WO1997008205A1 - Antikörper mit zwei oder mehr spezifitäten zur selektiven eliminierung von zellen in vivo - Google Patents

Antikörper mit zwei oder mehr spezifitäten zur selektiven eliminierung von zellen in vivo Download PDF

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Definitions

  • the present invention is therefore based on the object of providing antibodies and medicaments containing them which enable selective recognition and elimination of cells in vivo, in particular of tumor cells which do not express a tumor-specific antigen. This object is achieved by the provision of the embodiments described in the patent claims.
  • FIG. 6 schematically shows a trispecific F (ab) 2 construct in which a heavy chain of a bispecific antibody was replaced by an scFv fragment which recognizes CD3 and in which the other heavy chain has been removed.
  • FIG. 8 shows the results of the two experiments described in Example 9, in which SCID mice were injected with thymoma cells and the mice were then treated with bispecific antibodies to deplete the thymoma cells. The survival rate is shown in% of the treated animals over time.
  • CALLA is a lymphoma-associated proliferation marker
  • CD19-CD24 are B cell markers. Tumor cells that carry this combination of antigens are depleted by a bsAk with the specificities mentioned above; native B cells which only carry B cell markers (CD19-24) and do not express any CALLA antigen are not depleted.
  • 17-IA is a monoclonal antibody that recognizes an antigen associated with colorectal carcinoma cells and breast carcinoma cells (Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 1438).
  • the combination is suitable for the detection of ovarian carcinomas:
  • the monoclonal antibody CA125 recognizes an antigen strongly expressed on ovarian carcinomas (Larson et al., Int. J. Cancer 42 (1988), 877).
  • Antibodies that recognize combinations of the following antigens are useful for the detection and elimination of T-cell and myeloid leukemias, as well as those that cannot be clearly classified:
  • the equimolar amount of parental antibodies 2.5 + 2.5 ⁇ g only depletes CD8 + lymphocytes, on which both parental antibodies can bind, marginally from 14.5% to 12.6%.
  • This observation can be explained by a lower antibody stock on the CD8 + lymphocytes by the parental antibodies compared to the bsAk, since the parental anti-Thy-1.2 antibodies also bind to, for example, CD4 + lymphocytes, and thus also to others Distribute tissues and so with this small amount of antibody, the CD8 + lymphocytes can no longer be saturated 100%.
  • the threshold value for the anti-body population required for the lysis of the target cells by means of ADCC can (almost) only be achieved by the bsAk due to their higher selectivity for the target cells.

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Abstract

Es werden Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten beschrieben, die zwei unterschiedliche auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, sowie Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen enthaltend diese Antikörper. Die beschriebenen Antikörper und Arzneimittel eignen sich insbesondere zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen in vivo oder in vitro.

Description

Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten zur selektiven Eliminierung von Zellen in vivo
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, die zwei unterschiedliche auf einer Tu¬ morzelle lokalisierte Antigene erkennen, sowie Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen enthaltend diese Anti¬ körper. Die beschriebenen Antikörper und Arzneimittel eignen sich insbesondere zur spezifischen Eliminierung von Tumor¬ zellen in vivo oder in vitro.
Seitdem es möglich ist, monoclonale Antikörper in großen Mengen herzustellen (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975) , 495) , sind viele Versuche zum therapeutischen Einsatz dieser Antikörper zur Tumorbehandlung durchgeführt worden. Neben den anfänglichen Erfolgen im Tiermodell wurden schon früh die Grenzen des Einsatzes monoclonaler Antikörper als thera¬ peutischer Substanz deutlich. Vor allem die Therapiestudien, in denen Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung be¬ handelt wurden, verliefen enttäuschend. Zusammenfassend sind die Hauptprobleme dieses Therapieansatzes bei der Behandlung maligner Erkrankungen folgende:
1. Es muß ein möglichst tumorspezifisches Antigen exprimiert werden. Dies ist bei den meisten malignen Erkrankungen nicht der Fall.
2. Große Tumorknoten oder große Metastasen können mit diesem Ansatz kaum behandelt werden, da die Antikörpermoleküle nicht in ausreichender Menge in diese Tumorknoten eindringen können und somit keine Effektorfunktionen an den Tumorzellen mobilisieren. Beim Vorhandensein großer Tumormassen im Pati¬ enten besteht außerdem die Möglichkeit, daß eine bestimmte Subpopulation von Tumorzellen das vom Antikörper erkannte Antigen nicht exprimiert und damit unerkannt bleibt. Ein sicherer Erfolg beim klinischen Einsatz monoclonaler An¬ tikörper konnte bisher nur dann erzielt werden, wenn Mikro¬ metastasen als Ziel der eingesetzten Antikörper gewählt wur¬ den und ein großer Primärtumor chirurgisch entfernt wurde (Riethmüller et al., Lancet 343 (1994), 1177) . Ähnlich wie beim Einsatz cytotoxischer oder cytostatischer Chemothera¬ peutika zeichnet sich für die Verwendung monoclonaler Anti¬ körper ab, daß verschiedene Therapiemodalitäten miteinander kombiniert werden müssen, um deutliche Erfolge erzielen zu können.
Ein weiterer Nachteil liegt bei den monoclonalen Antikörpern selbst : Antikörper - üblicherweise aus der Maus gewonnen- führen zur Bildung von Anti-Antikörpern, die die Zirku¬ lationszeit und damit die Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers im Menschen stark reduzieren. Diesem Phänomen versucht man durch Humanisierung der Maus-Antikörper entge¬ genzuwirken.
Ein wesentlich einfacherer Lösungsweg wäre die Selektivität, sowie die Effektorfunktionen der Antikörper so zu verbes¬ sern, daß z.B. Mikrometastasen durch eine einmalige oder we¬ nige Gaben (innerhalb einer Woche) von Antikörpern voll¬ ständig eliminiert werden könnten.
Um die Effektivität der Antikörper zu erhöhen, wurden und werden weiterhin Versuche unternommen, nicht nur die Tumor¬ zelle mit einem Antikörper zu besetzen, sondern gleichzeitig eine spezifische Immunantwort des Patienten gegen den Tumor zu induzieren. Dazu wurden bispezifische Antikörper ent¬ wickelt, die mit dem einen Bindungsarm auf der Tumorzelle, mit dem anderen auf Effektorzellen des Immunsystems binden und diese gegen den Tumor redirigieren (Staerz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) , 1453) . Dieses Wirkungsprin¬ zip gilt aber nur für Tumore, die ein tumorspezifisches Antigen besitzen. Da der Mehrzahl der bekannten Tumorarten ein derartiges tumorspezifisches Antigen fehlt, ist dieses Prinzip zur Tumoreliminierung bei den meisten Tumoren nicht anwendbar. Der Einsatz der bisher verfügbaren Antikörper zur Tumorimmuntherapie ermöglicht daher nur in begrenztem Maße eine spezifische Eliminierung der Tumorzellen und ermöglicht insbesondere nicht die spezifische Erkennung und Eliminerung von Tumorzellen, die kein tumorspezifisches Antigen expri¬ mieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Antikörper und diese enthaltende Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, die eine selektive Erkennung und Eliminierung von Zellen in vivo ermöglichen, insbesondere von Tumorzel¬ len, die kein tumorspezifisches Antigen exprimieren. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa¬ tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper mit min¬ destens zwei Spezifitäten, wobei von zwei Antigenbindungs- stellen mit unterschiedlicher Spezifität zwei unterschiedli¬ che auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkannt wer¬ den. Der Begriff Spezifität bedeutet dabei die Fähigkeit eines Antikörpers, ein bestimmtes Antigen zu erkennen. Das Antigen kann dabei von einer oder mehreren Antigenbindungs- stelle(n) des Antikörpers erkannt werden, die wiederum glei¬ che oder unterschiedliche Epitope des Antigens erkennen kön¬ nen. Der Begriff "auf einer Tumorzelle lokalisiertes Anti¬ gen" umfaßt dabei Antigene, die von einer Tumorzelle expri¬ miert werden und derart lokalisiert sind, daß sie von Anti¬ körpern gebunden werden können.
Es konnte nun überraschend gezeigt werden, daß sogenannte bispezifische Antikörper, die zwei verschiedene auf einer Zelle lokalisierte Antigene erkennen, (Parham, Human Immu- nol. 12 (1985) , 213; Wong et al. , J. Immuno1. 139 (1987) , 1369) in vivo dazu verwendet werden können, um spezifisch Zellen zu eliminieren. Dieses Prinzip eignet sich insbeson¬ dere, um spezifisch Tumorzellen zu eliminieren, die kein spezifisches Tumorantigen exprimieren. Hierzu werden Anti¬ körper mit zwei oder mehr Spezifitäten eingesetzt, die eine Kombination von Antigenen erkennen, die ausschließlich oder fast ausschließlich auf Tumorzellen vorkommt.
Im Gegensatz zu den Arbeiten von Parham (s.o.) und Wong (s.o.) , die die Wirkungsweise bispezifischer Antikörper in vitro untersuchten, konnte erstmals gezeigt werden, daß die selektive Bindung und damit verbundene Elimination von be¬ stimmten Zielzellen durch Antikörper mit zwei oder mehr Spe- zifitäten in vivo trotz einer Vielzahl von interferierenden Einflüssen unerwartet hochspezifisch ist. In vivo können unterschiedliche Kompartimente und/oder die Vielzahl von Bindungsmöglichkeiten die Abschwachung der hohen Spezifität bispezifischer Antikörper durch Kreuzreaktionen zur Folge haben.
Es war möglich zu zeigen, daß Antikörper mit zwei Spezifitä- ten, die zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokali¬ sierte Antigene erkennen (siehe Figur 1) , in vivo bei einer bestimmten Konzentration nicht (oder nicht in relevanter Anzahl) an Zellen binden, die nur eines dieser Antigene ex¬ primieren. Unterhalb dieser kritischen Konzentration werden aufgrund der höheren Avidität nur Zellen gebunden und gege¬ benenfalls zerstört, die beide Antigene exprimieren. Die Tu¬ morselektivität kann durch Verwendung derartiger bispezi¬ fischer Antikörper um den Faktor 10-1000 erhöht werden, je nach Affinität der Antigenbindungsstellen des Antikörpers zu den gewählten Antigenen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen im Vergleich zu kon¬ ventionellen Antikörper den Vorteil auf, daß aufgrund einer höheren Antikörper-Dichte auf den Tumorzellen körpereigene Effektormechanismen zur Tumorzerstörung, wie z.B. das Kom¬ plementsystem oder die antikörpervermittelte Zytotoxizitat mittels Fc-Rezeptor tragender Zellen (ADCC) wesentlich effi¬ zienter angreifen oder überhaupt erst den Schwellenwert, der für die Zerstörung der Tumorzelle notwendig ist, überschrei¬ ten. Ferner weisen die erfindungsgemäßen Antikörper den Vorteil auf, daß die Wahrscheinlichkeit, daß Tumorzellen aufgrund der Entstehung von "Escape-Mutanten" nicht mehr erkannt wer¬ den, stark herabgesetzt ist, da zwei verschiedene Antigene auf dem Tumor, innerhalb kurzer Zeit, gleichzeitig herunter¬ reguliert werden müßten.
Bei den auf der Tumorzelle lokalisierten Antigenen, die von den erfindungsgemäßen Antikörpern erkannt werden, kann es sich prinzipiell um beliebige von der Tumorzelle exprimierte Antigene handeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den auf der Tumorzelle lokalisierten Antigenen, die von den er¬ findungsgemäßen Antikörpern erkannt werden, um tumorassozi¬ ierte Antigene.
Der Begriff tumorassoziiertes Antigen bedeutet dabei, daß diese Antigene vorzugsweise von Zellen des zu eliminierenden Tumors exprimiert werden und/oder sich auf derartigen Tumor¬ zellen in höherer Dichte befinden als auf nicht-malignen Zellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erkennt der erfindungsgemäße Antikörper mit mindestens einer Antigenbin- dungsstelle eine tumorassoziiertes Antigen und mit minde¬ stens einer weiteren Antigenbindungssteile ein nicht-tumor¬ spezifisches Antigen, das auch von nicht-malignen Zellen ex¬ primiert wird. Bei diesem Antigen handelt es sich vorzugs¬ weise um ein Antigen, das spezifisch ist für den Zelltyp oder den Gewebetyp des zu eliminierenden Tumors .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erkennt der Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten zwei normale, nicht-tumorspezifische Antigene, die auch von nicht-malignen Zellen exprimiert werden, die in dieser Kombination jedoch ausschließlich oder fast ausschließlich auf der zu eliminie¬ renden Tumorzelle vorkommen. Bei den Antigenen, die auf der zu eliminierenden Tumorzelle lokalisiert sind, handelt es sich vorzugsweise um die fol¬ genden Antigene:
CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD10, CDU, CD13, CD14, CD23, CD24, einen Ig-Idiotyp, CD30, CD33, CD37, CD40, CD41, c-erb-B2, CALLA (CD10) , MHCII, CD44v3, CD44v6, CD71, p97, Gangliosid-GD_2/ GD3, C215, das von dem monoclonalen Anti¬ körper 17-IA erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper 9.2.27 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper NE150 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper L6 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper CA125 erkannte Antigen (Mucin) , das Antigen Lewis y, CD19, CD20, CD21, CD22, B220 oder CD5. In den Beispielen wird erläutert welche Kombinationen dieser Antigene sich für die spezifische Erkennung und Eliminierung bestimmter Tu¬ morarten eignen. Neben den zwei Spezifitäten, die zwei ver¬ schiedene auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erken¬ nen, können die erfindungsgemäßen Antikörper weitere Spezi- fitäten zur Erkennung weiterer Antigene haben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise eine weitere Spezifität, die ein Antigen erkennt, daß spezifisch auf einer Effektorzelle lokalisiert ist. Somit betrifft die vor¬ liegende Erfindung auch trispezifische Antikörper, die zwei auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene als auch ein auf einer Effektorzelle lokalisiertes Antigen erkennen. Unter dem Begriff Effektorzelle werden dabei Zellen verstan¬ den, die aus der Hämatopoese hervorgehen und cytolytische, Apoptose-vermittelnde oder Phagozytose-Eigenschaften besit¬ zen. Insbesondere umfaßt dieser Begriff T-Zellen, Gra- nulocyten, Monocyten, Makrophagen, NK ("natural killer")- Zellen, Mastzellen und Langerhans-Zellen. Bei dem auf der Effektorzelle lokalisierten Antigen handelt es sich vorzugs¬ weise um ein Antigen, das nicht auf der zu eliminierenden Tumorzelle exprimiert wird. Insbesondere handelt es sich da- bei bevorzugt um die Antigene CD3, CD16, CD28, CD32 oder CD64.
Bei den erfindungsgemäßen Antikörper handelt es sich vor¬ zugsweise um monoclonale, chimäre, rekombinante, syntheti¬ sche, halbsynthetische oder chemisch modifizierte Antikör¬ per, sowie um Fragmente derartiger Antikörper, insbesondere Fv, Fab, scFv oder F(ab) 2-Fragmente.
Sind die erfindungsgemäßen Antikörper für eine in-vivo-The- rapie vorgesehen, werden bevorzugt Antikörper oder Derivate oder Fragmente vom Menschen verwendet, oder solche, die der¬ art verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Men¬ schen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z.B. Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405) .
Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörper- typen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig. Die Herstellung monoclonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z.B. Mensch, Ratte, Maus, Ka¬ ninchen oder Ziege haben, kann mittels herkömmlicher Metho¬ den erfolgen, wie sie z.B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975) , 495) , in Harlow und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988) , Cold Spring Harbor) oder in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981) , 3) beschrieben sind. Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA-Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe z.B. Kurucz et al. , J. Immu- nol. 154 (1995), 4576; Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 6444) .
Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spe- zifitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie mög¬ lich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fu¬ sionstechnik (siehe z.B. Milstein et al. , Nature 305 (1983) , 537) . Hierbei werden Hybridomazellinien, die Antikörper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produzieren, fu¬ sioniert und rekombinante Zellinien identifiziert und iso¬ liert, die Antikörper mit beiden Spezifitäten produzieren.
Die Herstellung von Antikörper mit drei Spezifitäten, soge¬ nannte trispezifische Antikörpern, kann beispielsweise der¬ art erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ketten eines bispezifischen Antikörpers eine dritten Antigenbindungs- stelle mit einer weiteren Spezifität, z.B. in Form eines "Single chain variable fragments" (scFv) angekoppelt wird. Das scFv kann beispielsweise über einen
-S-S (G4S)nD-I-Linker an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Glycin, D = Aspartat, I = Isoleucin) . Figur 5 zeigt schema¬ tisch den Aufbau eines derartigen trispezifischen Antikör¬ pers, der das Antigen CD3 mittels des angekoppelten scFv- Fragmentes erkennt.
Analog dazu können trispezifische F(ab) 2-Konstrukte herge¬ stellt werden, indem die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette der anderen Spezifi¬ tät beispielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hinge"-Region) in das codierende Gen, z.B. mittels ho¬ mologer Rekombination entfernt werden (siehe Figur 6) .
Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Kon- strukte. Hierbei werden drei VH-VL-Regionen, die drei ver¬ schiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet (siehe Figur 7) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die er¬ findungsgemäßen Antikörper mit Substanzen gekoppelt, die die Effektorfunktion der Antikörper, die zur Eliminierung der Zielzelle führen, verbessern. Die zeilzerstörende Wirkung von Antikörpern beruht normaler¬ weise auf den Effektorfunktionen der Fc-Region der Antikör¬ per. So können z.B. Fc-Rezeptor-tragende Zellen an eine mit Antikörper besetzte Zelle binden und diese zerstören. Diese auch als ADCC ("antibody dependent cell mediated cytotoxi- city") bezeichnete Reaktion reicht jedoch häufig nicht aus, um effektiv alle Zielzellen zu zerstören.
Bei den Substanzen, die an die in den erfindungsgemäßen Arz¬ neimitteln enthaltenen Antikörper gekoppelt werden können, handelt es sich vorzugsweise um Enzyme, toxische Substanzen, Biotin, Radionuclide oder Superantigene.
In Zusammenhang mit der Kopplung eines Antikörpers mit einem Enzym ist beispielsweise die von Rodrigues et al. (Cancer Res. 55 (1985), 63) beschriebene sogenannte "antibody depen¬ dent enzyme mediated prodrug therapy" (ADEPT) zu nennen. Bei diesem Verfahren wird die Vorstufe einer toxischen Substanz unmittelbar am vorgesehenen Wirkort, beispielsweise an der Tumorzelle, durch ein Enzym, das an den Antikörper gekoppelt ist, aktiviert. Dieses Prinzip ist umso effizienter und freier von Nebenwirkungen, je spezifischer der verwendete Antikörper die Zielzelle erkennt . Ein bevorzugt in dieser Methode verwendetes Enzym ist beispielsweise die ß-Lacta- mase.
Beispiele für toxische Substanzen, die direkt an die erfin¬ dungsgemäßen Antikörper gekoppelt werden können, sind Ricin, Saporin oder Pertussis-Toxin.
Durch die Kopplung der erfindungsgemäßen Antikörper mit Bio¬ tin ist es ferner möglich, an Avidin konjugierte Substanzen an Zielzellen anzureichern.
Vorteilhaft ist dies beispielsweise bei der Applikation von Radionuclid-Avidin-Konjugaten. In diesem Fall werden die Konjugate erst verabreicht, wenn der mit Biotin gekoppelte Antikörper bereits an die Zielzelle gebunden hat. Die Konju¬ gate werden aufgrund der hohen Affinität zwischen Biotin und Avidin sehr spezifisch an den Zielzellen angereichert. Unge¬ bundene Radionuclid-Avidin-Konjugate werden dagegen aufgrund ihrer geringen Größe schnell aus dem Organismus entfernt. Der Vorteil der Verwendung derartiger Antikörper ist eine relative geringe unspezifische radioaktive Belastung des Pa¬ tienten bei ihrer Anwendung.
Ferner können die erfindungsgemäßen Antikörper mit einem Su¬ perantigen gekoppelt sein. Superantigene sind extrem potente Aktivatoren von T-Zellen. Ein Beispiel ist das SEA ("staphylococcal enterotoxin A") . T-Zellen werden durch Su¬ perantigene zur Proliferation sowie zur Freisetzung von Cy- tokinen und der Cytolyse benachbarter Zellen angeregt. Aus¬ gelöst wird diese unkontrollierte, systemische T-Zellak- tivität durch Bindung der Superantigene an konservierte Be¬ reiche von MHCII-Molekülen bzw. die Vß-Kette des T-Zellre- zeptors . Dohlsten et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) , 8945) beschreibt, daß die unspezifische Bindung an MHCII durch eine spezifischere Antigenbindungssteile eines Antikörpers ersetzt werden kann. Dadurch gelingt es, die T- Zellaktivierung wesentlich kontrollierter ablaufen zu las¬ sen. Durch geeignete Kombination der Antigeneigenspezifitä¬ ten eines Antikörpers kann auch hier die Cytolyse-Wirkung der aktivierten T-Zellen auf eine bestimmte Zielzelle be¬ grenzt werden.
Bei der Herstellung von Antikörpern, die mit einem Superan¬ tigen gekoppelt sind, wird beispielsweise eine der schweren Immunglobulinketten eines Antikörpers oder Antikörperfrag¬ mentes um eine T-Zell-aktivierende Superantigensequenz ver¬ längert. Dabei kann diese Sequenz z.B. über einen
-S-S (G4S)nD-I-Linker mit einer der schweren Ig-Ketten verbunden sein. Das Anfügen der Linker- und Superantigensequenzen an die schwere Ig- Kette kann beispielsweise mittels homologer Rekombination auf DNA-Ebene in einer Hybridomazellinie stattfinden (Land und Mocikat, Mol. Gen. Genet. 242 (1994) , 528) . Eine derar- tige Konstruktion eines bispezifischen Antikörpers mit einer Superantigensequenz ist beispielhaft in Figur 2 gezeigt. Ferner ist es möglich, F (ab) 2-Fragmente mit einem Superanti¬ gen zu koppeln. Dies ist in Figur 3 beispielhaft für ein bispezifisches F (ab) 2-Fragment gezeigt. In diesem Fall wer¬ den die CH2, CH3-Regionen einer schweren Immunglobulinkette durch eine Superantigensequenz ersetzt, während die CH2, CH3-Regionen der anderen schweren Immunglobulinkette durch den Einbau eines Stopcodons mittels homologer Rekombination entfernt wurden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, sogenannte "Single chain variable fragments" (scFv) mit einem Superantigen zu koppeln. Dies ist beispielhaft für ein derartiges bispezifi¬ sches Fragment in Figur 4 gezeigt. Hierbei werden beispiels¬ weise lediglich die V-Regionen mit verschiedener Spezifität aneinandergekoppelt bei vollständiger Entfernung der kon¬ stanten Antikörperregionen und anschließend wird an eine der V-Regionen wie oben beschrieben eine Superantigensequenz ge¬ koppelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arz¬ neimittel, die Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, vorzugsweise bispezifische Antikörper, enthalten, wobei der Antikörper mindestens zwei unterschiedliche auf einer Ziel- zelle lokalisierte Antigene erkennt. Bei der Zielzelle kann es sich generell um jede beliebige Zelle handeln, vorzugs¬ weise um eine Zelle, die eliminiert werden soll, beispiels¬ weise eine Tumorzelle. Bei den auf der Zielzelle lokalisier¬ ten Antigenen handelt es sich vorzugsweise um Antigene, die in dieser Kombination ausschließlich oder fast ausschlie߬ lich von der Zielzelle exprimiert werden. Die in den Arznei¬ mitteln enthaltenen Antikörper können wie oben beschrieben modifiziert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die oben beschriebene erfindungsgemäßen Anti¬ körper enthalten. Derartige Arzneimittel können neben den Antikörpern gängige, dem Fachmann geläufige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe enthalten.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Antikörpern mit zwei oder mehr Spezifitäten, vorzugsweise bispezifischen Antikörpern, die mindestens zwei unterschied¬ liche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo Immunthera¬ pie.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Antikörpern um die oben beschriebenen erfindungsgemäßen An¬ tikörper.
Bei der Immuntherapie handelt es sich vorzugsweise um eine Therapie zur Behandlung von Tumoren, insbesondere von Leu¬ kämien, besonders bevorzugt von B-Zeil-Lymphomen oder T- Zell-Lymphomen, kolorektalen Karzinomen, Melanomen, Ovarial- Karzinomen, Glioblastomen (maligne Gliome) oder Mamma-Karzi- nomen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Zu¬ sammensetzungen, die Antikörper mit zwei oder mehr Spezi- fitäten enthalten, die mindestens zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennen, oder die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper.
Figur 1 zeigt die prinzipiell Wirkungsweise bispezifischer Antikörper
Figur 2 zeigt schematisch einen mit einer Superantigen¬ sequenz gekoppelten bispezifischen Antikörper Sag = Superantigensequenz bsAK = bispezifischer Antikörper
Figur 3 zeigt schematisch ein bispezifisches F(ab)2- Superantigenkonstrukt Sag = Superantigensequenz bsF(ab)2 = bispezifisches F(ab) 2-Fragment Figur 4 zeigt schematisch ein bispezifisches "Single chain variable fragment"-Superantigen-Konstrukt Sag = Superantigensequenz bs-scFv = bispezifisches "Single chain variable fragment"
Figur 5 zeigt schematisch einen trispezifischen Antikör¬ per, bei dem ein "single chain variable fragment", das CD3 erkennt, über einen Linker an eine der schweren Ketten eines bispezifischen Antikörpers gekoppelt wurde. triAK = trispezifischer Antikörper
Figur 6 zeigt schematisch ein trispezifisches F(ab)2- Konstrukt, bei dem eine schwere Kette eines bispe¬ zifischen Antikörpers durch ein scFv-Fragment er¬ setzt wurde, das CD3 erkennt, und bei dem die andere schwere Kette entfernt wurde.
Figur 7 zeigt schematisch ein trispezifisches scFv-Kon- strukt
Figur 8 zeigt die Ergebnisse von den zwei in Beispiel 9 beschriebenen Versuchen, bei denen SCID-Mäusen Thymomzellen injiziert wurden und die Mäuse an¬ schließend mit bispezifischen Antikörpern zur De- pletion der Thymomzellen behandelt wurden. Dargestellt ist die Überlebensrate in % der behan¬ delten Tiere im Verlauf der Zeit.
Die Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von B-Zell-Lyτπphomen
Um selektiv B-Zell-Lymphomzellen zu eliminieren, bieten sich folgende Antigenkombinationen an, die mit bispezifischen (bsAk) Antikörpern spezifisch erkannt werden können: a) anti-CALLA (CD10) X anti-CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23, CD24)
CALLA ist ein lymphomassoziierter Proliferationsmarker; CD19-CD24 sind B-Zellmarker. Tumorzellen, die diese Anti- genkombination tragen, werden von einem bsAk mit den oben genannten Spezifitäten depletiert; native B-Zellen, die le¬ diglich B-Zellmarker (CD19-24) tragen und kein CALLA Antigen exprimieren, werden dagegen nicht depletiert.
b) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3) X CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23, CD24)
Die CD44 Variante v6 wird verstärkt während der Tumorpro¬ gression exprimiert (Mulder et al. , Lancet 34 (1994), 1470); CD19-CD24 s. o.
c) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3) X anti-CALLA
d) anti-B220 X anti-CD5
CD5 wird häufig auf B-CLL oder zentrozytischen Lymphomen ex¬ primiert. B220 ist ein B-Zellmarker.
e) anti-CD19 (oder CD20, CD21, CD22, CD23 , CD24) X anti-CD5
f) anti-MHCII X anti-CD5 (oder anti-CALLA, anti-CD44v6, anti-B220, anti-CD19 bis 22, oder anti-CD24) B-Zell-Lymphome exprimieren häufig MHCII.
Beispiel 2 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von kolorektalen Karzinomen
Um selektiv kolorektale Karzinome zu eliminieren, bieten sich Antikörper mit folgenden Spezifitäten an: a) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3) X 17-1A
17-IA ist ein monoclonaler Antikörper der ein mit Kolorek- talen-Karzinom-Zellen und Mamma-Karzinom-Zellen assoziiertes Antigen erkennt (Herlyn et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) , 1438) .
b) anti-p97 X 17-IA p97 ist ein mit Kolon-Karzinomen und Melanomen assoziiertes Antigen (Hellström et al. , J. Immunol. 127 (1981) , 157) .
c) anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3) X anti-p97
d) anti-C215 X 17-1A
C215 ist ein Kolon-Adenokarzinom bzw. Mammakarzinom-asso- ziiertes Antigen. Es handelt sich dabei um ein Epitop, das ebenfalls auf dem tumorassoziierten Antigen GA-733-2 vor¬ kommt und folgende Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben-Code aufweist :
AKPEGALQNNDGLYDPDXD (Björk et al. , J. Biol. Chem. 268 (1993) , 24232) .
e) anti-C215 X anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3)
f) anti-C215 X anti-p97
Beispiel 3 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Melanomen
Zur Eliminierung von Melanomzellen bieten sich folgende Kom¬ binationen an:
a) anti-p97 X anti-CD44v6 (oder anti-CD44v3) b) anti-p97 X 9 .2 .27
Der monoclonale Antikörper 9.2.27 bindet auf einem Melanom- assoziierten Glykoprotein (Morgan et al. , Hybridoma 1 (1981) , 27) .
c) anti-GD3 X 9.2.27
Der monoclonale Antikörper anti-GD3 bindet auf einem Mela- nom-assoziierten Protein (Dippold et al. , Eur. J. Cancer Clin. One. 21 (1988) , 65) .
d) anti-CD71 X 9.2.97 (oder anti-p97 oder anti-GD3)
Beispiel 4 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Mamma-Karzinomen
Mamma-Karzinome können beispielsweise durch Antikörper mit folgenden Spezifitäten erkannt werden:
a) L6 X anti-c-erb-B2
L6 ist ein monoclonaler Antikörper, der ein mit Mamma-Karzi- nom assoziiertes Antigen erkennt (Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sei USA 84 (1987) , 3439) . c-erb-B2 ist ein mit Mamma- und Ovarial- Karzinomen assoziiertes Antigen.
b) L6 X anti-C215
c) anti-C215 X anti-c-erb-B2
d) anti-Lewis y X anti-c-erb-B2 (oder L6 oder anti C215)
Das Antigen Lewis y ist beispielsweise beschrieben in Pastan et al. (Cancer Res. 51(1991) , 3781) . Beispiel 5 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Ovarial-Karzinomen
Zur Erkennung von Ovarial-Karzinomen bietet sich die Kom¬ bination an:
anti-Mucin (CA125) X anti-c-erb-B2.
Der monoclonale Antikörper CA125 erkennt ein auf Ovarial Karzinomen stark exprimiertes Antigen (Larson et al. , Int. J. Cancer 42 (1988) , 877) .
Ferner bieten sich die Kombinationen anti-C215 X anti-Mucin (CA125) oder anti-C215 X anti-c-erb-B2 an.
Beispiel 6 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung eines malignen Glioms (Glioblastom)
Die Erkennung von Glioblastomen kann beispielsweise durch folgende Kombinationen erfolgen:
NE150 X 9.2.27
Die monoclonalen Antikörper NE150 (Nitta et al. , Lancet 335 (1990), 368) und 9.2.27 (Schrappe et al. , Cancer Res. 51 (1991) , 4986) binden beide auf unterschiedlichen Gliom-asso- ziierten Antigenen. Beispiel 7 :
Antikörper zur spezifischen Erkennung und Eliminierung von Neuroblastom-Zellen
Zur Erkennung von Neuroblastomzellen bieten sich Antikörper an, die das Antigen Ganliosid GD_2 in Kombination mit einem weiteren Neuroblastom-spezifischen Antigen oder einem Zell- oder gewebespezifischen Antigen erkennen.
Beispiel 8 :
Antikörper zur Erkennung und Eliminierung von weiteren Leukämien
Für die Erkennung und Eliminierung von T-Zell- und myeloi- schen sowie nicht eindeutig klassifizierbaren Leukämien bie¬ ten sich Antikörper an, die Kombinationen der folgenden Antigene erkennen:
CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD10, CDU, CD13 , CD14, CD23, CD24, CD31, CD33, CD37, CD40, CD41 und CD71.
Beispiel 9 :
Selektive Depletion von Tumorzellen in vivo
Um die Anwendbarkeit des Prinzips der "selektiven Depletion" mittels bi- und, davon abgeleitet, tri-spezifischer Antikör¬ per zur Zerstörung von Tumorzellen in vivo zu prüfen, wurden 2xl04 syngene ST-1-Thymomzellen mit dem Phänotyp CD4+, CD8+, Thy-1.2+ in SCID-Mäuse injiziert. Da bei der SCID-Maus die normale T-Zell-Reifung gestört ist, werden in derartigen Tieren so gut wie keine CD4+ und CD8+ Zellen gebildet. Es werden aber Thy-1.2+, CD4-, CD8- Zellen gebildet, die etwa 20% der Zellen im peripheren Blut ausmachen. Zur selektiven Depletion der Tumorzellen wurde ein bispezifischer Antikör- per (bsAk) mit den Spezifitäten anti-Thy-1.2 x anti-CD8 ver¬ wendet .
Vier Tage nach Tumorzeil-Injektion wurden den Tieren (6+6, Versuche 1+2) 10μg des o.g. bispezifischen Antikörpers in¬ jiziert bzw. die äquimolare Menge an parentalen anti-CD8 und anti-Thy-1.2 Antikörpern (ebenfalls 12 Tiere, Versuche 1+2) oder kein Antikörper (12 Tiere, Versuche 1+2) . Während sämt¬ liche Tiere, die keinen bsAk erhalten hatten, starben, über¬ lebten 5 der 12 mit bsAk behandelten Tiere bei allgemeiner Lebenszeitverlängerung (statistisch signifikant im log rank Test, p<0,02) (siehe Figur 8) . Darüberhinaus wurde im peri¬ pheren Blut der mit bsAk behandelten Mäuse kein Rückgang der Thy-1.2+, CD4-, CD8- Zellen festgestellt, während die Kombi¬ nation der parentalen Antikörper (anti-Thy-1.2, anti-CD8) zu einem Rückgang von 20% auf 11% dieser Zellen führte. Letz¬ tere Beobachtung zeigt, daß bei einer bestimmten Serumkon¬ zentration des bsAk im Blut eines behandelten Patienten be¬ vorzugt Zellen, die beide Antigene exprimieren, von derar¬ tigen bsAk attackiert werden, während Zellen, die nur eines der beiden Zielantigene exprimieren, verschont bleiben.
Beispiel 10:
Selektive Depletion von (CD8+ X Thyl.2+) -T-Zellen durch bispezifische Antikörper in vivo
In einem weiteren Versuch wurde normalen immunkompetenten BALB/c-Mäusen ebenfalls der in Beispiel 9 beschriebenen bsAk sowie die dazugehörigen parentalen Antikörper in den angege¬ benen äquimolaren Mengen injiziert.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 1 darge¬ stellt. Zur Erläuterung der Tabelle: RmCD8-6 = Antikörper mit Spezifität anti-CD8; MmTl = Antikörper mit Spezifität anti-Thy-1.2 ,- bsAk = bispezifischer Antikörper; BiB = bispe¬ zifischer Antikörper mit den Spezifitäten RmCD8-6 x MmTl. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, depletieren 5μg des bsAk BiB spezifisch die (CD8+, Thy-1.2+) -Zellen fast vollständig von 14,5% auf 0,8%, während die (CD4+, Thy-1.2+) -Zellen bei der verabreichten Antikörperdosis verschont bleiben. Die äquimolare Menge an parentalen Antikörpern 2,5+2,5 μg depletiert lediglich CD8+ Lymphozyten, auf denen beide parentalen Ak binden können, marginal von 14,5% auf 12,6%. Erklärt werden kann diese Beobachtung durch einen geringeren Antikörper-Besatz auf den CD8+ Lymphozyten durch die paren¬ talen Antikörper im Vergleich zu dem bsAk, da die parentalen anti-Thy-1.2 Antikörper auch auf z.B. CD4+ Lymphozyten bin¬ den, sich dadurch auch auf anderen Geweben verteilen und so¬ mit bei dieser geringen Anktikörpergabe die CD8+ Lymphozyten nicht mehr zu 100% absättigen können. D.h. bei dieser gerin¬ gen Antikörperkonzentration kann der zur Lyse der Zielzellen mittels ADCC notwendige Schwellenwert für den Anti¬ körperbesatz (fast) nur noch von den bsAk aufgrund deren hö¬ herer Selektivität für die Zielzellen erreicht werden.
Tabelle 1: Depletion von CD4+ und CD8+ T-Zellen mittels parentaler und bispezifischer Antikörper nach 4 Tagen
Lymphknoten (Balb/c)
inj . Antikörper [μg] Thy-1.2+/CD4+% Thy-1.2+/CD8+%
RmCD8-6 5 52,6 11,8
RmCD8-6 + MmTl 2,5+2, 5 49,3 12,6
RmCD8-6 + MmTl 5+5 47,8 10
BiB 5 59,9 0,8
Kontrolle - 40,4 14,5

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Antikörper mit mindestens zwei Spezifitäten, dadurch gekennzeichnet, daß von mindestens zwei Antigenbindungs- stellen mit unterschiedlicher Spezifität zwei unter¬ schiedliche auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkannt werden.
2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli¬ che auf der Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, zwei verschiedene tumorassoziierte Antigene erkannt wer¬ den.
3. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli¬ che auf der Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, mindestens eine Antigenbindungssteile ein tumorassozi¬ iertes Antigen erkennt und mindestens eine weitere Anti- genbindungssteile ein Antigen erkennt, das auch von nicht-malignen Zellen exprimiert wird.
4. Antikörper nach Anspruch 3, wobei das Antigen, das auch von nicht-malignen Zellen exprimiert wird, ein Antigen ist, das spezifisch für den Zeil- oder Gewebetyp des Tumors ist.
5. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Antigenbindungsstellen, die zwei unterschiedli¬ che auf einer Tumorzelle lokalisierte Antigene erkennen, zwei nicht-tumorspezifische Antigene erkannt werden, die in Kombination ausschließlich oder fast ausschließlich auf der Tumorzelle vorkommen.
6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die auf der Tumorzelle lokalisierten Antigene die Antigene CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD10, CDU, CD13 , CD14, CD23, CD24, einen Ig-Idiotyp, CD30, CD33, CD37, CD40, CD41, c-erb-B2, CALLA (CD10) , MHCII, CD44v3, CD44v6, CD71, p97, Gangliosid-GD_2, GD3 , C215, das von dem monoclonalen Antikörper 17-lA-erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper 9.2.27 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper NE150 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper L6 erkannte Antigen, das von dem monoclonalen Antikörper CA125 erkannte Antigen (Mucin) , das Antigen Lewis y, CD19, CD20, CD21, CD22, B220 oder CD5 sind.
7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Antikörper eine weitere Spezifität besitzt, die ein auf einer Effektorzelle lokalisiertes Antigen erkennt.
8. Antikörper nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das auf der Effektorzelle lokalisierte Antigen nicht auf der Tumorzelle vorhanden ist.
9. Antikörper nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich¬ net, daß es sich bei dem auf der Effektorzelle lokali¬ sierten Antigen um das Antigen CD3 , CD16, CD28, CD32 oder CD64 handelt.
10. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich um einen monoclonalen Antikörper, einen durch rekombinante DNA-Technologie hergestellten Antikörper, eine halbsynthetischen oder synthetischen Antikörper, um einen chemisch modifizierten Antikörper oder um ein Fragment eines solchen Antikörpers handelt.
11. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Antikörper gekoppelt ist mit einem Enzym, einer toxi¬ schen Substanz, einem Radionuclid, Biotin oder einem Superantigen.
12. Arzneimittel enthaltend mindestens einen Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Trä¬ gerstoff .
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.
14. Verwendung eines Antikörpers mit zwei oder mehr Spezifi- täten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo Immuntherapie.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Immunthe¬ rapie eine Therapie zur Behandlung eines Tumors ist.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Tumor eine Leukämie, ein kolorektales Karzinom, ein Melanom, ein Ovarialkarzinom, ein Glioblastom (malignes Gliom) oder ein Mamma-Karzinom ist.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Leukämie ein B- Zell-Lymphom oder ein T-Zell-Lymphom ist.
19. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend mindestens einen Antikörper mit zwei oder mehr Spezifitäten, der zwei unterschiedliche auf einer Zielzelle lokalisierte Antigene erkennt.
20. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der Antikörper ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ist.
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