JP3778453B2 - アポプトシス阻害剤 - Google Patents
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Description
アポトーシスは、計画された細胞死を意味する用語である。アポトーシスは例えば、器官の発達、変態、隆形成、および腫瘍の後退等においてみられる。アポトーシスは、細胞質の濃縮、原形質膜毛の喪失、核の分節化、および染色体DNAのはなはだしい放壊によって達成される(Oehm,A.等、The Journal of Biological Chemistry,Vol 267,No.15,1992,pp10709−10715)。
アポトーシス陽性細胞はしばしば、APO−1と呼ばれる細胞表面のタンパク質を含んでいる。この糖タンパク質は、腫瘍壊死因子/神経成長因子レセプター群に分類されている。APO−1が抗APO−1抗体と架橋結合することにより、前述の細胞中でアポトーシスが誘発される(Oehm,A.等、前出を参照)。APO−1リガンドと呼ばれる可溶性または膜結合性タンパク質がAPO−1に結合することによって、同じ現象が生じると思われる(Suda T,and Nagata,S,J.Exp.Med.,The Rockfeller,University Press,Vol,179,1994,pp873−879)。
しかしながら、アポトーシスの阻害については何も知られてはいない。しかし、出願人の最近の研究により、アポトーシスは、例えばエイズや自己免疫疾患等のさまざまな病気でも起こることが明らかとなったため、その阻害は必要であろう。エイズの場合には、アポトーシスはCD4−T細胞の激減に対する反応であると考えられている。
従って、本発明はアポトーシスを阻止し得る組成物を提供することを目的とする。
本発明に従って、
(a) APO−1阻害化合物
(b) APO−1リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
(c) 細胞内APO−1シグナル経路を阻害する化合物
から成る群より選択される成分を1以上含み、該成分が個体内において異物とみなされないことを特徴とする組成物を提供することにより、この目的を達成する。
「APO−1阻害化合物」という表現は,APO−1を阻害するのに適したいかなる化合物をも含む。好ましくは、その化合物は、非細胞毒性の抗APO−1阻止抗体またはFc部分を有さない抗APO−1抗体(例えば抗APO−1抗体のF(ab),F(ab)2またはFv断片)である。そのような断片は普通の当業者が行っている方法によって、(例えば根拠として、Oehm等、前出に記載されている抗APO−1抗体、またはDhein,J.等、The Journal of Immunology Vol.149,No.10,1992,pp.3166-3173に記載されている抗APO−1F(ab)2断片を用いて)調製される。後者は直接的に用いることができる。
上述の抗体でのFc部分の欠如は、結合したAPO−1の架橋を防ぎ、従ってアポトーシスの誘発を防ぐ。驚いたことに、APO−1はこのような抗体によって阻害される。
APO−1リガンドのアナログが、別の好ましい「APO−1−阻害化合物」として言及されるべきである。このアナログはAPO−1と結合はするが、もはや細胞内APO−1シグナル経路を誘導しない。このようなアナログは、例えば根拠としてSuda,T.およびNagata,S.前出に記載されているAPO−1リガンド等を用いて、当業者によって普通に調製できる。
「APO−1リガンドをそれそれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、APO−1リガンドをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなる化合物をも含む。好ましくは以下の化合物の一つである。
・抗APO−1リガンド抗体、
・APO−1、
・細胞外APO−1ドメイン、
・少なくとも1つの細胞外APO−1ドメインおよび担体を含む化合物
・APO−1リガンド結合部位を有するペプチド、および
・APO−1リガンド結合部位を有する少なくとも1つのペプチドおよび担体からなる化合物
このような化合物は通常の方法で調製できる。抗APO−1リガンド抗体の作成には、当業者は例えば前出のSuda,T.およびNagata,S.に記載されているAPO−1を基礎として用いる。当業者は、抗体のFc部分が個体中で異物とされない事実に注目している。当業者はこれを可能にしている工程をよく知っている。さらに当業者は、例えばEP−92 107 060.3に記載されているAPO−1およびそのAPO−1細胞外ドメインを、APO−1およびAPO−1細胞外ドメイン作成の基礎としてそれぞれ利用する。加えて、当業者は例えば、前述のAPO−1リガンドおよび前述のAPO−1およびその細胞外ドメインそれぞれの組合せも、APO−1リガンド結合部位を有するペプチドの作成のために利用する。
少なくとも1つのAPO−1細胞ドメインおよび担体を含む化合物の作成方法が以下の実施例に記載されている。APO−1リガンド結合部位を有する少なくとも1つのペプチドおよび担体を含む化合物を同様に作成することが可能である。
「細胞内APO−1シグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内APO−1シグナル経路を適切に阻害し得るいかなる化合物をも含む。以下の化合物の1つが好ましい。
・「インターロイキン1β変換酵素(ICE)」阻害剤、特に、3,4−ジクロロイソクマリン(DCI)、ICE特異的テトラペプチドであるYVAD−CHO、ワクシニアウイルスタンパク質であるCrmAまたはそれらの誘導体。YVAD−CHO、CrmAまたはそれらの誘導体を、発現可能な核酸として使用するのが好適である。さらに、ICE−アンチセンス核酸およびそれらの誘導体をICE阻害剤として用いるのも好ましい。
・構造的にICEに関連しているプロテアーゼ群、特にNedd−2/Ich−1またはpriCEの阻害剤
このような阻害剤化合物を普通に調製できる。DCIおよびそれらの誘導体の製造において、当業者は、例えばHarper,J.,W.等、Biochemistry,24,1831-1841,1985.の研究に戻るであろう。さらに当業者は、Thornberry,N.,A.等、Nature 356,768-774 1992の、YVAD−CHOおよびその誘導体それぞれについての研究を考慮するであろう。加えて、当業者は、例えば、Ray,C.,A.等、Cell 69,597-604,1994のCrmAまたはそれらの誘導体についての研究を考慮するであろう。そのうえ、当業者は、例えば、Cerretti等,Science 256,97-100,1992、の、ICEアンチセンス核酸およびその誘導体それぞれに関する研究を参考にするであろう。さらに、Wang,L.等、Cell 78,739-750,1994およびLazebnik,Y.A.等、Nature 371,346-347,1994の研究に、プロテアーゼNedd−2/Ich−1およびpriCEそれぞれに関して戻るであろう。
本発明に従って、前述の組成物は、特に、HIV感染関連疾患におけるアポトーシスの阻害に用いられる。これに関連して、本発明の組成物は、個体内で異物として認識されない1以上の以下の成分をさらに含む場合に特に有用であることが証明されている。
(a) TATレセプターを阻害する化合物
(b) TATをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
(c) 細胞内TATレセプターシグナル経路を阻害する化合物
(d) CD4レセプターを阻害する化合物
(e) gp120をそれぞれ阻害および捕捉する化合物、および、
(f) 細胞内CD4レセプターシグナル経路を阻害する化合物
「TATレセプターを阻害する化合物」という表現は、TATレセプターを阻害するのに適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは、抗TATレセプター抗体である。この抗体は通常の方法で調製される。当業者は抗体のFc部分が個体内で異物とみなされない点に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。
TATアナログもまた、別の好適な「TATレセプターを阻害する化合物」として言及されるべきである。そのような化合物はTATレセプターに結合するがもはや細胞内TATレセプターシグナル経路を誘導しない。このようなアナログは通常の方法で当業者が、例えば、Arya,S.,K.等、Scicence,Vol.229,1985,pp.69-73、等を基本として用いて調製できる。
「TATをそれぞれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、TATをそれぞれ阻害および捕捉するのに好適ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは以下の化合物の1つである。
・抗TAT抗体
・TATレセプター
・細胞外TATレセプタードメイン
・1以上の細胞外TATレセプタードメインおよび担体を含む化合物
・TAT結合部位を有するペプチド
・TAT結合部位を有する1以上のペプチドおよび担体を含む化合物
・核酸塩基のTAT結合部位
・トランスドミナント(transdominant)TAT変異体
このような化合物は通常の方法により調製できる。抗TAT抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のArya,S.,K.らに記載されているTATを基礎として用いるであろう。当業者は、抗体のFc部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うであろう。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに、当業者は、例えば、Feng,S.およびHolland,E.,C.,Nature,Vol.334,1988,pp.165-167、に記載されているTAT−LT R配列を、核酸塩基上のTAT結合部位に関する基礎として用いるであろう。さらに当業者は、例えば、Echetebu,C.,O.およびRice,A.,P.,J.Acquir.Immune Def,Syndrome,Vol.6,1993,pp.550-557、に記載されている変異体を、トランスドミナントTAT変異体に関する基礎として用いるであろう。
「細胞内TATレセプターシグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内TATレセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなる化合物をも含む。
「CD4レセプターを阻害する化合物」という表現は、CD4レセプターの阻害のために適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは抗CD4レセプター抗体である。そのような化合物は、当業者が例えば、Capon,D.,J.およびWard,R.,H.,R.,Annu,Rev.Immunol,9,1991,pp.649-678に記載されているCD4レセプターを基礎として用いて普通に調製できる。当業者は抗体のFc部分が個体内で異物とされないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程を熟知している。
gp120アナログを別の好ましい「CD4レセプターを阻害する化合物」として言及する。gp120アナログはCD4レセプターに結合するが、もはや細胞内CD4レセプターシグナル経路を誘導しない。そのようなアナログは、当業者が、例えば前出のCapon,D.,J.およびWard,R.,H.,R.,に記載されているgp120を基礎として用いる通常の方法により調製できる。
「gp120をそれぞれ阻害および捕捉する化合物」という表現は、gp120をそれぞれ阻害および捕捉するために適当ないかなる化合物をも含む。その化合物は、好ましくは、以下の化合物の1つである。
・抗gp120抗体
・CD4レセプター
・細胞外CD4レセプタードメイン
・1以上の細胞外CD4レセプタードメインおよび担体を含む化合物
・gp120結合部位を有するペプチド
・gp120結合部位を有する1以上のペプチドおよび担体を含む化合物
このような化合物は通常の方法により調製できる。抗gp120抗体の作成のために、当業者は、例えば、前出のCapon,D.,J.およびWard,R.,H.,R.,に記載されているgp120を基礎として利用するであろう。当業者は抗体のFc部分が個体内で異物として認識されないという事実に注意を払うべきである。当業者はこれを可能にする工程に精通している。さらに当業者は、前出のCapon,D.,J.,およびWard,R.,H.,R.,に記載されているCD4レセプターおよびその細胞外CD4レセプタードメインをそれぞれ、CD4レセプターおよび細胞外CD4レセプタードメインの作成に関する基礎として利用するであろう。さらに、当業者は、例えば上述のgp120およびCD4レセプターおよびその細胞外ドメインの組合せをそれぞれ、gp120結合部位を有するペプチドの作成に利用するであろう。
1以上の細胞外CD4レセプタードメイン、および1以上のgp120結合部位を有するペプチドそれぞれ、ならびに担体を含む化合物の作成は、以下に記載された、1以上の細胞外APO−1ドメインおよび担体からなる化合物の場合と同様に実施できる。
「細胞内CD4レセプターシグナル経路を阻害する化合物」という表現は、細胞内CD4レセプターシグナル経路を阻害するために適当ないかなる化合物をも含む。
上述の組成物は、個々の成分の1から数種類の化合物を有していても差支えないと解する。
本発明に基づき、1以上の細胞外APO−1ドメインおよび担体からなる化合物が提供され、そのドメインおよび担体は個体内で異物とはみなされない。
「担体」という表現は、1以上の細胞外APO−1ドメインが結合し得るいかなる化合物をも含む。
より好適な実施例において、担体は、例えば血清アルブミン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、コラーゲンなどのタンパク質、または抗体のFc部分であり、後者が好ましい。特に好ましい実施例では、本発明の化合物は融合タンパク質である。
本発明の化合物は通常の方法で調製できる。融合タンパク質の場合は、以下の作成工程が好ましいことが判明している。
(a)1以上の細胞外APO−1ドメインおよびその3’末端に取り付けられた結合領域をコードするDNAを公知のPCR技術により増幅させ、
(b)タンパク質担体およびタンパク質担体の5’末端に取り付けられた結合領域をコードするDNAを公知のPCR技術により増幅させ、
(c)工程(a)および工程(b)により増幅されたDNAを組み合わせて、更に、公知のPCR技術により、APO−1領域の5’末端DNAに対応するプライマーおよびタンパク質担体の3’末端DNAに対応するプライマーを用いてそれらDNAを増幅させて、両方のDNAが融合した増幅DNA断片を得て、
(d)工程(c)のDNA断片を発現ベクターに挿入し、通常の方法でDNA断片を発現させる。
好ましい実施例において、(a)および(b)の結合領域は、抗体ヒンジ領域あるいはその一部分である。さらには、それはトロンビン分解部位であってもよい。
前述の作成工程において、さまざまなDNAが公知のPCR技術により増幅される。当業者は、1以上の細胞外APO−1ドメインをコードするDNAと同様に、例えば前出のEP−92 107 060.3記載のDNAを利用するであろう。当業者は、その3’末端に結合領域をコードするDNAを結合させるであろう。ヒト抗体のヒンジ領域またはその一部分をコードするDNAの場合は、当業者は、例えば、
Methods in Molecular and Cellular Biology,Vol.3,1992,pp.47-52へと戻るであろう。タンパク質担体、例えば、ヒト抗体のFc領域をコードしているDNAに関しては、当業者は、前出の
に記載されているDNAへと戻るであろう。
動物の細胞中での発現にはpCDN83,pCEV4,およびpCDM8等の公知のベクターを用いて、E.coliでの発現用にはpGEMEXおよびpUC等の公知のベクターを用いて、並びに酵母での発現用にはpY100およびYCpAD1等の公知のベクターを用いて、増幅したDNA断片を発現させる。L COSおよびCHO細胞は、動物細胞として特に適切であるが、E.coliは原核生物として、およびサッカロミセスおよびピチア・パストリス(Pichia pastoris)は酵母細胞として、特に適切であることを言及しておかねばならない。
本発明の化合物はアポトーシスの阻害に非常によく適している。この目的のため、個体内で異物とは見なされない1以上の以下の成分の組合せを用いることができる。
(a) APO−1阻害化合物
(b) APO−1リガンドをそれぞれ阻害し捕捉する他の化合物
(c) 細胞内APO−1シグナル経路を阻害する化合物
個々の成分の記述については(a),(b)および(c)についてはすでに言及してある。これらの記述はここでも一致して適用される。
本発明の化合物は、HIV感染に関連した疾患におけるアポトーシスの阻害に特に適している。この目的のため、本発明の化合物は、個体内で異物と見なされない1以上の以下の成分の組合せを用いることができる。
(a) APO−1阻害化合物
(b) APO−1リガンドをそれぞれ阻害および捕捉する別の化合物
(c) 細胞内APO−1シグナル経路を阻害する化合物
(d) TATレセプターを阻害する化合物
(e) TATをそれぞれ阻害および捕捉する化合物
(f) 細胞内TATレセプターシグナル経路を阻害する化合物
(g) CD4レセプターを阻害する化合物
(h) gp120をそれぞれ阻害または捕捉する化合物、および
(i) 細胞内CD4レセプターシグナル経路を阻害する化合物
個々の成分(a)から(i)については、前記のように言及されており、成分(d)−(i)は前述した(a)−(f)のように言及される。前の記述はここでもそれに応じて適用される。
本発明は、アポトーシスが重要な役割を果たす疾患の新しい治療法を提供するものである。本発明は、特に、エイズ治療の突破口となることを想定している。
【図面の簡単な説明】
第1図は、hu APO−1−Igおよび抗−APO−1F(ab’)2それぞれによるアポトーシスの阻害を示している。
第2a図は、抗APO−1抗体による、ICEのタンパク質分解活性への影響を示している。
第2b図は、DCIによるアポトーシスの阻害を示している。
第2c図は、YVAD−CHOによるアポトーシスの阻害を示している。
第2d図は、アンチセンスICEおよびCrmA−cDNAそれぞれによるアポトーシスの阻害を示している。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例1:抗体ヒンジ領域を介して、細胞外APO−1ドメインをヒト抗体Fc部分に融合させた融合タンパク質の作成
前述の融合タンパク質の調製のため、細胞外APO−1ドメインをコードするcDNA(Oehm,A.ら、前出を参照)およびヒト抗体のFc部分
をコードするcDNAについて、公知のPCR増幅を実施した。
細胞外APO−1ドメインのcDNA用に用いられたプライマーは、開始メチオニンをとりまく完全コザック・コンセンサス(Kozak−Consensus)領域の上流にHindIII部位が導入されている5’ GCG AAG CTT GCC ACC ATG GTG GGC ATC TGG ACC CTC 3’、および細胞外APO−1ドメインおよびヒンジ領域の最初の18bpをコードする5’ GAC ACA ACA TTT GCG CTC GTT AGA TCT GGA TCC TTC 3’である。
Fc部分のcDNA用に用いられたプライマーは、ヒンジ領域の最初の18bpおよびFc部分の5’末端領域をコードする5’ GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC 3’、およびFc部分の3’末端をコードし、停止コドンの下流にXbaI部位を導入する5’ ATT AAG CAT TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3’である。
得られたPCR産物を、低融点アガロースゲルにより分離し、適当な分子量のDNA分子を含むゲル小片を集めた。そのサンプル自体について更にPCR増幅を行った。用いたプライマーは、それぞれ細胞外APO−1ドメインの5’末端およびFc部分の3’末端に対応するもののみであった。このように、共通ヒンジ領域を介して、細胞外APO−1ドメインをFc部分に融合させることが可能であった。「融合」DNA断片を得た。
この断片をHindIIIおよびXbaIで切断し、アガロースゲルにより精製し、さらにベクターpCDM8内にクローン化した。pCDM8のインサートの塩基配列をジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法により決定した。
実施例2:hu APO−1−Igおよび抗APO−1F(ab’)2それぞれによるアポトーシスの阻害
SKW6.4細胞(前出のOehm,A.らを参照)はアポトーシス陽性細胞であり、即ち、その細胞内において、例えば、抗APO−1抗体の結合によりアポトーシスが誘導され得る。
SKW6.4細胞を、さまざまな量の実施例1のタンパク質(hu APO−1−Ig)および抗APO−1−F(ab)2(上記を参照)それぞれの存在下で、抗APO−1抗体とともに24時間保温した。アポトーシスの阻害を測定した(第1図参照)。
実施例1の融合タンパク質および抗APO−1−F(ab)2は、強力なアポトーシス阻害効果を有することが判明した。融合タンパク質において特に強力であった。
実施例3:DCI、YVAD−CHO、アンチセンスICE、およびCrmA−cDNAそれぞれによるアポトーシスの阻害
L 929−APO−1細胞(Schulze-Osthoff,K.等、EMBO J.13,4587-459,1994を参照)は、実施例2のSKW6.4の細胞と同様にアポトーシス陽性である。
(a) 抗APO−1抗体によるICEのタンパク質分解活性の刺激
L 929−APO−1細胞(○)およびSKW6.4細胞(●)を培養し、抗APO−1抗体(1μg/ml)とともに第2a図に示した期間にわたり処理した。細胞を回収する10分前に、0.05%ジギトキシンを用いて細胞を透過性化(permeabilize)し、20μMの発蛍光性ICE基質、DABCYL−YVADAP−EDANS(Bachem,Bubendorf,スイス)とともに保温した。細胞を回収し、励起波長360nm、放出波長488nmのFACS分析により分析した。
その結果、ICEのタンパク質分解活性は抗APO−1抗体により刺激され得ることが判明した。
(b) 抗APO−1抗体によって誘導されるアポトーシスのDCIを用いた阻害
L 29 APO−1細胞をDCI存在下(●45μM、▲15μM)または非存在下(○)で保温した。1時間後、第2b図に示した量の抗APO−1抗体を添加し、細胞とともに7時間放置した。細胞死の割合(%)を、ジフェニルテトラゾリウム塩からのホルマザンの生成により決定した(MTTアッセイ)。
その結果、抗APO−1抗体により誘導されるアポトーシスはDCIによって阻害されることが判明した。
(c) 抗APO−1抗体によって誘導されるアポトーシスのYVAD−CHOを用いた阻害
L 29−APO−1細胞(○)およびSKW6.4細胞(●)を低張ショックにより透過性化し、第2c図に示されたYVAD−CHO濃度で30分間にわたり保温した。細胞を抗APO−1抗体(1μg/ml)とともに60分間保温した。アポトーシスは、Hoechst dye 33342(モレキュラー プローブス ユージーン,OR)を用いたDNAの断片化により測定した。特異的細胞死(抗APO−1抗体の存在下での細胞死から、抗体非存在下での細胞死を差し引く)のデータを、FACSバンテッジ7D−サイトメーターを用いた三連での測定により得た。抗APO−1抗体不在下での自発細胞死は7%以下であった。
この結果、抗APO−1抗体によって誘導されるアポトーシスはYVAD−CHOにより阻害されることが判明した。
(d) 抗APO−1抗体によって誘導されるアポトーシスの、アンチセンスICEおよびCrmA−cDNAそれぞれを用いた阻害
以下の発現プラスミドを調製した:
pCAGGS−ICE
第1ストランド合成用のEL4/C mRNAおよびオリゴdTプライマーを用いて、RT−PCRによりネズミICE cDNAを単離した。1322bpのPCR産物を、プライマー 5’−ATC GGA TCC AGC ATG GCT GAC AAG ATC CTG AGG−3’および5’−CGG CCT CGA GCA TCA TCT AAG GAA GTA TTG GC−3’のペアを用いて作成した。このペアは、pCAGGS中にクローン化されたE14/13cDNA発現コロニーバンクのスクリーニングのための試料として用いられた(Niwa,H.等、Gene 108,193-200,1994.を参照)。1387bpのICE cDNAクローンを得、その配列をDNAの配列決定により決定した。このクローンをpCAGGS−ICEと呼ぶ。
pCAGGS−アンチセンスICE
前出のICE cDNAの320bpのEcoRI断片をpCAGGS中に逆向きでクローン化した。断片は48bpの5’UTRおよびICE−オープンリーディングフレームの最初の255bpを含む。pCAGGS−アンチセンスICE発現プラスミドを得た。
pSV25S−CrmA
プライマーのペア 5’−GCG AAG CTT ACA CGA CCA ATA TCG ATT ACT A−3’および5’−CGC CAT GGT TAA CAA TTA GTT GTC GGA GAG−3’を用いてCrmAをコードするcDNAを、公知のPCRによってワクシニアウイルスDNAから得た。このcDNAを、公知のプラスミドpSV25S中にHindIII/KpnI断片としてクローン化した。このようにpSV25S−CrmA発現プラスミドを得た。
前記の発現プラスミドを、L 929−APO−1細胞の移入に用いた。この目的のために、細胞をTBSバッファーに入れ、氷上で10分間にわたり平衡化させた。バイオラッドエレクトロポレータ(960μFD、220V)を用いて、前述の発現プラスミドをそれぞれ20μgずつ細胞内に移入させた。電気穿孔(エレクトロポレーション)の後、培養用プレートに接種する前に、さらに30分間細胞を氷上に置いた。16時間後、洗浄工程により死細胞を除去した。第2d図に示した時間、抗APO−1抗体(1μm/ml)で生細胞を処理した。前述のように、アポトーシスをHoechst dye 33342を用いたFACS分析により測定した。2連の実験による細胞死の割合(%)のデータを得た。
その結果、抗APO−1抗体によって誘導されるアポトーシスは、アンチセンスICEおよびCrmAそれぞれによって阻害されることが判明した。
Claims (10)
- 完全長ヒトAPO−1細胞外ドメインと担体とを含む融合タンパク質。
- 前記担体が、タンパク質であることを特徴とする請求項1記載の融合タンパク質。
- 前記担体が、抗体のFc部分であることを特徴とする請求項1または2記載の融合タンパク質。
- 前記担体が、ヒト抗体のFc部分であることを特徴とする請求項1または2記載の融合タンパク質。
- 前記完全長ヒトAPO−1細胞外ドメインが、抗体のヒンジ領域を介して該抗体のFc部分に融合していることを特徴とする請求項3または4記載の融合タンパク質。
- 請求項1から5いずれか1項記載の融合タンパク質をコードするDNA分子。
- 請求項1から5いずれか1項記載の融合タンパク質を作成する方法であって、
(a)1以上の完全長APO−1細胞外ドメインおよびその3’末端に取り付けられた結合領域をコードするDNAを公知のPCR技術により増幅させる、
(b)担体タンパク質および該担体タンパク質の5’末端に取り付けられた結合領域をコードするDNAを公知のPCR技術により増幅させる、
(c)前記工程(a)および前記工程(b)により増幅されたDNAを連結させて、更に、公知のPCR技術により、前記APO−1細胞外ドメインの5’末端に対応するプライマー、および前記担体タンパク質の3’末端に対応するプライマーを用いてそれらDNAを増幅させて、両方のDNAが融合した増幅DNA断片を得る、
(d)前記工程(c)のDNA断片を発現ベクター内に挿入し、該DNA断片を通常の方法により発現させる、各工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1から5いずれか1項記載の融合タンパク質を活性物質として含有する、アポトーシスを阻害するための組成物。
- 請求項6記載のDNA分子を含む発現ベクターを活性物質として含有する、アポトーシスを阻害するための組成物。
- 抗APO−1リガンド抗体を含むことを特徴とする請求項8または9記載の組成物。
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