 나서(최종 GF-Fus3 농도는 45㎍/㎖임), 37℃에서 0, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 PBS 중에서 1:10으로 희석시키고, 10㎕(45ng의 GF-Fus3)를 3.3㎕의 NuPAGE LDS 샘플 완충제(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 NP0007)와 혼합하였다. GF-Fus3 표준을 100, 200, 400, 800 및 1600ng/㎖에서 제조하고 나서, 10㎕의 각각의 용액을 3.3㎕의 NuPAGE LDS 샘플 완충제와 혼합하였다. 모든 샘플 및 표준을 4 내지 12% NuPAGE 비스-트리스 겔(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 NP0321BOX) 상에 장입시키고 나서, NuPAGE MES SDS 실행 완충제(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 NP0002) 중에서 실행하였다. 단백질을 iBlot 키트(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 IB301001)를 이용하여 나이트로셀룰로스 막에 옮겼다. 막을 1시간 동안 실온에서 교반시키면서 오디세이(Odyssey) 차단 완충제(LI-COR, 카탈로그 번호 927-40000) 중에서 차단시켰다. 막을 0.05% 트윈20(PBS-T)로 PBS 중에서 2회 세척하고 나서, 2㎍/㎖ 항-IGF-1 항체(밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 05-172) 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 막을 PBS-T 중에서 3회 세척하고 나서, 1시간 동안 1:2000으로 희석시킨 IRDye 800CW 염소 항-마우스 항체(LI-COR, 카탈로그 번호 827-08364)와 함께 인큐베이션시켰다. 막을 PBS-T를 이용하여 3회 세척하고 나서 LI-COR 오디세이 CLx 상에서 영상화하였다.
인간 활액 공여체
연령 변형된 콜린스 연골 등급 성별
63 1 여성
76 3 여성
결과
등급 1(최소)과 등급 3(중증) 연골 분해를 둘 다 지니는 공여체에 대해(각각 도 17a 및 도 17b), 활액 중의 GF-Fus3의 37℃에서 96시간의 인큐베이션은 최소 단백질 분해를 야기하였다. 45㎍의 인큐베이션한 단백질을 장입시켰을 때, 7.5kDa 미만의 희미한 밴드가 도 17a와 도 17b 둘 다에서 보였지만, 두 경우 모두에서 이 밴드의 강도는 1ng GF-Fus3 표준 이하였고, 이는 활액 인큐베이션 동안 2% 이하의 초기 단백질이 분해되었음을 시사한다.
균등론
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 본 발명(들)의 구체적 실시형태의 다수의 동등물을 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 다음의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 임의의 독립항 및 임의의 종속항에 개시된 실시형태 중 하나 이상의 임의의 조합이 또한 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급되는 각각의 및 모든 특허, 계류 중인 특허 출원 및 공개는 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (34)

  1. 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질 내에 존재할 때, 상기 제1 도메인은 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되고, 상기 제2 도메인은 연골 기질 성분에 특이적으로 결합되는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 단일 폴리펩타이드쇄를 포함하는, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 IGF-1 수용체 결합 도메인인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 GAG(글라이코사미노글라이칸) 결합 도메인인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 콜라겐 결합 도메인인, 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 상기 GAG 결합 도메인은 프롤린-알기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복체 단백질(proline-arginine-rich end leucine-rich repeat protein: PRELP), 콘드로어드헤린(chondroadherin), 온코스타틴 M, 콜라겐 IX, BMP-4, 피브로넥틴, RAND1, RAND2, RAND3, RAND4, RAND5, RAND6, AKK15, RLR22, R1Q17, SEK20, ARK24, AKK24, AL1, AL2, AL3, LGT25, Pep184, Pep186, Pep185, Pep239, Pep246, ATIII 또는 피브베타(FibBeta)의 GAG 결합 도메인의 서열 또는 해당 도메인 대해 상동성이거나 또는 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  7. 제4항에 있어서, 상기 GAG 결합 도메인은 서열번호 2 내지 13, 및 54 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제4항에 있어서, 상기 GAG 결합 도메인은 서열번호 2를 포함하는, 융합 단백질.
  9. 제3항에 있어서, 상기 IGF-1 수용체 결합 도메인은 인간 IGF-1의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제3항에 있어서, 상기 IGF-1 수용체 결합 도메인은 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제5항에 있어서, 상기 콜라겐 결합 도메인은 CNA35, CNA344, 트롬보스폰딘, 매트릴린, 연골 올리고머 기질 단백질, PRELP, 연골 올리고머 단백질, 콘드로어드헤린, 피브로모듈린, 데코린 또는 아스포린의 콜라겐 결합 도메인의 서열 또는 해당 도메인 대해 상동성이거나 또는 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  12. 제5항에 있어서, 상기 콜라겐 결합 도메인은 서열번호 14 내지 16, 및 21 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 17 내지 20, 28 내지 53, 및 71 내지 87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질 내에 존재할 때에, 각각의 결합 도메인은 천연 결합 활성을 나타내는, 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 40,000, 35,000 30,000, 25,000, 20,000, 15,000, 10,000, 7,500, 5,000, 2,500, 1,000, 500 또는 250개 미만의 아미노산을 포함하는, 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류의 관절의 관절강내 공간 내로 주사 시, 상기 융합 단백질은 상기 제2 결합 도메인이 상기 연골 기질 성분에 특이적으로 결합하지 않는 돌연변이체 도메인이라는 점에서만 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 상이한 융합 뮤테인보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 긴 시간 기간 동안 상기 관절의 연골 조직 내에 보유되는, 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 상기 연골 조직 내에 보유된 상기 융합 단백질의 양은 적어도 약 5, 약 10, 약 20 또는 약 50p㏖/g의 조직인, 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 래트 또는 말이고, 상기 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 상기 관절은, 1) 연골 조직으로부터의 sGAG의 손실, 2) 세포 함량의 손실, 3) 총 연골 조직의 손실, 또는 4) 골질의 손실에서, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 1), 2), 3) 또는 4)의 손실과 비교할 때, 감소를 나타내는, 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 래트 또는 말이고, 상기 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 상기 연골 조직은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 생성과 비교할 때, sGAG의 생성의 증가를 특징으로 하는, 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 래트 또는 말이고, 상기 관절은 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절이며, 주사 후 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일에, 상기 연골 조직은, 대조군 단백질을 주사한 매칭된 대조군 관절의 연골 조직의 sGAG의 수준과 비교할 때, 상기 연골 조직 내 sGAG 수준의 증가를 특징으로 하는, 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 조성물로서, 글루코코티코이드를 더 포함하되, 선택적으로 상기 글루코코티코이드는 알클로메타손, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 클로로프레드니손, 시클레소니드, 코티솔, 코티스포린, 코티바졸, 데플라자코트, 덱사메타손, 플루드록시코타이드, 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루오코톨론, 플루오로메톨론, 플루티카손, 헥스아세톤하이드로코타메이트, 하이드로코티손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론, 모메타손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드닐리덴, 프레그나다이엔, 프레그나트라이엔, 프레그넨, 프록토세딜, 리멕솔론, 테트라하이드로콜티코스테론, 트라이암시놀론 및 유로베타솔, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 및 에스터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 1 내지 1000㎍/g의 농도로 존재하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코코티코이드는 지방산에 컨쥬게이션되고, 상기 지방산에 대한 상기 컨쥬게이션은 선택적으로 에스터 결합을 통한 것인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 지방산은 팔미트산을 포함하는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코코티코이드는 극미립자 담체에 함유되는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 극미립자 담체는 리포솜인, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 극미립자 담체는 다층 소포인, 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 극미립자 담체는 고융점 지질을 포함하는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 또는 하이드로 소이 포스파티딜콜린(Hydro Soy phosphatidylcholine: HSPC)을 포함하는, 조성물.
  30. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 글루코코티코이드는 상기 극미립자 담체 지질의 0.1 내지 20몰%의 농도로 상기 극미립자 담체 내에 존재하는, 조성물.
  31. 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 및 덱사메타손 21-팔미테이트를 포함하는 조성물로서, 상기 덱사메타손 21-팔미테이트는 HSPC-함유 다층 소포 내에 함유되는, 조성물.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 손상된 관절 또는 병에 걸린 관절의 관절강내 공간 내로 상기 조성물의 주사 후에, 연골 기질 합성 판독 또는 연골 분해 판독이 얻어지고, 상기 판독은 글루코코티코이드 없이 매칭된 조성물의 매칭된 주사 후에 얻어진 대조군 판독 이상으로 개선을 나타내는, 조성물.
  33. 관절 손상 또는 질환의 치료방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 관절의 관절강내 공간 내로 투여하는 단계를 포함하는, 관절 손상 또는 질환의 치료방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 관절 손상 또는 질환은 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 퇴행, 급성 염증성 관절염, 감염성 관절염, 골다공증, 약물 독성-관련 연골 결함 또는 외상성 연골 손상으로부터 선택되는, 관절 손상 또는 질환의 치료방법.
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