JP4010606B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は生理活性ポリペプチドの製造方法に関するものであり、詳細には、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペプチドの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの単離と、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、特開平８−２７１８９号公報及び特開平８−１９３０９８号公報に開示した。このポリペプチドは有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているので、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されている。
【０００３】
ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断されたり、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特願平８−２６９１０５号明細書（特開平９−２８９８９６号公報）に記載されているように、ヒト細胞は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。本発明者がその原因について鋭意研究したところ、ヒト細胞において、当該ポリペプチドは、通常、生理活性を有しない、分子量約２４，０００ダルトンの前駆体として存在していることが判明した。当該ポリペプチドにかぎらず、多くのサイトカインは、通常、まず、生理活性を有しない前駆体として産生され、その後、細胞内酵素によるプロセッシングを受けて活性型のポリペプチドに変換されることが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドを製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者が上記課題を解決すべく鋭意研究したところ、インターロイキン−１β変換酵素（以下、「ＩＣＥ」と略記する。）が当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成することが判明した。
【０００６】
すなわち、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体にＩＣＥを作用させることを特徴とする免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドの製造方法を要旨とするものである。
【０００７】
ＩＣＥは、例えば、ナンシー・エー・ソーンベリーらが『ネイチャー』、第３５６巻、７６８乃至７７４頁（１９９２年）に報告しているように、分子量約２０，０００ダルトンのサブユニットと分子量約１０，０００ダルトンのサブユニットからなるヘテロダイマー構造を有するシステイン・プロテアーゼの一種であり、通常、このヘテロダイマー同士が会合した状態で活性を発現する。ＩＣＥは公知の酵素であり、インターロイキン−１βの前駆体における第１１６番目のアスパラギン酸と第１１７番目のアラニンの間のペプチド結合、さらには、第２７番目のアスパラギン酸と第２８番目のグリシンの間のペプチド結合をそれぞれ切断することが知られている。しかしながら、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、そのアミノ酸配列における特定の部位、とりわけ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成することは知られていない。ＩＣＥのこの新規な作用を利用する当該ポリペプチドの製造方法は、この発明をもって嚆矢とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
前述のとおり、この発明は、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドを生成するという独自の知見に基づくものである。この発明でいう前駆体は、通常、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００ダルトンを示し、例えば、当該ポリペプチドを本来的に産生する細胞内、あるいは、当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡ（例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ）を導入することによって形質転換した哺乳類由来の宿主細胞内に存在する。斯かる前駆体は、通常、Ｎ末端には配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を、また、全体としては、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列の全部、又はそのＮ末端の一部が欠失したアミノ酸配列を有し、そのままでは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導しない。
【０００９】
しかしながら、斯かる前駆体はこの発明にしたがってＩＣＥを作用させると、前駆体の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合が切断され、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する活性型のポリペプチドに変換され、この活性型のポリペプチドは、単独又は適宜補因子の存在下、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。なお、活性型のポリペプチドは、通常、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を、また、全体としては、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１８，０００乃至１９，５００ダルトンを示す。
【００１０】
ＩＣＥとしては、それが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成するかぎり、天然のものであっても人工的に創成したものであってもよく、その構造や出所・由来は問わない。また、エマド・エス・アルネムリらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７０巻、第９号、４，３１２乃至４，３１７頁（１９９５年）に報告しているように、同一給源に由来するＩＣＥであっても、給源によっては、いくつかのアイソフォームの含まれることが知られている。これらのアイソフォームは生理作用において若干違いがあると言われているけれども、それらが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成するかぎり、この発明において使用可能である。
【００１１】
ＩＣＥは、通常、ＩＣＥを本来的に産生する細胞、あるいは、組換えＤＮＡ技術を適用することによってＩＣＥの産生能を有するに至った形質転換体から得ることができる。ＩＣＥを本来的に産生する細胞としては、ヒトを含む哺乳類由来の、例えば、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られる細胞株が挙げられる。また、形質転換体としては、ＩＣＥをコードするＤＮＡを微生物又は動物由来の適宜宿主に導入することによって得られる形質転換微生物及び形質転換細胞が挙げられる。これらの細胞又は形質転換体を斯界において慣用される培養培地を用いて培養し、得られる培養物から増殖した形質転換体を一旦分離するか培養上清とともに超音波を印加するか、低張媒体中に浸漬するなどして破砕し、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの酵素を精製するための斯界における慣用の方法を適宜組合せて適用してＩＣＥを採取する。なお、ＩＣＥをコードするＤＮＡ及びＩＣＥの産生能を有する形質転換体は、例えば、ナンシー・エー・ソーンベリーら『ネイチャー』、第３５６巻、７６８乃至７７４頁（１９９２年）やエマド・エス・アルネムリら『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７０巻、第９号、４，３１２乃至４，３１７頁（１９９５年）などにも記載されている。
【００１２】
当該ポリペプチドの前駆体にＩＣＥを作用させるこの発明の実施態様としては、例えば、当該ポリペプチドの前駆体に上記の方法により調製したＩＣＥを接触させるか、あるいは、ＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿主細胞に導入し、そこで両ＤＮＡを共発現させればよい。前者の場合には、当該ポリペプチドの前駆体の産生能を有する細胞、もしくは、形質転換によって当該ポリペプチドの前駆体の産生能を有するに至った細胞を培養する。その培養物に上記の方法により調製したＩＣＥを共存せしめるか、あるいは、培養物から細胞を分離するか分離することなく、必要に応じて細胞を破砕した後、培養物又は細胞破砕物にＩＣＥを添加すればよい。共存又は添加せしめるＩＣＥの量としては、通常、前駆体と等モル以下で事足り、また、温度及びｐＨとしては、ＩＣＥが作用し得るレベル、通常、温度約４乃至４０℃、ｐＨ約６乃至９で原料の前駆体から活性型のポリペプチドが所望量生成するまで反応させればよく、斯くして、活性型のポリペプチドを含む反応物を得る。なお、後述するＴＨＰ−１細胞やＡ−２５３細胞などのように、同一の細胞が当該ポリペプチドの前駆体とＩＣＥをそれぞれ産生する場合には、当然のことながら、必ずしもＩＣＥを添加する必要はなく、必要に応じて細胞を破砕した後、上記と同様、ＩＣＥが前駆体に作用して活性型のポリペプチドを生成し得る温度及びｐＨで細胞又は細胞破砕物を含む培養物をインキュベートすれば良い。このような場合には、より効率的な生成反応を得るため、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、還元型グルタチオンを始めとする還元剤の適量を加えるのが望ましい。
【００１３】
後者の場合には、ＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿主細胞にそれぞれ導入して形質転換すればよい。この場合には、ＤＮＡの発現により生成したＩＣＥが、同じ形質転換体内で、ＤＮＡの発現により生成した当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成する。宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞株、間質系細胞株、神経芽細胞株及び造血系細胞が用いられる。斯かる宿主細胞にＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。その際、必要に応じて、適宜のプロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列、ポリアデニル化配列及び／又は選択マーカーを含む、例えば、ｐＣＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＳＶ２−ｇｐｔなどのベクターを用いてもよい。形質転換細胞から目的とするクローンを選別するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、形質転換細胞を培養培地で培養し、活性型ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選別すればよい。このクローンを形質転換細胞を培養するための斯界における慣用の培養培地を用いて培養すれば、活性型のポリペプチドを含む培養物が得られる。当該ポリペプチドの前駆体を本来的に産生する細胞を用いる場合も、形質転換により当該ポリペプチドの産生能を有するに至った細胞を用いる場合も、細胞や培養条件によっては、当該ポリペプチドの前駆体とともに、活性型ポリペプチドを分解して不活性化する、例えば、ＣＰＰ３２やＭｃｈ−３などの分解酵素が生成することがある。このような場合、培養培地又は細胞若しくは細胞破砕物を含む培養物に斯かる分解酵素の活性を阻害する、例えば、アセチル−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパルト−１−アールなどの物質を適量共存させると、活性型ポリペプチドの分解が抑制され、収量が増加する。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００１４】
なお、この発明において、ＩＣＥの活性は、ダグラス・ケー・ミラーらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２６８巻、第２４号、１８，０６２乃至１８，０６９頁（１９９３年）に報告している方法にしたがって測定し、活性値（単位）で表示している。すなわち、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以下、「ＣＨＡＰＳ」と略記する。）及び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む２５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）を３９５μｌとり、これにＮ−（Ｎ−アセチル−チロシニル）−バリニル−アラニル−アスパラギン酸−７−アミノ−４−メチルクマリンアミドの１０ｍＭジチルスルホキシド溶液５μｌと被検ＩＣＥ溶液１００μｌをそれぞれ加え、３０℃で１時間反応させる。反応中、反応の進行に伴って遊離する７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、蛍光光度計により、波長３８０ｎｍで励起して放出される波長４６０ｎｍの蛍光の強度に基づき経時的にモニターする。ＩＣＥの１単位とは、斯かる条件で反応させたときに、１分間に７−アミノ−４−メチルクマリンを１ピコモル遊離する酵素の量と定義する。
【００１５】
斯くして得られた活性型のポリペプチドを含む反応物及び培養物は、ＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精製する。精製には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドを最小のコストと労力で得ることができる。
【００１６】
前述のとおり、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による特願平８−２８７２２号明細書（特開平９−１５７１８０号公報）に詳述されている。
【００１７】
以下、実施例に基づきこの発明を説明する。
【００１８】
【実施例１】
〈前駆体の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌ、５単位／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、そして、同じ特許出願人が特開平８−１９３０９８号公報に開示した組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を１ｎｇとり、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号５に示した当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき化学合成した５´−ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧ−３´及び５´−ＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０ピコモル加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、この混液を９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、ＰＣＲ反応試薬としては、宝酒造製『タカラＰＣＲアンプリフィケーションキット』を用いた。
【００１９】
得られた反応物を常法にしたがって制限酵素Ｂｓｔ ＸＩにより切断し、得られた約８００塩基対のＤＮＡ断片を０．１μｇとり、これを適量の滅菌蒸留水に溶解し、あらかじめ制限酵素Ｂｓｔ ＸＩにより切断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター『ｐＲｃ／ＣＭＶ』を１０ｎｇと適量の１０×ライゲーション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼをそれぞれ加え、さらに１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間反応させてＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、アルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡを『ｐＲＣＨｕＧＦ』と命名する一方、その塩基配列をジデオキシ法により調べたところ、図１に示す構造を有していた。図１に見られるように、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』においては、当該ポリペプチドの前駆体をコードする約８００塩基対からなるｃＤＮＡ『ＨｕＩＧＩＦ』が、サイトメガロウイルスプロモーター『ＰＣＭＶ』の下流に連結されていた。
【００２０】
別途、常法にしたがって、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、燐酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）により洗浄した後、細胞密度１×１０7 個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊させ、その浮遊液の０．８ｍｌを組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』１０μｇとともにキュベットにとり、１０分間氷冷し、バイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した後、直ちにキュベットを取外し、１０分間氷冷した。次いで、細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ４１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同じ条件でさらに３日間培養した。斯くして得られた１００個余りのコロニーから４８個を選別し、その一部をＧ４１８を４００μｇ／ｍｌ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注した培養プレートに接種し、上記と同様にして１週間培養した。その後、培養プレートの各ウェルに５．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を適量加えて細胞を溶解した。
【００２１】
細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリセロール５０μｌとジチオトレイトールを最終濃度２％（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれ加え、３７℃で１時間静置した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次いで、常法にしたがって、ゲル内で分離されたポリペプチドをニトロセルロース膜に移し取り、別途調製しておいた、同じ特許出願人が特開平８−２３１５９８号公報に開示した当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＨ−１株の培養上清に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。その後、ニトロセルロース膜を西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を含むＰＢＳに１時間浸漬し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄し、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素及び０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンをそれぞれ含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させた。その発色度に基づき、当該ポリペプチドの前駆体の産生能が高い形質転換体のクローンを選別し、これを『ＲＣＨｕＧＦ』と命名した。
【００２２】
この形質転換体『ＲＣＨｕＧＦ』を、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注した角形培養瓶に接種し、培養培地を適宜新鮮なものと取換えながら、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で１週間培養した。その後、培養瓶にギブコ製トリプシン剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』を適量加えて培養瓶内壁に付着した細胞を剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、さらに１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む氷冷した２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）により洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置した。その後、常法にしたがって細胞を破砕し、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、当該ポリペプチドの前駆体を含む上清部を採取した。この前駆体は、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００ダルトンを示し、Ｎ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有している。
【００２３】
【実施例２】
〈ＩＣＥの調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ及び１０ｍＭ ｄＴＴＰを各１μｌ、５０μＭランダムヘキサヌクレオチドを１μｌ、２０単位／μｌリボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ、５０単位／μｌ逆転写酵素を１μｌ、そして、常法にしたがってヒト急性単球性白血病由来の単球細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）から別途調製した全ＲＮＡ抽出液を１μｇそれぞれとり、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。この混液を４２℃で３０分間インキュベートして逆転写反応させた後、９９℃で５分間加熱して反応を停止させた。
【００２４】
この反応物に１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、５単位／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、ヒトのＩＣＥをコードする塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧ−３´及び５´−ＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてそれぞれ２０ピコモル加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサイクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、逆転写反応及びＰＣＲ反応用の試薬としては、パーキン・エルマー製『ジーンアンプＲＮＡ ＰＣＲキット』を用いた。
【００２５】
この新たに得られた反応物を常法にしたがって制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔＩにより切断し、得られたＩＣＥをコードする領域を含む約１，２００塩基対のＤＮＡ断片に、あらかじめ制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉにより切断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』１０ｎｇとともに、１０×ライゲーション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼのそれぞれ適量を加え、さらに、１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭになるように加えた後、１６℃で１８時間反応させて上記ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＤＭ８に挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株（ＡＴＣＣ４７０３５）に導入して形質転換体とし、これを２０μｇ／ｍｌアンピシリンと１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンをそれぞれ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した。培養物から菌体を採取し、この菌体にアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』を得た。ジデオキシ法により組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の塩基配列を調べたところ、図２に示すように、サイトメガロウイルスプロモーター『ＰＣＭＶ』の下流にＩＣＥをコードする領域を含む約１，２００塩基対からなるｃＤＮＡ『ＨｕＩＣＥ』が連結されていた。
【００２６】
次に、常法にしたがって、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにその浮遊液の０．２５ｍｌとともに上記で調製した組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』を１０μｇとり、１０分間室温下で静置した後、キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した。キュベットを取外し、室温下で１０分間静置した後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２日間培養した。
【００２７】
培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム及び１ｍＭ（４−アミジノ−フェニル）−メタン−スルホニルフルオライドをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破砕した。細胞破砕物を１，５００×ｇで５分間遠心分離して上清を採取し、これをさらに２２，５００×ｇで６０分間遠心分離してＩＣＥを２３０単位／ｍｌ含む上清を得た。
【００２８】
【実施例３】
〈ポリペプチドの製造〉
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む１００ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に実施例１の方法により得た当該ポリペプチドの前駆体を５００ｎＭになるように溶解して基質溶液とした。この基質溶液に実施例２の方法により得たＩＣＥを５００単位／ｍｌになるように加え、３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から０分後、１０分後、３０分後、１時間後、３時間後、６時間後及び１８時間後に反応物の一部をそれぞれ採取し、ヨードアセトアミドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えて反応を停止させた。この採取した反応物に同じ特許出願人が特開平８−２３１５９８号公報に開示したモノクローナル抗体を用いるウェスタン・ブロッティング法を適用し、当該ポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドが生成する経時変化を調べた。結果を図３に示す。
【００２９】
同時に、ヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）を免疫担当細胞として用いるバイオアッセイ法により、経時的に採取した反応物における活性型のポリペプチドの含有量を推定した。すなわち、ＫＧ−１細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１．５×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注した。上記において経時的に採取したそれぞれの反応物を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜希釈した後、これを上記マイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ含量を測定した。同時に、反応物を省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１に示すＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００３０】
【表１】
【００３１】
図３のウェスタン・ブロッティングに見られるように、本例の反応条件下においては、前駆体に相当する分子量約２４，０００ダルトンのバンドが反応開始から３時間までに漸次消滅し、それに伴って、活性型のポリペプチドに相当する分子量１８，２００ダルトンのバンドが出現した。表１のＩＦＮ−γ含量もこの結果とよく符合しており、分子量１８，２００ダルトンのバンドの出現に伴って反応物のＩＦＮ−γ誘導能が漸次上昇した。これらの結果は、ＩＣＥが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成したことを示している。
【００３２】
【実施例４】
〈ポリペプチドの精製と理化学的性質〉
【００３３】
【実施例４−１】
〈ポリペプチドの精製〉
実施例３の方法により１８時間反応させて得た反応物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３４】
この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、これをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して精製ポリペプチドの固状物を得た。収量は、原料として用いた前駆体に基づく理論収量の約６０％であった。
【００３５】
【実施例４−２】
〈ポリペプチドの分子量〉
実施例４−１の方法により得た精製ポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。このことは、ＩＣＥが分子量約２４，０００ダルトンの当該ポリペプチドの前駆体に作用し、より低分子量の活性型のポリペプチドを生成したことを示している。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００３６】
【実施例４−３】
〈ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列〉
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析したところ、実施例４−１の方法により得た精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。このことは、ＩＣＥが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、そのＮ末端アミノ酸配列である配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断したことを示している。
【００３７】
【実施例５】
〈ポリペプチドの製造〉
常法にしたがって、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにその浮遊液の０．２５ｍｌとともに実施例１の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』及び実施例２の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』をそれぞれ１０μｇずつ加え、１０分間室温下で静置した後、キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した。キュベットを取外し、室温下で１０分間静置した後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。
【００３８】
培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄した後、低張液として、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破砕した。細胞破砕物を１，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を採取し、これに当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法を適用して上清に含まれる当該ポリペプチドの量を決定した。
【００３９】
同時に、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』及び『ｐＣＤＨＩＣＥ』の両方又はいずれか一方を省略する系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２の結果は、ＣＯＳ−１細胞において、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡがそれぞれ良好に発現し、前者の前駆体に後者のＩＣＥが効率的に作用して、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドが生成したことを示している。なお、表２に見られるように、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡの両方又はいずれか一方を省略した対照系においても免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドが生成していたが、その量は僅少であった。この事実も、ＣＯＳ−１細胞において、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡがそれぞれ良好に発現したことを裏付けている。
【００４２】
その後、両ＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清に実施例４−１で述べた精製方法を適用して活性型のポリペプチドを精製し、得られた精製ポリペプチドに実施例４−２の方法を適用して分子量を測定したところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。さらに、実施例４−３の方法を適用したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４３】
【実施例６】
〈ポリペプチドの製造〉
常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株の一種であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）を約１×１０4 個／匹移植し、通常一般の方法で３２日間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約５ｇ／匹）を摘出し、細切し、低張液としての１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、−２０℃で凍結した。
【００４４】
次に、腫瘍塊を解凍し、腫瘍塊の湿重量１ｇに対して１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む新鮮な上記と同一の低張液を１ｍｌ加え、常法にしたがってポリトロン処理して細胞を破砕した後、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取した。なお、この上清はＩＣＥを約５００単位／ｍｌ含んでいた。その後、この上清を４℃又は３７℃でインキュベートしつつ、反応物を経時的にサンプリングし、これに当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法を適用して活性型ポリペプチドの量を決定した。結果を図４に示す。
【００４５】
図４の結果に見られるように、Ａ−２５３細胞の抽出液は、インキュベートすると、当該ポリペプチドの含量が顕著に高まるが、このことは、ＩＣＥと当該ポリペプチドの前駆体をそれぞれ含むＡ−２５３細胞の抽出液において、前者が後者に効果的に作用して活性型の当該ポリペプチドを生成したことを物語っている。インキュベートする温度は低温が望ましく、４℃でインキュベートしたときの当該ポリペプチドの生成量は３７℃でインキュベートする場合より有意に高かった。ちなみに、４℃及び３７℃でインキュベートしたときの当該ポリペプチドの収量は、腫瘍塊の湿重量１ｇ当り、それぞれ５．０μｇ及び２．５μｇに達した。
【００４６】
斯くして得られた活性型ポリペプチドを含む反応物を実施例４−１の方法により精製し、凍結乾燥した後、実施例４−２の方法を適用して分子量を測定したところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。また、実施例４−３の方法を適用したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。さらに、２−メルカプトエタノールに代えてジチオトレイトール又は還元型グルタチオンを用いて上記と同様に反応させたところ、２−メルカプトエタノールを含むすべての還元剤が濃度１ｍＭで当該ポリペプチドの生成を顕著に促進した。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したごとく、この発明は、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成するという独自の知見に基づくものである。この発明はＩＣＥのこの作用を利用するものであり、この発明にしたがって、ＩＣＥを当該ポリペプチドを本来産生する細胞や当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡにより形質転換した哺乳類由来の宿主細胞が産生する当該ポリペプチドの前駆体に作用させるか、ＩＣＥをコードするＤＮＡを当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡとともに哺乳類由来の宿主細胞に導入し、同細胞において両ＤＮＡを共発現させることにより、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受け、医薬品として有用なポリペプチドを所望量製造し得ることとなる。
【００４８】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【００４９】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
配列
【００５０】
配列番号：2
配列の長さ：193
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列
【００５１】
配列番号：3
配列の長さ：5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
配列
【００５２】
配列番号：4
配列の長さ：157
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列
【００５３】
配列番号：5
配列の長さ：579
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号：leader peptide
存在位置：1..108
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：109..579
特徴を決定した方法：S
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』の構造を示す図である。
【図２】ＩＣＥをコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の構造を示す図である。
【図３】ウェスタン・ブロッティング法により可視化した、当該ポリペプチドの前駆体から活性型の当該ポリペプチドが生成する継時変化を示すゲル電気泳動のディスプレー状に表示した中間調画像である。
【図４】Ａ−２５３細胞の抽出液を、温度を変えてインキュベートしたときの当該ポリペプチドの生成状況を示す図である。
【符合の説明】
ＰＣＭＶ サイトメガロウイルスプロモーター
ＨｕＩＧＩＦ 当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡ
ＨｕＩＣＥ ＩＣＥをコードするｃＤＮＡ
【発明の属する技術分野】
この発明は生理活性ポリペプチドの製造方法に関するものであり、詳細には、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペプチドの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの単離と、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、特開平８−２７１８９号公報及び特開平８−１９３０９８号公報に開示した。このポリペプチドは有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているので、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されている。
【０００３】
ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断されたり、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特願平８−２６９１０５号明細書（特開平９−２８９８９６号公報）に記載されているように、ヒト細胞は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。本発明者がその原因について鋭意研究したところ、ヒト細胞において、当該ポリペプチドは、通常、生理活性を有しない、分子量約２４，０００ダルトンの前駆体として存在していることが判明した。当該ポリペプチドにかぎらず、多くのサイトカインは、通常、まず、生理活性を有しない前駆体として産生され、その後、細胞内酵素によるプロセッシングを受けて活性型のポリペプチドに変換されることが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドを製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者が上記課題を解決すべく鋭意研究したところ、インターロイキン−１β変換酵素（以下、「ＩＣＥ」と略記する。）が当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成することが判明した。
【０００６】
すなわち、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体にＩＣＥを作用させることを特徴とする免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドの製造方法を要旨とするものである。
【０００７】
ＩＣＥは、例えば、ナンシー・エー・ソーンベリーらが『ネイチャー』、第３５６巻、７６８乃至７７４頁（１９９２年）に報告しているように、分子量約２０，０００ダルトンのサブユニットと分子量約１０，０００ダルトンのサブユニットからなるヘテロダイマー構造を有するシステイン・プロテアーゼの一種であり、通常、このヘテロダイマー同士が会合した状態で活性を発現する。ＩＣＥは公知の酵素であり、インターロイキン−１βの前駆体における第１１６番目のアスパラギン酸と第１１７番目のアラニンの間のペプチド結合、さらには、第２７番目のアスパラギン酸と第２８番目のグリシンの間のペプチド結合をそれぞれ切断することが知られている。しかしながら、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、そのアミノ酸配列における特定の部位、とりわけ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成することは知られていない。ＩＣＥのこの新規な作用を利用する当該ポリペプチドの製造方法は、この発明をもって嚆矢とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
前述のとおり、この発明は、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドを生成するという独自の知見に基づくものである。この発明でいう前駆体は、通常、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００ダルトンを示し、例えば、当該ポリペプチドを本来的に産生する細胞内、あるいは、当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡ（例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ）を導入することによって形質転換した哺乳類由来の宿主細胞内に存在する。斯かる前駆体は、通常、Ｎ末端には配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を、また、全体としては、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列の全部、又はそのＮ末端の一部が欠失したアミノ酸配列を有し、そのままでは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導しない。
【０００９】
しかしながら、斯かる前駆体はこの発明にしたがってＩＣＥを作用させると、前駆体の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合が切断され、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する活性型のポリペプチドに変換され、この活性型のポリペプチドは、単独又は適宜補因子の存在下、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。なお、活性型のポリペプチドは、通常、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を、また、全体としては、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１８，０００乃至１９，５００ダルトンを示す。
【００１０】
ＩＣＥとしては、それが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成するかぎり、天然のものであっても人工的に創成したものであってもよく、その構造や出所・由来は問わない。また、エマド・エス・アルネムリらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７０巻、第９号、４，３１２乃至４，３１７頁（１９９５年）に報告しているように、同一給源に由来するＩＣＥであっても、給源によっては、いくつかのアイソフォームの含まれることが知られている。これらのアイソフォームは生理作用において若干違いがあると言われているけれども、それらが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成するかぎり、この発明において使用可能である。
【００１１】
ＩＣＥは、通常、ＩＣＥを本来的に産生する細胞、あるいは、組換えＤＮＡ技術を適用することによってＩＣＥの産生能を有するに至った形質転換体から得ることができる。ＩＣＥを本来的に産生する細胞としては、ヒトを含む哺乳類由来の、例えば、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られる細胞株が挙げられる。また、形質転換体としては、ＩＣＥをコードするＤＮＡを微生物又は動物由来の適宜宿主に導入することによって得られる形質転換微生物及び形質転換細胞が挙げられる。これらの細胞又は形質転換体を斯界において慣用される培養培地を用いて培養し、得られる培養物から増殖した形質転換体を一旦分離するか培養上清とともに超音波を印加するか、低張媒体中に浸漬するなどして破砕し、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの酵素を精製するための斯界における慣用の方法を適宜組合せて適用してＩＣＥを採取する。なお、ＩＣＥをコードするＤＮＡ及びＩＣＥの産生能を有する形質転換体は、例えば、ナンシー・エー・ソーンベリーら『ネイチャー』、第３５６巻、７６８乃至７７４頁（１９９２年）やエマド・エス・アルネムリら『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２７０巻、第９号、４，３１２乃至４，３１７頁（１９９５年）などにも記載されている。
【００１２】
当該ポリペプチドの前駆体にＩＣＥを作用させるこの発明の実施態様としては、例えば、当該ポリペプチドの前駆体に上記の方法により調製したＩＣＥを接触させるか、あるいは、ＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿主細胞に導入し、そこで両ＤＮＡを共発現させればよい。前者の場合には、当該ポリペプチドの前駆体の産生能を有する細胞、もしくは、形質転換によって当該ポリペプチドの前駆体の産生能を有するに至った細胞を培養する。その培養物に上記の方法により調製したＩＣＥを共存せしめるか、あるいは、培養物から細胞を分離するか分離することなく、必要に応じて細胞を破砕した後、培養物又は細胞破砕物にＩＣＥを添加すればよい。共存又は添加せしめるＩＣＥの量としては、通常、前駆体と等モル以下で事足り、また、温度及びｐＨとしては、ＩＣＥが作用し得るレベル、通常、温度約４乃至４０℃、ｐＨ約６乃至９で原料の前駆体から活性型のポリペプチドが所望量生成するまで反応させればよく、斯くして、活性型のポリペプチドを含む反応物を得る。なお、後述するＴＨＰ−１細胞やＡ−２５３細胞などのように、同一の細胞が当該ポリペプチドの前駆体とＩＣＥをそれぞれ産生する場合には、当然のことながら、必ずしもＩＣＥを添加する必要はなく、必要に応じて細胞を破砕した後、上記と同様、ＩＣＥが前駆体に作用して活性型のポリペプチドを生成し得る温度及びｐＨで細胞又は細胞破砕物を含む培養物をインキュベートすれば良い。このような場合には、より効率的な生成反応を得るため、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、還元型グルタチオンを始めとする還元剤の適量を加えるのが望ましい。
【００１３】
後者の場合には、ＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿主細胞にそれぞれ導入して形質転換すればよい。この場合には、ＤＮＡの発現により生成したＩＣＥが、同じ形質転換体内で、ＤＮＡの発現により生成した当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成する。宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞株、間質系細胞株、神経芽細胞株及び造血系細胞が用いられる。斯かる宿主細胞にＩＣＥをコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。その際、必要に応じて、適宜のプロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列、ポリアデニル化配列及び／又は選択マーカーを含む、例えば、ｐＣＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＳＶ２−ｇｐｔなどのベクターを用いてもよい。形質転換細胞から目的とするクローンを選別するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、形質転換細胞を培養培地で培養し、活性型ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選別すればよい。このクローンを形質転換細胞を培養するための斯界における慣用の培養培地を用いて培養すれば、活性型のポリペプチドを含む培養物が得られる。当該ポリペプチドの前駆体を本来的に産生する細胞を用いる場合も、形質転換により当該ポリペプチドの産生能を有するに至った細胞を用いる場合も、細胞や培養条件によっては、当該ポリペプチドの前駆体とともに、活性型ポリペプチドを分解して不活性化する、例えば、ＣＰＰ３２やＭｃｈ−３などの分解酵素が生成することがある。このような場合、培養培地又は細胞若しくは細胞破砕物を含む培養物に斯かる分解酵素の活性を阻害する、例えば、アセチル−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパルト−１−アールなどの物質を適量共存させると、活性型ポリペプチドの分解が抑制され、収量が増加する。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００１４】
なお、この発明において、ＩＣＥの活性は、ダグラス・ケー・ミラーらが『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２６８巻、第２４号、１８，０６２乃至１８，０６９頁（１９９３年）に報告している方法にしたがって測定し、活性値（単位）で表示している。すなわち、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以下、「ＣＨＡＰＳ」と略記する。）及び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む２５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）を３９５μｌとり、これにＮ−（Ｎ−アセチル−チロシニル）−バリニル−アラニル−アスパラギン酸−７−アミノ−４−メチルクマリンアミドの１０ｍＭジチルスルホキシド溶液５μｌと被検ＩＣＥ溶液１００μｌをそれぞれ加え、３０℃で１時間反応させる。反応中、反応の進行に伴って遊離する７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、蛍光光度計により、波長３８０ｎｍで励起して放出される波長４６０ｎｍの蛍光の強度に基づき経時的にモニターする。ＩＣＥの１単位とは、斯かる条件で反応させたときに、１分間に７−アミノ−４−メチルクマリンを１ピコモル遊離する酵素の量と定義する。
【００１５】
斯くして得られた活性型のポリペプチドを含む反応物及び培養物は、ＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精製する。精製には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドを最小のコストと労力で得ることができる。
【００１６】
前述のとおり、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の方法により得られる活性型のポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による特願平８−２８７２２号明細書（特開平９−１５７１８０号公報）に詳述されている。
【００１７】
以下、実施例に基づきこの発明を説明する。
【００１８】
【実施例１】
〈前駆体の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌ、５単位／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、そして、同じ特許出願人が特開平８−１９３０９８号公報に開示した組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を１ｎｇとり、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号５に示した当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づき化学合成した５´−ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧ−３´及び５´−ＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０ピコモル加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、この混液を９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、ＰＣＲ反応試薬としては、宝酒造製『タカラＰＣＲアンプリフィケーションキット』を用いた。
【００１９】
得られた反応物を常法にしたがって制限酵素Ｂｓｔ ＸＩにより切断し、得られた約８００塩基対のＤＮＡ断片を０．１μｇとり、これを適量の滅菌蒸留水に溶解し、あらかじめ制限酵素Ｂｓｔ ＸＩにより切断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター『ｐＲｃ／ＣＭＶ』を１０ｎｇと適量の１０×ライゲーション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼをそれぞれ加え、さらに１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間反応させてＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採取し、アルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡを『ｐＲＣＨｕＧＦ』と命名する一方、その塩基配列をジデオキシ法により調べたところ、図１に示す構造を有していた。図１に見られるように、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』においては、当該ポリペプチドの前駆体をコードする約８００塩基対からなるｃＤＮＡ『ＨｕＩＧＩＦ』が、サイトメガロウイルスプロモーター『ＰＣＭＶ』の下流に連結されていた。
【００２０】
別途、常法にしたがって、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、燐酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する。）により洗浄した後、細胞密度１×１０7 個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊させ、その浮遊液の０．８ｍｌを組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』１０μｇとともにキュベットにとり、１０分間氷冷し、バイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した後、直ちにキュベットを取外し、１０分間氷冷した。次いで、細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ４１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同じ条件でさらに３日間培養した。斯くして得られた１００個余りのコロニーから４８個を選別し、その一部をＧ４１８を４００μｇ／ｍｌ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注した培養プレートに接種し、上記と同様にして１週間培養した。その後、培養プレートの各ウェルに５．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を適量加えて細胞を溶解した。
【００２１】
細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリセロール５０μｌとジチオトレイトールを最終濃度２％（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれ加え、３７℃で１時間静置した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次いで、常法にしたがって、ゲル内で分離されたポリペプチドをニトロセルロース膜に移し取り、別途調製しておいた、同じ特許出願人が特開平８−２３１５９８号公報に開示した当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＨ−１株の培養上清に１時間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。その後、ニトロセルロース膜を西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を含むＰＢＳに１時間浸漬し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄し、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素及び０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンをそれぞれ含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させた。その発色度に基づき、当該ポリペプチドの前駆体の産生能が高い形質転換体のクローンを選別し、これを『ＲＣＨｕＧＦ』と命名した。
【００２２】
この形質転換体『ＲＣＨｕＧＦ』を、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）を分注した角形培養瓶に接種し、培養培地を適宜新鮮なものと取換えながら、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で１週間培養した。その後、培養瓶にギブコ製トリプシン剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』を適量加えて培養瓶内壁に付着した細胞を剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、さらに１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む氷冷した２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）により洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置した。その後、常法にしたがって細胞を破砕し、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、当該ポリペプチドの前駆体を含む上清部を採取した。この前駆体は、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００ダルトンを示し、Ｎ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有している。
【００２３】
【実施例２】
〈ＩＣＥの調製〉
０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩衝液を１μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１０ｍＭ ｄＣＴＰ及び１０ｍＭ ｄＴＴＰを各１μｌ、５０μＭランダムヘキサヌクレオチドを１μｌ、２０単位／μｌリボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ、５０単位／μｌ逆転写酵素を１μｌ、そして、常法にしたがってヒト急性単球性白血病由来の単球細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）から別途調製した全ＲＮＡ抽出液を１μｇそれぞれとり、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。この混液を４２℃で３０分間インキュベートして逆転写反応させた後、９９℃で５分間加熱して反応を停止させた。
【００２４】
この反応物に１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、５単位／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、ヒトのＩＣＥをコードする塩基配列に基づき化学合成した５´−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧ−３´及び５´−ＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしてそれぞれ２０ピコモル加え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサイクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、逆転写反応及びＰＣＲ反応用の試薬としては、パーキン・エルマー製『ジーンアンプＲＮＡ ＰＣＲキット』を用いた。
【００２５】
この新たに得られた反応物を常法にしたがって制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔＩにより切断し、得られたＩＣＥをコードする領域を含む約１，２００塩基対のＤＮＡ断片に、あらかじめ制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔ Ｉにより切断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』１０ｎｇとともに、１０×ライゲーション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼのそれぞれ適量を加え、さらに、１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭになるように加えた後、１６℃で１８時間反応させて上記ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＤＭ８に挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株（ＡＴＣＣ４７０３５）に導入して形質転換体とし、これを２０μｇ／ｍｌアンピシリンと１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンをそれぞれ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養した。培養物から菌体を採取し、この菌体にアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』を得た。ジデオキシ法により組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の塩基配列を調べたところ、図２に示すように、サイトメガロウイルスプロモーター『ＰＣＭＶ』の下流にＩＣＥをコードする領域を含む約１，２００塩基対からなるｃＤＮＡ『ＨｕＩＣＥ』が連結されていた。
【００２６】
次に、常法にしたがって、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにその浮遊液の０．２５ｍｌとともに上記で調製した組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』を１０μｇとり、１０分間室温下で静置した後、キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した。キュベットを取外し、室温下で１０分間静置した後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２日間培養した。
【００２７】
培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム及び１ｍＭ（４−アミジノ−フェニル）−メタン−スルホニルフルオライドをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破砕した。細胞破砕物を１，５００×ｇで５分間遠心分離して上清を採取し、これをさらに２２，５００×ｇで６０分間遠心分離してＩＣＥを２３０単位／ｍｌ含む上清を得た。
【００２８】
【実施例３】
〈ポリペプチドの製造〉
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む１００ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に実施例１の方法により得た当該ポリペプチドの前駆体を５００ｎＭになるように溶解して基質溶液とした。この基質溶液に実施例２の方法により得たＩＣＥを５００単位／ｍｌになるように加え、３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から０分後、１０分後、３０分後、１時間後、３時間後、６時間後及び１８時間後に反応物の一部をそれぞれ採取し、ヨードアセトアミドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えて反応を停止させた。この採取した反応物に同じ特許出願人が特開平８−２３１５９８号公報に開示したモノクローナル抗体を用いるウェスタン・ブロッティング法を適用し、当該ポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドが生成する経時変化を調べた。結果を図３に示す。
【００２９】
同時に、ヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）を免疫担当細胞として用いるバイオアッセイ法により、経時的に採取した反応物における活性型のポリペプチドの含有量を推定した。すなわち、ＫＧ−１細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１．５×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注した。上記において経時的に採取したそれぞれの反応物を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜希釈した後、これを上記マイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ含量を測定した。同時に、反応物を省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１に示すＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００３０】
【表１】
図３のウェスタン・ブロッティングに見られるように、本例の反応条件下においては、前駆体に相当する分子量約２４，０００ダルトンのバンドが反応開始から３時間までに漸次消滅し、それに伴って、活性型のポリペプチドに相当する分子量１８，２００ダルトンのバンドが出現した。表１のＩＦＮ−γ含量もこの結果とよく符合しており、分子量１８，２００ダルトンのバンドの出現に伴って反応物のＩＦＮ−γ誘導能が漸次上昇した。これらの結果は、ＩＣＥが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成したことを示している。
【００３２】
【実施例４】
〈ポリペプチドの精製と理化学的性質〉
【００３３】
【実施例４−１】
〈ポリペプチドの精製〉
実施例３の方法により１８時間反応させて得た反応物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３４】
この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、これをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して精製ポリペプチドの固状物を得た。収量は、原料として用いた前駆体に基づく理論収量の約６０％であった。
【００３５】
【実施例４−２】
〈ポリペプチドの分子量〉
実施例４−１の方法により得た精製ポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。このことは、ＩＣＥが分子量約２４，０００ダルトンの当該ポリペプチドの前駆体に作用し、より低分子量の活性型のポリペプチドを生成したことを示している。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００３６】
【実施例４−３】
〈ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列〉
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析したところ、実施例４−１の方法により得た精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。このことは、ＩＣＥが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、そのＮ末端アミノ酸配列である配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断したことを示している。
【００３７】
【実施例５】
〈ポリペプチドの製造〉
常法にしたがって、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにその浮遊液の０．２５ｍｌとともに実施例１の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』及び実施例２の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』をそれぞれ１０μｇずつ加え、１０分間室温下で静置した後、キュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した。キュベットを取外し、室温下で１０分間静置した後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。
【００３８】
培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄した後、低張液として、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破砕した。細胞破砕物を１，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を採取し、これに当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法を適用して上清に含まれる当該ポリペプチドの量を決定した。
【００３９】
同時に、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』及び『ｐＣＤＨＩＣＥ』の両方又はいずれか一方を省略する系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
表２の結果は、ＣＯＳ−１細胞において、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡがそれぞれ良好に発現し、前者の前駆体に後者のＩＣＥが効率的に作用して、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドが生成したことを示している。なお、表２に見られるように、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡの両方又はいずれか一方を省略した対照系においても免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドが生成していたが、その量は僅少であった。この事実も、ＣＯＳ−１細胞において、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡがそれぞれ良好に発現したことを裏付けている。
【００４２】
その後、両ＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清に実施例４−１で述べた精製方法を適用して活性型のポリペプチドを精製し、得られた精製ポリペプチドに実施例４−２の方法を適用して分子量を測定したところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。さらに、実施例４−３の方法を適用したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４３】
【実施例６】
〈ポリペプチドの製造〉
常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株の一種であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）を約１×１０4 個／匹移植し、通常一般の方法で３２日間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約５ｇ／匹）を摘出し、細切し、低張液としての１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、−２０℃で凍結した。
【００４４】
次に、腫瘍塊を解凍し、腫瘍塊の湿重量１ｇに対して１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む新鮮な上記と同一の低張液を１ｍｌ加え、常法にしたがってポリトロン処理して細胞を破砕した後、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取した。なお、この上清はＩＣＥを約５００単位／ｍｌ含んでいた。その後、この上清を４℃又は３７℃でインキュベートしつつ、反応物を経時的にサンプリングし、これに当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法を適用して活性型ポリペプチドの量を決定した。結果を図４に示す。
【００４５】
図４の結果に見られるように、Ａ−２５３細胞の抽出液は、インキュベートすると、当該ポリペプチドの含量が顕著に高まるが、このことは、ＩＣＥと当該ポリペプチドの前駆体をそれぞれ含むＡ−２５３細胞の抽出液において、前者が後者に効果的に作用して活性型の当該ポリペプチドを生成したことを物語っている。インキュベートする温度は低温が望ましく、４℃でインキュベートしたときの当該ポリペプチドの生成量は３７℃でインキュベートする場合より有意に高かった。ちなみに、４℃及び３７℃でインキュベートしたときの当該ポリペプチドの収量は、腫瘍塊の湿重量１ｇ当り、それぞれ５．０μｇ及び２．５μｇに達した。
【００４６】
斯くして得られた活性型ポリペプチドを含む反応物を実施例４−１の方法により精製し、凍結乾燥した後、実施例４−２の方法を適用して分子量を測定したところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。また、実施例４−３の方法を適用したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。さらに、２−メルカプトエタノールに代えてジチオトレイトール又は還元型グルタチオンを用いて上記と同様に反応させたところ、２−メルカプトエタノールを含むすべての還元剤が濃度１ｍＭで当該ポリペプチドの生成を顕著に促進した。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したごとく、この発明は、ＩＣＥが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチドを生成するという独自の知見に基づくものである。この発明はＩＣＥのこの作用を利用するものであり、この発明にしたがって、ＩＣＥを当該ポリペプチドを本来産生する細胞や当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡにより形質転換した哺乳類由来の宿主細胞が産生する当該ポリペプチドの前駆体に作用させるか、ＩＣＥをコードするＤＮＡを当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤＮＡとともに哺乳類由来の宿主細胞に導入し、同細胞において両ＤＮＡを共発現させることにより、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受け、医薬品として有用なポリペプチドを所望量製造し得ることとなる。
【００４８】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【００４９】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：41
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
配列
配列番号：2
配列の長さ：193
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列
配列番号：3
配列の長さ：5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
配列
配列番号：4
配列の長さ：157
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ポリペプチド
配列
配列番号：5
配列の長さ：579
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号：leader peptide
存在位置：1..108
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：109..579
特徴を決定した方法：S
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』の構造を示す図である。
【図２】ＩＣＥをコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の構造を示す図である。
【図３】ウェスタン・ブロッティング法により可視化した、当該ポリペプチドの前駆体から活性型の当該ポリペプチドが生成する継時変化を示すゲル電気泳動のディスプレー状に表示した中間調画像である。
【図４】Ａ−２５３細胞の抽出液を、温度を変えてインキュベートしたときの当該ポリペプチドの生成状況を示す図である。
【符合の説明】
ＰＣＭＶ サイトメガロウイルスプロモーター
ＨｕＩＧＩＦ 当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮＡ
ＨｕＩＣＥ ＩＣＥをコードするｃＤＮＡ
Claims (1)
- 配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）を含み、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体を産生する形質転換体を培養して、当該前駆体を産生させる工程と、当該前駆体に対して下記の制限酵素地図で示されるプラスミドベクターｐＣＤＨＩＣＥを発現させて得ることができるインターロイキン１β変換酵素を作用させる工程とを含む、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を含む活性型のポリペプチドの製造方法。
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1997
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