HU229039B1

HU229039B1 - Cd19xcd3 specific polypeptides and uses thereof

Info

Publication number: HU229039B1
Application number: HU0102535A
Authority: HU
Inventors: Peter Kufer; Ralf Lutterbuese; Ralf Bargou; Anja Loeffler
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2013-07-29
Also published as: CZ302070B6; DE69909459T2; BRPI9909860B8; HUP0102535A3; ZA200005866B; AU761587B2; SK286683B6; AU4135299A; EP1348715A3; CZ20003889A3; EP1071752A1; HK1037674A1; ID27512A; NO326523B1; SK15792000A3; JP4169478B2; CA2326389C; CA2326389A1; PL199747B1; KR100508289B1

Description

Á jelen találmány tárgyát új egyláneű muítifunkeiós poíipeptidek képezik, amik legalább két kötőhelyet tartalmaznak a. CD 19 és CDS antigének számára. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá egy polipeptid, amiben, az előzékben említett polipeptid legalább még egy domént tartalmaz, aminek előnyösen. egy előre megbatározott funkciója va®. Emellett a jelen találmány tárgyát képezik az említett polipeptideket kódoló polinukleotidok, valamint az említett polinukleotídokat tartalmazó vektorok és az ezekkel transzformált gazdasejtek, és ezek felbaszn.álá.sa az említett polipeptidek előállításában. Emellett a jelen találmány tárgyát képezik azok a készítmények, előnyösen gyógyászati és ménvek, amik az előzőkben említett t tidok és vektorok közül bármelyiket tartalmazzák, A jelen tárgyát képezi továbbá az előzőkben említett polinukleotidok és vektorok

Immun terápiában használható gyógyászati készítmények előíjosen rosszindulatú .8-sejtes szaporodás, azaz

szövegében, számos dokumentumot idézünk.

idézett dokumentumot {beleértve a gyártók specifikációit., ♦ φ $ * * * * * .♦ * 2· *

** ♦ φ * φ£ * * * ♦ * /7. _ * ♦ azonban nem. ismerjük el, hogy bármelyik idézett dokumentum rontja a jelen találmány újdonságát.

Gyógyászati fontossága ellenére a. B-sejtek által közvetített betegségek, azaz például a nem-Hodgkin Iimíóma területén végzett kutatások csak kisszámú klinikailag használható adatot eredményeztek, és az ilyen betegségek gyógyítására, használt hagyományos megközelítések unalmasak és kellemetlenek maradtak és/vagy nagy a kockázata, a visszaesésnek. Például, bár a magas fokozatú nem-Hödgkíu limfóma elsődleges kezelésére használt magas dózisé kemoterápia, javíthatja az összes túlélést, a betegeknek körülbelül 50%-a belehal ebbe a betegségbe [Gianni: The New England Journal of Mediclne 336, 1290-1297 (1997); Ufha: J. NatL Caneer inst. Monogr. 29-37 (1990): kisbér: Caneer (1994)}.. Emellett az alacsony fokozatú nem-Hodgkin límfóma-szerű krónikus limfatíkus leukémia és köpenysejt limfóma még gyógyíthatatlan. Ez serkentette a kutatásokat az alternatív stratégiák, mint például az immunterápia iránt. A CD antigének által meghatározott sejtfelszíni molekulák elleni ellenanyagok egyedi lehetőséget biztosítanak a terápiás ágensek kifejlesztésére.

Bizonyos CD antigének expressziőja erősen korlátozódik specifikus eredetű limfohematopoietikus sejtekre, és az elmúlt néhány évben a limfoid-specífikus antigének elleni ellenanyagokat használták olyan kezelések kifejlesztésére, amik mind in vítm mind állatmodellekben hatékonyak [.Bohlen: Blnod 82. 1803-121. (1993); Bohlen: Caneer Rés. 53 18 4310-4314 (1993); Bohlen:

»8 $5

«*· φφ « φ * φ κ 9 φφφ* ·* ν*φ

Caneer Rés. 57 1704-1709 (1997); Haagen: Clin. Exp. Immunoi. 90, 368-375 (1995): Haagen: Caneer JrnmunoL Immunother. 39, 391-396 (1994); Haagen: Blood 84 556-563 (1.994); Haagen: Blood 85 3208-3212 (1995); Weiner: Leuk. inrmphoma 16, 199207 (1995); Csóka: Leukémia 10, 1765-1772 (1996)). Ebből a szempontból a CD 19 nagyon hasznos célpontnak bizonyult. A az érett B sejtekig, nem vész el, egyformán expresszálódik az összes limfóma sejtben és hiányzik az őssejtekből (Haagen: Clin. Exp. Immunoi. 90, 368-375 (1995); Uckun; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 8603-8607 (1988)1. Egy érdekes módozat egy híspecifíkns ellenanyag alkalmazása, aminek egy CD 19 antigén elleni specífítása és egy CDS antigén elleni specífítása van a T sejteken. Azonban a jelenleg elérhető bispecífíkus ellenanyagokkal az a. haj, hogy kicsi a T-sejt citotoxíeításuk, és ko-stimulációs ágensekre van szükség a kié utas réz.

Tehát a jelen találmányt aláhúzó technikai

?.ma az.

volt, hogy eszközöket és módszereket biztosítsunk a B-sejtek által közvetített betegségek, azaz például a nem-'Hodgkin limfóma megoldását ügy érjük el, hogy az igénypontokban ismertetett megvalósítási módokat biztosítjuk.

Tehát a jelen találmány tárgyát egyiáncú multifunkciós polipeptid képezi, ami az alábbiakat tartalmazza;

'5 ·« ί’¹'”' ♦· , * * * χ φ * ’ »*· . .

* · X **« χχχ, _Λ0 egy első dómén, ami egy immunglobulin. lánc, vagy egy no tja; es A) egy második ígf biztosítja, és v n felisme zet i, ami egy immunglobulin lánc, vagy egy

-ag kötőhelyét az említett domének az í: VlCD19-VhCD19-VhC bl sorrendben 3-V_lCD3<.

Az felső dómén” és ^második donién” szakkifejezés a jelen találmány szerint azt jelenti, hogy egy kötőhely a CD 1.9 B-sejt marker ellen irányul, ami egyformán expresszálódík a rosszindulatú B-sejtek a másik kötőhely a humán T-sejtek CD3 irányul

A ‘‘kötőhely* szákkifejezés a jelen találmány szerint egy olyan háromdimenziós struktúrával rendelkező domént jelent, ami képes specifikusan kötődni epitop-szerű természetes ellenanyagokhoz, szabad íz vagy az egyik, nekik megfelelő immun®¹* msen a Vh lánchoz. Tehát az említett dóméi ia. egy ellenanyag vagy egy immunglobulin lánc Vh és/vagy Vl doménjél, előnyösen legalább a Vh domént:. Másrészt a találmány szerinti polipeptidben levő említett, kötőhelyek· tartalmazhatják a CD 19 és CDS antigéneket felismerő ellenanyag vagy immunglobulin lánc légózó szempontbői meg kell jegyeznünk, hogy a találmány szerinti j tídben jelenlevő kötőhelyek doménjél nemcsak ellenanyagokból származhatnak, hanem más CD19-et vagy CD3-at kötő fehérjékből, azaz például a természetben előforduló felszíni receptorokból vagy li-

ΧΦΦ* gandumokbók A jelen, találmány szerint az említett kötőhely egy dóm én ben található.

A „multkúnkciős polipeptid” szakkifejezés az alábbiakban egy olyan polipeptidet jelent, ami legalább két, máshonnan, azaz két másik eltérő molekulából származó aminosav szekvenciát tartalmaz, adott esetben eltérő fajokból, amikben legalább két említett származású kötőhelyeket specifikál. Ennek megfelelően az említett kötőhelyek az említett .mnltífunkeiös peptid funkcióit vagy legalább néhány funkcióját specifikálják. Ilyen polipeptidek közé tartoznak például a hispecifikus egy láncú (bse) ellenanya Az _?,egyláneú’' szakkifejezés a jelen találmány leírásában azt jelenti, hogy a polipeptid említett első és második doménje kovalens kötéssel kapcsolódik egymáshoz, előnyösen egy nukleinsav molekula, állni kódolt ko-lineáris aminosav szekvencia formájában.

A CD 19 jelentése egy olyan antigén, ami a B utődvonalban expresszálődik, azaz a pro B sejtekben és az érett B sejtekben, nem tűnik el, egyformán expresszálődik az összes llmföma sejtben, és hiányzik az őssejtekből [Haagen: Clin. Exp, Immunok 90, 363-375 (1995); Uckun: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 8603-8607 (1988)).

A CD3 jelentése egy olyan antigén, ami a T-sejteken expresszálődik egy muliim ölekül ári s T-sejt receptor részeként, és három különböző láncot tartalmaz, a CDSepsziloxrt, a CDÜdeltát és a CD3gammát. A CD3 tömörülése a T-sejteken, például immobíiízált anti-CD3-ellenanyagok formájában, a T-sejtek aktiválásához vezet, hasonlóan a T-sejt receptor illeszkedéséhez, de függetlenül a klóntípus specifitásátöl. Tulajdonképpen a legtöbb antiCD3-ellenanyag felismeri a CD3epszílon láncot.

A CD 19 vagy CD3 antigént specifikusan felismerő ellenanyagokat a szakirodalomban ismertették (Dubek J. Immunological Methods 175, 89-95 (1994); Trannecker: EMBO Journal lö, 89-95 (1991); Kipríy&nov: int. J. Cancer 77, 763-772 (1998)], ezek a szakterületen ismert hagyományos módszerekkel állíthatók elő.

A bispecifikus CD19xCD3 ellenanyagokról, amik nem egyláncű formájúak, és a limfóma sejtekre gyakorolt T-sejt cítotoxicítását MHC-független módon irányítják át, már korábban kiniutatü hatókon vak in rifro ÍBohlen; Blood 82, 1803(1993): Boblem Cancer Rés. 53 IS 4310-4314 (1993); Haagen: Cancer Immunoi ímmunother. 39, 391-396 (1994); Haagen: Blood 84 556-563 (1994); Haagen: Blood 85 3208-321;

Csóka: Leukémia. 10, 1765-1772 (1996)], állatmodellben Cancer Rés. 57 1704-1709 (1997); Demanet: Int. J. Cancer Suppl. 7, 67-68 (1992)], valamint néhány pilot klinikai vizsgálatban fWeiner: Leuk. Lumphoma 16, 199-207 (1995); De: J. Hematother 4, 433-437 (1995): Haagen: Lénk. Lymphoma 19, 381-393 (1995)]. Eddig ezeket az ellenanyagokat hibrid-hibridórna technikákkal állították elő, kovalens kötéssel kapcsolva a monoklonálís ellenanyagokat (Anderson: Blood 80, 2826-2334 (1992)), vagy di-ellenanyag megközelítéssel jKipriyanov: Int. J.

φ ΦΦΦ 4

ΧΦΦ X»

Cancer 77, 763-772 (1998}}. Az alaposabb klinikai vizsgálatokat gátolta az a. tény, hogy ezeknek, az ellenanyagoknak alacsony a biológiai aktivitásuk, tehát magas dózisokat: kell alkalmazni, és az ellenanyagok önmagukban valő alkalmazása nem biztosít jótékony terápiás hatást. Emellett a klinikai minőségű anyag csak korlátozott mértékben hozzáférhető.

Anélkül hogy egy bizonyos elmélethez ragaszkodnánk, az a véleményünk, hogy' az előzőkben definiált híspeeifikus ellenanyag-szerű forma használata, az így' előállított polipeptidek, azaz például a bíspeeífikus CD 19* CDS ellenanyagok: általában képesek elroncsolói a CDI 9 célsejteket, oly módon, hogy eítotoxíkus T-limfocitákat gyűjtenek össze, anélkül hogy szükség lenne a Tsejtek pre- és/vagy ko-serkentésére. Ez éles ellentétben van az összes ismert, más molekuláris fonnának megfelelően előállított bispeciíikus CD 19* CDS ellenanyaggal, és általában nem függ nált CD 19- vagy CD3~eÍlenanyag specifitásoktőL A T-sejt pre~ és/vagy ko-serkentéséföl való függetlenség alapvetően hozzájárul a jelen találmány szerinti polipeptidek által közvetített kivételesen magas citotoxicításhoz, amire példaként megemlítjük, a példákban ismertetett CDlíhCDS bispeciíikus ellenanyagot.

A jelen találmány szerinti polipeptid további előnyös tulajdonsága az, hogy a kicsiny, viszonylag kompakt, struktúrája miatt könnyen elő lehet állítani és tisztítani, ezzel megkerülve az eddig híbrid-hibridómákkal kémiai kapcsolással vagy bakteriális zárványtestekböl renaturálássai előállított CD19*CD3 specifikus δ

XX * «

7, ellenanyagok alacsony kitermelését, a rosszul definiált melléktermékek vagy a munkaigényes tisztítási eljárások okozta kát f Staerz: Proceedíngs of tfae National Academy of c USA 83, 1453-1457 (1986); Lanzavecchia: Eur. 3. Immunoi. Γ 105-111 (1987); Mallender: Journal of Biologjeal Chemistry 269, 199-206 (1994); Gruber: J. of Immunoi. 152, 5368-5374 (1994); Kostelny: J. of Immunoi. 148, 1547-1553 (1992)). Az alábbiakban a találmány szerinti, polipeptid előnyös és váratlan tulajdonságait tárgyaljuk nem-korlátozó módon, a mellékek példák által illusztrálva, beleértve a találmány alábbiakban említett előnyben részesített megvalósítási módjait, amik illusztrálják a jelen találmány széles koncepcióját.

A jelen találmány szerint egy eukarióta expressziős rendszert használunk, amit rekombináns bispecifikus egyláncú ellenanyagok előállításához fejlesztettek ki [Mack: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7625 (1995)), azzal a céllal, hogy rekombináns bispecifikus- CD19*CD3. egyláncú ellenanyagot állítsunk elő, CHO sejtekben való expresszióval. A teljesen funkcionális ellenanyagot könnyen tisztíthatjuk egy Ní-NTA kromatográfiás oszloppá] a tenyészet felüluszojából, a C-termínálís hisztidin rész segítségévet A CD19~hez vagy CD3~hoz való specifikus kötést FACS elemzéssel lehet igazolni. A kapott találmány szerinti bscCD19xCD3 (bispecifikus egyláncú CD19^xCD-3) cula néhány váratlan tulajdonsággal rendelkezik:

Magas limfóma-vezérelt T-sejt cítotoxicitást indukál ín riiro és in úw>. Még nagyon alacsony koncentrációban (109 *· 9 és alacsony E (effektor): T (célpont) arányoknál. (5:1 és 2,5:1) a limíőma sejtvonaíak szignifikáns specifikus lizise figyelhető meg. Emellett a találmány szerinti fese€D19*€D3 molekulából 3-10 pg kivételes használata az orvosi állapot, világos és szignifikáns javulását eredményezi. Összehasonlítva a. korábban publikált, hibrid-hibridöma technikával vagy a di-ellenanyag megközelítési móddal (ami szintén egy más formátumot képvisel) előállított CD19*CD3 ellenanyagokkal, amiknek a eitotoxikus aktivitása néhány nanogramm/ml. vagy éppen pg/ml, a találmány szerint bseCD19'*CD3 ellenanyag. sokkal hatékonyabbnak tűnik (Bohlen; Blood 82, 1803-121 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 53 18 4310-4314 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 57 1709 (1997); Bohlen: 3, Immunological Methods 173, (1994)(, amint azt például a mellékelt 4,, 5. és 7. példában dokumentáljuk.

B) A találmány szerint hscCD19.xCD3 még alacsony koncentrációban is képes gyors, limloma vezérelt cítotoxicitást indukálni (4 Óra után) alacsony E:T arányok mellett, anélkül hogy a T-sejtek előzetes serkentésére szükség lenne. Ezzel szemben egy hagyományos CD19xCD3 bíspeeífikus ellenanyag (Bohlen: Blood 82, 1803-121 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 53 18 4310-4314 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 57 1704-1709 (1997); Bohlen; J. Immunological Methods 173, 55-62 (1994)( nem mutat szignifikáns citot w· ilyen körülmények között (nevezetesen T-sejt: előserkentés,

Η)

V Φ « « « « ♦ ♦ * »·♦ Φ* alacsony Ε:Τ arány) még magas, 3000 ng/ml-ig terjedő koncentrációban sem. Bár más hagyományos CD19xCD3 ellenanyag esetében is leírták citotoxikus aktivitás indukcióját előserkentes nélkül, ezt a hatást csak magas koncentráció és magas E;T arány mellett (löt) ng/rnl, 27:1) [Haagen: Cancer Immunot bnmunother. 39, 391-396 (1994)] érték el, a találmány szerint bscCD19xCD3-mal összehasonlítva (IÖÖ pg/ml, 2,5:1). Emellett ennek a hagyományos ellenanyagnak a citotoxikus aktivitását a h.íspeeifikns ellenanyaggal magával végzett eiőser.kentés után csak 1 nappal .figyelték meg, míg a találmány szerinti bseCD19xCD3 már 4 óra elteltével limfőma-vezérelt citoA találmány szerzőinek ismeretei szerint az eddig használt más bispecífikus ellenanyagokra eddig még nem írták le a nem-serkentett T-sejtek ilyen gyors és specifikus citotoxikus aktivitását ilyen alacsony koncentráció és E:T arány mellett. Bár űjabban egy antip!85HER2/anti-CD3 bispecífikus 'Ffabjs. ellenanyagról kimutatták, hogy a találmány szerint bscCD19xCD3-hoz hasonló koncentrációkban citotoxikus aktivitást indukál, ehhez az ellenanyaghoz Ib-2-veI 24 óra hosszat végzett, előserkentésre van szükség |Zhu: Int. J. Cancer 62 319-324 (1995)6 így a találmány szerint bscCD!9xCD3 ellenanyagról egyedi citotoxikus tulajdonságok derülnek ki, amik ezt a molekulát megkülönböztetik a már korábban ismertetett más bispecífikus ellenanyagoktól.

π

A találmány szerinti bsscCD19x€D3 befolyásolja az antigénspecifikus eitotoxikus hatásokat, amit az alábbi tények demonstrálnak:

megvonássá!

ez az ellenanyag nem tudja nzaim az t\rt! es plazmaeitóma sejtvonalakat, amik a CD 19 ellenanyagot nem expresszálö B-sejt eredetű sejtvonalak; és a limloma sejtekkel szemben mutatott eitotoxikus aktivitás blokkolható a kiindulási HD37 a.ntí CD19 ellenanyaggal {a HD37 ellenanyag a HD37 hibridómából származik (Pezzutto: J. oílmmunoL 138, 2793-2799 (1987)]},

A perfonn bioszintézis utat EGTA-val végzett teljes kalciumtitkolva teljesen blokkoljuk a bscCD19xCD3 által befolyásolt citotoxicitást, ami azt sugallja, hogy a specifikus lízis inkább egy T-sejtek által befolyásolt hatás mint az ellenanyagnak magának a közvetlen hatása.

Ezeket a tényeket összegezve a jelen találmány általános ámítása szerint készített bscCD19xCD3 ellenanyag sokkal , mint sz eddig leírt CDI9xCD3 bispecifikus ellenanyagok, abból a szempontból, hogy lényegesen magasabb a biológiai aktivitása, valamint: megvan a lehetőség arra, hogy gyorsan és könyven előállítsuk, ezzel elegendő mennyiséget állítva elő a kiváló, klinikai minőségű anyagból.

Ennek következtében a találmány szerinti bscCD19xCD3 molekuláktól az várható, hogy megfelelő jelöltek arra, hogy klinikai kipróbálások során bizonyítsák a bispecifikus ellenanyag te*

Φ Jí χ« ν« JÍ Φ

V Φ « * * * φ φ φ * ** a nemOtal közvetített betegségekb limfómában.

azaz

A találmány szerinti polipeptid egy előnyben részesített megvalósítási módja szerint az említett doméneket egy polipeptid linkéi' kapcsolja össze. Az említett imker az említett első és az említett második dómén között található meg, aholis az említett polipeptid felkér több hidrofil, peptldkötéses aminosavat tartalmaz, és az említett első dómén N-terminálísát és az említett második dómén C-terminálisát. köti össze.

A jelen találmány egy további részesített megváló sítási módja szerint az előzőkben ismertetett polipeptid említett első és/vagy doménje utánozza, vagy megfelel egy természetes ellenanyag Vh vagy Vt régiójának, A találmány szerint polipeptid kötési helyét biztosító ellenanyag lehet például egy monokíonális ellenanyag, egy poliklonálís ellenanyag, egy kiméra ellenanyag, humanizált ellenanyag, bi&pecífikus ellenanyag, szintetikus ellenanyag, ellenanyag-íragmens, azaz például a Fab, Fv vagy scFv fragmens, stb., vagy ezek közül bármelyiknek a kémiailag módosított származéka. A monokíonális ellenanyagokat előállíthatjuk például a szakirodalomban ismertetett technikával [Köhler és Milstein; Natúré 256, 495 (1975); Galfré: Methods ín Enzymology 73, 3 (1981)], ami abból áll, hogy egér mielóma sejteket fuzionáltatunk immunizált emlősökből származó lépsejtekkel, a szakterületen kidolgozott módosítások alkalmazásával. Emellett az előzőkben említett antigének elleni ellenanyagok vagy ezek fragmenseí előállíthatok a szakirodalomban közölt módszerekkel is (Hariow és Lane: „Antíbodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988)]. Az ellenanyagokat számos fajból előállíthatjuk, például emberekből is. Ha az említett ellenanyagok származékait a fág-display technikával állítjuk elő, akkor a felszíni plasmon rezonancia (a BÍAeore rendszerben alkalmazott módon) használható a CD 19 vagy CD3 antigén egy ropianoz kötődő fág ellenanyagok hatékonyságának fokozására |Schier: Humán Antíbodies Hybridomas· 7, 97-105 (1996); Mal.ru.borg: J. Immunological Methods 183, 7-13 (1995)]. A kunéra ellenanyagok előállítását például a WO 89/Ö9622 számú szabadalmi leírásban ismertetik, A. humanizált ellenanyagok előállítási eljárásait például az EP-A1 0 239 4Í)Ö és a Wö 9Ο/Ό786Ι számú szabadalmi leírásban ismertetik. A jelen találmány szerint használható ellenanyagok egy további forrásai az úgynevezett .xenogén-ellenanyagok. A xenogén ellenanyagok, azaz például a humán ellenanyagok egerekben való előállításának általános elveit a szakirodalomban ismertették (WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 és WO 96/33735).

A jelen találmány szerint használandó ellenanyagokat, vagy az ezeknek megfelelő immunglobulin lánco(ka)t tovább módosíthatjuk a szakterületen ismert hagyományos technikákkal, azaz például aminosav delécíó(k), inszercíó(k.), helyettesítésiek), addiciőfk), és/vagy rekombi.náciö(k) és/vagy más, a szakterületen ismert módosításokkal, ezeket önmagukban vagy egymással kombinálva használva, A szakterületen jártas szakember számára jól ismertek azok a módszerek, amikkel egy irumunglobul:

Η

Λ* · * lánc aminosav szekvenciáját meghatározó DNS szekvenciába módosításokat lehet bevinni (Sambrook és mtsai: Moleeular Cloning:

A Laboratory Manual; 2, kiadás, Cold Spring Harhor Press, Cold

Spring Harhor, HAL (1989)}, A hivatkozott módosításokat előnyösen nukleinsav szinten hajtjuk végre.

A jelen találmány egy további előnyben részesített megvalósítási módja szerint az előzőkben előzőkben Ismertetett polipeptid említett doménjei közül legalább egy az ellenanyag variábilis régiójának egy egyláncú fragmense.

Amint az jól ismert, az Fv, ami az a minimális ellenanyag fragmens, ami egy teljes antigén felismerési és kötési helyet tartalmaz, egy nehéz és egy könnyű lánc variábilis dómén (Va és· Wj dimerje, nem-kovalens módon összekapcsolva. Ebben a konfigurációban, ami megfelel a természetes ellenanyagokban talált konfigurációnak, az egyes variábilis domének három komplementaritást meghatározó régiója (CDR-ekj kölcsönhatásba lép, hogy meghatározzon egy antigén-kötő helyet a Vh-Vl dimer felszínén. Összességében a hat komplementaritást meghatározó régió antigén specifitást biztosít az ellenanyagnak. A komplementaritást ozo re an tercier struktúrával rendelkeznek, amik lényegében konzerválódtak, még az egymástól olyan nagymértékben eltérő fajok között is mint az egér és az ember. Ezek a keretek azt a célt szolgálják, hogy a komplementaritást meghatározó régiókat a megfelelő orientációban tartsák. A konstans doménekre nincs szükség a kötési funkcióhoz, de segíthetik a Vh-Vl kölcsönhatás stabilizí φ Φ \ ·** - «

Φ» *

Φ φ. * «Φφ *

Már egyetlen variábilis doniénnek (vagy egy Fv felének, ami csak három, egy antigénre specifikus komplementaritást meghatározó régiót tartalmaz) is megvan a képessége, hogy felismerjen és megkössön egy antigént, bár általában kisebb affinitással mint egy teljes kötőhely (Pointer: Biochem. II, 1327-1337 (1972)(. Ennek következtében a találmány szerinti polipeptíd kötési helyének említett doménje lehet egy Vh-Vl, Vh-Vh vagy Vt-Vt doménpár, ami származhat ugyanabból, vagy eltérő immunglobu'hnokböl. A jelen találmány szempontjából a V« és Vt doméneknek a -sorrendje a láncban nem. lényeges, a. domének előzőkben megadott sorrendje lehet, fordított is, általában a funkció elvesztése nélkül. Az azonban fontos, hogy a Vh és Vl domének úgy legyenek elrendezve, hogy az antigén kötőhelye megfelelő térszerkezetet vegyen fék

A jelen találmány szerinti polipeptidek egyik előnyben részesített megvalósítási módja szerint az említett domének a VlCD19~Vh€.D19~VhCD3~VlCD3 sorrendbe vannak elrendezve, ahol a „Vt* és „Vb* jelölés a specifikus anti-CD19 és anti~CD3 ellenanyagok variábilis doménje könnyű és nehéz láncát jelenti.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, az említett kötési helyeket előnyösen egy flexibilis linker köti össze, előnyösen az említett domének között elhelyezkedő polipeptíd ünker, ahol az említett polipeptíd línker több hidrofil, pepfídkötéssel összekötött aminosavból áll, megfelelő hosszúságú ahhoz, hogy az egyik említett dómén említett kötési helyének C~termmálisát összekösse az említett kötőhelyeket tartalmazó másik említett dómén N-ter16 « » mínálísával, ha a. találmány szerinti polipeptíd olyan konformációt vesz fel, ami vizes oldatba helyezve megfelel a kötés kialakításához. Az említett polipeptíd linker előnyösen sok glicin, alanín és/vagy szerin csoportot tartalmaz. Azt is előnyben részesítjük továbbá, ha az említett polipeptíd linker egy aminosav szekvenciából több egymást követő kópiát tartalmaz. A polipeptíd línker általában 1-15 aminosavből áll, bár a több mint 15 aminosavat tartalmazó linkerek Is jók lehetnek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az említett polipeptíd linker 1-5 aminosavöol aii.

A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az említeti: polipeptíd linker a találmány szerinti polipeptidben 5 aminosavat tartalmaz. Amint azt a csatolt példákban demonstráljuk, az említett polipeptíd linker előnyösen a Glv Gly Gly Gly Ser aminosav szekvenciát tartalmazza.

Egy további, különösen előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti .polipeptíd említett első doménje a Vh és Ve régiónak legalább egy komplementaritást meghatározó régióját tartalmazza. ami a 8. ábrán bemutatott: DNS szekvencia 82-144-es nukleotidjai (Ve) és. 4óÖ-831~cs nukleotidjai (Ve) által kódolt aminosav szekvenciát tartalmazza, és/vagy az említett második donién tartalmaz legalább egy komplementaritást .meghatározó régiót, még előnyösebben kettőt, és a leginkább előnyös, ha V_H és Vl régiónak legalább bárom .komplementaritást meghatározó régióját tartalmazza, ami a 8. ábrán bemutatott DNS szekvencia 847-1203-as nukleotidjai (Ve) és 1258-1575-ös. nukleotidjai (Vt) π

* # Φ Μ által kódolt aminosav szekvenciát tartalmazza, azokkal a. keretrégiókkal kombinálva, amik a kiindulási ellenanyagokban az említett komplementaritást meghatározó régiókkal együtt fordulnak elő. A 8. ábrán bemutatott variábilis régiókban levő komplementaritást meghatározó régiókat Kábát publikációja alapján határozhatjuk meg [Kábát: „Sequenoes of Proteins of Immunological interest7 US Department of Health and Humán Services, 3. kiadás (1983); 4. kiadás (1987); 5, kiadás (1990)], A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a kötőhely, vagy legalább egy, ebből származó komplementaritást meghatározó régió tett polipeptid előnyösen tartalmazza a 8. ábrán bemutatott DMS szekvencia 82-1575-ös nukleotidjai által kódolt aminosav szekvenciát A szakterületen jártas szakember számára, nyilvánvaló, hogy a találmány szerint polipeptid kötőhelyei elkészíthetők a szakterületen ismert módszerekkel (EP-A1. 0 451. 21.6 és EP-AI ö 549 581),

A találmány szerint poiipeptidek kötőhelyei doménjeinek a specifitása előnyösen lényegében azonos például annak az ellenanyagnak vagy immunglobulin láncnak a kötési specifúásával, amelyikből származik, Az ilyen kötőhely domének kötési affinitása lehet akár 10» M-¹ is, előnyösen nem magasabb mint 1Ö⁷a CDS antigén esetében és előnyösen egészen 10ⁱ⁰ M.'¹ vagy magasabb ís lehet a CD 19 antigén esetében,

A jelen találmány szerinti polipeptid egy előnyős megvalósítási mődia szerint:

Aj az első körülbelül 10-·' M,

10-⁹ M, és lég!

^helyének affinitása légmsén lül «Η* M:

es/vagy

B) a második dómén említett kötőhelyének affinitás kisebb mint körülbelül 10'⁷ M, előnyösen kisebb mint körülbelül 10⁶ M> és legelőnyösebben a nagyságrendje 10-⁵ M.

Azok szerint az előnyben részesített megvalósítási módok szerint, amikre hivatkoztunk, az az előnyös, ha a. CD 19 antigént felismerő kötőhelynek magas az affinitása, azzal a céllal, hogy nagy hatékonysággal fogja be az elroncsolandó célsejteket. Másrészt viszont a CD3 antigént felismerő kötőhely kötési affinitásának a természetes CDS receptor nagyságrendjében kell lennie, vagy akkorának, amit általában a T-sejt receptor és ligandumának kölcsönhatásában találhatunk, ami egy MHC-peptid komplex a megcélzott sejt felszínén.

A jelen találmány egy másik előnyben részesített megvalósí tási módja szerint az előzőkben ismertetett polípeptid egy foíspecifíkus egyláncú ellenanyag,

Á jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy polípeptid, ami még legalább egy domént tartalmaz, és az említett doméneket kovalens vagy nem-kovalens kötések tartják össze.

A kötés alapulhat genetikai fúzión, a szakterületen ismert és az előzőkben ismertetett eljárásoknak megfelelően, vagy kialakíthatjuk kémiai keresztkőtéssel is, .amint azt például a WO » κ·

94/04686 számú szabadalmi leírásban ismertetik. A találmány szerinti polipeptidben jelenlevő további dómén előnyösen kapcsolódhat flexibilis linkeren msen egy ád linker több hidrofil, peptidkőtésekkel összekötött amínosavból áll, és hossza elég ahhoz, hogy lefedje a távolságot az

egyik említett dómén C-termínálisa és az említett domének közöl a másik N-iermínálisa között, amikor az említett polipeptid olyan konformációt vesz fel, ami vizes közegbe helyezve alkalmas a kötéshez. Az említett polipeptid linker előnyösen az alábbi megvalósítási módokban leírt polipeptid linker. A találmány szerint politartalmazhat még egy hasítható linkért vagy hasítási hea proteinázok, mint például az enterokináz számára; lásd még a csatolt példákat,

Az említett további dómén emellett lehet egy előre meghatározott specifitássa.l vagy funkcióval rendelkező dómén, A szakirodalomban például vannak referenciák arról a koncepcióról, hogy a biológiailag aktív anyagokat, azaz például gyógyszereket, ioxínokat és enzimeket a test specifikus pontjaira irányítják, azzal a céllal, hogy elroncsolják vagy lokalizálják a rosszindulatú sejteket, vagy hogy lokalizált gyógyszeres vagy enzimatikus hatást indukáljanak. Javasolták már, hogy ezt a hatást úgy érjék el, hogy a biológiailag aktív anyagokat monoklonális ellenanyagokhoz kapcsolják ]N.Y. Oxford University Press; Ghose: J. Nat!. Cancer

- b 1, 657-676 (1978)).

Φ Sr φ #4χ«

Φ * < Φ χ

Φ» # φ φ Φ » Φ Φ

Φ* Φφφ XX

Ebben sz szövegösszefüggésben az. is nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptidek tovább módosíthatók a szakterületen ismert hagyományos módszerekkel. Ez lehetővé teszi olyan kiméra fehérjék előállítását, amik tartalmazzák a találmány szerinti polipeptídet és más funkcionális aminosav szekvenciákat, azaz például sejtmag lokalizációs szignálokat, transzaktiváló doméneket, DNS-kőtő doméneket, hormonkőto doméneket, fehérje jelöléseket (GST, GPP, h-myc peptid, FLAG, HA peptid), ami származhat heterolőg fehérjékből is. Amint azt a csatolt példákban ismertetjük, a találmány szerinti polipeptid előnyösen tartalmaz egy körülbelül 8 aminosavból álló FLAG-jelölést; lásd 8. ábra.

A találmány szerinti polipeptidek használhatók terápiásán, B-sejt rendellenességben, azaz például B-sejt limfómában, B-sejt eredetű krónikus limfatíkus leukémiában (B-CLL) szenvedő betegek kezelésére és/vagy B-sejthez kapcsolódó autoimmun betegségben, azaz például myastbenia gravis-ban, Morbüs Basedowban, Hashímoto thyreoiditis-ben vagy re bán szenvedő betegek kezelésére. Az ilyen kezelést például a találmány szerinti polipeptidek beadásával végezhetjük el. Az ilyen beadás során használhatunk jelöletlen és jelölt polipeptideket is.

A találmány szerinti polipeptideket beadhatjuk például egy terápiás ágenssel jelölt formában is. Ezeket: az ágenseket vagy közvetve vagy közvetlenül kapcsolhatjuk a találmány szerinti ellenanyagokhoz vagy antigénekhez. A közvetett kapcsolás egyik példája a térkitöltő egység használata. Ezek a térkitöltő egységek

-ί * Λ *Φ *·κ * viszont lehetnek oldhatatlanok és oldhatók (Dlener: Science 231, 148 (1986)], és úgy választhatók meg, hogy lehetővé tegyék a hatóanyag felszabadulását a megcélzott helyen. A találmány szerinti poiipeptidekhez .immunterápia esetében kapcsolható terápiás ágensek gyógyszerek, radioaktív izotópok, lektinek és toxtnok. A találmány szerinti poiipeptidekhez konjugálhatő hatóanyagok közé tartoznak azok a vegyületek, amiket a klasszikus értelmezés szerint gyógyszereknek nevezünk, azaz például a mítomicin ·€» a daunoruhieín és a vínblasztin.

A radioaktív izotóppal konjugáit találmány szerinti polipeptidek használatakor, azaz például immunterápia esetében, bizonyos izotópokat inkább előnyben részesítünk mint másokat, olyan faktoroktól függően, mint például a leukocíta eloszlás, valamint a stabilitás és emisszió. Az autoimmun választól függően.

bizonyos emittereket előnyben részesítünk másokkal szemben.

Általában, az alig és béta-részecskéket emitiáló- radioaktív izofóelőnyben az immunterápiában. Előnyben részesítik. a kis hatótávolságú, nagyenergiájú alfasugárzőkaí, azaz például a ²¹²Bí--í. A terápiás célokból, a jelen találmány szerinti polipeptidekhez köthető radioaktív izotópok az alábbiak lehetnek; usy U1I_? $ογ_? 6?Cu, ²^Si, snpb, ^Sc, ^Fd és Wíe.

A lektinek fehérjék, általában növényből izolált fehérjék, amik specifikus cukorcsoportokhoz kötődnek. Számos lektin képes sejtek agglutinálás&ra és limfocíták serkentésére. A ricin azonban egy toxikus lektin, amit az immunterápiában használnak. Ez ügy zajlik le, hogy a ricin alfa-peptid lánca, ami a foxicitásért felelős, kötődik a polipeptidhez, és ezzel lehetővé teszi a polipeptidnek a toxikus hatás hely specifikus eljuttatását.

A taxinak növények, állatok, vagy mikroorganizmusok által termelt mérgező anyagok, amik megfelelő dózisban gyakran halálosak. A diftéria toxín a Con/nehnctarium díphíheriae által termelt anyag, ami terápiásán használható. Ez a toxín egy alfa- és egy béta alegységet tartalmaz, amik megfelelő körülmények között, szétválaszthatok. A toxikus A komponens hozzáköthető a találmány szerinti polipeptidhez és a kölcsön hatásba lépő B-sejthez és T-sejtbez való helyspeeífikus eljuttatás céljára használható, amik szoros közelségbe kerültek a találmány szerinti polipeptidhez való kapcsolódás révén.

Más terápiás ágensek, például amiket az előzőkben ismertettünk, amik kapcsolhatok a találmány szerinti, polipeptidhez, valamint a megfelelő ex vivő és in vivő terápiás protokollok is ismertek, vagy könnyen megtudhatók a szakterületen jártas szakember számára. Ahol ez megfelelő, ott a szakterületen jártas szakember használhat egy jelen találmány szerinti pollnukleotidot, ámít az előzőkben ismertettünk, és ami az előzőkben ismertetett polipeptidek közül bármelyiket kódolja, vagy a fehérjeanyag helyett használhatjuk a megfelelő vektort.

Tehát a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptid használható más, kívánt specifitással és biológiai funkcióval rendelkező polipeptidek előállítására. A jelen találmány szerinti polipeptidektől azt várjuk, hogy fontos terápiás és tudományos szerepet játszanak .gyógyászatí területen, példánl az B-sejthez

Φ ' γ Φ* ·,<ί •X < Φ ί » •Χ ν - φ .# λ,' Φ « .·' re lenességek, azaz például a rák és autoimmun betegségek bizonyos formáinak kezelésére szolgáló- űj megközelítési módok kidolgozására, valamint érdekes eszközökként a megfelelő celluláris átadási bioszíntézís utak elemzésében és modulálásában.

A jelen találmány egy további előnyben részesített megvalósítási módja szerint az említett első további donién tartalmaz egy molekulát, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: effektor molekulák, amiknek a konformációja alkalmas a biológiai -aktivitáshoz, oyan aminosav szekvenciák amik képesek megkötni egy iont. valamint az olyan aminosav szekvenciák, amik képesek sze lektíven kötődni egy szöárd hordozóhoz vagy egy előre kiválasztott antigénhez.

Az említett további dómén előnyösen tartalmaz egy enzimet, egy loxint, e.gy receptort, kötőhelyet, bioszintetikus ellenanyag kötőhelyet, növekedési faktort, sejt-differenciálódási faktort, limfokint, eltekint, hormont, egy távolról kimutatható egységet, egy anti-metabolitot, egy radioaktív atomot vagy egy antigént. Az említett antigén lehet például egy tumor antigén, egy virális antigén, egy mikrobíálís antigén, egy allergén. egy autó-antigén, egy vírus, egy mikroorganizmus, egy polipeptid, egy peptid vagy több tumorsejt.

Emellett az említett, egy ion be_WSf cvencxat előnyösen az alábbi csoportból választhatjuk ki: ealmodulln, metallotionein, ennek funkcionális fragmense, vagy egy olyan ami X * « « # X nosav szekvencia, amí gazdag az alábbi aminosavak közül legalább egyben: glutaminsav, aszparagjnsav, lízin és arginin.

Emellett az említett, egy szilárd hordozóhoz szelektíven kötődni képes polipeptid szekvenciák lehetnek pozitívan vagy negatívan töltött aminosav szekvenciák, lehet ciszteinben gazdag aminosav szekvencia, avidin, sztreptavidín, a Stnphpbcoccua protein A funkcionális fragmense, G8T, His jelölés, egy FLAG-jelöiés vagy Lex A. Amint azt a csatolt példákban ismertetjük, a jelen találmány szerinti polipeptid lehet például egy egyláncú ellenanyag, -ami expresszálhatő egy N~terminális FLAG-jelöléssel és/vagv egy C-termínális Hís-jelöléssel, ami lehetővé teszi a könnyű tisztítást és kimutatást. Á példában használt FLAG-jelolés 8 amínosavat tartalmaz

8. ábra), és így osen .nasza jelen találmány szerint. Azonban a FLAG-jelölések a csatolt példákban használt FLAG rövidített verzióját használják, azaz lő.

az As zr-Lys-Asp aminosav szekvencia is ifeleAz előzőkben ismertetett effektor molekulák és aminosav szekvenciák egy pro-forma alakjában is jelen lehetnek, ami maga lehet aktív vagy inaktív, és ami eltávolítható, amikor például egy celluláris környezetbe lép be.

A jelen találmány egy legelőnyösebb megvalósítási módja szerint az említett receptor a T-sejt aktiváláshoz szükséges koserkentő felszíni molekula, vagy egy epitop kötőhelyet, vagy egy hormon kötőhelyet tartalmaz.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint az említett kő-serkentő molekula a CD80(B7-lj vagy a CD86(B7-2).

A jelen találmány egy további megvalósítási módja olyan íötidokra. vonatkozik, amik' az előzőkben ismertetett poliAz említett polinukleotidok füzionáltathatők a szakirodalomból ismert megfelelő expressziós kontroll szekvenciákhoz, hogy ezzel biztosítsuk a polipeptid helyes transzkripcióját és transzlációját.

Az említett polinukleotid lehet például DNS, cDNS, RNS, vagy szintetikus módszerekkel előállított DNS vagy RNS, vagy egy rekombináns módszerekkel előállított kiméra nukleínsav molekula, ami az említett polinukleotidok közül bármelyiket tartalmazhatja önmagában, vagy kombinációban. Az említett polinukleotid előnyösen egy vektor része. Az ilyen vektorok tartalmazhatnak további géneket, azaz például marker géneket, amik lehetővé teszik az említett vektor szelekcióját egy megfelelő gazdasejtben, megfelelő körülmények között. A találmány szerinti pohnukl tidot előnyösen működés szempontjából expressziós kontroll szekvenciákhoz kapcsoljuk., amik lehetővé teszik az expresszíőt prokariőta vagy eukariöta sejtekben Az említett polinukleotíd expressziója a polinukleotíd transzkripcióját jelenti transzlációba vihető mRNS~sé. Az expressziöt eukariöta sejtekben, előnyösen emlős sejtekben biztosító szabályozó elemek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Ezek általában szabályozóiciákat tartalmaznak, amik biztosítják a transzkripció iníφ φ * ♦ eíáciőját, és adott esetben tartalmaznak polí-A szignálokat, amik a transzkripció terniinációját és a transzkriptum stabilitását biztosítják. További szabályozó elemek lehetnek még a transzkripciós valamint transzlációs fokozó szekvenciák, és/vagy a természetesen asszociálódő vagy beterolög promoter régiók. A prok.ari.ota gazdasejtekben az expressziét lehetővé tevő lehetséges szabályozó elemek közé tartozik például a PL, a lac, a trp vagy a tac promoter Esehcnchin coléban, az eukarióta sejtekben az expressziét lehetővé tevő lehetséges szabályozó elemek közé tartozik az AOX1 vagy GÁLI promoter élesztőben, vagy a CMV-,

SV4Ö, RSV promoter szarkőma vírus), a az

SV40-íoközó, vagy egy globin intron az emlős és más állati sejtekben. .Azok mellett az elemek mellett, amik a transzkripció iniciációjáért felelősek, az ilyen szabályozó elemek tartalmazhatnak transzkripciós teradnácíós szignálokat, azaz például az SV40-polí-A helyet vagy a tk-poii-A-helyet, a polínukleotid után.

Emellett a használt expresszios rendszertől függően vesén venciákat, amik képesek a polipeptidet egy ceíluláris kompartmentfoe irányítani, vagy a táptalajba szekretálni, is hozzáadhatunk a találmány szerinti polínukleotídhoz, ezek jól ismertek a szakterületen; lásd például a csatolt példákat. A vezérszekvenciák a transzlációs, iníeiácíós és terminációs szekvenciákkal megfelelő fázisban vannak összeillesztve, és előnyösen egy vezérszekvenciával, ami a transzlálódott fehérjét, vagy annak egy részét a periplazmatikus térbe vagy az extracelluláris közegbe irányítják. Adott esetben a beterolög szekvencia kódolhat egy fúziós fehérjét.

•jr-y φ « « « w χ. v φ φ * φ φ φ « « φ » * φφφ φ.<.

ami tartalmaz egy, a kívánt jellemzőket, azaz például stabilizációt vagy egyszerűsített tisztítást vagy expresszált rekombináns terméket biztosító N-terminális azonosítási pepiidet; lásd az előzőket. Ebben a szövegösszefüggésben. a megfelelő expressziős vektorok ismertek a szakterületen. Ilyen például az Gkayama-Berg pcDVl cDK'S expressziós vektor (Pharmacia), a pCBM8, a pRc/CMV, a pe'DNAl, a pcDNA3 (Invitrogene), vagy pSPORTl (GIBCO BEL).

Az expressziós kontroli szekvenciák előnyösen egy etikádéta promoter rendszert ké transzformálni vagy transzferálni az eukarióta gazdasejteket de a prokaríóta. gazdaszervezeteknek megfelelő .kontroll szekvenciák is használhatók.. Ha a vektort már bejuttattuk a megfelelő gazdaszervezetbe, akkor a gazdaszervezetet olyan körülmények között z amik megfelelnek a nukleotid szekvenciák magas szintű ressziójához, és ahogy szükséges, ezt a találmány -szerinti po·* í >eptid összegyűjtése és tisztítása követi; lásd példán

Amint azt az előzőkben ismertettük, a találmány szerinti polínukleotídok használhatók önmagukban vagy egy vektor részeként, hogy expresszáltassuk a találmány szerinti polipeptidet a sejtekben, például a B-sejtes rendellenességek génterápiájához vagy diagnosztizálásához. Az előzőkben ismertetett polípeptidek közül bármelyiket kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó polinukleotídok vagy vektorok bejuttathatok a. sejtekbe, amik viszont, előállítják a számunkra érdekes polipeptidet. A génterápia, ami *4 azon alapul, hogy a terápiás géneket ex rivo vagy in riw technikákkal bejuttatjuk a sejtekbe, a géntranszfer egyik legfontosabb alkalmazása. Az in aífro vagy in m'oo génterápiához megfelelő vektorokat, eljárásokat. vagy génbeíuttaíó rendszereket a.

szakirodalomban ismertették, és ezek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára (Giorda.no: Natúré Medicine 2, 534-539 (1996); Schaper: Circ. Rés. 79, 911-919 (1996): Andersen: Science 256, 808-813 (1992); Verma: Natúré 389, (1994); Isner: Láncét 848, 370-374 (1996); Muhlhauser: Círc. Rés. 77, 1077-1086 (1995); Ónodéra: Blood 91, 30-36 Verma; Gene Ther, 5, 692-699 f

811, 289-292 (1997); Verzeletti: Hűm. Gene Ther. 9, 2243-2251 (1998); Wang: Natúré Medicine 2, 714-716 (1996); WO

94/29469; WO 97/00957; 5,580,859 számú Amerikai Egyesült Államok-heli szabadalmi leírás; 5,589,466 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Schaper: Current Gpínion in Biotechnology 7, 635-640 (1996); valamint, az ezekben idézett publikációk.)'. A találmány szerinti polmukleotidokaí és vektorokat vagy a sejtekbe való közvetlen bejuttatáshoz tervezhetjük meg, vagy liposzómákkal való bejuttatáshoz, vagy virális vektorokkal (azaz például adenovíráíis, retrovirális) való bejuttatáshoz, Az említett sejt előnyösen egy csírasejt-vonal, embrionális sejt, vagy petesejt, vagy ezekből származó sejt, legelőnyösebben az említett sejt egy őssejt. Az embrionális őssejt egyik ja lehet, többek között egy Nagy által leírt őssejt (Nagy:

fc fc * A fc fc « « « V fcfc fc fc

«. « v ♦ fc

Proceedtngs of the National Academy of Sciences, USA 90, 8424931 transzfer vagy célzó vektor. A vírusokból, azaz

A fentiekkel összhangban, a jelen találmányban vektorokat, hagyományosait olyan kozmídokat, vírusokat és bakteriofágokat használnak a génsebészetben, amik a találmány szerinti polípeptidet kódoló polínukleotidot tartalmaznak. Az említett vektor előnyösen egy expresszíós vektor és/vagy e-gy génretrpvírusokból, vakcínia vírusból, adeno-asszociált vírusból herpesz vírusokból vagy szarvasmarha paplllóma vírusból származó expressziös vektorok használhatók a találmány szerinti polinukleotidoknak vagy vektornak a megcélzott sejtpopulációba való juttatására. A szakterületen jártas szakember számára jól ismert eljárásók használhatók rekombináns vektorok készítésére [Sambrook és mtsai; Moleeúlar Cloning; A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. N,Y. (1989); Current. Protoeols in Moleeúlar Biology, szerk.; Ausubel és mtsai, Greene Publishing és Wiley-lnterscíenee; New York (1989)).. Egy másik változat szerint: a találmány szerinti polinukleotidok és vektorok liposzómákba. csomagolhatok a megcélzott sejtekbe való bejuttatáshoz. A találmány szerinti vektorokat jól ismert m zerel et ami a celluláris gazdasejtfől függ. Például a kalcium-klorid transzíekciöt általánosan használják a. prokariöta sejtekhez, míg a kalcium-foszfát. kezelést, vagy elektmporációt más celluláris gazdaszervezetekhez lehet, használni [Sambrook és mtsai; Moleeúlar « φ»

Cloning; A Laboratory Manual; 2, kiadás, Cold Spring Ha Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Ha egyszer expresszáltattuk, akkor a jelen találmány szerinti polipeptidek a szakterületen ismert standard eljárásokkal tisztíthatok, beleértve az ammóniám-szuifátos kicsapást, affinitás oszlopokat, oszlopkromatográfiát, gélelektroforézist és hasonlókat (Scopes: „Protein Purification”, Springer Veriag, New York (1982)]. A lényegében tiszta, legalább 90-95%-os tisztaságú polipeptideket részesítjük előnyben, és gyógyszeripari felhasználáshoz a 98-99%-os, vagy nagyobb homogenitást részesítjük inkább előnyben. Ha már egyszer meg van tisztítva, szükség szerint részlegesen vagy teljesen, a polipeptideket használhatjuk terápiásán (beleértve az extrakorporáüs felhasználást), vagy esszé-eljárások kifejlesztésére és elvégzésére.

Egy még további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát az előzőkben ismertetett polinúkleotidot vagy vektort tartalmazó sejt képezi. Az említett sejt előnyösen eukariőta, legelőnyösebben egy emlős sejt, ha a polipeptíd terápiás használata várható. Természetesen az élesztő, és kevésbé előnyösen prokariőta, azaz bakteriális sejtek is használhatók,, főleg akkor, ha az előállított polipeptidet diagnosztikai célokra használják..

A gazdasejtben levő, a találmány szerinti polinukieotíd vagy vektor vagy integrálódik a gazdasejt genomjába, vagy extrakromoszőmálísan marad fenn.

A „prokariőta.” szakkifejezés minden olyan baktériumra vonatkozik, amik egy DNS vagy RNS molekulával transzformálha31

tök, a találmány szerinti polipeptid előállítása céljából. A prokarióta. gazdaszervezetek lehetnek Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok is, azaz például Facherichía eod, Sulmoneko. typftírnurium, Sferraáa mnreescens és BnriOus suőriSh. Az „exfkarióta” szakkifejezés jelentése élesztő, magasabbrendü növény, rovar és előnyösen emlős sejt. A rekombináns előállítási eljárásban használt gazdaszervezettől függően a jelen találmány szerinti polehetnek glikozílezetiek vagy nem glikozilezettek. A talány szerinti polipeptidek tarts aminosavat is, Á találmány szerinti ponner leotidot használhatjuk a gazdaszervezet transzformálására vagy franszfektálására, bármelyik, a szakterületen jártas szakember számára általánosan ismert technika használatával. Különösen előnyös a. találmány szerinti polipeptídet kódoló szekvenciát tartalmazó plazmid vagy 'vírus használata, amely szekvencia genetikailag fúzionáltatva van egy N-termínális FLAG-jelöléshez és/vagy egy C-termínális His-jelöléshez. Az említett FLAG-jelölés hossza előnyösen körülbelül 4-8 aminosav, legelőnyösebben 8 aminosav. A fűzionáltatott, működés szempontjából kapcsolt gének előállítási eljárásai jól ismertek a szakirodalomból (Sambrook és mtsai; Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2, kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989}]. Az itt ismertetett genetikai konstrukciók és eljárások használhatók a találmány szerinti polipeptid expressziójára. eukariőta vagy prokarióta gazdaszervezetekben. Általánosságban a beépített polinukleotid hatékony transzkripcióját megkönnyítő promoter induló .metionin kódoló poimuk 32

Φ φ #φ * *« φ φ φ φ * * φ <« « χ χ ΦΦ szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokat használunk a gazdaszervezettel összhangban. Az expressziós vektor tipikus esetben tartalmaz egy replikációs origót, egy promotert és egy terminátort, valamint specifikus géneket, amik képesek biztosítani a transzformált sejtek fenotípusos szelekcióját. Emellett a találmány szerinti sejteket tartalmazó transzgenikus állatokat, előnyösen emlősöket használhatunk a találmány szerinti polipeptidek nagymennyíségben való előállítására.

Egy további megvalósítási mód szerint a. jelen találmány tárgyát az előzőkben ismertetett polipeptid előállítási eljárása képezi, ami abból áll, hogy a találmány szerinti sejtet olyan körül meny ó

táptá fik, ami megfelel a ni expresszi a polipeptidet izoláljuk a. sejtből vagy a

A transzíorms fermentorokban s opb gazdaszervezeteket a szakterületen ismert tjük, az i körülménveket. A taio szerinti nolípeptídet azután izolálhatjuk a nővesztő táptalajból, ceiluláris lizátumokböl vagy ceiluláris membrán-frakciókból. A találmány szerinti, például míkrobiálísan, expresszált polipeptid izolálását és tisztítását elvégezhetjük bármilyen hagyományos módszerrel, azaz például preparatív kromatográfiás elválasztásokkal és immunológiai elválasztásokkal, mint például azokkal, amikben a találmány szerinti polipeptid jelölése ellen készített monoklonális vagy poliklonális ellenanyagokat használnak, vagy a csatolt példákban ismertetett módon.

Tehát a jelen találmány lehetővé teszi az olyan polipeptídek rekombináns DNS technikákkal való előállítását, amiknek affinitásuk és speeifitásuk van a CD 19 és CD3 antigének egy epitopjavai szemben. Amint az az előzőkből nyilvánvaló, a jelen találmány tárgyát a polipeptídek nagy családja képezi, amik. tartalmaznak ilyen kötőhelyeket, a terápiás és -diagnosztikai megközelítésekben való bármilyen felhasználás céljára. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipepüdak tovább kapcsolhatok más, az előzőkben ismertetett egységekhez, például a gyógyszer célzásához vagy leképezési alkalmazásokhoz. Az ilyen, a kapcsolódási helyhez való kapcsolást elvégezhetjük kémiailag, a polipeptid expresszíőja után, vagy a kapcsolási terméket génsebészeti eljárással DNS szinten visszük he a találmány szerinti polipeptidbe. A DNS-eket azután egy megfelelő gazda-rendszerben expresszáltatjuk, és az expresszált fehérjéket összegyűjtjük és renaturáljuk, ha szükséges. Amint azt az előzőkben ismertettük, a kötőhelyek előnyösen az ellenanyag variábilis régiójából származnak. Ebből a szempontból a hibridóma technológia lehetővé teszi olyan sejtvonalak előállítását,amik lényegéhen bármilyen .kívánt, immunválaszt generáló anyag ellen ellenanyagot, választanak ki. Az immunglobulin könnyű- és nehéz láncát kódoló RNS kinyerhető a hibridóma ci~ toplazmájáből. Á mRNS 5' vége használható olyan cDNS készítésére. amit a jelen találmány szerinti módszerben használhatunk. A találmány szerinti polípeptideket kódoló DNS ezt követően expresszáihatő a sejtekben, előnyösen emlős sejtekben.

*»**·

A gazdasejttöl függően, renaturáciős technikákra szükség, hogy megkapjuk a helyes konformációt Ha szükséges, akkor pontmutációkat hajthatunk végre a DNS-ben, hogy optimalizáljuk a kötődést, erre a célra hagyományos kazetta mutagenezist vagy más protein engineering módszert használva, például az itt ismertetettet. A találmány szerinti polipeptidek előállítása, függhet a biológiailag aktív fehérjék, azaz például az enzimek, toxinok, növekedési faktorok, sejt diíferenciációs faktorok, receptorok, antimetabolitok, hormonok vagy különböző citokinek vagy límfokinek aminosav szekvenciájának (vagy a megfelelő RNS szekvenciájának) ismeretétől is. Az ilyen szekvenc ták a szakirodalomban, és számítógépes adatbankokból beszerezhetők., Például a találmány szerinti polipeptid elkészíthető, például egy olyan polipeptid, ami tartalmaz egy egyláncű Fv fragmenst és a CD8Ö (B7-1) humán ko-serkentö fehérje extracelluláris részét, egy Gly^Seri linkerrel összekapcsolva. A CD8Ö koserkentő fehérje az lg szupercsaíádha tartozik. Ez egy erősen glikozilezetf, 262 aminosavból álló fehérje, Preeman közölt egy részletesebb leírást [Preeman: J, of Immunoi. 1.43, 273.4-2722 (1989)). Stabil expressziót hajthatunk végre például Kanfman leírása szerint DHFR defieiens CHO sejtekben [Kanfman: Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)). A fehérje a C-terminálishoz kapcsolt His-jelölése révén tisztítható, egy Ní-N'TA oszlopon [Mack: Froceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7025 (19951), vagy « Λ' φ >

Emellett a jelen találmány az előzőkben említett políj:

-det, a találmány szerinti polinukleotidot vagy vektort tartalmazó készítményeket biztosít.

A jelen találmány tárgyát előnyösen olyan készítmények képezik, amik az előzőkben említett, a találmány szerint poiípeptide(ke)t, polinnkleotidojkajt vagy vektor(oka)t tartalmazzák.

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak még egy gyógyászatilag elfogadható- hordozót, A megfelelő- gyógyászati hordozókra a példák jól ismertek a szakirodalomban, ide tartoznak -a foszfáttal puffereit sóoldatok, a víz, az emulziók, azaz például az olaj/víz emulziók, a különböző típusú nedvesítő ágensek, steril oldatok, stb, Az ilyen hordozókat tartalmazó készítmények jól ismert hagyományos módszerekkel formulázhatők. Ezek a gyógyászati készítmények az alanynak megfelelő dózisban beadhatók. A megfelelő készítmények beadását különböző módon végezhetjük -el, azaz például intravénás, intraperítoneálís, szubkután, intramuszkuláris, topikális vagy íntraiis módon. A dőzistartománvt a kezelőorvos és a klinikai faktorok határozzák meg. Amint az. az orvostudományban közismert, bármilyen beteg dozirozása számos faktortól függ, beleértve a. beteg méretét, testfelszínét, korát, a beadandó vegyületet, a beteg nemét, a beadás idejét és útját, az általános egészségi állapotát, valamint, az egyidőben még beadott más gyógyszereket. A gyógyszerkészítmény rendszeres beadása esetében a dózistartomány 1 pg -10 mg egység per nap. Ha a beadás módja folyamatos infúzió, akkor a dózis nagysága 1 ug 10 mg egység per per perc. Azonban a folyamatos infúzió előnyben ré~ szesített dózisa 0,01 ug ·· 10 mg egység per testsédykg per óra. A különösen előnyben részesített dózist az alábbiakban adjuk be. Az előrehaladást periodikus becslés alapján határozhatjuk meg. A dózisok változnak, de a DNS intravénás beadásához előny ben részesített dózis körülbelül 10⁶-10ⁱ² kópia DNS molekula. A találmány szerinti készítményeket lokálisan vagy szisztémásán adhatjuk be. A beadás általában parenterális, azaz például intravénás; a DNS-t beadhatjuk egy megcélzott helyre irányítva, azaz például egy megcélzott belső vagy külső helyre,, biolisztíkus módszerrel, vagy katéterrel, az artéria egy pontjára. A parenterális beadáshoz előállított készítmények közé tartoznak a steril vizes vagy nem-vizes oldatok, szuszpenziók és· emulziók. A nem-vizes oldószer lehet például propilénglikol, pölietiíéngliköl, növényi olajok, azaz például olívaolaj és injekciózható szerves észterek, azaz például etiloleát. A vizes hordozók közé tartozik a víz, az alkoholos/vizes oldatok,,, emulziók vagy szuszpenziők, beleértve a sóoldatot és a puffereit közegeket. A parenterális hordozók közé tartozik a nátrium-klorid oldat, a Ringer szacharóz oldat, a szacharóz és nátrium-klorid, a laktátos Ringer oldat, vagy a fixált olajok. Az intravénás hordozók közé tartoznak a folyadék és tápanyag oht 1 . . (azaz például amik a Ringer szacharóz alapon készülnek)·, és hasonlók. Konzerválószerek és adalékanyagok is jelen lehetnek, mint például antimikrobiális szerek, antioxidánsok, kelátképzö ágensek és inért gázok, valamint egyebek. Emellett mérlegelni lehet, hogy a találmány szerin37 •V*'A ν ti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak további biológiailag aktív ágenseket, a gyógyászati készítmény szándékolt felhasználásától függően. Az ilyen ágensek lehetnek a gasztrointesztinális rendszerre ható gyógyszerek, a oltosztutikumként ható gyógyszerek, a híperurikémiát megakadályozó .gyógyszerek és/vagy más ágensek, azaz például a szakterületen ismert T-sejt ko-serkentő molekulák vagy citokinek,

A jelen találmányban azt is mérlegeljük, hogy a találmány szerinti különböző polinukleotidokat és vektorokat vagy önma·· be, vagy kombinációban, amihez standard vei torokat és/vagy génbejuttató rendszereket használunk, adott esetben egy gyogyászatilag elfogadható hordozóval vagy töltőanyaggal. A beadást követően az említett polinukleotidok vagy vektorok stabilan integrálódhatnak: az alany genomjába.

Másrészt viszont virális vektorok használhatók, amik bizonyos sejtekre vagy szövetekre specifikusak, és hosszú, ideig fennmaradnak az említett sejtekben. A megfelelő gyógyászati hordozók és töltőanyagok jól ismertek a szakterületen, A jelen mány szerint előállított gyógyászati készítmények különböző betegségek megelőzésére, vagy kezelésére, vagy késleltetésére, amik a Β-sejthez kapcsolódó Ímmundefieíenciák és malignanciák.

Továbbá lehetséges egy olyan, a találmány szerinti gyógyászati készítmény használata génterápiában, ami polímrkleotidot vagy vektort tartalmaz. A megfelelő génbejuttató rendszerek közé tartozhatnak liposzómák, receptorok által befolyásolt bejuttató

Φ * ♦ X rendszerek, puszta. DNS, és virális vektorok, azaz például herpesz vírusok, retrovírusok, adenovírusok és adeno-asszociált vírusok, többek között A nukleinsavaknak génterápia céljára a test egy specifikus helyére való bejuttatását, a Williams -által ismertetett biolisztikus bejuttató rendszerrel hajthatjuk végre [Williams; Froceedings of the National Academy of Sciences, VSA 88, 2726-2729 (1991)]. A nukleihsavak bejuttatásának további módszerei közé tartozik a Verma által ismertetett, részecskék által közvetített géntranszfer [Verma: Gene Ther, 15, 692-699 (1998)] . Az nyilvánvaló., hogy a bejuttatott, polinukleotidok és vektorok. az említett sejtbe való bejuttatás után expresszálják a génterméket, és előnyösen az. említett sejt élettartama során ebben a státuszban maradnak. Például a sejtvonalak, amik a megfelelő szabályozó-szekvenciák vezérlétével stabilan expresszálják a polinukleotidot, a szakterületen jártas szakember számára ismert génsebészeti módszerekkel változtathatjuk meg. Ahelyett, hogy olyan -expressziős vektorokat használnánk, amik virális replíkációs origót tartalmaznak, a gazdasejteket transzformálhatjuk a találmány szerinti poimukleotiddaj. és egy szelekciós markerrel, ami lehet ugyanazon, vagy egy más plazmidon. Az idegen DNS bejuttatását követően a génsebészeti utón megváltoztatott sejteket gazdag táptalajon 1 -2 napig hagyjuk növekedni, majd ezután váltunk a szelekciós táptalajra. A rekombináns plazmádban levő szelekciós marker a szelekcióhoz biztosit rezisztenciát, és lehetővé teszi azoknak a sejteknek a .szelekcióját, amiben a piazmid stabilan integrálódott a kromoszómákba, és * « φ telepeket képesnek, amik klónozhatok és sejtvon alakká szaporíthatok. Az ilyen, génsebészeti módszerrel megváltoztatott sejtvonalak különösen jól használhatók a szűrővizsgálati módszerekben, olyan vegyületek kimutatására, amik szerepet játszanak például a B-sejt/T-sejt kölcsönhatásokban.

Számos különböző szelekciós rendszer használható, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a herpes simplex vírus timidin fcinázt [Wigler: Cell 11, 223 (1977)1, a hípoxantin-guanin-foszforibozil transzferázt (Szyhalska: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 48, 2026 (1962)) és az adenin-föszforíhözíl transzferázt (Lowy: Cell 22, 81.7 (1980)), tk·, hgprt* vagy aprt·· sejtekben. Emellett az antímetaholit rezisztencia Is használható a dihidrofoláf-reduktáz szelekció alapjaként, ami metotrexát rezisztenciát biztosít (Wígler: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 77, 3567 (1980): O'Hare: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 1527 (1981)1, használható a gpt ís, ami. mikoíenolsav rezisztenciát biztosít (Muffigan.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 2072 (1981)), a neo is, ami a G-418 aminogiikozid elleni rezisztenciát biztosít (Colberre-Garapin: Journal of

Meeular gy 150, 1 (1981)1, vagy a puromicin (pai, puromícin N-acetil transzferáz). A további szelekciós géneket ís leírtak, például a trpB-t, ami lehetővé feszi, hogy a sejt triptofán helyett indolt használjon, a hísD, ami lehetővé teszi, hogy a sejt hisztinolt hasznosítson a hisztídín helyett (Harlmam Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 8047 (1988)), és az

XX

XX Φ

ODC (omitin-dekarboxiláz), ami az ornitin-dekarboxiláz inhibitor, a 2-(difiuo.rmetíl)-DL-ornitin (DFMO) elleni rezisztenciát [McCologue: lm Current Communications in Moleeular szerk.: Cold Spring Harbor Laboratory L

Ά jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a jelen találmány tárgyát egy diagnosztikai készítmény képezbamí egyet vagy többet tartalmaz az előzőkben említett, a találmány szerint polipeptidek, polinukleotidok vagy vektorok: közül, va.

mint adott esetben tartalmaz a kimutatáshoz szükséges eszközöA jelen találmány szerinti polipeptidek megfelelnek az ímmunes székbe n való felhasználáshoz is. amikben használható folyékony fázisban, vagy szilárd fázisú hordozóhoz kapcsolva. A találmány szerinti pölípeptidet használó immunesszék példái lehetnek a kompetitív és nem,-kompetitív immunesszék, mind a direkt mind az indirekt formában. Ilyen immunesszé lehet például a radioimmunesszé (RA1), a szendvics (ímmnnometriás esszé) és a Western biot esszé.

A találmány szerinti polipeptidek számos különböző hordozóhoz köthetők, és használhatók az említett polipeptidekhez specifikusan kötött sejtek izolálására. A jól ismert hordozók közé tartozik az üveg, a polisztírol, a polivmílklorld, a polipropilén, a polietilén, a polikarfoonái, a dextrán, a nylon, az amilőzok, a természetes és módosított cellulózok, a kolloid fémek, poliakrilamídok, agarozok és a magnetit, A hordozó természete a jelen találmány céiától függően lehet oldható vagy oldhatatlan.

* *

Φ *·Χ* φ φ φ φ *** ΚΦΦ V ;os jártassággal rendelkező szakember szádőlés és jelölési módszer ismert, A jelen az

A szakterületen át mára számos enzimek, a radioaktív izotópok, a ko( aek, a fluoreszcens vea kemilumineszcens bíoluxnineszeens vegyületek; lásd még az alábbiakban ismertetett megvalósítási módokat.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá az előzőkben ismertetett, jelen találmány szerinti polipeptid, polinukleotid és vektor, egy olyan gyógyászati készítmény készítése céljából, amivel a Bsejt malígnanciákat, a B-sejtek által közvetített autoimmun betegségeket vagy a B- sejtek elfogyását lehet kezeink

A humán T-sejtek bispeeifikus ellenanyagokkal átirányított citotoxícitásí aktivitásával végzett legfrissebb klinikai vizsgálatok ígéretes eredményeket mutatnak a nehezen kezelhető Hodgkin betegség (Hsrtmsnn: Blood 89, 2042-2047 (1997)], az emlő és ek. rák jValone: d. Clin. Oncol. 13, 2281-22 Valone: J, Hematother, 4, 471-475 (1995); Bolhuís: Int. J. Cancer Suppl. 7, 78-81 (1992); Canevarű d. Natl. Cancer Inst. 87, 14631.469 (1995)| és a malignns glíóma (Nítta: Láncét 335, 368-371 (I.99Ö)) kezelésére. Az alábbi tények fényében.

A) a bispeeifikus egyláncú ellenanyagok az alacsony molekulatömegük következtében megkönnyítik a tumorokba való behatolást (amint azt a Fab vagy Fv fragmensekre kimutatták (Yokota: Cancer Rés. 52, 3402-3408 (1992)]; és

B) a bíspeeífikus egyláncú ellenanyagoktól az várható, hogy csökkentik a hagyományos bíspeeífikus ellenanyagok Fc részei által befolyásolt szisztémás citokin felszabadulás dózísfűggő és dóziskorlátoző tozicitását :: J. of Immunok 152., 2385-2392 (1994)};. és C) még egy érintetlen (CD20 elleni) monoklonális ellenanyag is a tumor regresszióját eredményezi az NHL előrehaladott állapotaiban [Maloney: Blood 84, 24572466 (1994); Reff: Blood .83, 435-445 (1994)}, az várható - és valójában igazolták ís - hogy a találmány szerinti polipeptidek érdekes molekulák, amik hozzájárulnak a további terápiás j avulásokhoz.

Tehát: egy előnyben részesített .megvalósítási mód szerint a találmány szerinti, gyógyászati készítményt használjuk nemHodgkin limfóma. kezelésére.

A találmány szerinti polipeptidek, polinukleotidok és vektorok beadásánál a dozistartományok azok a dózisok, amik elég nagyok ahhoz a kívánt hatást kiváltsák, aminek eredménye az.

hogy a B-sejt által közvetített betegségek tüneteit enyhíteni· lehet. A dózisnak nem szabad olyan nagynak lennie, hogy lényeges káros mellékhatásokat okozzanak, azaz például nemkívánt keresztreakciókat, anafílaxiás reakciókat és hasonlókat. A dózis általában változik a kortól, állapottól, nemtől és a betegségnek a. betegben való kiterjedésétől, és a szakterületen jártas szakember könnyen .meghatározhatja. A dózisokat: a kezelőorvos az ellenjavallatok alapján, szabályozhatja. Az is mérlegelhető, hogy az emlíΦΧΧ tett dőristartományt 0,01 pg - lö mg találmány szerinti polipeptldre állítjuk. Egy különösen előnyben részesített dózis a 0,1 gg 1 mg, még ennél ís előnyösebb az 1-100 gg. és a legelőnyösebb a 3-10 μ§, amint azt például a csatolt 7. példában bemutatjuk.

Emellett a találmány tárgya eljárás T-sejt aktiváló vagy koserkentő vegyületek azonosítására, vagy a T-sejt aktiválás és serkentés inhibitorainak azonosítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk;

A) CD 19 pozitív sejteket (előnyösen B-sejteket) és Tsejteket tenyésztünk a találmány szerinti polípeptid jelenlétében, és adott esetben olyan komponens jelenvaló aktiválására adott válasz kimutatható jelét generálni, amely vegyüíetet olyan körülmények között kereshetjük, amik lehetővé teszik a. vegyűlet és a sejtek kölcsönhatását; és

B) kimutatjuk a vegyületnek a sejtekkel való kölcsönhatásából generált: jel meglétét vagy hiányát.

Ez a megvalósítási mód különösen jól használható a vegyületek azon képességének vizsgálatára, hogy ko-serkentő molekulákként viselkednek-e.. Ebben az eljárásban a CD 19 pozitív sejt/B-sejt egy primer aktiválási jelet biztosit a T-sejtekre, ezzel elkerülve a klonotipusos T-sejt receptort. Azután a találmány szerint meghatározható, hogy melyik vizsgálandó vegyűlet szükséges még a T-sejt aktuális aktiválásához. A találmány szerinti eljárásban a CB 19 pozitív sejt/B-sejt serkentő sejtként működik.

♦ X « *

X > X X «

X Λ * X X *♦ *4 * ami összekapcsolja. azokat a bíspeeííikus molekulákat, amik ugyanazon T-sejt felszínén levő CDS komplexekhez kötődnek. A tenyésztés, kimutatás és adott esetben a vizsgálat végrehajtásának biológiai módszerei jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

A találmány szerinti módszerben a „vegyűlet” szakkifejezés vagy több vegyűlet, amik vagy minták, azaz. pé:

vagy azonosak vagy nem.

vegy dául sejtkivonatok, például növény organizmusokból. Emellett az említett vegyületek lehetnek már ismertek a szakterületen, de eddig nem tudták róluk, hogy képesek gátolni a T-sejt aktiválását vagy nem volt ismert róluk, hogy használhatók T-sejt ko-serkentő faktorként. A több vegyüietet hozzáadhatjuk például a tenyésztő közeghez, vagy a. sejtbe injekcióz

Ha a találmány szerinti eljárással azonosítunk egy vegyülőte(ke)t tartalmazó mintát, akkor lehetséges, hogy a vegyüietet izoláljuk, az· eredeti mintából, amit úgy azonosítottunk, hogy tartalmazza a kérdéses vegyüietet, vagy az eredeti mintát tovább oszthatjuk:, ha főbb különböző vegyüietet tartalmaz, ezzel csökkentve a mintában levő különböző anyagok számát, és megismételjük az eljárást az eredeti minta kisebb részeivel. Meghatározható, hogy az említett minta vagy vegyűlet a szakterületen ismert, és itt. valamint a csatolt példákban ismertetett mód-e a kívánt tulajdonságokat. A minták komple45 xitásátől függően az előzőkben ismertetett, lépéseket többször is végrehajthatjuk^ előnyösen addig, amíg a jelen találmány szerinti eljárással azonosított minta, csak korlátozott számú vagy csak egyetlen vegyületet tartalmaz. Az említett minta előnyösen hasonló kémiai és/vagy fizikai tulajdonságokkal rendelkező anyagokat tartalmaz, és az a legelőnyösebb, ha az említett anyagok azonosak. A jelen találmány szerinti eljárásokat a szakterületen jártas szakember könnyen végrehajthatja és megtervezheti, például a szakirodalomban már ismertetett sejtalapú vizsgálatnak megfelelően, vagy a csatolt példákban, ismertetett eljárások használatával és módosításával. Emellett a szakterületen jártas szakember könnyen felismeri, hogy milyen további vegyületek és/vagy sejtek használhatók a találmány szerinti eljárások végrehajtásához, Ilyenek például az ínterleukínök vagy enzimek, ha szükségesek, amik egy bizonyos vegyületet egy prekurzorrá alakítanak át, ami viszont serkenti vagy elnyomja a T-sejt aktiválását. A találmány szerinti eljárás ilyen adaptálása természetesen. a szakterületen jártas szakember ismereteihez tartozik, és fölösleges kísérletezés nélkül elvégezhető.

A jelen találmány szerinti eljárásban használható vegyületek közé tartoznak a peptidek, fehérjék, nükleinsavak, ellenanyagok, kis szerves vegyületek, ligandumok, peptidomi.metik.nmok, peptid-nukleinsavak és hasonlók. Az említett vegyületek. lehetnek ismert T-sejt aktívátorok vagy inhibitorok Funkcionális származékai vagy analógjai. A kémiai származékok és analógok készítési eljárásai jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára,

4ő

X « és megtalálhatok a szakirodalomban [Beilstem: Handbook of Organíc Cbemistry, Springer, New York Inc., 175 Fifth Avenw, New York, N.Y. 10010 U.S.A.; Organíc Synthesis, Wiley, New York, USA]. Emellett az említett származékok és analógok megvizsgálhatok, hogy milyen hatásuk van a. szakterületen, ismert eljárásokban, amiket például a csatolt példákban, ismertetünk. Emellett a peptidomímetikumok' és/vagy a T-sejt aktiválás megfelelő aktivátoralnak vagy Inhibitorainak számítógéppel segített tervezése is· használható, például az alábbiakban ismertetett eljárások szerint. Megfelelő számítógépes programok használhatók egy zett •ol* reor es a xa x szerinti antigén kölcsönhatást biztosító helyek azonosítására, a komplementer tűrális motívumok számítógépes keresésével (Fassína:

5, 114-120 (1994)]. A fehérjék és peptídek számítógépes segítséggel végzett tervezéséhez további megfelelő számítógépes rendszereket írtak le a szakirodalomban {Berry: Biochem. Soc. Trans. 22, 1033-1036 (1994); Wodak; Ami. N.Y. Acad. Sci. 501, 1-13 (1087); Pabo: Biochemistiy 25, 5987-5991 (1986)). Az előzőkben említett számítógépes elemzéssel kapott eredményeket használhatjuk a találmány szerinti módszerekkel kombinálva, például ismert T-sejt aktivátorok vagy inhibitorok optimalizálására. A megfelelő peptidomímetikumok is azonosíthatók peptidomímeükus kombinatorlálls könyvtárak szintézisével, a kapott vegyületek egymást követő kémiai módosításával és tesztelésével, azaz például az alábbiakban és a csatolt példákban ismertetett eljárás szerint. A peptldomímetíkus könyvtárak, készt47

ΦΧΧΦ

t.ésí eljárásait és használatát a szakirodalombaíi már ismertették [Ostresfe: Methods in Enzymology 267, 220-234 (1996); Domer: Biorg. Med. Chem. 4, 709-715 (1996)(. Emellett a B-sejt/T-sejt kölcsönhatás inhibitorainak vagy aktivátorainak háromdimenziós és/vagy krisztallográfiás struktúrája használható a T-sejt kölcsönhatás találmány szerinti eljárással tesztelendő peptidomímetikus inhibitorainak vagy aktivátorainak tervezésére (Rose:

Chem. 4, 1545-1558 (1996)].

Összefoglalva, a jelen találmány tárgyát olyan vegyületek azonosítása képezi, amik képesek befolyásolni a B-sejt/T-sejt által közvetített immunválaszokat.

Azokat a vegyületeket, amikről kiderült, hogy aktiválják a B-sejt/T-sejt által közvetített válaszokat, használhatjuk a rak és rokon betegségek kezelésében. Emellett az ís lehetséges, hogy specifikusan gátoljuk: a virális betegségeket, ezzel megakadályozva. a virális fertőzést vagy' a vírus elterjedését. A T-sejt aktiválás· vagy serkentés azonosított vegyületek ís használhatók szervátültetésben, azzal a céllal graft kilökődését: (lásd még idézett publikációk).

A jelen találmány szerinti módszerrel kapott vagy azonosított vegynletektöl ezért azt várjuk, hogy nagyon hasznosak legyenek a diagnosztizálásban, és különösen a terápiás alkalmazásokban. Ezért a jelen találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát egy olyan, .gyógyászati készítmény képezi, ami a jelen találmány előzőkben ismertetett módszere b) azonosított vegyüietet tartalmazza gyógyászatílag elfogadható formában kiszerelve, Emellett az is elképzelhető, hogy az említett komponens peptid omímetikumokkal módosítható. A peptidomimetikus kombinatoriális konvvtár előállításának és használatának módszereit a

X·* szakirodalomban már ismertették [Ostresh: Methods ín Ensymology 267, 220-234 (1996); Dorner: Bi.org. Med, Chem, 4, 709-715 (1996); Beeley: Trends ín Biotechnology 12, 213-216 (1994); al~0beidi: Moh Bíotech, 9, 205-223 (1993)].

A jelen találmány szerinti módszerrel azonosított terápiásán hasznosítható vegyületek egy betegnek bármilyen, a vegyuletnek is megfelelő módszerrel beadhatók, azaz például orálisan, intravénásán, parenteráiisan, transzdermálísan, transzmukozálisan vagy sebészeti úton beültetéssel (például ügy, hogy a vegyüíet szilárd vagy félig szilárd, biológiailag kompatibilis és reszorbeálódó mátrix van), azon a helyen, vagy ahhoz közel, ahol a vegyidet hatására ség van. A terápiás dózisokat a szakterületen jártas szakembernek kell meghatároznia (lásd az idézett publikációkat).

Emellett a. jelen találmány tárgyát képezi egy eljárás a B-sejt malignanciák, B~ sejtek által közvetített autoimmun betegségek, vagy a B-sejtek elfogyása által okozott betegség kezelésére és/vagy egy olyan, módszer, amivel késleltetni lehet egy olyan kóros állapotot, amit. B-sejt rendellenességek okoznak, és amiben a jelen találmány szerinti polipeptidet, polinukleotidot vagy vektort bejuttatjuk az említett malignanciák, betegség és/vagy kóros állapot által sűjtott emlősbe. Továbbá azt is előnyben részesítjük, ha az említett emlős ember.

Az ismertetett és más megvalósítási módokat a jelen találmány leírásában és példáiban ismertetjük. Á további szakirodalmi adatokat, ami az ellenanyagoknak, eljárásoknak, alkalmazásoknak és vegyüa jelen találmány szerinti használatára vs zna k-,megS:

és adatbázisokból, például elektronikus eszközök segítségévet Például a Medline nevű publikus adatbázis az Interneten keresztül érhető el» például a http://www.ncbí.nIm.níh.gov/PubMéd/medl^:ine.http címen. Más adatbázisok és címek is ismertek is ismertek a szakterületen jártas szakember számára, ilyenek például az alábbiak:

: / / www. ncbi, nlHunih. go v/, : / / www.infohiogen.fr/ , : / / ww’w.fmi. eh/biology/ research_tools.html vagy >://tigr.org/» és például a κ / / wwwdy cos. com-on keresztül tudhatok meg. A biotechnológiában a szabadalmi információk áttekintése és a visszatekintő kereséshez és a megfelelő tájékozottsághoz szükséges szabadalmi információk releváns forrásai a szakirodalomban megtalálhatok (Berks; TIBTECH 12, 352-364 (1994)(.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a. mellékelt ábrákat.

1. ábra: A tisztított bsc€D19*CD3 fragmens Coomassíe festése, különböző mennyiségű fehérjével. A marker molekulatömegét a baloldalon jelezzük.

Sö « »

2. ábra; FACS elemzés a bseCD19><€D3-mal (200 pg/ml) különböző CD 1.9 pozitív B-sejtvonalakon (BJÁB, 8KW6.4, Blin-1, Daudi, Raji), a. BLóO CDi9~negatÍv B-sejtvonalon és a CD3~pozi~ tív Jurkat sejteken és primer humán PBMC-kem A szaggatott vonalak a negatív kontrollokat jelentik.

3. ábra: A bseCD19xCD3 cítotoxicífása egy ⁵ⁱCr felszabaduláson alapuló esszében ncm-serkentett humán FBMC-kkel és bácios Idő 4 óra. Mind a három Ismétlésben a standard deviáció

7% alatt van.

4. ábra; Króm-felszabadulási toxíeitási vizsgálat a nemserkentett primer humán PBL-ekkel az L363 és NO piazrnacitóma sejtvonalak ellen, valamint a limfóma sejtvonal Daudi E;T arány 20; 1, az inkubálás ideje 8 óra.

5. ábra; A bscCD19»CD3 citotoxicitásának gátlása a kiindulási HD37 anti~CDI9 ellenanyaggal króm felszabaduláson alapuló esszében; az inkubálás ideje 8 óra; E;T arány 20:1, a bsc koncentrációja. 1 ng/ml.

6. ábra; Citoloxieitási vizsgálat nem-serkenteft PBMCkkel Daudi sejtek ellen, növekvő mennyiségű EGTA hozzáadása után, B:T arány 10:1, az Inkubálás ideje 4 óra.

« fc fc * « 4 V β * χ X Φ •S*© Λ*

7. ábra: A hscCDl 9*003 citotoxicítása egy ⁵¹Cr felszabadó lá.si vizsgálatban., nem-serkentett PBMC-kkel és Blin-l-gyel mint célsejtekkel különböző E:T arányok mellett; az inkubálás ideje 4 óra; a hagyományos feispecáfikus ellenanyag koncentrációja 3 gg/ml; a bscl7~lAxCD3 koncentrációja 100 ng/ml; az E:T arány -a jelzett.

8. ábra: A hseCD19*CD3 ellenanyag (FlAG-jelölést tartalmazó variáns) DNS- és fehérjeszekvenciája. A számok a nukleotid (nt) pozíciókat jelölik, a megfelelő aminosav szekvenciát a nukleotíd szekvencia alatt jelöljük. A bispecifikus ellenanyagot as. pozícióban végződik. Az első hat nukleotíd pozíció (--10--tol -5igj és az utolsó hat nukleotíd pozíció (1596-1601-es pozíciók) tar talmazza az EeoRI és Sáli restrikciós enzim hasítási helyet. Az 157-es nukleotídok specifikálják a vezérszekvenciát; a 82-414 és 460-831 nukleotídok kódolják a VLCD19-et és a VH-CD'19-et; ΐ 847-1203 és 1258-1575 nukleotídok kódolják a V_HCD3-at és a VtCD3-at; a 1576-1593-as nukleotídok a His jelölést kódolják.

£3.

9. ábra: A primer (malignus) CD19⁺ B-sejtek elfogyása, antológ primer T-limfociták bscCD19*CD3on keresztül való gyűjtésével.

A) Kiindulási pont (t=0): n= 3 χ lö⁶ PBL/luk mennyiséget oltunk egy 24~lukas szövettenyésztö lemezre, mindegyiket 1 ml térfogatú RPMU 1640 táptalajban,

A) mindegyiket 10 % FCS-sel kiegészítve. A CD 19* Bsejtek, valamint a CD4* és CDS* T-sejtek kiindulási százalékát jelezzük.

B) B-G relatív B-sáv és CD4* és CD8* T-sejt számok t~5 napos mkubálása. után 37 °C/S% CÖa mellett bscCD1.9*CD3 távollétében (B-C) vagy jelenlétében (D-G) (a koncentrációkat jelöljük), 60 E/ml ínterÍeukin-2-vel vagy anélkül. A negatív kontrollok vagy egyíáncü bispecifikus· ellenanyagot (17~lAxCD3) tartalmaznak irreleváns célsejt speeifitással vagy egyáltalán nem tartalmaznak bispecifikus ellenanyagot (C).

1.0, ábra: A bscCD19*CD3 tisztítási, lépései

Lábra; A bscCB 19*003 tisztaságának SDS-PAGE· elemzése. Kolloid Coomassie-blue-val festett SDS 4-12% gradiens poliakrilamid gélt mutatunk be. Az l-es és 6-os sávok molekulatömeg markerek, a 2-es sáv sejttenyészel. felülűszó; a 3-as sáv aktív frakció a katíoncserélö kromaiográfíábób a 4-es sáv aktív frakció a kobalt kelát affinitáskromatográfiáből ; az 5-ös sáv aktív frakció a gélszűrésből. Azonos mennyiségű fehérjéi (2 pg) elemeztünk mind. a sejttenyészet felülúszóból, mind a különböző oszlop-frakciókból, A molekulatömeg standardok méretét kDa-ban a jobboldalon adjuk meg. A nyíl mutatja a bscCD19xCD3 pozícióját.

* fc

12. ábra; A bscCD 19xCD3 kationcserélő kromatográfiája. A fehérje-koncentrációt a 280 nm-en mért abszorpció alapján mérjük (mAU, baloldal), A fehérje elűeiös profilját folyamatos vonallal ábrázoljuk. A nátrium-klorid lépcsős gradiens profilját egyenes folyamatos vonallal ábrázoljuk [%B_S jobboldal), az összegyűjtött frakciókat szaggatott vonallal ábrázoljuk, A bscCD 19xCD3-at az Fó frakcióban mutattuk ki.

.3. ábra: A bseCD19xCD8 granaja, A fehérk alapján mérjük (mAU, át rációt a 280 nm-en mért abszorpció Á fehérje elűciős profilját folyamatos vonallal ábrázoljuk. Az imidazol gradienst egyenes folyamatos vonallal ábrázoljuk í%S. jobboldal), az összegyűjtött frakciókat szaggatott vonallal ábrázoljuk. A bscCDI9xCD3~at az F7 frakcióban mutattuk ki.

14, ábra: Az antí-CD19xanti-ÜD3 gélszűrése. A fehérje-koncentrációt a 280 nm-en mért abszorpció alapján mérjük (mÁU, baloldal). A fehérje elűciős profilját folyamatos vonallal ábrázoljuk. Az összegyűjtőit frakciókat szaggatott vonallal ábrázoljuk. A bscCD 19xCD3~at az F7 frakcióban mutattuk ki.

15. ábra: A gamma-glutamil-tr 'áz (GGT) szintje a A GGT szinteket standard klinikai biokémiai módszerekkel határozzuk meg, és egység/1 formában fejezzük ki. Az időtengelyen a napok (d) láthatók

Φ φ

Φφ az első gyógyszeres kezelés után, és. nullával kezdve az órák, az egyes gyógyszerek beadása után, A nyilak a gyógyszer-beadás

16, ábra: Az A~B beteg lépőnek ultrahangos mérése A; A lép méretének meghatározása (1999, április 12.}, a bscCD 19xCD3 terápia előtt. Az ábra a mutatja (146 x 69,2 mm}, ami a maligrm nek következménye.

B: A lép méretének meghatározása (1999, április 16.}, 3 gg~ mai végzett kezelés után (április 14.)·,. majd 10 ug-mal végzett kezelés után, (április 15.}, Az ábra demonstrálja a lép 132 x 58,9 ram-re való zsugorodását, amit a. szisztémás hscCD19xCD3 kezelés okozott. Az egyedi méréseknek, az 1. táblázatban bemutatott értékektől való eltéréseit a különböző térsíkokban való ultrahang alapú szerv-méret meghatározással lehet meghatározni, A két dimenziót (^-}-szal és (-}~sxal jelöljük.

17., ábra: Vér leukocitaszámok a bscCD 19xCD3~maI végzett kezelésre adott válaszként. A leukocitak számát Giga pont/ liter dimenzióban adjuk meg. Az időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után, majd nulláról kezdve mutatja az órákat az egyes gyógyszerek hozzáadása után, A gyógyszer beadásának időpontját nyilak jelölik.

Λ * X φ

X* « φ

18. ábra; A C-reaktív fehérje (CRP) vérszínfjei a bseCD19xCD3 kezelésre adott válaszként. A CRF szinteket standard klinikai biokémiai eljárással, határozzuk meg, és mg/dl dimenzióban fejezzük ki. Az időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után, majd nulláról kezdve mutatja az órákat az egyes gyógyszerek hozzáadása után. A gyógyszer beadásának időpontját nyilak jelölik.

19. ábra: A tumor nekrozis faktor alfa fFNF) vérszintjei a kezelésre adott válaszként. A TNF szinteket

ELISÁ-val határozzuk meg, és ng/ml dimenzióban, fejezzük ki. Az időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után, majd nulláról kezdve mutatja az órákat az egyes gyógyszerek hozzáadása, után. A gyógyszer beadásának időpontját nyilak jelölik.

20. ábra: Az interleukin-6 (IL-ó) vérszintjei a bscCD19xCD3 kezelésre adott válaszként. Az interleukin-ó szinteket ELISA-val határozzuk meg, és pg/ml dimenzióban fejezzük ki. Az időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után, majd nulláról kezdve mutatja az órákat az egyes gyógyszerek hozzáadása után. A gyógyszer beadásának időpontját nyilak jelölik.

bscCDi9xCD3 k interleukin-3 (IL-8) vérszintjeí a ; adott válaszként. Az interIeukin-8 szin56 φ Φ * teket ELISA-val határozzuk' meg,, -és pg/ml dimenzióban fejezzük ki. Az időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után, majd nulláról kezdve mutatja .az órákat az eg szerek hozzáadása után. A gyógyszer beadásának ία nyilak jelölik.

22. ábra: Az oldható i.nterleu.kín-2 receptor alfa-lánc (IL2R) vérszintjei a bscCD19xCD3 kezelésre adott válaszként. Az IL2R szinteket ELISA-val határozzuk meg, és egység/ml dimenzióban fejezzük ki. Az: időtengely a napokat (d) mutatja az első gyógyszeres kezelés után. majd nulláról kezdve mutatja, az órákat az egyes gyógyszerek hozzáadása után. A gyógyszer beadásának időpontját nyilak jelölik.

A. találmányt a továbbiakban az alábbi biológiai példák alapján ismertetjük, amik csak illusztratív jellegűek, és nem te kinthetők a jelen találmány oltalmi kőre korlátozásának,

Variábilis (V) immunglobulin dornének klónozása

A HD37 hibridőmából származó V könnyű lánc (Vi.) és V nehéz lánc (Vb) doménjeit standard polimeráz láncreakcióval klónozzuk (Orlandi; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 3833 -3837 (1989)1. A cDNS szintézisét oligo dT prímerekkel és Taq polimerázzal hajtjuk végre.

VT 1 vk u A >

φ >

(1. számú szekvencia)

3Έ:

GAAGATGGATCeAGCGGCCGCAGCATCAGC (2. számú szekvencia) (3, számú szekvencia)

3”G:

ACCAGGGGCCAGTGGAIAGACAAGCTTGGGTGTCGTrrr (4, számú szekvencia)

S'VLBSRRV:

AGGTGTACACTCCATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA (5. számú szekvencia)

3VLGS15:

GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCrriGÁTCTCGAGeTTGG

TCCC (6. számú szekvencia)

5'VHGS15:

GGCGGCGGCGGC'TCCGGTGG7GGTGG'T7C?CAGGTS.MARTCTG

CAGSAGTCWGG (7. számú szekvencia)

AATCCGGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG (8. számú szekvencia)

Sí

X X ♦ Φ

X ♦

A V etemének. polimeráz láncreakcióval való amplifikálásához az 5'LI és 3'K prímereket használjuk, amik a V?.. domént határolják, és a nehéz lánc esetében az 5Ή1 és 3'G prímereket használjuk (Dűbel és mtsai; 3. Jnununological Methods 175, 8995(1994)1.

Az anti-CD3 seFc fragmens cDNS-ét A. Traunecker bocsátotta rendelkezésünkre (Traunecker: EMBO Journal 10, 3655>59 (1991)).

L Példa

Bíspeeífikus egyláncú fragmensek készítése és expressziőja eukariótákban anti~€D19 scFv fragmens előállításához a megfelelő és Vn-ré:

C £ü latként szolgáinak a Vl- és Vh- specifikus polimeráz láncreakcióhoz,. amiben az 5VL85RRV/3VLGS1S és az 5'VHGS15/3'VBBspEI oligonukleotid primer párokat használjuk. Ennek következtében átlapoló komplementer szekvenciákat viszünk be a polimeráz láncreakció termékeibe, amiket kombinálva kapjuk a későbbi fúzlős-FCR-ben a 15 aminosavból álló (Gly^Serbs-iínkert kódoló szekvenciát. Ezt az amplífikácíós lépést az 5'VLBR.RV/3'VHBspEI primer-párral hajtjuk végre, és a kapott. fúziós terméket (vagy inkább az anti~€D19 scFv-fragmenst) BcoRV és BspEI restrikciós enzimekkel emésztjük, maid így klónozzuk a Bluescript KS-vektorba (Stratagene), ami vagy az (EcoRI/SalI klónozott) anti-17-lÁ/anti-CD3 bíspeeífikus egylán59

Φ V φ-φ cú ellenanyag kódoló szekvenciát tartalmazza, egy N-terminális FLAG-jelőléssel [Mack: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7025 (1995)], vagy ennek egy módosított verzióját, a FIAG/epltop nélkül JKufer: Caneer Immunoi. Immunother. 45, 193-197 (1997)], ezzel az' anti-17- IA-ΐ helyettesítve az antí-CD19-specifltássaÍ, és megőrizve a C terminális anti-scFv-fragmenst kapcsoló, 5 linkért. Ezt kővetően a DNS fragmenst, ami az anti~CD19/anti~ CDS bispecifíküs egyiáncú ellenanyagnak mindkét verzióját kódolja, a VLcdis - VHeo 19- VHcto - VLcds dómén- elrendezéssel, EcoRI/Sall fragmens formájában klónozzuk az ismerteteti: pEF DHRF expressziós vektorba (Mack: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7025 (1995)). A kapott plazporáeióval: a szelekciót, a gén amplifíkációját és a fehérjetermelést a szakirodalomban ismertetett módon hajtjuk vegye (Mack: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7025 (1995)]. Az alábbi példákban a bscCD19xCD3 FLAGot tartalmazó verziójával kapott eredményeket mutatjuk be.

való tisztítása 4 mg/liter felúlúszó kitermelést adott. A bsc-ell anyagnak a C-terminálís hiszüdín-farok segítségével végzett affinitáskromatográfiáját Ni-NTA oszlopon végeztük, a szakirodalomban Ismertetett módszerrel [Mack: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 7021-7025 (1995)). A bsc-Ab-t egy külön csúcs formájában eluáljuk a Ni-NTA oszlo β » ♦ *

<>ö

200 mmol/1 imidazol koncentrációnál. Az SDS-PAGE~t Laemmli módszerével végeztük el [laemmli; Natúré 27, 680-685 (1970)], 12%-os gélen, amit Coomassáe BriHiant Blue R250-ne.l festünk meg a bsc-ellenanyag tisztaságának elemzése céljából· Az SDSPAGE elemzés eredményei (1. ábra) a. bsc-ellenanyag várt méretét (60 kDa) mutatják.

A bsc-ellenanyag CDS és CD .19 elleni kötési specifitását €D3~pozitiv Jurkat sejtek, humán PBMC-k és számos különböző oziuv fc

16.4. a Daudi, a noma sejt és Raji sejtv

I. az felöl cíto metriás elemzésével mutatjuk ki. A CD 19-pozitív Saudi, BJAB (Burkitt limfőma), SKW6.4 (humán EBV-vel transzformált B-sejt) és Blín-1 (pre B-sejtvonal). B-sejtvonálakat használjuk az áramlási citometriás elemzésekben és a krómfelszabadulási vizsgálatokban. Á .Jurkat egy CDS-pozlüv T-sejtvonal; a BL60, valamint az NO és L363 plazmacitóma sejtvonalak negatívak mindkét felszíni molekulára (CD3 és CD 19). A sejtvonalakat komplett RPMI 1640 táptalajban ÍjBiochrom) tenyésztjük 10% FCS-sel (GIBCO) kiegészítve.

1.x 10^ö sejtet mosunk, foszfáttal puffereit sóoldattal, 200 ul foszfáttal puffereit: sóoldatban újra szuszpendáljuk 10% Vemimmun- nal (Centeon, Marburg, Németország ) és 0,1%

3-raal, maid 30 percig 4 °C~on inkubáliuk,. Egv centrtfugálásí ί**» lépés után {lÖÖ*g, 5 perc) a sejteket 50 μ! foscCD19xCD3-ban ínkubaijuk (200 ug/ml foszfáttal puffereit sóoldatban 10% Vernimmunnal és 0,1% NaNs-mal) 30 percig 4 °C-on. A sejteket kétszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal. A bsc-ellenanyag kimutatására egy ffis-jelölés (Dianova) elleni, FITC-vel konjugált ellenanyagot használunk. Az irreleváns bse-Ab I7-1AxCD3, amit ugyanabban az expresszíós rendszerben állítunk elő mint a hseCD19xCD3-at, vagy a His-jelőlés önmagában, szolgál negatív kontrollként. Az áramlási citometríát egy Becton Díckinson FACSean-nel végezzük el. Nincs kimutatható kötődés a BL60 sejtekhez, amik sem CD19-et sem CD3-at nem expresszálnak (2.

4.

ck. ellen

A bscCD 19x0133 ellenanyag nagyon toxikusnak bizonyult számos limföma sejtvonalra egy ⁵¹Cr felszabadulási vizsgálatban (3. ábra). Humán perifériális vér mononukleáris sejteket (PBMC), mint effektor sejteket izolálunk random donorok friss felülüszójából Lymphoprep™ (Nycomed) gradiens centrifugálással, majd ezt kővetően a trombocíták eltávolítása céljából egy WOg centrifugálási lépéssel, A CD19~pozitív B-sejteket DynabeadsjR) M-450 CDi9~ee! (Dynal) távolítjuk el. A kiürített sejtpopulációkat áramlási citometriával (Becton Dtckinson) elemezzükpxmi a CDl'9-pozitív sejtek 99%-os kiürülését mutatja. A PBMC-ket éjÍO * ♦ « » ¥6.41

Canberra Packard) vizsgáljuk, hogy mennyi ⁵¹Cr szabadult fel.

szakán át 37 *€-on, 5%-os CO2 atmoszférában CD19~pozitív B-sejtvonalakat (Raji, Blin I, Daudi, BJAB, használunk célsejtekként

A citotoxícitást standard krőmfelszabadulási vizsgálattal mérjük, kerekfenekű, 96-lukas lemezeken (Nunc), RPM! 1640 komplett táptalajt (Biochrom) használva, 10% FCS-sel (GIBCO) kiegészítve.

Nem-serkentett PBMC-ket adunk 80 μ,Ι táptalajban minden egyes lukhoz, amik 20 pl, különböző koncentrációjú bsc-ellenanyagot tartalmaznak. Ezután 100 μί ^slCr~jelzett célsejtet <1*1 Ö⁴) adunk hozzá, a lemezeket 3 percig 100*g-vel centrifugáljuk,, majd 4 óra hosszat 37 °C-on ínkubáijuk, 5% COs-t tartalmazó atmoszférában. Egy további centrífugálásí lépés után 50 m.l felülúszót eltávolítunk, majd egy gamma-számlálóban (TopCount, d

A spontán felszabadulást úgy mérjük, hogy a. célsejteket * sejtek vagy ellenanyagok nélkül ínkubáijuk, és a maximális felszabadulást ügy határozzuk meg, hogy a célsejteket 10% Triton Χ-100-zal ínkubáijuk, A célsejtek hsc-eöenanyaggal való inkubálásu, effektor sejtek nélkül, nem eredményez mérhető lízist. A. specifikus lizis százalékát a következőképpen számítjuk ki: aspecifikus felszabadnlás(%h((cpm, kísérleti felszabadulás) (cpm, spontán fölszabadulás)]/((epm₅ maximális felszabadulás) .fcpm, spontán felszabadulás)) * 100. Minden tesztet három párhuzamosban végzünk et. Mindegyik kísérletben a három párhuzamos standard deviációja 6% alatt volt. Az in vivő körülmények ♦ ♦♦♦:·» χχ χ« megközelítéséhez egészséges donorokból származó nem-serkentett PBMC-ket használunk effektor sejtekként. A citotoxicitás gyors, 4 órán belüli indukcióját megfigyelhetjük bármilyen T-sejt •előserkentésí protokoll nélkül· Kontrollként egy eltérő tumor-aktivitással rendelkező bsc-ellenanyag. <bscl7~lAxCD3), amit ugyanabban a rendszerben állítunk elő, mutat lítikus aktivitást, de ez nem szignifikánsan magasabb mint a táptalaj háttér. Emellett nem figyelhető meg citotoxikus aktivitás az NO és 1363 plazmacitöma sejtvonalak, mint célsejtek használatakor, amik nem expresszálják a CD19et. (4. ábra). A kompetíciós vizsgálatokban, amikben növekvő mennyiségű HD37, CD19-specifi'kus kiindulási monoktonális ellenanyagot használunk, a bscCD19xCD3 citotoxikus aktivitása majdnem teljesen blokkolható (5. ábra), Ezek a kontrollok azt mutatják, hogy a. bscCD19xCD3 által közvetített citotoxikus hatások antigén-specifikusak. Ahhoz, hogy több információt kapjunk arról a molekuláris mechanizmusról, hogy a bscCD19xCD3 ellenanyag miképpen pusztítja el a CD19-pozítív célsejteket, megpróbáltuk EGTAval blokkolni a bscCD19xCD3 által közvetített citotoxikus hatásokat, Amint az a 6. ábrán látható, a bscCD19xCD3 citotoxikus hatása teljesen blokkolható EGTA-val, ami azt mutatja, hogy a specifikus lízís inkább egy T-sejt által közvetített hatás (valószínűleg a. perforín bioszintézis úton keresztül) mint az ellenanyagnak magának egy közvetlen (azaz például apoptézist índu64

Nem-serkenteft T-sejteket használva, még 1 ng/ml ellenanyag koncentráció alatt is a Blin-1 sejtekkel szemben szignifikáns eitotoxikus hatás figyelhető meg (7. ábra). Még viszonylag alacsony E;T arányoknál (5:1 és 2,5:1) és nagyon alacsony ellenanyag koncentrációknál (lö-lOO pg/ml) a bscCD19xCD3 ellenanyag képes gyorsan indukálni a nem- serkentett 7-sejtek specifikus eitotoxikus aktivitását (7. ábra). Ezzel ellentétben, egy hibrid-híbridóma technikával előállított hagyományos bispecifikus CD19xCD3 ellenanyag (Bohlen: Blood 82, 1803-121 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 53 18 4310-4314 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 57 1704-1709 (1997): Bohlen: J. Immunological Methods 173, 55-62 (1994)) nem mutat szignifikáns eitotoxikus aktivitást ilyen körülmények között, még 3000 ng/ml koncentrációban sem (7. ábra). Ehhez a. hagyományos bispecifikus ellenanyaghoz további T-sejt elő-serkentés és magas ellenanyag koncentráció kell (körülbelül 100 ng/ml), hogy specifikus T-sejt cítotoxicitást índuami összhangban van a szakirodalommal f Bohlen: Blood

4310-4314 (1993); Bohlen: Cancer Rés. 57 1704-1709 (1997); Bohlen: J. Immunological Methods 173·, 55-62 11994)).

5. Példa

A primer (malignus) B-sejtek kimerítése autológ T-sejtekkei, a hscCO19.xCD3 eitotoxikus hatásán keresztül ihoz. hogy a bscCD19xCD3 eitotoxikus aktivitását megbecsüljük primer malignus B-sejteken, B-CLL-ben (B-sejt ere ** * * « « krónikus limfatlkus leukémia) szenvedő beteg perifériáké véréből Fieoll sűrűség-gradiens centrifugálássai mononukleáris sejteket izolálunk. Ezeket a sejteket azután S napig létében vagy távolié tőben tenyésztj ük 37 C~ »% FCS-sel, és adott esetbenben 60 on, 5% COz j«

E/ml interleukin-2-vel kiegészített RPM1 1640 táptalajban. Az áramlási cítometriás elemzésből kiderült, hogy ennek az NHL

k (akit később szisztémásán isis ver xntai

92,6% CD 19-pozitiv B-sejtet («célsejt) tartalmaznak és '7,4% CD3-pozitív T-limfocitákat («effektor sejtek), .2,6:4,3 CD4/CD8 Tsejt arány mellett. Ezeknek a CD 19-pozitiv B~sejteknek a legnagyobb többsége malignus sejt.. 3* lö⁶ PBL/ml per luk sejtet viszünk 1 ml térfogatban egy 24-lukas szövettenyésztö lemezre. Negatív kontrollként szolgál a tenyésztő táptalaj plusz inte.rleukin-2 és tenyésztő táptalaj plusz inferleukin-2 az irreleváns bsei7-lAxCD3 bispeeíSkns egyláncú ellenanyaggal (Mack:.

Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 92, 70217025 (1995)), 0,5 ag/ml koncentrációban, Amint az a 9. ábrán látható, a CD 1.9 sejtek kimerítése nem volt kimutatható ilyen körülmények között az inkuhálás után 5 nappal. Ha azonban a bscCD 19xCD3~at 0,5 pg/ml vagy 0,05 pg/ml koncentrációban adjuk hozzá (interleukín-2 jelenlétében vagy távollétében), majdnem az összes CD 19-pozitiv B~sejt elpusztul. Ebben az időpontban a tenyésztett sejtek főleg T-limíoeiták voltak, amikben a CD4/CD8 T-sejt arány körülbelül 1:2 - 1:3 között volt. Ez iga66 ν ·* φ Φ 4 4 4 «χ ♦:·** zolja a bseCD19xCD3 kivételes toxieítását a CD 19 pozitív Baejtek ellen, mivel a primer B-sejtek teljes kiürítése autológ Tsejtekfcel már 50 ng/ml koncentrációval indukálható, nagyon előnytelen kiindulási efíektoneélsejt aránynál, ami kisebb mint 1:10, még hozzáadott interleuki.n-2 vgy más további T-sejt serkentés nélkül is.

A bscCD 19xC.D3~at arany hörcsög petefészek (CHO) sejtekben állítjuk elő, amik stabilan transzfektálva vannak egy bscCD lüxCDS-at és emellett egy hex&hísztidínt és egy FLAG-jelökódoló cxnressziös vektorral (pEF-DHFP, lásd 2. példa). A sejteket szérummentes közegben (Rencyte) szaporítjuk „hollow fibre” reaktorban (Umsyn). ötszáz ul sejttenyészet felülúszót gyújtunk, össze, majd sterilre szüljük egy 0,2 pm-es szűrővel (AeroCap; Pali Gelman).

A öseCD19xCD3»AT Western blot-tal mutatjuk ki és határozzuk meg mennyiségileg, egér antí-PLAG IgG (Sigma) és alkalíkus íoszfatázhoz kötött kecske- anti egér IgG (Sigma) használa.táÁ kimutatást kemílnmineszeenciával vegezs

Ci

BCI.P/HBT rendszert (Devitron) alkalmazva.. A fehérje-koncentrációkat a Bradford módszerrel határozzuk meg (Biorad), szarvasmarha IgG-t (Biorad) használva fehérje standardként. Az oszlopfrakciók tisztaságát redukáló nátrium-dodecü-szulfát (SDS)

Bisz/Trísz 4-12%-os poliakrilamíd gradiens gélelektroforézissel φ »'«

CtA ffirr za (Novex).

A bscCD19xCD3 homogenitásig való tisztításához kationcserélő kromatográfiára, kobalt kelát affinitáskromatográfíára, és utolsó lépésként gélszűrésre van szükség. Ezeket a tisztítási lépéseket standard protokollokat használva hajtjuk végre (lásd az alábbiakban). A tisztítási eljárás folyamatábráját a 10. ábrán mutatjuk be.

Kaiioncserélő kromatográfia; A CHO sejtekből származó sejttenyészet felülüszókat két térfogat € pufferrel keverjük össze [30 mmol/1 morfolino-etánszulfonsav (MES), 20 mmol/1 nátriumul/ I EBTA, 0,3 mmol/1 henzamidin-hídroklorid,

5,5), majd egy 70 ml-es SP Sepharose Fást Flow kationcserélő oszlopon (Pharmacia) bocsátjuk át, 20 ml/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot A púderrel hozzuk egyensúlyba (20 mmol/1 MES, 20 mmol/ϊ nátrium-klorid, pH~5.,8). Az oszlopot 5 térfogat A pufferrel mossuk, majd a bseCD19xCD3-at egy lépcsős gradiklorid. 3 n enssel eluáljuk [45% B puffer (20 mmol/ i mol/1 nátriumklorid, pH~5,8) A púderben). Az eluátunx kapott 0,045 térfogat 1 mol/1 TRIS-HCl-t (pl-l~8,5)_s ami 47 mmol/1 ímidazolt tartalmaz, majd ezt követően sterilre szűrtük (0,2 am; AcroCap). A kationcserélő kromatográfia egy tipikus elúciös profilját a 12. ábrán mutatjuk be. A. bscCD19xC,B3 a 6-os frakcióban található.

Kobalt kelát: affinitás-tisztítás: A kaiioncserélő oszlopról kapott eluá.tumot. 2,5 ml /perc áramlási sebességgel bocsátjuk át egy 10 ml-es Chelating Sepharose Fást Flow són (Pharmacia), amit AO pufferrel (50 mmol/1 NazHPCh, 400 mmol/1 nátrium-klorid, pH~8,0) hoztunk egyensúlyba, Az oszlopot előre egyensúlyba hoztuk 0,1 mol/1 kofealt-kloriddal, 33 oszloptérfogatnyi AO pufferrel, A pufferrel (50 mmol/1 Na:rHPÖ4_; 400 mmol/1 nátrium-klorid, 2 m.mol/1 imidazol, pH^::::6,4) és egy 0-12%-os B-puffer gradienssel (50 mmol/1 Ha2HPO4, 400 mmol/1 nátrium-klorid, 500 mmol/1 imidazol, pH-6,4) A pufferben való mosás után a bscCD 19xCD3-at egy lépésben eluáljuk 30 ml 100%-os B pufferrel Az eluátumot sterilre szűrjük, majd körülbelül tízszeresre töményítjük egy MacroSep berendezésben (Pali Geliman; lö kDa vágási érték), A kobalt kelát affinításkromatográfia tipikus elűciős profilját a. 13. ábrán mutatjuk be. A bscCD 19xCD3-at a 7-es frakcióban mutattuk ki.

Gélszűrés: A kobalt-kelát affinitás oszlopról származó töményített eluátumot 0,75 ml/perc áramlási sebességgel visszük fel egy 124 mi-es High boád Superdex 200 oszlopra (Pharmacia; preparaiív minőség), amit foszfáttal puffereit sóoldattal (Cibco) hoztunk egyensúlyba.. A bscCD 19xCD3 abban a frakcióban eluálődik, aminek a molekulatömege körülbelül 55 kDa-nak felel meg (.14, ábra, 7. frakció). A bseCD19xCD3~at tartalmazó gélszurési frakciót 5% humán szérum-aibuminnal (Behring) egészítjük ki, majd egy 0,1 um-es szűrővel (Míllex; Millipore) sterilre szűrjük,

A bscCD 19xC.D3 bőségét a sejttenyészet felűlűszőban és a különböző aktív oszlop-frakciókban, SDS-PAGB-val való elemzés alapján, a 11. ábrán mutatjuk be. A bscCD 19xCD3 a fő fehérjecsík a sejttenyészet felűlúszőkban (2-es sáv). Az erősen tisztított * * ♦ » használni, ábra, S~ős anti-CD19xanti-CD3, amit a humán terápiában lehet nem tartalmaz 'kimutatható szennyeződéseket (11.

sáv).

Egy kivételes alkalmazás során egy beteget (A-B, nő, 1937ben született), aki B-sejt eredetű krónikus limfatikus leukémiában (B-CIX) szenved, kezeltünk a bscCD19xCD3 bíspecifikus egyláncű ellenanyaggal.

A beteg kortörténete és a kezelés magyarázata:

A'betegnél 1992-ben. diagnosztizálták a 8-CLL-t, A kiindulási diagnózis időpontjában a betegség különböző nyirokcsomó régiókat és a lépet érintette; emellett autoimmun eredetű hemolitikus anémia és egy immunglobulin defíciencia volt megfigyelhető.. Á betegnek struma nodosa-ja van, ami jól kezelhető, és eutireotikus állapotban van 2,5 mg/nap earbimazollaJ való kezeA beteg több sorozat kemoterápiás kezelést kapott chlorambueillal és prednizonnal, 1992 és 1994 között, A betegség továbbfejlődése után a kezelést ciklofosziamidra, doxo.mbioin.ra, vinkriszlinre és prednizonra változtatták (CHOP, 8 sorozat), és több mint egy éves visszafejlődés volt megfigyelhető. Egy új viszszaesés után a beteg újabb 6 sorozat CHOP-ot kapott, ezt követte

chloram bucii és prednizon, valamint egyetlen, csak chlorambucílos kezelést, ami a betegség semmilyen javulását nem okozta. 1998-ban besugározták a lépőt, hogy gátolják a beteg fokozódó -szplenomegáliáját. A beteg súlyos csontvelő depressziót kapott, többszöri fertőzéses komplikációval. Anémiájának és trombocitopéniájának kezelése vörös vérsejtek és vérlemezke helyettesi tesek transziuziojat igenyelte.

A betegség előrehaladott állapota és a károsodott csontvelő funkció miatt a betegnél nem javallott az agresszívebb vagy nagy dózisú kemoterápia alkalmazása. Az a.nt.l-CD20 ellenanyag ritwdmabbal való kezelés nem alkalmas, mivel a rituximahnak a B-CLL-ben való hatását: eddig még nem igazolták tisztán.

Egy FACS elemzésből kiderüli, hogy a beteg perifériális vérsejtjeinek 95%~a. CD 19 pozitív, míg a sejtek 77%-a expresszálja a CD2Ö antigént. A beteg perifériális vérsejtjeinek a bscCD19xCD3~mal való ínkubálása a CD 19 pozitív B-sejtek jelentős kimerülését eredményezte (lásd 5. példa). Ezért az orvosok elhatározták, hogy egy kivételes eljárás keretében a beteget az új hsc€D19xCD3-ma! kezelik. A beteget részletesen tájékoztatták a vegyület újdonságáról, valamint a kezelés potenciális kockázatairól és előnyeiről. Teljesen megértette a magyarázatokat, és írásban beleegyezett ebbe a kivételes kezelési eljárásba.

A klinikai beadás leírása:

A kezelés megkezdése előtt a beteg teljes klinikai kivizsgáláson és alapos diagnosztizáláson esett át. hogy igazoljuk a betegség kiterjedtségének mértékét, és hogy kizárjuk a további kockázati faktorokat. A beteg megfelelő klinikai állapotban volt, anémiával, trombocitopéniával és testtömegvesztéssel, de mindenféle szív-érrendszeri, károsodás vagy más komplikációk nélkül, amí megakadályozhatta volna a bscCD19xCD3 alkalmazását. Az első kezelés napja előtti éjjelen a beteg migrénes fejfájásban szenvedett. A bscCD19xCD3 beadásához a beteget kórházi osztályon tartottuk, intenzív felügyelet mellett, hogy biztosítsuk a gyors kezelést, bármilyen, előfordulható vészhelyzet esetében. Ahhoz, hogy megakadályozzunk a tumor lízíse által okozott, mindenféle akut. ci~ tokín reakciókat és komplikációkat, a beteg profilaktikusan intravénásán 2 mg clemastine-1 (Tavegil) és 200 mg eimetídint (Tagamét) kapott, valamint 300 mg allopuri omeprazolt (Antra) kapott.

és 20 mg .Az alkalizálást és a heparinízálást a kezelés során és a kővető is fenntartottuk. A beteg emelleb ges tüneti kezelést megkapott,

A gyógyszer beadása előtt és után vérmintákat vettünk, hogy kövessük a biokémiai, hematológiai és immunológiai paramétereket.

ziőban izotöniás ami 5% szérum-albumint (HSA) tartalmazott. Az infúzió során a betegen nem észleltünk káros hatásokat. Az infúzió után körülbelül 1 órával a betegnek hidegrázása volt, majd megizzadt, a vérnyomása enyhén lecsökkent (körülbelül 10 Hgmmj, és a testhőmérséklete enyhén .megemelkedett (+0,5 °C) néhány órára. Emellett a fejfájása enyhén erősödött. A beteg újabb 2 mg Tavegilt és 200 mg Tagametet, 250 mg prednizolont (Solu-Decortin) és 50 mg pethidint (Delantlnl kapott. Ugyanazon a napon mindén, tünet elmúlt, következmények nélkül.

A bscCD19xCD3 második beadása (1999. április 154:

Egy második, 10 pg-ns bscCD19xCD3 dózist adtunk be egy nappal később, azonos körülmények között. Körülbelül 1 órával az infúzió után a betegnek erős hidegrázása, láza. (39,2 °C) volt, enyhén, hiperventilláít és hipotenzív reakciója volt. A beteg 2 mg Tavegilt 200 mg Tagametet és 300 rng Solu-Decortínt, valamint 15 mg piritramidot (Dipidolor) kapott:, A kardiövaszkuláris funkciók stabilizálására a beteg dopandn infúziót és tblyadékpétlást

A kezelést követően a tünetek jelentősen enyhültek, a beteget éjszakára átszállítottuk a. kardiológiai osztályra, hogy biztosítsuk az életfolyamatok megfelelő ellenörzését, es vésznél récééi a

áció nélkül.

t átszállítottuk a normál osztályra, minden további kompAkövetkező 3 nap során a betegnek továbbra ís höemelkedése volt (körülbelül 37,2 °C)> enyhe mellhártya izzadmánya keletkezett, a második dózis után egy nappal (1999, április 16.}, valamint az alsó végtagjai enyhén ödémásak lettek (1999. április

J

18,). A kardíovaszkuláris funkciók stabilak maradtak, és a laboratóriumi eredmények nem mutattak említésre méltó változásokat a biztonság szempontjából, azzal a különbséggel, hogy a ganimaglutamiltranszferáz megnőtt a bscCD19xCD3· második dózisa után (15. ábra).

Mivel a bscCD 19xCD3~at a beteg tolerálta és a káros mellékhatások ellenőrzés alatt voltak tarthatók tüneti kezeléssel, az új hscCD1.9xCD3 beadását folytatjuk ennél a betegnél.

A bscCD 19xCD3 klinikai és immunológiai hatékonysága:

A lép és ót hasi valamint öt hónaljt nyirokcsomó ultrát vizsgálatát végeztük el a bscCD 19xCD3 második dózisának beadása után egy és négy nappal. Már- egy nappal a után (1999, április 164 a nvi u ug-os ö valamint a lén körülbelül 20%-kal kisebbek jest.

Ezt a megfigyelést megerősítette egy második ultrahangos vizsgálat 1999. április 19-én. A lép tömege 350 grammal csökkent (1630-ról 128Ö-ra az alapvonalnál 199. április 19-én) (1. táblázat, 1.6. ábra).

i-iematoiogiai eredmények:

A fehér vérsejtek száma, amik főleg malignus B-sejfek, a kezelés során és az utána, következő napokon csökkent (2. táblázat, 17. ábra). A €-reaktív fehérje (CRF) egy akut fázis reakció fe<· fc hérje, ami a T-sejt .aktiválását és a pro-gyulladásos citokinek hatását tükrözi. 10 pg bscCD 19xCD3 beadása után jelentősen megnőtt, ezt követte egy folyamatos csökkenés a következő 3 megfigyelési napon {2. táblázat, 18. ábra).

immunológiai eredmények.:

A szérum citokinek szintjét:, ami a vegyüiet beadására adott akut immunológiai választ tükrözi, az űj vegyüiet beadása előtt és utána különböző időpontokban mértük. A citokinek és az oldható interleukin-2 receptor szérum-szintjét mennyiségi ELÍSÁmérjük, a gyártó utasításainak megfelelően.

A tumor nekrozís faktor alfa szintje szignifikánsan, függő módon megnőtt a bscCD 19xCD3 beadása utáni első órában (19. ábra).

Az mterieukín-6 (IL-ó) és az interlenkin-8 (IL-8) szintén szignifikáns és dózisfűggő szintemelkedést mutatott. A maximális szintjüket a bscCD 19xCD3 - beadása után 2-4 órával lehetett megfigyelni (20, 21. ábra). Mindegyik eitokín szintje visszatért -az órán belül.

Az oldható interleukin-2 receptor szintje már az alapvonalon is magas volt, ami azzal magyarázható az interleukin-2 receptort expresszálö malignus Bsejtek tömegével. Az új bscCD !9xCD3 beadása után az -oldható interleukin-2 receptor szintjének növekedése figyelhető meg, ami az efíektor sejtek aktiválására utal (22. ábra).

♦ * ♦

* # * X « *·* > 8 » »«

Következtetések:

Az új bscCD19xCD3--at biztonságosan be lehetett adni refraktórikus B-CLL-hen szenvedő betegnek. A bse.CD19x€D3 tolerabilitása. 3 pg-os és lö gg~os dózisban elfogadható volt, és jól kézben tartható profilaktíkus módszerekkel és tüneti kezelésekkel.

Az új bseCD19xCD3 az ultrahangos vizsgálatok alapján a beteg korábban megnagyobbodott lépőnek és nyirokcsomóinak zsugorodását okozza. Mivel a lép és a nyirokcsomók megnagyobbodását malignus B-sejtek besz&rődése okozza, a zsugorodás a malignus B-sejtek bscCD19xCD3 kezelés hatására történő pusztulását tükrözi.

A szakterületen ismert, bármelyik másik bispecifikus CD19xCD3 ellenanyaggal éles ellentétben a találmány szerinti bispecifikus CD19xCD3 ellenanyag (bscCD19xCD3) klinikai hatékonyságot mutat a B-sejí eredetű nem-Hodgkin limfómában, ígnus B-sejtek elfoglalt lhnfoid szervek zsugoradása alapján lehet mérni. A hscCDi9xCD3 előnyösen kliníkaíla.g hatékonynak bizonyult, meglepően alacsony dózisoknál, amit a beteg a. szisztémás beadás után jól tolerált. Tehát a bsoCD 19xCD3 klinikai hatékonysága igazolja az m vitro meghatórozott kivételes eitotoxikus aktivitását.

A bscCD19xCD3 hatása a nyirokcsomók és a lép méretére

B-sejtes limfómában szenvedd .gos mérések

			.1.999, 04. 12,	1999. 04, 16.	1999.04. 19.
Nyirok-
csomók	hasi	b	54x59x14 _mm	42x30x13 mm	42x30x14 mm.
		2)	56x33x18 mm	43x33x18 mm	43x30x16 mm
		3)	46x3-2x27 ma	46x31x22 mm	47x32x23 mm
	hónalj	hal	36x24x16 mm	34x22x15 mm.	30x22x14 mm
		jobb	37x24x13 mm	33x20x11 mm	32x23x14 mm
W			270x146x69 mm	265x132x64	265x128x63
			1630 g	mm 1340 g	mm 1280g
A	bárom	hasi	nvírokesomó,	az egyik bak	ddalí és az

jobboldali hónaljt nyirokcsomó és a lép méretét szonográfiávai határozzuk meg, egy Toshiba SSA1.Ö0 berendezés használatával, A méreteket három dimenzióban, mm-ben adjuk meg, A lép tömegét a méretéből és az ultrahangos sűrűségéből számítottuk.

Ή

» t » i ♦ > * « 4 i « « φ

» « «

* ♦♦ *

« β>

φ φ * X

A gamma-gluiamil-transzferáz (GGT), a laktát-dehidrogenáz (LDH) és a C-reaktív fehérje (CRF) vérszintjét standard, klinikai biokémiai módszerekkel határozzuk meg, és Egység/ ml- ben (GGT), Egység/l-ben (LDH) és mg/dnri-ben (CRF) adjuk meg. A leukociták számát Giga pon.t/1 egységben adjuk meg, a limfocita számot az össz-leukocíta számok százalékában adjuk meg. Áz első görbe az 1999. április 14-én mért alapszint, a kezelés előtt. A második görbe a 3 pg bseCD19xCD3-re adott válasz április 15én (amit április 14~én adtunk be). Á második, ugyanazon a napon beadott lö gg vegyülettel végzett kezelésre adott választ mutatjuk be a 3. görbén. Az utolsó négy görbén a kiválasztott markerek vérszintjét adjuk meg a hatóanyaggal végzett kezelés

Az alábbia ismertetjük a leírásban említett szekvenA SZEKVENCIÁK J'E' < i > Általános információ:

(i) BENYÚJTÓ:

(A) . NÉV: Döerken, Bernd (B) UTCA: LyckaUee 47 (C) VÁROS: Berlin (E) ORSZÁG: Németország (F) IRÁNYÍTÓ SZÁM: 14055 (B) UTCA: Finauer Str, 12 (C) VÁROS; München (E) ORSZÁG ; Németország (F) ÍRÁ.NYÍTÓSZÁM: 14055 <n) A TALÁLMÁNY Új CDI9xCD3 specifikus polipeptidek és alkalmazásuk.

CÍME:

(ni) A SZEKVENCIÁK SZÁMA; 10 * .· a í

SÖ * « (ív) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:

(Bj SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (Dl PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.30 (EPO)

1, számú szekvenciavázlat (í) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 36 bázispár (B) Típus: nukleínsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ií) A molekula típusa: más nukleínsav (A) Leírás: / desc~ „oiigonukleotid” (iii) Elméleti: igen (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

G&&GCACGCG TAGATATCKT GfSTS&CCCAA WCVCCA .16

2. számú, szekvenpiavázlat (ί) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 30 bázíspár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav

T rá s · / ó esc=*n1; ffAm ikif»ní i d ” (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

GAAGATGGAT CCAGCGGCCS CAGCATCAGC 38

3. számú szekvenciavázlat fi) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú

Topológia: lineáris

A molekula típusa: más nukleinsav í’Al Leírás;

^;:’^!oligonukieotid” (xi) A szekvencia leírása; 3, számú szekvencia

CA.OCCCGCCA TGGCOOASGT SCAGCTOC&S S&G szánni sz enciav

i) A szekvencia jellemzői:

(B) Típus; nukleinsav (C) Szál típus: egyszálú pl) A molekula, típusa: más nukleinsav (A) Leírás; /desc^fóligonukleotíd” (ni) Elméleti; Igen (xi) A szekvencia leírása; 4. számú szekvencia &CCAGSGSCC AGZGOACAGA CAAÖCTTGGS TGTCŐTTTT

5. számú szekvenciaváziat

A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 34 bázispár

Száltípus: egyszái (D) Topológia: lineáris ü A molekula típusa: más nukleínsav (A) Leírás: /desc=’^?oligonukleotíd” (ííí) Elméleti: Igen (xl| A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

AGGTGTACAC TCCATATCCA GCTS&CCCAG TCTCCA

6. számú szekvenciaváziat $ A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 48 bázíspár (B) Típus: nukleínsav (C) : Szálripus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula. típusa: más nukleinsav (A) Leírás; / desc-^olígonukleotid* (iii) Elméleti: Igen (xi) Á szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

GGAGCCGCCG CCGCCAG&AC CACCACCTTT G&TCTCGAGC TTGGTCCC 48 /, számú sz (ij A szekvencia je (A) Hossz; 4 (B) Típus: nukleinsav aiapus: egyszar (D) Topológia: lineáris

A molekula típusa: más nukleinsav (A) Leírás: /desc^::;:'^>oligonuklcotid'^:

Elméleti: Igen

A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia

GGCGGGGGCG GCTCCGOTÖÖ TGGTGGTTCC GAGGTACTGC AGAGTCGG

4S

8.. számú szekvenciavázlat (í) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 39 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) Leírás: /desc^::::oligonukleotid” (Ili) Elméleti: Igen

AATCCSGAGG ÁG&CGOTGAC CCTGGTCCC? 'TGGCCCCAG

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 1611 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál típus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típussá: cDNS (iii) Elméleti: nem

Név/kulcs: CDS

Lokalizáció: 11... 1603 (xi) A szekvencia leírása: 9. számú cveneia

GAAWCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 49

Met Gly Trp· Ser Cys Ile Xle Len Phe Len Val Alá Thr

1

5

10

GCT

ACA

GGT

CTC

CAC

TCC

GAC

TAG

AAA

GAT

GAC

GAT

AAG

GAT

ATC

97

Alá.

Thr

Gly

Val

His

Ser

Asp

Tyr

Lys

Asp

Lys

Asp

Ile

IS

20

25

CAG

CTG

ACC

CAG

TCT

CCA

GCT

TCT

TTG

GCT

G'TG

TC'T

CTA

GGG

CAG

AGG

145

Cin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Alá

Ser

Les

Alá

Val

Ser

Lee

Gly

Gin

Arg

30

35

40

45

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

193

Alá

Thr

Xle

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

50

55

60

AGT

TAT

TTC

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

ATT

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

241

Ser

Tyr

Lee

Asn

Trp

Tyr

Glu

ol n

I.l e

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Len

65

70

75

CTC

ATC

TAT

GAT

GCA

TCC

AAT

CTA

GTT

TCT

GGG

ATC

CCA

CCC

AGG

TTT

289

Lee

Ile

Tyr

Asp

Alá

Ser^-

Asn

Len

Val

Ser

Gly

Xle

Pro

Arg

Phe

HO

85

00

ACT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

?iAC

ATC

CAT

CCT

GTG

337

Ser

Gly

Ser

Glv

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

He

His

Pro

Val

95

100

105

GAG

AAG

CTG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

CAC

•TGT

CAG

CAA

AGT

ACT

GAG

GAT

385

Glu

Lys

Val

Asp

Alá

Thr

Tyr

Hís

Cys

Gin

Ser

Thr

Gin

Asp

no

115

12 ö

125

CCG

TGG

AGG

TTC

GGT

GGA

GGG

ACC

AAG

CTC

GAG

ATC

AAA

GGT

433

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Len

Gin

Tle

Lys

Gly

130

135

140

GGT

TCT

GCC

GGC

TCC

GGT

TCT

CAG

GTG

CAG

GTG

431

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gin

Val

G In

Len

145

150

155

CAG

TCT

GGG

GCT

GAG

CTG

GTG

AGG

CCT

GGG

TCC

TCA

GTG

AAG

ATT

529

Gin

Ser

Gly

Aia

Gin

Lee

Val

Arg

Pro

Gly

Ser

S-a.r

Val

Lys

I le

160 1SS 170 ♦ φ * φ φ

8?

TCC

ίΦΪ<*^£·»

AAG

CCT

TCT

GGC

TAT

GCA

AGT

AGC

TAC TGG

ATS

AAC TGG

577

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

va^y

Tyr

Alá

Phe

Ser

Tyr Trp

Met

Asn Trp

175

ISO

185

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTT

GAG

TGG

ATT GGA

CAG

ATT TGG

€25

Val

.Lys'

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Glv

Leu

OiU

Trp

lle Gly

Gin

lle Trp

m

155

200

205

GCT

GGA

GAT

GGT

GAT

ACT

AAC

TAC

AAT

GGA

AAG

TTC .AAG

GGT

AAA GCC

673

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe Lys

CXy

Lys Alá

210

215

220

ACT

CTG

ACT

GCA

GAC

GAA

«i/v* x vv

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC ATG

CAA

CTC AGC.

721

Thr

Leu

Thr

Ara

Asp

Guu

Ser

Thr

Alá

Tyr Met

Gin

Leu S&u

225

230

235

AGC

CTA

\yCA

TCT

GAG

SAS

GCG

GTC

TAT

TTC

TGT GCA

AGA

CGG GAG

769

Ser

Leu

A la.

Ser

SXu

Asp

Ser

Alá

Val

Tyr

Phe.

Cys AXu

Arg

Arg Gin

/40

245

250

ACT

AGG

ACG

GTA

GGC

CGT

TAT

'L'A.C

TAT

GCT

ATG·

GAC TAC

TGG

GGC CAA

817

Thr

ThX’

Val

Gly

Arg

Tvr

Tyr

Alá

Met

.Asn Tyr

Trp

Gly Gin

2 55

260

265

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

GGA

GGT

GGA TCC

GAT

ATC AAA

865

Gly

Thr

VuX

Thr

VuX

Ser

Gly

Gly Ser

Asp

lle Lys

27Ö

27 5

200

265

CTG

CAG

TCA

GGG

GCT

GAA

CTG

GCA

W.j:.

GGG GCC

TCA

GTG AAG

813

Leu

Glu

Gin

Ser

Gly

Alá

Glu

Len

AX&

Arg

Pro

Gly Alá

Ser

Val Lys

250

295

30 0

ATG

TCC

TGC

AAG

ACT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTT

ACT

AGG TAC

ACC

ATG CAC

951

Ser

Cys

Lys

Thr

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Arg Tyr

Thr

Met His

305

310

'315

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTG

GAA

TGG ATT

GGA

TAC ATT

1009

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Cl n

Gly

Leu

Gin

Trp Lle

Gly

Tvr lle

320

325

330

AAT

CCT

AGC

CGT

GGT

TAT

ACT

AAT

TAC

AAT

CAG

AAG TTC

AAG

GAC AAG

1057

Asn

Fro

Ser

Arg

GXy

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys Phe

Lys

Asp Lys

335

340

345

GCC

ACA

TTC

ACT

AGA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC TAC

ATG

CAA CTG

1105

Alá

Thr

Leu

Thr

’i’ur

Asp

x^ys

Ser

Thr

Aia Tyr

Met

Gin Len

350

355

350

3 § 5

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

TAT

TAC TGT

GCA

AGA TAT

1153

Sí-ír

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

AXcv

Val

Tvr

Tyr Cvs

Alá

Arg Tvr

370

375

380

TAT

GAT

CAT

TAC

TGC

CTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

ACC

ACT CTC

1201

Tyr

Asp

His

Tyr

Cys

Len

Asp

Tvr

Trp

Gly

Gin Gly

Thr

Thr Leu

385

390

395

ACA

GTC

TCC

TCA

GTC

GAA

GGT

GGA

AGT

GGT

TCT GGT

GGA

•ft >·»Λ\ /V<VA

1249

Thr

Val

Ser

Val

Gin

Giy

Gly

Ser

Gly

Ser Gly

Gly

Ser Gly

4öö

405

410

GGT

TCA

·<>Κ> X

GGA

GTC

GAC

ATT

CAG

CTG

ACC

CAG TCT

CCA

GCA ATC

1297

Glv

Ser

Gly

Val

Asp

lle

Gin

Leu

Thr

Gin Ser

Pro

Alá He

415 420 425

8$ ♦ *

AVG Met. 430

TCT Ser

GCA Alá

j.G * Ser

CCA Pro

GGG Gly 435

GAG QLki

AAG Lys

GTC ACC Val Thr

ATG Hst 44Ö

ACC TGC Thr Cys

AGA Arg

GCC Alá

AGT Ser 445

1345

VGA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

AAC

TGG

TAG

CAG

AAG

TCA

GGC

ACC

TCC

1393

Ser

Sex·

Val

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Glr

Gin

Lys

Ser

Gly

Thr

Ser

450

455

460

CCC

AAA

AGA

TGG

ATT

TAT

GAG

ACA

TCC

AAA

GTG

GCT

TCT

GGA

GTC

ΑΛφ X.X.A

X.44-

Pro

Lys

Arg

Trp

lle

Tyr

Asp

Thr

Ser

Lys

val

AXs.

Sesr

Gly

Val

Pro

465

470

475

TAT

CCC

TTC

ΑλχΤ

GGC

.AGT

GGG

LxxGc

ACC

TCA

TAC

TCT

CTG

ACA

ATC

1489

Tyr

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Sőt

Tyr

Ser

Lev

Thr

lle

480

485

490

agg

AGC

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAA

CAG

TGG

1537

Ser

Μβί ’t’.

Gla

Alá

Glv

Asp

Alá

Thr

Tyr

Cys

Gin

Trp

495

500

505

AGT

AAC

CCG

ί**}·γ\ί> \^· .χ <χ·

ACG

TTC

GGT

GCT

LGG

ALL

.AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

1505

Ser

Asn

Pro

iuSSbi

mjw·'

The

ciy

AX&

Gly

Thr

Lys

Lee

L X u

Leu

Lvs

510

515

520

52.5

.<«< *A. ·>> •vaí

CAT

CAC

CAT

TAGTCGAC

16.11

His

Bís

His

Kis

His

Kis

53Ö számú vencsavaziai (í) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 531 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus; aminosav (D) Topológia: lineáris (ií) Á molekula típusa; fehérje φ ♦ ·* *

fxí) A

szekvencia.

leírása.; 10.

számú

szekvencia.

Met

Gly

Trp

Ser

xle

Leu Phe

Val

Alá

Thr

Alá

Thr Gly

1

5

10

15

Val

m s

Ser

Asp

Tyr

IíVS

Asp

Asp Asp

Asp

Lys

Asp

ne

Gin

Leu Thr

20

25

30

Gin

Ser

Pro

Alá

Ser

Alá

Val Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Alá

Thr Ile

35

40

45

Ser

Cys

lys

Alá

Ser

Gin

Ser

Val Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr Leu

50

55

60

Asn

Trp

Tyr

Gin

Glh

11 δ

Pro

Gly Gin

Pro

Lys

Leu

T.1.S Tvr

65

70

75

SO

Asp

Alá

Ser

Asn

Leu

Val

Ser

Gly Ile

Pro

Arg

The

Ser

35

90

95

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

.Leu Asn

He

HA s

Pro

Val

Gin

Lys Val

100

105

110

Asp

Alá

Thr

Tyr

Kis

Cys

Gin Gin

Ser

Thr

Glu

Asp

Pro

Trp Thr

115

120

125

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu He

Lys

Gly

Ser Gly

130

135

140

Gly

Ser

Gry

Gly

Gly Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Gin Ser

145

.150

155

ISO

Gly

Alá

Gin

Leu

Val

Arg

Pro

Gly Ser

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys Lvs

165

170

175

A.:. >3

Ser

Gly

Tyr

Al a

Phe

Ser

Ser Tyr'

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys Gin

ISO

135

190

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp He

Gly

Gin

Ιΐβ:

Trp

Pro

Gly Asp

195

200

205

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys Phe

Lys

Gly

Lys

Ara

Leu Thr

210

215

220

Alá

Asp

Glu

Ser

Thr

A.la Tyr

Met

Gin

Leu

Ser-

Leu Alá

225

230

235

240

Ser

Glu

Asp

Ser

Alá

V.« 1

Tyr

Phe Cys

Alá

Arg

Gin

Thr

Thr Thr

245

250

255

Val

Gly

Arg

Tyr

Alá

Met Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Glv

Thr Thr

260

265

r ? 0

Val

Ser

Gly

Gly Gly

Ser

Asp

Ile

Lys

Len

Gin Gin

275

2 00

235

Ser

r'* '5 v« •saly

Ara

Glu

Lea

Alá

Arg

Pro Gly

Alá

Ser

Var

Lys

Met

vys

200

235

3 00

Lys

Thr

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr Aro

Tyr

Thr

Met

His

rn s-vm Λ Λ Í.''

V&.L

305

310

315

323

** * ♦ * « *♦* «Qf

9G

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin 325

Gly

Len

Gl»

Trp

lle 330

Gly

Tyr

lle

Asn

Pro 335

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr 340

Asn

Tyr

Asn

Grh

Lys 345

Phe

Lys

Asp

Lys

Alá 350

Thr

Len

Thr

Asp 355

Lys

Ser

Thr 3SÖ

Alá

Tyr

Met

Gin

Len 365

Ser

Len

Thr

Ser 370

Gr»

Asp

Ser

Alá

Vei 375

Tyr

Cys

Alá

.Arc 380

Tvr

Tyx'

Asp

His 385

Tyr

Cys

Len

Asp

Tyr 399

Tr»

Gly

Gin

Giy

Thr 395

Thr

Len

Thr

Val

Ser 400

Ser

Val

Glu

Gly

Gly 405

Ser

Gly

Oly

Ser

Gly 410

Gly

Ser

Gly

Ser 415

Gly

Val

Asp

As» 420

lle

Gin

Lee

Thr

Oi!ó 425

Pro

Alá

He

Met 439

Ser

Alá

Ser

Pro

Gly 4 35

Gl»

Val

Thr

Met 440

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser 445

Ser

Val

Ser

Wyv· 450

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin 455

Gin

Lys

Ser

Gry

Thr 480

Ser

Pro

Lys

Arg

Trp 4S5

He

Tyr

Asp

Thr

Ser 470

Lys

Val

A.la

Ser

Gly 47 5

Val

Pro

Tyr

Arg

Phe 4 80

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 485

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser 490

Lee

Thr

I le

Ser

Ser 495

Met.

Gin

Alá

Gin

Asp 500

Alá

Ara

ffiK V' X ÍXX-

Tyr

Tyr 505

Cys

Gin

Trp

Ser 310

Ser

Asn

Pro

Len

Thr 515

Phe

Giy

Ale

Gly

Thr 520

Lys

Len

Gin

Lee

Lys 52 5

His

His His His 530

VI

ΦΦ «ΧΦ ΦΦ « ΦΦΧ > «φφ (ΧΦ «ΦΦ

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egyláncú multifunkclés polipepfid, ami az alábbi komponenseket tartalmazza; a> egy első- domént, ami tartalmazza: egy -olyan immunglobulin vagy egy ellenanyag kötőhelyét ami specifikusan felismert a CD 19 antigént; és

b) egy második domént, ami tartalmazza egy olyan Immunglobulin vagy egy ellenanyag kötőhelyét, ami specifikusan felismert a humán T-sejtek CD3 antigénjét, és ahol az említett domének az alábbi sorrendben vannak elrendezve;

VíCDIG-VhODWOTCDS-VŰDS.
2. Az 1. Igénypont szerinti polipeptid, amiben az említett két domént egy pollpeptld linker kapcsolja össze.
3. Az 1- vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, amiben az említett első és/vagy második dómén megfelel egy természetes ellenanyag V_H vagy V_L régiójának.
4. Az 1 vagy 2. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett ellenanyag egy monoklonális ellenanyag, szintetikus ellenanyag, vagy humanizált ellenanyag.
5. Azl-4, igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett domének közül legalább áz egyik áz ellenanyag variábilis régiéjáhák egy egyiáncö fragmense.
6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett polipeptid linker több gliein, aianin és/vagy szerin csoportot tartalmaz.
7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett polipepfid linker egy aminosav szekvencia több másolatéi tartalmazza egymás után.
8. A 2-7. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett linker 1-5 aminosavat tartalmaz.
9. A 2-8. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett polipepfid linker a Gly Gly Gly Gly Ser aminosav szekvenciát tartalmazza,
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amiben az említett első dómén a V« és V_L régiéből legalább egy komplementaritást meghatározó régiót tartalmaz, ami tartalmazza a 8. ábrán bemutatott aminosav szekvenciából a 82-414 nukleotidok közötti

Λ

ΦΦΦ 8«

X * Φ

Φ ΦΧΦ » X ♦ φ 9 Φ'

ΧΦ Φ-^Φ ΧΦ

X χχ · « ** részt (Vi.) és a 460-831 nukleoÖdoK közötti részt {V_H)> és/vagy amiben az említett második Öomén a V« és V_s. régiéből légáíabb égy köhlpíéméhtáflfásf mégháíározé regiét tartalmaz, ami tartalmazza a 8. ábrán bemutatott aminosav szekvenciádéi a 647-1203 nukleotidok közötti részt (Vh)_; és az 1268-1575 nukleotidok közötti részt (VJ.
11, Az 1 -10. igénypontok bármeíyíke szerinti polipeptid, amiben;

a) az említett éiso dómén említett kötőhelyének affinitása kisebb mint 10'⁷ M, és/vagy

b) az említett második dómén említett kötőhelyének affinitása kisebb mint 1 θ'⁷ M,
12, Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, ami egy bispecifikus egyláncú ellenanyag.
13, Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti polí peptid , am i domént tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti polipeptid, amiben az említett további domént kovalens vagy nem-kovalens kötések kapcsolják,
15. A 13 vagy 14. igénypont szerinti polipeptid, amiben az említett legalább még egy további dómén tartalmaz egy effektor molekulát, aminek a konformációja megfelel a biológiai aktivitáshoz, képes befogni egy iont vagy szelektíven kapcsolódni egy szilárd hordozóhoz vagy egy elére kiválasztott defermlnánshoz.

15. Egy polinukleotid, ami (expressziébe esetén) az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti pollpepfidet kódol.
17. Vektor, ami a 15, igénypont szerinti poiinukieolid láncot .tartalmazza.
18. Sejt, a 18, igénypont szerinti poiínukieotíddaí vagy a 17. igénypont szerinti vektorral transzformálva.
19. Eljárás az 1-15. igénypontok bármelyike szehnti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás abból áll, hogy a 18. igénypont szerinti sejtet tenyésztjük, és a ienyészközegből izoláljuk az említett poiipepttdet.
20, Az 1-15, Igénypontok bármelyike szehnti pollpeptidei, a 16. Igénypont szerinti polinukleotidot vagy a 17, igénypont szerinti vektort tartalmazó készítmény.

φ Φ ΦΦΦΧ »«

V φ * * * * ♦ * χ χ « ' * »** * *

Φ y φ ♦ Φ » Φ φ φ.χ -* ΦΦΧ ·♦* * *
21. A 20. igénypont szennti készítmény, ami égy gyógyászati készítmény,, és adott esetben tartalmaz még egy gyögyászatilag elfogadható hordozót.
22. A 20. igénypont szedni készítmény, ami egy diagnosztikai készítmény, és adott esetben tartalmaz még megfeleld eszközöket a kimutatásokhoz.
23. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid; a 18. igénypont szerinti polinukleotid, vagy a 17. igénypont szennti vektor alkalmazása B-sejt maiignanciák, B-sejt által közvetített autoimmun betegségek, vagy a B-sejtek kimerülésének kezelésére szolgáié gyógyászati készítmény előállítására.
24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett B-sejt malignancia nonHodgkin llmföma.

23. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett δ-sejt által közvetített autoimmun-betegség: Myasthenia gravis, Morbus Basedow, Hashimito thyreoiditís vagy Goodpasture szindróma.

23. Az 1-15. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, a 18. igénypont szerinti polinukleotid, vagy a 17. igénypont szerinti vektor alkalmazása B-sejt rendellenességek által kiváltott patológiai állapotok késleltetésére szoigáélö gyógyszerkészítmény előállítására.
27. A 13. igénypont szerinti polinukleotid vagy a 17. Igénypont szerinti vektor használata a génterápiában használható készítmények előállítására.
28. Eljárás a T-sejt aktiválás vagy serkentés aktivétoraínak vagy inhibitorainak azonosítására, azzal jellemezve, hogy:

a) a T-sejteket és CD 18 pozitív sejteket előnyösen B-sejteket tenyésztjük az 116. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid jelenlétében, és adott esetben egy olyan komponens jelenlétében, ami képes kimutatható jelet szolgáltatni a f-sejtnek egy olyan vegyülettel való aktiválására adott válaszként, amik lehetővé teszik a T-sejt aktiválását, és

b) kimutatjuk a vegyöletnek a sejtekkel való kölcsönhatásból származó jelnek a jelenlétét vagy hiányát.