JP2008519032A - Ｆｇｆ−２０の調合物、生成方法および使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＦＧＦ−２０、その断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む改良された調合物、改良された生成方法、および発明の組成物の使用法を提供する。本発明は、線維芽細胞成長因子、好ましくはＦＧＦ−２０、もしくはその断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む、改良された調合物を提供する。本発明はまた、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を単離する、改良された生成方法も提供する。本発明は更に、ＣＧ５３１３５タンパク質、および１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良された調合物の使用方法も提供する。
Description
１．発明の分野
本発明は、ＦＧＦ−２０、その断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む改良された調合物、改良されたその生成方法、およびその使用方法に関する。
本発明は、ＦＧＦ−２０、その断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む改良された調合物、改良されたその生成方法、およびその使用方法に関する。
２．発明の背景
線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）は、それぞれが保存されたアミノ酸コアを含む２０を超えるメンバーから成るファミリーである（例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，７（３）：６５〜１９７（２０００）を参照）。ＦＧＦは成長、生存、アポトーシス、運動、および分化といった様々な細胞機能を制御している（例えばＳｚｅｂｅｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１８５：４５〜１０６（１９９９）を参照）。ＦＧＦファミリーのメンバーはまた、形態形成、脚発生、組織修復、炎症、血管形成、ならびに腫瘍の増殖および浸潤を含む、胚発生および成体期間中の様々な生理学的および病理学的なプロセスにも関係している（例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，７（３）：１６５〜１９７（２０００）；およびＳｚｅｂｅｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１８５：４５〜１０６（１９９９）を参照）。
線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）は、それぞれが保存されたアミノ酸コアを含む２０を超えるメンバーから成るファミリーである（例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，７（３）：６５〜１９７（２０００）を参照）。ＦＧＦは成長、生存、アポトーシス、運動、および分化といった様々な細胞機能を制御している（例えばＳｚｅｂｅｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１８５：４５〜１０６（１９９９）を参照）。ＦＧＦファミリーのメンバーはまた、形態形成、脚発生、組織修復、炎症、血管形成、ならびに腫瘍の増殖および浸潤を含む、胚発生および成体期間中の様々な生理学的および病理学的なプロセスにも関係している（例えばＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，７（３）：１６５〜１９７（２０００）；およびＳｚｅｂｅｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１８５：４５〜１０６（１９９９）を参照）。
相同性に基づいたゲノムを模擬したプロセスを通して、新規ヒトＦＧＦのＦＧＦ−２０が発見された。それぞれの参照の開示は、参照によって本明細書に組み入れられた２０００年１月１３日に提出された米国特許出願第０９／４９４，５８５号、および２０００年、７月３日に提出された第０９／６０９，５４３号を参照。ＦＧＦ−２０のアミノ酸配列は、ヒトＦＧＦ−９（同一率７０％）およびＦＧＦ１６（同一率６４％）に近い相同率を示す。
全長組換えＦＧＦ−２０は、間葉細胞および上皮細胞に増殖反応を誘発するが、ヒトの平滑筋、赤血球、もしくは内皮細胞には誘発しないことが分かっている（例えば、非特許文献１を参照）。ＦＧＦ−２０およびその改変体もしくは誘導体は、口腔粘膜炎（２００３年５月９日に提出された特許文献１を参照）、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）（２００１年１１月６日に提出された特許文献２を参照）のような特定疾患、およびパーキンソン病のような中枢神経系に関係する特定の疾患、および脳卒中のような心臓血管に関係する特定の疾患（２００４年５月１０日に提出された特許文献３を参照）の予防および／または治療に有効であることも分かっている。ＦＧＦ−２０およびその改変体または誘導体については、放射線曝露に伴う症状の予防および／または治療に効果があることも分かっている（２００４年５月１０日に提出された特許文献４を参照）。各参照の開示は、参照によってそっくりそのまま本明細書に組み入れられている。
国際公開第２００３／０９９２０１号パンフレット
国際公開第２００２／０５８７１６号パンフレット
国際公開第２００４／１００８９２号パンフレット
国際公開第２００５／０２５４８９号パンフレット
Ｊｅｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（７）：３１３１〜３１３８（２００１）
かくして、臨床使用に好適である、ＦＧＦ−２０および／またはその改変体もしくは誘導体を含み、安定かつ商業規模で製造できる薬学的調合物が強く求められている。
本明細書内の参照の引用または論考は、かかる引用が本発明の先行技術であることを是認するものと解釈してはならない。
３．発明の概要
本発明は、線維芽細胞成長因子、好ましくはＦＧＦ−２０、もしくはその断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む、改良された調合物を提供する。本発明はまた、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を単離する、改良された生成方法も提供する。本発明は更に、ＣＧ５３１３５タンパク質、および１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良された調合物の使用方法も提供する。
本発明は、線維芽細胞成長因子、好ましくはＦＧＦ−２０、もしくはその断片、誘導体、改変体、相同体、類似体、またはそれらの組合せを含む、改良された調合物を提供する。本発明はまた、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を単離する、改良された生成方法も提供する。本発明は更に、ＣＧ５３１３５タンパク質、および１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良された調合物の使用方法も提供する。
１つの態様では、本発明は、約０．１〜１Ｍの塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、約０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１〜０．１重量／体積（「Ｗ／Ｖ」）％ポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、ならびに単離された線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）を含む調合物を提供する。特定の態様では、発明の調合物中のＦＧＦタンパク質濃度は、約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌである。ＦＧＦタンパク質は、好ましくはＣＧ５３１３５タンパク質である。特定の態様では、本発明の調合物は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；（ｂ）（ａ）のタンパク質に対し１つまたは複数のアミノ酸置換があるタンパク質であって、前記置換が配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０のアミノ酸配列の１５％を超えず、かつ前記の１つまたは複数のアミノ酸置換があるタンパク質が細胞増殖刺激活性を保持しているタンパク質；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、細胞増殖刺激活性を保持する断片、から成る群より選択される１つまたは複数の単離されたタンパク質を含む。いくつかの態様では、発明の調合物は、１つまたは複数の単離されたタンパク質を含み、このときタンパク質濃度は０．５〜３０ｍｇ／ｍｌである。特定の態様では、タンパク質濃度は１０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの態様では、発明の調合物は凍結乾燥または噴霧乾燥される。
特定の態様では、発明の調合物は塩形態のアルギニンを含み、前記アルギニンはアルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンから成る群より選択される。１つの態様では、発明の調合物中の塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖は、０．０１〜０．７Ｍ、好ましくは０．５Ｍの濃度である。
別の態様では、発明の調合物中のリン酸二水素ナトリウムは０．０５Ｍの濃度である。別の態様では、発明の調合物のポリソルベート８０またはポリソルベート２０は０．０１％（ｗ／ｖ）である。１つの態様では、発明の調合物はポリソルベート８０を含む。別の態様では、発明の調合物はポリソルベート２０を含む。
特定の態様では、発明の調合物は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む約１０ｍｇ／ｍｌの単離されたタンパク質、０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。別の特定態様では、発明の調合物は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質約１０ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む。別の態様では、発明の調合物は０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、および単離されたタンパク質の混合物約１０ｍｇ／ｍｌを含み、このとき前記タンパク質は配列番号２４のアミノ酸を含む第一タンパク質、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第二タンパク質を含む。特定の態様では、発明の調合物は更に１つまたは複数の単離されたタンパク質を含み、このとき前記タンパク質は配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２から成る群より選択されるアミノ酸を含む。幾つかの態様では、発明の調合物は１つまたは複数の、単離されたカルバミル化されたタンパク質を含む。
別の態様では、本発明は、水溶液中の線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）の溶解性を、前記溶液に塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、またはこれらの組合せを水溶液に最終濃度０．０１〜１Ｍで加えることによって上げる方法を提供する。幾つかの態様では、線維芽細胞成長因子は単離されたＣＧ５３１３５タンパク質である。特定の態様では、線維芽細胞成長因子は、配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質である。
幾つかの態様では、塩形態のアルギニンは、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンから成る群より選択される。１つの態様では、塩形態のアルギニンの最終濃度は０．０１〜０．７Ｍ、好ましくは０．５Ｍである。幾つかの態様では、発明の方法は、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはこれらの組合せを溶液に加えてタンパク質の溶解性を高めることを更に含む。好ましくは、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはこれらの組合せの溶液最終濃度は０．０１〜０．２Ｍである。
別の態様では、本発明は：（１）配列番号８を含むベクターを含有する大腸菌細胞を発酵させる工程；（２）発酵培養物を１０〜１５℃に冷やす工程；（３）冷やされた培養物を、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、６０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、７．５ｍＭのＤＴＴ、および３．５〜５Ｍ尿素を含む溶解緩衝液で希釈する工程；（４）細胞を希釈した培養物の中で溶解する工程；（５）生じた細胞溶解物を事前に平衡化したカチオン交換カラムに掛け、カラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ硫酸ナトリウム、および３〜５Ｍ尿素を含む緩衝液でフラッシュする工程；（６）フラッシュしたカラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０〜２５ｍＭ硫酸ナトリウム、および２．２２ｍＭのデキストロースを含む緩衝液で洗浄する工程；（７）５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０〜２５０ｍＭ硫酸ナトリウム、および０．５〜１ＭのＬ−アルギニンを含む溶出緩衝液で再度カラムを洗浄する工程；（８）得られた溶出物を、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０〜２５０ｍＭ硫酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１Ｍのアルギニンで事前に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにかける工程；（９）得られたカラムを１００〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．８〜１Ｍのアルギニンを含む溶液で洗浄する工程；ならびに（１０）カラムを、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１〜０．３Ｍのアルギニンを含む溶液で再度洗浄してタンパク質を溶出する工程を含む、単離されたタンパク質を製造する方法を提供する。特定の態様では、方法は更に：（１１）得られた溶出物を濃縮する工程；（１２）得られた残留物をまとめて５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍのアルギニンを含む溶液で濾過する工程；（１３）濾過残留物を濃縮する工程；ならびに（１４）濃縮残留物を濾過する工程を含む。
幾つかの態様では、細胞は：（ａ）配列番号８を含むベクターを含む大腸菌細胞を、化学的に規定された種培地の中で２．５〜４．５のＯＤ６００単位を示す対数増殖期まで培養する工程；（ｂ）工程（ａ）の細胞を種培地に接種して、細胞を３．０〜５．０のＯＤ６００単位の対数増殖期まで培養する工程；（ｃ）工程（ｂ）の細胞を化学的に規定されたバッチ培地に移す工程；（ｄ）工程（ｃ）の細胞を２５〜３０のＯＤ６００単位まで培養し、供給割合０．７ｇ／ｋｇブロス／分で化学的に規定した培地を追加する工程；（ｅ）工程（ｄ）の細胞を１３５〜１６５のＯＤ６００単位まで培養する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）の細胞を約４時間培養する工程を含む方法によって発酵される。
本発明はまた、発明の方法によって作られた、単離されたタンパク質も提供する。
発明の組成物および調合物の疾患、例えば消化器粘膜炎、関節炎のような疾患、放射線照射に伴う障害または症状、中枢神経系または心臓血管系の障害を予防および／または治療するための使用も提供される。
３．１ 用語
ある数値または範囲と結びついている用語「約」は、本明細書で使用される場合、その数値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、および更に好ましくは５％以内の数値または範囲を指す。
ある数値または範囲と結びついている用語「約」は、本明細書で使用される場合、その数値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、および更に好ましくは５％以内の数値または範囲を指す。
本明細書で使用する場合、用語「ＣＧ５３１３５」は、ある部類に属するタンパク質（ペプチドもしくはポリペプチドを含む）またはそのようなタンパク質をコードする核酸もしくはそれらの相補鎖を指し、このときタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列（２１１アミノ酸）またはその断片、誘導体、改変体、相同体もしくは類似体を含む。好ましい態様では、ＣＧ５３１３５タンパク質は、少なくともＦＧＦ−２０の生物活性の幾つかを保持している。本明細書で使用する場合、用語「生物活性」は、ＣＧ５３１３５タンパク質がＦＧＦ−２０と同一の特性（必ずしも同程度である必要はない）の幾つかを有するが、必ずしも全てを有していないことを意味する。
ＣＧ５３１３５ファミリーのメンバー（例えばタンパク質および／またはそのタンパク質をコードする核酸）には、識別名称を更に与えることもできる。例えばＣＧ５３１３５−０１（配列番号１および２）は、最初に同定されたＦＧＦ−２０（米国特許出願第０９／４９４，５８５号を参照）を表している；ＣＧ５３１３５−０５（配列番号８および２）はコドンを最適化した、全長のＦＧＦ−２０（即ちＦＧＦ−２０をコードする核酸配列はコドン最適化されているが、そのアミノ酸配列は最初に同定されたＦＧＦ−２０の配列と変わらない）を表す；ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）は、ＣＧ５３１３５−１２中の一アミノ酸が配列番号２と異なっている、ＦＧＦ−２０の一塩基多形（「ＳＮＰ」）（位置２０６のアスパラギン酸がアスパラギンに変更されている、「２０６Ｄ→Ｎ」）を表している。ＣＧ５３１３５ファミリーの幾つかのメンバーは、それらの核酸配列は異なっているが、同一のＣＧ５３１３５タンパク質をコードしており、例えばＣＧ５３１３５−０１、ＣＧ５３１３５−０３、およびＣＧ５３１３５−０５は全て同じＣＧ５３１３５タンパク質をコードしている。識別名はまたインフレームクローン（「ＩＦＣ」）番号の場合もあり、例えばＩＦＣ２５００５９６２９（配列番号３３および３４）は完全長ＦＧＦ−２０（ベクターのフレーム内にクローニングされた）のアミノ酸６３〜１９６を表している。表１Ａは、ＣＧ５３１３５ファミリーメンバーの幾つかの概要を示している。１つの態様では、発明はＦＧＦ−２０タンパク質の改変体を含むが、この改変体では幾つかのアミノ酸残基、例えばＦＧＦ−２０（配列番号２）のアミノ酸配列の１％、２％、３％、５％、１０％、または１５％を超えないアミノ酸残基が変更されている。別の態様では、発明はストリンジェントななハイブリダイゼーション条件においてＦＧＦ−２０とハイブリダイゼーションできる核酸分子を含む。
表１Ａ．ＣＧ５３１３５ファミリーメンバーの幾つかの概要
本明細書で使用する用語「ＦＧＦ−２０」は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸配列、もしくはその相補鎖を指す。
本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」とは、相互の同一率が少なくとも３０％（好ましくは３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％）であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイゼーションし続けるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表す。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に見出すことができる。１つの、非限定例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍのナトリウムイオンの塩濃度、約７．０〜約８．３のｐＨ、少なくとも約６０℃の温度、少なくとも０．２Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での少なくとも一回の洗浄を含む。別の非限定例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーションと、続く０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約６８℃での一回以上の洗浄である。更に別の非限定例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃、６Ｘ ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、続く０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０〜６５℃での一回以上の洗浄である（即ち５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃での一回以上の洗浄）。発明の核酸は、これらの条件でＡまたはＴだけから成るヌクレオチド配列とのみハイブリダイゼーションする核酸分子は含まないものとする。
本明細書で使用する、タンパク質作用物質と関係する場合の用語「単離された」は、細胞物質、またはそれが由来する細胞もしくは組織供給源からの汚染タンパク質を実質的に含んでいないか、あるいは化学的に合成される場合には、前駆化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まないタンパク質作用物質を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、タンパク質作用物質が、それが単離されたかもしくは組換え体として作られた細胞に由来する細胞成分から分離しているタンパク質作用物質の調製物を含む。かくして実質的に細胞物質を含まないタンパク質作用物質は、少なくとも約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量の）より少ない宿主細胞タンパク質を有する調製物である。タンパク質作用物質を組換え技術により作製する場合は、好ましくは細胞培地も実質的に含まず、即ち細胞培地はタンパク質作用物質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％より少ない。タンパク質作用物質を化学合成により作製する場合は、それは実質的に前駆化学物質もしくはその他化学物質を含まないことが好ましく、即ちそれらはタンパク質作用物質の合成に関係した前駆化学物質またはその他化学物質と分離されている。従って、タンパク質作用物質のこのような調製物は、関心対象のタンパク質作用物質以外の前駆化学物質または化合物の含有量は約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満である。特定の態様では、本明細書で開示されているタンパク質作用物質は単離されている。
本明細書で使用する、核酸分子に関係する用語「単離された」は、核酸分子の供給源に存在している他の核酸分子から分離された核酸分子を指す。更には、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術によって作製される場合には他の細胞物質もしくは細胞培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には前駆化学物質もしくは他の化学物質を実質的に含んでいなくともよい。特定の態様では、核酸分子は単離されている。
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」は、治療薬（例えばＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の投与、または治療薬の組合せの投薬の結果として起こる、被験体の疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）またはそれらの１つ以上の症状の再発、発症、または進行の阻止を指す。
本明細書で使用する用語「予防的有効量」とは、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）またはその１つ以上の症状の進行、再発、または発症の阻止、あるいは他の治療薬の予防効果の増強または改良をもたらすのに十分である治療薬（例えばＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の量を指す。
ここで使用する場合、タンパク質調合物と関連する用語「安定性」は、特定のタンパク質調合物が、タンパク質が長時間、熱−機械的ストレスに曝された時に、そのタンパク質の未変性の活性構造を維持できる能力を指す。幾つかの態様では、タンパク質調合物の安定性とは、タンパク質調合物が、タンパク質が熱−機械的ストレスに曝された結果として生物学的に不活性および／または不溶性のタンパク質凝集物を形成しやすいこと、ならびに疎水性表面および界面の様な不安定な界面および表面との相互作用の結果として、生物学的に不活性および／または不溶性であるタンパク質凝集物を形成する傾向にあることを指す。タンパク質調合物の「安定性」に関係するパラメータとしては、高分子量集合体、および部分変性型のタンパク質を含む変性型タンパク質での可溶性であり、それは、一般的には対応する非凝集型の低分子量集合体および未変性型のタンパク質よりも溶解性は低い。タンパク質調合物の「安定性」に関連する別のパラメータは、物理的に安定な調合物が、タンパク質の濃度を増減した時に、物理的に安定でなくなるタンパク質の濃度である。
本明細書で使用する場合、用語「被験体」は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコまたはイヌを含む）、霊長類（例えばサル、チンパンジー、またはヒト）を指し、より好ましくはヒトを指す。用語「被験体」は、本発明の中では「患者」と互換的に用いられる。
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療」、および「治療すること」は、疾患の（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）の進行、重篤度、および／もしくは期間の短縮、またはそれらの症状の１つ以上の改善を指し、この場合かかる短縮および／または改善は、１つまたは複数の治療薬（例えばＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の投与から生ずる。
本明細書で使用する場合、「治療的有効量」とは、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）の重篤度または期間を短縮する、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）の進行を阻止する、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）を退行させる、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）に関係する１つ以上の症状を改善する、または他の治療薬の治療効果を増強もしくは改良するのに十分である治療薬（例えばＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物）の量を指す。
５．発明の詳細な説明
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む、より安定かつ好適であり、市販の装置で容易に凍結乾燥できる改良調合物を提供する。改良調合物は、約０．０１〜１Ｍの、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、約０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１％〜０．１％重量／体積（「Ｗ／Ｖ」）ポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、ならびに１つもしくは複数の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む。特定の態様では、発明の改良調合物中のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は５０ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、または１ｍｇ／ｍｌ未満である。別の態様では、発明の改良調合物中のＣＧ５３１３５タンパク質濃度は、０．００５〜５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい態様では、調合物は凍結乾燥される。
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む、より安定かつ好適であり、市販の装置で容易に凍結乾燥できる改良調合物を提供する。改良調合物は、約０．０１〜１Ｍの、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、約０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１％〜０．１％重量／体積（「Ｗ／Ｖ」）ポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、ならびに１つもしくは複数の単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を含む。特定の態様では、発明の改良調合物中のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は５０ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、または１ｍｇ／ｍｌ未満である。別の態様では、発明の改良調合物中のＣＧ５３１３５タンパク質濃度は、０．００５〜５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい態様では、調合物は凍結乾燥される。
本発明はまた、溶液中（例えば水溶液）でのＦＧＦタンパク質の安定性を高めるための方法も提供する。１つの態様では、本発明は溶液に、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖を加えることによって溶液中のＦＧＦタンパク質の溶解性を高めるための方法を提供する。別の態様では、本発明は、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、またはこれらの組合せのような緩衝化塩を溶液に加えることによって、溶液中でのＦＧＦの溶解性または安定性を高めるための方法を提供する。さらに別の態様では、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、またはこれらの組合せのような緩衝塩を、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖と一緒にして溶液に加えられ、ＦＧＦタンパク質の安定性を高める。塩形態のアルギニンは、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンでよいが、これらに限定されない。好ましい態様では、硫酸アルギニンが用いられる。幾つかの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖の最終濃度は、０．０１Ｍ〜１Ｍの間である。１つの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖の最終濃度は０．５Ｍである。幾つかの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリン、またはショ糖の最終濃度は０．０５Ｍである。好ましい態様では、ＦＧＦタンパク質はＦＧＦ−２０タンパク質、ＦＧＦ−２０の断片、誘導体、改変体、相同体、もしくは類似体、またはそれらの組合せである。
本発明は更に、ＣＧ５３１３５タンパク質および／または１つもしくは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む調合物に関する、改良された製造法を提供する。改良製造法は、ＣＧ５３１３５タンパク質および／または１つもしくは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む調合物の商業規模の製造を可能にする。改良製造法は、ＣＧ５３１３５タンパク質を高純度に精製することも可能にする。幾つかの態様では、改良製造法によって精製されたＣＧ５３１３５の純度は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である。好ましい態様では、改良製造法によって精製されたＣＧ５３１３５の純度は９９％から最大１００％（１００％を含む）である。
本発明は、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）または１つもしくは複数のそれらの症状を予防または治療するための、発明の改良調合物および組成物の使用方法、ならびに投与計画も提供する。
開示を明瞭にし、かつ限定的にしないために、発明の詳細な説明を次の小区分に分ける：
（ｉ）ＣＧ５３１３５
（ｉｉ）ＣＧ５３１３５の調製方法
（ｉｉｉ）ＣＧ５３１３５の特徴付け
（ｉｖ）予防的および治療的な使用
（ｖ）投与レジメン
（ｖｉ）薬学的組成物および調合物。
（ｉ）ＣＧ５３１３５
（ｉｉ）ＣＧ５３１３５の調製方法
（ｉｉｉ）ＣＧ５３１３５の特徴付け
（ｉｖ）予防的および治療的な使用
（ｖ）投与レジメン
（ｖｉ）薬学的組成物および調合物。
５．１ ＣＧ５３１３５
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良調合物および改良製造法を提供する。本明細書で用いる用語「ＣＧ５３１３５」は、タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列（２１１アミノ酸、「ＦＧＦ−２０」）またはその断片、誘導体、改変体、相同体、もしくは類似体を含むタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）、あるいはそのようなタンパク質をコードする核酸またはそれらに相補的な鎖の部類を指す。
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良調合物および改良製造法を提供する。本明細書で用いる用語「ＣＧ５３１３５」は、タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列（２１１アミノ酸、「ＦＧＦ−２０」）またはその断片、誘導体、改変体、相同体、もしくは類似体を含むタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）、あるいはそのようなタンパク質をコードする核酸またはそれらに相補的な鎖の部類を指す。
１つの態様では、ＣＧ５３１３５タンパク質はＦＧＦ−２０の改変体である。当業者は、ＦＧＦ−２０タンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列の多形が集団（例えばヒト集団）内に存在できることを了解しているだろう。このようなＦＧＦ−２０遺伝子中の遺伝的な多形は、自然の対立遺伝子変異によって集団中の個体間に存在する場合もある。このような自然の対立遺伝子変異は、典型的にはＦＧＦ−２０遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の変動をもたらすだろう。任意かつ全てのこのような変動、およびその結果ＦＧＦ−２０タンパク質に生じたＦＧＦ−２０タンパク質の自然な対立遺伝子変異の結果であるアミノ酸の多形は、発明の範囲内に含まれるものとする。１つの態様では、ＣＧ５３１３５は、ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）であり、これはＦＧＦ−２０の単一ヌクレオチド多形（「ＳＮＰ」）である（即ち２０６Ｄ→Ｎ）。（ＣＧ５３１３５−１２の更に詳しい説明については、例えば２００３年、１１月４日に提出され、その開示は参照によってそっくりそのままここに組み入れられている米国特許出願第１０／７０２，１２６号を参照。）ＦＧＦ−２０の別のＳＮＰｓの例は、米国特許出願第１０／４３５，０８７号に開示されており、その内容は参照によってここに組み入れられている。
別の態様では、ＣＧ５３１３５は、別の種に由来するＦＧＦ−２０タンパク質をコードする核酸分子またはそれにコードされたタンパク質を指し、それゆえにＦＧＦ−２０のヒト配列とは異なるヌクレオチドもしくはアミノ酸配列を有する。発明のＦＧＦ−２０ ｃＤＮＡの自然対立遺伝子改変体および相同体に対応する核酸分子は、本明細書に開示されているヒトＦＧＦ−２０核酸に対するそれらの相同性に基づいて、ヒトｃＤＮＡまたはその一部分を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ったハイブリダイゼーションプローブとして用いることによって単離できる。
別の態様では、ＣＧ５３１３５は、改変体ＦＧＦ−２０タンパク質、成熟ＦＧＦ−２０タンパク質、および成熟ＦＧＦ−２０タンパク質の改変体の断片、ならびにＦＧＦ−２０核酸の対立改変体および単一ヌクレオチド多形がコードするＦＧＦ−２０タンパク質を含む、ＦＧＦ−２０タンパク質の断片を指す。ＦＧＦ−２０タンパク質断片の例としては、ＦＧＦ−２０（配列番号２）の残基２〜２１１、３〜２１１、９〜２１１、１２〜２１１、１５〜２１１、２４〜２１１、５４〜２１１または５５〜２１１が挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様では、ＣＧ５３１３５は、配列番号２の残基２〜２１１、３〜２１１、９〜２１１，１２〜２１１、１５〜２１１、２４〜２１１、５４〜２１１、または５５〜２１１を含むタンパク質断片をコードしている核酸を指す。
発明はまた、ＦＧＦ−２０の誘導体および類似体を包含する。ＦＧＦ−２０に関係する誘導体および類似体の製造および使用は、本発明の範囲内である。
特定の態様では、誘導体または類似体は機能的に活性であり、即ち完全長の野生型ＦＧＦ−２０に関係する機能活性を１つまたは複数示すことができる。ＦＧＦ−２０の誘導体または類似体は、それに相応しい細胞株、動物モデル、および臨床試験を用いることを含むが、これらに限定されない当技術分野公知の手順によって所望の活性について試験することができる。
具体的には、置換、挿入または欠失によってＦＧＦ−２０配列を変更することによって、機能的に透過な物質を提供するＦＧＦ−２０誘導体を作ることができる。１つの態様では、ＦＧＦ−２０のこのような変更は、ＦＧＦタンパク質ファミリーに保存されていない領域内に加えられる。ヌクレオチドコード配列の縮重性から、本発明の実施に、ＦＧＦ−２０と実質的に同じアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を用いることもできる。このような配列としては、機能的には同じであるアミノ酸配列をコードする別のコドンの置換、即ちサイレントな変化をもたらす変更を配列内に加えるＦＧＦ−２０の全て、または一部を含む核酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。好ましい態様では、野生型のＦＧＦ−２０核酸配列は配列番号８（ＣＧ５３１３５−０５）の核酸配列に対し最適化されたコドンである。同様に発明のＦＧＦ−２０誘導体としては、配列内の残基について機能的に等しいアミノ酸残基の置換が行われ、サイレントな変更配列を一次アミノ酸配列として含むＦＧＦ−２０のアミノ酸配列の全て、または一部分を含む誘導体が挙げられるが、これに限定されない。例えば、配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、機能的等価物として動作する同様の極性を有する別のアミノ酸によって置換し、サイレントな変更を起こすことができる。配列内のアミノ酸の置換基は、前記アミノ酸が属する部類の他のメンバーから選択できる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ロイシン、およびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。発明のＦＧＦ−２０誘導体は、アミノ酸残基が同様の化学的性質を有する残基に置換された、変更された配列を含むＦＧＦ−２０のアミノ酸配列の全てまたは一部を一次アミノ酸配列として含有する誘導体も含むが、これに限定されない。特定の態様では、１、２、３、４、または５つのアミノ酸が置換される。
ＦＧＦ−２０の誘導体または類似体としては、ＦＧＦ−２０またはその断片に実質的に相同であるか、またはその核酸がＦＧＦ−２０核酸配列にハイブリダイゼーションできるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
発明のＦＧＦ−２０誘導体および類似体は、当技術分野で公知の様々な方法によって製造できる。それらを製造するための操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで実施できる。例えば、クローニングされたＦＧＦ−２０遺伝子配列は、当技術分野で公知である多数の方策のいずれかにより変更できる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。配列は制限エンドヌクレアーゼ、必要ならば続いて更なる酵素的変更によってインビトロで適切な部位で開裂し、単離し、連結することができる。ＦＧＦ−２０の誘導体または類似体をコードする遺伝子の製造においては、変更された遺伝子がＦＧＦ−２０と同じ翻訳読み取りフレーム内に残ること、コードする遺伝子領域内の翻訳停止シグナルによって所望するＦＧＦ−２０活性が妨害されないことを保証するように注意しなければならない。
これに加えて、ＦＧＦ−２０をコードする核酸配列は、インビトロでの変更をさらに容易にするために、インビトロまたはインビボで突然変異させて翻訳、開始、および／または終止配列を創作および／または破壊する、あるいはコーディング領域内に多様性を創り出す、および／または新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、あるいは既存の同部位を破壊することができる。インビトロ部位指定突然変異誘導法（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５３：６５５１）、ＴＡＢ．ＲＴＭ．リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用等、当技術分野に公知である突然変異誘導技術を用いることができるが、これらに限定されない。
ＦＧＦ−２０配列は、タンパク質レベルでも操作できる。本発明の範囲には、ＦＧＦ−２０断片、あるいは、例えばグリコシレーション、アセチレーション、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基、タンパク質開裂、抗体分子もしくはその他細胞リガンドへの結合等による誘導化によって、翻訳中もしくは翻訳後に様々な変更が加えられたその他誘導体または類似体が含まれる。数多くある化学的変更は、遊離ＮＨ２−基、遊離ＣＯＯＨ−基、ＯＨ−基、Ｔｒｐ−、Ｔｙｒ−、Ｐｈｅ−、Ｈｉｓ−、Ａｒｇ−もしくはＬｙｓ−の側基の保護または変更に有効である試薬；臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ＢＮＰＳ−Ｓｋａｔｏｌｅ、酸、もしくはアルカリ加水分解による特異的な化学的開裂；トリプシン、肝トリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による酵素的開裂；アセチル化、フォルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下での代謝的合成等を含むがこれらに限定されない既知の技術によって実施できる。
これに加えて、ＦＧＦ−２０の類似体および誘導体は、化学的にも合成できる。例えば、所望のドメインを含むか、またはインビトロにおいて所望の集合活性、もしくはレセプターへの結合を仲介するＦＧＦ−２０の部分に対応するタンパク質は、ペプチド合成装置を用いて合成できる。さらには、望ましい場合には、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を、置換基または付加物としてＦＧＦ−２０配列内に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ−イソマー、α−アミノイソ絡酸、４−アミノ絡酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、β−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の態様では、ＦＧＦ−２０誘導体は、そのアミノ末端および／またはカルボキシル末端でＦＧＦ−２０以外のアミノ酸配列にペプチド結合を介して融合しているＦＧＦ−２０またはその断片を含むキメラもしくは融合タンパク質である。別の態様では、このようなキメラタンパク質は、前記タンパク質（ＦＧＦ−２０以外のコーディング配列とインフレームに結合しているＦＧＦ−２０コーディング配列を含む）をコードしている核酸の組換え発現によって製造される。この様なキメラ産物は、様々な企業（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ、Ｏｐｅｒｏｎ等）によるオーダーメードが可能であるか、または所望のアミノ酸配列をコードしている適切な核酸配列を当技術分野公知の方法によって、適切なコーディングフレームの中で互いに連結させて、当技術分野周知の方法によってキメラ産物を発現させることによって作ることができる。あるいは、このようなキメラ産物はタンパク質合成技術、例えばペプチド合成装置を用いることによって作ることもできる。特定の態様では、ＦＧＦ−２０を異種のシグナル配列と共にコードしているキメラ核酸は、キメラタンパク質が細胞によって成熟ＦＧＦ−２０タンパク質に発現および加工されるように発現される。ＦＧＦ−２０および非ＦＧＦ−２０遺伝子の一次配列はまた、コンピュータシミュレーションを用いた分子の立体構造予想にも用いられる（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４〜３８２８）；キメラ組換え遺伝子は、立体構造および生物学的機能の相関関係に注目して設計することもできる。同様に、異種（非ＦＧＦ−２０）タンパク質をコードしている配列と融合してＦＧＦ−２０分子の必須部位を含んでいるキメラ遺伝子を組み立てることもできる。特定の態様では、このようなキメラ構築物を用いて、ＦＧＦ−２０の安定性、溶解性、またはプロテアーゼ耐性を含むが、これらに限定されないＦＧＦ−２０の所望特性の１つまたは複数を増強できる。別の態様では、キメラ構築物は、ＦＧＦ−２０が特定の部位を標的とするのに用いることができる。さらに別の態様では、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）、細胞結合タンパク質（ＣｅｎＡ）、またはマンノースタンパク質等のようなキメラ構築物は、発明のＦＧＦ−２０の同定または精製に用いることができる。１つの態様では、ＣＧ５３１３５タンパク質はカルバミル化されている。
幾つかの態様では、ＣＧ５３１３５タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、改良された溶解性および／または延長されたインビボ半減期を有するように変更することができる。例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ断片、または高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような不活性ポリマー分子は、タンパク質のＮ−もしくはＣ−末端へのＰＥＧの部位特異的共役結合、またはリジン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介した多機能的リンカーを用いて、あるいは用いないで、ＣＧ５３１３５タンパク質に結合することができる。生物活性の損失が最小となる直線または枝分かれポリマー誘導化が用いられる。共役度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法によってストリンジェントなにモニタリングでき、ＰＥＧ分子のＣＧ５３１３５タンパク質への適切な共役を保証することができる。未反応のＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、ＣＧ５３１３５−ＰＥＧ共役体から分離できる。ＰＥＧ誘導化共役体は、当業者に公知の方法を用いてインビボ効率について試験できる。
ＣＧ５３１３５タンパク質はまたタンパク質をインビトロでより安定にするため、またはインビボでの半減期をより長くするためにアルブミンに結合させることもできる。この技術は当技術分野で周知であり、例えばその全てが参照によりここに組み入れられている国際特許出願第ＷＯ９３／１５１９９号、第ＷＯ９３／１５２００号、およびＷＯ０１／７７１３７号；ならびに欧州特許第ＥＰ４１３，６２２号を参照。
幾つかの態様では、ＣＧ５３１３５は、ＣＧ５３１３５−０１（配列番号１および２）、ＣＧ５３１３５−０２（配列番号３および４）、ＣＧ５３１３５−０３（配列番号５および２）、ＣＧ５３１３５−０４（配列番号６および７）、ＣＧ５３１３５−０５（配列番号８および２）、ＣＧ５３１３５−０６（配列番号９および１０）、ＣＧ５３１３５−０７（配列番号１１および１２）、ＣＧ５３１３５−０８（配列番号１３および１４）、ＣＧ５３１３５−０９（配列番号１５および１６）、ＣＧ５３１３５−１０（配列番号１７および１８）、ＣＧ５３１３５−１１（配列番号１９および２０）、ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２１および２２）、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２３および２４）、ＣＧ５３１３５−１４（配列番号２５および２６）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２７および２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号２９および３０）、ＣＧ５３１３５−１７（配列番号３１および３２）、ＩＦＣ２５００５９６２９（配列番号３３および３４）、ＩＦＣ２００５９６６９（配列番号３５および３６）、ＩＦＣ３１７４５９５５３（配列番号３７および３８）、ＩＦＣ３１７４５９５７１（配列番号３９および４０）、ＩＦＣ２５００５９５９６（配列番号４１および１０）、ＩＦＣ３１６３５１２２４（配列番号４１および１０）、またはそれらの組合せを指す。特定の態様では、ＣＧ５３１３５は、カルバミル化されており、例えばカルバミル化ＣＧ５３１３５−１３タンパク質またはカルバミル化ＣＧ５３１３５−０５タンパク質である。
ＣＧ５３１３５の予防的および治療的使用の例は、出願済みの特許出願（米国特許出願第０９／９９２，８４０、第１０／０１１，３６４号、第１０／３２１，９６２号、第１０／４３５，０８７号、第１０／８４２，２０６号、第１０／８４２，１７９号、および米国特許第６，７９７，６９５号を参照）に記載されておいる。各参照の開示は、参照によってそっくりそのまま組み入れられる。
５．２ ＣＧ５３１３５の調製方法
本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む調合物、および改良された生成方法を提供する。本明細書に記載されている方法によれば、発明の調合物に用いられるか、または発明の生成方法によって作られるＣＧ５３１３５タンパク質は、８０〜１００パーセントの範囲の純度を、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の純度を持つことができる。１つの態様では、発明の調合物に用いられているか、発明の生成方法によって作られる１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質は、少なくとも９９％の純度を有する。別の態様では、ＣＧ５３１３５は、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイした時に、はっきりと均質になるまで精製される。ＣＧ５３１３５タンパク質の精製には、沈殿による分離、吸着による分離（例えばカラムクロマトグラフィー、メンブレン吸着、渦巻きカラム、バッチ吸着、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、不動化金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、溶液中の分離（例えば、ゲル濾過、電気泳動、液相分配、界面活性剤分配、有機溶媒抽出、および限外濾過）を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知である任意の技術を用いることができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４）を参照。精製中、ＣＧ５３１３５の生物活性は、上記の第５．３節に記載されている、１つまたは複数のインビトロまたはインビボアッセイによってモニタリングできる。ＣＧ５３１３５の純度は、ゲル電気泳動のような、しかしこれに限定されない当技術分野で公知な任意の方法によってアッセイできる。上記Ｓｃｏｐｅｓを参照。
本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む調合物、および改良された生成方法を提供する。本明細書に記載されている方法によれば、発明の調合物に用いられるか、または発明の生成方法によって作られるＣＧ５３１３５タンパク質は、８０〜１００パーセントの範囲の純度を、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の純度を持つことができる。１つの態様では、発明の調合物に用いられているか、発明の生成方法によって作られる１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質は、少なくとも９９％の純度を有する。別の態様では、ＣＧ５３１３５は、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイした時に、はっきりと均質になるまで精製される。ＣＧ５３１３５タンパク質の精製には、沈殿による分離、吸着による分離（例えばカラムクロマトグラフィー、メンブレン吸着、渦巻きカラム、バッチ吸着、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、不動化金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、溶液中の分離（例えば、ゲル濾過、電気泳動、液相分配、界面活性剤分配、有機溶媒抽出、および限外濾過）を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知である任意の技術を用いることができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４）を参照。精製中、ＣＧ５３１３５の生物活性は、上記の第５．３節に記載されている、１つまたは複数のインビトロまたはインビボアッセイによってモニタリングできる。ＣＧ５３１３５の純度は、ゲル電気泳動のような、しかしこれに限定されない当技術分野で公知な任意の方法によってアッセイできる。上記Ｓｃｏｐｅｓを参照。
当技術分野で公知の方法を利用して、ＣＧ５３１３５タンパク質を組換え体として作ることができる。ＣＧ５３１３５タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞で継代および発現させるために発現ベクター内に挿入することができる。
本明細書で使用する場合、発現構築物とは、適切な宿主細胞内でＣＧ５３１３５タンパク質の発現を可能にする、１つまたは複数の制御領域と作動可能に連結したＣＧ５３１３５タンパク質をコードする核酸配列を指す。「作動可能に連結した」とは、制御領域と発現対象のＣＧ５３１３５配列が、転写および最終的には翻訳可能な様に結合および配置されている連結を指す。
ＣＧ５３１３５の転写に必要な制御領域は、発現ベクターから提供できる。それ本来の開始コドンを欠いているＣＧ５３１３５遺伝子配列を発現させる場合には、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も提供できる。適合した宿主−構築物系では、宿主生物において、ＲＮＡポリメラーゼのような細胞由来の転写因子が発現構築物の制御領域に結合し、変更されたＣＧ５３１３５配列の転写を行う。遺伝子発現に必要な制御領域のストリンジェントなな性質は宿主細胞によって異なることがある。一般的には、ＲＮＡポリメラーゼを結合でき、作動可能に連結している核酸配列の転写を促進できるプロモータが必要である。このような制御領域としては、転写開始および翻訳に関与する、ＴＡＴＡボックス、キャッピングは入れ宇、ＣＡＡＴ配列のような５’非コーディング配列が挙げられる。コーディング配列の３’側にある非コーディング領域は、終止部位およびポリアデニル化部位のような転写終止制御配列を含んでよい。
ＣＧ５３１３５遺伝子配列にプロモータのような制御機能を有するＤＮＡ配列を取り付けるか、またはＣＧ５３１３５遺伝子配列をベクターのクローニング部位内に挿入するために、当技術分野で周知の技術を用いて、目的に合った、適合制限部位を提供するリンカーまたはアダプターをｃＤＮＡの末端に結合してよい（例えばＷｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：３４３〜３４９を参照）。制限酵素による開裂に続いて、結合する前に単鎖ＤＮＡ末端部を消化または充填して平滑末端に変更することができる。または、望まれる制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによってＤＮＡを増幅することで、望まれる制限酵素部位をＤＮＡの断片内に入れることができる。
制御領域と作動可能に連結したＣＧ５３１３５配列を含む発現構築物は、その後クローニングすることなくＣＧ５３１３５タンパク質を発現および製造するために、それに適した宿主細胞に直接導入できる。例えば米国特許第５、５８０、８５９号を参照。発現構築物は、ＣＤ５３１３５配列の宿主細胞ゲノム内への統合、例えば相同的組換えによる統合を容易にするＤＮＡ配列を含むこともできる。この場合は、宿主細胞でＣＧ５３１３５を継代および発現させるために、それに適合した宿主細胞に好適な複製起点を含んだ発現ベクターを用いる必要はない。
プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または修飾ウイルスを含むが、これらに限定されない多様な発現ベクターを用いることができる。このような宿主−発現系は、ＣＧ５３１３５遺伝子のコーディング配列を産生および続いて精製できるビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクションした時に、ｉｎ ｓｉｔｕでＣＧ５３１３５を発現できる細胞でもよい。このようなものとしては、ＣＧ５３１３５コーディング配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ＣＧ５３１３５コーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；ＣＧ５３１３５コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＣＧ５３１３５コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来する（例えばメタロチオネインプロモータ）、もしくは哺乳動物ウイルスに由来する（例えばアデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）プロモータを含む組換え発現構築物を内部に持つ哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、組換えＣＧ５３１３５分子の発現には大腸菌のような細菌細胞、および真核細胞が用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ＣＧ５３１３５配列を効率的に発現させるために、サイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子に由来するプロモータエレメントを担持するベクターと共に用いることができる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４５：１０１；およびＣｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。
細菌系では、発現対象となるＣＧ５３１３５分子の使用目的に応じて、多くの発現ベクターを都合よく選択することができる。例えば、ＣＧ５３１３５分子の薬学的組成物を生成するために、大量のＣＧ５３１３５を製造する場合は、簡便に生成される融合タンパク質産物を高レベルに発現するベクターが望まれるだろう。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１〜３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｓ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３〜５５０９）等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＭＡＬ（ＮＥＢ）、およびｐＥＴ（Ｎｏｂａｇｅｎ）のような一連のベクターも、ＰＬＡＧペプチド、ｍａｌＥ−、またはＣＢＤ−タンパク質との融合タンパク質として外来タンパク質を発現させるのに用いることができる。これら組換えタンパク質は、正しく折りたたみ、かつペリプラズマ空間に向かわせ成熟させることができる。融合部分は、発現タンパク質のアフィニティー精製に用いることができる。エンテロキナーゼのような特定プロテアーゼの開裂部位の存在によりＣＧ５３１３５タンパク質を開裂させることができる。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来タンパク質を発現させるのに用いることができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着および結合させ、続いて遊離グルタチオン存在下に溶出することによって、溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含み、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ成分から放出できるようにデザインされている。
昆虫系では、外来遺伝子を発現する多くのベクター、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現させるベクターとして用いることができる。前記ウイルスはＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のような細胞で増殖する。ＣＧ５３１３５コーディング配列は、個別にウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン領域）にクローニングし、かつＡｃＮＰＶプロモータ（例えばポリヘドリンプロモータ）のコントロール下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスをベースにした発現系が利用できる。アデノウイルスを発現ベクターに用いる場合は、関心対象のＣＧ５３１３５コーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび３リーダー配列とに結合できる。そうするとこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスに挿入できる。ウイルスゲノム（例えば領域Ｅ１またはＥ３）の非必須領域内への挿入によって、感染した宿主の中で生存し、ＣＧ５３１３５を発現できる組換えウイルスができる（例えばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５〜３５９を参照）。挿入されたＣＧ５３１３５コーディング配列を効率的に翻訳するには、特異的開始シグナルも必要であろう。これらシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。さらには、開始コドンは所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調して、全挿入体の翻訳を保証しなければならない。これら外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の、様々な起源のものでよい。発現効率は、適切な転写増強エレメント、転写ターミネータを含めることで高められる（例えばＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１〜５４４を参照）。
これに加えて、挿入された配列の発現を変更するか、遺伝子産物を望む特定の様式に修飾および加工する宿主細胞株を選ぶこともできる。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）および加工（例えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要なこともある。様々な宿主細胞がタンパク質および遺伝子産物の翻訳後の加工および修飾に関する特徴および特異的メカニズムを有している。相応しい細胞株または宿主系を選び、発現した外来タンパク質を、確実に適正に修飾および加工することができる。そのためには、遺伝子産物の一次転写物を適切に処理し、翻訳後修飾、例えば遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化を行う細胞性の機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因性に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７０３０，ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌または酵母系での発現は、翻訳後修飾がＣＧ５３１３５の所望活性にとって本質的でない変更であれば用いることができる。好ましい態様では、ＣＧ５３１３５配列の発現には大腸菌が用いられる。
細胞内において、適切に加工されたＣＧ５３１３５が長期間、高収率で、安定に発現することが好ましい。ＣＧ５３１３５を安定的に発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを用いて作ることができる。これに限定されるものではないが一例を挙げると、発現構築物を導入した後、導入細胞を１〜２日間、強化培地で増殖させ、次に選択培地に変える。発現構築物中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞はその染色体に発現構築物を最適かつ安定的に組み込み、培養によって増殖して、細胞株として樹立される。このような細胞は、長期間培養することができ、同時にＣＧ５３１３５を継続して発現する。
抗生物質耐性（ジェネティシンに対する耐性を付与するＮｅｏのようなマーカー、またはＧ−４１８（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５〜２１５）；ゼオシンに対する耐性を付与するＺｅｏ；ブラスチシジンに対する耐性を付与するＢｓｄなど）；抗代謝剤耐性（メトトレキセートに対する耐性を付与するＤｈｆｒ、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；ならびに非グロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ ３０：１４７）を含むが、これらに限定されない多数の選択系を用いることができる。これに加えて、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞を含むが、これらに限定されない突然変異細胞株を、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン−またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼに対応する遺伝子と一緒に用いることができる。組換えＤＮＡ技術の分野に周知である方法を普通に用いて、所望する組換えクローンを選択することができ、このような方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。
組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、最適密度、および培地組成について標準的な条件の下で培養できる。しかしながら、組換え細胞の増殖条件は、ＣＧ５３１３５の発現の条件とは異なることがある。変更した培養条件および培地を用いて、ＣＧ５３１３５の産生を高めることもできる。当技術分野で公知である任意の技術を応用し、ＣＧ５３１３５産生にとって最適な条件を確立することができる。
組換え技術によるＣＧ５３１３５またはその断片の生成方法の代替法は、ペプチド合成である。例えば、ＣＧ５３１３５全体またはＣＧ５３１３５の一部分に対応するタンパク質は、ペプチド合成装置を用いて合成することができる。通常のペプチド合成または当技術分野で周知である他の合成プロトコールを用いることができる。
ＣＧ５３１３５のアミノ酸配列またはその一部分を有するタンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９に記載されている手順に類似した手順を用いた固相ペプチド合成によって合成できる。合成の間、そのＣ末端によって連結され伸長していくポリペプチド、および不溶性のポリマー支持体、即ちポリスチレンビーズに、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を段階的に付加していく。タンパク質は、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることによって活性化したＮ−α−保護されているアミノ酸のα−カルボキシル基に連結して合成される。活性化されたカルボキシルへの遊離アミノ基の結合によってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基としては、酸不安定なＢｏｃおよび塩基不安定なＦｍｏｃが挙げられる。相応しい化学、樹脂、保護基、保護型アミノ酸、および試薬は当技術分野で周知であり、ここでは詳しく説明しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，１９９３、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
得られたＣＧ５３１３５の精製は、ゲル濾過、分配、および／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いた調製ＨＰＬＣのような通常の手順を用いて行える。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は当技術分野で周知であることから、ここでは詳しく述べない。
５．２．１ 改良型生成法
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を製造するための改良された製造プロセスを提供する。改良された製造プロセスは、より好適かつより純粋な製剤といった便益を提供すると同時に１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の商業規模の製造にも好適である。
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を製造するための改良された製造プロセスを提供する。改良された製造プロセスは、より好適かつより純粋な製剤といった便益を提供すると同時に１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の商業規模の製造にも好適である。
本発明はタンパク質を単離する方法を提供するが、前記方法は次の工程を含む：（１）ベクターを含む大腸菌のような宿主細胞を発酵する工程を含む工程であって、前記ベクターがＣＧ５３１３５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む工程。好ましい態様では、ベクターはコドンに最適な、完全長のＣＧ５３１３５−０５（配列番号８）を含む；（２）培養した細胞を溶解する工程。細胞は、当技術分野公知の方法により溶解できる。１つの態様では、細胞はホモジェナイゼーションによって溶解される。別の態様では、発酵培養細胞は凍結され、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、６０ｍＭのＥＤＴＡ、７．５ｍＭのＤＴＴ、３．５〜５Ｍ尿素、ｐＨ７．２を含む細胞溶解緩衝液で希釈され、次に、例えばホモジェナイゼーションによって溶解される。好ましい態様では、ホモジェナイゼーション前に発酵ブロスにポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）が加えられる；（３）カチオン交換カラムによる精製工程。好ましい態様では、事前に平衡化し膨潤させた、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ ＥＰ（登録商標）のようなベッドカチオン交換体を用いる。１つの態様では、単離するタンパク質をカチオン交換カラムにかけた後、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ硫酸ナトリウム、３〜５Ｍ尿素、ｐＨ７．０を含む追加の平衡化緩衝液でカラムをフラッシングする。カラムは、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０〜２５ｍＭ硫酸ナトリム、２．２２Ｍのデキストロース、ｐＨ７．０を含む緩衝液で更に洗浄してもよい。カチオン交換カラムからタンパク質を溶出させる溶出緩衝液は、例えば５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０〜２５０ｍＭ硫酸ナトリウム、０．５〜１ＭのＬ−アルギニン、ｐＨ７．０を含む；および（４）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（例えばＰＰＧ６５０Ｍ）を用いた更なる精製の工程。１つの態様では、親水性相互作用クロマトグラフィーカラム、例えばＰＰＧ ６５０Ｍを５０〜１００ｍＭ硫酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で平衡化および洗浄される。別の態様では、カラムは更に１００〜２５０ｍＭリン酸ナトリム、５ｍＭのＥＤＴＡ，０．８〜１Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で洗浄される。別の態様では、タンパク質は５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１〜０．３Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で溶出される。
好ましい態様では、上記の工程（４）で溶出されたタンパク質は次の工程のいずれか１つ、または両方によって更に精製できる：（５）溶出されたタンパク質を濾過することによって更に精製する工程。好ましい態様では、荷電エンドトキシン結合フィルター（例えばＣＵＮＯ（登録商標）３０ＺＡデプスフィルター）が用いられる。１つの態様では、フィルターはまず注射用の水でフラッシュされ、次に５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１〜０．３Ｍアルギニン、ｐＨ７．０でフラッシュされる；ならびに（６）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（例えばフェニルセファロースＨＰクロマトグラフィー）を用いて更に精製する工程。１つの態様では、カラムは５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０〜１００ｍＭ硫酸アンモニウム、８００〜１０００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５〜１Ｍのアルギニン、ｐＨ７．０で平衡化されて洗われる。別の態様では、タンパク質は５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、および０．５〜１Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で溶出される。
本発明の方法により単離されたタンパク質をさらに濃縮および濾過して薬剤を製造してもよい。薬学的担体を加え、本発明により提供される調合物のような所望の調合物を製造することもできる。
５．３ ＣＧ５３１３５の特徴付け
本発明の生成方法により精製されたタンパク質または本発明の生成方法の中間産物の特徴（例えば純度、ＣＧ５３１３５の生物活性を含む様々な特徴）は、当技術分野公知の方法によって決定できる。治療で使用するための組成物は、ヒトで試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギを含むがこれらに限定されない、好適な動物モデル系で試験することができる（このような試験の例は、米国特許出願第０９／９９２，８４０号、第１０／０１１，３６４号、第１０／３２１，９６２号、１０／４３５，０８７号、１０／８４２，２０６号、および１０／８４２，１７９号に見いだすことができ、それぞれの開示は参照によって本明細書に組み入れられている）。
本発明の生成方法により精製されたタンパク質または本発明の生成方法の中間産物の特徴（例えば純度、ＣＧ５３１３５の生物活性を含む様々な特徴）は、当技術分野公知の方法によって決定できる。治療で使用するための組成物は、ヒトで試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギを含むがこれらに限定されない、好適な動物モデル系で試験することができる（このような試験の例は、米国特許出願第０９／９９２，８４０号、第１０／０１１，３６４号、第１０／３２１，９６２号、１０／４３５，０８７号、１０／８４２，２０６号、および１０／８４２，１７９号に見いだすことができ、それぞれの開示は参照によって本明細書に組み入れられている）。
例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ」）、ウエスタンブロット（例えば宿主細胞タンパク質のウエスタンブロット）を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の方法を用いて、本発明の製造プロセス産物の純度を分析することができる。好ましい態様では、本発明の製造プロセスの産物のデンシトメトリーによる純度は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。別の好ましい態様では、本発明の製造プロセスの産物の、デンシトメトリーによる純度は９７％より高く、９８％より高く、または９９％よりも高い。
ウエスタンブロット、シーケンシング（例えばＮ−末端エドマン配列決定法）、液体クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、ＵＶおよびエレクトロスプレー質量分析検出装置の両方を具えたＲＰ−ＨＰＬＣ）、質量分析法、全アミノ酸分析、ペプチドマッピング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような、しかしこれらに限定されない当技術分野で公知な方法を用いて、本発明の製造プロセスの産物の識別点を決定できる。本発明の製造プロセス産物の二次、三次および／または四次構造は当技術分野で公知である任意の方法によって分析でき、例えば遠紫外円偏光二色性分光法を用いて二次構造を分析でき、近赤外円偏光二色性分光法および二次導関数ＵＶ吸光分光法を用いて三次構造を分析でき、光散乱ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて四次構造を分析できる。
本発明の製造プロセス産物の有効性は、当技術分野で公知である方法、またはＣＧ５３１３５タンパク質の１つまたは複数の生物活性を測定する任意のバイオアッセイによって測定できる。１つの態様では、本発明の製造プロセス産物の有効性は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の細胞増殖を刺激する産物の能力によって測定される（例えばこのようなアッセイについては、６．５節を参照）。
安全性（例えば残留ＤＮＡ、エンドトキシン、汚染微生物数）、ｐＨ、浸透性、スルフヒドリル含有量のような本発明の製造プロセス産物の別の特徴も、当技術分野で公知である任意の方法（このような方法の例については、６節を参照）によって分析できる。このような方法は当技術分野において周知であるため、ここでは詳しく説明しない。
１つの態様では、改良された製造プロセスからのバルク製剤原料の標本であるＣＧ５３１３５タンパク質参照標準物が調製され、特徴が調べられる。好ましくは、この参照標準物は、その純度、識別点（例えば分子量、アミノ酸配列）、有効性、構造（例えば二次、三次、および四次構造）、安全性（例えばエンドトキシン、汚染微生物数）および、ｐＨ、浸透性およびスルフヒドリル含有量のような、しかしこれらに限定されないその他の特徴について特徴付けされる。目視検査では、ＣＧ５３２４５タンパク質参照標準物は透明で無色でなければならない。ＣＧ５３１３５タンパク質参照物が確立されたならば、それを、例えば製造プロセスの品質管理、およびＣＧ５３１３５に関係する他のアッセイの陽性コントロールとして用いることができる。
５．４ 予防的および治療的な使用
本発明は、それを必要とする被験体に、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を有効量投与することを含む、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）またはそれらの１つもしくは複数の症状を予防および／または治療する方法を提供する。
本発明は、それを必要とする被験体に、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を有効量投与することを含む、疾患（例えば消化器粘膜炎、ＩＢＤ、過敏性腸症候群、関節炎、発作、放射線関連疾患）またはそれらの１つもしくは複数の症状を予防および／または治療する方法を提供する。
５．４．１ 消化器粘膜炎
１つの態様では、本発明は消化器粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。発明の方法により阻止および／または治療が可能な消化器粘膜炎としては、口腔粘膜炎、食道炎、口内炎、腸炎、および直腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、発明の方法は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む有効量の組成物を、消化管内の一カ所以上の領域に粘膜炎がある被験体（例えば口腔粘膜炎と腸炎の両方に罹っている被験体）に投与することを含む。幾つかの態様では、発明の方法は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む有効量の組成物を、消化管内の一カ所の領域だけに粘膜炎がある被験体（例えば口腔粘膜炎だけに罹っている被験体または腸炎だけに罹っている被験体）に投与することを含む。好ましい態様では、発明の方法により予防および／または治療できる消化管粘膜炎（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）は口腔粘膜炎である。いくつかの態様では、発明の方法により予防および／または治療できる消化管粘膜炎は口腔粘膜炎ではない。消化管粘膜炎は、例えば化学的傷害、放射線的傷害、生物学的傷害（例えば細菌）、またはそれらの組合せによって誘導されてもよい。
１つの態様では、本発明は消化器粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。発明の方法により阻止および／または治療が可能な消化器粘膜炎としては、口腔粘膜炎、食道炎、口内炎、腸炎、および直腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、発明の方法は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む有効量の組成物を、消化管内の一カ所以上の領域に粘膜炎がある被験体（例えば口腔粘膜炎と腸炎の両方に罹っている被験体）に投与することを含む。幾つかの態様では、発明の方法は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む有効量の組成物を、消化管内の一カ所の領域だけに粘膜炎がある被験体（例えば口腔粘膜炎だけに罹っている被験体または腸炎だけに罹っている被験体）に投与することを含む。好ましい態様では、発明の方法により予防および／または治療できる消化管粘膜炎（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）は口腔粘膜炎である。いくつかの態様では、発明の方法により予防および／または治療できる消化管粘膜炎は口腔粘膜炎ではない。消化管粘膜炎は、例えば化学的傷害、放射線的傷害、生物学的傷害（例えば細菌）、またはそれらの組合せによって誘導されてもよい。
幾つかの態様では、本発明は、消化管片膜炎に罹った患者集団および消化管粘膜炎を発症するリスクを持った集団における消化管粘膜炎の予防および／または治療の方法を提供する。１つの態様では、本発明は放射線治療および／または化学療法による治療を受けている被験体の消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、放射線治療および／または化学療法による治療を受ける予定の被験体に、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与することによって、消化管粘膜炎を予防する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、自己または同種造血幹細胞移植のための状態調整骨髄機能廃絶放射線治療および／または化学療法による治療を受けている被験体の消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。別の特定の態様では、本発明は粘膜炎誘発剤による粘膜毒性化学療法を受けた、または受けている被験体（例えばシタラビン治療を受けている白血病患者）の消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、補助的化学療法と共に、または無しに放射線治療による治療を受けている頭部および／または頸部癌に罹った被験体の消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、消化管粘膜炎を誘発する可能性のある傷害（例えば化学的傷害、放射線傷害、生物学的傷害、またはそれらの組合せ）が被験体に生ずる前に、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与することを含む消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、消化管粘膜炎を誘発する可能性のある傷害（例えば化学的傷害、放射線傷害、生物学的傷害、またはそれらの組合せ）が被験体に生じた後であるが、しかし被験体に消化管粘膜炎が発生する前に１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与することを含む消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、被験体に消化管粘膜炎が発生した後に、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与することを含む消化管粘膜炎を治療する方法を提供する。
幾つかの態様では、本発明は１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を周期的に投与することを含む、消化管粘膜炎を予防および／または治療する方法を提供する。１つの態様では、周期的治療は、ある期間第一治療薬を投与し、続いてある期間第二治療薬を投与し、この連続する投与、即ち周期を繰り返して、例えば治療薬の一方が有する副作用を回避または軽減し、かつ／あるいは治療薬の効力を高めることを包含する。別の態様では、周期的治療は、ある期間治療薬を投与すること、ある期間治療薬を停止すること、および治療薬の投与を繰り返すことを包含する。本発明によれば、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、放射線治療および／または化学療法が周期的治療である場合には、放射線治療および／または化学療法が投与される前、最中、または後に被験体に投与できる。
本発明によれば、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、消化管粘膜炎を予防および／または治療する他の治療薬と一緒に用いることができる。１つの態様では、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、消化管粘膜炎に対し予防効果および／または治療効果を有し、かつ／あるいは消化管粘膜炎に関連する１つまたは複数の症状に対し改善効果を有する他の薬剤の１つ、または複数と一緒に被験者に投与され、消化管粘膜炎を予防および／または治療する。このような薬剤の非限定例としては：粘膜保護剤（例えばスクラフフェート、コロイド状ビスマス）、抗生物質、抗真菌剤（例えばフルコナゾール、アンホテルシンＢ）、抗ウイルス剤（例えばアシクロビル）、制吐剤（例えばフェノチアジン、ブチロフェノン、ベンゾジアゼピン、コルチコステロイド、カンナビノイド、５−ＨＴ３セロトニンレセプターブロッカー）、下痢止め剤（例えばジフェノキシレート、ロペラミド、カオリン、ペクチン、メチルアセルロース、活性化アタパルガイド、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ））、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、Ｌ−グルタミン、アミホステン、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）がある。別の態様では、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、消化管粘膜炎軽減効果を有する、１つまたは複数の他治療薬と共に投与される。このような治療の非限定例は：リドカインのような局所性鎮痛薬の塗布、および／または麻酔薬および抗菌剤の全身投与、リン酸カルシウムの有無に関係ないフッ化物の局所適用、機械的なプラークの除去、歯科用スポンジ、口腔を冷やす氷片の吸引、各種感染薬を使った口腔洗浄、局所麻酔を使った口腔洗浄がある。
５．４．２．放射線保護および幹細胞への刺激効果
１つの態様では、本発明は放射線曝露、化学療法、化学／生物兵器、および／または体内の急速に増殖する組織に影響を及ぼすその他傷害に関係した（例えば原因とする）１つまたは複数の疾患、あるいはそれらの１つまたは複数の症状を、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、被験体に予防的または治療的に有効な量投与することによって予防および／または治療する方法を提供する。
１つの態様では、本発明は放射線曝露、化学療法、化学／生物兵器、および／または体内の急速に増殖する組織に影響を及ぼすその他傷害に関係した（例えば原因とする）１つまたは複数の疾患、あるいはそれらの１つまたは複数の症状を、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、被験体に予防的または治療的に有効な量投与することによって予防および／または治療する方法を提供する。
幾つかの態様では、本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、上皮細胞および／または間葉細胞の病変を予防および／または治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、上皮細胞および／または間葉細胞の増殖、分化、または移動を刺激する方法を提供する。
上皮膜は、細胞間結合と呼ばれる密な接触に特殊化した特徴的な部位を有する、連続する細胞の境界を有する連続する細胞シートである。このような膜は、１つまたは複数細胞の厚みであり、毛細血管を含んでいない。上皮はその下にある結合組織と、基底膜として知られる構成要素によって結合しており、基底膜は上皮と結合組織間に薄層として分布している複雑な組成を有する細胞内物質の層である。
層状構造を有するケラチン化していない扁平上皮は一般的に、吸収機能を必要としない、大きな摩耗および断裂を受ける湿潤した表皮上に存在している。このような表面を湿った状態に保つのに必要な分泌物は、適切に配置された腺から供給される。このタイプの上皮に裏打ちされている部位としては、食道および口腔の床部および側部が挙げられる。
単層円柱上皮は、集合して六角形パターンを形成する背の高い細胞の単層から形作られている。単層分泌円柱上皮では、円柱細胞は全て保護的な役割に加えて、粘膜を分泌するように特殊化している。このタイプの上皮の部位は、胃の内層に在る。
吸収細胞および分泌細胞から出来ている単層円柱上皮は、腸を裏打ちしている。吸収を促進するために、この膜は一細胞の厚みしかない。吸収に特殊化した細胞は散在し、保護粘液を分泌する杯細胞が多く存在している。
間葉細胞は、例えば骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞に分化できる幹細胞である。間葉細胞−上皮の相互作用は、上皮組織の生理および病理に重要な役割を果たしている。間葉細胞には上皮基底膜（例えば周皮細胞および血管周囲単球由来細胞（ＭＤＣ））が付属するか、または上皮内に存在することもある（ＭＤＣおよびＴ細胞）。間葉細胞と組織特異的細胞との間の相互作用の性質は、組織のタイプ（例えば脳血管上皮）、または特定の上皮内に存在する間葉細胞による、細胞の自殺状態（アポトーシス）への分化の予防または容認／促進に依存するだろう。周皮細胞、ＭＤＣ、およびＴリンパ細胞のような特殊化した間葉細胞は、上皮細胞の分化および老化に大きな影響を及ぼすだろう。
骨洞の間質コンパートメントは、相互に連絡した間葉細胞の網状構造から出来ている。間質細胞は骨皮質、骨梁、および造血細胞と密接に結びついている。骨髄−基質の微小環境は、細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と成長因子およびサイトカインの複合体であり、個体の生涯を通して局所的な骨形成および造血を制御している。骨の生理および造血に関する微小環境の創造では、骨髄基質の役割は特殊な間質細胞の小集団が果たしている。これらの細胞は共通の幹細胞から、それぞれが異なる役割を有する特殊な株に分化する。これら細胞の機能が集合して３−Ｄ−構造が調和的に統合され、骨の中に活動的な骨髄が維持される。
成体では、血液細胞は、体部骨を満たす海綿状物質である骨髄によって産生されている。骨髄は２つの血液細胞群、即ち骨髄性血液細胞とリンパ系血液細胞を作る。骨髄性細胞株としては、例えば次のものが挙げられる：（１）後に赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）に発生するエリスロサイト（Ｅｒｙｓｔｈｒｏｃｙｔｅ）と呼ばれる未成熟細胞；（２）血液凝固細胞（血小板）；（３）マクロファージ（異物粒子のスカベンジャーとして機能する）、好酸球（アレルギーの引き金となり、また寄生虫に対する防御を行う）、および好中球（細菌感染に対する主な防御因子）を含む幾種類かの白血球を含む。リンパ株、例えばリンパ細胞は、体部の第一の抗感染細胞である。その他の生命機能として、ある種のリンパ細胞は、特定の異物（抗原）を標的として攻撃する因子である抗体の産生を担当している。リンパ細胞は胸腺または骨髄の中で発生し、それ故にＢ−細胞（骨髄由来細胞）またはＴ−細胞（胸腺由来細胞）のいずれかに分類される。
本発明によれば、ＣＧ５３１３５は上皮細胞および／または間葉細胞の増殖、分化、および／または移動を制御し、それにより上皮細胞および／または間葉細胞の病理に関係する疾患に予防的および／または治療的な効果を有している。
幾つかの態様では、発明の方法により用いられる組成物は、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２０の断片、誘導体、改変体、相同体、または類似体、あるいはそれらの組合せを含む。幾つかの態様では、発明の方法に従って用いられる組成物は、ＣＧ５３１３５−０１（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０２（配列番号４）、ＣＧ５３１３５−０３（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０４（配列番号７）、ＣＧ５３１３５−０５（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０６（配列番号１０）、ＣＧ５３１３５−０７（配列番号１２）、ＣＧ５３１３５−０８（配列番号１４）、ＣＧ５３１３５−０９（配列番号１６）、ＣＧ５３１３５−１０（配列番号１８）、ＣＧ５３１３５−１１（配列番号２０）、ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２２）、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２４）、ＣＧ５３１３５−１４（配列番号２６）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号３０）、ＣＧ５３１３５−１７（配列番号３２）、ＩＦＣ２５００５９６２９（配列番号３４）、ＩＦＣ２００５９６６９（配列番号３６）、ＩＦＣ３１７４５９５５３（配列番号３８）、ＩＦＣ３１７４５９５７１（配列番号４０）、ＩＦＣ２５００５９５９６（配列番号１０）、またはＩＦＣ３１６３５１２２４（配列番号１０）、あるいは任意の二またはそれ以上のＣＧ５３１３５タンパク質の組合せを含む。１つの態様では、本発明の方法に従って用いられる組成物は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、本発明の方法に従って用いられる組成物は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（５）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、本発明の方法に従って用いられる組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（５）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、本発明の方法に従って用いられる組成物は（１）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。さらに別の態様では、本発明の方法に従って用いられる組成物は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、（５）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（６）配列番号２４のアミノ酸配列を含むカルバミル化されたタンパク質、および（７）配列番号２のアミノ酸配列を含むカルバミル化されたタンパク質を含む。
幾つかの態様では、急速に増殖している組織に影響する傷害は、放射線曝露である。特定の態様では、傷害源はイオン化放射線である。別の態様では、傷害源は１つまたは複数の化学療法、あるいは１つまたは複数の化学／生物兵器（例えば発泡剤または細菌）、あるいはそれらの組合せでよい。化学療法および化学／生物兵器の非限定例は、アルキル化剤、発泡剤（例えばマスタード剤）および微生物である。幾つかの態様では、急速に増殖する組織に影響する傷害源は、１つまたは複数の放射線曝露、１つまたは複数の化学療法、１つまたは複数の化学／生物兵器、あるいはそれらの組合せである。
イオン化放射線のような傷害の作用に最も敏感な臓器および体部システムとしては、皮膚、造血およびリンパ系、生殖腺、肺、神経組織、およびＧＩ管が挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様では、傷害は特に被験体の造血組織および／または胃腸管組織を損傷する。特定の態様では、予防または治療対象となる障害は、貧血、白血球減少症（例えば好中球減少症）、血小板減少症、汎血球減少症、および凝固障害を含むがこれらに限定されない造血障害である。別の態様では、予防または治療対象となる障害は口腔粘膜炎、食道炎、口内炎、腸炎、および直腸炎を含むがこれに限定されない消化管粘膜炎である。別の態様では、予防または治療対象となる障害は脳血管シンドロームである。幾つかの態様では、急速増殖組織に影響する傷害（放射線、化学療法、および化学／生物兵器のような）に関連する症状としては、下痢、皮膚火傷、触痛、疲労、脱水、炎症、脱毛、口腔粘膜の潰瘍、口腔乾燥、および出血（例えば鼻、口、または直腸から）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、被験体の酸素消去経路をアップレギュレーションする方法を提供し、前記方法は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む。１つの態様では、酸素消去経路は、細胞内ＣｕＺｎＳＯＤおよびＭｎＳＯＤ、ならびに細胞外−ＳＯＤ（「ＥＣ−ＳＯＤ」）を含むがこれらに限定されない、スーパーオキサイドジスムターゼ（「ＳＯＤ」）を１つまたは複数含む。別の態様では、酸素消去経路はＥＲＫ、ＡＫＴ、スーパーオキサイドジスムターゼ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ＣＯＸ−２」）およびＮｒｆ−２から成る群より選択される遺伝子を含む。放射線に曝露した細胞は、Ｈ２Ｏのイオン化によって細胞内で生成される最も反応性の高い種であるイオン化ラジカル（反応性酸素種またはＲＯＳ）の障害効果に曝される。被験体への１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の投与は、ＲＯＳを排除し、それを過酸化水素のような低反応性中間体に変換するスーパーオキシダーゼのような酵素の転写を増加させる。被験体への１つまたは複数のＣＧ５３１３５の投与は、放射線のような傷害源により誘発された反応性酸素種の付加も下げる。
本発明は、被験体の細胞に由来する１つまたは複数の内因性サイトカインおよび／または内因性ケモカインの分泌を刺激する、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を更に提供する。分泌される内因性サイトカインは、インターロイキン（「ＩＬ」）−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、および顆粒球コロニー形成因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）でよいが、これらに限定されない。分泌される内因性ケモカインは、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（「ＣＸＣＬ１」）および単球化学誘因物質（「ＭＣＰ−１」）でよいが、これらに限定されない。これら内因性サイトカインおよびケモカインの幾つかは、内因性の放射線保護反応に関係していることが示されている。
本発明は、被験体の造血幹細胞および／または胃腸管幹細胞の増殖を促進する方法であって、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を被験体に投与する方法を提供する。１つの態様では、被験体への１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の投与は、骨髄基質内の線維芽細胞を刺激して、造血幹細胞の健康および増殖能力を増強する因子を分泌させる。別の態様では、被験体への１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の投与は、胃腸管幹細胞の急速な爆発的増殖をもたらし、これに続いて２４時間後にこの増殖に対向する制御的な阻害がかかる。これにより組織レベルの細胞周期は同調化し、これはより放射線耐性である。
本発明はまた、被験体の造血幹細胞の移植を最適化する方法であって、被験体に１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を投与することを含む方法も提供する。１つの態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の投与は、放射線によって骨髄を無力化した後の骨髄移植に続くＴ細胞の移植または集団再形成の成功率を高める。別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の投与は、骨髄移植後の胸腺内でのＴ細胞再形成の速度を速める。
本発明の方法の使用対象患者集団としては、急速に増殖している組織に影響する傷害源（例えば放射線、化学療法、および化学／生物兵器）に曝されたことのある被験体、急速に増殖している組織に影響する傷害源（例えば放射線、化学療法、および化学／生物兵器）に曝されたことが疑われる被験体、急速に増殖している組織に影響する傷害源（例えば放射線、化学療法、および化学／生物兵器）に曝される可能性がある被験体、および急速に増殖している組織に影響する傷害源（例えば放射線、化学療法、および化学／生物兵器）に曝されるリスクのある被験体が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、体内の急速に増殖している組織を傷害する傷害源に被験体が曝される前に、被験体に投与される。別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、体内の急速に増殖している組織を傷害する傷害源に被験体が曝された後であるが、被験体にそれに関係する傷害または症状が発生する前に被験体に投与される。別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、体内の急速に増殖している組織を傷害する傷害源に被験体が曝された後に被験体に投与される。更に別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、急速に増殖している組織に影響する傷害に曝されたリスクを持つ被験者に投与される。
１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、急速に増殖している組織に影響する傷害源（放射線、化学療法、および化学／生物兵器のような）に関連した１つまたは複数の障害または症状を予防、治療、または軽減する、１つまたは複数のその他治療法と組み合わせて投与することもできる。好ましい態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、急速に増殖している組織に影響する傷害源（放射線、化学療法、および化学／生物兵器のような）に関連した１つまたは複数の障害または症状の予防、治療、または軽減への使用が公知である１つまたは複数のその他の治療法と組み合わせて投与される。かかるその他治療の例としては、メスナ（２−メルカプトエテンスルホネートナトリウム）およびその他の遊離チオール成分を有する類似体、ジメスナ（２’−ジチオビスエタンスルホネート２ナトリウム）およびその他のジスルフィド、ならびに、例えば米国特許出願第２００３００９２６８１号に記載されているような化合物、およびＫＧＦ（例えば米国特許第６，７４３，４２２号を参照）。ＣＧ５３１３５を含む組成物と組み合わせて用いることができる、その他作用物質の例を表１Ｂに示す。
１つの態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質、および１つまたは複数のその他治療薬を含む組成物は、同一患者来院時に投与される。別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、１つまたは複数のその他治療薬が投与される前に投与される。更に別の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、１つまたは複数のその他治療薬に続いて投与される。特定の態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質、および１つまたは複数のその他治療薬を含む組成物は、被験体に周期的に投与される。周期的治療は、ある期間第一治療薬を投与し、続いてある期間第二治療薬を投与し、この連続する投与、即ち周期を繰り返して、例えば治療薬の一方が有する副作用を回避または軽減し、かつ／あるいは治療薬の効力を高めることを包含する。周期的治療は、１つまたは複数の治療薬に対する耐性の発生を減らし、治療薬の１つの副作用を回避または軽減し、ならびに／あるいは治療の効果を改善できる。
５．４．３．炎症性腸疾患および過敏性腸症候群
１つの態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に有効量投与することを含む、炎症性腸疾患または過敏性腸症候群を予防および／または治療する方法を提供する。発明の方法により予防および／または治療できる炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に有効量投与することを含む、炎症性腸疾患または過敏性腸症候群を予防および／または治療する方法を提供する。発明の方法により予防および／または治療できる炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、炎症性腸疾患に罹った患者集団の炎症性腸疾患を発症するリスクのある集団の炎症性腸疾患を予防および／または治療する方法を提供する。本発明はまた、過敏性腸症候群にかかった患者集団および過敏性腸症候群を発症するリスクのある集団での過敏性腸症候群を予防および／または治療する方法も提供する。
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号２、４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、もしくは４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；（ｂ）（ａ）のタンパク質に対し１つまたは複数の置換があるタンパク質であって、前記置換が配列番号２、４，７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、もしくは４０のアミノ酸配列の１５％を越えず、かつ前記１つまたは複数のアミノ酸置換があるタンパク質が細胞増殖刺激活性を保持しているタンパク質；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、細胞増殖刺激活性を保持している断片から成る群より選択された、単離されたタンパク質を、これを必要とする被験体に有効量投与することを含む、炎症性腸疾患または過敏性腸疾患を予防または治療する方法を提供する。
幾つかの態様では、本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を周期的に投与することを含む、炎症性腸疾患または過敏性腸疾患を予防および／または治療する方法を提供する。１つの態様では、周期的治療は、第一治療薬をある期間投与し、続いて第二治療薬をある期間投与し、この連続する投与、即ち周期を繰り返して、例えば治療薬の一方が有する副作用を回避または軽減し、かつ／あるいは治療薬の効力を高めることを包含する。別の態様では、周期的治療は、治療薬をある期間投与すること、治療薬をある期間停止すること、および治療薬の投与を繰り返すことを包含する。
本発明によれば、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、他の治療薬と組み合わせて使用され、炎症性腸疾患および／または過敏性腸疾患を予防および／または治療できる。１つの態様では、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、炎症性腸疾患に対し予防および／または治療効果を持ち、かつ／あるいは炎症性腸疾患に関係する、１つまたは複数の症状に対し改善効果を有する、１つまたは複数のその他治療薬と組み合わせて被験体に投与され、炎症性腸疾患を予防および／または治療する。このような治療薬の非限定例は：５−アミノサリチル酸、抗生物質、コルチコステロイド、免疫調整剤（例えば６−メルカプトプチン、アザチオプリン、メトトレキセート、シクロスポリン）、および生物反応変更因子（例えばインフリキシマブ）である。別の態様では、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は、過敏性腸症候群に対し予防および／または治療効果を有する、ならびに／あるいは過敏性腸症候群に対し予防および／または治療効果を有する、１つまたは複数のその他治療薬と組み合わせて被験者に投与され、炎症性腸疾患を予防および／または治療する。このような治療薬の非限定例は：ラキサチブ；下痢止め剤（例えばジフェノキシレート（例えばロモチル、ロモコット）；ロペラミド（例えばイモジウム、ペプトジアリア（Ｐｅｐｔｏ Ｄｉａｒｒｈｅａ））、コレスチラミン（例えばクエストラン、コリバール（Ｃｈｏｌｙｂａｒ））；鎮痙薬（例えばジシクロミン、ヒオスシアミン、およびクリジニウム（塩酸クロルジアゼポキシドと組み合わせて））；ペパーミントオイル；直接平滑筋弛緩剤；抗鬱剤；５−ＨＴ３アンタゴニスト（例えばアロセトロン（ロトロネクス）、シランセトロン）；５−ＨＴアゴニスト（例えばテガセロド（ゼルノーム（Ｚｅｌｏｎｏｒｍ）／ゼルマック）およびプルカロプリド）；Ｍ３レセプターアンタゴニスト（例えばザミフェナチンおよびダリフェナチン）である。
５．４．４．関節炎およびＣＮＳ系または心臓血管系に関係する疾患
１つの態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患（例えば関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患）を予防および／または治療する方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患（例えば関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患）を予防および／または治療する方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む関節炎（例えば骨関節炎またはリウマチ関節炎）を予防および／または治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む軟骨変性を軽減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、軟骨修復を促進する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を被験体に投与することを含む、手術後の被験体の軟骨治癒を促進する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を被験体に投与することを含む、発作（例えば虚血性発作、出血性発作）のような心血管疾患を予防および／または治療する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、配列番号４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、もしくは４０のアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを含む単離されたタンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む、発作のような心血管疾患を予防および／または治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、萎縮性側索硬化症、ハンチントン病）を予防および／または治療する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、配列番号４、７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、もしくは４０のアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを含む単離されたタンパク質を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患を予防および／または治療する方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を周期的に投与することを含む、疾患（例えば関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患）を予防および／または治療する方法を提供する。１つの態様では、周期的治療は、ある期間第一治療薬を投与し、続いてある期間第二治療薬を投与し、この連続する投与、即ち周期を繰り返して、例えば治療薬の一方が有する副作用を回避または軽減し、かつ／あるいは治療薬の効力を高めることを包含する。別の態様では、周期的治療は、ある期間治療薬を投与すること、ある期間治療薬を停止すること、および治療薬の投与を繰り返すことを包含する。本発明によれば、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、放射線治療および／または化学療法が周期的治療である場合に、放射線治療および／または化学療法が投与される前、最中、または後に被験体に投与できる。
本発明によれば、単離されたＣＧ５３１３５タンパク質を１つまたは複数含む組成物は他の治療薬と組み合わせて用い、疾患（例えば関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患）を予防および／または治療することもできる。１つの態様では、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物は、疾患（例えば関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患）に対し予防および／または治療効果を有する、ならびに／あるいは疾患に関係する１つまたは複数の症状の改善効果を有する１つまたは複数のその他薬剤と組み合わせて被験者に投与され、疾患を予防および／または治療する。関節病、虚血性発作、出血性ショック、外傷、脊髄損傷、重金属中毒、または神経変性疾患のような疾患を予防および／または治療することができる当技術分野で公知である任意のその他薬剤または治療薬が、本発明の方法による１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物と組み合わせて用いることができる。特定の態様では、本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む、手術後の被験体の軟骨治癒を促進する方法を提供する。
５．５ 投与レジメン
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を致死させる投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある投与量）の決定については、細胞培養または実験動物を用いた標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、この指数はＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。高い治療指数を持つ予防薬および／または治療薬が好ましい。有毒な副作用を持つ予防薬および／または治療薬は用いることはできるが、このような薬物が患部組織部位を標的とするようにして、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にとどめ、これにより副作用を低減させるようにデリバリーシステムを設計するように心がけなければならない。
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を致死させる投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある投与量）の決定については、細胞培養または実験動物を用いた標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、この指数はＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。高い治療指数を持つ予防薬および／または治療薬が好ましい。有毒な副作用を持つ予防薬および／または治療薬は用いることはできるが、このような薬物が患部組織部位を標的とするようにして、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にとどめ、これにより副作用を低減させるようにデリバリーシステムを設計するように心がけなければならない。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための予防薬および／または治療薬の投与量範囲の作成に用いることができる。このような薬物の投与量は、毒性がほとんど無いか、全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、用いる投与形態および利用する投与経路に応じてこの範囲内の中で変えることができる。発明の方法で用いる薬剤について、治療有効投与量は、まずは細胞培養アッセイによって推測できる。投与量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（即ち症状の半最大阻止を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を動物モデルにおいて得ることができるように定めることができる。このような情報を用いて、ヒトで有用な投与量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。
特定の障害または状態の治療に有効である発明の組成物の量は、障害または状態の性質に依存し、それは標準的な臨床技術によって決定できる。調合物に用いられる正確な用量もまた投与経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、これらは医師の判断および各患者の環境に合わせて決定されなければならない。
１つの態様では、発明が提供する、ヒト患者に投与する、１つまたは複数のＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ（ＵＶアッセイにより測定した場合）である。別の態様では、本発明が提供する、ヒト患者へ投与するための、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜５ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜１ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．９ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．８ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．７ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．６ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．００５〜０．３ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．９ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．８ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．７ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．６ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、または０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇの間である（ＵＶアッセイで測定した場合）。
タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイまたはＵＶアッセイのような当技術分野で公知である方法によって測定でき、濃度はどのアッセイを用いたかによって変わることがある。非限定例では、本発明の薬学的組成物のタンパク質濃度は、２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸収の直接測定を用いるＵＶアッセイ、および良く特徴付けされたＣＧ５３１３５タンパク質の参照標準物（ＩｇＧの代わりに）を用いて測定される。このＵＶ法を用いて得た試験結果（ＣＧ５３１３５参照標準物）は、ブラッドフォード法を用いて同サンプルを試験した場合（キャリブレータとしてＩｇＧを用いる）の試験結果よりも三倍低い。例えば、本発明が提供する、ヒト患者へ投与するための、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、ＵＶアッセイで測定した時に０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、従ってブラッドフォードアッセイで測定した時に０．００３〜３０ｍｇ／ｋｇである。
１つの態様では、全投与量を初めて投与する前に、発明の組成物を少量（例えば記載投与量の１／１００〜１／１０）皮下注射して急性不寛容を検出することが好ましい。注射部位を試験後１および２時間後に検査する。反応が見つからない場合には、全投与量を投与する。
５．６ 薬学的組成物および調合物
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物（調合物を含む）を包含する。薬学的組成物を予防的有効量または治療的有効量を被験体に投与して、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）、過敏性腸症候群、消化管粘膜炎（口腔粘膜炎を含む）、関節炎、中枢神経系もしくは心臓血管系に関係する疾患のような、１つまたは複数の疾患、および放射線曝露に関係する症状を予防および／または治療することができる。様々なデリバリーシステムが公知であり、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与に用いることができる。このようなデリバリーシステムとしては、リポソームへの封入化、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたはその他ベクターの一部としての発明の核酸の構築等が挙げられるが、これらに限定されない。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、くも膜下、脳室内、硬膜外、静脈内、皮下、鼻内、腫瘍内、経皮、直腸、および口腔経路が挙げられるが、これらに限定されない。発明の組成物は、任意の通常の経路、例えば注入または大量注射、上皮もしくは粘膜下層（例えば口腔粘膜、膣粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収による経路から投与でき、かつ他の生物活性作用物質と一緒に投与することもできる。投与は全身性にも局所性にもできる。特定の態様では、本発明は、好ましくは針安全装置を鋭利な針を具えた、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が前もって充填されている単一またはデュアルチャンバーシリンジを含む。１つの態様では、二重チャンバーシリンジ（例えば、Ｖｅｔｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｒ−Ｆｅｒｔｉｇｕｎｇ社製Ｖｅｔｔｅｒ Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔデュアルチャンバーシリンジ）が用いられる。このようなシステムは、凍結乾燥された調合物にとって望ましく、緊急時に特に有用である。
本発明は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物（調合物を含む）を包含する。薬学的組成物を予防的有効量または治療的有効量を被験体に投与して、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）、過敏性腸症候群、消化管粘膜炎（口腔粘膜炎を含む）、関節炎、中枢神経系もしくは心臓血管系に関係する疾患のような、１つまたは複数の疾患、および放射線曝露に関係する症状を予防および／または治療することができる。様々なデリバリーシステムが公知であり、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与に用いることができる。このようなデリバリーシステムとしては、リポソームへの封入化、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたはその他ベクターの一部としての発明の核酸の構築等が挙げられるが、これらに限定されない。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、くも膜下、脳室内、硬膜外、静脈内、皮下、鼻内、腫瘍内、経皮、直腸、および口腔経路が挙げられるが、これらに限定されない。発明の組成物は、任意の通常の経路、例えば注入または大量注射、上皮もしくは粘膜下層（例えば口腔粘膜、膣粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収による経路から投与でき、かつ他の生物活性作用物質と一緒に投与することもできる。投与は全身性にも局所性にもできる。特定の態様では、本発明は、好ましくは針安全装置を鋭利な針を具えた、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が前もって充填されている単一またはデュアルチャンバーシリンジを含む。１つの態様では、二重チャンバーシリンジ（例えば、Ｖｅｔｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｒ−Ｆｅｒｔｉｇｕｎｇ社製Ｖｅｔｔｅｒ Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔデュアルチャンバーシリンジ）が用いられる。このようなシステムは、凍結乾燥された調合物にとって望ましく、緊急時に特に有用である。
幾つかの態様では、発明の薬学的組成物は治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいだろう。これは、例えば局所的な塗布により、注射により、注入ポンプにより、坐剤を手段として、または移植を手段として達成できる（移植物は、シアル性メンブレンのようなメンブレン、またはファイバーを含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン性材料のリザーバーである）。
幾つかの態様では、ＣＧ５３１３５核酸は、核酸を適切な核酸発現ベクターとして構築すること、およびその核酸を、例えばレトロウイルスベクターを用いることによって、または筋肉内もしくは皮内に直接注射することによって、または微粒子ボンバートメント（例えば遺伝子銃）を用いて、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって細胞内に入るようにして投与することによって、あるいはその核酸を核内に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドと結合した状態で投与することによって、インビボに投与して、それらがコードしているタンパク質の発現を促進することができる。または、ＣＧ５３１３５核酸は、発現のために、細胞内に導入して相同的組み換えによって宿主ＤＮＡ内に組み入れることもできる。
本発明は、単位投与形態の調製に用いることができる薬学的組成物の製造に有用なバルク薬剤組成物を包含する。好ましい態様では、発明の組成物は薬学的組成物である。このような組成物は、予防的有効量または治療的有効量のＣＧ５３１３５、および薬学的許容される担体を含む。好ましくは、薬学的組成物は、被験体への投与経路に好適な形に調合される。
１つの態様では、用語「薬学的に許容される」とは、ヒトへの使用について連邦政府または州政府の監督官庁により承認されているか、または米国薬局方掲載されているか、または一般的に安全であると認識されているその他物質であることを意味する。用語「担体」は、ＣＧ５３１３５と一緒に投与される希釈剤、補助剤、増量剤（例えば塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはショ糖）、賦形剤、あるいはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、水または油（ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油等のような石油、動物、植物または合成起源の油）のような無菌の液体、あるいは希釈材、香味剤、安定化剤、潤滑剤、懸濁化剤、または封入化材料としても働くこともできる１つまたは複数の物質のような固体担体でよい。薬学的組成物が静脈内に投与される場合には、好ましい担体は水である。生理的食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液も液体担体として、特には注射液のための液体担体として用いることができる。好ましい薬学的賦形剤としては、デンプンもしくはヒドロキシエチルデンプンのような合成的に修飾されたその誘導体、ステアリン酸塩、グリセロール、グルコース、ラクトース、ショ糖、トレハロース、ゼラチン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。組成物は、望まれる場合には、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤も含むことができる。
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、液体、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、ソフトゲル、ピル、粉末、浣腸剤、持続放出製剤等のような、しかしこれに限定されない多くの可能ないずれの投与形態にも調合できる。ＣＧ５３１３５を含む組成物はまた、水性、非水性、または混合型の媒体の懸濁液として調合することもできる。水性懸濁液は、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を上げる物質を更に含有してもよい。懸濁液は、安定化剤を含有してもよい。組成物は、トリグリセリドのような伝統的な結合剤および担体を用いて、坐剤として調合することもできる。経口調合物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプンもしくはヒドロキシエチルデンプンのような合成的に修飾されたその誘導体、ステアリン酸塩、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムのような標準的な担体を含むことができる。
ＣＧ５３１３５を含む薬学的組成物は、意図する投与経路に適合するように調合される。特定の態様では、組成物は、通常の手順に従って、ヒトへの静脈、皮下、筋肉内、経口、鼻内、腫瘍内または局所投与に適合した薬学的組成物として調合される。典型的には、静脈投与用の組成物は、無菌の等張または高張水性緩衝液の溶液である。必要時には、組成物は安定化剤および、注射部位の疼痛を和らげるためにベンジルアルコールもしくはリドカインの様な局所麻酔剤を含むことができる。
ＣＧ５３１３５を含む組成物が局所投与される場合は、組成物は経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体、および粉末の形態に調合できる。通常の薬学的担体、水溶液、粉末、または油性基材、増粘剤等が必要または望まれることもある。コーティングを施したコンドーム、手袋等も有用であろう。好ましい局所調合物としては、発明の組成物が、脂質、リポソーム、ミセル、乳剤、スフィンゴミエリン、脂質−タンパク質もしくは脂質ペプチド複合体、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤のような、しかしこれらに限定されない局所送達剤と混合されている調合物である。ＣＧ５３１３５を含む組成物は、リポソームに封入するか、またはリポソームと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成させることができる。または、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成させることができる。非噴霧型の局所投与形態の場合、局所適用に適合した担体または１つもしくは複数の賦形剤を含み、好ましくは水よりも大きな動態粘度を有する半固体または固体形態が一般的には用いられる。他の好適な局所投与形態としては、活性成分が、好ましくは固体または液体の不活性担体と組み合わせた形で加圧された揮発成分（例えばフレオンまたはハイドロフルオロカーボンのような気体推進剤）と混合した状態、またはスクィーズボトルに包装されているスプレー式のエアロゾル調合物が挙げられる。望ましい場合には、加湿剤または湿潤化剤もまた薬学的組成物および投与形態に加えることができる。このような追加成分の例は技術分野において周知である。
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、鼻内投与が好ましい場合には、エアロゾル形態、スプレー、霧、または滴もしくは粉末の形に調合できる。特に、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、好適な推進剤（例えばジクロロジフルオメタン、トリクロロフロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、その他のヒドロフルオロカーボン、二酸化炭素、またはその他の好適な気体）を用いて、加圧包装もしくは噴霧器から発射されるエアロゾルスプレーの形で都合よく送達できる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送り出すバルブを具えることによって定めることができる。吸入器または注入器に使用するマイクロカプセル（例えば重合表面から構成される）は、化合物と二糖類またはデンプンのような好適な粉末基材の粉末混合物を含むように調合できる。
１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質は、１つまたは複数のポリマー（例えばヒドロキシエチルデンプン）と共にマイクロカプセルに調合し、マイクロカプセルの表面を形成させることもできる。
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、経口投与が好ましい場合には、粉末、顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ、錠剤、またはミニタブレットの形態に調合できる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望まれることもある。錠剤またはカプセルは、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水酸カルシウム）；潤滑材（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；あるいは湿潤化剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて、通常の手段によって調製できる。錠剤は、当技術分野で周知な方法によってコーティングしてもよい。経口投与向けの液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または画分植物油）；および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加物を用いて、通常の手段によって調製できる。調製物は、適当であれば緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含むこともできる。経口投与向け調製物は、予防または治療薬の緩速放出、制御放出、または持続放出に合わせて調合できる。
１つの態様では、発明の組成物は、１つまたは複数の浸透増強剤、例えばアルコール、界面活性剤、およびキレート化剤と一緒に経口投与できる。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸およびそのエステルまたは塩、胆汁酸、およびその塩が挙げられるが、これに限定されない。幾つかの態様では、浸透増強剤の組み合わせ、例えばアルコール、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩の組み合わせを用いる。ある態様では、ラウリル酸のナトリウム塩、カプリン酸は、ＵＤＣＡと組み合わせて用いられる。その他の浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。発明の組成物は、吹付乾燥粒子を含むがこれに限定されない粒子形態にて、または複合体化させて微粒子もしくはナノ粒子を形成して経口的に送達してもよい。発明の組成物との複合体化に用いることができる複合体化剤としては、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＥＡＥ誘導化ポリイミン、プルラン、セルロース、およびデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、例えば吸入器または噴霧器を用いて、エアロゾル化剤と共に調合された組成物を肺投与することによって被験体に送達できる。
好ましい態様では、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、注入による非腸管投与（例えば、大量注入または持続輸液）に合わせて調合される。注入向け調合物は、追加の保存剤と共に単位投与形態（例えばアンプルまたは複数回投与向け容器）にすることができる。組成物は、油性または水性ビヒクルの懸濁液、溶液、または乳剤のような形態を取ることができ、懸濁化、安定化、および／または分散化剤のような調合剤を含有できる。または、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば無菌の発熱物質を含まない水）を使って液体にするための粉末形態にすることもできる。
好ましい態様では、組成物はヒトへの静脈投与に適合した薬学的組成物として、通常の手順に従って調合される。典型的には、静脈投与向け組成物は、無菌の等張水性緩衝液の溶液である。組成物は必要に応じて、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのベンジルアルコールもしくはリドカインのような局部麻酔剤を含むこともできる。一般的に成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々または混合して単一投与形態にまとめて、バイアル、アンプル、またはサッシュのような密封容器に入れられて、活性成分の量を表示して供給される。組成物が輸液によって投与される場合は、組成物は医薬品等級の水もしくは食塩水の入った輸液容器と共に投薬できる。組成物が注入によって投与される場合は、成分を投与前に混合できるように注入用の無菌水または食塩水のアンプルまたはバイアルを提供することができる。
ＣＧ５３１３５を含む組成物は、中性または塩の形態に調合できる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する塩のような、遊離アミノ基を持つように形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミノ、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する塩のような、遊離カルボキシル基を持つように形成された塩が挙げられるが、これらに限定されない。
前記の調合物に加えて、ＣＧ５３１３５を含む組成物は、デポー調合物として調合することもできる。このような長期作用調合物は、埋め込み（例えば皮下もしくは筋肉内）、または筋肉内注射によって投与できる。それ故に、組成物は好適な重合性もしくは疎水性物質（例えば許容される油中の乳液として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは例えば緩溶解性の塩のような、緩溶解性の誘導体を用いて調合できる。リポソームおよび乳剤は、親水性薬剤向けの送達ビヒクルまたは担体の周知例である。
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を致死させる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果がある投与量）を決定についての細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、その指数はＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。大きな治療指数を示す予防および／または治療薬が好ましい。有毒な副作用を示す予防および／または治療薬は用いることはできるが、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にとどめ、それによって副作用を減らすために、このような薬剤を病変組織部位だけを標的とするようなデリバリーシステムをデザインするように注意しなければならない。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトで使用するための予防および／または治療薬の投与量範囲の設定に利用できる。このような薬剤の投与量は、毒性がほとんど無いか、全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、用いる投与形態および利用する投与経路に応じてこの範囲内の中で変えることができる。発明の方法で用いる薬剤について、治療有効投与量は、まずは細胞培養アッセイによって推測できる。投与量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（即ち症状の半最大阻止を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を動物モデルにおいて得ることができるように定めることができる。このような情報を用いて、ヒトで有用な投与量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。
特定の障害または状態の治療に有効である発明の組成物の量は、障害または状態の性質に依存し、それは標準的な臨床技術によって決定できる。調合物に用いられる正確な用量もまた投与経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、これらは医師の判断および各患者の環境に合わせて決定されなければならない。
１つの態様では、発明が提供するヒト患者に投与するための、１つまたは複数のＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２００ｍｇ／ｋｇである（ＵＶアッセイにより測定した場合）。別の態様では、本発明が提供する、ヒト患者へ投与するための、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、０．００１〜３０００ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜３００ｍｇ／ｋｇの間、０．１〜３００ｍｇ／ｋｇの間、０．５〜２５０ｍｇ／ｋｇの間、１〜２００ｍｇ／ｋｇの間、１〜１５０ｍｇ／ｋｇの間、１〜１２５ｍｇ／ｋｇの間、１〜１００ｍｇ／ｋｇの間、１〜９０ｍｇ／ｋｇの間、１〜８０ｍｇ／ｋｇの間、１〜７０ｍｇ／ｋｇの間、１〜６０ｍｇ／ｋｇの間、１〜５０ｍｇ／ｋｇの間、１〜４０ｍｇ／ｋｇの間、１〜３５ｍｇ／ｋｇの間、１〜３０ｍｇ／ｋｇの間、１〜２５ｍｇ／ｋｇの間、１〜２０ｍｇ／ｋｇの間、１〜１５ｍｇ／ｋｇの間、１〜１０ｍｇ／ｋｇの間、または１〜５ｍｇ／ｋｇの間である（ＵＶアッセイで測定した場合）。
タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイまたはＵＶアッセイのような当技術分野で公知である方法によって測定でき、濃度はどのアッセイを用いたかによって変わることがある。非限定例では、本発明の薬学的組成物のタンパク質濃度は、２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸収の直接測定を用いるＵＶアッセイ、および良く特徴付けされたＣＧ５３１３５タンパク質の参照標準物（ＩｇＧの代わりに）を用いて測定される。このＵＶ法を用いて得た試験結果（ＣＧ５３１３５参照標準物）は、ブラッドフォード法を用いて同サンプルを試験した場合（較正物質としてＩｇＧを用いる）の試験結果よりも三倍低い。例えば、本発明が提供する、ヒト患者へ投与するための、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物の投与量は、ブラッドフォードアッセイで測定した時に０．１〜３００ｍｇ／ｋｇであり、従ってＵＶアッセイで測定した時に０．０３３〜１００ｍｇ／ｋｇである。
１つの態様では、全投与量を初めて投与する前に、発明の組成物を少量（例えば記載投与量の１／１００〜１／１０）注射して急性不寛容を検出することが好ましい。注射部位を試験後１および２時間後に検査する。反応が見つからない場合には、全投与量を投与する。
発明はまた、発明の治療レジメンを実施するためのキットも提供する。このようなキットは、１つまたは複数の容器の中に、薬学的に許容される形態をした発明の組成物を、予防的有効量または治療的有効量含んでいる。発明のキットのバイアル中の組成物は、薬学的に許容される溶液の形態でよく、例えば無菌食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝化溶液、またはその他の薬学的に許容される無菌液体と組み合わせることができる。あるいは、組成物は凍結乾燥または脱水してもよい；この場合、キットは、容器の中に、組成物を注射目的の溶液に戻すための、薬学的に許容される、好ましくは無菌の溶液（例えば食塩水、デキストロース溶液等）を、随意選択的に含んでよい。
別の態様では、発明のキットは、好ましくは無菌の形態に包装された、調合物を注射するための針またはシリンジ（単室または二室型）、および包装されたアルコール綿を更に含む。特定の態様では、発明のキットは、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む組成物が事前に充填された、充填済みの針またはシリンジ（単室または二室型）を含む。医師または患者が発明の調合物を注射するための指示書が、随意選択的に加えられる。
幾つかの態様では、本発明は、それぞれに単回投与に十分な用量の発明の組成物を含む薬学的調合物または組成物が入っている複数の容器を含むキットを提供する。
５．６．１ 改良型調合物およびＦＧＦタンパク質の溶解性を上げる方法
本発明は、１つまたは複数のＦＧＦ、好ましくは１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良型調合物、およびＦＧＦタンパク質の溶解性を上げるための方法を提供する。改良型調合物はより安定であり、商業規模の製造により適している。
本発明は、１つまたは複数のＦＧＦ、好ましくは１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良型調合物、およびＦＧＦタンパク質の溶解性を上げるための方法を提供する。改良型調合物はより安定であり、商業規模の製造により適している。
特定の理論に限定されるものではないが、改良型調合物は、高濃度の塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、ショ糖、酢酸塩、コハク酸塩、または酒石酸塩、あるいはそれらの組み合わせがＦＧＦタンパク質を含む成長因子の溶解性を上げるという発見に一部基づいている。それ故に１つの態様では、本発明は溶液中（例えば水溶液）のＦＧＦタンパク質の溶解性を、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはショ糖を溶液に加えることによって高める方法を提供する。別の態様では、本発明は、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはそれらの組み合わせを溶液に加えることによって溶液中のＦＧＦタンパク質の溶解性を高める方法を提供する。さらに別の態様では、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはそれらの組み合わせは、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはショ糖と一緒に溶液に加えられて、ＦＧＦタンパク質の溶解性を高める。塩形態のアルギニンは、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンでよいが、これらに限定されない。好ましい態様では、硫酸アルギニンが用いられる。幾つかの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはショ糖の最終濃度は、０．０１Ｍ〜１Ｍである。１つの態様では、塩形態のアルギニンの最終濃度は、０．５Ｍである。幾つかの態様では、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはそれらの組み合わせの最終濃度は、０．０１〜０．２Ｍである。
好ましい態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質はＦＧＦ−２０タンパク質、ＦＧＦ−２０タンパク質の断片、誘導体、改変体、相同体、または類似体、あるいはそれらの組み合わせである。幾つかの態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質は、ＣＧ５３１３５−０１（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０２（配列番号４）、ＣＧ５３１３５−０３（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０４（配列番号７）、ＣＧ５３１３５−０５（配列番号２）、ＣＧ５３１３５−０６（配列番号１０）、ＣＧ５３１３５−０７（配列番号１２）、ＣＧ５３１３５−０８（配列番号１４）、ＣＧ５３１３５−０９（配列番号１６）、ＣＧ５３１３５−１０（配列番号１８）、ＣＧ５３１３５−１１（配列番号２０）、ＣＧ５３１３５−１２（配列番号２２）、ＣＧ５３１３５−１３（配列番号２４）、ＣＧ５３１３５−１４（配列番号２６）、ＣＧ５３１３５−１５（配列番号２８）、ＣＧ５３１３５−１６（配列番号３０）、ＣＧ５３１３５−１７（配列番号３２）、ＩＦＣ２５００５９６２９（配列番号３４）、ＩＦＣ２００５９６６９（配列番号３６）、ＩＦＣ３１７４５９５５３（配列番号３８）、ＩＦＣ３１７４５９５７１（配列番号４０）、ＩＦＣ２５００５９５９６（配列番号１０）、またはＩＦＣ３１６３５１２２４（配列番号１０）、あるいは任意の二またはそれ以上のＣＧ５３１３５タンパク質の組合せである。１つの態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、調合物中のタンパク質は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（５）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（５）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質は（１）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。さらに別の態様では、調合物中のＦＧＦタンパク質は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、（５）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（６）配列番号２４のアミノ酸配列を含むカルバミル化されたタンパク質、および（７）配列番号２のアミノ酸配列を含むカルバミル化されたタンパク質を含む。
本発明は、塩形態のアルギニン、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、界面活性剤、および１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む、改良調合物を提供する。１つの態様では、本発明は０．１〜１Ｍの塩形態のアルギニン、０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、０．０１〜０．１％重量／容積（「ｗ／ｖ」）のポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、および０．００５〜５０ｍｇ／ｍｌの、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む改良調合物を提供する。塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはそのショ糖は、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンでよいが、これらに限定されない。好ましい態様では、硫酸アルギニンが用いられる。幾つかの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはそのショ糖の最終濃度は、０．０１〜０．７Ｍである。１つの態様では、塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、またはそのショ糖の最終濃度は０．５Ｍである。いくつかの態様では、調合物中のリン酸二水素ナトリウムの濃度は、０．０２〜０．０９Ｍ、０．０３〜０．０８Ｍ、または０．０４〜０．０６Ｍである。特定の態様では、リン酸二水素ナトリウムは０．０５Ｍである。１つの態様では、改良調合物は界面活性剤を含み、これは、例えば透析濾過および／または限外濾過工程の間に加えることができ、凝集塊の形成を最小限に抑える。界面活性剤は、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０でよいが、これらに限定されない。特定の態様では、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０の濃度は０．０１％（重量／容積）である。
本発明の改良調合物は、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む。１つの態様では、発明の改良調合物は、配列番号２、４，７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を１つまたは複数含む。別の態様では、発明の改良調合物は、配列番号２、４，７、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を、１つまたは複数含む。特定の態様では、発明の改良調合物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。別の特定の態様では、発明の改良調合物は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。さらに別の特定の態様では、発明の改良調合物は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。特定の態様では、発明の改良調合物は（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、（２）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質、（３）配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質、（４）配列番号２８のアミノ酸配列を含むタンパク質、（５）配列番号３０のアミノ酸配列を含むタンパク質、および（６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。１つの態様では、発明の改良調合物は、上記５．２節に記載のプロセスのいずれかによって作られたタンパク質を１つまたは複数含む。いくつかの態様では、本発明の改良調合物中の１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも５０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの態様では、本発明の改良調合物中の１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は、僅か５０ｍｇ／ｍｌ、僅か３０ｍｇ／ｍｌ、僅か１０ｍｇ／ｍｌ、僅か５ｍｇ／ｍｌ、僅か１ｍｇ／ｍｌ、または僅か０．５ｍｇ／ｍｌに過ぎない。幾つかの態様では、本発明の改良調合物中の１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は、０．０００５〜６０ｍｇ／ｍｌ、０．００５〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜６０ｍｇ／ｍｌ、１〜５０ｍｇ／ｍｌ、５〜４０ｍｇ／ｍｌ、５〜３０ｍｇ／ｍｌ、または５〜２０ｍｇ／ｍｌである。特定の態様では、本発明の改良調合物中の１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌである。
発明の改良調合物は凍結乾燥または噴霧乾燥でき、その結果貯蔵期間のより長い、取り扱いおよび輸送が容易な、より安定な製品ができる。凍結乾燥のプロセスは、当技術分野では周知であることから、ここでは詳しく説明しない。簡単に説明すると、凍結乾燥は、真空下において凍結し、続いて昇華することによって生成物の水分含有量を減らすプロセスである。凍結乾燥プロセスは主に三工程から構成されている。第一工程は、生成物を凍結し、乾燥に好適な凍結したマトリックスを作り出すことを含んでいる。この工程は、次の二つの工程の乾燥特性に影響を及ぼす。第二工程は一次乾燥である。一次乾燥は、生成物の環境を減圧することによって（典型的にはおおよそ５０〜５００μｍＨｇまで）昇華させ、氷を取り除きながら生成物の温度を、低い、望ましいレベルに維持することを含む。プロセスの第三工程は第二乾燥と呼ばれる工程で、ここで結合水は、残留水分含有量が目標レベル以下に達するまで除去される。任意の当技術分野で公知の凍結乾燥プロセスを用いて、発明の調合物を凍結乾燥できる。
凍結乾燥プロセスの目的は、許容可能な外観、生物学的効能、再生し易さ、および長期保存安定性を持つ凍結乾燥タンパク質のケークを得ることである。慎重に計画された凍結乾燥サイクルとは、間違いのない、時間とエネルギーの消費が少なく、かつ製品の品質が保たれているサイクルである。調合物に関係する要素とサイクルに関係する要素の両方が、この目標の達成に影響を及ぼす。
ここに記載のプロセスでは、凍結乾燥賦形剤の添加が必要なこともある。１つまたは複数の添加剤を加えることができる。本プロセスに用いられることが予想される凍結乾燥賦形剤としては、ショ糖、ラクトース、マンニトール、デキストラン、ショ糖、ヘパリン、グリシン、グルコース、グルタミン酸、ゼラチン、ソルビトール、ヒスチジン、デキストロース、トレハロース、メトセル、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、スルホブチルエーテルベータ−シクロデキストリンナトリウム、およびポリビニルアルコール、またはそれらの様々な組み合わせ、ならびに当業者によって用いられるその他緩衝剤、タンパク質安定化剤、凍結保護剤、および凍結保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
発明の改良調合物の活性成分はＦＧＦタンパク質、好ましくは１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質であることから、それゆえに発明の改良調合物は、ＦＧＦタンパク質、好ましくはＣＧ５３１３５タンパク質が有効であることが知られている任意の状況で用いることができる。例えば、発明の改良調合物は、消化器粘膜炎、炎症性腸疾患、骨関節炎、中枢神経系または心臓血管系の障害、および放射線曝露に関係する障害のような障害、あるいはそれらの症状の予防および／または治療に用いることができる。
６．実施例
発明の特定の態様を、次の非限定的実施例により例示する。
発明の特定の態様を、次の非限定的実施例により例示する。
６．１ 実施例１：ＣＧ５３１３５の発現
複数種類の発現構築物を作製し、ＣＧ５３１３５タンパク質を発現させた（表２）
表２．ＣＧ５３１３５を発現するために作製した構築物
複数種類の発現構築物を作製し、ＣＧ５３１３５タンパク質を発現させた（表２）
表２．ＣＧ５３１３５を発現するために作製した構築物
完全長ＣＧ５３１３５−０１遺伝子はまた、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍ Ｈ１−Ｘｈｏ１部位内にＢｇＩ ＩＩ−Ｘｈｏ１断片としてもクローニングされた。得られた構築物、ｐＩｇＫ−ＦＧＦ−２０（構築物１ｂ）は、ＣＧ５３１３５−０１の分泌を補助できる異種性の免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）シグナル配列を有している。ｐＩｇＫ−ＦＧＦ−２０をヒト２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号Ｒ６２０−０７）内にトランスフェクションした後、ＣＧ５３１３５−０１は抗Ｖ５抗体を用いて条件培地の中で検出した。
ＣＧ５３１３５タンパク質の収量を上げるために、完全長ＣＧ５３１３５−０１遺伝子をコードしているＢｇＩ ＩＩ−Ｘｈｏ１断片を、大腸菌発現ベクター、ｐＥＴＭＹ（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１部位部位にクローニングした。得られた構築物、ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−２０（構築物２）は、６アミノ酸のヒスチジンタグおよびＣＧ５３１３５のアミノ末端にインフレームに融合しているＴ７タグを有している。ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−２０でＢＬ２１大腸菌（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を形質転換した後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ誘導を行い、ＣＧ５３１３５−０１タンパク質は細胞可溶性画分に検出された。
タグの付いていないＦＧＦ−２０を発現させるために、ＣＧ５３１３５−０５（コドン最適化された、完全長のＦＧＦ−２０遺伝子）およびＣＧ５３１３５−０２（ＦＧＦ−２０のコドン最適化された欠失構築物で、Ｎ末端のアミノ酸２〜５４が除去されている）を合成した。完全長構築物（ＣＧ５３１３５−０５）については、開始コドンを含むＮｄｅ １制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）をコーディング配列の５’末端に配置した。３’末端には、コーディング配列には２つの構成的な停止コドン（ＴＡＡ）およびＸｈｏ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）が続いた。合成された遺伝子をｐＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングして、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ−ＣＧ５３１３５−０５を作成した。コドン最適化されたＣＧ５３１３５−０５遺伝子を含むＮｄｅ １−Ｘｈｏ１断片を、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔ−ＣＧ５３１３５−０５から単離し、Ｎｄｅ １−Ｘｈｏ１消化ｐＥＴ２４ａにサブクローニングしてｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０５（構築物３）を作成した。完全長の、コドン最適化したバージョンのＦＧＦ−２０は、ＣＧ５３１３５−０５と呼ぶ。
ＣＧ５３１３５のコドン最低化された欠失構築物を作るために、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、平滑端を持つＦＧＦ−２０遺伝子をｐＣＲＳｃｒｉｐｔ−ＣＧ５２１３５−０５から増幅した。フォワードプライマーは、Ｎｄｅ １部位（ＣＡＴＡＴＧ）を含み、これに続いてアミノ酸５５から始まるコーディング配列を含んでいる。約４８０塩基対の単一のＰＣＲ産物を得て、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてｐＣＲ２．１−ＣＧ５３１３５ｄｅｌが作成された。ｐＣＲ２．１−５３１３５ｄｅｌからＮｄｅ１−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片が単離され、Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化ｐＥＴ２４ａにサブクローニングされ、ｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０２（構築物４）を作成した。
プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０５（構築物３）およびｐＥＴ２４ａ−ＣＧ５３１３５−０２（構築物４）はタグを有していない。各ベクターを用いて大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換し、イソプロピルチオガラクトピラノシドで誘導した。完全長およびＮ−末端を平滑端化したＣＧ５３１３５タンパク質は細胞の可溶性画分の中に検出された。
６．２ 実施例２：ＣＧ５３１３５−０５および薬学的調合物の製造
臨床開発に好適であろう構築物を目指して、無ファージの宿主細菌でタグを持たない分子を作成した。コドン最適化した、完全長の、タグを持たない分子（ＣＧ５３１３５−０５）が最も好ましい薬理学的特性を有しており、これを用いて安全性試験および臨床試験向けの生成物を調製した。
臨床開発に好適であろう構築物を目指して、無ファージの宿主細菌でタグを持たない分子を作成した。コドン最適化した、完全長の、タグを持たない分子（ＣＧ５３１３５−０５）が最も好ましい薬理学的特性を有しており、これを用いて安全性試験および臨床試験向けの生成物を調製した。
６．２．１ 製造プロセスおよび薬学的調合物（プロセス１）
ＣＧ５３１３５−０５をコドン最低化された構築物を用いて大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）で発現させ、精製して均一化し、標準的なタンパク質化学技術によって特徴付けした。単離されたＣＧ５３１３５−０５タンパク質は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を用いたとき単一バンド（２３キロダルトン）として移動し、クマシーブルーで染色した。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を電気泳動的にポリビニリデンフルオライド膜に移し、染色された２３ｋＤのバンドを膜から切り出し、自動エドマン配列分析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で分析した；先頭１０アミノ酸のＮ−末端アミノ酸配列は、予想通りのタンパク質配列と同一であることが確認された。
ＣＧ５３１３５−０５をコドン最低化された構築物を用いて大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）で発現させ、精製して均一化し、標準的なタンパク質化学技術によって特徴付けした。単離されたＣＧ５３１３５−０５タンパク質は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術を用いたとき単一バンド（２３キロダルトン）として移動し、クマシーブルーで染色した。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を電気泳動的にポリビニリデンフルオライド膜に移し、染色された２３ｋＤのバンドを膜から切り出し、自動エドマン配列分析装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で分析した；先頭１０アミノ酸のＮ−末端アミノ酸配列は、予想通りのタンパク質配列と同一であることが確認された。
発酵および一次回収組換え体
ＣＧ５３１３５−０５は、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖｏｇｅｎ）を用いて発現した。これらの細胞を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、完全長の、コドン最適化されたＣＧ５３１３５−０５で形質転換した。これらの細胞について製造マスター細胞バンク（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＭＭＣＢ）を作成して、適格性を調べた。発酵および一次回収のプロセスは、１００Ｌ（即ち可動容積）のスケールで、再生可能な形で実施した。
ＣＧ５３１３５−０５は、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖｏｇｅｎ）を用いて発現した。これらの細胞を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、完全長の、コドン最適化されたＣＧ５３１３５−０５で形質転換した。これらの細胞について製造マスター細胞バンク（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＭＭＣＢ）を作成して、適格性を調べた。発酵および一次回収のプロセスは、１００Ｌ（即ち可動容積）のスケールで、再生可能な形で実施した。
１〜６バイアルのＭＭＣＢを溶解およびプールし、それぞれ７５０Ｍｌの接種培地の入った４〜７つの振盪フラスコに接種して種の調製を開始した。この時点で、３〜６Ｌの接種物を、６０〜８０Ｌの開始培地が入った製造用発酵器に移した。製造用発酵器は３７℃の温度、および７．１のｐＨで運転した。溶存酸素を、攪拌速度、通気速度、および空気中の酸素量を操作して飽和濃度３０％以上に管理した。細胞密度が３０〜４０Ｕ（６００ｎｍ）になった時点で増殖培地の追加を開始し、発酵終了まで続けた。１ｍＭイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて、細胞を４０〜５０ＡＵ（６００ｎｍ）の細胞密度に誘導し、誘導後４時間ＣＧ５３１３５−０５タンパク質を産生させた。発酵は１０〜１４時間で終了させ、約１００〜１１０Ｌの細胞ブロスを連続遠心分離によって濃縮した。得られた細胞ペーストは−７０℃で凍結保存した。
凍結した細胞ペーストを溶解緩衝液（最終濃度３Ｍ尿素を含む）に懸濁し、高圧ホモジェナイザーを使って破壊した。細胞溶解物を、連続フロー遠心分離器を用いて清澄化した。得られた清澄溶解物は、ＳＰ平衡化緩衝液（３Ｍ尿素、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で平衡化したＳＰ−セファロースファーストフローカラムに直接かけた。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質は、ＳＰ溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍアルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を用いてカラムから溶出した。次に収集した物質を、等容積のＳＰ溶出緩衝液で希釈した。よく混合した後、ＳＰセファロースＦＦプールを０．２μｍのＰＥＳフィルターに通して濾過し、−８０℃で凍結した。
製剤原料の精製
ＳＰ−セファロースファーストフローのプールは、硫安を使って沈殿させた。４℃で一晩インキュベーションした後、沈殿物をボトル遠心分離によって集め、続いてフェニルローディング緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）の中で溶解した。得られた溶液を０．４５ｕＭ ＰＥＳフィルターを通して濾過し、フェニル−セファロースＨＰカラムにかけた。カラムを洗浄した後、タンパク質をフェニル溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）の直線勾配で溶出した。フェニル−セファロースＨＰプールを０．２μｍ ＰＥＳフィルターを通して濾過し、１．８Ｌずつ−８０℃で凍結した。
ＳＰ−セファロースファーストフローのプールは、硫安を使って沈殿させた。４℃で一晩インキュベーションした後、沈殿物をボトル遠心分離によって集め、続いてフェニルローディング緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）の中で溶解した。得られた溶液を０．４５ｕＭ ＰＥＳフィルターを通して濾過し、フェニル−セファロースＨＰカラムにかけた。カラムを洗浄した後、タンパク質をフェニル溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＬ−アルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）の直線勾配で溶出した。フェニル−セファロースＨＰプールを０．２μｍ ＰＥＳフィルターを通して濾過し、１．８Ｌずつ−８０℃で凍結した。
調合および充填／仕上げ
４バッチの精製製剤原料を２４〜４８時間、２〜８℃で溶解し、接線流限外濾過（ＴＦＦ）装置の収集タンクにプールした。プールされた製剤原料をＴＦＦで〜５倍濃縮し、続いて調合物緩衝液（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ＭのＬ−アルギニン、３％グリセロール）を用いて約５倍に透析濾過した。この緩衝液−交換製剤原料をさらに目標濃度の＞１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。収集タンクに移した後、調合物緩衝液を用いて濃度を〜１０ｍｇ／ｍＬに調節した。調合が終わった製剤を無菌タンク内に無菌濾過し、無菌的に充填して（２０ｍＬバイアル当たり１０．５ｍＬ）密封した。充填密封したバイアルについて充填が正確か、目に見える欠陥はないか検査した。一定数のバイアルを取り出し、リリースアッセイ、安定性試験、安全性試験、および保存サンプル向けラベルを貼った。残りのバイアルには、臨床試験用のラベルを貼り、完成した製剤は−８０±１５℃に保管した。
４バッチの精製製剤原料を２４〜４８時間、２〜８℃で溶解し、接線流限外濾過（ＴＦＦ）装置の収集タンクにプールした。プールされた製剤原料をＴＦＦで〜５倍濃縮し、続いて調合物緩衝液（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ＭのＬ−アルギニン、３％グリセロール）を用いて約５倍に透析濾過した。この緩衝液−交換製剤原料をさらに目標濃度の＞１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。収集タンクに移した後、調合物緩衝液を用いて濃度を〜１０ｍｇ／ｍＬに調節した。調合が終わった製剤を無菌タンク内に無菌濾過し、無菌的に充填して（２０ｍＬバイアル当たり１０．５ｍＬ）密封した。充填密封したバイアルについて充填が正確か、目に見える欠陥はないか検査した。一定数のバイアルを取り出し、リリースアッセイ、安定性試験、安全性試験、および保存サンプル向けラベルを貼った。残りのバイアルには、臨床試験用のラベルを貼り、完成した製剤は−８０±１５℃に保管した。
完成した製剤は、注射向けの単回使用無菌バイアルに入った無菌の透明無色の溶液である。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、最終濃度８．２ｍｇ／ｍＬで調合された（表３）
表３．製剤の組成
表３．製剤の組成
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の静脈内投与（０．０５、５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日（ブラッドフォード）、１４連続日）の安全性を、ラットの主要毒性試験の中で調べた。０．０５ｍｇ／ｍＬ（ブラッドフォード）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌生成物を１４日間投与したラットには、治療に関係する所見は認められなかった。５ｍｇ／ｋｇ（ブラッドフォード）のＣＧ５３１３５を１４日間投与したラットでは、食物摂取量が低下し、体重が減少した；この投与群の臓器重量、尿分析、眼科、または組織病理パラメータに治療に関係する変化は無かったが、この治療群には、血液学および臨床化学パラメータには治療に関係する変化が存在した。５０ｍｇ／ｋｇ（ブラッドフォード）のＣＧ５３１３５大腸菌精製物を１２日間投与したラット（推定最大血漿レベルは活性投与量の２０〜３０倍）では、食物摂取量が低下し、体重は顕著に減少した；眼科に関しては治療に関係する変化は認められなかったが、この治療群には臓器重量、尿分析、血液学、臨床化学、および組織病理パラメータに治療に関係する顕著な変化が存在した。
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（０または１０ｍｇ／ｋｇ／日（ブラッドフォード）、７連続日）の静脈内投与の安全性を、アカゲザルを用いた安全薬理学試験の中で更に調べた。１ｍｇ／ｋｇ（ブラッドフォード）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を７日間投与した動物には、治療に関係する臨床的観察は行われなかった。１０ｍｇ／ｋｇ（ブラッドフォード）のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を７日間投与した動物では、体重に対する僅かな影響が記録され、これは定性的な食物摂取量減少の観察結果と関連した。いずれの投与量群についても、血液学、臨床化学、眼科、または電気生理学に関して、治療に関係する明瞭な影響は存在しなかった。
ＣＧ５３１３５−０５製剤原料の安定性
ｃＧＭＰ製造中に作られたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物について、安定性試験を実施した。精製された製剤原料の安定性を示すアッセイとして用いた分析方法を表４にリストアップする。
ｃＧＭＰ製造中に作られたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物について、安定性試験を実施した。精製された製剤原料の安定性を示すアッセイとして用いた分析方法を表４にリストアップする。
表４．製剤原料の安定性アッセイ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびブラッドフォードアッセイは、タンパク質分解または大きな凝集の指標である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣアッセイは、タンパク質の凝集またはオリゴマー形成の変化を検出し、バイオアッセイはタンパク質の生物活性の消失を検出する。精製製剤原料の安定性試験は、３、６、９、１２、および２４ヶ月目に試験したサンプルを用いて、−８０〜１５℃で行われた。
１つの実験では、完成製剤の安定性試験は、１、３、６、９、１２、および２４ヶ月目に試験したサンプルを用いて、−８０±１５℃および−２０±５℃で、Ｃａｍｂｒｅｘによって実施された。１ヶ月後に集められた安定性試験のデータは、完成製剤が、−８０±１５℃および−２０±５℃に保存された場合には、少なくとも１ヶ月間安定であることを示している（表５）。
表５．１ヶ月目の製剤原料の安定性データ
別の実験では、完成した製剤のサンプルは、−８０±１５℃に保存されるか、または５±３℃、２５±２℃、もしくは３７±２℃でストレスを加えてから、１ヶ月間、様々な間隔で試験を受けた。安定性データは、完成製剤が−８０±１５℃または５±３℃で１ヶ月間保存した後に有意な不安定性を示さないことを示している。２５±℃でストレスを加えた場合、完成製剤は少なくとも４８時間は安定であった；この温度では、１週間後に分解が明瞭となった。３７±２℃でストレスを加えた場合は、完成製剤の分解は４時間以内に明瞭となった。
６．２．２．ＣＧ５３１３５−０５改良された薬学的調合物および製造プロセス（プロセス２）
臨床使用を目的とする、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む製剤を製造するための改良型製造プロセスを開発した。図１は、ＣＧ５３１３５の改良型製造プロセスに含まれる工程を示す。コドン最適化された、完全長の、タグを持たないＣＧ５３１３５−０５分子（実施例１の構築物３）を用いた。改良型製造プロセスのプロセス工程を以下記載する。
臨床使用を目的とする、１つまたは複数のＣＧ５３１３５タンパク質を含む製剤を製造するための改良型製造プロセスを開発した。図１は、ＣＧ５３１３５の改良型製造プロセスに含まれる工程を示す。コドン最適化された、完全長の、タグを持たないＣＧ５３１３５−０５分子（実施例１の構築物３）を用いた。改良型製造プロセスのプロセス工程を以下記載する。
細胞バンク：初期のプロセスには、動物成分を含まない複合培地を利用した製造マスター細胞バンク（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＭＭＣＢ）を用いた。最初のＭＭＣＢから、動物成分を含まない、化学合成培地を用いた第二製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を誘導し、さらにこの二番目のＭＭＣＢから製造作業細胞バンク（ＭＷＣＢ）を作成した。このＭＷＣＢを、図１に記載の製造プロセスに用いた。
接種物の調製：最初の細胞拡大は振盪フラスコ内で行った。種の調製は、２〜３バイアルのＭＷＣＢを既知組成培地中で融解し、プール、それぞれ５００ｍＬの既知組成種培地の入った３〜４振盪フラスコ３〜４個に接種して行った。
接種および最終発酵：対数増殖期（２．５〜４．５ＯＤ６００単位）の細胞が入った振盪フラスコを用いて、接種培地が入った、単一の２５Ｌ（即ち作業容積）の種発酵器に接種を行った。２５Ｌの種発酵器内で対数増殖期（３．０〜５．０ＯＤ６００単位）に達した細胞を、７８０〜８２０Ｌの既知組成バッチ培地の入った１５００Ｌの製造用発酵器に移した。発酵中、温度を３７±２℃、ｐＨを７．１±０．１に管理し、１５０〜２５０ｒｐｍで攪拌しながら、空気または富酸素空気を０．５〜１．５（ｖｖｍ）で通気して溶存酸素を２５％以上に制御した。必要に応じて消泡剤（Ｆｅｒｍａｘアジュバント２７）を用いて発酵器内の泡を抑えた。培養物のＯＤ（６００ｎｍでの）が２５〜３５単位に達したら、追加の既知組成培地を当初０．７ｇ／ｋｇブロス／分の割合で加え、次に必要に応じて追加速度を調整した。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質発現の誘導は、６００ｎｍのＯＤが１３５〜１６５単位に達した時点で開始した。誘導４時間後、発酵を完了した。最終的な発酵ブロスの容積は約１５００Ｌだった。それから培養物を１０〜１５℃まで冷ました。
ホモジェナイゼーション：冷却した培養物を発酵ブロス１部に対し細胞溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、７．５ｍＭ ＤＴＴ、４．５Ｍ尿素、ｐＨ７．２、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））２部の比率で細胞溶解緩衝液を用いて希釈し、希釈した発酵ブロスに凝集剤を加え、最終ＰＥＩ濃度を０．０３３％（Ｗ／Ｖ）にした。細胞を１０〜１５度で、７５０〜８５０バールの高圧ホモジェナイザーに３回かけて溶解した。
捕獲および回収：冷却した細胞溶解物を、事前に平衡化しておいたストリームライン（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）ＳＰ膨張床カチオン交換カラムに直接、上向流方向に装填した。装填中、床膨張係数を充填層カラム容積の２．５〜３．０倍に維持した。装填後、カラムを、追加のストリームラインＳＰ平衡化緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ硫酸ナトリウム、３Ｍ尿素、ｐＨ７．０）を用いて、上向流方向にフラッシュした。それからカラムをＳＰストリームライン洗浄緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ硫酸ナトリウム、２．２２Ｍデキストロース、ｐＨ７．０）を用いて下向流方向に更に洗浄した。タンパク質は、ストリームラインＳＰ溶出緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ硫酸ナトリウム、１Ｍ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．０）を用いて、上向流方向にカラムから溶出した。
ＰＰＧ ６５０Ｍクロマトグラフィー：ＳＰストリームライン溶出液を、事前に平衡化しておいたＰＰＧ ６５０ Ｍ、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装填した。カラムを１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ硫酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ＭアルギニンｐＨ７．０で平衡化して洗浄した。カラムを１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で更に洗浄した。生成物を１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で溶出した。
ＣＵＮＯ濾過：ＰＰＧ溶出物をエンドトキシン結合ＣＵＮＯ ３０ＺＡデプスフィルターを通過させた。フィルターをまず注射用の水（ＷＦＩ）でフラッシュし、次に１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍアルギニン、ｐＨ７．０（ＰＰＧ溶出緩衝液）でフラッシュした。フラッシュ後、ＰＰＧ溶出液をフィルターに通す。残った液体は、空気圧を用いてフィルターを通過させ容器に押し出す。
フェニルセファロースクロマトグラフィー：ＣＵＮＯ濾過液を次に事前に平衡化したフェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装填した。カラムを１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ硫安、８００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で平衡化し、洗浄した。生成物を５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ７．０で溶出した。
濃縮および透析濾過：１％ポリソルベート８０をフェニルセファロース溶出物に加え、製剤原料の最終濃度を０．０１％（ｗ／ｖ）にした。次に溶出液を限外濾過にかけて約２〜３ｇ／Ｌまで濃縮した。次に残留物を、７倍の透析濾過容積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ７．０（フェニルセファロース溶出緩衝液）を用いて透析濾過した。透析濾過後、残留物は１２〜１５ｇ／Ｌに濃縮した。残留物を０．２２μｍのフィルターで濾過し、続いて１０ｇ／Ｌまで希釈した。
バルクボトリング：濃縮および透析濾過工程からの残留物を０．２２μｍの孔サイズを持つフィルターにかけて濾過し、２Ｌの単回使用テフロン（登録商標）ボトルに入れた。ボトルを−７０℃に凍結した。
製剤／バイアル：凍結した製剤原料を、製剤の製造に用いた。凍結した製剤原料のボトルを室温で融解した。製剤原料が完全に融解したら、それを無菌容器にプールして、濾過し、バイアルに充填し、部分的に栓をして凍結乾燥にかけた。凍結乾燥プロセス終了後、バイアルに栓をしてキャップをした。凍結乾燥製剤は、２〜８℃に保存した。
６．３ 実施例３：製剤の参照標準物の特徴付け
タンパク質の参照標準物を、６．２．２節に記載のバルク製剤原料製造プロセス（実施例２）を典型とする１４０Ｌスケールの製造プロセスを用いて調製した。参照標準物は２ｍＬの凍結用バイアルに１ｍＬずつ小分けして−８０℃±１５℃で保存した。参照標準物に提案されている仕様を表６にリストアップする。
タンパク質の参照標準物を、６．２．２節に記載のバルク製剤原料製造プロセス（実施例２）を典型とする１４０Ｌスケールの製造プロセスを用いて調製した。参照標準物は２ｍＬの凍結用バイアルに１ｍＬずつ小分けして−８０℃±１５℃で保存した。参照標準物に提案されている仕様を表６にリストアップする。
表６．ＣＧ５３１３５−０５参照標準物の提案仕様
６．４ 実施例４：製剤の純度分析
６．２節に記載の製造プロセス（実施例２）で作られた製剤の純度を、本節に記載する実験によって分析した。
６．２節に記載の製造プロセス（実施例２）で作られた製剤の純度を、本節に記載する実験によって分析した。
６．４．１ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による純度
６．２．２節に記載した改良製造プロセス（実施例２）を用いた精製タンパク質および６．２．１節に記載した製造プロセス（実施例１）を用いた精製タンパク質を、４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにタンパク質量を増やしながらかけ、ゲルコードブルー染色液で染色して微量の不純物を検出することで分析した（図２Ａ）。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２それぞれから得たものは共に）は、還元条件下で単一バンド（〜２３ｋＤａ）として移動した。ＬＯＤ（＜２８ｎｇ）を超える不純物は検出されなかった。
６．２．２節に記載した改良製造プロセス（実施例２）を用いた精製タンパク質および６．２．１節に記載した製造プロセス（実施例１）を用いた精製タンパク質を、４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにタンパク質量を増やしながらかけ、ゲルコードブルー染色液で染色して微量の不純物を検出することで分析した（図２Ａ）。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２それぞれから得たものは共に）は、還元条件下で単一バンド（〜２３ｋＤａ）として移動した。ＬＯＤ（＜２８ｎｇ）を超える不純物は検出されなかった。
プロセス１およびプロセス２の精製タンパク質はまた、４〜１２％の勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにタンパク質の量を増やしながらかけ、銀染色を用いて微量の不純物を検出することによっても分析した（図２Ｂ）。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２それぞれから得たものは共に）は、全て装填量について、還元条件下で単一バンド（〜２３ｋＤａ）として移動した。
６．４．２ ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度
精製した製剤は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析した。プロセス１およびプロセス２の精製タンパク質を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を移動相とする、標準的なＨＰＬＣシステムを用いたタンパク質Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にかけた。プロセス１の精製タンパク質は、主要ピークが２４．０分に、追加のピークが２４．３および２４．７分に溶出した。これらは、ＣＧ５３１３５−０５のイソフォームを表している。プロセス２を用いて得たＣＧ５３１３５−０５は、保持時間２４．０分の主要ピークとして溶出した（図３）。これらピークの特徴について以下６．７節で更に論ずる（実施例７）。
精製した製剤は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析した。プロセス１およびプロセス２の精製タンパク質を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を移動相とする、標準的なＨＰＬＣシステムを用いたタンパク質Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にかけた。プロセス１の精製タンパク質は、主要ピークが２４．０分に、追加のピークが２４．３および２４．７分に溶出した。これらは、ＣＧ５３１３５−０５のイソフォームを表している。プロセス２を用いて得たＣＧ５３１３５−０５は、保持時間２４．０分の主要ピークとして溶出した（図３）。これらピークの特徴について以下６．７節で更に論ずる（実施例７）。
６．４．３ サイズ排除−ＨＰＬＣによる純度
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、２８０ｎｍのＵＶ検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。分析は、タンパク質を１００ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍアルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含む移動相とする標準的なＨＰＬＣシステムを用いたサイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ−２５０、０．７８ｃｍ×３０ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に注入して行った。精製タンパク質は、プロセス１およびプロセス２について、保持時間２０．５分の単一の分散ピークとして同一のものとして溶出された（図４）。この保持時間は、約４５キロダルトンの見かけ上の分子量に相当し（同一条件で流した較正標準物のセットと比較した時）、ＦＧＦ−２０が非共有結合性のダイマーとして存在していることを示唆した。
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、２８０ｎｍのＵＶ検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。分析は、タンパク質を１００ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍアルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含む移動相とする標準的なＨＰＬＣシステムを用いたサイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ−２５０、０．７８ｃｍ×３０ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に注入して行った。精製タンパク質は、プロセス１およびプロセス２について、保持時間２０．５分の単一の分散ピークとして同一のものとして溶出された（図４）。この保持時間は、約４５キロダルトンの見かけ上の分子量に相当し（同一条件で流した較正標準物のセットと比較した時）、ＦＧＦ−２０が非共有結合性のダイマーとして存在していることを示唆した。
６．４．４ ウエスタンブロットを用いた宿主細胞タンパク質の決定
精製製剤中の宿主細胞由来不純物のレベルを、ウエスタンブロット分析を用いて定性的に調べた。精製ＣＧ５３１３５タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。膜を一次抗体（ウサギ抗大腸菌、Ｄａｋｏ Ｓｙｓｔｅｍ）と、続いて二次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ標識、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベーションし、標準的な技術を用いて発色させた。プロセス１については、宿主細胞タンパク質由来の不純物は認められず、プロセス２のものについては１本のバンド（〜７０ｋＤａ）だけが認められた（図５）。
精製製剤中の宿主細胞由来不純物のレベルを、ウエスタンブロット分析を用いて定性的に調べた。精製ＣＧ５３１３５タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。膜を一次抗体（ウサギ抗大腸菌、Ｄａｋｏ Ｓｙｓｔｅｍ）と、続いて二次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ標識、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベーションし、標準的な技術を用いて発色させた。プロセス１については、宿主細胞タンパク質由来の不純物は認められず、プロセス２のものについては１本のバンド（〜７０ｋＤａ）だけが認められた（図５）。
６．４．５ ウエスタンブロットを用いたＣＧ５３１３５の同定
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、ウサギポリクローナル抗ＣＧ５３１３５血清を用いたウエスタンブロットにより同定した（図６）。精製ＣＧ５３１３５−０５は、タンパク質１０μｇを４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにかけて分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。膜を一次抗体（ポリクローナル抗ＣＧ５３１３５血清）と、続いて二次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ標識、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベーションし、標準的な技術を用いて発色させた。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たものそれぞれ）は、還元および非還元条件において、予想通りの分子量（ＦＧＦ−２０の分子量）の単一バンドとして移動し、ＣＧ５３１３５特異的抗血清に対し免疫反応性であった。
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、ウサギポリクローナル抗ＣＧ５３１３５血清を用いたウエスタンブロットにより同定した（図６）。精製ＣＧ５３１３５−０５は、タンパク質１０μｇを４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにかけて分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移した。膜を一次抗体（ポリクローナル抗ＣＧ５３１３５血清）と、続いて二次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ標識、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベーションし、標準的な技術を用いて発色させた。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たものそれぞれ）は、還元および非還元条件において、予想通りの分子量（ＦＧＦ−２０の分子量）の単一バンドとして移動し、ＣＧ５３１３５特異的抗血清に対し免疫反応性であった。
６．５ 実施例５：ＣＧ５３１３５生成物の効力
プロセス１およびプロセス２で得た精製タンパク質に反応したＮＩＨ ３Ｔ３細胞の細胞増殖により効力を測定した。細胞増殖は、リサズリン（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ試薬）からレソルフィンへの変換による蛍光を利用して、間接的に測定した。ＤＥＶ−１０（プロセス１）を参照標準物として用いたところ、プロセス２の暫定参照標準物が同等の１０１％の効力を持つことが見出された。プロセス２で製造した複数のロットを分析した。これらの結果を表７に示す。
プロセス１およびプロセス２で得た精製タンパク質に反応したＮＩＨ ３Ｔ３細胞の細胞増殖により効力を測定した。細胞増殖は、リサズリン（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ試薬）からレソルフィンへの変換による蛍光を利用して、間接的に測定した。ＤＥＶ−１０（プロセス１）を参照標準物として用いたところ、プロセス２の暫定参照標準物が同等の１０１％の効力を持つことが見出された。プロセス２で製造した複数のロットを分析した。これらの結果を表７に示す。
表７．ＤＥＶ−１０（プロセス１）を参照標準物として用いた、プロセス２のロットの効力
ＬＣおよびＭＳで同定された４つのピークから集められたＣＧ５３１３５−０５に関係する種の生物活性は、血清欠乏培養したＮＩＨ ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞を各種用量の単離ＣＧ５３１３５−０５関連種で処理し、ＤＮＡ合成時のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを測定することによって測定した。このアッセイでは、細胞は１０％のウシ胎児血清を加えたダルベッコ改良イーグル培地で培養した。細胞は９６ウエルプレートを用いて、１０％ＣＯ２／空気中、３７℃にて集密状態まで培養されてから、ダルベッコ改良イーグル培地の中で２４〜７２時間、飢餓状態に置かれた。ＣＧ５３１３５−０５関連種を加え、１０％ＣＯ２／空気中、３７℃にて１８時間インキュベーションした。ＢｒｄＵ（１０ｍＭ最終濃度）を加え、細胞と１０％ＣＯ２／空気の中で、３７℃にて２時間インキュベーションした。ＢｒｄＵの取り込みは、酵素結合免疫吸収アッセイによって、メーカー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の仕様書に従って測定された。
ピーク４については、物質が十分集まらなかったことから（ピーク４は、ＣＧ５３１３５−０５の全ピーク面積の３％未満であった）このアッセイに含めなかった。ＣＧ５３１３５−０５および残り３つ全ての画分（即ちピーク１、２、および３）から集めた物質は、用量依存的な様式でＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞にＤＮＡ合成を誘導した（表４）。ＰＩ２００は、バックグランドの２倍のＢｒｄＵの取り込みをもたらすタンパク質濃度として定義した。ＣＧ５３１３５−０５および測定可能な３つのピーク全てから回収されたＣＧ５３１３５−０５関連種は、０．７〜１１ｎｇ／ｍＬのＰＩ２００と、よく似た生物活性を示した（表８）。
表８．ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（ＤＥＶ１０）の生物活性：ＤＮＡ合成の誘導
６．６ 実施例６：生化学適合性に関する特性試験
下記表９に記載するような一次、二次、三次および四次構造を比較するための特性試験も実施した。プロセス１からの参照標準物（ＤＥＶ１０を指定）とプロセス２を用いて得た参照標準物との比較の結果を用いて、精製ＣＧ５３１３５タンパク質の生化学的性質をさらに明らかにした。
下記表９に記載するような一次、二次、三次および四次構造を比較するための特性試験も実施した。プロセス１からの参照標準物（ＤＥＶ１０を指定）とプロセス２を用いて得た参照標準物との比較の結果を用いて、精製ＣＧ５３１３５タンパク質の生化学的性質をさらに明らかにした。
表９．ＣＧ５３１３５−０５参照物質の生化学的特徴付け
６．７ 精製タンパク質の一次構造の特徴付け
６．７．１ ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ：ピーク同定
精製製剤原料（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、ＵＶおよびエレクトロスプレー質量分光検出の両方を具えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって更に分析した。プロセス１またはプロセス２いずれかからの精製タンパク質を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を移動相とする標準的なＨＰＬＣシステムを用いたタンパク質Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にかけた。この方法の溶出勾配は、４つのクロマトグラフィーピークが、それぞれ２６．６、２７．３、２８．５、および３０．０分に分離するように変更された（図７）。これらのピークを、エレクトロスプレー質量分析により特徴付けした。クロマトグラムから分かるように、プロセス１および２からの精製最終産物には４つの効力の等しいピークが存在した。しかしながら、これらのピークの割合（１、３、および４）は、プロセス２により精製された最終産物では遙かに低く、主なものはピーク２であった。
６．７．１ ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ：ピーク同定
精製製剤原料（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）を、ＵＶおよびエレクトロスプレー質量分光検出の両方を具えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって更に分析した。プロセス１またはプロセス２いずれかからの精製タンパク質を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を移動相とする標準的なＨＰＬＣシステムを用いたタンパク質Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にかけた。この方法の溶出勾配は、４つのクロマトグラフィーピークが、それぞれ２６．６、２７．３、２８．５、および３０．０分に分離するように変更された（図７）。これらのピークを、エレクトロスプレー質量分析により特徴付けした。クロマトグラムから分かるように、プロセス１および２からの精製最終産物には４つの効力の等しいピークが存在した。しかしながら、これらのピークの割合（１、３、および４）は、プロセス２により精製された最終産物では遙かに低く、主なものはピーク２であった。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分離で同定された各ピークを表１０に示す。
表１０．分子量の精密測定に基づくＣＧ５３１３５−０５のＲＰ−ＨＰＬＣ分離によるピーク同定
６．７．２ エドマン配列決定および全アミノ酸分析
プロセス１の参照標準物、ＤＥＶ１０、およびプロセス２の暫定参照標準物の実験的Ｎ末端アミノ酸配列を定性的に決定した。参照標準物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動的にポリビニリデンフルオライド膜に移した；各参照標準物に対応する、クマシー染色された〜２３ｋＤａの主要バンドを膜から切り出し、自動エドマン配列決定装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により分析した。２つの主要な配列の比較を下表１１に示す。各参照標準物の主要配列は同一であり、ＣＤ５３１３５−０５の理論的なＮ末端配列の残基３〜２０に一致した。
プロセス１の参照標準物、ＤＥＶ１０、およびプロセス２の暫定参照標準物の実験的Ｎ末端アミノ酸配列を定性的に決定した。参照標準物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動的にポリビニリデンフルオライド膜に移した；各参照標準物に対応する、クマシー染色された〜２３ｋＤａの主要バンドを膜から切り出し、自動エドマン配列決定装置（Ｐｒｏｃｉｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により分析した。２つの主要な配列の比較を下表１１に示す。各参照標準物の主要配列は同一であり、ＣＤ５３１３５−０５の理論的なＮ末端配列の残基３〜２０に一致した。
表１１．プロセス１および２のＣＧ５３１３５−０５の先頭２０アミノ酸に関するエドマン配列決定データ
表１２．プロセス１およびプロセス２の最終精製タンパク質の定量的アミノ酸分析
６．７．３ ＲＰ−ＨＰＬＣによるトリプシンマッピング
プロセス１および２の精製製剤原料を、酢酸ヨードを用いて還元およびアルキル化し、次に配列分析等級のトリプシンで消化した。トリプシンペプチドをＵＶおよびエレクトロスプレー質量分光検出器を両方備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離した。プロセス１またはプロセス２いずれかのトリプシン消化物を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を含む移動相を利用した、標準的なＨＰＬＣシステムを用いたＯＤＳ−１無孔性シリカカラム（Ｍｉｃｒａ、１．５μｍ；５３×４．６ｍｍ）にかけた。溶出されたペプチドは、２１４ｎｍのＵＶ（図８）および陽イオンエレクトロスプレー質量分光器によって検出された。プロセス１とプロセス２の２つのクロマトグラム間の主たる違いは、プロセス１トレースでは、明瞭なピークのピーク面積が減少していることである（８．２分のピーク；図８）。このピークはＴ１ペプチド、残基１〜４０に相当している。この観察結果は、このペプチドの源が、未変性のＣＧ５３１３５−０５に由来する場合、プロセス１の材料により多く存在している（ピーク３、図７）ことから予測通りである。
プロセス１および２の精製製剤原料を、酢酸ヨードを用いて還元およびアルキル化し、次に配列分析等級のトリプシンで消化した。トリプシンペプチドをＵＶおよびエレクトロスプレー質量分光検出器を両方備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離した。プロセス１またはプロセス２いずれかのトリプシン消化物を、水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸を含む移動相を利用した、標準的なＨＰＬＣシステムを用いたＯＤＳ−１無孔性シリカカラム（Ｍｉｃｒａ、１．５μｍ；５３×４．６ｍｍ）にかけた。溶出されたペプチドは、２１４ｎｍのＵＶ（図８）および陽イオンエレクトロスプレー質量分光器によって検出された。プロセス１とプロセス２の２つのクロマトグラム間の主たる違いは、プロセス１トレースでは、明瞭なピークのピーク面積が減少していることである（８．２分のピーク；図８）。このピークはＴ１ペプチド、残基１〜４０に相当している。この観察結果は、このペプチドの源が、未変性のＣＧ５３１３５−０５に由来する場合、プロセス１の材料により多く存在している（ピーク３、図７）ことから予測通りである。
６．８ 実施例８：二次構造の特徴付け：精製タンパク質の円偏光二色性分光測定
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２両方からのものについて、それぞれ）の遠ＵＶ円偏光二色性スペクトルは、２２６〜２２７ｎｍに最大幅を持ち、約２０６ｎｍに鋭い最小幅を持つことを特徴とした。両特徴は他の線維芽細胞成長因子に共通しており、βシートおよびβターンに富む二次構造を示唆している。ＤＥＶ１０参照標準物およびＰＸ３５３６Ｇ００１−Ｈ参照標準物の遠ＵＶ円偏光二色スペクトルは共にこれらの特徴を示し、かつほとんど同一であった（図９）。スペクトルの僅かな違いは、実験誤差によるものである。
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２両方からのものについて、それぞれ）の遠ＵＶ円偏光二色性スペクトルは、２２６〜２２７ｎｍに最大幅を持ち、約２０６ｎｍに鋭い最小幅を持つことを特徴とした。両特徴は他の線維芽細胞成長因子に共通しており、βシートおよびβターンに富む二次構造を示唆している。ＤＥＶ１０参照標準物およびＰＸ３５３６Ｇ００１−Ｈ参照標準物の遠ＵＶ円偏光二色スペクトルは共にこれらの特徴を示し、かつほとんど同一であった（図９）。スペクトルの僅かな違いは、実験誤差によるものである。
６．９ 実施例９：三次構造の特徴付け
６．９．１ 精製タンパク質の近ＵＶ円偏光二色分光測定
タンパク質の近ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、タンパク質の芳香族アミノ酸の数および方向を反映している。同一数の芳香族アミノ酸を有するタンパク質については、それらの近ＵＶ ＣＤスペクトルの差は芳香族アミノ酸の位置および方向の差を表す。芳香族アミノ酸の位置および方向は、タンパク質の三次構造の尺度である。従って、タンパク質の近ＵＶ ＣＤスペクトルの差は三次構造の差を表している。
６．９．１ 精製タンパク質の近ＵＶ円偏光二色分光測定
タンパク質の近ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、タンパク質の芳香族アミノ酸の数および方向を反映している。同一数の芳香族アミノ酸を有するタンパク質については、それらの近ＵＶ ＣＤスペクトルの差は芳香族アミノ酸の位置および方向の差を表す。芳香族アミノ酸の位置および方向は、タンパク質の三次構造の尺度である。従って、タンパク質の近ＵＶ ＣＤスペクトルの差は三次構造の差を表している。
ＤＥＶ１０参照標準物およびＰＸ３５３６Ｇ００１−Ｈ参照標準物の近ＵＶ ＣＤスペクトルを図１０に示す。これら２つのスペクトルの間に有意な差はなく、両参照標準物がそれらの三次構造に有意な差を有していないことを示唆する。
６．９．２ 精製タンパク質の二次微分ＵＶ吸収分光測定
芳香族アミノ酸のＵＶ吸収は、アミノ酸の微小環境の影響を受ける。タンパク質の中に埋没している芳香族アミノ酸は、表面に露出している残基に比べ極性の低い微小環境に在る。この極性の差は、芳香族アミノ酸のＵＶ吸収に大きな影響を及ぼす。微小環境の違いは、極端な例では、芳香族アミノ酸のスペクトルを４〜６ｎｍシフトさせる。個々のタンパク質について、タンパク質ＵＶスペクトルの二次微分を計算して、これらの変化をモニタリングした。タンパク質の二次微分ＵＶ吸収スペクトルは、個別の芳香族アミノ酸に対応する極小値を含んでいる。これら極小値の波長は、アミノ酸の微小環境を反映している。それゆえに、これら極小値の変化は、タンパク質の立体構造（三次）の変化を表す。
芳香族アミノ酸のＵＶ吸収は、アミノ酸の微小環境の影響を受ける。タンパク質の中に埋没している芳香族アミノ酸は、表面に露出している残基に比べ極性の低い微小環境に在る。この極性の差は、芳香族アミノ酸のＵＶ吸収に大きな影響を及ぼす。微小環境の違いは、極端な例では、芳香族アミノ酸のスペクトルを４〜６ｎｍシフトさせる。個々のタンパク質について、タンパク質ＵＶスペクトルの二次微分を計算して、これらの変化をモニタリングした。タンパク質の二次微分ＵＶ吸収スペクトルは、個別の芳香族アミノ酸に対応する極小値を含んでいる。これら極小値の波長は、アミノ酸の微小環境を反映している。それゆえに、これら極小値の変化は、タンパク質の立体構造（三次）の変化を表す。
精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２の両方から得たそれぞれのもの）の二次微分ＵＶ吸収スペクトルを、２５０〜３００ｎｍの間の７つの極小値によって特徴付けした。下表１３に、かつ図１１に定性的に示すように、ＤＥＶ１０参照標準物およびＰＸ３５３６Ｇ００１−Ｈ参照標準物の両方について、７つ全ての極小値の波長に有意な違いは無かった。これらのデータは、両標準参照物中の、個々の芳香族アミノ酸を取り巻く微小環境は極めて類似していることを証明しており、これら２つの参照標準物の間に有意な三次構造の違いが存在しないことを示唆している。
表１３．プロセス１および２の二次微分ＵＶ吸収スペクトルデータ
６．１０ 実施例１０：四次構造の特徴付け
６．１０．１ 精製タンパク質の示差走査熱量測定
示差走査熱量分析は、温度に伴うサンプルの熱量（エンタルピー）または比熱の変化の検出に基づいている。熱エネルギーがサンプルに供給されると、そのエンタルピーおよびその温度は、サンプルの比熱によって、加わったそのエネルギーに応じて決まる量だけ上昇する。タンパク質の比熱は、特別な物理状態では温度と共にゆっくりと変化するが、状態変化時、例えばタンパク質の融解または変性時に不連続的に変化する。
６．１０．１ 精製タンパク質の示差走査熱量測定
示差走査熱量分析は、温度に伴うサンプルの熱量（エンタルピー）または比熱の変化の検出に基づいている。熱エネルギーがサンプルに供給されると、そのエンタルピーおよびその温度は、サンプルの比熱によって、加わったそのエネルギーに応じて決まる量だけ上昇する。タンパク質の比熱は、特別な物理状態では温度と共にゆっくりと変化するが、状態変化時、例えばタンパク質の融解または変性時に不連続的に変化する。
図１２に見ることができるように、精製タンパク質の融解曲線は似ており、平均Ｔｍ（融解温度）はプロセス１では６２．２５℃であり、プロセス２では６２．０２℃である。これらの違いは、装置の実験誤差の範囲内である。
６．１１ 実施例１１：精製タンパク質のスルフヒドリル含有量の測定
プロセス１およびプロセス２のスルフヒドリル含有量を測定した（表１４）。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２からのものそれぞれ）を、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）を用いた、一般的にエルマン試薬と呼ばれるものを用いて、分光光学的に総スルフヒドリル含有量について分析した。結果は、最終産物中の測定可能なスルフヒドリルの総量は、プロセス１およびプロセス２について同じであり、精製タンパク質中の理論的スルフヒドリルの全てをまかなうのに十分な量であった。
プロセス１およびプロセス２のスルフヒドリル含有量を測定した（表１４）。精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２からのものそれぞれ）を、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）を用いた、一般的にエルマン試薬と呼ばれるものを用いて、分光光学的に総スルフヒドリル含有量について分析した。結果は、最終産物中の測定可能なスルフヒドリルの総量は、プロセス１およびプロセス２について同じであり、精製タンパク質中の理論的スルフヒドリルの全てをまかなうのに十分な量であった。
表１４．精製タンパク質（プロセス１およびプロセス２、それぞれ）について行ったその他特徴付けアッセイの結果
６．１２ 実施例１２：ＣＧ５３１３５を含む改良調合物
市販製品に求められる３つの要求事項：（１）配送を容易にするために、最低保存温度が２〜８℃であること；（２）商業流通システムに合わせて、製品は上記保存温度において少なくとも１８ヶ月間安定であること；および（３）製品は商業規模の装置を用いて製造され、かつプロセスを様々な商業的な契約製造者に移転できること、を満たす新規調合物を開発した。
市販製品に求められる３つの要求事項：（１）配送を容易にするために、最低保存温度が２〜８℃であること；（２）商業流通システムに合わせて、製品は上記保存温度において少なくとも１８ヶ月間安定であること；および（３）製品は商業規模の装置を用いて製造され、かつプロセスを様々な商業的な契約製造者に移転できること、を満たす新規調合物を開発した。
新規調合物は、０．５Ｍの塩形態のアルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０に加えられた６．２節記載のプロセスで作られたタンパク質産物（「プロセス２タンパク質」）１０ｍｇ／ｍｌから成る。凍結乾燥産物は、加速安定性データに基づき、２〜８℃で少なくとも１８ヶ月間安定であると予想された。新規調合物に対し、米国出願第１０／４３５，０８７号の従来の調合物は、以下の理由から凍結乾燥できない：第一に、酢酸緩衝液の酸成分が酢酸であり、これが凍結乾燥中に昇華するため。この酢酸の凍結乾燥による損失によりｐＨは＞７．５に上昇し、目標のｐＨ５．３から離れることになる。第二の理由は、グリセロールの虚脱温度が＜−４５℃であり、このことがこの調合物を商業的に凍結乾燥できなくさせている。殆どの市販の凍結乾燥機は、棚温度が−４５〜−５０℃であり、温度変動±３℃である。
次の４つの予想外のＣＧ５３１３５の特性が見つかり、これらを用いて新規調合物を開発した：（１）＞０．４Ｍの、高濃度のアルギニン濃度が、溶解度を＞３０ｍｇ／ｍＬまで高めた；（２）アルギニンの硫酸塩の使用が溶解度を、少なくとも２〜６倍高めた；（３）緩衝化塩としてのリン酸ナトリウムの最適濃度が５０ｍＭであり、これに伴って２５、７５、および１００ｍＭの濃度に比べ溶解度が少なくとも１〜２倍上昇する；および（４）透析濾過／限外濾過工程中に界面活性剤を加えることが凝集塊の形成を最小限に抑える。凍結乾燥調合物の開発では、新規調合物の各成分の溶解度を個別に評価した。ＣＧ５３１３５−０５を沈殿緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰｉ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｌ−アルギニンＨＣｌ、２．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を用いて沈殿させた。沈殿物は、ｐＨ６．５の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄して、残留するアルギニンおよび硫安を除去した。洗浄した沈殿物を、次の表にリストアップした以下の各緩衝液に再溶解した。以下はデータの例である。
表１５．＞０．４Ｍの高濃度アルギニンは、溶解度を＞３０ｍｇ／ｍＬまで高める
表１６．緩衝化塩が５０ｍＭの時の、リン酸ナトリウムの最適濃度
緩衝化塩としてのリン酸ナトリウムの最適濃度を観察した（表１６）。リン酸ナトリウムの最適濃度は５０ｍＭで、２５、７５、および１００ｍＭの濃度と比較して少なくとも１〜２倍の溶解度を示した。
表１７．アルギニンの硫酸塩の使用は、溶解度を少なくとも１〜３倍高める
表１８．透析濾過／限外濾過工程での界面活性剤の添加は、凝集塊の形成を最小限に抑える
新規調合物は次の利点を有している：（１）凍結乾燥産物は２〜８℃の保存温度を有すること；（２）２〜８℃で保存した時、少なくとも１８ヶ月の推定有効期間を持つ凍結乾燥産物は、＞３０ｍｇ／ｍＬの溶解度を達成すること；および（３）凍結乾燥産物が、市販の装置で容易に凍結乾燥できる−３０℃の虚脱温度を有していること。アルギニン、硫酸塩、および表面活性化剤とＣＧ５３１３５の間の相互作用は予想外であった。
６．１３ 実施例１３：ＦＧＦ−２０核酸配列中の一塩基多形の同定
この実施例は、幾つかのＦＧＦ−２０の一塩基多形（ＳＮＰ）をどのように同定したかを明らかにする。ＳＮＰは、幾つかの例では、「ｃＳＮＰ」とも称され、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源があることを表すこともある。遺伝子内にＳＮＰが発生すると、遺伝子がコードするアミノ酸を、ＳＮＰの位置で変えることがある。遺伝子内ＳＮＰはサイレントであることもあり、この場合ＳＮＰを含むコドンは遺伝子コードの縮重性の結果、同一のアミノ酸をコードする。遺伝子領域外、または遺伝子内のイントロンの中にＳＮＰが発生した場合は、タンパク質のアミノ酸配列に変化を起こすことはないが、発現パターンの制御が変わることがある。非限定例としては、一過性の発現、生理的反応の制御、細胞タイプ発現制御、発現の強さ、および転写されたメッセージの安定性が挙げられる。
この実施例は、幾つかのＦＧＦ−２０の一塩基多形（ＳＮＰ）をどのように同定したかを明らかにする。ＳＮＰは、幾つかの例では、「ｃＳＮＰ」とも称され、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源があることを表すこともある。遺伝子内にＳＮＰが発生すると、遺伝子がコードするアミノ酸を、ＳＮＰの位置で変えることがある。遺伝子内ＳＮＰはサイレントであることもあり、この場合ＳＮＰを含むコドンは遺伝子コードの縮重性の結果、同一のアミノ酸をコードする。遺伝子領域外、または遺伝子内のイントロンの中にＳＮＰが発生した場合は、タンパク質のアミノ酸配列に変化を起こすことはないが、発現パターンの制御が変わることがある。非限定例としては、一過性の発現、生理的反応の制御、細胞タイプ発現制御、発現の強さ、および転写されたメッセージの安定性が挙げられる。
エクソンの連結プロセスにより作られたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アッセンブリーを、以下の基準から選択し、伸長した：初期または伸長後の配列の全てまたは一部と９８％の同一性を有する領域を持つゲノムクローンを、関連配列を用いてＢＬＡＳＴＮ検索にかけ、ヒトゲノムデータベースに問い合わせを行った。上記同一性は、これらのクローンがこれらＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アッセンブリーのゲノム遺伝子座を含んでいることを示していることから、さらに分析を進めるために得られたゲノムクローンの選択を行った。これら配列を、推定コーディング領域および既知ＤＮＡおよびタンパク質配列との類似性について分析した。これらの分析に用いたプログラムとしては、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄ、およびその他関連プログラムが挙げられる。
選択したＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アッセンブリーがこれらの領域をマップしたことから、いくつかのゲノム領域が追加して同定された。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）配列は、相同性およびエクソン予測によって同定された領域と重複している。それらはまた、断片の位置が類似性、または元々の予測配列に含まれるエクソン予測から同定されたゲノム領域に近いことから含められることもある。こうして同定された配列は、ヒトの手で組み立てられ、次にＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ‘ｓ ｈｕｍａｎ ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）データベースから得た１つもしくは複数の追加配列を用いて伸長した。含めるのに相応しいＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）断片は、ＣｕｒａＴｏｏｌｓ（登録商標）プログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって、または分析したゲノムクローンの適切な領域にマッピングされるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ断片を見つけることによって同定した。
上記の手順によって規定された領域を次にヒトの手で統合し、例えば元の断片中の塩基の誤読によって、または予測されたエクソン結合、ＥＳＴの一および類似配列領域の間の矛盾から生じる、見かけ上の矛盾点を補正し、本明細書に開示されている最終的な配列を得た。必要に応じて、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）アッセンブリーおよびゲノムクローンを同定および分析するプロセスを再調整し、全長配列を得た（Ａｌｄｅｒｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０（８）１２４９〜１２６５（２０００））。
表１９には改変体を個別に示したが、全てまたは選択した改変体の任意の組み合わせも本発明の範囲内である。
表１９．ＣＧ５３１３５−０１（配列番号１および２）のＳＮＰ
６．１４ 実施例１４：平滑端型ＦＧＦ−２０に反応したＮＩＨ ３Ｔ３細胞内へのブロモデオキシウリジン取り込みの刺激
ＦＧＦ−２０の残基２４〜２１１を発現しているベクター（（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０、表１および配列番号３２（ＣＧ５３１３５−１７）を参照）を調製した。平滑端型を組み入れたベクターを用いて得たコンディショニングベクターで処理したＮＩＨ ３Ｔ３細胞へのＢｒｄＵの取り込みを、完全長のＦＧＦ−２０をコードするベクターを用いたコンディショニング培地での処理に対する反応と比較した。この実験は次のようにして行った：
２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、リポフェクタミン２０００を用いて、メーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のプロトコール通りにトランスフェクションした。トランスフェクション５時間前に、細胞に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。ＢｒｄＵおよび増殖アッセイのためのタンパク質を調製するために、トランスフェクション１８時間後に細胞を洗浄し、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を与えた。４８時間後、培地を捨て、細胞単層を１００μＭのスラミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の入った０．５ｍｌのＤＭＥＭと３０分間、４℃でインキュベーションした。次にスラミン抽出コンディショニング培地を取り除き、遠心分離（５分間；２０００Ｘｇ）で清明化し、カルボキシル末端のポリヒスチジンタグを利用したＴＡＬＯＮ金属親和性クロマトグラフィーに、メーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の取扱説明書に従ってかけた。保持された融合タンパク質は、イミダゾールでカラムを洗浄することによって放出した。
ＦＧＦ−２０の残基２４〜２１１を発現しているベクター（（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０、表１および配列番号３２（ＣＧ５３１３５−１７）を参照）を調製した。平滑端型を組み入れたベクターを用いて得たコンディショニングベクターで処理したＮＩＨ ３Ｔ３細胞へのＢｒｄＵの取り込みを、完全長のＦＧＦ−２０をコードするベクターを用いたコンディショニング培地での処理に対する反応と比較した。この実験は次のようにして行った：
２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、リポフェクタミン２０００を用いて、メーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のプロトコール通りにトランスフェクションした。トランスフェクション５時間前に、細胞に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。ＢｒｄＵおよび増殖アッセイのためのタンパク質を調製するために、トランスフェクション１８時間後に細胞を洗浄し、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を与えた。４８時間後、培地を捨て、細胞単層を１００μＭのスラミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の入った０．５ｍｌのＤＭＥＭと３０分間、４℃でインキュベーションした。次にスラミン抽出コンディショニング培地を取り除き、遠心分離（５分間；２０００Ｘｇ）で清明化し、カルボキシル末端のポリヒスチジンタグを利用したＴＡＬＯＮ金属親和性クロマトグラフィーに、メーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の取扱説明書に従ってかけた。保持された融合タンパク質は、イミダゾールでカラムを洗浄することによって放出した。
ＦＧＦ−２０タンパク質の濃度は、既知濃度のＶ５−タグ付きタンパク質を用いて作成した標準曲線を利用して、ウエスタン分析から推定した。ウエスタン分析では、コンディショニング培地をトランスフェクション４８時間後に集め、次に細胞単層を、１００μＭスラミンを含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭと３０分間、４℃でインキュベーションした。その後スラミン含有コンディショニング培地を集めた。
組換え体ＦＧＦ−２０および（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイを用いて、それらのＤＮＡ合成誘導能について試験した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＣＣＤ−１０７０Ｓｋ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０９１）またはＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２７）を９６ウエルプレートで〜１００％集密度まで培養し、ＤＭＥＭで洗浄してから２４時間（ＮＩＨ ３Ｔ３）または４８時間（ＣＣＤ−１０７０ＳｋおよびＭＧ−６３）ＤＭＥＭの中で血清飢餓状態に置いた。次に、組換えＦＧＦ−２０または（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０を細胞に１８時間加えた。ＢｒｄＵアッセイを、メーカー仕様書（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従い、５時間のＢｒｄＵ取り込み時間で行った。
結果を図１３に示す。（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０が試験した１０ｎｇ／ｍＬという低濃度においても高い活性を維持していることが示された。この濃度では、完全長のＦＧＦ−２０の活性は大きく低下し、コントロールのレベルに近くなる。（ｄ１−２３）ＦＧＦ−２０は、完全長ＦＧＦ−２０よりも少なくとも５倍活性であると推測された。
６．１５．実施例１５：ＣＧ５３１３５による細胞増殖反応（研究Ｌ−１１７．０１およびＬ−１１７．０２）
実験は、ＣＧ５３１３５、例えば全長タグ付き改変体（ＣＧ５３１３５−０１）、欠失改変体（ＣＧ５３１３５−０２）、および全長コドン最適化タグ無し改変体（ＣＧ５３１３５−０５）に対する、代表的なタイプの細胞の増殖反応を評価するために行われた。
実験は、ＣＧ５３１３５、例えば全長タグ付き改変体（ＣＧ５３１３５−０１）、欠失改変体（ＣＧ５３１３５−０２）、および全長コドン最適化タグ無し改変体（ＣＧ５３１３５−０５）に対する、代表的なタイプの細胞の増殖反応を評価するために行われた。
材料および方法：
異種タンパク質発現：これらの実験にはＣＧ５３１３５−０１（バッチ４Ａおよび６）を用いた。タンパク質はｐＥＴＭＹ−ｈＦＧＦ２０Ｘ／ＢＬ２１発現ベクターの完全長ＣＧ５３１３５−０１を用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて発現させた。細胞を集めて破壊し、次に可溶性タンパク質画分を濾過して清明化し、金属キレート化カラムに通した。最終タンパク質画分を１ＭのＬアルギニンを加えたリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対し透析した。タンパク質サンプルは、−７０℃で保管した。
異種タンパク質発現：これらの実験にはＣＧ５３１３５−０１（バッチ４Ａおよび６）を用いた。タンパク質はｐＥＴＭＹ−ｈＦＧＦ２０Ｘ／ＢＬ２１発現ベクターの完全長ＣＧ５３１３５−０１を用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて発現させた。細胞を集めて破壊し、次に可溶性タンパク質画分を濾過して清明化し、金属キレート化カラムに通した。最終タンパク質画分を１ＭのＬアルギニンを加えたリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対し透析した。タンパク質サンプルは、−７０℃で保管した。
これらの実験には、ＣＧ５３１３５−０２（バッチ１および１３）も用いた。タンパク質は、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に挿入された欠失改変体ＣＧ５３１３５−０２を用いて形質転換した大腸菌、ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に発現させた。研究細胞バンク（ＲＣＢ）を作製し、ＲＣＢを起源とする細胞を発酵してＣＧ５３１３５−０２を含有する細胞ペーストを調製した。細胞膜を高圧ホモジェナイザーを用いて破壊し、溶解物を遠心分離して清明にした。ＣＧ５３１３５−０２は、イオン交換クロマトグラフィを用いて精製した。最終タンパク質画分を、調合緩衝液（１００ｍＭクエン酸、１ｍＭエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、および１ＭのＬアルギニン）に対し透析した。
これらの実験ではＣＧ５３１３５−０５、ＤＥＶ１０も使用したが、これらはＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）によって下記６．１８．１節に記載したプロセス１通りに調製された。
ＢｒｄＵ取り込み：増殖活性は、血清飢餓培養した細胞を一定量の作用物質で処理し、ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵの取り込みを計測することによって測定した。細胞は、１０％のウシ胎児血清または１０％のウシ血清をメーカーが推奨する通りに補充した、各メーカーが推奨する基本培地で培養した。細胞は１０％ＣＯ２／空気（脱分化した軟骨細胞およびＮＨＯｓｔについては５％で準集密状態にした）中、３７℃で、９６ウエルプレートの中で集密状態まで増殖させた。次に細胞を各基本増殖培地で２４〜７２時間飢餓状態に置いた。大腸菌またはｐＣＥＰ４／ＳｅｃもしくはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ２０Ｘを多く含むコンディショニング培地から精製したＣＧ５３１３５タンパク質を１８時間加えた（１０μＬ／１００μＬ培養物）。ＢｒｄＵの取り込みは、メーカー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の仕様書通りにアッセイした。
増殖アッセイ：増殖活性は、培養した細胞を所定の作用物質で、一定期間処理した後に細胞数を測定して得た。一般的には、６ウエル皿で〜２０％集密度まで増殖させた細胞をＣＧ５３１３５またはコントロールを補充した基本培地で処理し、数日間インキュベーションし、トリプシン処理した後Ｃｕｌｔｅｒ Ｚ１パーティクルカウンターを用いて細胞数測定した。
結果：
間葉細胞の増殖：組換えＣＧ５３１３５が線維芽細胞のＤＮＡ合成を刺激できるか決定するために、ＣＧ５３１３５−０１処理したＮＩＨ ３Ｔ３マウス胚性肺線維芽細胞を用いてＢｒｄＵ取り込みアッセイを行った。組換えＣＧ５３１３５−０１は、用量依存的な様式でＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞にＤＮＡ合成を誘導した（図１４（Ａ））。ＤＮＡ合成は、一般的には、〜１０ｎｇ／ｍＬの半最大濃度で誘導された。これに対し、細胞から精製されたビヒクルコントロールで処理した場合には、ＤＮＡ合成は誘導されなかった。
間葉細胞の増殖：組換えＣＧ５３１３５が線維芽細胞のＤＮＡ合成を刺激できるか決定するために、ＣＧ５３１３５−０１処理したＮＩＨ ３Ｔ３マウス胚性肺線維芽細胞を用いてＢｒｄＵ取り込みアッセイを行った。組換えＣＧ５３１３５−０１は、用量依存的な様式でＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞にＤＮＡ合成を誘導した（図１４（Ａ））。ＤＮＡ合成は、一般的には、〜１０ｎｇ／ｍＬの半最大濃度で誘導された。これに対し、細胞から精製されたビヒクルコントロールで処理した場合には、ＤＮＡ合成は誘導されなかった。
ＣＧ５３１３５−０１はＣＣＤ−１０７０Ｓｋ細胞正常ヒト包皮線維芽細胞、ＭＧ−６３骨肉腫細胞株、およびウサギ滑膜細胞株、ＨＩＧ−８２を含む間葉起源のその他細胞にもＤＮＡ合成を誘導した。これに対し、ＣＧ５３１３５−０１は一次ヒト骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）、ヒト肺動脈平滑筋細胞、ヒト冠動脈平滑筋細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、またはマウス骨格筋細胞には有意なＤＮＡ合成増加をもたらさなかった。
組換えＣＧ５３１３５−０１が細胞増殖を指示できるか決定するために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を１μｇのＣＧ５３１３５−０１またはコントロールと共に４８時間培養し、その後細胞数を計測した（図１４（Ｂ））。このアッセイでは、ＣＧ５３１３５はコントロールに比べ、細胞数を約２倍増加させた。これらの結果は、ＣＧ５３１３５が成長因子として機能することを示している。
上皮細胞の増殖：組換えＣＧ５３１３５が上皮細胞のＤＮＡ合成を刺激し、細胞増殖を決定するために、ＣＧ５３１３５で処理した代表的な上皮細胞株でＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施した。幾つかの細胞株については、タンパク質処理の細胞数も測定した。
ＣＧ５３１３５が７８６−Ｏヒト腎癌細胞株に、用量依存的な様式でＤＮＡ合成を誘導することが見出された（図１４（Ｃ））。これに加えてＣＧ５３１３５−０１は、ＣＣＤ １１０６ ＫＥＲＴｒヒトケラチノサイト、Ｂａｌｂ ＭＫマウスケラチノサイト、および乳房上皮細胞株Ｂ５５８９を含む上皮起源のその他細胞にＤＮＡ合成を誘導した。
造血幹細胞の増殖：赤芽球細胞株であるＴＦ−１をＣＧ５３１３５−０１で処理した場合、ＤＮＡ合成に対する刺激効果は観察されなかった。これらのデータは、ＣＧ５３１３５−０１が赤血球起源の細胞には増殖を誘導しないことを示唆している。これに加えて、急性Ｔリンパ芽球白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔは、ＣＧ５３１３５−０１で処理した時には全く反応を示さなかったが、血清で処理した時にはＢｒｄＵ取り込みの力強い刺激が観察された。
内皮細胞に対するＣＧ５３１３５の作用：タンパク質治療薬は、血管新生、即ち内皮細胞が毛細血管に分化するプロセスを阻害または促進できる。ＣＧ５３１３５は線維芽細胞成長因子ファミリーに属し、その内の幾つかのメンバーが血管新生特性を有することから、内皮細胞株に対するＣＧ５３１３５の抗血管新生または汎血管新生作用について評価した。それらが癌での血管新生の解明に用いられている細胞タイプであることから次の細胞株を選んだ：ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＢＡＥＣ（ウシ動脈内皮細胞）、ＨＭＶＥＣ−ｄ（ヒト内皮細胞、皮膚毛細血管）。これらの内皮細胞タイプは形態形成分化をとげ、大血管（ＨＵＶＥＣ、ＢＡＥＣ）および毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ）を代表する。
ＣＧ５３１３５−０１処理は、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、またはウシ大動脈内皮細胞について細胞の生存を変えることはなく、ＢｒｄＵ取り込みに対する刺激効果も有していない。更に、ＣＧ５３１３５−０１処理は、ＨＵＶＥＣＳにおいて、新規血管の形成の重要事象である管形成を阻害しなかった。この結果は、ＣＧ５３１３５が抗血管新生特性を有していないことを示唆している。最後に、ＣＧ５３１３５−０１は、ＶＥＧＦが誘発するＨＵＶＥＣの細胞移動に影響を及ぼさず、それが転移に関わっていないことを示唆している。
上記の実験は、ＣＧ５３１３５−０２およびＣＧ５３１３５−０５タンパク質産物を用いても行われ、その結果は下記結論の節にまとめる。
結論
組換えＣＧ５３１３５−０１（ＣＧ５３１３５−０５と同一タンパク質をコードしている）は、インビトロにおいて、間葉細胞および上皮細胞（即ちＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＣＣＤ−１０７０正常ヒト皮膚線維芽細胞、ＣＣＤ−１１０６ヒトケラチノサイト、７８６−Ｏヒト腎癌細胞、ＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞、およびヒト乳房上皮細胞）に増殖反応を誘導したが、ヒト平滑筋、赤芽球、または内皮細胞には誘導しなかった。ＣＧ５３１３５−０１およびＣＧ５３１３５−０５と同様に、ＣＧ５３１３５−０２も間葉細胞および上皮細胞の増殖を誘導した。これに加えて、ＣＧ５３１３５−０２は、内皮細胞の増殖も誘導した。
組換えＣＧ５３１３５−０１（ＣＧ５３１３５−０５と同一タンパク質をコードしている）は、インビトロにおいて、間葉細胞および上皮細胞（即ちＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＣＣＤ−１０７０正常ヒト皮膚線維芽細胞、ＣＣＤ−１１０６ヒトケラチノサイト、７８６−Ｏヒト腎癌細胞、ＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞、およびヒト乳房上皮細胞）に増殖反応を誘導したが、ヒト平滑筋、赤芽球、または内皮細胞には誘導しなかった。ＣＧ５３１３５−０１およびＣＧ５３１３５−０５と同様に、ＣＧ５３１３５−０２も間葉細胞および上皮細胞の増殖を誘導した。これに加えて、ＣＧ５３１３５−０２は、内皮細胞の増殖も誘導した。
６．１６ 実施例１６：化学療法誘発口腔粘膜炎のハムスターモデルにおけるＣＧ５３１３５の活性（Ｎ−２１２研究）
ＣＧ５３１３５を、雄のゴールデンシリアンハムスターでの化学療法誘発口腔粘膜炎の治療について評価した（本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイで測定された）。
ＣＧ５３１３５を、雄のゴールデンシリアンハムスターでの化学療法誘発口腔粘膜炎の治療について評価した（本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイで測定された）。
材料および方法
本研究に用いたＣＧ５３１３５−０５（バッチ２９−ＮＢ８４９：７６）を、最終タンパク質画分を３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール（ｐＨ６．１）を含む調合緩衝液に対し透析したことを除いて６．５節に記載の通りに発現させ、精製した。
本研究に用いたＣＧ５３１３５−０５（バッチ２９−ＮＢ８４９：７６）を、最終タンパク質画分を３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール（ｐＨ６．１）を含む調合緩衝液に対し透析したことを除いて６．５節に記載の通りに発現させ、精製した。
この研究では、研究開始時に５〜６週齢の、同様の体重の雄のゴールデンシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。６０匹の雄のハムスターを、放射線照射前にそれぞれ１０匹ずつの６群に無作為に割り付けた。処理群の概要を表２０に示す。
表２０．処理群
コントロール群と比べた粘膜炎に対する各処置の影響を、表２１にリストアップしたパラメータに従って評価した。処置群間の統計差は、スチューデントのｔ検定、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、およびカイ二乗分析を用いて、０．０５を棄却限界値として決定した。
表２１．活性の評価に関するパラメータ
ビヒクルコントロール群（群１）およびＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理群（群２〜６）の間に、経時的な体重または生存率の統計学的に有意な差は無かった。
化学療法で一次誘導されるこの粘膜炎のモデルでは、口腔粘膜炎の治療にとって投与スケジュールが重要であった。第６日〜第１４日、または第１日〜第９日までのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ／日）の投与は、粘膜炎の経過または重篤度の顕著な改善をもたらさなかった（図１５）。第１日〜第１８日、または第１日から第６日までのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ／日）の投与は、重篤な粘膜炎の期間を有意に改善した（カイ二乗分析）。しかしながら、これらの処置は毎日の粘膜炎スコアに有意な改善はもたらさなかった（ランク合計分析）。１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物による処置（第１日〜第２日）は、本研究では、粘膜炎の経過および重篤度の両方に有意な影響を示した（図１５）。これらの結果は、化学療法薬と放射線の併用治療直後の、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を用いた短期の処置により、この粘膜炎のモデルでの疾患の転帰を改善されることを示唆している。
別の実験では、放射線照射後に開始した１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を用いたハムスターの処置（第１日〜第１８日）は、潰瘍発生を有意に低下し（ｐ＜０．００１）、ランク合計分析にて判定した時、これに併せて粘膜炎スコアも７日間有意に低下した（Ｎ−１９８試験）。このことは、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の投与が、粘膜毒性傷害後に投与したとき極めて有益な、放射線誘発口腔粘膜炎処置であることを示唆している。
さらに別の実験では、１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ＭのＬ−アルギニン、および３％グリセロールに調合）を第１〜２日に投与したところ、粘膜炎の重篤度が有意に低下した（Ｎ−２３７試験）。これらの結果は、上記の所見を確認している。
結論
ＣＧ５３１３５の活性を、第−４および−２日に６０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルで処理し、その後半粘膜毒性線量の放射線（〜３０Ｇｙ）を第０日目に照射したハムスターに誘導した粘膜炎のモデルで評価した。臨床上問題となる口腔粘膜炎（粘膜炎スコア≧３のもの）が〜第１５日に発生した。２、６、または１８日間ＣＧ５３１３５を腹腔内投与したところ、粘膜炎の重篤度は顕著に低下した。
ＣＧ５３１３５の活性を、第−４および−２日に６０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルで処理し、その後半粘膜毒性線量の放射線（〜３０Ｇｙ）を第０日目に照射したハムスターに誘導した粘膜炎のモデルで評価した。臨床上問題となる口腔粘膜炎（粘膜炎スコア≧３のもの）が〜第１５日に発生した。２、６、または１８日間ＣＧ５３１３５を腹腔内投与したところ、粘膜炎の重篤度は顕著に低下した。
６．１７．実施例１７：インビボのハムスター上皮細胞増殖に及ぼすＣＧ５３１３５−０５投与の作用（Ｎ−２２５研究）
ここに記載する実験は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物単回投与後（本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した）の胃腸管上皮および骨髄へのＢｒｄＵのインビボ取り込みを評価した。
ここに記載する実験は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物単回投与後（本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した）の胃腸管上皮および骨髄へのＢｒｄＵのインビボ取り込みを評価した。
材料および方法
雄の、５〜６週齢の、試験開始時の平均体重８２ｇのゴールデンシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を用いた。２５匹の雄のハムスターを、表２２に概要を示す、各５匹の群に無作為に割り付けた。
雄の、５〜６週齢の、試験開始時の平均体重８２ｇのゴールデンシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を用いた。２５匹の雄のハムスターを、表２２に概要を示す、各５匹の群に無作為に割り付けた。
表２２．処置群
ＢｒｄＵ投与および免疫組織学：犠牲２時間前に全ての動物にＢｒｄＵ５０ｍｇ／ｋｇをＩＰ投与し、試薬を増殖組織内に取り込ませた。安楽死時に次の組織を集めた；ほお袋粘膜、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および胸骨。全ての組織サンプルは、１０％中性緩衝化ホルマリンで２４時間固定してから７０％エタノールに移された。サンプルをトリミングし、パラフィンに包埋し、切片を作製してマウントした。上皮組織はＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈの製品であるＢｒｄＵ免疫組織学キット、カタログ番号ＨＣＳ２４を、メーカー指示書通りに用いて、免疫組織化学によりＢｒｄＵの取り込みについて染色した。
結果
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の全組織内へのＢｒｄＵ取り込みに及ぼす作用は、実質的には同じであった：ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製投与２時間後に、ＢｒｄＵ標識核の数の比較的小さな増加が観察された。これに続いてＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与４時間後には、標識された核の数は減少した。全ての組織が投与後８時間にＢｒｄＵ標識の劇的増加を示した。２４時間の時点では、直腸を除く全ての組織が、未処理コントロールに比べ標識された核の数の減少を示したが、直腸組織はコントロールに比べ僅かな上昇を示した。未処理の動物の直腸組織については、標識された細胞は観察されなかったことから、２４時間の時点で観察された２つの標識細胞は観察誤差として、または前記組織での細胞増殖レベルが低いはずであることから、データのバラツキであると考えられた。
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の全組織内へのＢｒｄＵ取り込みに及ぼす作用は、実質的には同じであった：ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製投与２時間後に、ＢｒｄＵ標識核の数の比較的小さな増加が観察された。これに続いてＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与４時間後には、標識された核の数は減少した。全ての組織が投与後８時間にＢｒｄＵ標識の劇的増加を示した。２４時間の時点では、直腸を除く全ての組織が、未処理コントロールに比べ標識された核の数の減少を示したが、直腸組織はコントロールに比べ僅かな上昇を示した。未処理の動物の直腸組織については、標識された細胞は観察されなかったことから、２４時間の時点で観察された２つの標識細胞は観察誤差として、または前記組織での細胞増殖レベルが低いはずであることから、データのバラツキであると考えられた。
結論
ＣＧ５３１３５のインビボの機械的活性を、インビボでのブロモデオキシウリジン標識を用いて評価し、粘膜組織に及ぼすＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の単回大量投与（１２ｍｇ／ｋｇ）の作用について２４時間にわたって調べた。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、ほお袋、空腸、直腸、ならびに骨髄の造血幹細胞の上皮細胞の分裂を刺激した。これら組織へのＢｒｄＵの取り込み上昇のピークは、ＣＧ５３１３５−０５投与後８時間目に見られた。全ての組織が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与に対し同じ時間に反応を示した。
ＣＧ５３１３５のインビボの機械的活性を、インビボでのブロモデオキシウリジン標識を用いて評価し、粘膜組織に及ぼすＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の単回大量投与（１２ｍｇ／ｋｇ）の作用について２４時間にわたって調べた。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、ほお袋、空腸、直腸、ならびに骨髄の造血幹細胞の上皮細胞の分裂を刺激した。これら組織へのＢｒｄＵの取り込み上昇のピークは、ＣＧ５３１３５−０５投与後８時間目に見られた。全ての組織が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与に対し同じ時間に反応を示した。
６．１８．実施例１８：マウスへのＣＧ５３１３５−０５投与による腸陰窩細胞増殖およびアポトーシスの調節（Ｎ−３４２）
本研究は、幹細胞と嬢細胞への作用とを識別すること、および胃腸管幹細胞損傷（例えば粘膜炎）を伴う症候群におけるＣＧ５３１３５の作用モードに関し洞察することを目的として、小腸陰窩細胞の回転に及ぼすＣＧ５３１３５の作用を評価した。更には、幹細胞の放射線感受性に及ぼすＣＧ５３１３５の作用についても評価した。本実施例のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定した。
本研究は、幹細胞と嬢細胞への作用とを識別すること、および胃腸管幹細胞損傷（例えば粘膜炎）を伴う症候群におけるＣＧ５３１３５の作用モードに関し洞察することを目的として、小腸陰窩細胞の回転に及ぼすＣＧ５３１３５の作用を評価した。更には、幹細胞の放射線感受性に及ぼすＣＧ５３１３５の作用についても評価した。本実施例のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定した。
「陰窩」とは陰窩の基部に向かう幹細胞の階層構造である。細胞は成熟するにつれて陰窩底部から陰窩最上部に向かって前進的に移動する。それゆえに、幹細胞とそれらの移動しながら増幅している嬢細胞とに対比的に影響する変化は、それぞれの細胞集団での事象の発生頻度の変化を見ることによって検知できる。細胞の位置は図１６に印した。このようにして陰窩の微小構造に及ぼすＣＧ５３１３５の作用を、陰窩の細胞充実性の観点で分析した。
実験計画
動物は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を１２ｍｇ／ｋｇ単回投与（ＩＰ）した後、様々な時間で犠牲にした。犠牲直前に、マウスにブロモデオキシウリジンを単回注射して標識し、Ｓ期の細胞を標識して陰窩細胞の増殖／アポトーシスに及ぼす薬剤の作用を判定した。マウスの体重を測定してから、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ、単回注射、ｉｐ）を投与した。動物６匹の群を、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物注射後０、３、６、９、１２、２４、４８時間目に犠牲にした。全ての動物が、犠牲４０分前にブロモデオキシウリジンの単回注射を受けた。
動物は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を１２ｍｇ／ｋｇ単回投与（ＩＰ）した後、様々な時間で犠牲にした。犠牲直前に、マウスにブロモデオキシウリジンを単回注射して標識し、Ｓ期の細胞を標識して陰窩細胞の増殖／アポトーシスに及ぼす薬剤の作用を判定した。マウスの体重を測定してから、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ、単回注射、ｉｐ）を投与した。動物６匹の群を、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物注射後０、３、６、９、１２、２４、４８時間目に犠牲にした。全ての動物が、犠牲４０分前にブロモデオキシウリジンの単回注射を受けた。
追加の、６匹のマウスの２群を用いて幹細胞の放射線感受性に及ぼすＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用を評価した（群８および９、表２３を参照）。１つの群は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理され（１２ｍｇ／ｋｇ、単回注射、ｉｐ）、もう一方の群はプラセボコントロールが注射された。注射から２４時間後に動物に１ＧｙのＸ線（幹細胞にアポトーシスを特異的に誘導する）を照射し、続いて通常のインビボのＢｒｄＵ標識を行った。４．５時間後（最大アポトーシス時）に動物を犠牲にした。
表２３．研究計画
腸陰窩細胞の増殖およびアポトーシスの調節：手順
Ｓ期の分裂細胞は全て注射されたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込むことから、細胞周期を回転している細胞のマーカーとなる。放射線照射された動物を、無麻酔でパースペクスジグに入れ、０．７Ｇｙ／分の線量率で１ＧｙのＸ線を全身照射した。低レベルの放射線照射は、小腸幹細胞集団にアポトーシスを誘導したが、より成熟した細胞には誘導しなかった。
Ｓ期の分裂細胞は全て注射されたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込むことから、細胞周期を回転している細胞のマーカーとなる。放射線照射された動物を、無麻酔でパースペクスジグに入れ、０．７Ｇｙ／分の線量率で１ＧｙのＸ線を全身照射した。低レベルの放射線照射は、小腸幹細胞集団にアポトーシスを誘導したが、より成熟した細胞には誘導しなかった。
小腸を取り出し、カルノワ固定液で固定し、組織分析向けに処理した（パラフィン包埋した）。１セットの３ｍｍの切片をＢｒｄＵについて免疫標識し、１セットの切片をＨ＆Ｅで染色した。小腸陰窩の縦断片を、ＢｒｄＵまたはアポトーシス／有糸分裂核いずれかの存在について分析した。動物一匹あたり５０の半陰窩をスコア化した。
群１〜７（結果の群Ａ）を試験し、４８時間にわたりＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用を決定した。群８〜９（結果の群Ｂ）を試験して、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が低線量の放射線照射後に発生するアポトーシス細胞の数を変えるか、即ちＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が放射線感受性幹細胞集団に影響するかについて決定した。
得られた結果は、統計差について更に分析を加える各動物群における陰窩の頻度分布を示している。組織サンプルを、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理後３、６、９、１２、２４、および４８時間目に集めた。本試験のエンドポイントはアポトーシス、有糸分裂指数、および増殖であった。
結果：
群Ａ
群１〜７では（表２３）、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、自然発生アポトーシスに対して有意な作用を有していなかった。有糸分裂指数についても同様の結果が得られた（表２４）。しかしながら表２４に示すように、ＢｒｄＵ取り込みの結果は、次のようなことを示した：
ａ）３時間目に増殖領域（位置１２〜２２）の拡大／増加が見られた。
ｂ）９時間までは、多くの位置で大きな増殖作用が記録された。
ｃ）１２時間までは、位置４〜８だけが取り込み増加を示した（幹細胞）
ｄ）２４時間までは、増殖に顕著な阻害があった。
ｅ）４８時間までは、取り込みはコントロールのレベルと同等であった。
群Ａ
群１〜７では（表２３）、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、自然発生アポトーシスに対して有意な作用を有していなかった。有糸分裂指数についても同様の結果が得られた（表２４）。しかしながら表２４に示すように、ＢｒｄＵ取り込みの結果は、次のようなことを示した：
ａ）３時間目に増殖領域（位置１２〜２２）の拡大／増加が見られた。
ｂ）９時間までは、多くの位置で大きな増殖作用が記録された。
ｃ）１２時間までは、位置４〜８だけが取り込み増加を示した（幹細胞）
ｄ）２４時間までは、増殖に顕著な阻害があった。
ｅ）４８時間までは、取り込みはコントロールのレベルと同等であった。
表２４．アポトーシス、有糸分裂、および増殖評価後の、陰窩における有意な細胞位置のまとめ
群Ｂ：
群８および９では（表２３）、幹細胞の放射線感受性を評価した。表２３に示すように、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物またはＰＢＳを、１Ｇｙの放射線を照射する１日前に投与した。放射線照射４．５時間後に組織を集めた。放射線誘導アポトーシスおよび有糸分裂指数の両方について、有意な作用は存在しなかった。しかしながらＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で事前処理してから放射線照射されたマウスでは、群Ａの結果と同じで、１２時間まで、位置４〜８について取り込みの増加および増殖の有意な阻害が見られた（表２４）。
群８および９では（表２３）、幹細胞の放射線感受性を評価した。表２３に示すように、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物またはＰＢＳを、１Ｇｙの放射線を照射する１日前に投与した。放射線照射４．５時間後に組織を集めた。放射線誘導アポトーシスおよび有糸分裂指数の両方について、有意な作用は存在しなかった。しかしながらＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で事前処理してから放射線照射されたマウスでは、群Ａの結果と同じで、１２時間まで、位置４〜８について取り込みの増加および増殖の有意な阻害が見られた（表２４）。
６．１９ 実施例１９：放射線照射傷害後のマウス腸陰窩生存率に対するＣＧ５３１３５−０５の予防的投与の作用（Ｎ−３４３）
本研究の目的は、Ｃｌｏｎｏｑｕａｎｔ（登録商標）アッセイを用いた、インビボでの、放射線による陰窩細胞死滅率に対するＣＧ５３１３５の効力を評価することである。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した。
本研究の目的は、Ｃｌｏｎｏｑｕａｎｔ（登録商標）アッセイを用いた、インビボでの、放射線による陰窩細胞死滅率に対するＣＧ５３１３５の効力を評価することである。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した。
マウスの体重を測定してから、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはプラセボを投与した。放射線照射２４時間前に、腹腔内（ｉｐ）に単回注射投与した。動物６匹の各群に、下表のように放射線を照射した。放射線量毎に薬物処理群およびプラセボ処理群の反応を比較した。
小腸を取り出し、カルノワ固定液で固定し、組織分析向けに処理した（パラフィン包埋した）。通常のプロトコールに従ってＨ＆Ｅ切片を調製した。各動物について、１０カ所の小腸周縁部を分析し、周縁部当たりの生存陰窩の数をスコア化し、群毎に平均を決定した。強くＨ＆Ｅ染色された細胞（パネート細胞を除く）を１０個以上含んでいる陰窩および無傷で、パイエル板を含まない周縁部だけをスコア化した。
陰窩のサイズの差によるスコア化の誤差を補正するために、平均の陰窩幅（その最も広い点を測定した）も測定した。補正は次のようにして行った：
補正後の周縁部当たりの陰窩数＝処理群Ｘ中の周縁部当たりの生存陰窩の平均数（未処理コントロールの平均陰窩幅／処理動物の平均陰窩幅）。
補正後の周縁部当たりの陰窩数＝処理群Ｘ中の周縁部当たりの生存陰窩の平均数（未処理コントロールの平均陰窩幅／処理動物の平均陰窩幅）。
表２５．研究計画
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の予防的投与後の陰窩生存率は、照射線量と逆相関を示し、照射線量が低いほど陰窩生存率は高かった（図１７（Ａ）および（Ｂ））。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の予防的投与は、陰窩数を有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。表２６は、タンパク質（ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物）を予防的投与した後の放射線照射について得られた保護係数を示している。保護係数（表２６）は、処理細胞と未処理細胞の比を表している。平均では、動物にＣＧ５３１３５−０５大腸菌生成物を放射線傷害前に投与すると、１２Ｇｙの線量において１．５５倍多い細胞が生存した。
６．２０．実施例２０：口腔粘膜炎の化学療法−放射線照射モデルに対するＣＧ５３１３５投与の作用（Ｎ−３４６研究）
材料および方法
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて完全長のコドン最適化したＣＧ５３１３５−０５で形質転換し、これら細胞の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を作製した。ＭＭＣＢに由来する細胞を発酵させて作製したＣＧ５３１３５−０５を含有する細胞ペーストを、高圧ホモジェナイザーを用いて溶解緩衝液中で溶解し、遠心分離にかけて清明化した。ＣＧ５３１３５−０５を、清明化した細胞溶解物から、イオン交換クロマトグラフィーおよび硫安沈殿のサイクル２回により精製した。最終タンパク質画分を調合緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール）に対し透析した。ビヒクルは３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．１、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロールを含む。本実施例のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって測定した。
材料および方法
大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、ｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて完全長のコドン最適化したＣＧ５３１３５−０５で形質転換し、これら細胞の製造マスター細胞バンク（ＭＭＣＢ）を作製した。ＭＭＣＢに由来する細胞を発酵させて作製したＣＧ５３１３５−０５を含有する細胞ペーストを、高圧ホモジェナイザーを用いて溶解緩衝液中で溶解し、遠心分離にかけて清明化した。ＣＧ５３１３５−０５を、清明化した細胞溶解物から、イオン交換クロマトグラフィーおよび硫安沈殿のサイクル２回により精製した。最終タンパク質画分を調合緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２００ｍＭソルビトール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール）に対し透析した。ビヒクルは３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．１、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロールを含む。本実施例のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって測定した。
この研究では、研究開始時５〜６週齢、平均体重８４ｇのゴールデンシリアンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ）を用いた。動物には耳パンチを用いて個別に番号を付け、ケージ当たり最高７匹までの小さな群で収納した。動物は、研究開始前に順応させた。この期間中、状態の悪い動物を排除するために、動物を毎日観察した。
６０匹のハムスターは、放射線照射前に１０匹ずつ、６群に無作為に分けた。各群は、表２７に掲載した様々な処置に割り付けられた。動物には、第−４および−２日に６０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵが投与され、０日目に、左頬粘膜に放射線を急性照射した。動物には、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、急性照射後第１日目についてのみ６、１２、２４、または４８ｍｇ／ｋｇ／日が、あるいは第１日および第２日に１２ｍｇ／ｋｇ／日がＩＰ投与された。粘膜炎は、第６日を開始日として隔日で評価し、第２８日の実験終了まで続けた（即ち第８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、および２８日）。
表２７．処理群
口腔粘膜炎の化学療法／放射線モデル：ハムスターの口腔粘膜炎の５−ＦＵ／急性放射線照射モデルは、粘膜炎の急性放射線照射モデルで行われた臨床観察（Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ ６９（４）：４３７（１９９０））を拡大するためにデザインされた実験モデルである。前者の急性放射線照射モデルは、成長因子およびサイトカインを含む抗粘膜炎化合物を予備評価できる、正確で効率的な、経済的な技術であることが証明されている（例えばＯｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ３６（４）：３７３〜３８１（２０００）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（８）：６０５〜６１２（１９９７）；Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ３３（１）：４７〜５４（１９９７）を参照）。
粘膜炎は、５−ウルオロウラシルを用いて、第−４および第−２日に腹腔内（ＩＰ）用量（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与して誘導した。全ての動物に、第０日目に放射線の単回照射（３０Ｇｙ／照射）を行った。放射線は、１６０キロボルト電位（１８．７５−ｍａ）の線源を用いて、焦点距離２１ｃｍ、３．０ｍｍのＡｌフィルターシステムで強化して発生させた。放射線照射は左頬袋粘膜を、１．３２Ｇｙ／分の比率で狙った。照射前、動物をケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射して麻酔した。左頬袋を裏返し、固定して、鉛のシールドで隔離した。この結果、第１４日付近をピークとする潰瘍性の口腔粘膜炎が発生した。
粘膜炎の評価：粘膜炎を評価する際は、動物を吸入麻酔薬で麻酔してから左頬袋を裏返した。粘膜炎は、妥当性が確認されている写真を用いたスケールと比べ、目視によって正常の０から重篤な潰瘍の５の範囲でスコア化した。スケールの内容を表２８に示す。
表２８．粘膜炎スコア値の説明
体重および生存率：各ハムスターは、試験期間中（即ち第−４日〜第２８日）、毎日体重測定を受けた。粘膜炎の重篤度および／または処理によって生ずる可能性のある毒性の指標として、処理群間に生じる可能性がある差を評価するために、体重および生存率をモニタリングおよび記録した。適切であれば、生存率をカプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ）対数順位分析を用いて分析した。体重増加の差は、個々の動物の体重増加率の曲線下面積（ＡＵＣ）について一元配置分散分析を、棄却限界値０．０５で行い評価した。
活性の評価：コントロール群と比較した、粘膜炎に及ぼす各処理の作用を、３以上のスコアを持つ動物日数のカイ二乗（χ２）分析を用いて評価し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）順位合計検定を用いて、各群の、それぞれの日のブラインド粘膜炎スコアを比較し評価を行った。いずれの例でも処理群をコントロール群を、棄却限界値を０．０５として比較した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位合計検定では、２日間、統計学的に有意な改善を示した場合を、一般的に陽性の結果に必要な最低の改善と見なした。
結果
粘膜炎：毎日の平均粘膜炎スコアを各群について計算し、表１８に示す。コントロール群の粘膜炎のピークは第１４日であり、このとき、この群の平均スコアは３．２であった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群は全て、第１６日にピークのスコアを有しており、その範囲は第１日に２４ｍｇ／ｋｇまたは４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群の３．０を最高に、第１日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群の２．６３までであった。粘膜炎スコアを評価するために、３以上のスコアを示した日数を、カイ二乗検定を用いて分析した。この分析の結果を表２９および図１８に示す。更に図１９は、カイ二乗分析によって計算した、粘膜炎スコア＞３の動物の重篤粘膜炎の長さを表している。１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された両群は、３以上のスコアの日数が有意に減少し、１日目だけ処理を受けた群は、第１および２日目に処理を受けた群に比べ僅かではあるがより有意であった（Ｐ＝０．００３）。第１日目に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、若干の改善を示したが有意ではなかった（Ｐ＝０．０９２）。２４ｍｇ／ｋｇおよび４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、本実施例では、実質的にコントロールと同じであった。
粘膜炎：毎日の平均粘膜炎スコアを各群について計算し、表１８に示す。コントロール群の粘膜炎のピークは第１４日であり、このとき、この群の平均スコアは３．２であった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群は全て、第１６日にピークのスコアを有しており、その範囲は第１日に２４ｍｇ／ｋｇまたは４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群の３．０を最高に、第１日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群の２．６３までであった。粘膜炎スコアを評価するために、３以上のスコアを示した日数を、カイ二乗検定を用いて分析した。この分析の結果を表２９および図１８に示す。更に図１９は、カイ二乗分析によって計算した、粘膜炎スコア＞３の動物の重篤粘膜炎の長さを表している。１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された両群は、３以上のスコアの日数が有意に減少し、１日目だけ処理を受けた群は、第１および２日目に処理を受けた群に比べ僅かではあるがより有意であった（Ｐ＝０．００３）。第１日目に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、若干の改善を示したが有意ではなかった（Ｐ＝０．０９２）。２４ｍｇ／ｋｇおよび４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、本実施例では、実質的にコントロールと同じであった。
表２９．３以上のスコアの粘膜炎を起こした動物の日数のカイ二乗分析
粘膜炎スコアの差の有意性は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位合計検定を用いて各評価日についてコントロール群と試験群とを比較して、更に分析した。この分析の結果を表３０に示すが、結果は、第１日に６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、第１４日（Ｐ＝０．０１０）および２６日（Ｐ＝０．０３１）についてのみ、コントロールに対し有意な改善を示したことを表している。第１日に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、第１４日（Ｐ＝０．０１１）、第１６日（Ｐ＝０．０３１）、第１８日（Ｐ＝０．００５）、および第２０日（Ｐ＝０．００３７）のみ有意な改善を示した。２４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、コントロールに対し有意な改善を示さなかった。４８ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、第１２日に有意な改善を示したが（Ｐ＝０．０３５）、第２６日（Ｐ＝０．０３６）および第２８日（Ｐ＝０．００６）では有意な悪化も示した。第１日及び第２日に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群は、第１４日（Ｐ＝０．０１０）および第１８日（Ｐ＝０．０４５）に、コントロールに対し有意な改善を示した。本試験において意味ある改善の基準は、粘膜スコアがコントロールに対し２日間、統計学的有意に改善することであることから、第１日に６ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群、ならびに第１および第２日に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群が、意味のある改善を示した。
表３０．Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位合計検定を用いて実施した場合の粘膜炎スコア
生存率：研究期間中、５匹の動物が死亡した。死亡例は、２４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与群の第４日、６ｍｇ／ｋｇ群の第７日、第１日のみの１２ｍｇ／ｋｇ群の第９および１１日、４８ｍｇ／ｋｇ群では第１１日に起きた。コントロール群ならびに第１日および第２日に１２ｍｇ／ｋｇ／日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を投与した群には死亡例は観察されなかった。生存率は、化学療法／放射線照射モデルに通常観察される死亡率と同じであった。
体重変化：各群の平均日体重変化パーセントを図２０に示す。未処理コントロール群の動物では、本研究中の体重の全体増加率は４７．５％であったが、これに対し第１日、６ｍｇ／ｋｇＣＧ５３１３５−０５処理群では４５．９％、第１日、１２ｍｇ／ｋｇＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理群では５３．８％、第１日、２４ｍｇ／ｋｇＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理群では４１．２％、第１日、４８ｍｇ・ｋｇＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理群では４９．７％、ならびに第１日および第２日、１２ｍｇ／ｋｇＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物処理群では４６．９％であった。群の体重増加分析は、各動物の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算して行った。全研究群間の、体重に関する群ＡＵＣ値の一元配置分散分析からは、研究群の間に有意差が存在しないことが示された（Ｐ＝０．６８７）。本研究の各群のＡＵＣ値の平均比較を図２１に示す。この結果は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群の動物が、未処理コントロール群の動物と同様の様式で体重を増やしたことを示している。
６．２１．実施例２１：ハムスター化学療法／放射線照射モデルにおける、確立した口腔粘膜炎の治療に及ぼすＣＧ５３１３５の作用（Ｎ−３１８）
動物、タイプ、齢数、および化学療法／放射線照射モデルは、６．２０節に記載したものと同じである。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイで測定した。
動物、タイプ、齢数、および化学療法／放射線照射モデルは、６．２０節に記載したものと同じである。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイで測定した。
６０匹のハムスターを、放射線照射前に、各１０匹の動物から成る６群に無作為に割り付けた。各群には、表３１に掲載した各種処理を割り当て、１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物をＩＰ処理した。本研究では、動物には６０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを第−４日および第−２日に投与し、続いて第０日に約３０Ｇｙの放射線を急性照射し、第１５日前後に重篤な粘膜炎を発生させた。本研究期間は３５日間であった。処理スケジュールおよび投与は、動物がスコア２の口腔粘膜炎を発症した後に開始した。本研究では粘膜炎のスコア化に加えて、実験群の各動物について下痢、体重減少、および死亡発生についても評価した。
表３１．処理群
粘膜炎がハムスターに誘発された。エンドポイント、粘膜炎、体重、および生存率について評価した。用いた統計方法はカイ二乗分析およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位合計検定であった。３つのパラメータは全て、６．２０節の中で説明する。
結果
粘膜炎：未処理コントロール群では、粘膜炎のピークは第１４日であり、平均スコアは３であった。ビヒクルコントロール群では、粘膜炎のピークは第１６日であり、平均スコアは３．４であった。スコアが２に達した後、第１日および第２日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物のＩＰ投与を受けた群は、コントロール群と同様の粘膜炎スコアのパターンを示した（図２２（Ａ））。スコアが２に達した後、第３日および第４日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物をＩＰ投与された群は、コントロール群に比べ粘膜炎のスコアは低下したが、これは主に粘膜炎ピーク後によった（図２２（Ｂ））。
粘膜炎：未処理コントロール群では、粘膜炎のピークは第１４日であり、平均スコアは３であった。ビヒクルコントロール群では、粘膜炎のピークは第１６日であり、平均スコアは３．４であった。スコアが２に達した後、第１日および第２日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物のＩＰ投与を受けた群は、コントロール群と同様の粘膜炎スコアのパターンを示した（図２２（Ａ））。スコアが２に達した後、第３日および第４日に１２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物をＩＰ投与された群は、コントロール群に比べ粘膜炎のスコアは低下したが、これは主に粘膜炎ピーク後によった（図２２（Ｂ））。
群間の粘膜炎スコアの差を、カイ二乗検定を用いて、３以上のスコアを示した日数を比較して評価した。未処理コントロール群では、評価した動物日数の３２．３％が３以上のスコアを示したのに対し、ビヒクルコントロール群では動物日数の４１．１％が３以上のスコアを示した。２つのコントロール群間に差が生じた結果として、２つの治療群（スコアが２に達した後の第２日および第２日にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の投与を受けた群）はビヒクルコントロールとの比較では有意な改善を示したが、未処理コントロールと比較した場合には有意な改善を示さなかった。２日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群については、未処理コントロールと比較した時のＰ値は０．３４７であったが、ビヒクルコントロールと比較した時の値は０．００７であり、３日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された群では、未処理コントロールと比較した時にＰ値は０．５８０であり、ビヒクルコントロールと比較した時の値は０．０２０であった。スコアが２に達した後４日間ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群は、未処理（Ｐ＝０．００３）およびビヒクル（Ｐ＜０．００１）コントロール両方との比較について有意な改善を示した。スコアが２に達した後１日のみＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群は、いずれのコントロール群との比較でも有意性を示さなかった。
コントロール群と処理群との間に見られる差の有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位合計検定を用いて更に調べ、スコアを得たそれぞれの日について、各群の粘膜炎スコアを評価した。この分析では、各種処理群を未処理コントロール群またはビヒクルコントロール群のいずれかと比較した。この未処理コントロール群との比較の結果は、２日間処理群と未処理コントロール群の間には、第１０日のみ統計有意な差が存在していることを示している（Ｐ＝０．０１１）。３日間処理群と未処理コントロール群の間では、第１４日（Ｐ＝０．０３６）および第２２日（Ｐ＝０．０１３）について統計有意な差が存在した。４日間処理群と未処理コントロール群との間では、第１０日（Ｐ＝０．００９）、第１２日（Ｐ＝０．０２９）、第１４日（Ｐ＝０．００２）、第２２日（Ｐ＝０．０２１）、および第２４日（Ｐ＝０．０３２）に統計有意な差が存在した。ＣＧ５３１３５、１日処理群と未処理コントロール群との間に統計有意な差は見られなかった。
ビヒクルコントロール群間の順位合計比較の結果は、３日間処理群とビヒクルコントロール群の間については、第１４日（Ｐ＝０．０２０）および第２２日（Ｐ＝０．０２０）で統計有意な差が存在した。４日間処理群とビヒクルコントロールとの間に統計有意差は、第１０日（Ｐ＝０．０３６）、第１４日（Ｐ＜０．００１）、第１８日（Ｐ＝０．０２４）、第２２日（Ｐ＝０．０４８）、第２４日（Ｐ＝０．０２１）、第２６日（Ｐ＝０．０４８）、および第２８（Ｐ＝０．００４）に見られた。ＣＧ５３１３５の１日間または２日間処理群とビヒクルコントロール群の間には、統計有意な差は見られなかった。
体重変化：未処理コントロール群の動物は、研究終了までに、開始時体重の平均５０．５％の増加を示した。ビヒクルコントロール群は、研究期間中の平均体重増加が最も低く、平均で４１．１％であった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の投与を１日４回受けた群の研究期間中の体重増加が最も大きく、５３．４％であったのに対し、１日１回、２回、および３回の投与を受けた群の体重増加は、平均でそれぞれ４８．１％、４６．８％、および４４．４％であった。これらの差は、各動物の１日体重増加率の曲線下面積を計算し、次に一元配置分散分析検定を用いてＡＵＣを査定することによって評価した。群間に統計有意な差は見られなかった（Ｐ＝０．２６６）。ＡＵＣの平均データを図２３に示す。
６．２２．実施例２２：ＣＧ５３１３５は、ヒト患者の粘膜炎向けの、単回投与治療法として用いることができる（研究Ｃ−２１４およびＣ−３２５）
進行（ステージ４）癌に罹ったヒト患者に静脈投与されたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（本実施例では「ＣＧ５３１３５−０５」製剤原料と呼ばれる、６．２．１節に記載の調合物についての）の安全性、寛容性、および薬物動態の評価を行った（一回用量増加寛容評価）。この用量増加寛容研究の最終目標は、０．０３、０．１、０．３３、および１ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の４患者コホートについて、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料の安全性、寛容性、および薬物動態を評価することである。用量増加は、１５分間かけて０．３３ｍｇ／ｋｇを投与した時の寛容性情報（第１相研究Ｃ−３２５）に基づいて停止し、プロトコールを修正して０．２ｍｇ／ｋｇ用量を追加した。
進行（ステージ４）癌に罹ったヒト患者に静脈投与されたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（本実施例では「ＣＧ５３１３５−０５」製剤原料と呼ばれる、６．２．１節に記載の調合物についての）の安全性、寛容性、および薬物動態の評価を行った（一回用量増加寛容評価）。この用量増加寛容研究の最終目標は、０．０３、０．１、０．３３、および１ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の４患者コホートについて、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料の安全性、寛容性、および薬物動態を評価することである。用量増加は、１５分間かけて０．３３ｍｇ／ｋｇを投与した時の寛容性情報（第１相研究Ｃ−３２５）に基づいて停止し、プロトコールを修正して０．２ｍｇ／ｋｇ用量を追加した。
試験中、口腔粘膜は経験を積んだ研究スタッフによって調べられ、世界保健機構（ＷＨＯ）ＯＭスコアリングシステムおよび口腔粘膜炎評価スケール（Ｏｒａｌ Ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ（ＯＭＡＳ）の両方に従って粘膜炎をスコア化した。ＷＨＯ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １９７９ ＷＨＯ．ＷＨＯ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｉｎ：ＷＨＯ Ｏｆｆｓｅｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．４８．Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；１９７９を参照。ＯＭＡＳは、より定量的な傷害評価法を提供している。退院後、患者には毎日ＷＨＯスコアを１回記録するための日記が与えられた。研究スタッフは、患者にどのように口腔粘膜炎の自己評価を行ってスコアを付けるか指導した。
表３２．ＷＨＯスコアリングシステム
表３３．ＯＭＡＳスコアリングシステム
予備的な薬物動態データは、血漿曝露の平均Ｃｍａｘが０．０３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）用量レベル（ｎ＝３：幅１７５．６〜１１９２．６ｎｇ／ｍｌ）については５６４．３ｎｇ／ｍｌ、および０．１ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）用量レベル（ｎ＝３；幅４２０．９〜７９７．５ｎｇ／ｍｌ）については５６４．７ｎｇ／ｍｌであることを明らかにした。輸液後、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料は、１時間以内（輸液終了後１５〜３５分）に最大血漿濃度に達した。平均の最終数半減期は４９分（範囲１６．２〜８７分、ｎ＝５）であった。有害経験から試験を中止した患者はいなかった。試験薬に関係すると思われる有害事象（患者数）としては以下のものが挙げられる：悪心（２）；寒気（２）；発熱（２）；嘔吐（１）；目眩（１）；光幻覚（１）（視覚−第１５日に「光フラッシュ」）、および乱視（１）（第２８日に軽度の乱視）；神経疾患（１）（第１５日に足裏に）；頻脈（１）；頭痛（１）；ならびに無症候性、ＥＣＧ上に記録された単独の心房早期波形）。報告された全ての事象は軽度から中度であった。試験薬に関連する、等級３または４の検査毒性は記録されなかった。２００４年９月３日から薬剤投与を受けた１１例の患者のうち、３例の患者について、試験薬と無関係と判定された６つの重篤な有害事象が記録された。これらの事象は、癌の進行（ｎ＝２）、カテーテル感染症、小腸閉塞、食道炎／粘膜炎、および好中球減少症性発熱であった。
研究を終了した１１例の患者のうち６例の患者には口腔粘膜炎は発症しなかった。４例の患者が等級１（ｎ＝１）または等級２（ｎ＝３）の口腔粘膜炎を発症した。等級３の口腔粘膜炎を発症した１例の患者が観察された。完全非腸管栄養を必要とした患者はいなかった。ＣＰＴ−１１の投与を受けた患者は、一般的に下痢の頻度が高かった。この試験では、７例の患者がＣＴの一部としてＣＰＴ−１１が投与され、２例の患者（共に０．０３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５製剤原料の投薬を受けている）だけが軽度から中度の下痢を経験し、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料治療を受けた直後に下痢を発症したのは１例のみであった。我々は、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料は、０．０３、０．１、および０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）の単回用量投与について良く受け入れられたと結論した。
自己幹細胞移植患者を対象とした単回用量増加、第１相試験（研究Ｃ−３２５）が同時に進行中であり、２７例の患者がＣＧ５３１３５−０５製剤原料で治療を受けている。ＰＢＳＣＴによるＨＤＣＴを受けた２２例の患者（ｐｔｓ）（年齢２５〜７５歳）が、次のような（患者数）を含むＣＧ５３１３５−０５製剤原料の用量を増加する研究を終了している：０．０３ｍｇ／ｋｇ（２）、０．１ｍｇ／ｋｇ（１０）、０．２ｍｇ／ｋｇ（８）、および０．３３ｍｇ／ｋｇ（２）。患者の治療対象は次の通りであり：多発性骨髄腫（ｎ＝１１）、非ホジンキンリンパ腫（ｎ＝９）、急性骨髄性白血病（ｎ＝１）、および線維形成円形細胞癌（ｎ＝１）、メルファラン（Ｍｅｌ ２００）、シクロホスファミド、カルムスチン、およびエトポシド（ＣＢＶ）を、カルボプラチンおよびチオテパ（ＣＴ）、ならびにブスルファン／シクロホスファミド（標的化ＢｕＣｙ）を含むコンディショニングレジメンによる治療を受けていた。試験の主目的は、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料の安全性、寛容性、および薬物動態を評価することである。患者は、ＷＨＯおよびＯＭＡＳ両方の等級付けスケールを用いてＯＭの存在についても毎日スコア付けされた（上表３２および３３）。試験を終了した２２例の患者のうち８例の患者はＯＭを経験しなかった（４Ｍｅｌ ２００ ｐｔｓを含む）；１０例の患者がＷＨＯ等級１（ｎ＝７）または等級２（ｎ＝３）のＯＭのみ経験したのに対し、４例の患者は等級３（ｎ＝３）または等級４（ｎ＝１）の重篤なＯＭを経験した。等級４のＯＭを経験した１例の患者は４日間ＴＰＮを必要とした。患者は試験薬をよく受け入れ、０．３３ｍｇ／ｋｇの用量まで重大な副作用はなかった。この用量において２例の患者が発熱、悪心、および軽度の高血圧から成る輸液反応を経験した。１３例の患者から得た予備的な薬物動態結果から、用量レベル０．１、０．２、および０．３３ｍｇ／ｋｇについて、それぞれ平均Ｃｍａｘ１３５．５ｎｇ／ｍｌ、３４３．３ｎｇ／ｍｌ、および６５８．３ｎｇ／ｍｌの用量依存的な血漿曝露が確認された。好中球定着（ＡＮＣ＞５００／ｕＬにより判定）の中央日は、幹細胞輸液後１３日目に起こった。予備的データからは、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料がＰＢＳＣＴ患者に、０．３３ｍｇ／ｋｇの用量までよく受け入れられ、ＯＭを軽減または予防について明瞭な臨床作用を持つことが示唆された。その結果、２２例中１８例の患者がＨＤＣＴ後の粘膜炎（ＷＨＯ等級３〜４）を回避した。より大規模な第ＩＩ相臨床試験が開始され、ＨＤＣＴ誘発ＯＭ予防におけるＣＧ５３１３５−０５製剤原料の効力を評価する予定である。
結論として、ＣＧ５３１３５−０５製剤原料は、今日までの二つの第Ｉ相試験で投与が行われた３８例の患者には、一般的によく受け入れられた。試験した用量は０．０３、０．１、０．２、および０．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）であった。０．３３ｍｇ／ｋｇの薬物を１５分間かけて投与した時、より低い用量でも観察された明瞭な活性と共に輸液反応が現れたため、この用量レベルを中止することとした。その他一貫性のある薬物関連または明瞭な用量関連性の有害事象または検査異常は観察されなかった。試験薬に関係する有害事象は観察されなかった。寛容性および予備活性に関する十分な情報は、第ＩＩ相試験において０．０３、０．１、および０．２ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）用量を利用することを提示していると考えられる。
６．２３．実施例２３：ＣＧ５３１３５は放射線が誘発する下痢の頻度、長さ、および重篤度を軽減する（Ｎ−４３８）
本研究は、下痢の発生および胃の形態学から測定した、放射線全身照射が誘発する胃腸管障害に対するＣＧ５３１３５の活性を評価するために行われた。本実施例のタンパク質濃度はＵＶ吸収によって測定した。
本研究は、下痢の発生および胃の形態学から測定した、放射線全身照射が誘発する胃腸管障害に対するＣＧ５３１３５の活性を評価するために行われた。本実施例のタンパク質濃度はＵＶ吸収によって測定した。
材料および方法：
投与：マウスの体重を測定してから、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（４または１６ｍｇ／ｋｇ）を投与するか、または未処理とした。投与は表３４および３５に記載した通りに行った。各群２０匹の動物に、下表に従って放射線を投与した。第０日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の投薬は全て放射線照射直後に行った。麻酔薬は投与しなかった。
投与：マウスの体重を測定してから、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（４または１６ｍｇ／ｋｇ）を投与するか、または未処理とした。投与は表３４および３５に記載した通りに行った。各群２０匹の動物に、下表に従って放射線を投与した。第０日のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の投薬は全て放射線照射直後に行った。麻酔薬は投与しなかった。
腸陰窩細胞への損傷誘発：マウスに、０．７Ｇｙ／分の照射率で１４または１４．５Ｇｙの線量の放射線を全身照射した。試験期間を通して、動物の下痢の頻度を調べた。６日後、動物を犠牲にして、組織分析のためにマウスの腸管を集めた。
体重：研究期間中毎日、イオン化放射線曝露に対する反応の指標として、処理群間に動物の体重差が現れるか評価するために、各動物の体重を測定し、その生存を記録した。
死亡または瀕死で見つかった動物：下痢の発生／進行を正確に評価し、死亡前の瀕死の動物を見つけ出すために、第３日からは２ｘ／日で動物を評価した。このような瀕死の動物は脊椎脱臼によって犠牲にした。回腸および中央結腸を取り出し、保存および必要な場合の今後の分析／ＩＨＣのためにホルマリンで固定し、パラフィンに包埋（ブロック当たり１動物、ブロック当たり２組織）した。死亡して見つかった動物からは組織は取り出さなかった。
表３４．研究計画
エクセルスプレッドシートには、１４または１４．５Ｇｙの放射線が照射された動物の下痢スコアおよび体重が貼り付けられている。各放射線照射のデータは非常に類似しているため、１４Ｇｙの放射線照射を受けた動物の分析だけを示す。
体重：質量比成長速度は次式から計算した：
下痢スコア：マウスの下痢の重篤度を、放射線照射後第４日から３日間、１日２回、０〜３のスケールを用いてスコア化した。３日間の平均下痢スコア、ならびに３日間の下痢スコアの合計を測定してグラフにした。一元配置分散分析およびチューキーの多重比較検定により有意差を得た（図２５（Ａ）および２５（Ｂ））。
それぞれの日の観察結果も分析し、下痢がピークとなった日の違いを決定した。有意性は上記のようにして決定した（＊−Ｐ＜０．０５、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊＊＊−Ｐ＜０．００１）。（図２６）。
結論：
１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を放射線照射に対し第−１、０、および＋１日に動物に投与すると、放射線が誘発する下痢の頻度、長さ、および重篤度が極めて顕著に低下した。１日４回、６時間毎、４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５の動物への投与も、下痢の発生頻度を大きく下げた。下痢のピーク日は放射線照射から５日後であり、この時点では１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５のみが下痢を有意に低下させた。研究期間中、体重減少について処理群間に有意な差はなかった。
１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を放射線照射に対し第−１、０、および＋１日に動物に投与すると、放射線が誘発する下痢の頻度、長さ、および重篤度が極めて顕著に低下した。１日４回、６時間毎、４ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５の動物への投与も、下痢の発生頻度を大きく下げた。下痢のピーク日は放射線照射から５日後であり、この時点では１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５のみが下痢を有意に低下させた。研究期間中、体重減少について処理群間に有意な差はなかった。
６．２４．実施例２４：ＣＧ５３１３５は、ラットにＣＰＴ−１１が誘発する下痢を軽減する（研究Ｎ−３９２）
イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は固形癌に対し一般的に用いられる化学療法薬であり、重篤な下痢を特徴とする胃腸粘管（ＧＩ）粘膜炎を引き起こす。本研究の第一の目的は、ＣＧ５３１３５がインビボ動物モデルにＣＰＴ−１１が誘発したＧＩ粘膜炎を軽減するか調べることである。第二の目的は、ＣＧ５３１３５の各種投与スケジュールを検証することである。
イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は固形癌に対し一般的に用いられる化学療法薬であり、重篤な下痢を特徴とする胃腸粘管（ＧＩ）粘膜炎を引き起こす。本研究の第一の目的は、ＣＧ５３１３５がインビボ動物モデルにＣＰＴ−１１が誘発したＧＩ粘膜炎を軽減するか調べることである。第二の目的は、ＣＧ５３１３５の各種投与スケジュールを検証することである。
方法論：
腫瘍を持ったラットに、単回腹腔内用量のＣＰＴ−１１（２００ｍｇ／ｋｇ）を用いて下痢を誘発した。動物を、化学療法開始前、最中、または終了後のいずれかに、６．１８．２節に記載のプロセス２（硫酸によってｐＨをｐＨ７．０に調整した、０．５Ｍアルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０のビヒクルを用いて）に従って得たＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内処理した。ラットを、下痢の発生頻度および重篤度、ならびに死亡率について詳しく調べた。動物を、下痢誘発後１６８時間目に安楽死させた。安楽死時、胃腸管の組織病理評価のために組織を採取した。
腫瘍を持ったラットに、単回腹腔内用量のＣＰＴ−１１（２００ｍｇ／ｋｇ）を用いて下痢を誘発した。動物を、化学療法開始前、最中、または終了後のいずれかに、６．１８．２節に記載のプロセス２（硫酸によってｐＨをｐＨ７．０に調整した、０．５Ｍアルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０のビヒクルを用いて）に従って得たＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内処理した。ラットを、下痢の発生頻度および重篤度、ならびに死亡率について詳しく調べた。動物を、下痢誘発後１６８時間目に安楽死させた。安楽死時、胃腸管の組織病理評価のために組織を採取した。
結果：
ＣＰＴ−１１で処理されたラットのおおよそ４０％に重篤または中度の下痢が起こった。この場合の、化学療法後第４日目の死亡率は５０％であった。ＣＰＴ−１１処理前、または前とその最中にＣＧ５３１３５を投与されたラットは重篤または中度の下痢を発症したが、その頻度はより低く、死亡率とは関係しなかった。他の投与レジメンは有効ではなかった。
ＣＰＴ−１１で処理されたラットのおおよそ４０％に重篤または中度の下痢が起こった。この場合の、化学療法後第４日目の死亡率は５０％であった。ＣＰＴ−１１処理前、または前とその最中にＣＧ５３１３５を投与されたラットは重篤または中度の下痢を発症したが、その頻度はより低く、死亡率とは関係しなかった。他の投与レジメンは有効ではなかった。
結論：
ＣＧ５３１３５で前処理された動物（１６ｍｇ／ｋｇ）は、下痢の発生頻度の低下により測定したとき、胃腸管粘膜炎に改善を示した。この群では死亡率全体の低下も示された。このことはヒトでのＧＩ粘膜炎へのＣＧ５３１３５の使用にとって重要であり、更に研究しなければならない。
ＣＧ５３１３５で前処理された動物（１６ｍｇ／ｋｇ）は、下痢の発生頻度の低下により測定したとき、胃腸管粘膜炎に改善を示した。この群では死亡率全体の低下も示された。このことはヒトでのＧＩ粘膜炎へのＣＧ５３１３５の使用にとって重要であり、更に研究しなければならない。
６．２５．実施例２５：急性イオン化放射線への曝露後のマウスに対するＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の予防作用（研究Ｎ−３０８）
本研究は、後に全身に各種線量のイオン化放射線に曝露するマウスに予防的に投与されたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用について研究するために実施された。雄の、研究開始時の平均体重が２２．１グラムのＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを各処理に用いた。動物には標準的な市販のマウスの餌を与えた。餌と水は自由にとらせた。
本研究は、後に全身に各種線量のイオン化放射線に曝露するマウスに予防的に投与されたＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用について研究するために実施された。雄の、研究開始時の平均体重が２２．１グラムのＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを各処理に用いた。動物には標準的な市販のマウスの餌を与えた。餌と水は自由にとらせた。
タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定した。マウスを、第０日に、麻酔せずに４８４〜６４１ｃＧｙの線量範囲のイオン化放射線に曝露した。動物には、放射線照射前第−１日、または第−２日および−１日の両日にＰＢＳ（コントロール）またはＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ、ブラッドフォード、毎日ＩＰ）を投与した。スケジュールは表３６に示した。研究のエンドポイントは生存率および体重の変化であった。生存率は、放射線照射後３０日間調べた。
表３６．研究設計
全ての治療群で、放射線量の増加に伴って生存率が低下した。ＰＢＳを投与された動物では、最低線量（４８４ｃＧｙ）での放射線照射は第３０日の生存率は９３．７５％であったが、５３４ｃＧｙでは５０．０％まで、５７０ｃＧｙでは３１．２５％まで、６０６ｃＧｙでは１２．５％まで、６４１ｃＧｙでは６．２５％まで低下した（図２７）。ＣＧ５３１３５を、第１日だけに１２ｍｇ／ｋｇがＩＰ投与された動物では、最低線量（４８４ｃＧｙ）での放射線照射での第３０日の生存率は８７．５％であったが、これに対し５３４ｃＧｙでは８７．５％、５７０ｃＧｙでは８１．２５％、６０６ｃＧｙでは４３．７５％、６４１ｃＧｙでは３１．２５％であった（図２８）。第−２日および−１日にＣＧ５３１３５をＩＰ投与された動物では、最低線量の放射線照射（４８４ｃＧｙ）時の第３０日の生存率は８７．５％であったのに対し、５３４ｃＧｙでは７５．０％、５７０ｃＧｙでは３７．５％、６０６ｃＧｙでは３１．２５％、および６４１ｃＧｙではゼロであった（図２９）。
多重比較検定は、第−１日に処理を受けた動物の生存率のオッズが、コントロール動物に対し４．８倍高くなることを示した（ｐ＝０．０００１６）。ＬＤ５０／３０値は、ブーツトラッピングによって計算された９５％信頼幅の生存率のプロビットプロットを用いて計算した。しかしながら、コントロール動物に対する第−２日および第−１日に処理を受けた動物の生存率のオッズは有意ではなかった（ｐ＝０．４１６２）。結果は、放射線保護に、ＣＧ５３１３５−０５の予防的投与が治療的に有効であることを示している。更には、放射線照射前１日（第−１日）の処理もまた、最高放射線レベル（６４１ｃＧｙ）を除く全ての体重減少から動物を保護した。この特別なシステムでは、単回投与（第−１日）は２回投与レジメン（第−２日および−１日、それぞれ）よりも、特により高い放射線レベルで有意に効果的であった。
上記の結果に加えて、発明は、放射線曝露前および／または後でのＣＧ５３１３５−０５Ｅ大腸菌精製物の予防的および／または治療的投与のような、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の追加の投与レジメンに拡張することもでき、これらは本明細書に記載したものと同じ手順に従って、同一の動物モデルで検証し、この化合物の治療効力の範囲を規定することができる。治療処理の投与レジメンとしては、放射線曝露後＋１、＋１、および＋２日が挙げられるが、これに限定されない。例えば別の実験では、マウスに、指示線量の放射線全身照射を行う２４時間前に、４ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５Ｅ大腸菌精製物をＩＰ処理した。その後マウスの生存率を３０日間追跡調査した。図２８Ｂは、５７０ｃＧｙおよび６０６ｃＧｙでの生存率に関するカプラン−マイヤーのプロットを示しており、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理した群とコントロール群との間に統計有意な差、即ちそれぞれｐ＝０．００８およびｐ＝０．０１５の差があった。図２８は、投与範囲での生存率のプロビット分析を示している。コントロールおよびＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された動物のＬＤ５０／３０は、線量修飾係数（ＤＭＦ）１．１０で、それぞれ５５２．４ｃＧｙおよび６０７．４ｃＧｙであった。
６．２６．実施例２６：放射線照射を受けた腸陰窩細胞に対するＣＧ５３１３５の予防的投与スケジュールの作用（Ｎ−３７５）
本研究の目的は、放射線照射４日間、１日１回投与した時の、インビボでの放射線照射誘発腸陰窩細胞死に対するＣＧ５３１３５の保護能力を評価することであった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＢＤＦ１マウスに、第０日に１０〜１４Ｇｙの致死的放射線量に曝露する前、１日１回、４連続日腹腔内（ＩＰ）投与した。生き残り再生している陰窩巣の数を、放射線照射から４日間測定した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって測定した。
本研究の目的は、放射線照射４日間、１日１回投与した時の、インビボでの放射線照射誘発腸陰窩細胞死に対するＣＧ５３１３５の保護能力を評価することであった。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＢＤＦ１マウスに、第０日に１０〜１４Ｇｙの致死的放射線量に曝露する前、１日１回、４連続日腹腔内（ＩＰ）投与した。生き残り再生している陰窩巣の数を、放射線照射から４日間測定した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって測定した。
動物に１日１回、４日間ＣＧ５３１３５を投与すると、ＰＢＳ処理、放射線照射動物と比較して、陰窩細胞生存率の全体的な増加が示された（表３７）。
表３７．放射線照射前のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物複数回用量投与による腸陰窩保護係数
最高レベルの保護効果は、１３Ｇｙの放射線照射時に見られ、そのときの保護係数は２．０９であった（例えば生存陰窩細胞数が２倍に増加した）。陰窩生存曲線は、ＣＧ５３１３５−０５処理により放射線に対する感受性が有意に低下したことを示している（図３０）。かくしてＣＧ５３１３５による４連続日の前処理は、全体の陰窩細胞生存率を上げた。本研究は、放射線保護特性を利用したスケジュールとしてＣＧ５３１３５−０５の複数日、予防的投与が利用できることを示している。
６．２７．実施例２７：放射線保護ウインドウの評価（Ｎ−３８２）
単日投与または１日１回複数日投与後の、ＣＧ５３１３５の陰窩細胞放射線保護作用が確立されたことから、本研究では放射線照射前、２４時間を超える間隔で投与した時のＣＧ５３１３５の活性について評価した。１３Ｇｙの単回大量放射線照射曝露６、１２、２４、３６、または４８時間前に、それぞれＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＢＤＦ１マウスＩＰ注射して投与した。生存し、再生中の陰窩巣の数を、放射線照射から４日間測定した。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した。
単日投与または１日１回複数日投与後の、ＣＧ５３１３５の陰窩細胞放射線保護作用が確立されたことから、本研究では放射線照射前、２４時間を超える間隔で投与した時のＣＧ５３１３５の活性について評価した。１３Ｇｙの単回大量放射線照射曝露６、１２、２４、３６、または４８時間前に、それぞれＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳをＢＤＦ１マウスＩＰ注射して投与した。生存し、再生中の陰窩巣の数を、放射線照射から４日間測定した。本実施例のタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定した。
放射線照射２４または３６時間前にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を単回用量投与すると、最高レベルの腸陰窩細胞の保護がもたらされた。これらのスケジュールは、陰窩生存率をそれぞれ８０％および３１％高めた（表３８）。放射線照射６、１２、または４８時間前の投与は、線量修飾係数をそれぞれ０．７８、０．４０、または０．８４にした。
表３８．放射線照射６〜４８時間前のＣＧ５３１３５−０５投与時の腸陰窩保護係数
これらの結果は、単回用量のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物投与に関する最適ウインドウが放射線照射前２４〜３６時間であることを示唆している。
６．２８．実施例２８：放射線照射腸陰窩細胞の生存率に及ぼすＣＧ５３１３５投与スケジュールの影響（Ｎ−４１６）
本研究の目的は、ＣＧ５３１３５−０５投与の最適な投与スケジュールを確立して、放射線が誘発する陰窩細胞死に対する保護レベルを確立することである。本実施例のタンパク質濃度はＵＶ吸収によって測定した。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（４ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を雄のＢＤＦ１マウスに、放射線（１３Ｇｙ）照射前、または照射後１、２、３、４、または５連続日（第−１、０、１、２、および／または３日）、１日１回腹腔内（ＩＰ）投与した。生存し再生中の陰窩巣の数を、放射線照射後４日間測定し、線量修飾係数（ＤＭＦ）を計算した。
本研究の目的は、ＣＧ５３１３５−０５投与の最適な投与スケジュールを確立して、放射線が誘発する陰窩細胞死に対する保護レベルを確立することである。本実施例のタンパク質濃度はＵＶ吸収によって測定した。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（４ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を雄のＢＤＦ１マウスに、放射線（１３Ｇｙ）照射前、または照射後１、２、３、４、または５連続日（第−１、０、１、２、および／または３日）、１日１回腹腔内（ＩＰ）投与した。生存し再生中の陰窩巣の数を、放射線照射後４日間測定し、線量修飾係数（ＤＭＦ）を計算した。
第−１日でのＣＧ５３１３５−０５の単回用量投与はＤＭＦを２．３にした（図３１）。第−１、０、および１のＣＧ５３１３５−０５投与は、第０日のＴＢＩと比較したＤＭＦを３．０にした（例えば生存陰窩細胞の数が３倍になる）。これらのデータは、ＣＧ５３１３５が予防および介入（治療）特性を備えたＧＩ細胞放射線保護剤であることを示唆している。
６．２９．実施例２９：ＣＧ５３１３５の放射線保護のメカニズム
イオン化放射線の攻撃を受けて細胞内に起こる多くの変化の中で、反応性酸素種の増加はＨ２Ｏのイオン化によって起こる。このプロセスは細胞の中で最も反応性の分子を生ずるため、細胞への損傷を軽減するために、核はこれらラジカルをより反応性の低い中間体にする酵素の転写を高める。ＣＧ５３１３５は放射線保護剤であることが示されているため、ＣＧ５３１３５による細胞の処理が、細胞に酸素ラジカルスカベンジング経路を「事前付加」する、関心対象の放射線保護に関与すると考えられるいずれかの遺伝子をアップレギュレーションするか決定することは有意義である。ＲＯＳスカベンジャーおよび転写因子を含む複雑な経路へのＣＧ５３１３５の作用の評価からは、この作用物質について観察されたインビボの放射線保護作用を機械的に描いている。そのために、発現研究および生存研究を細胞レベルで実施した。
イオン化放射線の攻撃を受けて細胞内に起こる多くの変化の中で、反応性酸素種の増加はＨ２Ｏのイオン化によって起こる。このプロセスは細胞の中で最も反応性の分子を生ずるため、細胞への損傷を軽減するために、核はこれらラジカルをより反応性の低い中間体にする酵素の転写を高める。ＣＧ５３１３５は放射線保護剤であることが示されているため、ＣＧ５３１３５による細胞の処理が、細胞に酸素ラジカルスカベンジング経路を「事前付加」する、関心対象の放射線保護に関与すると考えられるいずれかの遺伝子をアップレギュレーションするか決定することは有意義である。ＲＯＳスカベンジャーおよび転写因子を含む複雑な経路へのＣＧ５３１３５の作用の評価からは、この作用物質について観察されたインビボの放射線保護作用を機械的に描いている。そのために、発現研究および生存研究を細胞レベルで実施した。
発現研究：
ＣＧ５３１３５による放射線保護のメカニズムを描き出すために、分子状酸素ラジカルスカベンジャーおよび転写因子の発現特性を、線維芽細胞および内皮細胞で研究した。ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＣＤ−１０７０ｓｋ（ヒト包皮線維芽細胞）、ＣＣＤ−１８Ｃｏ（ヒト結腸線維芽細胞）、およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯寿尾脈血管内皮細胞）細胞を０．１％ＦＢＳおよび指示濃度のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を含む基本培地に移した。１８時間インキュベーションした後、ＲＮＥａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてトータルＲＮＡを得るために細胞を集めた。ＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて逆転写し、プライマーおよび以下のサイクルを用いて関心遺伝子を増幅した。
ＣＧ５３１３５による放射線保護のメカニズムを描き出すために、分子状酸素ラジカルスカベンジャーおよび転写因子の発現特性を、線維芽細胞および内皮細胞で研究した。ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＣＤ−１０７０ｓｋ（ヒト包皮線維芽細胞）、ＣＣＤ−１８Ｃｏ（ヒト結腸線維芽細胞）、およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯寿尾脈血管内皮細胞）細胞を０．１％ＦＢＳおよび指示濃度のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を含む基本培地に移した。１８時間インキュベーションした後、ＲＮＥａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてトータルＲＮＡを得るために細胞を集めた。ＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて逆転写し、プライマーおよび以下のサイクルを用いて関心遺伝子を増幅した。
表３９．ＲＴ−ＰＣＲのプライマー（ヒト）
発現の結果を表４０にまとめ、かつ図３２（Ａ）〜（Ｆ）に示す。
Ｎｒｆ２転写因子は「酸化予防反応要素」（ＡＲＥとも呼ばれる）と考えられている複数の酸化予防剤の制御に関与しており、研究した全ての細胞株でＣＧ５３１３５によって誘導された（表４０、図３２（Ａ）〜（Ｆ））。ＥＲＫおよびＡｋｔキナーゼもまたＣＧ５３１３５によって活性化された。ＣＣＤ１８Ｃｏヒト結腸線維芽細胞を１８時間、０．１％ＢＳＡを含む培地の中で飢餓状態に置くか、または完全血清（「Ｃｏｍｐ」）中に放置した後１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２０で刺激し、指示した時点で収集した。溶解物をヒトＥＲＫまたはＡｋｔ、あるいは表示の、それらのリン酸化物について免疫ブロッティングした。ＥＲＫおよびＡｋｔキナーゼは共にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で２分間処理することによって活性化された（図３２（Ｄ）および（Ｅ））。これらのキナーゼ、特にＡＫｔの活性化は、放射線保護事象と関連していた。
イオン化放射線から細胞を保護するメカニズムの１つが、酸素ラジカルスカベンジング経路の誘導を介していることは明瞭に確立している。本明細書に詳述する遺伝子発現研究は、これが放射線保護を調節しているＣＧ５３１３５の経路の１つである可能性を示している。更に、放射線全身照射（ＴＢＩ）の主要な標的臓器の１つは胃腸管である。ここに開示したデータは、（１）研究した全細胞株の中で最も反応性であるものが胃腸管線維芽細胞（ＣＣＤ−１８ｃｏ）であること；および（２）良く特徴付けされた腸放射線保護材であるＴｆｆ３がＣＧ５３１３５によって強くアップレギュレーションされたことを示している。当技術分野公知の他の放射線保護剤が骨髄生存率に影響するが、他のコンパートメントには影響しないことを考えると、ＣＧ５３１３５が造血幹細胞と同様に影響を受けるが、動物の生存にとってそれほど重要でない組織でも活性であることに言及することは重要である。
生存率研究：
ある線量の放射線を受けた細胞は、イオン化ラジカルの攻撃に対抗し、ラジカルが加えて損傷を修復し、または修復不可能な傷害に直面した場合にはアポトーシスの発生を遅らせるか、またはこれらのメカニズムの全てを組み合わせて実行しなければならない。それゆえに、これらの経路はそれぞれ、細胞の最終的な生存およびその増殖能力にとって重要である。細胞の生存は、放射線照射後に生存している細胞はコロニーをインビトロで形成できる発色発生によって評価した。
ある線量の放射線を受けた細胞は、イオン化ラジカルの攻撃に対抗し、ラジカルが加えて損傷を修復し、または修復不可能な傷害に直面した場合にはアポトーシスの発生を遅らせるか、またはこれらのメカニズムの全てを組み合わせて実行しなければならない。それゆえに、これらの経路はそれぞれ、細胞の最終的な生存およびその増殖能力にとって重要である。細胞の生存は、放射線照射後に生存している細胞はコロニーをインビトロで形成できる発色発生によって評価した。
発色アッセイは、ＣＣＤ−１８ｃｏ細胞、ＦａＤｕヒト扁平上皮細胞癌細胞、ＩＥＣ６、およびＩＥＣ１８ラット結腸陰窩細胞、ならびにＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いて行われ、放射線保護に及ぼすＣＧ５３１３５の作用を評価した。細胞培養条件は次の通りである：ＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清＋５０μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンで増殖させた；ＩＥＣ６およびＩＥＣ１８細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋０．１Ｕ／ｍｌインスリン＋５０μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンで増殖させた；ＦａＤｕ細胞は、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｍＭピル酸ナトリウム＋５０μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン＋非必須アミノ酸で増殖させた。細胞は１０ｃｍの皿あたり５×１０５の密度（ＮＩＨ ３Ｔ３）で、または６ウエル皿の各ウエル当たり５×１０５の密度（ＩＥＣ１８、ＩＥＣ６、ＦａＤｕ）で接種され、付着させた。次に細胞を、０．１％血清（ＩＥＣ１８、ＩＥＣ６、ＦａＤｕ）または１％血清（ＮＩＨ ３Ｔ３）を含む基本培地の中で、１０または１００ｎｇ／ｍｌ（ＩＥＣ１８、ＩＥＣ６、ＦａＤｕ）、または５０および２００ｎｇ／ｍｌ（ＮＩＨ ３Ｔ３）の用量のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理し、１６時間（ＩＥＣ１８、ＩＥＣ６、ＦａＤｕ）または１時間（ＮＩＨ ３Ｔ３）インキュベーションした。次に細胞に、１３０ｋＶｐにて、２．５、５、７．５、１０、１２．５、および１５Ｇｙの放射線をＦａｘｉｔｒｏｎ Ｘ−ｒａｙ照射装置（Ｗｈｅｅｌｉｎｇ，ＩＬ）を用いて、放射線率５０ｃＧｙ／分で照射した。照射直後に細胞をトリプシン処理し、ＮＩＨ ３Ｔ３を６０ｍｍ皿当たり２５０、５００，１０００、２０００、５０００、および１０，０００細胞；ＦａＤｕ、ＩＥＣ１８、およびＩＥＣ６を：６ウエル皿のウエル当たり５００、２５００細胞／６ウエルの密度で二重接種した。細胞を完全増殖培地で１〜２週間、コロニーの平均直径が２ｍｍになるまで増殖させ、その後コロニーをクリスタルバイオレットで染色して、数を測定した。
結果：
生存している未処理またはＣＧ５３１３５−０５処理した細胞の数を放射線量の関数としてプロットし、生存曲線を描いた。生存曲線の傾きの異なる部分は、放射線の細胞殺滅特性の違いを表しており、以下に記載する：
Ｄ０は後ろ２点間の曲線の傾きであり、放射線量が高い時の細胞殺滅速度を示す。数値は、生存細胞画分を、グラフ上の前値の３７％まで減らすのに必要な放射線量を示すと解釈される。数字が小さいほど細胞殺滅速度が速い。
生存している未処理またはＣＧ５３１３５−０５処理した細胞の数を放射線量の関数としてプロットし、生存曲線を描いた。生存曲線の傾きの異なる部分は、放射線の細胞殺滅特性の違いを表しており、以下に記載する：
Ｄ０は後ろ２点間の曲線の傾きであり、放射線量が高い時の細胞殺滅速度を示す。数値は、生存細胞画分を、グラフ上の前値の３７％まで減らすのに必要な放射線量を示すと解釈される。数字が小さいほど細胞殺滅速度が速い。
Ｄ１は先頭２点間の曲線の傾きであり、放射線量が低い時の細胞殺滅速度を示す。数値は、生存細胞画分を、グラフ上の前値の３７％まで減らすのに必要な放射線量を示すと解釈される。数字が小さいほど細胞殺滅速度が速い。
Ｄｑは、生存細胞の対数的な減少が見られる前の、曲線の肩の幅である。これは、本質的に、細胞殺滅の発生が見られるまでに必要な放射線の閾値量である。Ｄｑ値が大きいことは、放射線が低線量の時に細胞が完全に保護されることを意味する。
放射線照射を受けたＩＥＣ１８細胞の生存に及ぼすＣＧ５３１３５処理の作用を図３３（Ａ）に示す。Ｄ０およびＤ１値は、明瞭な処理関連傾向を示さなかったが、ＣＧ５３１３５で処理されたＤｑ値はＩＥＣ１８が未処理の細胞に比べて、低線量の放射線照射からより強く保護されていることを示している（１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５で処理された細胞の生存曲線の肩が広い）。かくしてＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物による細胞の処理は、細胞の殺滅を未処理細胞に比べより高線量にし、ＣＧ５３１３５がこれらの細胞において放射線保護剤としての機能を果たすことを示している。
放射線照射を受けたＮＩＨ ３Ｔ３細胞の生存に及ぼすＣＧ５３１３５処理の作用を図３３（Ｂ）に示す。５０ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５で処理されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞のＤ０値は、未処理細胞のＤ０値よりも大きいと思われ、その差は５０ｎｇ／ｍｌ用量については有意に達している。これらの結果は、ＣＧ５３１３５が放射線保護剤としての役割を果たし、高線量の放射線が照射された時のＮＩＨ ３Ｔ３の生存を促進することを示唆している。さらには、１００ｎｇ／ｍＬのＣＧ５３１３５で処理した細胞のＤ１値は、未処理細胞に比べ小さく、低線量の放射線照射時の細胞死亡速度が遅くなることを示している。主に、未処理細胞の生存率が変動したために、生存曲線のＤｑ値には一定の傾向は認められなかった。
放射線照射を受けたＨＵＶＥＣ細胞の生存に及ぼすＣＧ５３１３５処理の作用を図３４に示す。１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５で処理された細胞のＤ０値は、未処理のＨＵＶＥＣ細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５で処理された細胞より大きく、高線量の放射線が照射された時の細胞死の速度が遅くなることを示している。これに加えて、１００ｎｇ／ｍＬのＣＧ５３１３５で処理された細胞のＤｑ値は、低線量の放射線を照射された時の細胞死の速度が、未処理のＨＵＶＥＣ細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５で処理された細胞に比べ遅いことも示唆している。Ｄ１値に対するＣＧ５３１３５処理の明瞭な影響は観察されなかった。かくして１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物によるＨＵＶＥＣ細胞の処理は、高線量放射線照射時の細胞殺滅速度の有意な低下をもたらす。１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理されたＨＵＶＥＣ細胞はまた、未処理細胞に比べ、低線量放射線照射時の殺滅からもより強く保護されると思われる。
これに対し、放射線照射を受けたＦａＤｕおよびＩＥＣ６細胞は、ＣＧ５３１３５投与の結果として、Ｄ０、Ｄｑ、またはＤ１値になんらの明瞭な傾向も示さなかった。
別の研究（Ｌ−４１１およびＬ−４３２）では、腸粘膜の各層の様々なタイプの細胞を代表する７つの細胞株：上皮（ＩＥＣ６およびＩＥＣ１８、ラット腸上皮）、間葉細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス線維芽細胞；ＣＣＤ−１８Ｃｏ、ヒト結腸線維芽細胞）、ならびに造血幹細胞（３２Ｄ、マウス造血幹細胞株）について、発色アッセイ（上記）を用いて放射線照射後の細胞生存が調べられた。細胞に放射線を照射し、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を含む、または含まない完全増殖培地に接種し、１０〜１４日間コロニー形成させた。データをプロットして、高線量（Ｄ０）および低線量（Ｄ１、Ｄｑ）の放射線を照射した時の細胞殺滅の速度について分析した（図３５、表４１）。
表４１．細胞の生存反応パラメータ
３２Ｄ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＩＥＣ１８、ＩＥＣ６、およびＵ２ＯＳ細胞株で有意な保護が観察されたが、ＣＣＤ１８ＣｏおよびＳａｏｓ株ではより控えめな保護が観察された（図３５、表４１）。放射線照射後のＦＧＦ−２０によるＵ２ＯＳおよびＮＩＨ ３Ｔ３細胞の処理は、事前処理よりも効果的であった。
まとめると、これらの結果は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が、インビトロ放射線照射に対する保護作用を有していることを示している。
６．３０ 実施例３０：サイトカイン放出に及ぼすＣＧ５３１３５の作用
サイトカインは、広範囲の生理学的反応を仲介する重要なシグナル伝達タンパク質である。イオン化放射線は、遺伝子発現およびサイトカイン特性に一連の変化を引き起こすことができる。本研究の目的は、細胞培養中のＣＧ５３１３５処理によるサイトカイン特性を経時的に評価することである。
サイトカインは、広範囲の生理学的反応を仲介する重要なシグナル伝達タンパク質である。イオン化放射線は、遺伝子発現およびサイトカイン特性に一連の変化を引き起こすことができる。本研究の目的は、細胞培養中のＣＧ５３１３５処理によるサイトカイン特性を経時的に評価することである。
ＢｉｏＰｉｅｘサイトカインアッセイは組織培養上清から複数のサイトカインを定量化するように設計されたマルチプレックスビーズを基礎とするアッセイであり、これをサイトカイン検出に用いた。アッセイの原理は捕捉サンドイッチ免疫アッセイに類似している。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を９６ウエルプレートに接種した。細胞をＤＭＥＭ＋０．１％ウシ血清（ＳＦＭ）で洗浄した。ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌで細胞に加えた。３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間後に細胞上清を集めた。陽性コントロールには５０ｎｇのＴＮＦを用いた。Ｂｉｏｐｌｅｘ １８−Ｐｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を、製造元の手順書に従って行った。
結果：
図３６にＭｏ ＫＣ放出に及ぼすＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用を示す。Ｍｏ ＫＣは、ケモカインＣＸＣＬ１としても知られている（これはＧｒｏ１、メラノーマ成長刺激活性（ＭＳＧＡ）または好中球活性化タンパク質−３（ＮＡＰ３）とも示される）。これは、ＣＸＣＲ１レセプターを介しシグナル伝達する好中球の化学誘因物質としても機能する。これはまた、放射線全身照射に対する反応にも関係し、それ自体が放射線保護特性を持つ可能性が提議されている（Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１６０：６３７〜４６，２００３）。図３６は、測定した反応について用量に矛盾がないこと（ｐ＝０．００８５）および時間依存的に増加すること（ｐ＝４．６×１０−６）を示している。これに加えて、両濃度のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、コントロール（ＣＧ５３１３５なし）に比べて有意に高い反応を示した。
図３６にＭｏ ＫＣ放出に及ぼすＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の作用を示す。Ｍｏ ＫＣは、ケモカインＣＸＣＬ１としても知られている（これはＧｒｏ１、メラノーマ成長刺激活性（ＭＳＧＡ）または好中球活性化タンパク質−３（ＮＡＰ３）とも示される）。これは、ＣＸＣＲ１レセプターを介しシグナル伝達する好中球の化学誘因物質としても機能する。これはまた、放射線全身照射に対する反応にも関係し、それ自体が放射線保護特性を持つ可能性が提議されている（Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１６０：６３７〜４６，２００３）。図３６は、測定した反応について用量に矛盾がないこと（ｐ＝０．００８５）および時間依存的に増加すること（ｐ＝４．６×１０−６）を示している。これに加えて、両濃度のＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、コントロール（ＣＧ５３１３５なし）に比べて有意に高い反応を示した。
ＣＧ５３１３５処理に反応したＩＬ−６およびＩＬ−１１の発現についても調べた。ＩＬ−６およびＩＬ−１１は最近、放射線全身照射に対する反応とも関連付けられている。これに加えてＩＬ−１１は化学療法または放射線療法後の血小板減少症の治療薬としても用いられている。ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞を、０．１％ＢＳＡを含む基礎培地の中で、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５と指示時間インキュベーションした。コンディショニング培地を取り出し、ＬｕｍｉｎｅｘまたはＥＬＩＳＡをそれぞれ用いてＩＬ−６およびＩＬ−１１濃度を分析した。図３６Ｂは、ＩＬ−６およびＩＬ−１１サイトカインが、インビトロでのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物への曝露によって誘導されることを示している。
追加の実験を行い、ＣＧ５３１３５−０５とＣＸＣＬ１との組合せが、インビトロおよびインビボの両方で相乗的に放射線保護に機能するか決定できる。さらには、他のサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ）の誘導についても、当業者が認識するように、様々な細胞株（例えばＨＵＶＥＣ、ＣＣＤ−１８、ＮＩＨ ３Ｔ３）について、ＣＧ５３１３５−０５存在化で試験できる。
６．３１ 実施例１０：放射線曝露後の反応性酸素中間体スカベンジャーの測定
ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ法
細胞は、第一工程として、反応性酸素種の増加に伴ってスーパーオキシドジスムターゼ−Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤ、および細胞外−ＳＯＤをアップレギュレーションして、スーパーオキシドラジカルを過酸化水素にして除く。これら酵素の活性は、それらのＨ２Ｏ２副産物を、アセトキシメチルエステルを用いて間接的に測定することができる。この分類の誘導体である、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡとしても知られる５−（および６−）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオロセインジアセタートは、Ｈ２Ｏ２によって酸化されると細胞内に効率的に保持されて緑色の蛍光を発する。
ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ法
細胞は、第一工程として、反応性酸素種の増加に伴ってスーパーオキシドジスムターゼ−Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤ、および細胞外−ＳＯＤをアップレギュレーションして、スーパーオキシドラジカルを過酸化水素にして除く。これら酵素の活性は、それらのＨ２Ｏ２副産物を、アセトキシメチルエステルを用いて間接的に測定することができる。この分類の誘導体である、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡとしても知られる５−（および６−）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオロセインジアセタートは、Ｈ２Ｏ２によって酸化されると細胞内に効率的に保持されて緑色の蛍光を発する。
結果は、ＩＥＣ１８およびＣＣＤ１８Ｃｏ細胞が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された後、用量反応的な様式で細胞内のＨ２Ｏ２を増加させたことを示している（図３７（Ａ）〜（Ｃ））。これは、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物によって誘導されたスーパーオキサイドジスムターゼ、主にＭｎＳＯＤの発現増加によるものと考えられる。
ＩＥＣ１８細胞内でのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物による細胞内Ｈ２Ｏ２産生は、イオン化放射線の線量の増加に伴って増加した（図３７（Ｂ））。この結果は、放射線の照射によってスーパーオキサイドおよびヒドロキシルのような高反応性の酸素種の産生が増加し、結果としてＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物によって誘導されるスーパーオキサイドジスムターゼの基質が増加したことを反映したものである。
ＲｅｄＣＣ−１法
イオン化放射線に曝露すると、放射線がＨ２Ｏをヒドロキシルラジカル（ＯＨ）、スーパーオキサイド（Ｏ２）、または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）にイオン化する結果として、細胞は反応性酸素種を蓄積する。これらの多量のイオンは細胞に有害な作用を及ぼすため、これら分子をより安定な変異種にして除く経路がアップレギュレーションされる。ＣＧ５３１３５は細胞質の酸化還元能力を低下させる経路をアップレギュレーションすることによって、放射線障害から細胞を保護していると仮説が立てられている。Ｒｅｄｏｘ Ｓｅｎｓｏｒ１（Ｒｅｄ ＣＣ−１）と呼ばれる色素は、酸化によってＦＡＣＳのＦＬ２チャンネルで測定可能な赤色の蛍光剤に変化することによって、細胞質の酸化還元レベルをモニタリングできる。
イオン化放射線に曝露すると、放射線がＨ２Ｏをヒドロキシルラジカル（ＯＨ）、スーパーオキサイド（Ｏ２）、または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）にイオン化する結果として、細胞は反応性酸素種を蓄積する。これらの多量のイオンは細胞に有害な作用を及ぼすため、これら分子をより安定な変異種にして除く経路がアップレギュレーションされる。ＣＧ５３１３５は細胞質の酸化還元能力を低下させる経路をアップレギュレーションすることによって、放射線障害から細胞を保護していると仮説が立てられている。Ｒｅｄｏｘ Ｓｅｎｓｏｒ１（Ｒｅｄ ＣＣ−１）と呼ばれる色素は、酸化によってＦＡＣＳのＦＬ２チャンネルで測定可能な赤色の蛍光剤に変化することによって、細胞質の酸化還元レベルをモニタリングできる。
細胞質反応性酸素種＋Ｒｅｄ ＣＣ−１ → 酸化Ｒｅｄ ＣＣ−１
ＩＥＣ１８（ラット腸上皮）およびＣＣＤ−１８Ｃｏ（ヒト結腸線維芽細胞）細胞を６０ｍｍの皿に１×１０５細胞／皿で接種した。付着後、細胞を０．１％血清および指示用量のＣＧ５３１３５大腸菌精製物を含む培地に移した。１８時間インキュベーションした後、細胞に２または４ＧｙのＸ線を、Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ−ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを用いて照射し、続いて５ｍＭ Ｒｅｄ ＣＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と１５分間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、トリプシン処理してＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ２チャンネルで分析した。
ＩＥＣ１８（ラット腸上皮）およびＣＣＤ−１８Ｃｏ（ヒト結腸線維芽細胞）細胞を６０ｍｍの皿に１×１０５細胞／皿で接種した。付着後、細胞を０．１％血清および指示用量のＣＧ５３１３５大腸菌精製物を含む培地に移した。１８時間インキュベーションした後、細胞に２または４ＧｙのＸ線を、Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ−ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを用いて照射し、続いて５ｍＭ Ｒｅｄ ＣＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と１５分間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、トリプシン処理してＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ２チャンネルで分析した。
結果：ＩＥＣ１８およびＣＣＤ１８Ｃｏ細胞が、ＣＧ５３１３５−０５処理後に、図３８（Ａ）〜（Ｃ）に示すように用量反応的な様式で低下する細胞質酸化還元能を有することが見出された。ここに示したデータは、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物によってスーパーオキサイドジスムターゼの発現増加が誘導され、これがより高い反応種であるスーパーオキサイドおよびヒドロキシルラジカルを排除した結果と考えられる。また、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、重要な酸化予防−制御転写因子のＮｒｆ２の発現を増加させることも示されたが、これが別の経路でこの細胞質反応性の低下に寄与した可能性もある。
６．３２．実施例３２：骨髄腫細胞株３２Ｄのインビトロ放射線保護
骨髄細胞でのＣＧ５３１３５の放射線保護作用についても、骨髄細胞株３２Ｄを用いたインビトロ実験で研究した。３２Ｄ細胞に０、１、２、３、４、または５Ｇｙで放射線を照射してから、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物と共に、または無しでメチルセルロース含有増殖培地に接種した。細胞を１０日間コロニー形成させ、次にスコアを付けた。図３９は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物への曝露によって３２Ｄ細胞の生存率が上昇することを示している。細胞生存率を生存画分の自然対数でプロットし、線形象眼式を用いて曲線を得た。曲線の資質、即ちＤ１、Ｄｑ、およびＤ０は、放射線保護が観察されるポイントを示しており、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１１４（３）：４１５〜４２４（１９８８）に記載の方法によって導いたが、その記述は、参照することによって、そっくりそのままここに組み入れられる。Ｄｑ値の上昇は、細胞死が対数的に増加し始めるのに必要な放射線量（または低放射線量時の曲線の「肩」の幅）を示しており、２．１０Ｇｙ〜２．７９Ｇｙに観察された。
骨髄細胞でのＣＧ５３１３５の放射線保護作用についても、骨髄細胞株３２Ｄを用いたインビトロ実験で研究した。３２Ｄ細胞に０、１、２、３、４、または５Ｇｙで放射線を照射してから、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物と共に、または無しでメチルセルロース含有増殖培地に接種した。細胞を１０日間コロニー形成させ、次にスコアを付けた。図３９は、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物への曝露によって３２Ｄ細胞の生存率が上昇することを示している。細胞生存率を生存画分の自然対数でプロットし、線形象眼式を用いて曲線を得た。曲線の資質、即ちＤ１、Ｄｑ、およびＤ０は、放射線保護が観察されるポイントを示しており、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１１４（３）：４１５〜４２４（１９８８）に記載の方法によって導いたが、その記述は、参照することによって、そっくりそのままここに組み入れられる。Ｄｑ値の上昇は、細胞死が対数的に増加し始めるのに必要な放射線量（または低放射線量時の曲線の「肩」の幅）を示しており、２．１０Ｇｙ〜２．７９Ｇｙに観察された。
６．３３．実施例３３：骨髄除去および続く骨髄移植後の胸腺の再生に及ぼすＣＧ５３１３５の作用
免疫系再生時の、特に胸腺微小環境におけるＣＧ５３１３５の長期作用についても調べた。本実施例のタンパク質濃度は、ＵＶ吸収によって測定した。ＣＧ５３１３５大腸菌精製物を、骨髄除去および移植モデルを用いて試験し、胸腺細胞による胸腺再生について調べた。マウスに９Ｇｙの放射線を照射して骨髄を除去し、続いて骨髄移植を行った。これを行う前に、一群のマウスに１６ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５（ＩＰ）を、１日１回、骨髄除去日を基準とする第−３、−２、−１、０、および＋１日に投与した。骨髄移植後３０日目に、未処理および処理マウス両方から胸腺を採取し、胸腺細胞を集めた。細胞数を測定（Ａ）すると同時に（Ｂ）Ｔ細胞特異マーカーのＣＤ４およびＣＤ８について染色した。
免疫系再生時の、特に胸腺微小環境におけるＣＧ５３１３５の長期作用についても調べた。本実施例のタンパク質濃度は、ＵＶ吸収によって測定した。ＣＧ５３１３５大腸菌精製物を、骨髄除去および移植モデルを用いて試験し、胸腺細胞による胸腺再生について調べた。マウスに９Ｇｙの放射線を照射して骨髄を除去し、続いて骨髄移植を行った。これを行う前に、一群のマウスに１６ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５（ＩＰ）を、１日１回、骨髄除去日を基準とする第−３、−２、−１、０、および＋１日に投与した。骨髄移植後３０日目に、未処理および処理マウス両方から胸腺を採取し、胸腺細胞を集めた。細胞数を測定（Ａ）すると同時に（Ｂ）Ｔ細胞特異マーカーのＣＤ４およびＣＤ８について染色した。
図４０は、胸腺内の全胸腺細胞集団および成熟ＣＤ４／ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で処理された動物で有意に増加していることを示している（ｐ＝０．００００３）。
６．３４．実施例３４：放射線誘発性の下痢に及ぼすＣＧ５３１３５の作用（研究Ｎ４３９）
本研究は、致死線量の放射線に曝露したマウスの下痢のレベルおよび重篤度を下げるＣＧ５３１３５の能力について調べた。前述の研究（Ｎ４３８）は、１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を第−１、０、および＋１日の３回投与スケジュールで投与すると、１４ＧｙのＸ線照射に曝露したマウスの下痢重篤度が有意に低下することを示した。これに対し、第０日、放射線照射後０、６、１２、１８時間目の４ｍｇ／ｋｇ投与は、下痢の重篤度を上げた。今回の研究は、これらの観察を更に検証し、他の治療的ＣＧ５３１３５処理スケジュールが、薬物が放射線曝露後だけに投与された場合に、下痢の重篤度を下げることができるか評価した。
本研究は、致死線量の放射線に曝露したマウスの下痢のレベルおよび重篤度を下げるＣＧ５３１３５の能力について調べた。前述の研究（Ｎ４３８）は、１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を第−１、０、および＋１日の３回投与スケジュールで投与すると、１４ＧｙのＸ線照射に曝露したマウスの下痢重篤度が有意に低下することを示した。これに対し、第０日、放射線照射後０、６、１２、１８時間目の４ｍｇ／ｋｇ投与は、下痢の重篤度を上げた。今回の研究は、これらの観察を更に検証し、他の治療的ＣＧ５３１３５処理スケジュールが、薬物が放射線曝露後だけに投与された場合に、下痢の重篤度を下げることができるか評価した。
材料および方法：
試験材料：本研究に用いた試験材料はＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物、バッチ番号ＰＴ０５０４Ａであった。これは９．９ｍｇ／ｍｌの凍結保存品として供給され、各バイアルを−８０℃から融解し、必要に応じて層流フード内で、アミノシン（Ａｍｉｎｏｓｙｎ）を用いて１．６または０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、またアミノシンは希釈前に無菌濾過した。次に動物に０．１ｍｌ／１０ｇ体重の割合でｉｐ注射した。ＣＧ５３１３５は用時に調製した。
試験材料：本研究に用いた試験材料はＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物、バッチ番号ＰＴ０５０４Ａであった。これは９．９ｍｇ／ｍｌの凍結保存品として供給され、各バイアルを−８０℃から融解し、必要に応じて層流フード内で、アミノシン（Ａｍｉｎｏｓｙｎ）を用いて１．６または０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、またアミノシンは希釈前に無菌濾過した。次に動物に０．１ｍｌ／１０ｇ体重の割合でｉｐ注射した。ＣＧ５３１３５は用時に調製した。
試験動物および飼育：研究開始時１０〜１２週齢の１４０匹の雄ＢＤＦ１マウス（Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ）に、耳パンチを使って個別に番号をふった。各処理群は２０匹のマウスから構成され、４つのケージに５匹ずつ収納した。動物は、１時間当たり２７回空気交換を行う、個別換気式ケージに入れられた。動物は試験開始まで１４日間順応させた。部屋は自動タイマーによって、薄明のない１２時間の明暗サイクルに置かれた。全てのケージに研究を特定するのに必要な適切な情報、用量、動物数、および処理群が表示された。動物には標準的な齧歯類用の維持食が与えられた。餌と水は自由に摂らせた。
実験手順：
マウスは群当たり２０匹の動物から成る７処理群に分けられ、区別するために耳に穴が開けられた。次に表ｘｘのスケジュールに従って、動物にＩＰ注射によって薬物（ＣＧ５３１３５）を投与するか、または未処理のまま維持した。０．７Ｇｙ／分の割合で放射線を送り出すＰａｎｔａｋ ＰＭＣ １０００、モデルＨＦ３２０装置を用いて、マウスに１４ＧｙのＸ線を、全身に単回照射した。全ての放射線照射は、１３：００〜１７：００の間に実施した。動物は、放射線照射中は拘束されたが、麻酔はかけなかった。
マウスは群当たり２０匹の動物から成る７処理群に分けられ、区別するために耳に穴が開けられた。次に表ｘｘのスケジュールに従って、動物にＩＰ注射によって薬物（ＣＧ５３１３５）を投与するか、または未処理のまま維持した。０．７Ｇｙ／分の割合で放射線を送り出すＰａｎｔａｋ ＰＭＣ １０００、モデルＨＦ３２０装置を用いて、マウスに１４ＧｙのＸ線を、全身に単回照射した。全ての放射線照射は、１３：００〜１７：００の間に実施した。動物は、放射線照射中は拘束されたが、麻酔はかけなかった。
表４２．研究計画
０＝下痢の兆候なし
１＝軟便／軽度の下痢
２＝下痢、肛門周辺の汚れ／毛皮のつやが無くなる
３＝広範囲の汚れ／柔毛のつやが無くなる、重篤な水様便
個々の動物の下痢のスコアを記録した。
組織病理：犠牲時に、回腸および中腸を取り出し、パラフィン包埋する前にホルマリン食塩水に入れ固定した。これら包埋サンプルを次に３μｍの切片にし、Ｈ＆Ｅで染色して、腸の損傷レベルを目視で評価した。各マウスの切片を評価し、以下１〜５のスコアを付けた：
１：正常組織
２：再生上皮、殆ど修復
３：潰瘍
４：重篤な潰瘍、陰窩が殆ど残っていない
５：完全剥離。
１：正常組織
２：再生上皮、殆ど修復
３：潰瘍
４：重篤な潰瘍、陰窩が殆ど残っていない
５：完全剥離。
結果：
群当たりの体重の相対減少を図４１に示す。下痢重篤度スコアの生データを図４２（Ａ）および（Ｂ）にまとめた。
群当たりの体重の相対減少を図４１に示す。下痢重篤度スコアの生データを図４２（Ａ）および（Ｂ）にまとめた。
全ての動物が体重減少を示したが、ＣＧ５３１３５処理動物は、コントロール群に比べ初期の体重減少率が大きかった。この減少差は、中間点（第２および３日）で最も大きく、投与スケジュールに直接関係していた（最も高用量が投与された動物の体重減少が最も大きかった）。しかしながら、研究後半までに、群間の体重減少レベルの差は無くなった。前回同様、マウスはその体重が２０％を超えて減少し、かつ困窮の兆候を示した場合には瀕死状態と考え間引いた。マウスが２０％を超える体重減少を示したが活動的であった場合には、それらはそのまま残して次回に再評価した。間引いたマウスが死亡した場合には、組織は採取しなかったため組織学のスコアは存在しない。
第４日まで下痢は観察されなかったが、下痢の発生は第３日から１日２回測定した。１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５が下痢の重篤度を下げることは直ちに明らかになった。放射線照射を起点とした第−１、０、＋１日について前回有効であった投与プロトコールは、今回も最も有効なプロトコールであり、放射線照射後０、６、１２、および１８時間後の投与は最も効果が低かった。放射線曝露直後の単回治療的投与、または放射線曝露直後および２４時間後の投与も非常に効果的であった。前者は、初期の時点の有効性は低いと考えられたが、下痢の重篤度は第５日の夕方までに低下した。この中期間については、投与頻度と重篤度の間に相関関係が見られ、１日の投与回数が多い動物ほど重篤な下痢を経験した。
群毎の総下痢スコアを調べたところ、第−１、０、および＋１日の投与の作用は、下痢の重篤度を未処理レベルの６０％に下げた（瀕死の動物を重篤度スコア３に割り付けた場合には４９％）。放射線照射直後にＣＧ５３１３５を投与された場合は、この値は６８％まで増加する（瀕死の動物を重篤度スコア３に割り付けた場合には７０％）。それ以外で投与された動物の重篤度は、コントロール（瀕死動物を含めた場合には、６０、５６、および６３％）の６９（投与日０、１日）、８０（投与日０、１、２）、および７７％（投与日０、１、２、３日）であった。
小腸の組織学スコアは、下痢のデータを確認した。瀕死のマウスをスコア４とした総スコアおよび平均スコアの検査からは、第０日のみ投与を受けたマウス、および第−１、０、および＋１日に投与を受けたマウスの反応が最も良かった。この場合も、０、６、１２、および１８時間後のＣＧ５３１３５投与の効果は低かった。
本研究中に観察されたその他の報告事項としては、１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を投与された殆どのマウスが、投与後直ぐに射精したという事実がある。これは新しい観察であるが、我々がこれまでの殆どの仕事を４ｍｇ／ｋｇを用いて行っており、この現象は薬物の用量が高いことに関係するだろう。
最後に、１６ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５−０５は、１４ＧｙのＸ線照射に曝露したマウスの下痢重篤度を安定して下げた。各種パラメータにより調べたところ、第０日のみ、または第−１、０、＋１日の投与が最も良い保護をもたらした。それ以外の投与（第０、１日；第０、＋１、＋２；および第０、＋１、＋２、＋３日）は優れた便益をもたらさなかった。放射線照射後０、６、１２、および１８時間目の投与もまた、総下痢重篤度を下げなかった。
６．３５．実施例３５：創傷修復試験
インビトロ細胞培養：ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ２、ＨＴ２９、およびＴＨＰ−１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得、ＨＴ−２９ＭＴＸはＤｒ．Ｌｅｓｕｆｆｌｅｒ、ＩＮＳＥＲＭ、Ｄｉｌｌｅｊｕｉｓ、Ｆｒａｎｃｅから提供された。これらの細胞株（Ｃａｃｏ２、ＨＴ−２９、およびＨＴ−２９ＭＴＸ）は前記の通りに増殖させた。ＴＨＰ−１細胞株は、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌの抗生物質／抗菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含むＲＭＰＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で増殖させた。
インビトロ細胞培養：ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ２、ＨＴ２９、およびＴＨＰ−１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得、ＨＴ−２９ＭＴＸはＤｒ．Ｌｅｓｕｆｆｌｅｒ、ＩＮＳＥＲＭ、Ｄｉｌｌｅｊｕｉｓ、Ｆｒａｎｃｅから提供された。これらの細胞株（Ｃａｃｏ２、ＨＴ−２９、およびＨＴ−２９ＭＴＸ）は前記の通りに増殖させた。ＴＨＰ−１細胞株は、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌの抗生物質／抗菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含むＲＭＰＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で増殖させた。
インビトロ治癒アッセイは、改良法を用いて行った。簡単に説明すると、参照ラインを２４ウエルプレートの底の外側に、横切るように水平に引いた。ＨＴ−２９およびＣａｃｏ−２細胞を接種し、集密状態まで増殖させてから、０．１％ＦＢＳを含む培地で２４時間インキュベーションした。
無菌のプラスチックピペットチップを、ウエルの底に引いたラインに垂直に立てて直線上の傷を付けた。それから単離したＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。創傷のサイズを、３カ所の所定位置で、創傷後の様々な時間（０、６、２０、および２４時間）に測定した。創傷の閉鎖を、倍率２０倍の顕微鏡を用いて経時的に測定し、平均創傷閉鎖パーセンテージをベースライン値（０時間）に対し計算した。細胞の回復に対するＦＧＦ−２０の作用がＴＧＦ−βおよびＩＴＦ経路に関係しているか調べるために、抗ＴＧＦβ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびポリクローナル抗ＩＴＦ抗体（Ｄ Ｋ Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡより贈られた）を用いた。
図４３は、様々なヒト細胞株での創傷閉鎖におけるＦＧＦ−２０の作用を示している。試験した全ての細胞株において、創傷閉鎖に対するＦＧＦ−２０の効果は用量依存的に上昇し、創傷修復におけるＦＧＦ−２０の役割を証明した。
６．３６．実施例３６：リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）
細胞株および結腸組織のトータルＲＮＡを、ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの指示書に従って用いて調製した。ＲＮＡを、２μｇのトータルＲＮＡ、１５ＵのＲＮＡ阻害剤、１ｘの第一鎖緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）、１２５ｐｍｏｌランダムヘキサマープライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および１２５Ｕのモロニーマウス白血病ウイルスＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を最終容積２５ｕｌで用いて逆転写した。反応は３９℃で１時間行い、続いて９３℃で７分、さらに２４℃で１分行い、その後、２０分間かけてゆっくりと４℃まで冷やした。ＰＣＲは、５０μｌの容積中に５μｌのＲＴ混合物、１ＸのＴｈｅｒｍｏｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）緩衝液、各プライマー５ｐｍｏｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、および１ＵのＴａｑポリメラーゼを含む形で実施した。
細胞株および結腸組織のトータルＲＮＡを、ＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの指示書に従って用いて調製した。ＲＮＡを、２μｇのトータルＲＮＡ、１５ＵのＲＮＡ阻害剤、１ｘの第一鎖緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）、１２５ｐｍｏｌランダムヘキサマープライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および１２５Ｕのモロニーマウス白血病ウイルスＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を最終容積２５ｕｌで用いて逆転写した。反応は３９℃で１時間行い、続いて９３℃で７分、さらに２４℃で１分行い、その後、２０分間かけてゆっくりと４℃まで冷やした。ＰＣＲは、５０μｌの容積中に５μｌのＲＴ混合物、１ＸのＴｈｅｒｍｏｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）緩衝液、各プライマー５ｐｍｏｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、および１ＵのＴａｑポリメラーゼを含む形で実施した。
用いたプライマーの配列は次の通りである：
ヒトＣＯＸ−２センス：５’−ＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ−３’（配列番号６２）、
ヒトＣＯＸ−２アンチセンス：５’−ＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６３）、
ヒト腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）センス：５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号６４）、
ヒトＩＴＦアンチセンス：５’−ＣＧＴＴＡＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号６５）、
ヒトＰＰＡＲ−γセンス：５’−ＴＣＴＣＴＣＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号６６）、
ヒトＰＰＡＲ−γアンチセンス：５’−ＧＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号６７）、
ヒトβ−アクチンセンス：５’−ＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６８）、
ヒトβ−アクチンアンチセンス：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴ−３’（配列番号６９）、
マウスＣＯＸ−２センス：５’−ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号７０）、
マウスＣＯＸ−２アンチセンス：５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧ−３’（配列番号７１）、
マウスＩＴＦセンス：５’−ＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号７２）、
マウスＩＴＦアンチセンス：５’−ＣＣＧＣＡＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧ−３’（配列番号７３）、
マウスＩＬ−１０センス：５’−ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号７４）、
マウスＩＬ−１０アンチセンス：５’−ＣＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴ−３’（配列番号７５）、
マウスＧ３ＰＤＨセンス：５’−ＣＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７６）、
マウスＧ３ＰＤＨアンチセンス：５’−ＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７７）。
ヒトＣＯＸ−２センス：５’−ＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ−３’（配列番号６２）、
ヒトＣＯＸ−２アンチセンス：５’−ＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６３）、
ヒト腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）センス：５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧ−３’（配列番号６４）、
ヒトＩＴＦアンチセンス：５’−ＣＧＴＴＡＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号６５）、
ヒトＰＰＡＲ−γセンス：５’−ＴＣＴＣＴＣＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号６６）、
ヒトＰＰＡＲ−γアンチセンス：５’−ＧＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号６７）、
ヒトβ−アクチンセンス：５’−ＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６８）、
ヒトβ−アクチンアンチセンス：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴ−３’（配列番号６９）、
マウスＣＯＸ−２センス：５’−ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号７０）、
マウスＣＯＸ−２アンチセンス：５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧ−３’（配列番号７１）、
マウスＩＴＦセンス：５’−ＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号７２）、
マウスＩＴＦアンチセンス：５’−ＣＣＧＣＡＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧ−３’（配列番号７３）、
マウスＩＬ−１０センス：５’−ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号７４）、
マウスＩＬ−１０アンチセンス：５’−ＣＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴ−３’（配列番号７５）、
マウスＧ３ＰＤＨセンス：５’−ＣＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７６）、
マウスＧ３ＰＤＨアンチセンス：５’−ＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７７）。
ＰＣＲは、増幅直線性を得るように２０〜４０サイクルに設定されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００ ｃｙｃｌｅｒを用いて行った。ＰＣＲ産物は、ゲル開始蛍光色素（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を含む２％トリス−アセテートおよびＥＤＴＡアガロースゲルで電気泳動した。ゲルからネガをＡｌｐｈａｉｍａｇｅｒ２０００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）を用いて取り、β−アクチンおよびＧ３ＰＤＨ転写物の密度に対して正規化して、Ａｄｏｂｅフォトショップ３．０．４ソフトウエアを用いＲＴ−ＰＣＲ転写物の相対量を評価した。
細胞株または標準的な手順でマウス（Ｃ５７ＢＬ６）から分離された細胞でのｍＲＮＡ発現によって、幾つかの保護遺伝子の発現も検出された。
ＣＧ５３１３５存在下での、ＨＴ２９細胞株におけるＣＯＸ−２遺伝子の発現は用量依存的であり、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物で誘導した時最高の発現を示した（図４４）。この濃度では、遺伝子の発現は、１時間および３時間のインキュベーション時間の時より高く、その後６時間および２４時間では減少した。
Ｃａｃｏ２細胞株におけるＣＯＸ−２遺伝子の発現は、図４５に見られるように、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５で刺激したときに高かった。１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物とインキュベーションした１、３、および６時間後にＣＯＸ２の発現増加が見つかった。
ＩＥＣ−６細胞株におけるＣＯＸ−２の発現は、ＣＧ５３１３５存在下で用量依存的増加を示した（図４６）。ＣＯＸ−２の発現上昇は、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物とインキュベーションした１時間後に見つかった。
ＨＴ−２９およびＣａｃｏ２細胞株における腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）の、ＣＧ５３１３５存在時の発現を図４７に示す。結果は、ＨＴ−２９およびＣａｃｏ２細胞の両方において、ＦＧＦ−２０刺激時にはＩＴＦの発現が用量および時間依存的に増加することを示している。図４８は、ＣＯＸ−２がＨＴ−２９細胞で発現していることを繰り返し示している。図４８には、これに加えＴＧＦ−β、ＩＴＦ、ＰＰＡＲ−γの発現も示してある。
示した結果は、ＣＧ５３１３５が、ＣＯＸ−２およびＩＴＦ遺伝子を誘導することによって粘膜の修復に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。ＦＧＦ−２０がＴＧＦ−βの発現を誘導するというデータに基づいて、Ｃａｃｏ−２細胞における創傷の修復を実施例３５に記載したようにして、抗ＴＧＦ−β抗体（２０μｇ／ｍｌ）を存在させて試験した。図４９は、ＸＧ５３１３５による上皮回復が、一部ＴＧＦ−β経路によって仲介されていることを示している（ｐ＜０．０５対ＣＧ５３１３５大腸菌精製物＋抗ＴＧＦ−β）。
６．３７．実施例３７：転写経路アッセイ
シグナル伝達は、ＣＧ５３１３５で刺激した時の、上皮細胞へのＣＯＸ−２発現誘導に関わる可能性があるメカニズムである。様々なキナーゼについて、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が存在する状態で、Ｃａｃｏ２細胞におけるそれらの発現を試験した。結果は、リン酸化されたＭＡＰＫ（ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ）はＣＧ５３１３５存在下で誘導されたが、その他の試験したキナーゼは、有意な誘導を示さなかった（図５０（Ａ））。また、ＩｋＢαの発現は、ＣＧ５３１３５が存在すると、中程度の分解を示した。これに加えて、図５０（Ｂ）はＥｒｋおよびＭＡＰＫの阻害剤がＣａｃｏ２細胞において、ＦＧＦ−２０存在下にＣＯＸ−２の発現を低下することを明らかにした。さらには、キナーゼの発現を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が存在する状態で、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞株について分析した（図５０（Ｃ））。結果は、リン酸化されたＳＴＡＴ３、ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ、およびＳＯＣＳ−３遺伝子の発現の増加を明らかにした。また図５０（Ｄ）〜（Ｅ）は、ＣＧ５３１３５が存在する状態で、Ｃａｃｏ−２においてリン酸化されたＥＩｋ−１、ＡＴＦ−２の発現が増加すること、およびリン酸化されたプロテインキナーゼＣのごく僅かに誘導されることを示している。ＨＴ−２９細胞では、ＣＧ５３１３５と一緒に培養すると、Ｃ−ＦｏｓおよびＣ−Ｊｕｎが誘導された（図５０（Ｄ）〜（Ｅ））。
シグナル伝達は、ＣＧ５３１３５で刺激した時の、上皮細胞へのＣＯＸ−２発現誘導に関わる可能性があるメカニズムである。様々なキナーゼについて、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が存在する状態で、Ｃａｃｏ２細胞におけるそれらの発現を試験した。結果は、リン酸化されたＭＡＰＫ（ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ）はＣＧ５３１３５存在下で誘導されたが、その他の試験したキナーゼは、有意な誘導を示さなかった（図５０（Ａ））。また、ＩｋＢαの発現は、ＣＧ５３１３５が存在すると、中程度の分解を示した。これに加えて、図５０（Ｂ）はＥｒｋおよびＭＡＰＫの阻害剤がＣａｃｏ２細胞において、ＦＧＦ−２０存在下にＣＯＸ−２の発現を低下することを明らかにした。さらには、キナーゼの発現を、１００ｎｇ／ｍｌのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物が存在する状態で、ＴＨＰ−１マクロファージ細胞株について分析した（図５０（Ｃ））。結果は、リン酸化されたＳＴＡＴ３、ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ、およびＳＯＣＳ−３遺伝子の発現の増加を明らかにした。また図５０（Ｄ）〜（Ｅ）は、ＣＧ５３１３５が存在する状態で、Ｃａｃｏ−２においてリン酸化されたＥＩｋ−１、ＡＴＦ−２の発現が増加すること、およびリン酸化されたプロテインキナーゼＣのごく僅かに誘導されることを示している。ＨＴ−２９細胞では、ＣＧ５３１３５と一緒に培養すると、Ｃ−ＦｏｓおよびＣ−Ｊｕｎが誘導された（図５０（Ｄ）〜（Ｅ））。
６．３８．実施例３８：硫酸デキストラン誘発大腸炎のメスＳｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおけるＣＧ５３１３５の用量反応作用
本実施例で報告する実験は、炎症性大腸炎の動物モデルにおける用量滴定実験の結果を報告する。
本実施例で報告する実験は、炎症性大腸炎の動物モデルにおける用量滴定実験の結果を報告する。
誘導法および一般的方法
大腸炎研究計画：体重約２０ｇの６〜８週齢の正常なメスのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ）を４日間（第−４日から第−１日）順応させてから５％硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を含む水またはコントロールの水を、７日間（第０日〜第６日）自由に経口摂取させた。ＤＳＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ ＣＡ）は、５％の水道水の溶液として作られた；ＤＳＳは一日おきに作り、４℃で保管した。マウスは、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇのＱＤ投与、ならびに投与当たり５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ投与レジメンを含む８つの処理群に分けられた（表４３）。第０日に、ビヒクル（１ＭのＬ−アルギニンのリン酸緩衝化食塩溶液）またはＣＧ５３１３５タンパク質のビヒクル溶液を用いた毎日行う腹腔内（ｉｐ）処理を開始し、第６日まで続けた。第７日に、ＣＯ２を使ってマウスを犠牲にした。
大腸炎研究計画：体重約２０ｇの６〜８週齢の正常なメスのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ）を４日間（第−４日から第−１日）順応させてから５％硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を含む水またはコントロールの水を、７日間（第０日〜第６日）自由に経口摂取させた。ＤＳＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ ＣＡ）は、５％の水道水の溶液として作られた；ＤＳＳは一日おきに作り、４℃で保管した。マウスは、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇのＱＤ投与、ならびに投与当たり５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ投与レジメンを含む８つの処理群に分けられた（表４３）。第０日に、ビヒクル（１ＭのＬ−アルギニンのリン酸緩衝化食塩溶液）またはＣＧ５３１３５タンパク質のビヒクル溶液を用いた毎日行う腹腔内（ｉｐ）処理を開始し、第６日まで続けた。第７日に、ＣＯ２を使ってマウスを犠牲にした。
表４３．処理群
剖検時に、次の判定基準に従って結腸内容物をスコア化した：
０＝正常から半固体の便、血液観察されず
１＝正常から半固体の便、うっすらと血液が観察される
２＝明瞭な血液を示す半固体から液状便
３＝血液の混じった液体。
０＝正常から半固体の便、血液観察されず
１＝正常から半固体の便、うっすらと血液が観察される
２＝明瞭な血液を示す半固体から液状便
３＝血液の混じった液体。
病理的方法：結腸の先端１／３（このモデルで最も重篤な影響を受ける領域）から先を等間隔に３つの区画に分け、パラフィン包埋して、切片を作製して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して病理評価にかけた。
各区画について、粘膜筋板から外筋層の内側境界線までの距離を測り、粘膜下浮腫を定量化した。炎症（泡沫マクロファージ、リンパ細胞、およびＰＭＮ浸潤）重篤度は、次の基準に従ってスコア化した：正常＝０；極微＝１；軽度＝２；中程度＝３；顕著＝４；および重篤＝５。脾臓リンパ球萎縮についても、上記の判定基準に従ってスコア化した。上皮細胞の損失／損傷を表すパラメータは、次のような関係する面積の％に応じてスコア化する方法を用い個別にスコア化した：なし＝０；該当する粘膜が０．１〜１０％＝１；該当する粘膜が１１〜２５％＝２；該当する粘膜が２６〜５０％＝３；該当する粘膜が５１〜７５％＝４；および該当する粘膜が７６〜１００％＝５。
該当するものの％を用いてスコア化されたパラメータとしては：（１）結腸腺上皮損失−これには陰窩上皮の消失だけでなく残りの腺上皮の消失も含まれ、陰窩損傷スコアに等しいと思われる；および（２）結腸びらん−これは表面上皮の損失を表し、一般的には粘膜出血と関係している（臨床および剖検時に見られる出血を反映している）が挙げられる。各動物について、３カ所の基部（重篤な傷害が少ない）および３カ所の先端部（最も重篤な傷害）領域についてスコアを取り、各領域について平均スコアを決定した。疾患コントロールについても群平均および％阻害を決定した。このようにすることで（様々な区画からのスコアを合計するのではなく）、個々のパラメータの平均値±ＳＥ（３区画を代表する）を知ることができ、それで重篤度の概略を表すことができる。例えば、腺上皮損失の平均が４であれば、粘膜の５１〜７５％で上皮が無いことが分かる。
最終的に、三つの重要なスコア化パラメータ（炎症、腺上皮消失、びらん）を合計して、全体的な障害および創傷が最高１５のスコアを持つ合計組織病理スコアとした。
最終的に基端部＋先端部合計スコアを合計して、全体の結腸重篤度スコアとした。
統計学：各処理群の平均および標準誤差（ＳＥ）をスコア化した各パラメータについて決定した；データを、ｐ≦０．０５を有意とする両側スチューデントｔ検定を用いて、疾患コントロール（群２）と比較した。
生存期、剖検、および臓器重量の結果
研究期間中に４匹の動物が死亡した（第７日目にビヒクルコントロール群２の＃１０、第６日目に群６、０．３ｍｇ／ｋｇの＃３、第７日目に群８、ビヒクルコントロールＢＩＤの＃５、および第６日目に群７、５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤの＃６）。
研究期間中に４匹の動物が死亡した（第７日目にビヒクルコントロール群２の＃１０、第６日目に群６、０．３ｍｇ／ｋｇの＃３、第７日目に群８、ビヒクルコントロールＢＩＤの＃５、および第６日目に群７、５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤの＃６）。
ＤＳＳ処理に関係した体重変化は、全てのＤＳＳ処理マウスにおいて第５日までに顕在化し、最終的には、ビヒクルで処理した動物で最も重篤であった（図５１（Ａ））。研究終了時、ＤＳＳ＋ビヒクルコントロールは、体重が２８％減少した。ＤＳＳ誘導体重減少に対する顕著な便益作用は、ＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）ＱＤ投与されたマウスに、全用量について見られた（図５１（Ｂ））。
全てのＤＳＳ＋ビヒクル動物について、出血性下痢の臨床兆候が明らかであった。剖検時、全ＤＳＳコントロールが結腸内に出血、または出血をうかがわせる液体を示した。これに対し１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）でＱＤ処理されたマウスは、半固体の便を示し、出血はより少なかった（動物＃５を除く）。３または１ｍｇ／ｋｇの用量をＱＤ投与されたマウスでも臨床便益は認められたがより低い印象であり、また０．３ｍｇ／ｋｇで処理されたマウスには臨床便益は認められなかった（図５１（Ｃ））。５ｍｇ／ｋｇでＢＩＤ処理したマウスが最も印象的な臨床便益を示し（６８％阻害）、これらのマウスは最も優れた、総合的な改善を示した。
結腸の絶対長は、ビヒクル処理マウスでは４１％短くなった。１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）ＱＤ処理により、ＤＳＳが誘発した結腸長の変化は有意に阻害（２１％）された。５ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）ＢＩＤ処理は、結腸の長さの短縮を３６％まで低下させた。
結腸の絶対重量は、ＤＳＳのビヒクル溶液を処理したマウスで約２６％低下した。ＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）１０ｍｇ／ｋｇのＱＤ処理、または５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ処理は、ＤＳＳが誘発した結腸重量の変化を有意に縮小した。
脾臓の絶対重量は、ＤＳＳ＋ビヒクルで処理したマウスでは約４０％低下した（過度の髄外造血による）。脾臓重量は、正常動物に比べ、全ＤＳＳ処理動物で有意に重かった。
組織病理学所見
ＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）ＱＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＩＤ（５ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスの結腸炎症、腺消失、びらんおよび総合組織病理学のスコアは、ほぼ同程度であった（図５２（Ａ）〜（Ｄ））。
ＡＢ０２０８５８（ＣＧ５３１３５）ＱＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＩＤ（５ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスの結腸炎症、腺消失、びらんおよび総合組織病理学のスコアは、ほぼ同程度であった（図５２（Ａ）〜（Ｄ））。
脾臓リンパ球萎縮（ストレスの指標）は、これら同一動物でそれぞれ４７％および４６％阻害された（図５３）。脾臓髄外造血誘導の阻害は、ＱＤ処理マウスに比べＢＩＤ処理マウスで大きく、全処理群に見られた（図５４）。
考察および結論
本実施例報告の実験からは、ＡＢ０２０２５８（ＣＧ５３１３５）投与に関する用量−反応情報が得られた。結果は、ＡＢ０２０２５８（ＣＧ５３１３５）の同時投与が、特に用いた最高用量において、ＤＳＳ誘発炎症性大腸炎のマーカー出現の阻害に効果的であることを示している。
本実施例報告の実験からは、ＡＢ０２０２５８（ＣＧ５３１３５）投与に関する用量−反応情報が得られた。結果は、ＡＢ０２０２５８（ＣＧ５３１３５）の同時投与が、特に用いた最高用量において、ＤＳＳ誘発炎症性大腸炎のマーカー出現の阻害に効果的であることを示している。
マウスをさらにＣＧ５３１３５で皮下処理する追加の実験も実施した。これらの研究は、５または１０ｍｇ／ｋｇのｉｐ用量、および５または１ｍｇ／ｋｇのｓｃ用量のＣＧ５３１３５の予防的投与が、硫酸デキストランナトリウムが大腸炎マウスモデルに誘発する粘膜損傷の範囲および重篤度を有意に下げることを明らかにした。
６．３９．実施例３９：インドメタシン処理ラットへのＣＧ５３１３５投与の作用
ラットをインドメタシンで処理すると、クローン病に見られるような肉眼的な組織病理的な腸の変化が起こる。本実施例に示す実験は、インドメタシン誘発腸傷害のラットモデルの治療における、ＣＧ５３１３５の有効性について報告する。別の腸傷害モデルにおいても、このタンパク質が有効であったことから、炎症性大腸炎の治療に関するＣＧ５３１３５の潜在的治療能力が更に支持された。
ラットをインドメタシンで処理すると、クローン病に見られるような肉眼的な組織病理的な腸の変化が起こる。本実施例に示す実験は、インドメタシン誘発腸傷害のラットモデルの治療における、ＣＧ５３１３５の有効性について報告する。別の腸傷害モデルにおいても、このタンパク質が有効であったことから、炎症性大腸炎の治療に関するＣＧ５３１３５の潜在的治療能力が更に支持された。
材料および方法
タンパク質産生：ＣＧ５３１３５タンパク質は、実施例３８の記載と同じに調製した。
タンパク質産生：ＣＧ５３１３５タンパク質は、実施例３８の記載と同じに調製した。
研究計画：体重１７５〜２００ｇの雌のＬｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を８日間順応させた（第−８日〜第−１日）。ラットを次の８つの処理群に分けた：ＣＧ５３１３５が投与（３群はｉｖ、１群がｓｃ）された４つの群、正常および疾患モデルにコントロールをｉｖ投与した２つの群、ならびに正常および疾患モデルにコントロールをｓｃ投与した２つの群。第−１日に、ＣＧ５３１３５またはビヒクルによる処理を開始し、第４日まで続けた。ＣＧ５３１３５は５、１、または０．２ｍｇ／ｋｇの用量でｉｖに注射（尾静脈）、または１ｍｇ／ｋｇのｓｃに注射され；ビヒクルコントロールはＢＳＡと一緒に注射された（５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ＋１Ｍ Ｌ−アルギニン溶液）。第０日および１日目に、ラットをインドメタシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；用量７．５ｍｇ／ｋｇ）で処理し、腸にクローン病時に起こるものに類似した肉眼的な組織病理的な変化を誘導した。インドメタシンは５％重炭酸ナトリウム液として調製された。第５日目に、剖検１時間前に、５０ｍｇ／ｋｇの５−ブロモ−２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）の単回ｉｐ用量を注射し、腸および脾臓における増殖中の細胞をパルスラベルした。終了後、傷害リスク領域の１０ｃｍの空腸区画の重さを測定し、肉眼的病理スコアを付けてから、組織病理評価ならびに壊死および炎症のスコア化のためにホルマリンの中に集めた。ＣＢＣ分析のために血液を集めた。
病理学マーカの観察および分析
肉眼観察：体重は、第０日から毎日測定した。剖検時、肝臓および脾臓の重量を測定し、リスク域の１０ｃｍの空腸区画の重さを量り、肉眼的に病変をスコア化し、組織学的評価ならびに壊死および炎症のスコア化のためにホルマリンに集めた。剖検時に、インドメタシン誘導傷害リスクが高い領域について、以下の基準に従ってスコアを付けた：０＝正常；１＝腸の腸間膜／腸間膜境界線のごく僅かな肥厚；２＝腸の腸間膜／腸間膜境界線の軽度〜中程度の肥厚、しかし壊死はなし；３＝容易に分離される１つまたは複数の規定された癒着を伴う中程度の肥厚；４＝１〜多数の分離が難しい癒着を伴う顕著な肥厚；ならびに５＝死に至る重篤な腸傷害。
肉眼観察：体重は、第０日から毎日測定した。剖検時、肝臓および脾臓の重量を測定し、リスク域の１０ｃｍの空腸区画の重さを量り、肉眼的に病変をスコア化し、組織学的評価ならびに壊死および炎症のスコア化のためにホルマリンに集めた。剖検時に、インドメタシン誘導傷害リスクが高い領域について、以下の基準に従ってスコアを付けた：０＝正常；１＝腸の腸間膜／腸間膜境界線のごく僅かな肥厚；２＝腸の腸間膜／腸間膜境界線の軽度〜中程度の肥厚、しかし壊死はなし；３＝容易に分離される１つまたは複数の規定された癒着を伴う中程度の肥厚；４＝１〜多数の分離が難しい癒着を伴う顕著な肥厚；ならびに５＝死に至る重篤な腸傷害。
組織病理：インドメタシン誘導傷害リスクが高い、重量を測定した、１０ｃｍの小腸区画より得た５つの断片（ほぼ等間隔）を１０％の中性、緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋して、５μｍの切片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して組織病理評価を行った。壊死は、実施例３８に上皮細胞損失のスコア化について記載したものと同じ方法で、疾患部位の面積のパーセントに基づいてスコア化した。
炎症は次の判定基準に従ってスコア化した；０＝なし；１＝腸間膜および筋肉、または病変にごく僅かな炎症；２＝腸間膜および筋肉または病変に軽度の炎症；３＝腸間膜および筋肉、または病変に中程度の炎症；４＝病変に顕著な炎症；ならびに５＝病変に重篤な炎症。
各動物について、炎症および壊死の平均値を決定し、次に各群の平均値を計算した。
統計学。各処理群の平均および標準誤差（ＳＥ）をスコア化した各パラメータについて決定した；データを、ｐ≦０．０５を有意とする両側スチューデントｔ検定を用いて、疾患コントロールと比較した。
結果
インドメタシン処理された全ての動物で体重減少が観察された。ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）処理を受けた動物は、疾患コントロール（ｉｖ）に比べ、僅かではあるが有意な体重減少の低下が観察された。他のＣＧ５３１３５用量（ｉｖおよびｓｃ投与経路の両方について）は、インドメタシンによる体重減少を緩和したが、有意ではなかった。
インドメタシン処理された全ての動物で体重減少が観察された。ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）処理を受けた動物は、疾患コントロール（ｉｖ）に比べ、僅かではあるが有意な体重減少の低下が観察された。他のＣＧ５３１３５用量（ｉｖおよびｓｃ投与経路の両方について）は、インドメタシンによる体重減少を緩和したが、有意ではなかった。
剖検時、各動物から得たリスク領域の空腸の１０ｃｍの区画の重量を測定した。インドメタシン処理は、この腸損傷モデルに伴う浮腫および炎症に一致して、正常ｉｖおよびｓｃコントロールに比べて小腸の重量を増加させた。ＣＧ５３１３５（１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）処理は、疾患コントロールと比較して、小腸の重量を有意に下げた（図５５（Ａ））。小腸の臨床スコアの僅かな低下が観察され、最も大きな便益は１．０ｍｇ／ｋｇ ｉｖ投与（３８％）および０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ投与（２５％）で観察された；しかしながらこれらの便益は、統計学的には有意でなかった。脾臓および肝臓の相対重量は、インドメタシン処理された動物で増加した。ＣＧ５３１３５の投与は、これらの重量をさらに僅かに増加した。
血液学：ラットへの２用量のインドメタシン投与は、好中球およびリンパ細胞の増加の結果として全白血球数を増加させた。赤血球数、ヘマトクリット、およびヘモグロビン濃度の減少も観察された。ＣＧ５３１３５（５ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）処理は、疾患コントロールに対し好中球の絶対数を有意に低下させた（図５５（Ｂ））。ヘモグロビン濃度は、正常コントロールに比べインドメタシンコントロールで低下し、ＣＧ５３１３５処理ラットで僅かではあるが更に低下した。
組織病理：各動物について、５つの小腸区画を評価し、スコア化した。小腸に対する保護作用に関する組織学的な証拠は、ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）処理動物にだけ観察された。疾患コントロールｉｖに比べ０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖＣＧ５３１３５用量では空腸壊死は５３％低下し、炎症スコアは３８％低下した（図５６）。患部小腸の顕微鏡写真を、正常および疾患コントロールについて、ならびに０．２ｍｇ／ｋｇＣＧ５３１３５処理ラットについては図５７に示した。パネルＡは、ビヒクル（ＢＳＡ）をｉｖ処理した正常コントロール動物の小腸である。パネルＢは、ビヒクル（ＢＳＡ）ｉｖと共にインドメタシンで処理したラットの小腸の顕微鏡写真である。腸間膜の癒着を伴う殆どの領域を横切って伸びる病巣性の粘膜壊死が見られる（例えば、右上小腸壁および右下小腸壁のアスタリスクを参照）。腸間膜には顕著な炎症性細胞浸潤が存在する（矢印）。パネルＣは、インドメタシン処理に加え、さらにＣＧ５３１３５、０．２ｍｇ／ｋｇをｉｖ処理したラットの小腸の像である。通常の絨毛状構造と腸間膜（矢印）が見られる。パネルＢの疾患コントロールとは異なり明瞭な壊死は見られない。絨毛が衰弱している病巣域および筋層への細胞の浸潤が見られる（例えば腸壁右上、右、および右下にある三つのアスタリスクを参照）。腸間膜には、炎症性細胞が浸潤している（矢印）。図５７の顕微鏡写真は、０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖのＣＧ５３１３５の保護作用を更に裏付けている。
ＢｒｄＵラベリングは、剖検１時間前に、５０ｍｇ／ｋｇを注射することで行った。正常コントロール動物の小腸では、正常パターンの陰窩ラベリングが１００Ｘで見られた（図５８、パネルＡ）。疾患モデルへのＢｒｄＵの取り込みは、壊死を起こした粘膜域の上皮細胞では低下するか、または無かったが、近接する炎症組織では増加し、その中では線維芽細胞のラベリングが最も顕著であった（図５８、パネルＢ、５０倍で表示）。病巣部の粘膜壊死（矢印）は、ＢｒｄＵ免疫染色が無いこと、ならびに炎症性細胞の浸潤が激しいこと、および線維芽細胞の増殖を特徴とする。インドメタシン＋ＣＧ５３１３５、０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ処理されたラットの小腸では陰窩ラベリングは無いが、粘膜は比較的無傷であった（図５８、パネルＣの矢印、５０倍で表示）。隣接する平滑筋および腸間膜は、疾患コントロールに比べると、軽度の炎症性細胞浸潤だけが見られた（パネルＢ）。ＣＧ５３１３５で処理された特定の動物では粘膜の健全性は保存され、陰窩ラベリングの上昇も観察された；これは正常コントロールに見られた傾向である。
本実施例の実験結果をまとめると次のようになる：インドメタシンでラットを処理すると、肉眼的および組織病理学的な腸の変化が起こり、これはクローン病に生ずる変化に類似していた。インドメタシン処理ラットへのＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）投与は、体重減少、小腸重量、好中球絶対数、および空腸壊死および炎症スコアを有意に下げた。より高用量のＣＧ５３１３５（５、１ｍｇ／ｋｇ ｉｖおおび１ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の有効性は小さかった。剖検１時間前にＢｒｄＵを注射した動物から集めた組織の形態学的外観からは、小腸損傷のこのモデルにおいてＣＧ５３１３５の便益作用は、標的細胞への増殖作用よりは粘膜保護の結果であることが示唆された。
６．４０．実施例４０：ＣＧ５３１３５の治療的投与は、マウスＤＳＳモデルの生存率を高める
上記の実験では、ＤＳＳ曝露およびＣＧ５３１３５投与は、第０日に同時に開始した。本実施例では、ＤＳＳ処理開始後に投与されたＣＧ５３１３５の作用について調べた。ＣＧ５３１３５は実施例３８に記載した通りに調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスＤＳＳに７日間（第０日〜第６日）曝露した。マウスに、各種濃度のＣＧ５３１３５（５、１、および０．２ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクルだけをＤＳＳ曝露５日目（即ち第４日）からＤＳＳ曝露終了後３日目（即ち第９日）まで毎日皮下注射した。動物の生存を毎日記録し、第１０日に実験を終了した。
上記の実験では、ＤＳＳ曝露およびＣＧ５３１３５投与は、第０日に同時に開始した。本実施例では、ＤＳＳ処理開始後に投与されたＣＧ５３１３５の作用について調べた。ＣＧ５３１３５は実施例３８に記載した通りに調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスＤＳＳに７日間（第０日〜第６日）曝露した。マウスに、各種濃度のＣＧ５３１３５（５、１、および０．２ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクルだけをＤＳＳ曝露５日目（即ち第４日）からＤＳＳ曝露終了後３日目（即ち第９日）まで毎日皮下注射した。動物の生存を毎日記録し、第１０日に実験を終了した。
図５９に示すように、５ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５の治療的投与は、疾患コントロール群に比べ生存率を高めた。即ち、疾患コントロールで試験終了まで生存した動物はわずか４４％（４／９）であったのに対し、５ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５で処理された動物は８９％（８／９）が生存した。
６．４１．実施例４１：ＩＬ−１０欠損マウス（ＩＬ−１０ノックアウトマウス）での炎症性大腸炎免疫仲介モデルにおけるＣＧ５３１３５の作用
研究の目的は、ＩＬ−１０欠損マウスを無菌状態から特殊な無病原菌環境に移した時生ずる炎症を治療的に阻害するＣＧ５３１３５の能力を評価することである。炎症性大腸炎には免疫系が関わると考えられていることから、本研究では、重大疾患時に治療投与した場合の、このＩＢＤの免疫介在モデルにおけるＣＧ５３１３５の有効性および安全性を評価した。
研究の目的は、ＩＬ−１０欠損マウスを無菌状態から特殊な無病原菌環境に移した時生ずる炎症を治療的に阻害するＣＧ５３１３５の能力を評価することである。炎症性大腸炎には免疫系が関わると考えられていることから、本研究では、重大疾患時に治療投与した場合の、このＩＢＤの免疫介在モデルにおけるＣＧ５３１３５の有効性および安全性を評価した。
表４４．材料および方法
試験品の保存条件：全てのチューブは使用準備まで−７０℃で保存。
ビヒクル：グリセロール緩衝液：２０％グリセロール、２００ｍＭソルビトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭクエン酸、５０ｍＭ ＫＣｌ。
ビヒクルの保存条件：全てのチューブは使用準備まで−７０℃で保存。
表４５．試験品の投与
ｂ疾患コントロール：治療投与レジメンに従って、１日１回、ビヒクルをｉｐ投与した。
表４７．研究スケジュール
ｂＣＧ５３１３５−０５またはビヒクルを、スケジュール終了前日まで毎日投与した。
実験手順
マウスを細菌コロニーを移植する前２日間順応させ、この時期オートクレーブにかけた餌と水道水を自由にとらせた。マウスを、移動日から２日間ＣＧ５３１３５大腸菌精製物または緩衝液で処理し、それから口腔および直腸を可溶化した便材料で拭って特定の病原菌を含まない細菌を移植した。動物は、研究を開始する前に調べて、健康かつ適正であるか確認した。疾患または問題点が見出された動物は研究に割り付けなかった。
マウスを細菌コロニーを移植する前２日間順応させ、この時期オートクレーブにかけた餌と水道水を自由にとらせた。マウスを、移動日から２日間ＣＧ５３１３５大腸菌精製物または緩衝液で処理し、それから口腔および直腸を可溶化した便材料で拭って特定の病原菌を含まない細菌を移植した。動物は、研究を開始する前に調べて、健康かつ適正であるか確認した。疾患または問題点が見出された動物は研究に割り付けなかった。
本研究は、動物の入手、ならびに剖検時にＴ細胞刺激および結腸片培養のために細胞および組織を集めることに手間がかかることから、２回、それぞれ約２０匹の動物に分けて実施された。２回の研究では、マウスを全ての投与群に等しく割り付けた（例えば処理群当たり、雄雌各２匹）。開始時に入手できた動物の数が、雄雌同数に分けられない場合は、可能な限り雄雌のバランスがとれるように動物を割り付けた。
臨床観察／兆候
マウスは、投与約６０分後に、毒性の重大な臨床兆候、瀕死、および死亡について毎日調べた。
マウスは、投与約６０分後に、毒性の重大な臨床兆候、瀕死、および死亡について毎日調べた。
体重：全てのマウスの体重を、試験前（無作為化のため）および第１０日まで毎日個別に測定した。終了時に計画されている動物の剖検日の体重を用いて、体重に対する臓器の割合を決定した。以下が測定対象となった臓器／組織である。
表４８．重量測定対象臓器／組織
特殊結腸評価：リスク領域（盲腸先端、横行結腸、および直腸）から、約１ｃｍ離して３区画を集め、ホルマリンに保存し、染色して炎症（ヘマトキシリン＆エオシン）、ムチン（過ヨウ素酸シッフ）、およびコラーゲン（トリクロム染色）について定量化した。３区画は全て疾患領域を代表するものでなければならない。
結腸から得た組織を集め、パラフィン包埋向けに処理して、切片を作製し、上記のように染色した。組織病理学は、盲腸、横行結腸、および直腸の組織サンプルについてブラインド形式で行われ、次のような０〜４の炎症スコアを付けた：０＝炎症なし；１＝単球浸潤増加を伴う軽度の炎症、軽度の陰窩過形成；２＝浸潤単球の増加を伴うより活発な炎症、軽度の杯細胞の減少、および軽度の陰窩過形成；３＝陰窩過形成、杯細胞減少、および顕著な単球浸潤を伴う活発な炎症；ならびに４＝広範囲の好中球浸潤、潰瘍、陰窩膿瘍、および顕著な粘膜過形成を特徴とする極めて活動的な炎症。
肉眼検査および組織病理の対象となった臓器／組織は次の通りである。
表４９．組織病理学評価対象臓器／組織＊
細胞および細胞培養の準備：基部、中央部、および遠位結腸の断片からプールした、残りの結腸断片から結腸片培養物を樹立した。結腸片にリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）をフラッシュして糞便を除去し、縦方向に切開して、０．５〜１．０ｃｍの小片に切り分け、ＰＢＳの中で激しく攪拌した。次に約５０〜１００ｍｇの組織を、２４ウエル組織培養プレートのウエルに二重に分配し、抗生物質および抗菌剤を含む完全培地１ｍＬの中で培養した（Ｖｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ、２００１、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ １２０（４）：９００−９１３）。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、培養上清を小分けして集め、サイトカインおよび、おそらくは免疫グロブリン測定に備えて−７０℃で凍結した。上清中のＩｇＧ２ａおよびＩＬ−１２を、ＥＬＩＳＡで測定した。
腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）を機械的に分散させ、洗浄、数を測定して盲腸細菌溶解物に用い−Ｖｅｌｔｋａｍｐら、２００１、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ １２０（４）：９００〜９１３が記載したようにインターフェロンガンマ測定を刺激した。簡単に説明すると、ＣＤ４＋Ｔリンパ細胞を、ネガティブＭＡＣＳ選択にかけて単離し、抗原パルス処理した野生型マウス脾臓由来の抗原提示細胞と、Ｔ細胞除去後にインキュベーションした。あるいは、未画分のＭＬＮ細胞を抗原とインキュベーションした。
サイトカインアッセイ：ＩＬ−１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＩＦＮ−αおよびＴＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、ＥＬＩＳＡを用いてＭＮＬ細胞および脾臓培養上清について測定した。さらには、ＩＬ−１２およびＰＧＥ２（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて、結腸培養物の上清について測定した。これらサイトカインおよびＰＧＥ２の濃度は、組換えサイトカインを用いて作製した標準曲線と比較して、二重の培養上清について測定した。
結果
体重および組織病理−予防：予防群の体重変化を調べた。図６０（Ａ）は、ＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）にＦＧＦ−２０を作用させた時の重量変化を示している。図６０（Ａ）はまた、マウスに各種濃度のＦＧＦ−２０（０．２、１．５ｍｇ／ｋｇ）を作用させた時の結腸の組織病理も示している。結果は、ＦＧＦ−２０の投与がビヒクルコントロールに比べて保護作用を有していることを示している。図６０（Ｂ）はさらに、ＦＧＦ−２０の投与について、総盲腸組織学スコアが、ビヒクルと比べて用量依存的に低下していることを明らかにしている（１２．２±２．３対２．５±０．６；ｐ＜０．００１）。
体重および組織病理−予防：予防群の体重変化を調べた。図６０（Ａ）は、ＩＬ−１０ノックアウト（ＫＯ）にＦＧＦ−２０を作用させた時の重量変化を示している。図６０（Ａ）はまた、マウスに各種濃度のＦＧＦ−２０（０．２、１．５ｍｇ／ｋｇ）を作用させた時の結腸の組織病理も示している。結果は、ＦＧＦ−２０の投与がビヒクルコントロールに比べて保護作用を有していることを示している。図６０（Ｂ）はさらに、ＦＧＦ−２０の投与について、総盲腸組織学スコアが、ビヒクルと比べて用量依存的に低下していることを明らかにしている（１２．２±２．３対２．５±０．６；ｐ＜０．００１）。
サイトカイン産生−予防：サイトカイン産生はＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。図６１（Ａ）（ＩＬ−１２）、６１（Ｂ）（ＩＦＮγ）および６１（Ｃ）（ＰＧＥ２）は、ＦＧＦ−２０が、上記のＩＬ−１０ ＫＯマウスから調製したＭＬＮ、結腸片培養物、脾臓細胞培養物でのサイトカイン産生を変更することを示している。図６２も、総ＭＬＮ数（３２±３．４対２３±２．５；ｐ＜０．０５）、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞（３．２±０．３対１．６７±０．１；ｐ＜０．０５）のＦＡＣＳ分析も示す。
体重および組織病理−治療：治療群の研究プロトコールは、第１日にＳＰＦ細菌を移植され完全無菌ＩＬ−１０−／−マウスに生じた盲腸炎を治療することで構成されている。治療は、第１０日にビヒクルまたはＦＧＦ−２０（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与することで開始し、第１７日に剖検を行った。
図６３は、治療研究での重量変化を示しており、ここではＦＧＦ−２０（５ｍｇ／ｋｇ）がＩＬ−１０ ＫＯマウスに投与された。ＦＧＦ−２０の保護作用を証明している、盲腸および直腸の組織学を図６４および６８５にそれぞれ示す。盲腸の組織学スコアは、ＦＧＦ−２０がビヒクルコントロールに比べて低いことが分かる（１３．１±１．８対５．９±１．４；ｐ＜０．００６、図６６）。
ＥＬＩＳＡでアッセイした場合の治療群におけるサイトカイン産生は、ＦＧＦ−２０投与は、ＩＬ−１０ ＫＯマウスのＧｕｔ培養物および未分離脾臓細胞でのサイトカイン産生を変えないことを明らかにした。図６７はＭＬＮ数、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すが、これら全てがＦＧＦ−２０処理群において、ビヒクル処理に比べ低下していた。
正常マウスでの結果：ＣＯＸ−２、ＩＬ−１０、ＩＴＦ、ＴＧＦ−βの発現を、ＦＧＦ−２０（５ｍｇ／ｋｇ）注射後７日間について正常な野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ６マウスで分析した。ＲＴ−ＰＣＲを結腸組織および未分離ＭＬＮについて実施し（実施例３６に記載のように）、上記遺伝子の発現について調べた。ＣＯＸ−２、ＩＬ−１０、ＩＴＦ、およびＴＧＦ−βは、ＦＧＦ−２０投与によって、ＷＴマウスの結腸組織ではアップレギュレーションされた。未分離のＭＬＮでは、ＩＬ−１０の発現が、ビヒクルに比べアップレギュレーションされることが見出された。
６．４２．実施例４２：ＤＳＳ誘導潰瘍性大腸炎の慢性２週マウスモデルにおけるＣＧ５３１３５の作用（Ｎ−４０４）
７日間硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）に曝された雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは結腸に炎症および腺消失を発症した。この処理によって生じた肉眼的および組織病理的変化は、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）の１つであるヒトの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に起こる変化に似ていた（「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」編集ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ ＲＰおよびＳｔｅｎｓｏｎ ＷＦ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）の中のＡｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｒｏｓｉｏｎ；Ｏｋａｙａｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６９４〜７０２（１９９０）；ならびにＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ，、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８〜２４９（１９９３）を参照）。ヒトＩＢＤの治療に有効である化合物はこのモデルで活性を有しており、潜在的な新薬の研究に用いられている（Ａｘｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．１２：９２５〜９３４（１９９８）；Ｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓ Ｓｃｉ．４４：４３６〜４４４（１９９９）；Ｍｉｃｅｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９０：４６４〜４７１（１９９９）；およびＪｅｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３（４）：１１５１〜６２（２００２）を参照）。しかしながら、ＤＳＳへの曝露が持続する７日バージョンのモデルは、粘膜炎症および損傷の急性期に対する薬物の作用を評価する場合にのみ有用である。致死性の潜在性が低い、より慢性の潰瘍性大腸炎のモデルを開発して、ＣＧ５３１３５−０５について、粘膜修復能を試験した。本研究の目的は、３％（ＤＳＳ）を５日間、および１％ＤＳＳを９日間投与して誘発した潰瘍性大腸炎の２週マウス慢性モデルにおけるＣＧ５３１３５−０５の潜在的治療活性を評価することである。
７日間硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）に曝された雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは結腸に炎症および腺消失を発症した。この処理によって生じた肉眼的および組織病理的変化は、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）の１つであるヒトの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に起こる変化に似ていた（「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」編集ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ ＲＰおよびＳｔｅｎｓｏｎ ＷＦ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）の中のＡｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｒｏｓｉｏｎ；Ｏｋａｙａｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６９４〜７０２（１９９０）；ならびにＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ，、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８〜２４９（１９９３）を参照）。ヒトＩＢＤの治療に有効である化合物はこのモデルで活性を有しており、潜在的な新薬の研究に用いられている（Ａｘｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．１２：９２５〜９３４（１９９８）；Ｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓ Ｓｃｉ．４４：４３６〜４４４（１９９９）；Ｍｉｃｅｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９０：４６４〜４７１（１９９９）；およびＪｅｆｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３（４）：１１５１〜６２（２００２）を参照）。しかしながら、ＤＳＳへの曝露が持続する７日バージョンのモデルは、粘膜炎症および損傷の急性期に対する薬物の作用を評価する場合にのみ有用である。致死性の潜在性が低い、より慢性の潰瘍性大腸炎のモデルを開発して、ＣＧ５３１３５−０５について、粘膜修復能を試験した。本研究の目的は、３％（ＤＳＳ）を５日間、および１％ＤＳＳを９日間投与して誘発した潰瘍性大腸炎の２週マウス慢性モデルにおけるＣＧ５３１３５−０５の潜在的治療活性を評価することである。
材料および方法：
大腸炎は、第１〜５研究日に飲料水中の３％ＤＳＳに曝露させて雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに誘発し、第６〜１５研究日に飲料水中の１％ＤＳＳに曝露し続けてこれを維持した（表５０）。マウスは第１〜５試験日の間飲料水中の３％ＤＳＳに、第６〜１５試験日の間１％ＤＳＳに曝露させ、また疾患成立後第６〜１４日にビヒクルまたは０．３３、１．６７、および３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５を同時に腹腔内（ＩＰ）処理した。マウスの重量を毎日測定した。第１５日に動物を頸椎脱臼により殺し、結腸の長さを測定して、結腸の内容物を記録した。組織は１０％中性緩衝化ホルマリンの中に集め、組織病理学向けに通常に処理した。
大腸炎は、第１〜５研究日に飲料水中の３％ＤＳＳに曝露させて雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに誘発し、第６〜１５研究日に飲料水中の１％ＤＳＳに曝露し続けてこれを維持した（表５０）。マウスは第１〜５試験日の間飲料水中の３％ＤＳＳに、第６〜１５試験日の間１％ＤＳＳに曝露させ、また疾患成立後第６〜１４日にビヒクルまたは０．３３、１．６７、および３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５を同時に腹腔内（ＩＰ）処理した。マウスの重量を毎日測定した。第１５日に動物を頸椎脱臼により殺し、結腸の長さを測定して、結腸の内容物を記録した。組織は１０％中性緩衝化ホルマリンの中に集め、組織病理学向けに通常に処理した。
表５０．研究計画
臨床パラメータおよび肉眼的病理学：研究期間を通し生存した動物だけを、体重変化、最終結腸長、および結腸内容物のスコアの分析に加えた。剖検時、結腸の長さを測定し、便の健全性の変化を示す証拠について評価した。剖検時に、次の判定基準に従って結腸の内容物をスコア化した：０＝正常（堅く、しっかりした形の糞便）；１＝半固体の糞便；２＝半固体〜液状の糞便；および３＝血液の明瞭な証拠を示す半固体の糞便、血便、または内容物なし。
組織病理学：剖検時に結腸を集め、ほぼ等しい断片に２分割し、基部から先端方向に、このモデルに誘導された局所変化を評価した。先端部は方向を維持するためにマーク付けされた。これらの結腸断片を集め、１０％中性緩衝化ホルマリンの中に保存し、組織病理用に通常に処理した。組織学向けに処理している間、基部および先端部の結腸断片をそれぞれトリミングし、４つの等間隔の断片を得、それぞれからヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドを調製した。基部および先端部の組織両方について検査したが、それはこのモデルでは、それらの組織の疾患重篤度が多様であるためである（遠位結腸の方が重篤度が高く、かつ症状の変動が小さい場合が多い）。
各結腸区画について、粘膜筋板から外筋層の内側境界線までの距離（ｍｍ）を測り、粘膜下浮腫を定量化した。炎症（泡沫マクロファージ、リンパ細胞、およびＰＭＮ浸潤）重篤度は、次の順位に従ってスコア化した：正常＝０；極微＝１；軽度＝２；中程度＝３；顕著＝４；および重篤＝５。
上皮消失／損傷を反映するパラメータを、問題となる部分の面積のパーセントでスコア化する方法を用い個別にスコア化した。上記パーセントスケールを用いてスコア化されたパラメータとしては、結腸腺消失および結腸びらんが挙げられる。
０＝なし
１＝患部粘膜の１〜１０％
２＝患部粘膜の１１〜２５％
３＝患部粘膜の２６〜５０％
４＝患部粘膜の５１〜７５％
５＝患部粘膜の７６〜１００％。
１＝患部粘膜の１〜１０％
２＝患部粘膜の１１〜２５％
３＝患部粘膜の２６〜５０％
４＝患部粘膜の５１〜７５％
５＝患部粘膜の７６〜１００％。
粘膜上皮の過形成（好塩基球、有糸分裂像、基底膜上の多層化、杯細胞欠如）について、次の判定基準に基づいて０〜５にスコア化した
０＝正常
１＝微小−一般的に炎症変化に隣接した小さな病巣
２＝軽度−患部粘膜の１１〜２５％
３＝中度−患部粘膜の２６〜５０％
４＝顕著−患部粘膜の５１〜１００％
５＝重篤−患部粘膜の５１〜１００％であることに加え、腺腔内に乳頭増殖。
０＝正常
１＝微小−一般的に炎症変化に隣接した小さな病巣
２＝軽度−患部粘膜の１１〜２５％
３＝中度−患部粘膜の２６〜５０％
４＝顕著−患部粘膜の５１〜１００％
５＝重篤−患部粘膜の５１〜１００％であることに加え、腺腔内に乳頭増殖。
腺の基部、および最も粘膜が厚い代表的な区画の非接触域に接眼マイクロメータを置いて、部分粘膜の厚さ（増殖性変化または浮腫性の炎症による粘膜肥厚の指標）を測定した。
基部組織および先端結腸のスコアを平均して、評価対象の各パラメータについて結腸全体のスコアを決定した。３つのスコア化されたパラメータ（即ち、炎症、腺消失、および上皮表面のびらん）をまとめて、結腸の基部または先端部区画の全体的な組織病理スコアの合計を得て、次に基部および先端部の全スコアを平均して結腸全体を対象とした全組織病理スコアを得た。これらの合計は、結腸の先端部、基部、または全体の全体的な損傷を示し、最大の重篤度スコアは１５となる。
それ以外の組織（ほお、舌、食道、中結腸、および直腸）を集め、２つの等しい区画に分けた。１つの区画は液体窒素の中で急速凍結し、もう１つは、パラフィン包埋およびＫｉ６７抗体を用いた免疫組織染色のために１０％の中性緩衝化ホルマリンに入れた。ホルマリン保存した組織を約０．５ｃｍの区画（１区画／組織）にトリミングし、一連の濃度勾配のアルコールおよび清掃剤を通して処理し、浸透後にパラフィンに包埋して切片を作製した。次にスライドを脱水し、１：７０に希釈されたマウスＫｉ６７抗体（Ｄａｋｏ）、続いてＤＡＢペルオキシダーゼをインジケータとするストレプトアビジン／ＨＲＰ検出システムで染色し、ギルのヘマトキシリンで二重染色した。スライドをジアミノベンザジン（ＤＡＢ）に４分間曝して、バックグランドの非特異的染色が最小の、最適の特異的染色を得た。
統計学：処理群間の体重変化の差は、球面度に関するＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅ−Ｇｅｉｓｓｅｒ補正を使った反復測定ＡＮＯＶＡにより分析し、続いてペアワイズ反復測定分析を行い、変動の源を特定した。これらペアワイズ測定は、各日および正常コントロールの間で行われた。病理学（結腸の長さ、浮腫）の定量項目は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用い、その後線形対比して分析した。病理学（組織学スコア）の定性項目は次のようにして分析した：病理学的評価を、結腸基部から先端部に沿った複数の点について実施した。これら反復評価から平均病理学スコアおよび各個体の最高病理学スコアを得て、疑似反復を補正した。平均および最高スコアはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定にかけ、続いて各日および正常コントロール動物間のＤｕｎｎの多重比較検定を行って分析した。全てのその他の場合では、多重比較検定は、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ補正を用いて、比較対象数について調整を行った。病理学スコアの場合、平均および最大値を分析することによって、比較を効率的に倍加した。
結果：
６０匹のマウスの内５９匹が研究期間生存し、体重減少、最終的な結腸の長さ、および結腸内容物の分析に加えられた。体重増加の低下は全ての群に見られ、最も重篤な作用は第９日に起こり、第１０日にＤＳＳが誘発した体重減少の用量依存的阻害傾向が観察され、０．３３、１．６７、または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５のＩＰ注射を受けた群ではそれぞれ、１９、３５、および６７％低下した。肉眼による病理学評価からは、結腸長の短縮および結腸内容物スコアの増加がビヒクル処理疾患コントロール群で最大であったことが示された。結腸長の用量反応性の増加が全てのＣＧ５３１３５−０５ＩＰ処理群に見られ、最高の効果（２９％阻害、統計有意）は３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５が投与されたマウスに生じた。結腸スコアもまた、１．６７または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）ＣＧ５３１３５−０５で処理されたマウスにおいて有意に改善した（２１〜２９％）。
６０匹のマウスの内５９匹が研究期間生存し、体重減少、最終的な結腸の長さ、および結腸内容物の分析に加えられた。体重増加の低下は全ての群に見られ、最も重篤な作用は第９日に起こり、第１０日にＤＳＳが誘発した体重減少の用量依存的阻害傾向が観察され、０．３３、１．６７、または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５のＩＰ注射を受けた群ではそれぞれ、１９、３５、および６７％低下した。肉眼による病理学評価からは、結腸長の短縮および結腸内容物スコアの増加がビヒクル処理疾患コントロール群で最大であったことが示された。結腸長の用量反応性の増加が全てのＣＧ５３１３５−０５ＩＰ処理群に見られ、最高の効果（２９％阻害、統計有意）は３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５が投与されたマウスに生じた。結腸スコアもまた、１．６７または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）ＣＧ５３１３５−０５で処理されたマウスにおいて有意に改善した（２１〜２９％）。
疾患ビヒクル−処理コントロールマウスは全て、微小〜重篤までの炎症および腺消失を伴う大腸炎病変を有した。びらんおよび腺過形成は、１５匹のマウスのうちの１４匹で顕著であり、これらの変化は遠位結腸で最高であった。浮腫は散在性に見られたが、主に遠位結腸に見られた。遠位結腸の粘膜の厚みは、正常コントロールと比較した場合に、炎症および過形成の結果として疾患コントロールで約１３０％増加した。これに対し、基部、先端部、および全体の結腸炎症、ならびに腺消失、さらには合計した全結腸組織病理学スコアについても用量反応的な阻害が見られた。より更には、３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５が投与されたマウスは、炎症（３５％）および全炎症（３４％）、先端部（３８％）および全体（３７％）の腺消失、ならびに先端部（３８％）および全体（３７％）の合計組織病理学スコアについて有意な改善を示した。中および高用量群では、基部、先端部および全体の結腸びらんについても、ＣＧ５３１３５−０５の保護作用（４６〜６２％阻害、有意ではない）が見られた。粘膜厚の変化および過形成スコアの阻害についても有益作用（用量反応性、有意ではない）が見られ、３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）処理マウスでは全粘膜厚は３９％阻害され、過形成スコアは３１％改善した。
結論：
まとめると、ＣＧ５３１３５−０５ＩＰ、１日１回、１．６７または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）処理は、処理を疾患確立後に開始した場合に、ＤＳＳ誘発大腸炎の１５日慢性モデルにおいて、肉眼的および組織病理学パラメータに対し軽度から中程度の、用量反応性の阻害作用をもたらした。結腸の長さ、平均の全腺消失、遠位結腸の平均組織学合計スコア、最大先端部および全体炎症、ならびに最大先端部および全体の腺消失は、有意な直線的用量反応を示し、ビヒクル処理コントロール群および３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）ＣＧ５３１３５−０５で処理された群の動物の間には有意差が存在した。
まとめると、ＣＧ５３１３５−０５ＩＰ、１日１回、１．６７または３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）処理は、処理を疾患確立後に開始した場合に、ＤＳＳ誘発大腸炎の１５日慢性モデルにおいて、肉眼的および組織病理学パラメータに対し軽度から中程度の、用量反応性の阻害作用をもたらした。結腸の長さ、平均の全腺消失、遠位結腸の平均組織学合計スコア、最大先端部および全体炎症、ならびに最大先端部および全体の腺消失は、有意な直線的用量反応を示し、ビヒクル処理コントロール群および３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）ＣＧ５３１３５−０５で処理された群の動物の間には有意差が存在した。
別の実験では、第６、８、１０、１２、および１４日の１日おき（ｑ２ｄ）の３．３３ｍｇ／ｋｇ（ＵＶ）のＣＧ５３１３５−０５ＩＰ投与は、雌Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける慢性ＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎の重篤度を有意に低下させた（Ｎ−４０５研究）。これらの結果は、上記の所見を確認する。
６．４３．実施例４３：卒中治療
３０匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、下表５１の研究計画に示すように処理群に割り振った。
３０匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、下表５１の研究計画に示すように処理群に割り振った。
表５１．実験計画
実験手順
中脳動脈（ＭＣＡ）手術および槽内注射：動物は、手術前７日間順応させた。セファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を手術前日および手術直後に投与した。手術時、ラットは２％ハロタンのＮ２Ｏ：Ｏ２の２：１混合ガスを用いて麻酔した。体温は３７±０．５０℃に維持した。基部右側のＭＣＡを嗅覚路のちょうど基部から下大脳静脈まで電気凝固してから離断した。槽内注射のために、動物を再度、上記のようにして麻酔し、定位フレームに入れた。ラットにはＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物またはビヒクル（４０ｍＭアセテート、２００ｍＭマンニトール（ｐＨ５．３））を大槽内に、ＭＣＡ後１日目（約２４時間）に１回、および３日目（約７２時間）に１回、経皮注射して投与した。動物には、研究計画に従って試験品（２投与群）またはビヒクル処理が行われた。
中脳動脈（ＭＣＡ）手術および槽内注射：動物は、手術前７日間順応させた。セファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を手術前日および手術直後に投与した。手術時、ラットは２％ハロタンのＮ２Ｏ：Ｏ２の２：１混合ガスを用いて麻酔した。体温は３７±０．５０℃に維持した。基部右側のＭＣＡを嗅覚路のちょうど基部から下大脳静脈まで電気凝固してから離断した。槽内注射のために、動物を再度、上記のようにして麻酔し、定位フレームに入れた。ラットにはＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物またはビヒクル（４０ｍＭアセテート、２００ｍＭマンニトール（ｐＨ５．３））を大槽内に、ＭＣＡ後１日目（約２４時間）に１回、および３日目（約７２時間）に１回、経皮注射して投与した。動物には、研究計画に従って試験品（２投与群）またはビヒクル処理が行われた。
臨床観察／兆候
動物は、注射後直ちに１時間にわたって発作（振戦およびケージを回る激しい運動によって示される）、疼痛（大きな声で鳴くことによって示される）、ならびに嗜眠の兆候について観察した。動物は死亡および瀕死についても毎日調べた。
動物は、注射後直ちに１時間にわたって発作（振戦およびケージを回る激しい運動によって示される）、疼痛（大きな声で鳴くことによって示される）、ならびに嗜眠の兆候について観察した。動物は死亡および瀕死についても毎日調べた。
体重：動物は第１、３、７、１４、および２１日に体重を測定した。
四肢置き直し試験：四肢置き直し試験を、全ての動物について、第−１日（手術前）、第１日（注射直後）、第３日、その後７日毎（第７、１４、２１日）に行った。
前肢置き直し（ｐｌａｃｉｎｇ）試験評価スコア：前肢置き直し試験は、動物が前肢を机上面に置いた状態で視覚、触覚、および固有感覚刺激に反応した時の、各前肢の感覚運動機能を測定する。前肢置き直し試験は、次の評価およびスコア化から構成されており、前肢置き直し試験の全スコアをまとめたものは、０（機能障害なし）から１０（最大機能障害）までの数値をとる：
視覚置き直し（前進、側方）：０〜４
触覚置き直し（背側、側方）：０〜４
固有感覚置き直し：０〜２
全前肢試験の総スコア：０〜１０
後肢置き直し（ｐｌａｃｉｎｇ）試験評価スコア：後肢置き直し試験は、動物が後肢を机上面に置いた状態で触覚、および固有感覚刺激に反応した時の、各後肢の感覚運動機能を測定する。後肢置き直し試験は、次の評価およびスコア化から構成されており、後肢置き直し試験の全スコアをまとめたものは、０（機能障害なし）から６（最大機能障害）までの数値をとる：
触覚置き直し（背側、側方）：０〜４
固有感覚置き直し：０〜２
全前肢試験の総スコア：０〜６
ボディスイング試験：ボディスイング試験を、全ての動物について、第−１日（手術前）、第１日（注射直後）、第３日、その後７日毎（第７、１４、２１日）に実施した。
視覚置き直し（前進、側方）：０〜４
触覚置き直し（背側、側方）：０〜４
固有感覚置き直し：０〜２
全前肢試験の総スコア：０〜１０
後肢置き直し（ｐｌａｃｉｎｇ）試験評価スコア：後肢置き直し試験は、動物が後肢を机上面に置いた状態で触覚、および固有感覚刺激に反応した時の、各後肢の感覚運動機能を測定する。後肢置き直し試験は、次の評価およびスコア化から構成されており、後肢置き直し試験の全スコアをまとめたものは、０（機能障害なし）から６（最大機能障害）までの数値をとる：
触覚置き直し（背側、側方）：０〜４
固有感覚置き直し：０〜２
全前肢試験の総スコア：０〜６
ボディスイング試験：ボディスイング試験を、全ての動物について、第−１日（手術前）、第１日（注射直後）、第３日、その後７日毎（第７、１４、２１日）に実施した。
ボディスイング試験は、動物を机表面の上約１インチに固定し、右または左側方に振ったとき、どちらか一方を好む傾向があるか調べる。３０回の振りについて調べ、右に振れたパーセンテージを基にスコアを計算する。（スコア範囲＝〜５０％右揺れ（機能障害なし）〜０％右振れ（最大機能障害））。
シリンダ試験：シリンダ試験を、全ての動物について、第−１日（手術前）、第１日（注射直後）、第３日、その後７日毎（第７、１４、２１日）に実施した。シリンダ試験は、前肢の自発的な運動活性を測定する。動物を狭いガラス製のシリンダ（１６．５ｃｍ×２５ｃｍ）に入れて、卒中手術前日およびその後毎週５分間ビデオ撮影する。次に経験を積んだ観察者一名が、ビデオテープを独立的にスコア化し、自発運動を５０回まで数える（〜５分／ラット／日）。自発運動としては、まず各前肢を上げて起立し、それからシリンダ壁に着けるかまたは側方に動かす運動、または起立後に床に着ける運動が挙げられる。
肉眼的および組織形態学：予定終了日（第３日）に動物を抱水クロラール（５００ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔した。脳を肉眼で調べ取り出し、ホルマリンで後固定し、脱水してパラフィンに包埋した。冠状断片（５ｍｍ）をスライドガラス上に載せたミクロトムに切り出し、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。７枚のスライスそれぞれの脳梗塞の面積を（ブレグマに対し＋４．７、＋２．７、＋０．７、−１．３、−３．３、−５．３、および−７．３ｍｍの位置）、処理中の脳の萎縮留を補正する間接的方法（無傷の反対半球の面積−梗塞を起こした側の半球の面積）を用いたコンピュータインターフェイス画像システムを利用して決定した。次に梗塞容積を無傷の反対側半球の容積のパーセンテージとして表した。皮質および線条の梗塞容積についても、同じ方法を用いて別々に決定した。Ｈ＆Ｅ染色した切片を、出血、膿瘍、または腫瘍形成のような組織学的変化について調べた。
統計分析：全ての槽内注射、行動試験、およびその後の組織学的分析は、各動物に割り当てられた処理について知らされていない研究者が実施した。次にデータを平均値＋／−ＳＥＭで表し、一元または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析し、続いて適切なペアワイズの事後検定を行い多重比較向けに補正を行った。
結果
前肢置き直し試験：ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に、四肢置き直し試験を用いて動物を調べ、視覚、触覚、および固有感覚刺激に対する反応での、前肢の感覚運動機能を評価した（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ，Ｔ．，Ｇｏｔｔｓ，Ｅ．，Ｃｏｃｋｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．＆ Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、８１７９〜８１８４；Ｄｅ Ｒｙｃｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．，Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ，Ｂ．＆ Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５７３、４４〜６０）。視覚的置き直し（スコア０〜４）、触覚置き直し（０〜４）、および固有感覚置き直し（スコア０〜２）を合計して、最高障害が１２となる０〜１２の潜在的総スコア範囲を生成した（図６８（Ａ））。
前肢置き直し試験：ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に、四肢置き直し試験を用いて動物を調べ、視覚、触覚、および固有感覚刺激に対する反応での、前肢の感覚運動機能を評価した（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ，Ｔ．，Ｇｏｔｔｓ，Ｅ．，Ｃｏｃｋｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．＆ Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、８１７９〜８１８４；Ｄｅ Ｒｙｃｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．，Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ，Ｂ．＆ Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５７３、４４〜６０）。視覚的置き直し（スコア０〜４）、触覚置き直し（０〜４）、および固有感覚置き直し（スコア０〜２）を合計して、最高障害が１２となる０〜１２の潜在的総スコア範囲を生成した（図６８（Ａ））。
後肢置き直し試験：ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に、四肢置き直し試験を用いて動物を調べ、触覚および固有感覚刺激に対する反応での、後肢の感覚運動機能を評価した（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ，Ｔ．，Ｇｏｔｔｓ，Ｅ．，Ｃｏｃｋｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．＆ Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、８１７９〜８１８４；Ｄｅ Ｒｙｃｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．，Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ，Ｂ．＆ Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５７３、４４〜６０）。触覚置き直し（０〜４）および固有感覚置き直し（スコア０〜２）を合計して、最高障害が６となる０〜６の潜在的総スコア範囲を生成した（図６８（Ｂ））。
ボディスイング試験：ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に、ボディスイング試験を用いて動物を調べ、動物を机表面の上約１インチに固定し、右または左側方に振ったとき、どちらか一方を好むか調べた。（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ，Ｔ．，Ｇｏｔｔｓ，Ｅ．，Ｃｏｃｋｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．＆ Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、８１７９〜８１８４；Ｄｅ Ｒｙｃｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．，Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ，Ｂ．＆ Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５７３、４４〜６０） ３０回振って測定し、右に振られたパーセンテージを基にスコアを計算した（図６８（Ｃ）。
シリンダ試験：ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に、シリンダ試験で動物を調べ、前肢の自発的運動活性を評価した。（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ，Ｔ．，Ｇｏｔｔｓ，Ｅ．，Ｃｏｃｋｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．＆ Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｐ．（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、８１７９〜８１８４；Ｄｅ Ｒｙｃｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ，Ｊ．，Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ，Ｂ．＆ Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｇ．（１９９２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５７３、４４〜６０）簡単に説明すると、動物を狭いガラス製のシリンダ（１６．５ｃｍ×２５ｃｍ）に入れて、卒中手術前日およびその後毎週５分間ビデオ撮影する。次に経験を積んだ観察者一名が、ビデオテープを独立的にスコア化し、自発運動を５０回まで数える（〜５分／ラット／日）。自発運動としては、まず各前肢を上げて起立し、それからシリンダ壁に着けるかまたは側方に動かす運動、または起立後に床に着ける運動が挙げられる（図６８（Ｄ））。
体重：動物の体重を、ＭＣＡ閉鎖を基点とする第−１、１、３、７、１４、および２１日に測定し、結果はビヒクルとＣＧ５３１３５−０５処理の間に有意差は存在しないことを示した（図６８（Ｅ））。
結論
ＭＣＡ閉塞後のＣＧ５３１３５投与は、低容量および高用量共に、反対側性の（疾患）肢に関する前肢（図６８（Ａ））および後肢の置き直し試験（図６８（Ｂ））の回復を有意に増進し、かつボディスイング試験を改善すること（図６８（Ｃ）））を示唆した。このモデルにおいて、その他治療法がこの活性パターンを示すことは、一般的には、それぞれ脳皮質および皮質下（線条）機能の改善を反映していることが示されている（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ ＲＭ，Ｒｅｎ Ｊ，Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ ＪＢ、Ｗｕ Ｏ，Ｏｚｄａｇ ＦＭ、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ ＭＡ，Ｒｏｓｅｎ ＢＲ，Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ ＳＰ．２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（２２）：１２７６６−７１）。自発的な四肢の使用についてのシリンダ試験（図６８（Ｄ））または動物の体重（図６８（Ｅ））に明瞭な差は見られなかった。
ＭＣＡ閉塞後のＣＧ５３１３５投与は、低容量および高用量共に、反対側性の（疾患）肢に関する前肢（図６８（Ａ））および後肢の置き直し試験（図６８（Ｂ））の回復を有意に増進し、かつボディスイング試験を改善すること（図６８（Ｃ）））を示唆した。このモデルにおいて、その他治療法がこの活性パターンを示すことは、一般的には、それぞれ脳皮質および皮質下（線条）機能の改善を反映していることが示されている（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ ＲＭ，Ｒｅｎ Ｊ，Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ ＪＢ、Ｗｕ Ｏ，Ｏｚｄａｇ ＦＭ、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ ＭＡ，Ｒｏｓｅｎ ＢＲ，Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ ＳＰ．２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（２２）：１２７６６−７１）。自発的な四肢の使用についてのシリンダ試験（図６８（Ｄ））または動物の体重（図６８（Ｅ））に明瞭な差は見られなかった。
それ故に、ＣＧ５３１３５投与は、虚血性発作、出血性発作、外傷、脊椎損傷、重金属または毒物中毒、および神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病のような）を含む病的状態の治療に有用であろう。
６．４４．実施例４４：マトリックスメタロプロテイナーゼ産生アッセイ
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）は骨および軟骨中の細胞外マトリックスを分解に関係する酵素のファミリーである。これらの酵素は、組織の分化およびリモデリング時の正常発生中に機能する。骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ関節炎（ＲＡ）のような関節疾患では、これらの酵素の発現上昇が不可逆的なマトリックスの分解に関与している。それ故に、ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５の作用についてアッセイした。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）は骨および軟骨中の細胞外マトリックスを分解に関係する酵素のファミリーである。これらの酵素は、組織の分化およびリモデリング時の正常発生中に機能する。骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ関節炎（ＲＡ）のような関節疾患では、これらの酵素の発現上昇が不可逆的なマトリックスの分解に関与している。それ故に、ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５の作用についてアッセイした。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）産生に対するＣＧ５３１３５の活性は、ＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９４）を用いてアッセイした。この細胞株はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）産生について良く確立されている軟骨細胞モデルである。ＳＷ１３５３細胞を２４ウエルプレート、ＤＭＥＭ培地−１０％ＦＢＳに１×１０５細胞／ｍｌ（１ｍｌ）で接種した。一晩インキュベーションした後、培地をＤＭＥＭ＋０．２％ラクタブルミン（Ｌａｃｔａｂｕｌｍｉｎ）血清に交換した。ＩＬ−１ベータ（０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはビヒクルコントロールが存在または存在しない状態で、ウエルにＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、最終容積０．５ｍｌで１０〜５０００ｎｇ／ｍｌを加えた。ＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファは共に強力なＭＭＰ活性刺激物質である。２４時間後、上清を集め、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰｒｏ−ＭＭＰ−１および−１３ならびにＭＭＰ活性の天然阻害剤であるＴＩＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤）を測定した。測定値はＭＴＳアッセイで得たる細胞数について標準化した。
結果
ＣＧ５３１３５は、図６９（Ａ）および図６９（Ｂ）にそれぞれ明示されているように、ＩＬ−１ベータまたはＴＮＦ−アルファのいずれかが存在する状態で、ＭＭＰ−１３の産生を有意に低下させた。ＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファは共にＭＭＰ活性の強力な刺激物質であった。ＯＡで分解される主要なコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンに対するＭＭＰ−１３の親和性は、ＭＭＰ−１のそれに比べ１０倍高かった。ＯＡおよびＲＡではＭＭＰ−１３の発現が上昇することから、ＣＧ５３１３５の添加に伴って観察されたＭＭＰ−１３の低下は、このタンパク質がＯＡおよびＲＡ治療薬として用いることができることを示している。更には、ＣＧ５３１３５はＭＭＰ活性の天然の阻害剤であるＴＩＭＰ−１の産生をアップレギュレーションした（図６９（Ｃ））。ＣＧ５３１３５によるＴＩＭＰ−１産生のこの増強は、ＯＡおよびＲＡに観察されるＭＭＰ−１および−１３によるマトリックス分解を減らすのに有益である。これに加えて、ＣＧ５３１３５はＭＭＰ−３産生に構成的またはＩＬ−１誘導後に影響することはない。同様にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、ＳＷ１３５３細胞のＭＭＰ−１の基礎発現上昇も示した。
ＣＧ５３１３５は、図６９（Ａ）および図６９（Ｂ）にそれぞれ明示されているように、ＩＬ−１ベータまたはＴＮＦ−アルファのいずれかが存在する状態で、ＭＭＰ−１３の産生を有意に低下させた。ＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファは共にＭＭＰ活性の強力な刺激物質であった。ＯＡで分解される主要なコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンに対するＭＭＰ−１３の親和性は、ＭＭＰ−１のそれに比べ１０倍高かった。ＯＡおよびＲＡではＭＭＰ−１３の発現が上昇することから、ＣＧ５３１３５の添加に伴って観察されたＭＭＰ−１３の低下は、このタンパク質がＯＡおよびＲＡ治療薬として用いることができることを示している。更には、ＣＧ５３１３５はＭＭＰ活性の天然の阻害剤であるＴＩＭＰ−１の産生をアップレギュレーションした（図６９（Ｃ））。ＣＧ５３１３５によるＴＩＭＰ−１産生のこの増強は、ＯＡおよびＲＡに観察されるＭＭＰ−１および−１３によるマトリックス分解を減らすのに有益である。これに加えて、ＣＧ５３１３５はＭＭＰ−３産生に構成的またはＩＬ−１誘導後に影響することはない。同様にＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物は、ＳＷ１３５３細胞のＭＭＰ−１の基礎発現上昇も示した。
６．４５．実施例４５：正常ラットへのＣＧ５３１４５の作用：半月板断裂に対する概念検証
正常ラットに対するＣＧ５３１３５の作用を概念検証として研究し、疾患モデル（例えばラットの骨関節炎の半月板断裂モデル）を用いて更に研究を行った。ＣＧ５３１３５の滑膜および軟骨に対する作用を、タンパク質を正常の雄のＬｅｗｉｓラットに注射して評価した。
正常ラットに対するＣＧ５３１３５の作用を概念検証として研究し、疾患モデル（例えばラットの骨関節炎の半月板断裂モデル）を用いて更に研究を行った。ＣＧ５３１３５の滑膜および軟骨に対する作用を、タンパク質を正常の雄のＬｅｗｉｓラットに注射して評価した。
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の正常ラットへの関節内注射の作用
ラットに、ビヒクル溶液（８ｍＭアセテート、４０ｍＭアルギニン、および０．６％グリセロール（ｐＨ５．３）の約１％のヒアルロン酸溶液）、１０μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物、または１００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、２週間、週３回、関節内に注射した。
ラットに、ビヒクル溶液（８ｍＭアセテート、４０ｍＭアルギニン、および０．６％グリセロール（ｐＨ５．３）の約１％のヒアルロン酸溶液）、１０μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物、または１００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、２週間、週３回、関節内に注射した。
研究設計：第０日に体重が２９３〜３２５グラムの雄ＬｅｗｉｓラットはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）より得て、８日間順応させた。ラットを各群３匹の動物からなる３処理群に分けた：２つの群にはＣＧ５３１３５を投与し、１つの群にはビヒクルコントロールだけを投与した。ラットをイソフランで麻酔し、膝蓋腱を通して両膝の十字付着域に注射した。ＣＧ５３１３５は、０．１ｍｇ／ｍｌ（０．０１ｍｇ／関節）または１．０ｍｇ／ｍｌ（０．１ｍｇ／関節）の用量で注射された。コントロールには、上記のビヒクル溶液が注射された。注射は、２週間、月曜日、水曜日、および金曜日に行われた。第１５日に、動物に増殖中の細胞をパルスラベリングするために動物にＢＲＤＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）注射して、殺した。
病理マーカーの観察および分析
肉眼観察：ラットを異常な腫脹、または歩行の変化について毎日観察し、体重を毎週測定した。
肉眼観察：ラットを異常な腫脹、または歩行の変化について毎日観察し、体重を毎週測定した。
組織病理学：保存し脱灰した（５％ギ酸）膝を、ほぼ等しい縦方向（踝）または正面（膝）の２つの半体にトリミングし、アルコールの濃度勾配および清浄剤に通し、浸透してパラフィンに包埋し、切片を作製してトルイジンブルー（膝）で染色した。右膝の複数の区画（３レベル）について、下記の関心対象パラメータに注目しながら顕微鏡で分析した。各パラメータに、正常、微小、軽度、中程度、顕著または重篤の等級を付けた。軟骨の評価は、タンパク質の反復注射によって生じる変化のタイプから、骨関節炎モデルで一般的に用いられているスコア化の基準ではなく、記述的パラメータを用いて行った。動物を殺す前に、動物にはＢＲＤＵを注射したが、増殖の変化はトルイジンブルー染色切片に容易に観察された。
結果
表５２：顕微鏡でモニタリングしたパラメータ
表５２：顕微鏡でモニタリングしたパラメータ
形態学的病理：ビヒクルを注射したラットは、微小から軽度の滑膜過形成、炎症、および線維増殖を示したが、線維増殖滑膜内へのマトリックスの蓄積は全くないか微小であった。関節軟骨にプロテオグリカン消失または線維性萎縮は見られなかった。十字靱帯が付着し、かつ関節内注射を行う関節の中央域については、線維形成および軟骨／骨損傷は認められないか、または微々たるものであった。境界域の軟骨形成は存在しなかった。
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を１０μｇ注射した膝では、軽度から中程度の滑膜過形成、炎症、および線維増殖が起こり、線維増殖滑膜には軽度から中程度のマトリックスが見られた。関節軟骨のプロテオグリカン消失または線維性萎縮は認められなかった。十字靱帯が付着し、かつ関節内注射を行う関節の中央域については、線維形成および軟骨／骨損傷は認められないか、または微々たるものであった。膝の１つが、境界域の微小な軟骨形成を示した。
ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物、１００μｇを注射された膝は、線維増殖滑膜への中程度蓄積を伴う中度から顕著な滑膜過形成、炎症、および軟骨形成を示した。関節軟骨のプロテオグリカンの消失または線維性萎縮は無いか、または微小であった。全ての膝に、軽度から中程度の境界域の軟骨形成が見られた。一匹の動物が、関節軟骨に関係する領域に軟骨形成を示した。
結論
これらの結果は、ＣＧ５３１３５の関節内の反復注射が滑膜の線維増殖および軟骨形成を誘導することを明示している。ビヒクル注射は軽度の炎症および線維増殖をもたらしたことから、このビヒクルがいくらかの刺激性を有していることが示唆された。タンパク質を注射された動物では、滑膜増殖反応ならびに境界域の軟骨形成について濃度反応性の上昇が起こった。注射を行った十文字付着領域は骨吸収および線維増殖の領域であり、タンパク質の濃度増加に伴って、滑膜炎症時と同様にこれらの重篤度も上がった。観察された滑膜の線維増殖および骨吸収という潜在的な有害作用は、ＦＧＦ−２０活性またはタンパク質調合時に用いた非臨床等級のヒアウロン酸内のエンドトキシンレベルのいずれかに拠るものであろう。これに加えて、関節の炎症も骨吸収および境界域の軟骨形成を誘導することから、これらの結果を解釈する際には、注射されたタンパク質に対する炎症反応が増殖反応の一因である可能性に考慮する必要がある。増殖性の変化および軟骨形成の形態学的外観は、このタンパク質（ＣＧ５３１３５）の生物活性が反応生成にとって重要であることを明瞭に示している。
これらの結果は、ＣＧ５３１３５の関節内の反復注射が滑膜の線維増殖および軟骨形成を誘導することを明示している。ビヒクル注射は軽度の炎症および線維増殖をもたらしたことから、このビヒクルがいくらかの刺激性を有していることが示唆された。タンパク質を注射された動物では、滑膜増殖反応ならびに境界域の軟骨形成について濃度反応性の上昇が起こった。注射を行った十文字付着領域は骨吸収および線維増殖の領域であり、タンパク質の濃度増加に伴って、滑膜炎症時と同様にこれらの重篤度も上がった。観察された滑膜の線維増殖および骨吸収という潜在的な有害作用は、ＦＧＦ−２０活性またはタンパク質調合時に用いた非臨床等級のヒアウロン酸内のエンドトキシンレベルのいずれかに拠るものであろう。これに加えて、関節の炎症も骨吸収および境界域の軟骨形成を誘導することから、これらの結果を解釈する際には、注射されたタンパク質に対する炎症反応が増殖反応の一因である可能性に考慮する必要がある。増殖性の変化および軟骨形成の形態学的外観は、このタンパク質（ＣＧ５３１３５）の生物活性が反応生成にとって重要であることを明瞭に示している。
ここに報告した実験の結果は、ＣＧ５３１３５の関節内への反復注射が滑膜線維増殖および軟骨形成を誘導することを示している。
６．４６．実施例４６：ラット骨関節炎の半月板断裂モデルでのＣＧ５３１３５−０５の関節内注射：予防的および治療的投与
実施例４５は、正常ラット関節内へのＣＧ５３１３５投与を利用して、組織形態学的分析により、関係細胞集団への作用を特定している。１００μｇ／関節の用量では、ＣＧ５３１３５はＴＧＦ−ベータの様なその他成長因子で見られたものに似て境界領域に有意な軟骨形成を誘導し、境界領域内の多能性幹細胞への作用が示唆された。関節の成熟軟骨領域では反応が無いことから明らかなように、成熟軟骨細胞への明瞭な作用は存在しなかった。観察された滑膜線維増殖および骨吸収の潜在的な有害作用は、ＦＧＦ−２０活性またはタンパク質調合時に用いた非臨床等級のヒアウロン酸内のエンドトキシンレベルのいずれかに拠るものであろう。
実施例４５は、正常ラット関節内へのＣＧ５３１３５投与を利用して、組織形態学的分析により、関係細胞集団への作用を特定している。１００μｇ／関節の用量では、ＣＧ５３１３５はＴＧＦ−ベータの様なその他成長因子で見られたものに似て境界領域に有意な軟骨形成を誘導し、境界領域内の多能性幹細胞への作用が示唆された。関節の成熟軟骨領域では反応が無いことから明らかなように、成熟軟骨細胞への明瞭な作用は存在しなかった。観察された滑膜線維増殖および骨吸収の潜在的な有害作用は、ＦＧＦ−２０活性またはタンパク質調合時に用いた非臨床等級のヒアウロン酸内のエンドトキシンレベルのいずれかに拠るものであろう。
以下の点を明らかにするために、骨関節炎の動物を用いて更に研究を行った：（１）抗炎症薬（骨関節炎患者に対する標準的な措置）との相乗性；（２）ＣＧ５３１３５が関節軟骨層の機能的修復または保護を誘導できるか；および（３）滑膜線維増殖および骨吸収がＣＧ５３１３５に誘導されたものか、または調合中のエンドトキシンの混入によるものか。
それ故に、本研究の１つの局面は、ラット骨関節炎の半月板断裂モデルを用いて、骨関節炎の関節損傷に対するＣＧ５３１３５関節内注射の保護および治療作用を評価することである。この比較的新しいＯＡモデルは軟骨変性および骨棘形成という形態学的な変化を示したが、これらは他の種における自然発生の疾患および手術によって誘発した疾患でも類似の変化が起こっている（Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２００１；１：３６３〜３７６、Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．Ｍ ａｎｄ Ｈｕｌｍａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１９８８；３１：５６１〜５６５）。このモデルを用いて、抗変性および再生治療の潜在的有益作用を評価することができる。
実験計画
２匹／ケージの割合で飼育した動物（１０／群）をイソフルランで麻酔し、手術に備え右膝を調整した。膝中央部の皮膚を切開し、鈍的切除によって中央両側の腱を露出してから離断した。次に小型のハサミを使って半月板中央部を折り曲げ、全幅にわたって切断し完全断裂をシミュレーションした。皮膚は縫合した。
２匹／ケージの割合で飼育した動物（１０／群）をイソフルランで麻酔し、手術に備え右膝を調整した。膝中央部の皮膚を切開し、鈍的切除によって中央両側の腱を露出してから離断した。次に小型のハサミを使って半月板中央部を折り曲げ、全幅にわたって切断し完全断裂をシミュレーションした。皮膚は縫合した。
予防的投与：右膝関節への関節内投与（ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物）を手術日に開始して２週間継続し、木曜日、土曜日、および月曜日（第０、２、４、７、９、および１１日）にラットをイソフルラン麻酔にかけて関節内注射した。非ステロイド抗炎症剤であるインドメタシンを、手術後０日から経口経路から毎日投与し（１ｍｇ／ｋｇ／日）、注射による潜在的炎症を抑えた。体重を第０、７、および１４日に記録した。手術後第１４日に動物を殺した後、組織病理評価のために両膝を集めた。研究計画を表５３に示す。
表５３．予防的投与の研究計画
ｂ２週間、毎日投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）。
治療的投与：膝関節への関節内投与（ＣＧ５３１３５大腸菌精製物）を手術後第２１日に開始して２週間継続し、金曜日、日曜日、および水曜日（第２２、２５、２７、２９、３２、および３４日）にラットをイソフルラン麻酔にかけて関節内注射した。非ステロイド抗炎症剤であるインドメタシンを、手術後０日から経口経路から毎日投与した。体重を第０、７、１４、２１、２８、および３５日に記録した。第３５日に組織病理評価のために両膝を集めた。研究計画を表５４に示す。
表５４．予防的投与の研究計画
ｂ２週間、毎日投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）。
予防的投与研究の結果：実施した観察では、このモデルの標準も加えられた。右膝の複数（３レベル）の区画を顕微鏡で分析し、次の方法に従ってスコア化した。３区画のスコア化では、軟骨変性および骨棘形成について３枚のスライドがそれぞれ３レベルを示した２つの半体が最悪の例であった。次に各スライドについて、各パラメータについてこの値を平均化して、頸骨および大腿骨については、全体的な、主観的な軟骨変性スコアを、および頸骨については骨棘のスコアを決定した。
軟骨変性は、以下の基準を用いて、深度および面積（表面積を三分割する）について、なし〜重篤（数値としては０〜５）のいずれかにスコア化した：
０＝無変化
１＝極僅かな変性、表面域を含む線維性萎縮を伴う、または伴わない軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
２＝軽度の変性、上部１／３を含む線維性萎縮を伴う、または伴わない軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
３＝中程度の変性、中域まで伸びる線維性萎縮を伴い、一般的には全軟骨厚の１／２が冒されている軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
４＝顕著な変性、中域まで伸びているが、マトリックスが完全には失われていない（石灰化線まで）軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
５＝重篤な変性、マトリックスの石灰化線までの消失。
０＝無変化
１＝極僅かな変性、表面域を含む線維性萎縮を伴う、または伴わない軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
２＝軽度の変性、上部１／３を含む線維性萎縮を伴う、または伴わない軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
３＝中程度の変性、中域まで伸びる線維性萎縮を伴い、一般的には全軟骨厚の１／２が冒されている軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
４＝顕著な変性、中域まで伸びているが、マトリックスが完全には失われていない（石灰化線まで）軟骨細胞およびプロテオグリカンの消失
５＝重篤な変性、マトリックスの石灰化線までの消失。
このスコア化の方法では、領域（外側、中央、内側の１／３）厳守について特に注意が払われ、合計スコアは頸骨変性の重篤度を包括する総計値となる。
この軟骨変性の全体的な主観的分析に加えて、同様の判定基準を用いた追加の主観的評価を行い変性の重篤度を評価したが、特に頸骨プラトーを横切る特異的な領域差について注意を払った。このＯＡモデルでは、一般的には頸骨外側１／３が最も半月板断裂損傷の影響を受けやすく、傷害は手術後３週目までに石灰化線に達することも多い。中央１／３は、通常移行域であり、重篤または顕著な変化は中程度または軽度となり、内側１／３では、軽度または微小を超える変化はほとんどない。外側１／３の重篤な傷害と、中央１／３および内側１／３の軽度の傷害に対する処理の潜在的な差を比較し決定するために、これらの領域を別々にスコア化した。領域値の合計を計算して、３領域の合計として表した。
上記主観的なスコア化に加えて、マイクロメータを用いた重篤な変性（全頸骨軟骨変性幅μｍ）に冒された頸骨プラトー範囲の測定を、骨棘、または軟骨変性近傍に骨棘が存在しない場合には境界域を起点として（外側１／３）、表面を横断し、組織学的には正常と思われた接線層および基礎をなす軟骨まで拡大した。
さらなる測定（有意な軟骨変性の幅μｍ）は、軟骨細胞およびマトリックスの消失が軟骨厚の５０％を超えて伸びている頸骨軟骨変性の領域を表している。
最後に、石灰化線までの深度に対する変化を示した領域の深度の比として表された、あるタイプの損傷（細胞／プロテオグリカン消失、メタクロマジーの変化、しかしコラーゲン性マトリックスは良く保持し、線維性萎縮はみられない損傷）のマイクロメータ深度も加え、頸骨表面上に等間隔に置いた４つの点について深度を得た。これらの測定値は、骨棘近傍のマトリックス（第一）、頸骨プラトーの１／４横断距離（第二）、骨棘プラトーの１／２横断距離（第三）、骨棘プラトーの３／４横断距離（第四）で取った。この測定は、存在する在るタイプの顕微鏡レベルの変化の最も重要な分析であった。石灰化線までの深度の測定値（分母）は頸骨プラトーを横切る軟骨の厚さの指標でもあり、従ってこれを用いて群間を比較し、肥大または過形成が発生しているか決定できる。
各区画について、区画の非接平面内の全体幅を最もよく表すと考えられる領域で頸骨成長プレートの測定を一回行った。
骨棘のスコア化および小、中、大への分類は、接眼マイクロメータを使って行った。
なし＝０ 境界域に測定可能な増殖性の反応がない
小骨棘＝１（２９９μｍまで）
中骨棘＝２（３００〜３９９μｍ）
大骨棘＝３（＞４００μｍ）。
なし＝０ 境界域に測定可能な増殖性の反応がない
小骨棘＝１（２９９μｍまで）
中骨棘＝２（３００〜３９９μｍ）
大骨棘＝３（＞４００μｍ）。
スコア（０〜３）は、全体関節スコア内に加えられた。これに加えて実際の骨棘測定値の平均±ＳＥ（３区画の平均）も決定した。
一般的に、手術中に、結果として半月板が基部方向に大腿骨に向かって曲がるような場所で両側の靱帯の離断を試みた。次に、メスの先端を頸骨ではなく大腿骨に向かって差し込み切断した。こうすれば大腿顆状軟骨が機械的に損傷されることはあっても、頸骨が損傷を受けることはほとんどなく、その結果、頸骨が軟骨保護を評価するための最適な部位となる。
大腿軟骨へ加わった物理的外傷の結果と考えられる病巣性の、小さなプロテオグリカンおよび細胞の損失域について記載はしたが、頸骨について記載した方法に従った主観的スコア化の対象となる、より大型で、より拡散した領域と一緒にスコアに加えることはしなかった。これらのより大きな領域は、非外傷性の変性とより一致した。大腿骨に医原性傷害が加わった可能性があることから、全体関節スコアは、大腿軟骨の変性スコアと一緒にした場合と除いた場合の両方で表した。
石灰化した軟骨層および軟骨下骨への損傷は、以下の基準を用いてスコア化した：
０＝無変化
１＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化線または骨髄の変化は無い
２＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化線の石灰化軟骨の微小〜軽度の断片化、骨髄の間葉性変化が全域の１／４で見られるが、一般的には傷害下の軟骨下領域に限定される。
３＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の中度〜顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、骨髄の軟骨形成域が明瞭であるが、骨端骨内への関節軟骨の虚脱はない
４＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、かつ関節軟骨が石灰化線から２５０μｍ以下の深さまで骨端骨内へ虚脱している
５＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、かつ関節軟骨が石灰化線から２５０μｍを超える深さまで骨端骨内へ虚脱している。
０＝無変化
１＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化線または骨髄の変化は無い
２＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化線の石灰化軟骨の微小〜軽度の断片化、骨髄の間葉性変化が全域の１／４で見られるが、一般的には傷害下の軟骨下領域に限定される。
３＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の中度〜顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、骨髄の軟骨形成域が明瞭であるが、骨端骨内への関節軟骨の虚脱はない
４＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、かつ関節軟骨が石灰化線から２５０μｍ以下の深さまで骨端骨内へ虚脱している
５＝石灰化線の好塩基球増加：石灰化軟骨の顕著な断片化、骨髄の間葉性変化が全域の３／４までに見られ、かつ関節軟骨が石灰化線から２５０μｍを超える深さまで骨端骨内へ虚脱している。
滑膜炎症、滑膜線維形成、境界域の軟骨形成、骨吸収、軟骨形成／既存軟骨への組み入れを伴う、または伴わない線維の過剰発達の程度についてのコメントを記述した。
統計分析：組織病理学パラメータの統計分析は、有意レベルをｐ≦０．０５とするスチューデントの両側ｔ検定を用いて、群平均を比較して行った。データの性質上、スコア化されたパラメータはノンパラメトリックＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を用いて分析し、測定値はパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて分析した。パラメトリックデータに用いた、適切な事後検定はＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定であり、ノンパラメトリックデータにはＤｕｎｎの検定を用いた。有意レベルは全てのパラメータについてｐ≦０．０５に設定した。
結果：１００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物を、インドメタシンの同時投与有り無しで関節内注射すると、中央１／３（領域１の４０〜４３％）の頸骨軟骨変性を有意に阻害（３９％）し、また３つの領域を合わせた場合の阻害は４１％であったが、有意ではなかった（図７０（Ａ））。全体軟骨変形幅は３５〜３７％と有意に減少し（図７０（Ｂ））かつ有意な変性は７０〜８９％低下したが、この阻害はタンパク質とインドメタシンで処理した群でのみ有意であった（図７０（Ｃ））。
予防的投与研究の結果：記載したデータは、中央半月板断裂を起こしたラット膝関節への１００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の関節内注射は、軟骨変性の阻害と軟骨修復刺激の両方をもたらすことを示している。幾つかの関節では、既存の、正常と思われるか、または損傷を受けた軟骨の上に増殖した新規の軟骨が見られた。この観察は、これが表面再生の可能性を証明していることから特に刺激的である。
これらの有益作用は常に拡散性の滑膜線維増殖、骨吸収、および滑膜炎症の激化を伴っていた。インドメタシンの同時処理（１ｍｇ／ｋｇ／日）は、Ｓｙｎｖｉｓｃのみ膝注射した場合の疾患プロセス、またはタンパク質を含むＳｙｎｖｉｓｃを膝に注射した場合の疾患プロセスおよびタンパク質に対し何ら作用がなければ、最小と考えられる。この既述に対する唯一の例外は、全ての群がタンパク質およびビヒクルのｐｏ処理を受けた群を除いて同様の測定値を示した骨棘測定に関するデータである。この群の測定値はより大きく、従ってより強い境界域の刺激を示唆しているが、炎症を起こした関節では珍しいことではない。
１００μｇのこのタンパク質の注射によって誘導された形態学的な変化は、ＣＧ５３１３５が軟骨修復プロセスに有効である可能性を明らかにした。それは軟骨への分化を伴う線維組織の増殖を誘導する能力を有しており、重要なことは新たに増殖した組織が統合されることである。増殖プロセスは幾分無秩序であり、境界域および軟骨下骨のような領域では逆効果的である。しかしながら、齧歯類は炎症メディエイターを含む様々な刺激を受けて境界域、骨膜および骨髄が増殖する傾向が遙かに強いため、ラットに見られる過剰な逆効果的な反応はイヌや霊長類では起こらないだろう。また、抗体反応の誘導も起こる場合があることから膝に強い炎症を招くことがあるが、これは抗体反応が起こらないヒトまたはその他動物には起こらないだろう。
骨関節炎へのＣＧ５３１３５の潜在的効力の概要を描く上で有用な更なる研究としては次のものが挙げられる：（１）動物モデル、例えばＯＡのウサギまたはイヌのモデルの評価−この研究は、ヒトへの類似性がより高い軟骨および骨構造を持つ大型の関節、ならびに齧歯類で起こるような高い増殖反応を示す傾向が小さい種の評価も可能にする；ならびに（２）３〜４週間のｉａ注射の評価、おそらくそれと同時に、より積極的な全身性の炎症治療およびそれに続く新規組織リモデリングがどれほど有益なものか知ることができる回復期の評価。それ以上の増殖性の刺激を伴わない関節のリモデリングが可能であることは、より満足できる形態学的なエンドポイントを提供できるだろう。あるいは、免疫反応が消失する時点がエンドポイントとなることもあるだろう。リモデリング期のある治療サイクルが、最も満足できる修復を達成できる方法だろう。このような研究はまた、修復組織が長期間維持されるかという疑問にも答えるだろう。一般的には、線維軟骨は、このような傾向が低い。
結果：１００μｇのＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物の、インドメタシンの同時経口投与を伴う、または伴わない関節内注射は、頸骨の軟骨変性スコアを有意に抑制することはなかった（図７１（Ａ））。全体または有意な軟骨変性の幅は縮小しなかった（図７１（Ｂ）および（Ｃ））。
予防的投与研究の結果：記載したデータは、関節内投与されたＣＧ５３１３５の潜在的な軟骨増殖活性を明らかにした。しかしながら、タンパク質を注射した関節は、炎症、線維増殖、および結合組織吸収のプロセスが顕著に亢進した。
予防的投与研究と治療的投与研究との間の最も重要な違いは、投与開始時のＯＡ傷害の性質である。治療投与研究のラットは、軟骨の中央１／３の外側に重篤なマトリックス消失域を有しており、石灰化した軟骨／軟骨下骨がタンパク質に曝されていることが示唆される。それゆえに、効果的な修復には、境界域または露出した骨髄の多能性幹細胞から新規に増殖した組織でこの欠損を満たす必要がある。予防的投与研究では、有益な修復にはマトリックス変性の抑制、および境界域に由来する修復組織による変性骨格の修復促進のみが必要となる。欠損の充填は損傷骨格の修復に比べ遙かに困難であることから、有益な効果を得るには、より長い治療期間が治療モデルに必要となる可能性がある。
インドメタシン処理は、炎症性の変化の抑制には有効ではなく、骨内で起こっている吸収プロセスの抑制に対し有効作用を有していなかった。炎症および組織破壊がない、効率的な増殖および軟骨への分化を達成するために、治療的投与研究に次のような改良を加えることができるだろう：投与間隔を週１回または２回に増やし、かつ／または研究期間を延長して、この疾患プロセスがもたらした大きな軟骨の欠損を増殖組織が充填できる時間を与える。別の可能性は、イヌのような大型の種でのＣＧ５３１３５の作用を研究することであるが、これはイヌが様々な組織に反応して結合組織を増殖させること、および骨を吸収する性向が齧歯類より小さいからである。
ここに詳述した結果（予防的および治療的投与研究の両方）は、ＣＧ５３１３５が、最終的に関節交換が必要となる重篤な骨関節炎に特に有用であることを示している。このようなタイプの薬物は、正常軟骨が殆ど、または全く残っておらず、表面再生が必要な関節の中に注射されるだろう。この場合、修復は境界領域または骨髄内の多能性幹細胞から生ずるだろう。このような場所からの修復は、硝子軟骨ではなく線維案骨の産生をもたらすと思われる。しかしながら大量の軟骨は軟骨にとって好ましくない場合があり、長期間処置を繰り返して修復を支えるものであっても、軟骨表面を維持する注射モデルは許容されるだろう。同化注射剤を用いた治療では、持続的な能動的荷重負荷運動ではなく、むしろ連続的な受動的運動と組み合わせた、ある種の周期的なプロセスが必要になるだろう。
６．４７．実施例４７：ＣＧ５３１３５は血清飢餓誘導細胞死から神経性ＰＣ１２細胞を救済する
ＣＧ５３１３５の栄養（神経保護）特性を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）と比較するために、次の実験を実施した。
ＣＧ５３１３５の栄養（神経保護）特性を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）と比較するために、次の実験を実施した。
材料および方法：
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
方法：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの入ったポリリジンをコーティングした組織培養プレートの上に、ＰＣ１２細胞を低密度で接種した。２４時間培養した。ＮＧＦまたはＣＧ５３１３５を投与範囲で含むか、または成長因子を添加しない無血清培地を加えた。７２時間目に写真撮影を行い、生存し増殖している細胞を視覚化した。
結果：
ＣＧ５３１３５は用量依存的な様式で細胞死を予防した。最大栄養活性は５０ｎｇ／ｍｌで得られた。ＣＧ５３１３４５の効力はＮＧＦの効力の約２０％であったが、両成長因子の栄養作用の最大範囲は等しかった。ＥＧＦも栄養活性を示した。細胞死（アポトーシス）はＬＤＨアッセイおよび目視によって測定した。（図７２）
結論：
ＣＧ５３１３５は神経栄養物質のＮＧＦおよび成長因子のＥＧＦと同様に機能し、ＣＧ５３１３５はこれと同程度にＰＣ１２細胞を血清飢餓誘導細胞死から救済できた。このようにＣＧ５３１３５は栄養活性を有している。栄養活性は、数多く在る中枢神経系障害の治療に価値があることが認められている。特に、神経細胞を保護する能力は、アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性が関与する病気、および卒中や外傷性の脳損傷といった壊滅的な細胞死を伴う疾患にとって重要である。
ＣＧ５３１３５は用量依存的な様式で細胞死を予防した。最大栄養活性は５０ｎｇ／ｍｌで得られた。ＣＧ５３１３４５の効力はＮＧＦの効力の約２０％であったが、両成長因子の栄養作用の最大範囲は等しかった。ＥＧＦも栄養活性を示した。細胞死（アポトーシス）はＬＤＨアッセイおよび目視によって測定した。（図７２）
結論：
ＣＧ５３１３５は神経栄養物質のＮＧＦおよび成長因子のＥＧＦと同様に機能し、ＣＧ５３１３５はこれと同程度にＰＣ１２細胞を血清飢餓誘導細胞死から救済できた。このようにＣＧ５３１３５は栄養活性を有している。栄養活性は、数多く在る中枢神経系障害の治療に価値があることが認められている。特に、神経細胞を保護する能力は、アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性が関与する病気、および卒中や外傷性の脳損傷といった壊滅的な細胞死を伴う疾患にとって重要である。
６．４８．実施例４８：ＣＧ５３１３５は神経性ＰＣ１２細胞の血清除去誘導カスパーゼ活性化を阻害する
この実験は、前アポトーシスカスパーゼ酵素の活性化阻害能を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）の作用を比較するために行われた。
この実験は、前アポトーシスカスパーゼ酵素の活性化阻害能を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）の作用を比較するために行われた。
材料および方法：
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
方法：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの入ったポリリジンをコーティングした組織培養プレートの上に、ＰＣ１２細胞を低密度で接種した。２４時間培養した。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＣＧ５３１３５（１０００ｎｇ／ｍｌ）を含む、または成長因子を添加しない無血清培地を加えた。様々な時点（０、３、６、および２０時間目）で細胞溶解物を集めた。カスパーゼ２、３、８、９の活性化はＥＬＩＳＡを用いて評価した。
結果：
血清除去は誘導カスパーゼ活性を時間依存的に誘導した。ＣＧ５３１３５およびＮＧＦは共にカスパーゼ誘導を遮断した（図７３）。
血清除去は誘導カスパーゼ活性を時間依存的に誘導した。ＣＧ５３１３５およびＮＧＦは共にカスパーゼ誘導を遮断した（図７３）。
結論：
ＣＧ５３１３５は神経栄養物質のＮＧＦ同様に機能し、両タンパク質とも同程度にアポトーシス刺激によるアポトーシス促進カスパーゼ酵素の活性化を予防できた。カスパーゼは、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、および外傷性の脳損傷を含む、神経死が関係する数多くのＣＮＳ疾患に関係している。従ってＣＧ５３１３５は、これらの疾患の治療にとって有用である。
ＣＧ５３１３５は神経栄養物質のＮＧＦ同様に機能し、両タンパク質とも同程度にアポトーシス刺激によるアポトーシス促進カスパーゼ酵素の活性化を予防できた。カスパーゼは、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、および外傷性の脳損傷を含む、神経死が関係する数多くのＣＮＳ疾患に関係している。従ってＣＧ５３１３５は、これらの疾患の治療にとって有用である。
６．４９．実施例４９：ＣＧ５３１３５は神経性ＰＣ１２細胞による神経突起成長を誘導する
本実験は、ＣＧ５３１３５−０５の神経形成特性を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）の作用と比較するために実施された。
本実験は、ＣＧ５３１３５−０５の神経形成特性を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）の作用と比較するために実施された。
材料および方法：
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）。
方法：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの入ったポリリジンをコーティングした組織培養プレートの上に、ＰＣ１２細胞を低密度で接種した。２４時間培養した。１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦまたはＣＧ５３１３５を含むか、または成長因子を添加していない無血清培地を加えた。７２時間目に写真撮影を行い神経突起の生育を視覚化した。
結果：
ＣＧ５３１３５は用量依存的様式で神経突起の生育を誘導した。最大の神経生育は、１０００ｎｇ／ｍｌで達成された。両成長因子が誘導した最大神経生育は、同程度であった。ＥＧＦは神経突起の生育を誘導しなかった（図７４）。
ＣＧ５３１３５は用量依存的様式で神経突起の生育を誘導した。最大の神経生育は、１０００ｎｇ／ｍｌで達成された。両成長因子が誘導した最大神経生育は、同程度であった。ＥＧＦは神経突起の生育を誘導しなかった（図７４）。
結論：
ＣＧ５３１３５は、神経栄養物質のＮＧＦと同様に機能し、ＣＧ５３１３５は同程度に神経突起の生育を誘導できた。ＮＧＦの神経突起誘導能力は、このような神経栄養活性を持たないＥＧＦのような他の因子とＮＧＦとを区別する、この神経成長因子の重要な特徴である。従ってＣＧ５３１３５は神経栄養活性を有している。神経栄養活性は、中枢神経系の様々な障害の治療に有用であることが認められている。特に神経突起の生育を誘導する能力は、神経変性が関係するアルツハイマー病、パーキンソン病といった疾患、および卒中や外傷性の脳損傷といった病理的な構造変化または神経構造を伴う疾患にとって重要である。
ＣＧ５３１３５は、神経栄養物質のＮＧＦと同様に機能し、ＣＧ５３１３５は同程度に神経突起の生育を誘導できた。ＮＧＦの神経突起誘導能力は、このような神経栄養活性を持たないＥＧＦのような他の因子とＮＧＦとを区別する、この神経成長因子の重要な特徴である。従ってＣＧ５３１３５は神経栄養活性を有している。神経栄養活性は、中枢神経系の様々な障害の治療に有用であることが認められている。特に神経突起の生育を誘導する能力は、神経変性が関係するアルツハイマー病、パーキンソン病といった疾患、および卒中や外傷性の脳損傷といった病理的な構造変化または神経構造を伴う疾患にとって重要である。
６．５０．実施例５０：ＣＧ５３１３５は神経ＰＣ１２細胞のＭＡＰキナーゼを活性化する
本実験は、ＣＧ５３１３５のＭＡＰＫ活性化作用を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）と比較するために行った。
本実験は、ＣＧ５３１３５のＭＡＰＫ活性化作用を評価し、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）と比較するために行った。
材料および方法：
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）、ＥＧＦ、ＭＡＰＫＫ阻害剤ＰＤ９８０５９
方法：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの入ったポリリジンをコーティングした組織培養プレートの上に、ＰＣ１２細胞を低密度で接種した。２４時間培養した。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＣＧ５３１３５を含むか、または成長因子を添加していない無血清培地を加えた。これとは別に、ＣＧ５３１３５またはＮＧＦで処理する前に、ＰＤ９８０５９で前処理して培養した。処理後１０分に細胞を溶解し、抗リンＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロットを行いＭＡＰＫの活性化を評価した。また、ヒト皮質神経細胞株ＨＣＮ１Ａでの、ＣＧ５３１３５およびｂＦＧＦによるＭＡＰＫ活性化の経時変化を０、１０分、１時間、および３時間について評価した。
材料：ＰＣ１２細胞、組織培養プレート、および培地（ＤＭＥＭ＋／−１０％ＦＢＳ）、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＧ５３１３５−０５大腸菌精製物（プロセス１による）、ＥＧＦ、ＭＡＰＫＫ阻害剤ＰＤ９８０５９
方法：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの入ったポリリジンをコーティングした組織培養プレートの上に、ＰＣ１２細胞を低密度で接種した。２４時間培養した。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＣＧ５３１３５を含むか、または成長因子を添加していない無血清培地を加えた。これとは別に、ＣＧ５３１３５またはＮＧＦで処理する前に、ＰＤ９８０５９で前処理して培養した。処理後１０分に細胞を溶解し、抗リンＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロットを行いＭＡＰＫの活性化を評価した。また、ヒト皮質神経細胞株ＨＣＮ１Ａでの、ＣＧ５３１３５およびｂＦＧＦによるＭＡＰＫ活性化の経時変化を０、１０分、１時間、および３時間について評価した。
結果：
ＣＧ５３１３５はＭＡＰＫＫ依存的な様式で力強いＭＡＰＫの活性化を誘導した。ＣＧ５３１３５は、漸次的かつ持続的なＭＡＰＫ活性化の経時変化を示した。（図７５）
結論：
ＣＧ５３１３５は、細胞の生存および神経分化に関係する重要細胞内シグナル伝達分子であるＭＡＰＫの誘導に関して、神経栄養物質であるＮＧＦと同様に作用した。この栄養経路の活性化は、学習および記憶の基礎となるプロセスにも関係しており、数多くある中枢神経系障害の治療に有用であることが認められている。特に、神経細胞を保護する能力は、神経変性が関係しているアルツハイマー病、パーキンソン病といった疾患、および卒中や外傷性の脳損傷といった壊滅的な細胞死を伴う疾患にとって重要である。学習および記憶に関係する細胞内経路を刺激する能力は、アルツハイマー病および年齢に関係する記憶力の低下といった記憶機能不全が関係する障害とも関係すると思われる。
ＣＧ５３１３５はＭＡＰＫＫ依存的な様式で力強いＭＡＰＫの活性化を誘導した。ＣＧ５３１３５は、漸次的かつ持続的なＭＡＰＫ活性化の経時変化を示した。（図７５）
結論：
ＣＧ５３１３５は、細胞の生存および神経分化に関係する重要細胞内シグナル伝達分子であるＭＡＰＫの誘導に関して、神経栄養物質であるＮＧＦと同様に作用した。この栄養経路の活性化は、学習および記憶の基礎となるプロセスにも関係しており、数多くある中枢神経系障害の治療に有用であることが認められている。特に、神経細胞を保護する能力は、神経変性が関係しているアルツハイマー病、パーキンソン病といった疾患、および卒中や外傷性の脳損傷といった壊滅的な細胞死を伴う疾患にとって重要である。学習および記憶に関係する細胞内経路を刺激する能力は、アルツハイマー病および年齢に関係する記憶力の低下といった記憶機能不全が関係する障害とも関係すると思われる。
７．均等物
当業者は、本明細書に記載されている発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識するか、または過度の実験を行うことなしに確かめることができる。
当業者は、本明細書に記載されている発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識するか、または過度の実験を行うことなしに確かめることができる。
Claims (73)
- 約０．１〜１Ｍの塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、約０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１〜０．１％重量／容積（「ｗ／ｖ」）のポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、および単離された線維芽細胞成長因子を含む、調合物。
- 約０．０１〜１Ｍの塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖、約０．０１〜０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１〜０．１％重量／容積（「ｗ／ｖ」）のポリソルベート８０もしくはポリソルベート２０、ならびに
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）（ａ）のタンパク質に対し１つまたは複数のアミノ酸置換があるタンパク質であって、該置換が配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０のアミノ酸配列の１５％を超えず、かつ該１つまたは複数のアミノ酸置換があるタンパク質が細胞増殖刺激活性を保持している、タンパク質；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質の断片であって、細胞増殖刺激活性を保持する断片
から成る群より選択される１つまたは複数の単離されたタンパク質を含む、調合物。 - 前記塩形態のアルギニンが、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンから成る群より選択される、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリンナトリウムもしくはショ糖が０．０１〜０．７Ｍである、請求項１または２に記載の調合物。
- ０．５Ｍの濃度で塩形態のアルギニンを含む、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記リン酸二水素ナトリウムが０．０５Ｍである、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記ポリソルベート８０またはポリソルベート２０が０．０１％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の調合物。
- ポリソルベート８０を含む、請求項１または２に記載の調合物。
- ポリソルベート２０を含む、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記タンパク質が０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記タンパク質が１０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記タンパク質が配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の調合物。
- 前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の調合物。
- ２以上のタンパク質を含む、請求項１または２に記載の調合物。
- 前記タンパク質が配列番号２４のアミノ酸配列を含む第一タンパク質、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第二タンパク質を含む、請求項１４に記載の調合物。
- 凍結乾燥または噴霧乾燥されている、請求項１または２の調合物。
- 前記単離されたタンパク質が約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２の調合物。
- 配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を約１０ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む、調合物。
- 配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を約１０ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、および０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む、調合物。
- ０．５Ｍ硫酸アルギニン、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、および約１０ｍｇ／ｍｌの単離タンパク質混合物を含む調合物であって、該タンパク質が配列番号２４のアミノ酸配列を含む第一タンパク質および配列番号２のアミノ酸配列を含む第二タンパク質を含む、調合物。
- 単離されたタンパク質を更に含む請求項２０に記載の調合物であって、該タンパク質が配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２から成る群より単離されるアミノ酸配列を含む、調合物。
- 単離されたタンパク質の１つまたは複数がカルバミル化されている、請求項２１に記載の調合物。
- 配列番号２８のアミノ酸配列を含む第三タンパク質、配列番号３０のアミノ酸配列を含む第四タンパク質、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第五タンパク質を更に含む、請求項２０に記載の調合物。
- 前記単離されたタンパク質が少なくとも純度９８％である、請求項２、１８〜２３のいずれか一項に記載の調合物。
- 塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリンナトリウム、もしくはショ糖、またはそれらの組み合わせを、水溶液中に０．０１〜１Ｍの最終濃度で加えることを含む、水溶液における線維芽細胞成長因子（「ＦＧＦ」）の溶解度を上げる方法。
- 前記線維芽細胞成長因子が、配列番号２、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
- 前記塩形態のアルギニンが、アルギニン、硫酸アルギニン、リン酸アルギニン、および塩酸アルギニンから成る群より選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
- 前記の塩形態のアルギニンの最終濃度が０．０１〜０．７Ｍである、請求項２５または２６に記載の方法。
- 前記の塩形態のアルギニンの最終濃度が０．５Ｍである、請求項２５または２６に記載の方法。
- 酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはこれらの組合せを前記溶液に加えることを更に含む、請求項２５に記載の方法。
- 溶液に酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはこれらの組合せを加えることを含む、溶液中のＦＧＦ溶解性を高める方法。
- 前記酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、またはこれらの組合せの前記溶液中の最終濃度が０．０１〜０．２Ｍである、請求項３１に記載の方法。
- （１）配列番号８を含むベクターを含有する大腸菌細胞を発酵させる工程；
（２）発酵培養物を１０〜１５℃に冷やす工程；
（３）冷やされた培養物を、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、６０ｍＭエチレンジアミン四酢酸、７．５ｍＭのＤＴＴ、および３．５〜５Ｍ尿素を含む溶解緩衝液で希釈する工程；
（４）希釈培養物の中で細胞を溶解する工程；
（５）生じた細胞溶解物を事前に平衡化したカチオン交換カラムにかけて、該カラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ硫酸ナトリウム、および３〜５Ｍ尿素を含む緩衝液でフラッシュする工程；
（６）フラッシュしたカラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０〜２５ｍＭ硫酸ナトリウム、および２．２２ｍＭデキストロースを含む緩衝液で洗浄する工程；
（７）５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０〜２５０ｍＭ硫酸ナトリウム、および０．５〜１ＭのＬ−アルギニンを含む溶出緩衝液で再度カラムを洗浄する工程；
（８）得られた溶出物を、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０〜２５０ｍＭ硫酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１Ｍのアルギニンで事前に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにかける工程；
（９）得られたカラムを１００〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．８〜１Ｍのアルギニンを含む溶液で洗浄する工程；ならびに
（１０）該カラムを、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１〜０．３Ｍのアルギニンを含む溶液で再度洗浄してタンパク質を溶出する工程、
を含む、単離されたタンパク質を生成する方法。 - （１１）得られた溶出物を濃縮する工程；
（１２）得られた残留物をまとめて５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍのアルギニンを含む溶液で濾過する工程；
（１３）濾過残留物を濃縮する工程；ならびに
（１４）濃縮残留物を濾過する工程、
を更に含む、請求項３３に記載の方法。 - 前記工程（１）の発酵が：
（ａ）配列番号８を含むベクターを含有する大腸菌細胞を、化学的に規定された種培地の中で２．５〜４．５のＯＤ６００単位を示す対数増殖期まで培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を種培地に接種して、細胞を３．０〜５．０のＯＤ６００単位の対数増殖期まで培養する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を化学的に規定されたバッチ培地に移す工程；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞を２５〜３０のＯＤ６００単位まで培養し、供給割合０．７ｇ／ｋｇブロス／分で化学的に規定した培地を追加する工程；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞を１３５〜１６５のＯＤ６００単位まで培養する工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）の細胞を約４時間培養する工程
を含む、請求項３３に記載の方法。 - 前記工程（３）が希釈した細胞培養物にポリエチレンイミンを加えることを更に含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記工程（１０）が：
（ａ）溶出液を、荷電エンドトキシン結合フィルターを通過させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）のフィルターを水でフラッシングし、次に５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１〜０．３Ｍアルギニンを含む緩衝液でフラッシングして、タンパク質を溶出する工程、を更に含む、請求項３３に記載の方法。 - 前記工程（４）における溶解が、高圧ホモジェナイザーを通過させることを含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記工程（１０）が、
（ａ）溶出液を、事前に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにかける工程であって、該カラムが５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０〜１００ｍＭ硫酸ナトリウム、８００〜１０００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．５〜１Ｍアルギニンで平衡化されている、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）のカラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５〜１Ｍアルギニンで洗浄して溶出物を生成する工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。 - 前記工程（１０）が、工程（１０）の溶出物に１％ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）で加える工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記工程（１０）が：
（ａ）溶出液を、荷電エンドトキシン結合フィルターを通過させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のフィルターを最初に水でフラッシングし、次に５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１〜０．３Ｍアルギニンを含む緩衝液でフラッシングし、濾過物を生成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の濾過物を事前に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに掛ける工程であって、前記カラムが５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０〜１００ｍＭ硫安、８００〜１０００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５〜１Ｍアルギニンで平衡化されている、工程；
（ｄ）工程（ｃ）のカラムを５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５〜１Ｍアルギニンで洗浄し溶出物を生成する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）の溶出物に１％ポリソルベート８０またはポリソルベート２０を加えて最終濃度を０．０１％にする工程、
を更に含む、請求項３３に記載の方法。 - 工程（１４）の濾過溶液を凍結乾燥または噴霧乾燥する工程を更に含む、請求項３４に記載の方法。
- 請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法で生成した、１つまたは複数の単離されたタンパク質。
- 少なくとも純度９８％である、請求項４３に記載の単離されたタンパク質。
- 請求項４３に記載の単離されたタンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項４４に記載の単離されたタンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 約０．０１〜１Ｍの塩形態のアルギニン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリンナトリウム、もしくはショ糖、またはそれらの組み合わせ、約０．０１〜１Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、約０．０１％〜０．１％重量／容積（「ｗ／ｖ」）ポリソルベート８０またはポリソルベート２０、および請求項４２に記載の単離されたタンパク質を含む、調合物。
- 消化管粘膜炎の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 炎症性大腸炎（「ＩＢＤ」）の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 変形性関節症の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 放射線曝露に関係する障害またはその症状の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 中枢神経系の障害の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 心血管疾患の予防または治療のための、請求項２または４７に記載の調合物。
- 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物の予防的有効量または治療的有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、消化管粘膜炎を治療または予防する方法。
- 前記有効量が０．００１〜３ｍｇ／ｋｇの間である、請求項５４に記載の方法。
- 投与が、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される単回投与である、請求項５４に記載の方法。
- 前記投与が、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇの各単位用量で投与される複数回投与である、請求項５４に記載の方法。
- 前記消化管粘膜炎が、口腔粘膜炎、腸炎、食道炎、口内炎、または直腸炎である、請求項５４に記載の方法。
- 前記消化管粘膜炎が、化学的傷害、生物学的傷害、放射線、またはそれらの組み合わせから生ずる、請求項５４に記載の方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、炎症性大腸炎を治療または予防する方法。
- 前記炎症性大腸炎がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項６０に記載の方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、過敏性腸症候群を治療または予防する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、上皮細胞または間葉細胞の増殖、分化、または移動を刺激する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、関節炎または軟骨変性を治療または予防する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、軟骨再生または修復を刺激する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、卒中または神経変性疾患を治療または予防する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、急速に増殖する組織に影響する傷害によって起こる障害、またはその１つもしくは複数の症状を治療または予防する方法。
- 前記傷害が放射線曝露、化学物質もしくは微生物への曝露、またはそれらの組み合わせである、請求項６８に記載の方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、酸素消去経路をアップレギュレーションする方法。
- 被験体の細胞からの内因性サイトカインまたは内因性ケモカインの分泌を刺激する方法であって、予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、造血幹細胞の増殖を刺激する方法。
- 予防的有効量または治療的有効量の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の調合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、造血幹細胞移植を最適化する方法。
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