DE19531348A1

DE19531348A1 - Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten zur selektiven Eliminierung von Zellen in vivo

Info

Publication number: DE19531348A1
Application number: DE1995131348
Authority: DE
Inventors: Horst Dr Lindhofer; Stefan Prof Dr Thierfelder
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1997-02-27
Also published as: WO1997008205A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, die zwei unterschiedliche auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, sowie Arzneimit tel und diagnostische Zusammensetzungen enthaltend diese Antikörper. Die beschriebenen Antikörper und Arzneimittel eignen sich insbesondere zur spezifischen Eliminierung von Tumorzellen in vivo oder in vitro.

Seitdem es möglich ist, monoclonale Antikörper in großen Mengen herzustellen (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495), sind viele Versuche zum therapeutischen Einsatz dieser Antikörper zur Tumorbehandlung durchgeführt worden. Neben den anfänglichen Erfolgen im Tiermodell wurden schon früh die Grenzen des Einsatz es monoclonaler Antikörper als thera peutischer Substanz deutlich. Vor allem die Therapiestudien, in denen Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung behandelt wurden, verliefen enttäuschend. Zusammenfassend sind die Hauptprobleme dieses Therapieansatzes bei der Behandlung maligner Erkrankungen folgende:

1. Es muß ein möglichst tumorspezifisches Antigen exprimiert werden. Dies ist bei den meisten malignen Erkrankungen nicht der Fall.
2. Große Tumorknoten oder große Metastasen können mit diesem Ansatz kaum behandelt werden, da die Antikörpermoleküle nicht in ausreichender Menge in diese Tumorknoten eindringen können und somit keine Effektorfunktionen an den Tumorzellen mobilisieren. Beim Vorhandensein großer Tumormassen im Patienten besteht außerdem die Möglichkeit, daß eine bestimmte Subpopulation von Tumorzellen das vom Antikörper erkannte Antigen nicht exprimiert und damit unerkannt bleibt.

Ein sicherer Erfolg beim klinischen Einsatz monoclonaler Antikörper konnte bisher nur dann erzielt werden, wenn Mikrometastasen als Ziel der eingesetzten Antikörper gewählt wurden und ein großer Primärtumor chirurgisch entfernt wurde (Riethmüller et al., Lancet 343 (1994), 1177). Ähnlich wie beim Einsatz cytotoxischer oder cytostatischer Chemothera peutika zeichnet sich für die Verwendung monoclonaler Anti körper ab, daß verschiedene Therapiemodalitäten miteinander kombiniert werden müssen, um deutliche Erfolge erzielen zu können.

Ein weiterer Nachteil liegt bei den monoclonalen Antikörpern selbst: Antikörper - üblicherweise aus der Maus gewonnen führen zur Bildung von Anti-Antikörpern, die die Zirku lationszeit und damit die Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers im Menschen stark reduzieren. Diesem Phänomen versucht man durch Humanisierung der Maus-Antikörper entge genzuwirken.

Ein wesentlich einfacherer Lösungsweg wäre die Selektivität, sowie die Effektorfunktionen der Antikörper so zu verbes sern, daß z. B. Mikrometastasen durch eine einmalige oder wenige Gaben (innerhalb einer Woche) von Antikörpern voll ständig eliminiert werden könnten.

Um die Effektivität der Antikörper zu erhöhen, wurden und werden weiterhin Versuche unternommen, nicht nur die Tumor zelle mit einem Antikörper zu besetzen, sondern gleichzeitig eine spezifische Immunantwort des Patienten gegen den Tumor zu induzieren. Dazu wurden bispezifische Antikörper entwickelt, die mit dem einen Bindungsarm auf der Tumor zelle, mit dem anderen auf Effektorzellen des Immunsystems binden und diese gegen den Tumor redirigieren (Staerz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1453). Dieses Wirkungsprinzip gilt aber nur für Tumore, die ein tumorspe zifisches Antigen besitzen. Da der Mehrzahl der bekannten Tumorarten ein derartiges tumorspezifisches Antigen fehlt, ist dieses Prinzip zur Tumoreliminierung bei den meisten Tumoren nicht anwendbar. Der Einsatz der bisher verfügbaren Antikörper zur Tumorimmuntherapie ermöglicht daher nur in begrenztem Maße eine spezifische Eliminierung der Tumorzel len und ermöglicht insbesondere nicht die spezifische Erken nung und Eliminerung von Tumorzellen, die kein tumorspezifi sches Antigen exprimieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Antikörper und diese enthaltende Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, die eine selektive Erkennung und Eliminierung von Zellen in vivo ermöglichen, insbesondere von Tumorzel len, die kein tumorspezifisches Antigen exprimieren.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper mit min destens zwei Spezifitäten, wobei von zwei Antigenbindungs stellen mit unterschiedlicher Spezifität zwei unterschiedli che auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkannt wer den. Der Begriff Spezifität bedeutet dabei die Fähigkeit eines Antikörpers, ein bestimmtes Antigen zu erkennen. Das Antigen kann dabei von einer oder mehreren Antigenbindungs stelle(n) des Antikörpers erkannt werden, die wiederum glei che oder unterschiedliche Epitope des Antigens erkennen kön nen. Der Begriff "auf einer Tumorzelle lokalisiertes Anti gen" umfaßt dabei Antigene, die von einer Tumorzelle expri miert werden und derart lokalisiert sind, daß sie von Anti körpern gebunden werden können.

Es konnte nun überraschend gezeigt werden, daß sogenannte bispezifische Antikörper, die zwei verschiedene auf einer Zelle lokalisierte Antigene erkennen, (Parham, Human Immu nol. 12 (1985), 213; Wong et al., J. Immunol. 139 (1987), 1369) in vivo dazu verwendet werden können, um spezifisch Zellen zu eliminieren. Dieses Prinzip eignet sich insbeson dere, um spezifisch Tumorzellen zu eliminieren, die kein spezifisches Tumorantigen exprimieren. Hierzu werden Anti körper mit zwei oder mehr Spezifitäten eingesetzt, die eine Kombination von Antigenen erkennen, die ausschließlich oder fast ausschließlich auf Tumorzellen vorkommt.

Im Gegensatz zu den Arbeiten von Parham (s. o.) und Wong (s. o.), die die Wirkungsweise bispezifischer Antikörper in vitro untersuchten, konnte erstmals gezeigt werden, daß die selektive Bindung und damit verbundene Elimination von bestimmten Zielzellen durch Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten in vivo trotz einer Vielzahl von interferieren den Einflüssen unerwartet hochspezifisch ist. In vivo können unterschiedliche Kompartimente und/oder die Vielzahl von Bindungsmöglichkeiten die Abschwächung der hohen Spezifität bispezifischer Antikörper durch Kreuzreaktionen zur Folge haben.

Es war möglich zu zeigen, daß Antikörper mit zwei Spezifitä ten, die zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokali sierte Antigene erkennen (siehe Fig. 1), in vivo bei einer bestimmten Konzentration nicht (oder nicht in relevanter Anzahl) an Zellen binden, die nur eines dieser Antigene exprimieren. Unterhalb dieser kritischen Konzentration wer den aufgrund der höheren Avidität nur Zellen gebunden und gegebenenfalls zerstört, die beide Antigene exprimieren. Die Tumorselektivität kann durch Verwendung derartiger bispezi fischer Antikörper um den Faktor 10-1000 erhöht werden, je nach Affinität der Antigenbindungsstellen des Antikörpers zu den gewählten Antigenen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen im Vergleich zu kon ventionellen Antikörper den Vorteil auf, daß aufgrund einer höheren Antikörper-Dichte auf den Tumorzellen körpereigene Effektormechanismen zur Tumorzerstörung, wie z. B. das Kom plementsystem oder die antikörpervermittelte Zytotoxizität mittels Fc-Rezeptor tragender Zellen (ADCC) wesentlich effi zienter angreifen oder überhaupt erst den Schwellenwert, der für die Zerstörung der Tumorzelle notwendig ist, überschrei ten.

Ferner weisen die erfindungsgemäßen Antikörper den Vorteil auf, daß die Wahrscheinlichkeit, daß Tumorzellen aufgrund der Entstehung von "Escape-Mutanten" nicht mehr erkannt wer den, stark herabgesetzt ist, da zwei verschiedene Antigene auf dem Tumor, innerhalb kurzer Zeit, gleichzeitig herunter reguliert werden müßten.

Bei den auf der Tumorzelle lokalisierten Antigenen, die von den erfindungsgemäßen Antikörpern erkannt werden, kann es sich prinzipiell um beliebige von der Tumorzelle exprimierte Antigene handeln.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den auf der Tumorzelle lokalisierten Antigenen, die von den er findungsgemäßen Antikörpern erkannt werden, um tumorassozi ierte Antigene.

Der Begriff tumorassoziiertes Antigen bedeutet dabei, daß diese Antigene vorzugsweise von Zellen des zu eliminierenden Tumors exprimiert werden und/oder sich auf derartigen Tumor zellen in höherer Dichte befinden als auf nicht-malignen Zellen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erkennt der erfindungsgemäße Antikörper mit mindestens einer Antigenbin dungsstelle eine tumorassoziiertes Antigen und mit minde stens einer weiteren Antigenbindungsstelle ein nicht-tumor spezifisches Antigen, das auch von nicht-malignen Zellen ex primiert wird. Bei diesem Antigen handelt es sich vorzugs weise um ein Antigen, das spezifisch ist für den Zelltyp oder den Gewebetyp des zu eliminierenden Tumors.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erkennt der Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten zwei normale, nicht-tumorspezifische Antigene, die auch von nicht-malignen Zellen exprimiert werden, die in dieser Kombination jedoch ausschließlich oder fast ausschließlich auf der zu eliminie renden Tumorzelle vorkommen.

Bei den Antigenen, die auf der zu eliminierenden Tumorzelle lokalisiert sind, handelt es sich vorzugsweise um die fol genden Antigene:
CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD23, CD24, einen Ig-Idiotyp, CD33, CD40, CD41, c-erb-2, CALLA (CD10), MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, Gangliosid-G_D-2, GD3, C215, das von dem monoclonalen Antikörper 17-1A erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper 9.2.27 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper NE150 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper L6 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper CA125 erkannte Antigen (Mucin), CD19, CD20, CD21, CD22, B220 oder CD5. In den Beispielen wird erläutert welche Kombinationen dieser Antigene sich für die spezifische Erkennung und Eliminierung bestimmter Tumorarten eignen. Neben den zwei Spezifitäten, die zwei verschiedene auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, können die erfindungsgemäßen Antikörper weitere Spezifitäten zur Erkennung weiterer Antigene haben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise eine weitere Spezifität, die ein Antigen erkennt, daß spezifisch auf einer Effektorzelle lokalisiert ist. Somit betrifft die vor liegende Erfindung auch trispezifische Antikörper, die zwei auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene als auch ein auf einer Effektorzelle lokalisiertes Antigen erkennen.

Unter dem Begriff Effektorzelle werden dabei Zellen verstan den, die aus der Hämatopoese hervorgehen und cytolytische, Apoptose-vermittelnde oder Phagozytose-Eigenschaften besitzen. Insbesondere umfaßt dieser Begriff T-Zellen, Gra nulocyten, Monocyten, Makrophagen, NK ("natural killer")-Zellen, Mastzellen und Langerhans-Zellen. Bei dem auf der Effektorzelle lokalisierten Antigen handelt es sich vorzugs weise um ein Antigen, das nicht auf der zu eliminierenden Tumorzelle exprimiert wird. Insbesondere handelt es sich da bei bevorzugt um die Antigene CD3, CD16, CD28, CD32 oder CD64.

Bei den erfindungsgemäßen Antikörper handelt es sich vor zugsweise um monoclonale, chimäre, rekombinante, syntheti sche, halbsynthetische oder chemisch modifizierte Antikör per, sowie um Fragmente derartiger Antikörper, insbesondere Fv, Fab, scFv oder F(ab)₂-Fragmente.

Sind die erfindungsgemäßen Antikörper für eine in-vivo-Therapie vorgesehen, werden bevorzugt Antikörper oder Deri vate oder Fragmente vom Menschen verwendet, oder solche, die derart verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Menschen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z. B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992, 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).

Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörper typen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig.

Die Herstellung monoclonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen oder Ziege haben, kann mittels herkömmlicher Methoden erfolgen, wie sie z. B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) oder in Galfr´ (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschrieben sind.

Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA-Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe z. B. Kurucz et al., J. Immu nol. 154 (1995), 4576; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444).

Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spe zifitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie mög lich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fusionstechnik (siehe z. B. Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Hierbei werden Hybridomazellinien, die Anti körper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produ zieren, fusioniert und rekombinante Zellinien identifiziert und isoliert, die Antikörper mit beiden Spezifitäten produ zieren.

Die Herstellung von Antikörper mit drei Spezifitäten, soge nannte trispezifische Antikörpern, kann beispielsweise der art erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ketten eines bispezifischen Antikörpers eine dritten Antigenbindungs stelle mit einer weiteren Spezifität, z. B. in Form eines "single chain variable fragments" (scFv) angekoppelt wird. Das scFv kann beispielsweise über einen

-S-S (G₄S)_nD-I-Linker

an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Glycin, D = Aspartat, I = Isoleucin). Fig. 5 zeigt schema tisch den Aufbau eines derartigen trispezifischen Antikör pers, der das Antigen CD3 mittels des angekoppelten scFv-Fragmentes erkennt.

Analog dazu können trispezifische F(ab)₂-Konstrukte herge stellt werden, indem die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette der anderen Spezifi tät beispielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hinge"-Region) in das codierende Gen, z. B. mittels homologer Rekombination entfernt werden (siehe Fig. 6).

Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Konstrukte. Hierbei werden drei VH-VL-Regionen, die drei verschiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet (siehe Fig. 7).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antikörper mit Substanzen gekoppelt, die die Effektorfunktion der Antikörper, die zur Eliminierung der Zielzelle führen, verbessern.

Die zellzerstörende Wirkung von Antikörpern beruht normaler weise auf den Effektorfunktionen der Fc-Region der Antikör per. So können z. B. Fc-Rezeptor-tragende Zellen an eine mit Antikörper besetzte Zelle binden und diese zerstören. Diese auch als ADCC ("antibody dependent cell mediated cytotoxi city") bezeichnete Reaktion reicht jedoch häufig nicht aus, um effektiv alle Zielzellen zu zerstören.

Bei den Substanzen, die an die in den erfindungsgemäßen Arz neimitteln enthaltenen Antikörper gekoppelt werden können, handelt es sich vorzugsweise um Enzyme, toxische Substanzen, Biotin, Radionuclide oder Superantigene.

In Zusammenhang mit der Kopplung eines Antikörpers mit einem Enzym ist beispielsweise die von Rodrigues et al. (Cancer Res. 55 (1985), 63) beschriebene sogenannte "antibody depen dent enzyme mediated prodrug therapy" (ADEPT) zu nennen. Bei diesem Verfahren wird die Vorstufe einer toxischen Substanz unmittelbar am vorgesehenen Wirkort, beispielsweise an der Tumorzelle, durch ein Enzym, das an den Antikörper gekoppelt ist, aktiviert. Dieses Prinzip ist umso effizienter und freier von Nebenwirkungen, je spezifischer der verwendete Antikörper die Zielzelle erkennt. Ein bevorzugt in dieser Methode verwendetes Enzym ist beispielsweise die β-Lacta mase.

Beispiele für toxische Substanzen, die direkt an die erfin dungsgemäßen Antikörper gekoppelt werden können, sind Ricin, Saporin oder Pertussis-Toxin.

Durch die Kopplung der erfindungsgemäßen Antikörper mit Bio tin ist es ferner möglich, an Avidin konjugierte Substanzen an Zielzellen anzureichern.

Vorteilhaft ist dies beispielsweise bei der Applikation von Radionuclid-Avidin-Konjugaten. In diesem Fall werden die Konjugate erst verabreicht, wenn der mit Biotin gekoppelte Antikörper bereits an die Zielzelle gebunden hat. Die Konju gate werden aufgrund der hohen Affinität zwischen Biotin und Avidin sehr spezifisch an den Zielzellen angereichert. Unge bundene Radionuclid-Avidin-Konjugate werden dagegen aufgrund ihrer geringen Größe schnell aus dem Organismus entfernt.

Der Vorteil der Verwendung derartiger Antikörper ist eine relative geringe unspezifische radioaktive Belastung des Patienten bei ihrer Anwendung.

Ferner können die erfindungsgemäßen Antikörper mit einem Superantigen gekoppelt sein. Superantigene sind extrem potente Aktivatoren von T-Zellen. Ein Beispiel ist das SEA ("staphylococcal enterotoxin A"). T-Zellen werden durch Superantigene zur Proliferation sowie zur Freisetzung von Cytokinen und der Cytolyse benachbarter Zellen angeregt. Ausgelöst wird diese unkontrollierte, systemische T-Zellak tivität durch Bindung der Superantigene an konservierte Bereiche von MHCII-Molekülen bzw. die Vβ-Kette des T-Zellre zeptors. Dohlsten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 8945) beschreibt, daß die unspezifische Bindung an MHCII durch eine spezifischere Antigenbindungsstelle eines Antikörpers ersetzt werden kann. Dadurch gelingt es, die T-Zellaktivierung wesentlich kontrollierter ablaufen zu las sen. Durch geeignete Kombination der Antigeneigenspezifitä ten eines Antikörpers kann auch hier die Cytolyse-Wirkung der aktivierten T-Zellen auf eine bestimmte Zielzelle begrenzt werden.

Bei der Herstellung von Antikörpern, die mit einem Superan tigen gekoppelt sind, wird beispielsweise eine der schweren Immunglobulinketten eines Antikörpers oder Antikörperfrag mentes um eine T-Zell-aktivierende Superantigensequenz ver längert. Dabei kann diese Sequenz z. B. über einen

-S-S(G₄S)_nD-I-Linker

mit einer der schweren Ig-Ketten verbunden sein. Das Anfügen der Linker- und Superantigensequenzen an die schwere Ig-Kette kann beispielsweise mittels homologer Rekombination auf DNA-Ebene in einer Hybridomazellinie stattfinden (Land und Mocikat, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 528). Eine derar tige Konstruktion eines bispezifischen Antikörpers mit einer Superantigensequenz ist beispielhaft in Fig. 2 gezeigt.

Ferner ist es möglich, F(ab)₂-Fragmente mit einem Superanti gen zu koppeln. Dies ist in Fig. 3 beispielhaft für ein bispezifisches F(ab)₂-Fragment gezeigt. In diesem Fall wer den die CH2, CH3-Regionen einer schweren Immunglobulinkette durch eine Superantigensequenz ersetzt, während die CH2, CH3-Regionen der anderen schweren Immunglobulinkette durch den Einbau eines Stopcodons mittels homologer Rekombination entfernt wurden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, sogenannte "single chain variable fragments" (scFv) mit einem Superantigen zu koppeln. Dies ist beispielhaft für ein derartiges bispezifi sches Fragment in Fig. 4 gezeigt. Hierbei werden beispiels weise lediglich die V-Regionen mit verschiedener Spezifität aneinandergekoppelt bei vollständiger Entfernung der kon stanten Antikörperregionen und anschließend wird an eine der V-Regionen wie oben beschrieben eine Superantigensequenz gekoppelt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arz neimittel, die Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, vorzugsweise bispezifische Antikörper, enthalten, wobei der Antikörper mindestens zwei unterschiedliche auf einer Ziel zelle lokalisierte Antigene erkennt. Bei der Zielzelle kann es sich generell um jede beliebige Zelle handeln, vorzugs weise um eine Zelle, die eliminiert werden soll, beispiels weise eine Tumorzelle. Bei den auf der Zielzelle lokalisier ten Antigenen handelt es sich vorzugsweise um Antigene, die in dieser Kombination ausschließlich oder fast ausschließ lich von der Zielzelle exprimiert werden. Die in den Arznei mitteln enthaltenen Antikörper können wie oben beschrieben modifiziert sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die oben beschriebene erfindungsgemäßen Anti körper enthalten. Derartige Arzneimittel können neben den Antikörpern gängige, dem Fachmann geläufige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe enthalten.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Antikörpern mit zwei oder mehr Spezifitäten, vorzugsweise bispezifischen Antikörpern, die mindestens zwei unterschied liche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo Immuntherapie.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Antikörpern um die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper.

Bei der Immuntherapie handelt es sich vorzugsweise um eine Therapie zur Behandlung von Tumoren, insbesondere von B-Zell-Lymphomen, kolorektalen Karzinomen, Melanomen, Ovarial-Karzinomen, Glioblastomen (maligne Gliome) oder Mamma-Karzi nomen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Zusammensetzungen, die Antikörper mit zwei oder mehr Spezi fitäten enthalten, die mindestens zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennen, oder die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper.

Fig. 1 zeigt die prinzipiell Wirkungsweise bispezifischer Antikörper

Fig. 2 zeigt schematisch einen mit einer Superantigen sequenz gekoppelten bispezifischen Antikörper
Sag = Superantigensequenz
bsAK = bispezifischer Antikörper

Fig. 3 zeigt schematisch ein bispezifisches F(ab)₂-Superantigenkonstrukt
Sag = Superantigensequenz
bsF(ab)₂ = bispezifisches F(ab)₂-Fragment

Fig. 4 zeigt schematisch ein bispezifisches "single chain variable fragment"-Superantigen-Konstrukt
Sag = Superantigensequenz
bs-scFv = bispezifisches "single chain variable fragment"

Fig. 5 zeigt schematisch einen trispezifischen Antikör per, bei dem ein "single chain variable fragment", das CD3 erkennt, über einen Linker an eine der schweren Ketten eines bispezifischen Antikörpers gekoppelt wurde.
triAK = trispezifischer Antikörper

Fig. 6 zeigt schematisch ein trispezifisches F(ab)₂-Konstrukt, bei dem eine schwere Kette eines bispe zifischen Antikörpers durch ein scFv-Fragment ersetzt wurde, das CD3 erkennt, und bei dem die andere schwere Kette entfernt wurde.

Fig. 7 zeigt schematisch ein trispezifisches scFv-Konstrukt

Fig. 8 zeigt die Ergebnisse von den zwei in Beispiel 9 beschriebenen Versuchen, bei denen SCID-Mäusen Thymomzellen injiziert wurden und die Mäuse an schließend mit bispezifischen Antikörpern zur Depletion der Thymomzellen behandelt wurden.

Dargestellt ist die Überlebensrate in % der behan delten Tiere im Verlauf der Zeit.

Die Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von B-Zell-Lymphomen

Um selektiv B-Zell-Lymphomzellen zu eliminieren, bieten sich folgende Antigenkombinationen an, die mit bispezifischen (bsAk) Antikörpern spezifisch erkannt wer den können:

a) anti-CALLA (CD10)/anti-CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23, CD24)
CALLA ist ein lymphomassoziierter Proliferationsmarker; CD19-CD24 sind B-Zellmarker. Tumorzellen, die diese Anti genkombination tragen, werden von einem bsAk mit den oben genannten Spezifitäten depletiert; native B-Zellen, die lediglich B-Zellmarker (CD19-24) tragen und kein CALLA Antigen exprimieren, werden dagegen nicht depletiert.
b) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)/CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23, CD24)
Die CD44 Variante v6 wird verstärkt während der Tumorpro gression exprimiert (Mulder et al., Lancet 34 (1994), 1470); CD19-CD24 s. o.
c) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)/anti-CALLA
d) anti-B220/anti-CD5
CD5 wird häufig auf B-CLL oder zentrozytischen Lymphomen exprimiert.
B220 ist ein B-Zellmarker.
e) anti-CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23, CD24)/anti- CD5
f) anti-MHCII/anti-CD5 (oder anti-CALLA, anti-CD44v6, anti-B220, anti-CD19 bis 22, oder anti-CD24) B-Zell-Lymphome exprimieren häufig MHCII.
g) anti-Ig-Idiotyp in Kombination mit einer Spezifität, die ein B-Zell-Lymphom-assoziiertes Antigen oder einen B-Zellmarker erkennt.

Beispiel 2 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von kolorektalen Karzinomen

Um selektiv kolorektale Karzinome zu eliminieren, bieten sich Antikörper mit folgenden Spezifitäten an:

a) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)/17-1A
17-1A ist ein monoclonaler Antikörper der ein mit Kolorek talen-Karzinom-Zellen und Mamma-Karzinom-Zellen assoziier tes Antigen erkennt (Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76 (1979), 1438).
b) anti-p97/17-1A
p97 ist ein mit Kolon-Karzinomen und Melanomen assoziier tes Antigen (Hellström et al., J. Immunol. 127 (1981), 157).
c) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)/anti-p97
d) anti-C215/17-1A
C215 ist ein Kolon-Adenokarzinom bzw. Mammakarzinom-asso ziiertes Antigen. Es handelt sich dabei um ein Epitop, das ebenfalls auf dem tumorassoziierten Antigen GA-733-2 vor kommt und folgende Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben-Code aufweist:
AKPEGALQNNDGLYDPDXD (Björk et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 24232).
e) anti-C215/anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)
f) anti-C215/anti-p97

Beispiel 3 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Melanomen

Zur Eliminierung von Melanomzellen bieten sich folgende Kombinationen an:

a) anti-p97/anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)
b) anti p97/9.2.27
Der monoclonale Antikörper 9.2.27 bindet auf einem Mela nom-assoziierten Glykoprotein (Morgan et al., Hybridoma 1 (1981), 27).
c) anti-GD3/9.2.27
Der monoclonale Antikörper anti-GD3 bindet auf einem Mela nom-assoziierten Protein (Dippold et al., Eur. J. Cancer Clin. Onc. 21 (1988), 65).

Beispiel 4 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Mamma-Karzinomen

Mamma-Karzinome können beispielsweise durch Antikörper mit folgenden Spezifitäten erkannt werden:

a) L6/anti-c-erb-2
L6 ist ein monoclonaler Antikörper, der ein mit Mamma-Karzinom assoziiertes Antigen erkennt (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 (1987), 3439). c-erb-2 ist ein mit Mamma- und Ovarial- Karzinomen assoziiertes Antigen.
b) L6/anti-C215
c) anti-C215/anti-c-erb-2

Beispiel 5 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Ovarial-Karzinomen

Zur Erkennung von Ovarial-Karzinomen bietet sich die Kom bination an:
anti-Mucin (CA125)/anti-c-erb-2.
Der monoclonale Antikörper CA125 erkennt ein auf Ovarial Karzinomen stark exprimiertes Antigen (Larson et al., Int. J. Cancer 42 (1988), 877).

Beispiel 6 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung eines malignen Glioms (Glioblastom)

Die Erkennung von Glioblastomen kann beispielsweise durch folgende Kombinationen erfolgen:
NE150/9.2.27
Die monoclonalen Antikörper NE150 (Nitta et al., Lancet 335 (1990), 368) und 9.2.27 (Schrappe et al., Cancer Res. 51 (1991), 4986) binden beide auf unterschiedlichen Gliom-asso ziierten Antigenen.

Beispiel 7 Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Neuroblastom-Zellen

Zur Erkennung von Neuroblastomzellen bieten sich Antikörper an, die das Antigen Ganliosid G_D-2 in Kombination mit einem weiteren Neuroblastom-spezifischen Antigen oder einem Zell- oder gewebespezifischen Antigen erkennen.

Beispiel 8 Antikörper zur Erkennung und Eliminierung von weiteren Leukämien

Für die Erkennung und Eliminierung von T-Zell- und myeloi schen sowie nicht eindeutig klassifizierbaren Leukämien bie ten sich Antikörper an, die Kombinationen der folgenden Antigene erkennen:
CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD23, CD24, CD33, CD40 und CD41.

Beispiel 9 Selektive Depletion von Tumorzellen in vivo

Um die Anwendbarkeit des Prinzips der "selektiven Depletion" mittels bi- und, davon abgeleitet, tri-spezifischer Antikör per zur Zerstörung von Tumorzellen in vivo zu prüfen, wurden 2×10⁴ syngene ST-1-Thymomzellen mit dem Phänotyp CD4+, CD8+, Thy-1.2+ in SCID-Mäuse injiziert. Da bei der SCID-Maus die normale T-Zell-Reifung gestört ist, werden in derartigen Tieren so gut wie keine CD4+ und CD8+ Zellen gebildet. Es werden aber Thy-1.2+, CD4-, CD8- Zellen gebildet, die etwa 20% der Zellen im peripheren Blut ausmachen. Zur selektiven Depletion der Tumorzellen wurde ein bispezifischer Antikör per (bsAk) mit den Spezifitäten anti-Thy-1.2 x anti-CD8 ver wendet.

Vier Tage nach Tumorzell-Injektion wurden den Tieren (6+6, Versuche 1+2) 10 µg des o.g. bispezifischen Antikörpers in jiziert bzw. die äquimolare Menge an parentalen anti-CD8 und anti-Thy-1.2 Antikörpern (ebenfalls 12 Tiere, Versuche 1+2) oder kein Antikörper (12 Tiere, Versuche 1+2). Während sämt liche Tiere, die keinen bsAk erhalten hatten, starben, über lebten 5 der 12 mit bsAk behandelten Tiere bei allgemeiner Lebenszeitverlängerung (statistisch signifikant im log rank Test, p(0,02) (siehe Fig. 8). Darüberhinaus wurde im peri pheren Blut der mit bsAk behandelten Mäuse kein Rückgang der Thy-1.2+, CD4-, CD8-Zellen festgestellt, während die Kombi nation der parentalen Antikörper (anti-Thy-1.2, anti-CD8) zu einem Rückgang von 20% auf 11% dieser Zellen führte. Letz tere Beobachtung zeigt, daß bei einer bestimmten Serumkon zentration des bsAk im Blut eines behandelten Patienten bevorzugt Zellen, die beide Antigene exprimieren, von derar tigen bsAk attackiert werden, während Zellen, die nur eines der beiden Zielantigene exprimieren, verschont bleiben.

Beispiel 10 Selektive Depletion von (CD8+/Thv1.2+)-T-Zellen durch bispezifische Antikörper in vivo

In einem weiteren Versuch wurde normalen immunkompetenten BALB/c-Mäusen ebenfalls der in Beispiel 9 beschriebenen bsAk sowie die dazugehörigen parentalen Antikörper in den angege benen äquimolaren Mengen injiziert.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 1 darge stellt. Zur Erläuterung der Tabelle: RmCD8-6 = Antikörper mit Spezifität anti-CD8; MmT1 = Antikörper mit Spezifität anti-Thy-1.2; bsAk = bispezifischer Antikörper; BiB = bispe zifischer Antikörper mit den Spezifitäten RmCD8-6 x MmT1.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, depletieren 5 µg des bsAk BiB spezifisch die (CD8+, Thy-1.2+)-Zellen fast vollständig von 14,5% auf 0,8%, während die (CD4+, Thy-1.2+)-Zellen bei der verabreichten Antikörperdosis verschont bleiben.

Die äquimolare Menge an parentalen Antikörpern 2,5+2,5 4g depletiert lediglich CD8+ Lymphozyten, auf denen beide parentalen Akbinden können, marginal von 14,5% auf 12,6%. Erklärt werden kann diese Beobachtung durch einen geringeren Antikörper-Besatz auf den CD8+ Lymphozyten durch die paren talen Antikörper im Vergleich zu dem bsAk, da die parentalen anti-Thy-1.2 Antikörper auch auf z. B. CD4+ Lymphozyten bin den, sich dadurch auch auf anderen Geweben verteilen und somit bei dieser geringen Anktikörpergabe die CD8+ Lymphozy ten nicht mehr zu 100% absättigen können. D.h. bei dieser geringen Antikörperkonzentration kann der zur Lyse der Ziel zellen mittels ADCC notwendige Schwellenwert für den Anti körperbesatz (fast) nur noch von den bsAk aufgrund deren höherer Selektivität für die Zielzellen erreicht werden.

Tabelle 1

Depletion von CD4+ und CD8+ T-Zellen mittels parentaler und bispezifischer Antikörper nach 4 Tagen

Lymphknoten (Balb/c)

Claims

1. Antikörper mit mindestens zwei Spezifitäten, dadurch gekennzeichnet, daß von mindestens zwei Antigenbindungs stellen mit unterschiedlicher Spezifität zwei unter schiedliche auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkannt werden.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli che auf der Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, zwei verschiedene tumorassoziierte Antigene erkannt wer den.

3. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli che auf der Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, mindestens eine Antigenbindungsstelle ein tumorassozi iertes Antigen erkennt und mindestens eine weitere Anti genbindungsstelle ein Antigen erkennt, das auch von nicht-malignen Zellen exprimiert wird.

4. Antikörper nach Anspruch 3, wobei das Antigen, das auch von nicht-malignen Zellen exprimiert wird, ein Antigen ist, das spezifisch für den Zell- oder Gewebetyp des Tumors ist.

5. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli che auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, zwei nicht-tumorspezifische Antigene erkannt werden, die in Kombination ausschließlich oder fast ausschließlich auf der Tumorzelle vorkommen.

6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die auf der Tumorzelle lokalisierten Antigene die Antigene CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD23, CD24, einen Ig-Idiotyp, CD33, CD40, CD41, c-erb-2, CALLA (CD10), MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, Gangliosid-G_D-2, GD3, C215, das von dem monoclonalen Antikörper 17-1A-erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper 9.2.27 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Anti körper NE150 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper L6 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper CA125 erkannte Antigen (Mucin), CD19, CD20, CD21, CD22, B220 oder CD5 sind.

7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Antikörper eine weitere Spezifität besitzt, die ein auf einer Effektorzelle lokalisiertes Antigen erkennt.

8. Antikörper nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das auf der Effektorzelle lokalisierte Antigen nicht auf der Tumorzelle vorhanden ist.

9. Antikörper nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich net, daß es sich bei dem auf der Effektorzelle lokali sierten Antigen um das Antigen CD3, CD16, CD28, CD32 oder CD64 handelt.

10. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich um einen monoclonalen Antikörper, einen durch rekombinante DNA-Technologie hergestellten Antikörper, eine halbsynthetischen oder synthetischen Antikörper, um einen chemisch modifizierten Antikörper oder um ein Fragment eines solchen Antikörpers handelt.

11. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Antikörper gekoppelt ist mit einem Enzym, einer toxi schen Substanz, einem Radionuclid, Biotin oder einem Superantigen.

12. Arzneimittel enthaltend mindestens einen Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Trä gerstoff.

13. Arzneimittel nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.

14. Verwendung eines Antikörpers mit zwei oder mehr Spezifi täten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo Immuntherapie.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Immunthe rapie eine Therapie zur Behandlung eines Tumors ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Tumor ein B-Zell-Lymphom, ein kolorektales Karzinom, ein Melanom, ein Ovarialkarzinom, ein Glioblastom (malignes Gliom) oder ein Mamma-Karzinom ist.

18. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend mindestens einen Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt.

19. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.