CN110590955B - 一种双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种方法，该方法的核心是一个抗人PD‑L1的抗体，使用该抗人PD‑L1的抗体与抗人CD3的抗体组成一个双特异性抗体。此双特异抗体可同时结合T细胞和表达PD‑L1或诱导表达PD‑L1肿瘤细胞并杀伤结合的肿瘤细胞。该方法既可以绕过TCR和MHC‑I抗原的限制同时也解决PD‑L1诱导表达后与T细胞表面的PD‑1结合导致的免疫抑制。从而更有效地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。

Description

一种双特异性抗体

相关申请

本申请要求申请日为2018年09月17日，发明名称为“一种双特异性抗体”的中国专利申请201811082753.6的优先权。

发明领域

本发明属于生物医药领域，具体的，涉及一种治疗表达PD-L1或可诱导表达PD-L1肿瘤的双特异抗体。

发明背景

高等动物的免疫系统被机体自身精密地控制稳定平衡状态，在这种状态下，免疫系统既能对外来入侵者或自体发生的异常快速反应并清除，又能在清除异常后减弱免疫反应并保持静息状态。参与调控维持免疫状态的有许多因子，其中包括一些免疫刺激因子，如CD40,CD137,OX40,CD28,CD27,CD3等等，以及一些免疫抑制因子，如PD-1,PD-L1,CTLA4,LAG-3,TIM-3等等。这些免疫抑制因子通常被称为免疫检查点。近几年，这些免疫检查点在肿瘤的发生发展及肿瘤的治疗中发挥的作用得到了长足的阐明和应用。

PD-1是表达在T细胞表面的受体蛋白，当T细胞激活时，其表面的PD-1表达上调。当PD-1与其配体PD-L1结合时，PD-1开始发挥抑制作用使T细胞处于耗竭状态，不再能发挥免疫杀伤作用。PD-L1是表达在细胞表面的蛋白质，通常表达在正常的外周组织的细胞上，但许多肿瘤组织也组成型地表达PD-L1蛋白，从而经过PD-1/PD-L1信号轴心，有效地抑制了T细胞对肿瘤组织的杀伤，达到了肿瘤逃逸的目标。

针对这一肿瘤逃逸机制，已经研发出若干单克隆抗体，阻止PD-1和PD-L1的结合，解除PD-1对T细胞的抑制，恢复T细胞对肿瘤组织的杀伤作用。这些单克隆抗体包括抗PD-1的抗体，如百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)研发的纳武单抗(Nivolumab，商品名Opdivo)和默沙东(Merck&Co.Inc)研发的派姆单抗(Pembrolizumab，商品名Keytruda)，已分别于2015年和2016年获得美国FDA的临床使用许可，用于治疗黑色素瘤，肠癌，头颈癌，胃癌，宫颈癌，非霍金氏淋巴瘤，霍金氏淋巴瘤，非小细胞肺癌，Merkel细胞癌，尿道上皮癌，肾癌，肝细胞癌等等。针对PD-L1的抗体有基因泰克公司(Genentech)的Atezolizumab(商品名Tecentriq)，2016年获美国FDA批准，用于治疗尿道上皮癌和非小细胞肺癌；默克(MerckKGaA)和辉瑞(Pfizer)联合研制的Avelumab(商品名Bavencio)2017年批准用于Merkel细胞癌及尿道上皮癌；以及阿斯利康公司(Astra Zeneca)研制的Durvalumab(商品名Imfinzi)2017年批准用于非小细胞肺癌和尿道上皮癌。

单克隆抗体由于其对靶点的特异性和高亲和力，早已用于肿瘤，自身免疫等疾病。这方面的例子有基因泰克公司(Genentech)研制的针对血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抗体贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin中文名安维汀)用于抗肿瘤的血管生成，针对肿瘤表面受体Her2的曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin，中文名赫赛汀)，用于治疗Her2阳性乳腺癌，针对B细胞表面蛋白的利妥昔单抗(Rituximab,商品名Rituxan，中文名美罗华)，用于治疗B细胞淋巴瘤。雅培公司研制的针对肿瘤坏死因子(TNF)的阿达木单抗(Adalimumab,商品名Humira，中文名修美乐)，用于治疗风湿性关节炎和强直性脊柱炎。罗氏公司(Roche)研制的针对白介素6(IL-6)的托珠单抗(Tocilizumab，商品名Actemra),用于治疗风湿性关节炎，也用于治疗肿瘤免疫治疗过程中发生是细胞因子风暴。截止2017年，FDA已经批准超过50多个单克隆抗体药物。

单克隆抗体只能识别一个单一的靶点，这既赋予单克隆抗体特异性的优势，也因此而受到靶点特异性的限制。近年来，抗体类药物研发的另一个趋势是双特异抗体。所谓双特异抗体是指一个抗体分子的可变区有两个特异性结构，可以同时结合两个抗原。双特异抗体除了极少数通过杂交瘤产生的“天然”分子如同时抗人EpCam和CD3的Catumaxomb之外，绝大部分都是通过基因工程的方法将两个单克隆抗体分子以某种融合蛋白的形式的表达和生产。

双特异抗体的构成形式大致可以分成包含抗体Fc区域和不含Fc区域两种类型。包含Fc区域的结构形式因为保留了Fc的功能而具有Fc所带来的特点比如半衰期比较长，可以诱导ADCC和CDC，易于纯化等。不含Fc区域的结构形式具有比较小的分子量，可以在原核生物，并且具有比较好的组织穿透能力，可以达到病灶内部。包含Fc区域的双特异分子形式有Triomab,Knob-in-hole IgG,CrossMab,ortho-Fab IgG,DVD-IgG，Two-in-one IgG,IgG-scFv,scFv2-IgG,Y-Body,FIT-IG等形式，而不含Fc的结构形式有BiTE，DART，TandAbs,bi-Nanobody等等。

在作用机制方面，双特异抗体大致可以分成三类，即双靶点信号阻断，连接蛋白形成功能性复合体，以及介导免疫细胞杀伤。在第一种机制中双特异抗体中的两个抗体可变区分别结合两个不同的靶点，阻断这两个靶点所驱动的信号通路，从而达到阻止肿瘤生长的目的。另一种机制是双特异抗体结合两个蛋白，使这两个蛋白接近并形成功能性复合体。这一机制的例子有罗氏代号为RG6013双特异抗体Emicizumab，商品名HemiLibra。该双特异抗体取代凝血因子VIII，一端结合凝血因子IXa,另一端结合凝血因子X,形成功能性复合体，可以有效地治疗凝血因子VIII功能缺陷所引起的甲型血友病。双特异性抗体还有一种重要的机制是介导免疫细胞的杀伤。这种双特异抗体一个可变区结合肿瘤细胞表面蛋白，一个可变区结合免疫细胞表面的分子，并激活相应的免疫细胞杀伤功能。免疫细胞的类型有T细胞，NK细胞和巨噬细胞，其结合的抗原分别是T细胞的CD3,NK细胞的CD16，巨噬细胞表面的CD47。这一类双特异抗体成功的例子有安进公司(Amgen)的Blinatumomab(商品名Blindcyto)。该抗体分子的一个可变区以scFv形式结合CD19，另一个可变区以scFv形式结合CD19，两个scFv以一段蛋白质连接子相连。当双特异抗体结合B细胞淋巴瘤表面的CD19并因其抗CD3的scFv结合T细胞从而在T细胞和B淋巴瘤细胞之间形成免疫突触，同时抗CD3的scFv激活T细胞释放穿孔素(Perforin),颗粒酶(Granzyme)和伽马干扰素(IFN)等活性分子杀死B淋巴瘤细胞。像Blincyto这样的双特异抗体被称为T细胞接触型双特异抗体。

在人体自身对肿瘤细胞杀伤的各种手段中，CD8阳性T细胞的杀伤能力最为有效和特异。CD8+T细胞通过其表面特异的TCR(T细胞受体)识别肿瘤细胞表面由MHC-I复合体所递呈的抗原，然后再在T细胞和肿瘤细胞之间形成免疫突触，由TCR激活的T细胞释放穿孔素(Perforin),颗粒酶(Granzyme)和伽马干扰素(IFN)，肿瘤坏死因子(TNF)等，完成对肿瘤细胞的杀灭。在这一过程中，至少有两个必要条件即特异性TCR和MHC-I限制的多肽抗原。在许多肿瘤类型和病人中恰恰会出现具备识别肿瘤抗原的TCR阳性T细胞不足甚至缺乏的情况。另一方面，许多肿瘤细胞表面也缺乏肿瘤特异性抗原，因而不足以让T细胞识别并杀灭。而T细胞接触型双特异抗体正好解决了这两个局限，其一端是抗CD3的激动剂型抗体可以绕过TCR而直接结合并激活T细胞，另一方面，其另一端的抗体结合的是肿瘤细胞表面的蛋白质，可以绕过MHC的限制。

但是，在T细胞激活的过程中，T细胞同时会表达PD-1并分泌IFN，IFN可以诱导肿瘤细胞表达PD-L1。随着PD-1和PD-L1的逐渐表达，T细胞的免疫状态逐渐由激活转为抑制或耗竭。这样的过程本来是机体正常的免疫调节以免因过度免疫造成伤害或自身免疫疾病，但在肿瘤的发生发展过程中这样的过程会导致肿瘤的免疫逃逸或耐受。

基于这种假设，本发明提出一种方法，该方法既可以绕过TCR和MHC-I抗原的限制同时也解决PD-L1诱导表达后与T细胞表面的PD-1结合导致的免疫抑制。该方法的核心是一个抗人PD-L1的抗体与抗人CD3的抗体组成一个双特异性抗体。

发明内容

本发明目的在于提供一种抗人PD-L1的单克隆抗体序列用于构架同时抗人PD-L1和人CD3的双特异抗体。此双特异抗体可同时结合T细胞和表达PD-L1或诱导表达PD-L1d肿瘤细胞并杀伤结合的肿瘤细胞。

为达到上述目标，本发明提供了以下技术方案

在一个方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述抗体含有SEQ ID NO:1所示重链可变区序列和SEQ ID NO：2所示的轻链可变区序列。

在优选的实施方式中，本发明可以使用一种抗人CD3抗体的序列与上述抗人PD-L1抗体构建制备双特异抗体，所述抗人CD3抗体含有SEQ ID NO：3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所述的轻链可变区序列。

在进一步优选的实施方式中，本发明所述抗人PD-L1抗体可以以scFv形式表达，即重链可变区和轻链可变区表达在同一条多肽链中，中间以GlyGlyGlyGly SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer连接。

在进一步优选的实施方式中，本发明所使用的抗人CD3抗体可以以scFv形式表达，即重链可变区和轻链可变区表达在同一条多肽链中，中间以GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly SerGlyGlyGlyGly Ser连接。

在进一步优选的实施方式中，本发明所使用的抗人PD-L1的scFv抗体和抗人CD3的scFv抗体可以按SEQ ID NO：9所示表达在同一条多肽链中。该多肽序列的N端附加有一段信号肽，可以使表达的多肽(蛋白质)分泌到细胞外。在该多肽链的C段是串联的6个组氨酸，可以用来进行Ni柱亲和层析。

在其他实施方式中，所述双特异抗体中抗人PD-L1抗体可以以Fab或(Fab)2的形式表达。

在其他实施方式中，所述双特异抗体中抗CD3抗体可以由其他重链可变区和轻链可变区组成。

在其他实施方式中，所述双特异抗体中抗人CD3抗体可以以Fab或(Fab)2的形式表达。

在其他实施方式中，所述双特异抗体可以包含人IgG1或人IgG2或人IgG4的Fc区域，以增加所述双特异抗体的半衰期，并引进ADCC和ADC功能。

在其他实施方式中，所述双特异抗体所使用的Fc区域可以进一步进行工程改变以便更有效地延长半衰期，或更有效的施行ADCC或CDC功能，或减弱甚至ADCC或CDC功能。

在其他实施方式中，所述双特异抗体所使用的Fc区域可以进一步进行工程改变以便减弱甚至消除ADCC或CDC功能。

在另一方面，本发明提供一种表达所述双特异抗体的表达载体或宿主细胞，包含上述抗体的核苷酸序列。所述表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体

在另一方面，本发明提供一种本发明所述双特异抗体或其在药学上可接受的复合物在制备治疗表达PD-L1或可诱导表达PD-L1肿瘤的药物中的应用。

本发明的主要优点是：

A.不受特异性TCR的限制；B.不受MHC-I型肿瘤抗原的限制；C.阻断肿瘤表面PD-L1与T细胞表面PD-1的结合，解除由PD-1和PD-L1结合所致的免疫抑制；D.T细胞激活过程中IFN所诱导表达的肿瘤表面PD-L1可将PD-L1阴性细胞变成PD-L1阳性细胞，成为该双特异抗体的新的目标细胞。

具体的实施方式

编码序列

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

制备方法：

一种方法是用重组技术产生本发明双特异抗体。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产重组双特异抗体。一般来说有以下步骤：

(1)将编码本发明双特异抗体的多核苷酸或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组双特异抗体可在细胞内或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。本发明的双特异抗体可以使用SEQ ID NO：9中所包含的寡聚组氨酸标签进行初步亲和纯化。如果构建的双特异抗体包含Fc区域，则可以用蛋白质A或蛋白质G亲和柱进行初步纯化。

所述药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。

药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油。另外这些载体中还可能存在辅助性的物质，抗冻剂pH缓冲物质等。

药物可以选择冻干制剂的形式以便提高稳定性或利于运输。

药物可以选择以缓释的制剂的形式以便提高药物在体内的稳定性以及维持血药浓度。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1.所述双特异抗体实施例PL56表达纯化后不同的组分在SDS-PAGE电泳的结果。Lane 3.蛋白质分子量标志；Lane 4.阴离子纯化后产物；Lane 5.阳离子纯化组分1；Lane6.阳离子纯化组分2；Lane 7&Lane 8.其他类似双抗产品纯化产物。

图2.所述双特异抗体实施例PL56表达纯化后终产品分子筛HPLC分析的结果。显示主峰占所有蛋白质94％。

图3.所述双特异抗体实施例PL56纯化后终产品对CD3和PD-L1蛋白质的亲和力测定。结果显示，PL56终产物对CD3蛋白质分子的亲和力约为6.6nM,对PD-L1的亲和力约为17.3nM.

图4.所述双特异抗体实施例PL56纯化后终产品对表达CD3和PD-L1细胞的亲和力测定。结果显示，PL56对细胞表面CD3蛋白质分子的亲和力约为30.8nM,对细胞表面的PD-L1的亲和力约为68.6nM。Y111是一个对照。左：PL56与CD3阳性细胞的结合曲线；中：PL56与PD-L1阳性细胞的结合曲线；右：PL56对CD3阳性和PD-L1阳性细胞亲和力总结。

图5.所述双特异抗体实施例PL56阻断PD-L1结合PD-1。Anti-PDL1 Ab是一个阳性对照，G39是阴性对照。结果显示，PL56和Anti-PDL1 Ab均可阻断PD-L1结合PD-1，而PL56比Anti-PDL1 Ab阻断能力要弱。G39无法阻断PD-L1和PD-1结合。

图6.所述双特异抗体实施例PL56发挥桥联作用，将肿瘤靶细胞和免疫细胞结合在一起，形成细胞结团。左侧图为未加PL56的免疫细胞和靶细胞混合物；右侧图为加了PL56的免疫细胞和靶细胞混合物。显微镜下明显可见细胞结团。

图7.所述双特异抗体实施例PL56杀伤组成型表达PD-L1的肿瘤细胞MDA-MB-231细胞。本图为五次重复实验的结果。显示PL56确能介导PBMC对肿瘤的杀伤，其EC50小于1ng/ml。

图8.所述双特异抗体实施例PL56杀伤诱导型表达PD-L1的肿瘤细胞A549。本图为三次重复实验的结果。显示PL56确能介导PBMC对肿瘤的杀伤。

图9.所述双特异抗体实施例PL56所介导的T细胞的激活可以诱导A549细胞表达PD-L1。结果显示PL56在24小时和48小时都能介导PD-L1的诱导表达。24小时的PD-L1表达的MFI值接近30000，48小时的PD-L1表达的MFI值接近50000，都超过阴性对照G39在24和48小时的所介导的PD-L1诱导表达。

图10A和图10B.比较所述双特异抗体PL56和PDL1单克隆抗体对组成型表达PD-L1的工程化CHO细胞CHO-PDL1和PD-L1表达阳性的乳腺癌细胞MDA-MB231细胞的杀伤作用。本图为五次重复实验的结果。在图10A中，效应细胞：人PBMC(外周血单个核细胞，含T细胞)，

靶细胞：CHO-PDL1＝工程化CHO细胞表达PD-L1，抗体：mAb＝PDL1单克隆抗体，PL56＝PDL1XCD3双特异抗体，结果显示PL56双抗的EC50为142.5ng/ml，而PD-L1单克隆抗体对MDA-MB-231细胞没有杀伤。在图10B中，效应细胞为人PBMC(外周血单个核细胞，含T细胞)，靶细胞：PD-L1表达阳性的乳腺癌细胞MDA-MB231，抗体：mAb＝PDL1单克隆抗体，PL56＝PDL1XCD3双特异抗体。结果显示，PL56双抗的EC50为1.732ng/ml，而PD-L1单克隆抗体的EC50为1.175E18，杀伤力很低。因此，图10A和图10B显示，PL56的确能介导PBMC对表达PD-L1的肿瘤细胞或其它细胞例如CHO-PDL1的杀伤。并且，双特异抗体PL56对于表达PD-L1的肿瘤细胞或其它细胞例如CHO-PDL1的杀伤能力显著优于PDL1单克隆抗体。

实施例1

双特异抗体的表达与纯化

(1)合成SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列并测定序列的正确性。(2)将合成的序列以本领域技术人员熟知的方式克隆进一个哺乳动物表达载体中。(3)将该表达载体转染到宿主细胞CHO细胞内，并培养合适的时间。(4)在设定的培养时间后，收获细胞培养上清液。(5)用Ni株通过亲和层析的方法纯化所述双特异抗体。(6)进一步用阴离子和阳离子纯化所述双特异抗体。(7)用SDS-PAGE，SEC，iCE等方法测定所述双特异抗体纯化后的纯度，浓度和电荷异质性。

实施例2

用SPR检测双特异抗体对CD3和PD-L1蛋白的亲和力测定

(1)制备或购买PD-L1蛋白质和CD3蛋白质。(2)将PD-L1或CD3蛋白质按SPR生产商的说明固定在芯片上。(3)制备4到5种不同浓度的纯化后的所述双特异抗体的溶液。(4)将所述双特异抗体溶液以合适的速度流过固定有PD-L1或CD3蛋白质的芯片并记录SPR读数。根据读数和浓度计算所述双特异抗体对PD-L1和CD3蛋白质的亲和力。

实施例3

双特异抗体对表达CD3和PD-L1细胞的亲和力测定

(1)制备和培养表达CD3的细胞如细胞因子诱导的人T细胞或表达人PD-L1的CHO细胞；(2)将不同浓度的纯化的所述双特异抗体与一定量的CD3阳性细胞或PD-L1阳性CHO细胞共培养；(3)加入荧光标记的抗His-Tag抗体，并培养；(4)洗去没有结合到细胞上的抗体和二抗；(5)用流式细胞以测定结合到细胞表面的所述双特异抗体的量；(5)计算所述双特异抗体对CD3阳性细胞和PD-L1阳性细胞的亲和力。

实施例4.

双特异抗体阻断PD-1和PD-L1的结合

(1)用PD-1蛋白质包被酶标板，反应过夜。(2)用PBS洗去过剩的PD-1蛋白质。(3)用BSA处理酶标板，以减少非特异反应。(4)加入PD-L1:Fc融合蛋白以及不同浓度的所述双特异抗体，反应至少2小时。

(5)洗去多余蛋白和抗体。(6)加入HRP标记的看Fc的二抗。(7)洗去多余的二抗，加入显色剂并显色，测量光吸收值。计算PD-1和PD-L1的结合能力。

实施例5.

双特异抗体连接肿瘤细胞和免疫细胞

(1)培养PD-L1阳性肿瘤细胞如MDA-MB-231。(2)经志愿者同意，抽取不到10ml志愿者血液，制备PBMC。(3)将一定量的肿瘤细胞和PBMC混合，再加入不同浓度的所述双特异抗体。(4)静置48小时。(5)在显微镜下细胞混合液的情况。所述双特异抗体会发挥桥联作用将肿瘤细胞和免疫细胞聚集在一起，在显微镜下可以观察到细胞结团现象，而对照没有。

实施例6.

双特异抗体杀伤组成型表达PD-L1的肿瘤细胞

1)培养PD-L1组成型表达的肿瘤细胞如MDA-MB-231，并加入CFSE标记肿瘤细胞。(2)经志愿者同意，抽取不到10ml志愿者血液，制备PBMC。(3)将一定量的肿瘤细胞和PBMC混合，再加入不同浓度的所述双特异抗体。(4)反应24，48，72小时。(5)加入PI(碘化丙啶)染色。(6)用流式细胞术计数并分析CFSE和PI。双阳性细胞及其在CFSE阳性细胞中的比例。(7)计算免疫细胞在不同浓度的所述双特异抗体存在时对肿瘤细胞的杀伤。

实施例7.

双特异抗体杀伤可诱导表达PD-L1的肿瘤细胞

1)培养PD-L1组成型表达的肿瘤细胞如A549，并加入CFSE标记肿瘤细胞。(2)经志愿者同意，抽取不到10ml志愿者血液，制备PBMC。(3)将一定量的肿瘤细胞和PBMC混合，再加入不同浓度的所述双特异抗体。(4)反应24，48，72小时。(5)加入PI(碘化丙啶)染色。(6)用流式细胞术计数并分析CFSE和PI。双阳性细胞及其在CFSE阳性细胞中的比例。(7)计算免疫细胞在不同浓度的所述双特异抗体存在时对肿瘤细胞的杀伤。(8)同时用流式细胞术检测不同时间点A549细胞表面PD-L1表达情况。

实施例8.

比较双特异抗体和PD-L1单克隆抗体体外杀伤能力

1)培养PD-L1组成型表达的细胞如工程化CHO细胞CHO-PDL1，并加入CFSE标记CHO-PDL1。(2)经志愿者同意，抽取不到10ml志愿者血液，制备PBMC。(3)将一定量的CHO细胞和PBMC混合，再加入不同浓度的所述双特异抗体或者PDL1单克隆抗体。(4)反应24，48，72小时。(5)加入PI(碘化丙啶)染色。(6)用流式细胞术计数并分析CFSE和PI。双阳性细胞及其在CFSE阳性细胞中的比例。(7)计算免疫细胞在不同浓度的所述双特异抗体存在时对CHO-PDL1的杀伤。

2)培养PD-L1表达阳性的乳腺癌细胞MDA-MB231，并加入CFSE标记MDA-MB231细胞。(2)经志愿者同意，抽取不到10ml志愿者血液，制备PBMC。(3)将一定量的MDA-MB231细胞和PBMC混合，再加入不同浓度的所述双特异抗体或者PDL1单克隆抗体。(4)反应24，48，72小时。(5)加入PI(碘化丙啶)染色。(6)用流式细胞术计数并分析CFSE和PI。双阳性细胞及其在CFSE阳性细胞中的比例。(7)计算免疫细胞在不同浓度的所述双特异抗体存在时对肿瘤细胞MDA-MB231细胞的杀伤。

序列表

<110> 北京盛诺基医药科技有限公司

<120> 一种双特异性抗体

<130> C19P5122

<150> 201811082753.6

<151> 2018-09-17

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PL56中的抗人PD-L1抗体的重链可变区序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr His Ala Met Asp His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PL56中的抗人PD-L1抗体的轻链可变区序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Thr

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PL56中的抗人CD3抗体的重链可变区序列

<400> 3

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PL56中的抗人CD3抗体的轻链可变区序列

<400> 4

Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser

1 5 10 15

Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser

20 25 30

Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys

35 40 45

Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser

85 90 95

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码PL56中的抗人PD-L1抗体的轻链可变区序列的DNA序列

<400> 5

gatatccaga tgacccagtc tccttcttcc ctgtctgctt ctgtgggaga tagagtgacc 60

atcacctgta gagcttctca ggatatcgga aacaccctga actggctgca gcagaagcct 120

ggaaaggcta tcaagagact gatctatgct acctcctctc tggattctgg agtgcctaag 180

agattctctg gatctagatc tggatctgat tattctctga ccatctctag cctgcagcct 240

gaggatttcg ctacctatta ctgtctgcag tatgcttcct ctcctttcac cttcggacag 300

ggaaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码PL56中的抗人PD-L1抗体的重链可变区序列的DNA序列

<400> 6

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaaac ctggagcttc tgtgaaggtg 60

tcttgtaagg cttctggata ttctttcacc tcttattgga tgcactgggt gagacaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggagct atctatcctg gaaactctga tacctcttat 180

aaccagaagt tcaagggaag agtgaccatc accgctgtga cctctgcttc taccgcttat 240

atggagctgt cctctctgag atctgaggat accgctgtgt actattgtac cagatgggga 300

gatggatatt accacgctat ggatcactgg ggacagggaa ccctggtgac cgtgtcctct 360

<210> 7

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码PL56中的抗人CD3抗体的轻链可变区序列的DNA序列

<400> 7

gatatccagc tgacccagtc tcctgctatc atgtctgctt ctcctggaga gaaggtgacc 60

atgacctgta gagcttcttc ttctgtgtct tatatgaact ggtatcagca gaagtctgga 120

acctctccta agagatggat ctatgatacc tctaaggtgg cttctggagt gccttataga 180

ttctctggat ctggatctgg aacctcttat tctctgacca tctcttctat ggaggctgag 240

gatgctgcta cctattattg tcagcagtgg tcttctaacc ctctgacctt cggagctgga 300

accaagctgg agctgaag 318

<210> 8

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码PL56中的抗人CD3抗体的重链可变区序列的DNA序列

<400> 8

gatatcaagc tgcagcagtc tggagctgag ctggctagac ctggagcttc tgtgaagatg 60

tcttgtaaga cctctggata taccttcacc agatatacca tgcactgggt gaagcagaga 120

cctggacagg gactggagtg gatcggatat atcaaccctt ctagaggata taccaactat 180

aaccagaagt tcaaggataa ggctaccctg accaccgata agtcttcttc taccgcttat 240

atgcagctgt cttctctgac ctctgaggat tctgctgtgt attattgtgc tagatattat 300

gatgatcact attgtctgga ttattgggga cagggaacca ccctgaccgt gtcttct 357

<210> 9

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PL56的氨基酸序列

<400> 9

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala His Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Gly Asn Thr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln

100 105 110

Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

145 150 155 160

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

165 170 175

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

180 185 190

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

195 200 205

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Thr Arg Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr His Ala Met Asp His Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys

260 265 270

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

275 280 285

Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His

290 295 300

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

305 310 315 320

Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys

325 330 335

Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu

340 345 350

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr

355 360 365

Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

370 375 380

Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

405 410 415

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

420 425 430

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

435 440 445

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro

450 455 460

Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

465 470 475 480

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

485 490 495

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

500 505 510

His His His His His His

515

<210> 10

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码PL56的核苷酸序列

<400> 10

atggctcctg tggctgtgtg ggctgcactg gctgtgggac tggagctgtg ggctgcagct 60

cacgctgata tccagatgac ccagtctcct tcttccctgt ctgcttctgt gggagataga 120

gtgaccatca cctgtagagc ttctcaggat atcggaaaca ccctgaactg gctgcagcag 180

aagcctggaa aggctatcaa gagactgatc tatgctacct cctctctgga ttctggagtg 240

cctaagagat tctctggatc tagatctgga tctgattatt ctctgaccat ctctagcctg 300

cagcctgagg atttcgctac ctattactgt ctgcagtatg cttcctctcc tttcaccttc 360

ggacagggaa ccaagctgga gatcaaggga ggcggtggat ctggcggagg tggatctggt 420

ggaggcggat ctgaggtgca gctggtgcag tctggagctg aggtgaagaa acctggagct 480

tctgtgaagg tgtcttgtaa ggcttctgga tattctttca cctcttattg gatgcactgg 540

gtgagacagg ctcctggaca gggactggag tggatgggag ctatctatcc tggaaactct 600

gatacctctt ataaccagaa gttcaaggga agagtgacca tcaccgctgt gacctctgct 660

tctaccgctt atatggagct gtcctctctg agatctgagg ataccgctgt gtactattgt 720

accagatggg gagatggata ttaccacgct atggatcact ggggacaggg aaccctggtg 780

accgtgtcct ctggaggcgg tggatctgat atcaagctgc agcagtctgg agctgagctg 840

gctagacctg gagcttctgt gaagatgtct tgtaagacct ctggatatac cttcaccaga 900

tataccatgc actgggtgaa gcagagacct ggacagggac tggagtggat cggatatatc 960

aacccttcta gaggatatac caactataac cagaagttca aggataaggc taccctgacc 1020

accgataagt cttcttctac cgcttatatg cagctgtctt ctctgacctc tgaggattct 1080

gctgtgtatt attgtgctag atattatgat gatcactatt gtctggatta ttggggacag 1140

ggaaccaccc tgaccgtgtc ttctgtggag ggaggatctg gaggatctgg aggatctgga 1200

ggatctggag gagtggatga tatccagctg acccagtctc ctgctatcat gtctgcttct 1260

cctggagaga aggtgaccat gacctgtaga gcttcttctt ctgtgtctta tatgaactgg 1320

tatcagcaga agtctggaac ctctcctaag agatggatct atgatacctc taaggtggct 1380

tctggagtgc cttatagatt ctctggatct ggatctggaa cctcttattc tctgaccatc 1440

tcttctatgg aggctgagga tgctgctacc tattattgtc agcagtggtc ttctaaccct 1500

ctgaccttcg gagctggaac caagctggag ctgaagcacc atcaccacca tcactga 1557

Claims (13)

1.一种双特异性抗体，该抗体由抗人PD-L1的抗体与抗人CD3抗体联合构建而成，

所述的抗人PD-L1抗体含有SEQ ID NO：1所示重链可变区序列和SEQ ID NO：2所示轻链可变区序列，所述的抗人PD-L1抗体以scFv形式表达；并且所述的抗体含有SEQ ID NO：3所示抗人CD3抗体重链可变区序列和SEQ ID NO：4所示抗人CD3抗体轻链可变区序列，所述的抗人CD3抗体以scFv形式表达。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，抗人PD-L1抗体轻链可变区由SEQ ID NO：5所示DNA序列编码。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，抗人PD-L1抗体重链可变区由SEQ ID NO：6所示DNA序列编码。

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述抗人PD-L1抗体轻链可变区由根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO：5所示DNA序列相似的DNA序列编码。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述抗人PD-L1抗体重链可变区由根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO：6所示DNA序列相似的DNA序列编码。

6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述抗人CD3抗体轻链可变区由SEQ ID NO：7所示DNA序列编码。

7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述抗人CD3抗体重链可变区由SEQ ID NO：8所示DNA序列编码。

8.根据权利要求6所述的双特异性抗体，所述抗人CD3抗体轻链可变区由根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO：7所示DNA序列相似的DNA序列编码。

9.根据权利要求7所述的双特异性抗体，所述抗人CD3抗体重链可变区由根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO：8所示DNA序列相似的DNA序列编码。

10.一种表达载体，其可以表达权利要求1中的双特异抗体，其中抗人PD-L1抗体的重链可变区由SEQ ID NO:1组成，抗人PD-L1轻链可变区由SEQ ID NO:2组成，抗人CD3抗体的重链可变区由SEQ ID NO:3组成，抗人CD3抗体的轻链可变区由SEQ ID NO:4组成。

11.权利要求1所述的双特异性抗体在制备用于杀伤组成性表达PD-L1的肿瘤细胞的药物中的用途。

12.权利要求1所述的双特异性抗体在制备用于杀伤伽马干扰素诱导表达PD-L1的肿瘤细胞的药物中的用途。

13.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1所述的双特异抗体。

Images